CN104082819B - 一种食药用菌功能性固体饮料及其制备方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种食药用菌功能性固体饮料及其制备方法。该饮料中功能成分的原料为食药用菌发酵产物浓缩液，其制备包括：将鸡腿菇菇柄粉和花菇菇柄粉混合制成复合食用菌菇柄粉原料；取复合食用菌菇柄粉原料、蔗糖、玉米粉和大豆粉，加水配制发酵培养基，先接入灵芝液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵培养，再接入姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段共发酵培养，终止发酵后升温搅拌，浸提后过滤、浓缩，得到食药用菌发酵产物浓缩液。食药用菌发酵产物浓缩液直接或者添加辅料后经喷雾干燥得固体饮料。本发明充分利用了食用菌菇柄资源，使资源得到充分利用，原料成本低，并结合姬松茸和灵芝的发酵特征，配制科学，不含防腐剂，产品绿色、天然、安全。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种食药用菌功能性固体饮料及其制备方法。
背景技术
食用菌因其高蛋白、低脂肪、氨基酸组成丰富而备受消费者的喜爱。食用菌的风味非常复杂，它具有独特的滋味和香味。在食用菌的生长、采摘、包装等过程中会产生较大量的畸形菇、菇柄、破边菇、碎菇屑。由于外形缺陷，这些食用菌资源往往被菇农和销售商作为低商品价值的菇类废弃或低价出售，造成资源未充分利用。
鸡腿菇(Copyindscomatus(MUII.Fr)Gray)是一种高蛋白低脂肪食用菌，不但蛋白质含量高，而且蛋白质质量优。鸡腿菇含14种氨基酸，氨基酸种类齐全，其中人体7种必需氨基酸含量占49.2％左右，且必需氨基酸中赖氨酸含量较高，营养价值高。由于鸡腿菇菇柄粗纤维含量较多,粗韧难嚼，吞咽困难，加工品质受限。大多没有被充分地开发和利用，而是当作废弃物处理。
花菇(Lentinulaedodes(Berk.)Pegler.)菇质肥厚，鲜嫩，香味浓郁，以丰富的营养和防病、健身、延缓衰老等作用深受国内外群众的欢迎。花菇中含有丰富的蛋白质和氨基酸、脂肪、粗纤维和维生素等。花菇中氨基酸含量极高，含有17种人体所需要氨基酸，VD含量达120个国际单位，并含有大量的花菇嘌呤碱。花菇收获后的菇柄基部由于含有大量的纤维，质地比较粗糙，口感较差，人们不喜欢食用，通常在鲜菇出售前将其剪下丢弃，造成资源的浪费，而且对环境也造成一定的污染。
灵芝(GanodermaLucidum(Leyss.exFr.)Karst.)是我国传统的名贵中药材和药用真菌，其主要功效成分为灵芝三萜和灵芝多糖。其中灵芝多糖的功能主要在于抗肿瘤、调节免疫、抗氧自由基、活血化瘀作用和抗衰老，而灵芝三萜则具有护肝排毒、抗氧化、抗菌抗炎、抗HIV病毒、镇痛、抑制血管紧张素转化酶、抑制胆固醇合成、降低血小板聚集、抑制组胺释放、抑制肝脏肿瘤细胞等作用。
姬松茸(AgaricusblazeiMurrill)，又名巴西蘑菇，含有多种抗肿瘤活性多糖，此外在降血脂、降血压、治疗糖尿病及维护肝等方面均具有神奇的医疗保健作用，被日本学者称为“地球上最后的食品”。
中国专利ZL200910180070.9公开了一种灵芝固体饮料的制备方法及其制备的灵芝固体饮料，包括：将灵芝加水经加热提取所得的灵芝提取液与白砂糖、低聚异麦芽糖、植脂末、全脂奶粉、柠檬酸混合均匀，经制粒、干燥和杀菌，制得灵芝固体饮料。该灵芝固体饮料仅以灵芝子实体提取液与砂糖、低聚异麦芽糖等其它添加剂经简单调配，制备较为简单，所得产品菇类功效与呈香、呈味成分较少。
中国专利申请CN201310686079.3中公开了一种番茄灵芝固体饮料，由以下重量份原料组成：番茄80-100、胡萝卜40-50、红豆40-50、酸奶50-60、蜂蜜50-60、淀粉20-30、灵芝5-6、人参3-4、甘草3-4、山药4-5、黄精3-4、牡丹皮3-4、木通3-4、黄连2-3、丽春花2-3、食用乳化剂0.5-0.6、食品添加剂10-12、水适量。该番茄灵芝固体饮料以灵芝子实体提取液与番茄等果蔬经水提后与其它食品添加剂简单调配而成，所得产品菇类成分较少。
上述技术多以单一或少数食药用菌子实体和其它果蔬、中药材等为原料，且仅以其提取液辅以添加甜味剂、酸味剂等简单复配而成，未充分利用菇类自身的功效成分与呈香、呈味成分间的科学组配，所得产品菇类成分较少。为了提高食药用菌资源的利用率，充分利用菇类自身的功效成分与呈香、呈味成分，有必要开发新的食药用菌功能性产品及新的制备方法。
