CN109136303A - 一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，包括如下步骤：(1)干海带浸泡脱盐后加水匀浆，得到海带浆；(2)对海带浆进行酸处理；(3)酸处理后的海带浆添加纤维素酶和褐藻胶裂解酶进行复合酶处理，复合酶处理后灭酶获得酶解液；(4)将酶解液离心，向上清液中添加蔗糖并接种乳酸菌进行发酵；(5)发酵后灭菌、离心，取上清液干燥即得海藻膳食纤维。本发明方法步骤简单，制备的海藻膳食纤维得率高，褐藻胶寡糖含量高，并且对油脂、胆固醇具有良好的吸附作用。
Description
技术领域
本发明涉及膳食纤维制备技术领域，更具体的说是涉及一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法。
背景技术
膳食纤维在人体中具有独特的营养功能，能够促进肠胃蠕动，缓解便秘，整合胆固醇，预防高胆固醇血症和动脉硬化，是除了水、蛋白质、糖类、脂类、维生素、矿物质六大营养素之外的第七营养素。目前，研究较多的主要是陆生植物膳食纤维如谷物、果蔬膳食纤维，对海藻膳食纤维的研究相对较少；海带营养价值很高，富含褐藻胶、膳食纤维和矿物质等，是生产膳食纤维的良好来源。
海带富含褐藻胶，主要是大分子量褐藻胶，其可作为凝固剂、增稠剂、稳定剂等应用于食品、医药和化工领域，但不易被人体消化吸收，因此在应用方面受到很大限制；采用合适方法将海带中的大分子量褐藻胶水解，得到的褐藻胶寡糖有利于人体吸收，并且具有降血糖降血脂、抗炎抗氧化、调节免疫等作用，可作为糖尿病、肥胖症、便秘患者的疗效食品。
目前已有的海藻膳食纤维只是经过简单的物理粉碎，加工制备成不溶性海藻粉，不仅海藻腥味重，而且大部分营养成分无法充分释放，不能被人体吸收；制备的活性海藻提取物中褐藻胶寡糖含量较少，需要外源添加；因此，如何提供一种简单方便，膳食纤维得率高，并且富含功能性褐藻酸寡糖的海藻膳食纤维的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，制备的海藻膳食纤维得率高，褐藻胶寡糖含量高，并且对油脂、胆固醇具有良好的吸附作用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)干海带浸泡脱盐后加水匀浆，得到海带浆；
(2)对海带浆进行酸处理；
(3)酸处理后的海带浆添加纤维素酶和褐藻胶裂解酶进行复合酶处理，复合酶处理后灭酶获得酶解液；
(4)将酶解液离心，向上清液中添加蔗糖并接种乳酸菌进行发酵；
(5)发酵后灭菌、离心，取上清液干燥即得海藻膳食纤维。
优选地，加水匀浆步骤中按照海带干物质与水重量比为1:15-1:30的比例进行匀浆。
优选地，酸处理条件为：pH 3-4，100-120℃条件下处理20-40min。酸处理有利于后续酶解作用。
优选地，纤维素酶添加量为海带干物质的1％-3％，于pH 4.5-5.5、50℃条件下酶解4-6h。
优选地，纤维素酶为Celluclast BG与Viscozyme L 1:1重量比混合物。
选择纤维素酶对酸处理后的海带浆进行酶解，可降解细胞壁，加快内容物的溶出，其中，Celluclast BG可水解纤维素中的(1,4)-β-D-葡萄糖苷键和其他β-D-葡聚糖，Viscozyme L中的内切-β-葡聚糖酶可水解β-D-葡聚糖的1,3-或1,4-键。
优选地，褐藻胶裂解酶添加量为海带干物质的1％-6％，于pH 6.5-7.5、45℃条件下酶解4-6h。
优选地，褐藻胶裂解酶基因序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，步骤(4)中向酶解液中添加重量百分比为1％-2％的蔗糖，接种1％-3％的乳酸菌，在37℃液体发酵状态下发酵6-12h。
乳酸菌发酵可使海藻膳食纤维脱腥，获得良好风味。
优选地，海藻膳食纤维得率大于60％，每克海藻膳食纤维中功能性褐藻胶寡糖含量大于170mg。
