CN106832041A - 一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海藻多糖的提取技术领域，提供了一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括海带研磨成浆液；浸泡；加入酸性纤维素酶、半纤维素酶；加碱性果胶酶；加蛋白酶；加入氯化钠和水，反应，得到褐藻酸钠胶状物；加入改性凹凸棒土；离心机分离；加入酒精，脱水，得到固相褐藻糖胶。本发明提供的褐藻糖胶提取方法，采用生物酶解法，基于海带细胞壁的结构和成分基础上，分阶段，适量地加相关酶，以使细胞壁彻底地裂解，将其中的褐藻糖胶充分的释放出来，以此提高褐藻糖胶的提取率；在提取过程中加入改性凹凸棒土进行脱色和去除腥味，使制品外观更加纯净；另外，简化提取步骤，减少化学原料的使用，达到环保的目的。
Description
技术领域
本发明属于海藻多糖的提取技术领域，具体地，涉及一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法。
背景技术
海藻是生长在海中的藻类，一般而言，藻类主要可分为绿藻、褐藻、红藻及蓝藻等四类，是植物界的隐花植物，藻类包括数种不同类以光合作用产生能量的生物。海藻富含营养成分和功能性成分，从海藻提炼出来的藻胶或海藻多糖具有特殊乳化性、凝胶性和药用价值、有增强免疫力及抗癌活性，因而逐渐应用于工业和医药产业中。
海藻多糖具有抑制病毒、降低胆固醇、降血糖及降血脂等效果。其中，褐藻糖胶是一种存在于所有褐藻中的细胞多糖。近年来的研究发现，褐藻糖胶具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抑制补体激活及吸收重金属等功能，为一种重要的机能性保健素材，可将其用于兽药的制备。因此，如何从海藻中萃取出褐藻糖胶为一重要课题。
褐藻糖胶萃取方法，
一种是为用乙醇、丙酮和氯仿进行预处理，接着将样品经脱脂、脱盐和干燥后得干粉，再以热水萃取得到粗萃物，最后将粗萃物进一步纯化可得褐藻糖胶。此方法所制备的褐藻糖胶的萃取率为干粉重量的6.5％。
一种是将藻体切成小片，浸在甲醛中，再以热水萃取得到粗萃物，最后将粗萃物进一步纯化可得褐藻糖胶。
一种是用甲醇预处理后，以盐酸萃取预处理物，离心后取沉淀物再次萃取，合并上清液，用氢氧化钠中和，真空蒸发至干后溶于0.5公升水而制备为粗萃物，最后将粗萃物进一步纯化可得褐藻糖胶。此方法所制备的褐藻糖胶的萃取率为干粉重量的27．2％。
现有的提取方法存在以下不足：
（1）以上方法不能彻底破坏细胞壁结构，而使细胞壁内的褐藻糖胶充分释放出来，提取率低；
（2）产品外观为浅黄色，不够美观，还留有藻腥味，影响制品的再次利用；
（3）使用大量的乙醇、丙酮、氯仿和甲醇等有机溶液无机溶液进行处理，不够环保。
生物酶解法具有针对性强，提取效率高的优点。目前国内利用生物酶解法提取褐藻糖胶方法还比较少，但也存在有效物质含量低的缺陷。
因此，如何发展一种可改善上述技术缺陷的褐藻糖胶提取方法，为相关技术领域急需解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法。
本发明提供的褐藻糖胶提取方法，采用生物酶解法，基于海带细胞壁的结构和成分基础上，分阶段，适量地加相关酶，以使细胞壁彻底地裂解，将其中的褐藻糖胶充分的释放出来，以此提高褐藻糖胶的提取率；在提取过程中加入改性凹凸棒土进行脱色和去除腥味，使制品外观更加纯净；另外，简化提取步骤，减少化学原料的使用，达到环保的目的。
根据本发明提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量5-7倍的水，搅拌均匀，浸泡12-36小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在4.5-6.5之间，温度控制在45-55℃之间，反应8-12小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.0-10.0之间，温度控制在40-70℃之间，反应7-12小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.0-9.0之间，温度控制在30-60℃之间，反应3-11小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5-7％的氯化钠和重量10-15 倍的水，在50-80℃的温度条件下，反应120-160分钟，得到褐藻酸钠胶状物；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其0.2-5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味20-40min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为90-94％的酒精，脱水15-30min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1。
优选地，所述步骤（3）中酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的9-11%。
优选地，所述步骤（4）中碱性果胶酶加入量为步骤（1）中加水后浆液重量的6-10%。
优选地，所述步骤（4）中蛋白酶加入量为步骤（1）中加水后浆液重量的3-7%。
优选地，步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在5.5之间，温度控制在48℃，反应9小时。
优选地，所述步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.5，温度控制在52℃，反应8小时。
优选地，所述步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.9，温度控制在42℃，反应7小时。
优选地，向所述步骤（7）得到的产品四中加入700-800U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的10-15％，搅拌均匀，再加质量浓度为8-9％的NaOH溶液，调pH至7-9，在20-45℃的温度条件下酶解反应3-4小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖。
优选地，所述加入酒精质量浓度为80-90%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明提供的褐藻糖胶提取方法，采用生物酶解法，基于海带细胞壁的结构和成分基础上，分阶段，适量地加酸性纤维素酶、半纤维素酶、碱性果胶酶、蛋白酶，以使细胞壁彻底地裂解，将其中的褐藻糖胶充分的释放出来，以此提高褐藻糖胶的提取率；