发明内容
本发明提供了一种食药用菌功能性固体饮料，其含有鸡腿菇菇柄、花菇菇柄经灵芝和姬松茸发酵转化后的多种菇类活性多糖、蛋白质、呈味核苷酸、呈味氨基酸等成分，不仅具有菇类特有的芳香味，还具有明显的免疫促进和免疫增强的作用。
本发明还提供了一种食药用菌功能性固体饮料的制备方法，菇类功效成分与呈香、呈味成分间科学组配，原料成本低，操作简单，适于工业化生产。
本发明针对目前食用菌生产加工中普遍存在的鸡腿菇菇柄、花菇菇柄等资源被废弃的现实状况，根据其富含呈味氨基酸、呈味核苷酸等呈香、呈味物质以及蛋白质、活性多糖等多种功效成分的特点。利用灵芝、姬松茸等食药真菌具有强大的纤维素降解酶系、木质素降解酶系，能降解、转化利用不溶性营养组成的特点。以目前多弃之不用的鸡腿菇菇柄、花菇菇柄为主要原料，根据灵芝、姬松茸的发酵特征，创造性地先进行第Ⅰ阶段的灵芝单菌液体发酵、再通过接入姬松茸进行第Ⅱ阶段的共发酵，将发酵产物经提取、浓缩、喷雾干燥制得固体饮料。
本发明采用的技术方案是：
一种食药用菌功能性固体饮料，其功能成分的原料为食药用菌发酵产物浓缩液，所述的食药用菌发酵产物浓缩液的制备方法，包括：
(1)将鸡腿菇菇柄、花菇菇柄分别洗净后干燥，粉碎，分别得到鸡腿菇菇柄粉、花菇菇柄粉；
(2)将鸡腿菇菇柄粉:花菇菇柄粉按照质量比1：3至6：1的比例混合，制成复合食用菌菇柄粉原料；
(3)取姬松茸菌种活化后的菌块、灵芝菌种活化后的菌块分别接种于液体种子培养基中，发酵培养，分别得到姬松茸液体菌种、灵芝液体菌种；
(4)向灭菌冷却后的发酵培养基中先接入占发酵培养基体积1％-20％的灵芝液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵培养，然后再接入占发酵培养基体积1％-20％的姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段共发酵培养，终止发酵后，升温搅拌，浸提后过滤、浓缩，得到食药用菌发酵产物浓缩液；所述的发酵培养基每1升由步骤(2)制备的复合食用菌菇柄粉原料10g-50g、蔗糖1g-10g、玉米粉1g-8g、大豆粉1g-5g和余量的水组成。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，所述的鸡腿菇菇柄粉和花菇菇柄粉的目数均优选为40目-80目。
步骤(3)中，所述的发酵培养的条件优选为：在22℃-30℃发酵培养72h-240h。
所述的液体种子培养基采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的液体种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L和MgSO40.5g/L。
所述的姬松茸菌种、灵芝菌种可采用任意一种姬松茸菌种、灵芝菌种，可采用市售产品，例如北京北纳创联生物技术研究院生产的姬松茸菌种、灵芝菌种。
步骤(4)中，所述的第Ⅰ阶段发酵培养的条件优选为：在20℃-30℃发酵培养1天-8天。
所述的第Ⅱ阶段共发酵培养的条件优选为：在18℃-28℃发酵培养1天-10天。
优选：终止发酵后，升温至40℃-90℃，搅拌转速为40rpm-80rpm，浸提30min-120min后过滤。
所述的食药用菌发酵产物浓缩液中可溶性固形物的质量百分含量优选为30％-40％，更便于制备固体饮料。可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等等。测定方法按国家标准GB/T12143-2008饮料通用分析方法。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在121℃下灭菌20min-30min。
所述的食药用菌发酵产物浓缩液由于富含呈味氨基酸、呈味核苷酸等呈香、呈味物质以及蛋白质、活性多糖等多种功效成分，可以直接作为一种饮料，或在所述的食药用菌发酵产物浓缩液中添加适量的添加剂后作为一种饮料，也可以将食药用菌发酵产物浓缩液制成固体饮料或在所述的食药用菌发酵产物浓缩液中添加适量的添加剂后制成固体饮料。所述的饮料中食药用菌发酵产物浓缩液的质量百分用量可为10％-100％(即所述的食药用菌功能性固体饮料的原料包含质量百分比为10％-100％的食药用菌发酵产物浓缩液。)，从节约原料并兼顾优良功效等角度考虑，优选为80％-99％。
为了使所述的食药用菌功能性固体饮料具备更加优良的口感，可在食药用菌发酵产物浓缩液中添加适量的添加剂。优选，所述的食药用菌功能性固体饮料由以下质量百分比的原料制成：