进一步优选地，海藻膳食纤维得率大于78％，每克海藻膳食纤维中功能性褐藻胶寡糖含量大于200mg。
优选地，制得的海藻膳食纤维的油脂吸附力大于2g/g，在酸性条件下对胆固醇的吸附力大于20mg/g，在中性条件下对胆固醇的吸附力大于3mg/g。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，对海带浆进行酸处理后加入纤维素酶及褐藻胶裂解酶进行复合酶解，酶解液离心取上清接种乳酸菌进行发酵脱腥，离心除去不溶性杂质，将上清液干燥得到海藻膳食纤维。本发明方法步骤简单，易于工业化生产，制备的海藻膳食纤维得率高，褐藻胶寡糖含量高，并且对油脂、胆固醇具有良好的吸附作用。
附图说明
下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为实施例3褐藻酸寡糖质谱图。
图2附图为实施例3褐藻胶寡糖GPC检测结果。
图3附图为对比例2褐藻胶寡糖GPC检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.褐藻胶裂解酶的制备
根据褐藻胶裂解酶基因序列SEQ ID NO:1设计上游引物F1和下游引物F2：
F1：5’-ATGAAAGTAAGTTGCGCTGTC-3’(SEQ ID NO:2)；
R1：5’-TTAATCGTGCGACTGCTCC-3’(SEQ ID NO:3)；
PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因全序列；EcoR I和Hind III酶切扩增序列与大肠杆菌表达载体pProEXHTa，T4连接酶连接，转入大肠杆菌BL21中。
选取大肠杆菌重组菌，接种到含90μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床160r/min培养12h；以2％接种量接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃中摇床160r/min中培养至OD600为0.5-0.8时，加入终浓度为0.4％的乳糖转至28℃摇床中160r/min培养34h，4800r/min离心20min得到上清液即褐藻胶裂解酶。
2.海藻膳食纤维的制备
含盐干海带过夜浸泡脱盐，用绞肉机搅碎，取4kg海带碎块(含水量为91.25％，即海带干物质为350g)，加入6kg水匀浆，得到海带浆。
向海带浆中加入5M HCl调节pH至3.8，120℃处理0.5h。
酸处理后的海带浆使用5M NaOH调节pH至5.0，添加Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)进行50℃酶解，CelluclastBG和Viscozyme L(诺维信)重量比1:1，共10.5g，分三次加入，每次添加3.5g，每2h添加一次，共酶解6h；调节pH 7.0，加入褐藻胶裂解酶进行45℃酶解，褐藻胶裂解酶用量21ml，分三次加入，每次加入7ml，每2h添加一次，共酶解6h。
升温至90℃，灭酶10min；4000r/min离心20min，上清液中固形物含量为230g。
此时酶解上清液含有明显的海藻味，故加入上清液重量1％的蔗糖，并且按3％的接种量接入干酪乳杆菌菌液(活菌数为2.0×108cfu/ml)，37℃发酵6h进行脱腥。
发酵后90℃保持10min灭菌，4000r/min离心20min，将上清液旋蒸浓缩至固形物含量20％左右，喷雾干燥得海藻膳食纤维。
膳食纤维得率(％)＝酶解后上清液固形物量/海带干物质量×100％＝230g/350g×100％＝65.7％。
寡糖得率(mg/g)＝膳食纤维寡糖含量(mg)/膳食纤维质量(g)＝208mg/1.2g＝173mg/g。
实施例2
褐藻胶裂解酶的制备同实施例1。
将干海带清洗、浸泡至无咸味，剪成小方块备用，测得海带块干物质含量为50g；加入1500g蒸馏水打碎匀浆，得到海带浆。