（2）本发明提取过程中使用到多种酶，如酸性纤维素酶、半纤维素酶、碱性果胶酶、蛋白酶等，由于酶的特性限制，其生物活性受到温度、PH值的因素的影响，本发明在酸性纤维素酶、半纤维素酶、碱性果胶酶、蛋白酶各自最适温度范围和PH范围条件下进行生物酶解，在各类酶生物活性最大的条件下提取褐藻糖胶，可最大程度地将褐藻糖胶从海带细胞壁中分离出来，提高提取率，且提取过程安全环保；
（3）本发明在提取过程中加入改性凹凸棒土进行脱色和去除腥味，使制品外观更加纯净；
（4）本发明简化提取步骤，减少化学原料的使用，达到环保的目的；
（5）本发明中使用的改性凹凸棒土，凹凸棒土是一种具有特殊层链状结构的天然纳米无机物，具有较大的比表面积，吸附性强，脱色能力强，吸附能力好，具有脱色率高、不含残留酸等诸多优点。凹凸棒石本身具有一定的L酸中心和B酸中心，通过改性后，可增强凹凸棒土的酸性，提高其与游离脂肪酸、蜡质、色素等杂质的结合能力，从而能有效地吸附油脂中的色素等杂质，是一种性能优异的吸附剂和脱色剂。本发明将其加入进行脱色和除腥，可使提取的褐藻糖胶外观好，无腥味；
（6）本发明提取的褐藻糖胶具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抑制补体激活及吸收重金属等作用，因此可用于兽药的制备。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供的褐藻糖胶提取方法，采用生物酶解法，基于海带细胞壁的结构和成分基础上，分阶段，适量地加相关酶，以使细胞壁彻底地裂解，将其中的褐藻糖胶充分的释放出来，以此提高褐藻糖胶的提取率；在提取过程中加入改性凹凸棒土进行脱色和去除腥味，使制品外观更加纯净；另外，简化提取步骤，减少化学原料的使用，达到环保的目的。
本发明提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量5-7倍的水，搅拌均匀，浸泡12-36小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在4.5-6.5之间，温度控制在45-55℃之间，反应8-12小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.0-10.0之间，温度控制在40-70℃之间，反应7-12小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.0-9.0之间，温度控制在30-60℃之间，反应3-11小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5-7％的氯化钠和重量10-15 倍的水，在50-80℃的温度条件下，反应120-160分钟，得到褐藻酸钠胶状物；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其0.2-5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味20-40min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为90-94％的酒精，脱水15-30min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1。
优选地，所述步骤（3）中酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的9-11%。
优选地，所述步骤（4）中碱性果胶酶加入量为步骤（1）中加水后浆液重量的6-10%。
优选地，所述步骤（4）中蛋白酶加入量为步骤（1）中加水后浆液重量的3-7%。
优选地，步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在5.5，温度控制在48℃，反应9小时。
优选地，所述步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.5，温度控制在52℃，反应8小时。
优选地，所述步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.9，温度控制在42℃，反应7小时。
优选地，向所述步骤（7）得到的产品四中加入700-800U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的10-15％，搅拌均匀，再加质量浓度为8-9％的NaOH溶液，调pH至7-9，在20-45℃的温度条件下酶解反应3-4小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖。
优选地，所述加入酒精质量浓度为80-90%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明提供的褐藻糖胶提取方法，采用生物酶解法，基于海带细胞壁的结构和成分基础上，分阶段，适量地加酸性纤维素酶、半纤维素酶、碱性果胶酶、蛋白酶，以使细胞壁彻底地裂解，将其中的褐藻糖胶充分的释放出来，以此提高褐藻糖胶的提取率；
（2）本发明提取过程中使用到多种酶，如酸性纤维素酶、半纤维素酶、碱性果胶酶、蛋白酶等，由于酶的特性限制，其生物活性受到温度、PH值的因素的影响，本发明在酸性纤维素酶、半纤维素酶、碱性果胶酶、蛋白酶各自最适温度范围和PH范围条件下进行生物酶解，在各类酶生物活性最大的条件下提取褐藻糖胶，可最大程度地将褐藻糖胶从海带细胞壁中分离出来，提高提取率，且提取过程安全环保；
（3）本发明在提取过程中加入改性凹凸棒土进行脱色和去除腥味，使制品外观更加纯净；
（4）本发明另外，简化提取步骤，减少化学原料的使用，达到环保的目的；
（5）本发明中使用的改性凹凸棒土，凹凸棒土是一种具有特殊层链状结构的天然纳米无机物，具有较大的比表面积，吸附性强，脱色能力强，吸附能力好，具有脱色率高、不含残留酸等诸多优点。凹凸棒石本身具有一定的L酸中心和B酸中心，通过改性后，可增强凹凸棒土的酸性，提高其与游离脂肪酸、蜡质、色素等杂质的结合能力，从而能有效地吸附油脂中的色素等杂质，是一种性能优异的吸附剂和脱色剂。本发明将其加入进行脱色和除腥，可使提取的褐藻糖胶外观好，无腥味；
（6）本发明提取的褐藻糖胶具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抑制补体激活及吸收重金属等作用，因此可用于兽药的制备。
实施例1