食药用菌发酵产物浓缩液93.5％-99％；
麦芽糊精0.5％-6％；
柠檬酸0.02％-0.6％。
所述的食药用菌功能性固体饮料的制备方法，包括：将所述的原料混合均匀后均质，经喷雾干燥，得到食药用菌功能性固体饮料。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明以鸡腿菇菇柄、花菇菇柄为原料，通过生物转化，使其中残存的多糖、氨基酸、核苷酸类物质释放出来，生物转化率高。
2、本发明充分运用不同种类的食药真菌对食用菌菇柄中不同营养成分的分解作用，利用姬松茸、灵芝在发酵过程中产生的多种特征纤维素降解酶系统、木质素降解酶等系统，创造性地依次分阶段发酵，先接入灵芝单一液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵，培养一段时间调温后再接入姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段的共发酵培养模式；根据食用菌菇柄粉原料的物料特点，通过分阶段依次接入不同的菌种，充分发挥各真菌菌株作用效果的差异性，获得更加丰富的菌类功效成分。
3、本发明采用的原料来源于食用菌生产中的菇柄等下脚料，成本低，变废为宝，使资源得到充分利用。
4、本发明方法操作简单，易于实现规模化生产，且整个生产过程条件温和，没有重金属等有害物质的摄入，产品绿色安全。
5、本发明食药用菌固体饮料配制科学，不含防腐剂，所用原料绿色、天然、安全，顺应了当今人们对食品的“方便、卫生、营养、功能、安全、回归自然”的追求，且具有携带和食用方便等优点。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
采用北京北纳创联生物技术研究院生产的姬松茸菌种、灵芝菌种。
实施例1
1、原料预处理
将鸡腿菇菇柄清洗干净后烘干，粉碎至过60目筛大小的鸡腿菇菇柄粉；将花菇菇柄清洗干净后烘干，粉碎至过60目筛大小的花菇菇柄粉。
2、将上述鸡腿菇菇柄粉:花菇菇柄粉按照质量比1：3的比例混合，制成复合食用菌菇柄粉原料。
3、单菌发酵种子液的制备：取姬松茸菌种活化后的菌块、灵芝菌种活化后的菌块分别接种于液体种子培养基，培养基组成为葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。22℃发酵培养240h，分别得到姬松茸液体菌种、灵芝液体菌种。
4、深层发酵培养：取步骤2制得的复合食用菌菇柄粉原料10g、蔗糖5g、玉米粉1g和大豆粉5g，加水至1L，配制发酵培养基，将发酵培养基注入机械搅拌式发酵罐中，121℃下灭菌20min；冷却至20℃时先接入占发酵培养基体积1％的灵芝液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵，培养1天后，将温度调为18℃，再接入占发酵培养基体积10％的姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段共发酵，培养10天后终止发酵，升温至40℃，搅拌转速为40rpm，浸提30min后，过滤，滤液真空浓缩至可溶性固形物的质量百分含量为35％，得到食药用菌发酵产物浓缩液。
5、按质量百分比组分配比食药用菌发酵产物浓缩液99％、麦芽糊精0.98％和柠檬酸0.02％，搅拌均匀后均质，经喷雾干燥，得到食药用菌功能性固体饮料。
实施例2
1、原料预处理
将鸡腿菇菇柄清洗干净后烘干，粉碎至过40目筛大小的鸡腿菇菇柄粉；将花菇菇柄清洗干净后烘干，粉碎至过40目筛大小的花菇菇柄粉。
2、将上述鸡腿菇菇柄粉:花菇菇柄粉按照质量比1：1的比例混合，制成复合食用菌菇柄粉原料。
3、单菌发酵种子液的制备：取姬松茸菌种活化后的菌块、灵芝菌种活化后的菌块分别接种于液体种子培养基，培养基组成为葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。30℃发酵培养72h，分别得到姬松茸液体菌种、灵芝液体菌种。
4、深层发酵培养：取步骤2制得的复合食用菌菇柄粉原料35g、蔗糖1g、玉米粉8g和大豆粉1g，加水至1L，配制发酵培养基，将发酵培养基注入机械搅拌式发酵罐中，121℃下灭菌20min；冷却至26℃时先接入占发酵培养基体积10％的灵芝液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵，培养6天后，将温度调为25℃，再接入占发酵培养基体积20％的姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段共发酵，培养5天后终止发酵，升温至85℃，搅拌转速为50rpm，浸提70min后，过滤，滤液真空浓缩至可溶性固形物的质量百分含量为40％，得到食药用菌发酵产物浓缩液。
5、按质量百分比组分配比食药用菌发酵产物浓缩液98.9％、麦芽糊精0.5％和柠檬酸0.6％，搅拌均匀后均质，经喷雾干燥，得到食药用菌功能性固体饮料。
实施例3
1、原料预处理
将鸡腿菇菇柄清洗干净后烘干，粉碎至过80目筛大小的鸡腿菇菇柄粉；将花菇菇柄清洗干净后烘干，粉碎至过80目筛大小的花菇菇柄粉。
2、将上述鸡腿菇菇柄粉:花菇菇柄粉按照质量比6：1的比例混合，制成复合食用菌菇柄粉原料。
3、单菌发酵种子液的制备：取姬松茸菌种活化后的菌块、灵芝菌种活化后的菌块分别接种于液体种子培养基，培养基组成为葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。26℃发酵培养150h，分别得到姬松茸液体菌种、灵芝液体菌种。
4、深层发酵培养：取步骤2制得的复合食用菌菇柄粉原料50g、蔗糖10g、玉米粉4g和大豆粉2g，加水至1L，配制发酵培养基，将发酵培养基注入机械搅拌式发酵罐中，121℃下灭菌20min；冷却至30℃时先接入占发酵培养基体积20％的灵芝液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵，培养8天后，将温度调为28℃，再接入占发酵培养基体积1％的姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段共发酵，培养1天后终止发酵，升温至90℃，搅拌转速为80rpm，浸提120min后，过滤，滤液真空浓缩至可溶性固形物的质量百分含量为30％，得到食药用菌发酵产物浓缩液。
5、按质量百分比组分配比食药用菌发酵产物浓缩液93.5％、麦芽糊精6％和柠檬酸0.5％，搅拌均匀后均质，经喷雾干燥，得到食药用菌功能性固体饮料。
对比例1
除了步骤4中仅接入灵芝液体菌种进行单一菌种发酵，不接入姬松茸液体菌种进行发酵之外，其它操作同实施例1，得到固体饮料。
对比例2
除了步骤4中不接入灵芝液体菌种进行发酵，仅接入姬松茸液体菌种进行单一菌种发酵之外，其它操作同实施例1，得到固体饮料。
对比例3
步骤4的操作如下：
深层发酵培养：取步骤2制得的复合食用菌菇柄粉原料10g、蔗糖5g、玉米粉1g和大豆粉5g，加水至1L，配制发酵培养基，将发酵培养基注入机械搅拌式发酵罐中，121℃下灭菌20min；冷却至20℃时同时接入占发酵培养基体积10％的姬松茸液体菌种和占发酵培养基体积5％的灵芝液体菌种进行共发酵，培养6天后终止发酵，升温至40℃，搅拌转速为40rpm，浸提30min后，过滤，滤液真空浓缩至可溶性固形物的质量百分含量为35％，得到食药用菌发酵产物浓缩液。
其它操作同实施例1，得到固体饮料。
一、本发明实施例1-3制备的固体饮料与对比例1-3制备的固体饮料中氨基酸的含量分析
表1本发明固体饮料与对比例固体饮料中氨基酸的含量/(mg/g)
注：与对比例相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
由表1可知，与对比例1-3制备的固体饮料比较，本发明提供的实施例1-3制备的固体饮料中的氨基酸(包括人体必需氨基酸)含量较高，差异显著(P<0.05)。
二、下面通过本发明对小鼠免疫功能影响试验进一步说明本发明的有益效果。
1.材料
1.1实验动物
实验用ICR小鼠(由浙江省实验动物中心提供)160只，雌性，体重(20±2)g。饲料由浙江省实验动物中心提供，检测环境条件：温度20℃-22℃，相对湿度40％-70％。每20只分为1组，共8组，各组平均体重基本相同。
1.2主要仪器与试剂
Hank’s液，美国HyClone公司；RPMI-1640培养基，Pharmacia公司；刀豆蛋白A(ConA)，美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，美国Sigma公司；印度墨汁，Winsaw&Newton公司。
超净工作台，苏州净化设备工程有限公司；恒温CO2培养箱，美国Thermo公司；722分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；酶标仪，美国Thermo公司。
2.实验方法
2.1灌胃剂量及方法