本实施例提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量7倍的水，搅拌均匀，浸泡12小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的11%，搅拌均匀，PH控制在4.5之间，温度控制在55℃之间，反应8小时，冷却，得产品一，由于PH控制在6.5，温度控制在45℃的时候，酸性纤维素酶、半纤维素酶的活性最高，因此酶解效果也是最好的，可将细胞壁中含有的纤维素酶解，从而破坏细胞壁，而使其中的褐藻糖胶释放出来；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，碱性果胶酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的10%，搅拌均匀，PH控制在8.0，温度控制在70℃，反应7小时，冷却，得产品二。细胞壁的化学组成是胞间层基本上是由果胶质组成，果胶质是细胞壁主要的成分，如果植物组织中的果胶质用果胶酶分解掉，细胞就会离散，因此本发明用果胶酶来酶解果胶质，使细胞壁离散，同时果胶酶的最高活性条件是PH在10.0，温度控制在40℃，在此条件下，酶解反应较为彻底，从而破坏细胞壁，而使其中的褐藻糖胶释放出来；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，蛋白酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的7%，搅拌均匀，PH控制在6.0，温度控制在60℃，反应3，冷却，得产品三。蛋白质也是细胞壁成分的重要组成部分，在PH为在9.0，温度控制在30℃条件下，蛋白酶的活性也是最高的，可以充分分解细胞壁中蛋白质，从而促进细胞壁的离散，而使其中的褐藻糖胶释放出来；
步骤（6）：向产品三中加入其重量6％的氯化钠和重量11 倍的水，在60℃的温度条件下，反应135分钟，得到褐藻酸钠胶状物。褐藻酸在一般情况下是不稳定的，将其与盐结合成盐可稳定存在；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其1.5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味25min，得产品四。一般工艺提取出来的褐藻糖胶是淡黄色的，外观不好，且具有海藻腥味，加入改性凹凸棒进行脱色和除腥，由于改性凹凸棒具有加大的比表面积，使其具有较强的吸附性，因此对褐藻糖胶的颜色和气味上具有很好的调节效果；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六。由于前面提取步骤中有各种酶残余，以及细胞壁离散后产生的杂质，因此需要进行离心除杂，以保留褐藻糖胶，保证其纯度；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为92％的酒精，脱水28min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1，通过酒精脱水，可提取纯度较高的褐藻糖胶。
向所述步骤（7）得到的产品四中加入750U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的12％，搅拌均匀，再加质量浓度为8％的NaOH溶液，调pH至7，在28℃的温度条件下酶解反应3小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖，所述加入酒精质量浓度为83%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。褐藻糖胶在褐藻糖胶裂解酶的作用下分解，可得到聚合度较低的低聚糖。
实施例2
本实施例提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量5倍的水，搅拌均匀，浸泡12小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的9%，搅拌均匀，PH控制在6.5，温度控制在45℃，反应12小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，碱性果胶酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的6%，搅拌均匀，PH控制在10.0，温度控制在40℃，反应12小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，蛋白酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的7%，搅拌均匀，PH控制在9.0，温度控制在30℃，反应11小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5％的氯化钠和重量13 倍的水，在55℃的温度条件下，反应130分钟，得到褐藻酸钠胶状物。褐藻酸在一般情况下是不稳定的，将其与盐结合成盐可稳定存在；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其3.5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味35min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为93％的酒精，脱水20min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1，通过酒精脱水，可提取纯度较高的褐藻糖胶。
向所述步骤（7）得到的产品四中加入700-800U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的12％，搅拌均匀，再加质量浓度为8％的NaOH溶液，调pH至7-9，在35℃的温度条件下酶解反应3小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖，所述加入酒精质量浓度为88%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。褐藻糖胶在褐藻糖胶裂解酶的作用下分解，可得到聚合度较低的低聚糖。
实施例3