据人体口服推荐量，分别设空白对照组、模型组、实施例1-3组和对比例1-3组，浓度为450mg/(kgbwd)。实施例1-3组和对比例1-3组灌胃给样品(各组对应其制备的饮料)，灌胃容量按0.2mL/10g.BW体重计，模型组和空白对照组给予同体积的蒸馏水，连续30d。除正常组即空白对照组注射生理盐水外，其余各组第1周连续7d腹腔注射0.2mL环磷酰胺[50mg/(kgbwd)]造模，形成免疫机能低下。
2.2实验步骤
2.2.1小鼠碳廓清实验
各组灌胃给样品，每天一次，连续30d。在试验第30d，每鼠尾静脉注入用生理盐水稀释3-4倍的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min分别从内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2mL0.1％Na2CO3溶液中，用722分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。第二次采血结束后，立即处死小鼠，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。计算吞噬指数。
2.2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
各组灌胃给样品，每天一次，连续30d。动物处死前30min，每鼠腹腔内注射20％(V/V)鸡红细胞悬液1mL，处死后再注入2mL生理盐水，取腹腔液滴片，37℃温箱孵育30min，固定，染色，镜检，计数100个巨噬细胞，计算吞噬率及吞噬指数。
2.2.3迟发型变态反应(DTH)试验(足跖增厚法)
各组灌胃给样品，每天一次，连续30d。在试验第25d，每只鼠腹腔注射0.2mL2％(v/v)压积绵羊红细胞(SRBC)悬液，进行免疫。免疫后4d，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，每只鼠20μL，注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。
2.24ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)
各组灌胃给样品，每天一次，连续30d。在试验第30d，每鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1m1，一孔加50μLconA液(相当于5μg/mL)，另一孔作为对照，置37℃、5％CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入MTT(5mg/m1)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1m1酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。在570nm波长处测定光密度值(OD)。最后用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
2.2.5抗体生成细胞检测
小鼠被采血后，迅速摘取其脾脏，用冰生理盐水冲洗干净，配制成15mg/mL的脾细胞悬液。在试管中依次加入2％绵羊红细胞悬液和1：10豚鼠血清各0.5mL。另设不加补体的空白对照管，置于37℃水浴中温育1h，3000r/min离心10min，取上清液于413nm处测定AOD值。
2.2.6小鼠血清溶血素测定(半数溶血值法)
用2％绵羊红细胞免疫的小鼠，于末次给药后24h，眼眶静脉窦采血。将血液室温放置1h，3000r/min离心15min分离血清，10μL血清用生理盐水稀释100倍。取稀释血清1mL于试管内，依次加入0.5mL5％(体积分数)绵羊红细胞悬液、0.5mL10％补体，在37℃下保温30min，冰水浴终止反应。3000r/min离心10min，取上清液1mL，加都氏液3mL于试管内，同时取5％绵羊红细胞悬液0.25mL，加都氏液至4mL，置于另一试管内，作为绵羊红细胞的半数溶血值。充分摇匀，放置10min，于540nm处比色。以不加血清为空白对照，分别测定各管的AOD值。血清溶血素的量以半数溶血值表示，计算公式：
半数溶血值(HC50)＝(样品管OD值/SRBC半数溶血时的OD值)×稀释倍数
2.2.7NK细胞活性测定
各组灌胃给样品，每天一次，连续30d。在试验第30d，每鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。试验前24h将YAC-1细胞(靶细胞)传代培养，应用前用Hank’s液洗3次，用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。取靶细胞和脾细胞悬液(效应细胞)各100μL(效靶比50：1)，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2，培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清100μ1置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μ1，反应5min，每孔加入1mol/L的HCL30μL在490nm波长处测光密度(OD)值，计算NK细胞活性。
3.实验数据统计
用Spss11.0软件进行统计分析。
4.结果
表2各组样品对小鼠脏器/体重比值的影响
| 组别 | 脾脏指数(mg/g) | 胸腺指数(mg/g) |
| 空白对照组 | 7.432±0.342 | 3.405±0.429 |
| 模型组 | 4.897±0.513ΔΔ | 2.583±0.335ΔΔ |
| 对比例1组 | 5.543±0.418 | 2.883±0.385 |
| 对比例2组 | 5.498±0.552 | 2.769±0.236 |
| 对比例3组 | 5.572±0.332 | 2.773±0.441 |
| 实施例1组 | 6.621±0.425** | 3.287±0.316** |
| 实施例2组 | 6.801±0.329**# | 3.347±0.429** |
| 实施例3组 | 6.667±0.413** | 3.651±0.328**# |
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；与模型组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；与对比例组比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表2可知，腹腔注射环磷酰胺可导致实验小鼠的免疫器官脾脏和胸腺明显萎缩(P<0.01)，说明免疫低下模型建立成功。与模型组比较，本发明实施例1-3各组均能明显提高小鼠的脾脏指数、胸腺指数(P<0.01)；与对比例组比较，本发明实施例1-3各组提高小鼠的脾脏指数、胸腺指数的效果也优于对比例1-3各组。
表3各组样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
| 组别 | 吞噬率(％) | 吞噬指数 |
| 空白对照组 | 31.36±6.21 | 1.08±0.15 |
| 模型组 | 23.87±4.16Δ | 0.87±0.21 |
| 对比例1组 | 33.62±5.34* | 1.26±0.17 |
| 对比例2组 | 34.83±4.62* | 1.28±0.22 |
| 对比例3组 | 35.26±3.83* | 1.30±0.23 |
| 实施例1组 | 45.86±5.34**# | 3.53±0.32**# |
| 实施例2组 | 46.18±6.12**# | 3.48±0.27**#8 --> |
| 实施例3组 | 46.35±6.05**# | 3.58±0.22**# |
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；与模型组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；与对比例组比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表3可见，与模型组比较，本发明提供的实施例1-3各组均能明显提高小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数(P＜0.01)。本发明食药用菌功能性固体饮料产品对小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数效果也明显高于对比例1-3制备的固体饮料(P＜0.05)。
表4各组样品对小鼠对小鼠碳廓清能力的影响
| 组别 | 碳廓清吞噬指数 |
| 空白对照组 | 5.96±0.35 |