本实施例提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量5-7倍的水，搅拌均匀，浸泡12-36小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的9-11%，搅拌均匀，PH控制在4.5-6.5之间，温度控制在45-55℃之间，反应8-12小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，碱性果胶酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的6-10%，搅拌均匀，PH控制在8.0-10.0之间，温度控制在40-70℃之间，反应7-12小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，蛋白酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的3-7%，搅拌均匀，PH控制在6.0-9.0之间，温度控制在30-60℃之间，反应3-11小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5-7％的氯化钠和重量10-15 倍的水，在50-80℃的温度条件下，反应120-160分钟，得到褐藻酸钠胶状物。褐藻酸在一般情况下是不稳定的，将其与盐结合成盐可稳定存在；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其0.2-5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味20-40min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为90-94％的酒精，脱水15-30min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1，通过酒精脱水，可提取纯度较高的褐藻糖胶。
向所述步骤（7）得到的产品四中加入700-800U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的10-15％，搅拌均匀，再加质量浓度为8-9％的NaOH溶液，调pH至7-9，在20-45℃的温度条件下酶解反应3-4小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖，所述加入酒精质量浓度为80-90%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。褐藻糖胶在褐藻糖胶裂解酶的作用下分解，可得到聚合度较低的低聚糖。
实施例4
本实施例提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量7倍的水，搅拌均匀，浸泡12小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在5.5之间，温度控制在48℃，反应9小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.5，温度控制在52℃，反应8小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.9，温度控制在42℃，反应7小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量7％的氯化钠和重量10倍的水，在80℃的温度条件下，反应120分钟，得到褐藻酸钠胶状物；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味20min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为94％的酒精，脱水15min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1。
所述步骤（3）中酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的11%。
所述步骤（4）中碱性果胶酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的6%。
所述步骤（4）中蛋白酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的7%。
向所述步骤（7）得到的产品四中加入800U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的10％，搅拌均匀，再加质量浓度为9％的NaOH溶液，调pH至7，在45℃的温度条件下酶解反应3小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖。
优选地，所述加入酒精质量浓度为90%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。
实施例5
本实施例提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量5倍的水，搅拌均匀，浸泡36小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在5.5之间，温度控制在48℃，反应9小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.5，温度控制在52℃，反应8小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.9，温度控制在42℃，反应7小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5％的氯化钠和重量15 倍的水，在50℃的温度条件下，反应160分钟，得到褐藻酸钠胶状物；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其0.2％的改性凹凸棒土，脱色除腥味40min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为90％的酒精，脱水30min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1。
所述步骤（3）中酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的9%。
所述步骤（4）中碱性果胶酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的10%。
所述步骤（4）中蛋白酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的3-7%。