| 模型组 | 5.42±0.42Δ |
| 对比例1组 | 6.35±0.24 |
| 对比例2组 | 6.31±0.25 |
| 对比例3组 | 6.40±0.21 |
| 实施例1组 | 7.26±0.27*# |
| 实施例2组 | 7.18±0.34*# |
| 实施例3组 | 7.24±0.41*# |
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；与模型组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；与对比例组比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表4可见，与模型组比较，本发明提供的实施例1-3各组均能显著增强小鼠碳廓清能力(P＜0.05)。本发明食药用菌功能性固体饮料产品增强小鼠碳廓清能力效果也明显高于对比例1-3制备的固体饮料(P＜0.05)。
表5各组样品对小鼠NK细胞的影响
| 组别 | NK细胞活性(％) |
| 空白对照组 | 20.6±4.1 |
| 模型组 | 18.9±5.8 |
| 对比例1组 | 22.1±3.9 |
| 对比例2组 | 21.9±4.6 |
| 对比例3组 | 23.4±3.7 |
| 实施例1组 | 32.4±4.2**# |
| 实施例2组 | 33.1±5.3**# |
| 实施例3组 | 36.7±61**# |
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；与模型组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；与对比例组比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表5可见，与模型组比较，本发明提供的实施例1-3各组均能显著增加小鼠NK细胞活性(P＜0.01)。对比例1-3制备的固体饮料增加小鼠NK细胞活性不显著，效果明显低于本发明食药用菌功能性固体饮料产品(P＜0.05)。
表6各组样品对小鼠脾淋巴细胞增殖能力及迟发型变态反应(DTH)的影响
| 组别 | DTH(mm) | 淋巴细胞的增殖能力(OD差值) |
| 空白对照组 | 0.62±0.06 | 0.148±0.047 |
| 模型组 | 0.51±0.09 | 0.113±0.035Δ |
| 对比例1组 | 0.72±0.11* | 0.163±0.057 |
| 对比例2组 | 0.74±0.11* | 0.169±0.043 |
| 对比例3组 | 0.87±0.11* | 0.154±0.032 |
| 实施例1组 | 1.05±0.11**# | 0.224±0.027**# |
| 实施例2组 | 1.12±0.09**# | 0.237±0.019**# |
| 实施例3组 | 1.15±0.13**# | 0.228±0.032**# |
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；与模型组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；与对比例组比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表6可见，与模型组比较，本发明提供的实施例1-3各组均能显著增加免疫低下模型小鼠的足趾增厚(P＜0.01)。对比例1-3制备的固体饮料增加模型小鼠的足趾增厚效果也明显低于本发明食药用菌功能性固体饮料产品(P＜0.05)。与模型组比较，本发明提供的实施例1-3各组均能明显提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P＜0.01)。本发明食药用菌功能性固体饮料产品提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力效果也明显高于对比例1-3制备的固体饮料(P＜0.05)。
表7各组样品对小鼠抗体生成细胞及血清溶血素的影响
| 组别 | 半数溶血值(HC50) | 抗体生成细胞(AOD) |
| 空白对照组 | 108.35±4.52 | 0.624±0.025 |
| 模型组 | 72.95±5.32Δ | 0.412±0.031Δ |
| 对比例1组 | 76.23±2.64 | 0.472±0.021 |