向所述步骤（7）得到的产品四中加入700U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的15％，搅拌均匀，再加质量浓度为8％的NaOH溶液，调pH至9，在20℃的温度条件下酶解反应4小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖。
所述加入酒精质量浓度为80%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。
实施例6
本实施例提供的一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量6倍的水，搅拌均匀，浸泡30小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在5.5之间，温度控制在48℃，反应9小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.5，温度控制在52℃，反应8小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.9，温度控制在42℃，反应7小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5-7％的氯化钠和重量13 倍的水，在560℃的温度条件下，反应140分钟，得到褐藻酸钠胶状物；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其3％的改性凹凸棒土，脱色除腥味30min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为93％的酒精，脱水25min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1。
所述步骤（3）中酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的10%。
所述步骤（4）中碱性果胶酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的7%。
所述步骤（4）中蛋白酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的4%。
向所述步骤（7）得到的产品四中加入750U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的13％，搅拌均匀，再加质量浓度为9％的NaOH溶液，调pH至8，在35℃的温度条件下酶解反应3小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖。
所述加入酒精质量浓度为85%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.一种生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1）：海带预处理，清洗海带，切成小段、研磨成浆液；
步骤（2）：向浆液中加入浆液重量5-7倍的水，搅拌均匀，浸泡12-36小时后，将浆液转入酶解容器内；
步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在4.5-6.5之间，温度控制在45-55℃之间，反应8-12小时，冷却，得产品一；
步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.0-10.0之间，温度控制在40-70℃之间，反应7-12小时，冷却，得产品二；
步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.0-9.0之间，温度控制在30-60℃之间，反应3-11小时，冷却，得产品三；
步骤（6）：向产品三中加入其重量5-7％的氯化钠和重量10-15 倍的水，在50-80℃的温度条件下，反应120-160分钟，得到褐藻酸钠胶状物；
步骤（7）：向褐藻酸钠胶状物加入重量为其0.2-5％的改性凹凸棒土，脱色除腥味20-40min，得产品四；
步骤（8）：将得到的产品四通过离心机分离出残渣，得到产品五；用适量水洗涤残渣，再次离心，得到产品六；
步骤（9）：向产品六加入质量浓度为90-94％的酒精，脱水15-30min，得到固相褐藻糖胶，酒精与产品六的体积比为1.5∶1。
2.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中酸性纤维素酶、半纤维素酶加入量分别为步骤（1）中加水后浆液重量的9-11%。
3.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：所述步骤（4）中碱性果胶酶加入量为步骤（1）中加水后浆液重量的6-10%。
4.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：所述步骤（4）中蛋白酶加入量为步骤（1）中加水后浆液重量的3-7%。
5.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：步骤（3）：向酶解容器内加入酸性纤维素酶、半纤维素酶，搅拌均匀，PH控制在5.5，温度控制在48℃，反应9小时。
6.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：所述步骤（4）：向产品一加碱性果胶酶，搅拌均匀，PH控制在8.5，温度控制在52℃，反应8小时。
7.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：所述步骤（5）：向产品二加蛋白酶，搅拌均匀，PH控制在6.9，温度控制在42℃，反应7小时。
8.根据权利要求1所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：向所述步骤（7）得到的产品四中加入700-800U/g褐藻糖胶裂解酶进行酶解，加入量为产品四重量的10-15％，搅拌均匀，再加质量浓度为8-9％的NaOH溶液，调pH至7-9，在20-45℃的温度条件下酶解反应3-4小时，得到褐藻胶裂解酶酶解液，将褐藻胶裂解酶酶解液通过离心机分离获得滤液，将滤液用酒精脱水得到固相褐藻糖胶寡糖。
9.根据 权利要求8所述的生物酶解法提取褐藻糖胶的方法，其特征在于：所述加入酒精质量浓度为80-90%，酒精与滤液的体积比为1.4∶1。
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