| 对比例2组 | 78.91±3.95 | 0.462±0.033 |
| 对比例3组 | 77.32±4.08 | 0.459±0.042 |
| 实施例1组 | 96.35±3.42*# | 0.589±0.037*# |
| 实施例2组 | 92.54±4.81*# | 0.603±0.045*# |
| 实施例3组 | 91.38±5.23*# | 0.593±0.026*# |
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；与模型组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；与对比例组比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表7可见，与模型组比较，本发明提供的实施例1-3各组均能显著促进免疫抑制小鼠血清溶血素和抗体细胞的生成(P＜0.05)。本发明食药用菌功能性固体饮料产品促进免疫抑制小鼠血清溶血素和抗体细胞的生成的效果也明显高于对比例1-3制备的固体饮料(P＜0.05)。
通过以上实验结果表明，本发明提供的固体饮料能够显著提高小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数，增强小鼠碳廓清能力，增加小鼠NK细胞活性，提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，提高小鼠血清溶血素含量和迟发型变态反应水平，说明本发明提供的固体饮料具有明显的免疫促进和免疫增强的作用，能够辅助调理免疫功能低下，抵抗能力低等疾病。对比例1-3制备的固体饮料的免疫力增强的效果明显低于本发明产品，显示本发明工艺制备的菇类产品的功能活性效果好。
表8本发明食药用菌功能性固体饮料质量标准
本发明实施例1-3制备的食药用菌功能性固体饮料均符合表8中的质量标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种食药用菌功能性固体饮料，其特征在于，所述的饮料中功能成分的原料为食药用菌发酵产物浓缩液，所述的食药用菌功能性固体饮料的原料包含质量百分比为10％-100％的食药用菌发酵产物浓缩液，所述的食药用菌发酵产物浓缩液的制备方法，包括：
(1)将鸡腿菇菇柄、花菇菇柄分别洗净后干燥，粉碎，分别得到鸡腿菇菇柄粉、花菇菇柄粉；
(2)将鸡腿菇菇柄粉:花菇菇柄粉按照质量比1：3至6：1的比例混合，制成复合食用菌菇柄粉原料；
(3)取姬松茸菌种活化后的菌块、灵芝菌种活化后的菌块分别接种于液体种子培养基中，发酵培养，分别得到姬松茸液体菌种、灵芝液体菌种；所述的发酵培养的条件为：在22℃-30℃发酵培养72h-240h；
(4)向灭菌冷却后的发酵培养基中先接入占发酵培养基体积1％-20％的灵芝液体菌种进行第Ⅰ阶段发酵培养，然后再接入占发酵培养基体积1％-20％的姬松茸液体菌种进行第Ⅱ阶段共发酵培养，终止发酵后，升温搅拌，浸提后过滤、浓缩，得到食药用菌发酵产物浓缩液；所述的发酵培养基每升由步骤(2)制备的复合食用菌菇柄粉原料10g-50g、蔗糖1g-10g、玉米粉1g-8g、大豆粉1g-5g和余量的水组成；所述的第Ⅰ阶段发酵培养的条件为：在20℃-30℃发酵培养1天-8天；所述的第Ⅱ阶段共发酵培养的条件为：在18℃-28℃发酵培养1天-10天。
2.根据权利要求1所述的食药用菌功能性固体饮料，其特征在于，所述的鸡腿菇菇柄粉和花菇菇柄粉的目数均为40目-80目。
3.根据权利要求1所述的食药用菌功能性固体饮料，其特征在于，步骤(4)中，终止发酵后，升温至40℃-90℃，搅拌转速为40rpm-80rpm，浸提30min-120min后过滤。
4.根据权利要求1所述的食药用菌功能性固体饮料，其特征在于，所述的食药用菌发酵产物浓缩液中可溶性固形物的质量百分含量为30％-40％。
5.根据权利要求1所述的食药用菌功能性固体饮料，其特征在于，所述的食药用菌功能性固体饮料由以下质量百分比的原料制成：
食药用菌发酵产物浓缩液93.5％-99％；
麦芽糊精0.5％-6％；
柠檬酸0.02％-0.6％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的食药用菌功能性固体饮料的制备方法，其特征在于，包括：将所述的原料混合均匀后均质，经喷雾干燥，得到食药用菌功能性固体饮料。
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