用5M HCl调节海带浆pH至3.5左右，120℃处理20min。
酸处理后的海带浆使用5M NaOH调节pH至5.0左右，添加Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)进行50℃酶解，Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)重量比1:1，共1.5g，分三次加入，每次添加0.5g，每1-2h添加一次，共酶解5h；用5M NaOH调节pH 6.5左右，加入褐藻胶裂解酶进行45℃酶解，褐藻胶裂解酶用量1.5ml，分三次加入，每次加入0.5ml，每1.5-2h添加一次，共酶解5h。
90℃10min灭酶，4000r/min离心20min，向上清液中加入1％重量的蔗糖，并且按2％的接种量接入干酪乳杆菌菌液(活菌数为2.0×108cfu/ml)，37℃发酵12h。
90℃保持10min灭菌，4000r/min离心20min，将上清液旋蒸浓缩至固形物含量20％左右，冷冻干燥得海藻膳食纤维。
按实施例1计算海藻膳食纤维得率为78％，每克海藻膳食纤维中功能性褐藻胶寡糖含量为180mg；
测定海藻膳食纤维的体外油脂吸附能力和胆固醇吸附能力：
(1)油脂吸附力
取3g左右海藻膳食纤维于洁净离心管中(W1)，加入花生油24g，搅匀，37℃静置1h，4000r/min离心20min，去上层油，吸干残油，称重得吸油后膳食纤维重W2；
油脂吸附力(g/g)＝(W2—W1)/W1＝(8.901-2.910)/2.910＝2.05g/g
(2)胆固醇吸附能力
取新鲜蛋黄，加9倍重量蒸馏水搅打均匀；取25g稀释蛋黄液，加入0.5g膳食纤维，搅拌均匀，置于两管中，分别调节pH 2(模拟胃环境)和pH 7(模拟小肠环境)，37℃震荡3h，4000r/min离心20min，取0.04ml上清，采用邻苯二甲醛法在550nm比色测定胆固醇；
胆固醇吸附量(mg/g)＝(吸附前蛋黄液中胆固醇量—吸附后上清液中胆固醇量)/膳食纤维质量
制得的膳食纤维在酸性和中性条件下对胆固醇的吸附力分别为20.30mg/g和3.31mg/g。
实施例3
褐藻胶裂解酶的制备同实施例1。
干海带过夜浸泡脱盐，60℃烘干，粉碎，过80目筛；取800g烘干海带粉，料水比1:25充分溶解，得到海带浆。
向海带浆中加入5M HCl调节pH至3.0，100℃处理40min。
酸处理后的海带浆使用5M NaOH调节pH至5.0，添加Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)进行50℃酶解，Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)重量比1:1，共9g，分三次加入，每次添加3g，每1h添加一次，共酶解4h；再使用5MNaOH调节pH至7.0，加入褐藻胶裂解酶进行45℃酶解，褐藻胶裂解酶用量48ml，分三次加入，每次加入16ml，每2h添加一次，共酶解6h。
90℃10min灭酶，4000r/min离心20min，向上清液中加入2％重量的蔗糖，并且按1％的接种量接入干酪乳杆菌菌液(活菌数为2.0×108cfu/ml)，37℃发酵8h。
90℃保持10min灭菌，4000r/min离心20min，上清液70℃旋蒸，浓缩至固形物含量10％左右，离心去除沉淀后，将上清液进行5倍醇沉，离心，将沉淀冻干后进行质谱分析和GPC检测，结果如图1、图2所示，制备的海藻膳食纤维富含功能性褐藻胶寡糖，以二糖、三糖、四糖为主；另外还有少量的五、六糖。每克海藻膳食纤维中功能性褐藻胶寡糖含量为200mg。
对比例1
褐藻胶裂解酶的制备同实施例1。
含盐干海带过夜浸泡脱盐，用绞肉机搅碎，取4kg海带碎块(含水量为91.25％，即海带干物质为350g)，加入6kg水匀浆，得到海带浆。
使用5MNaOH将海带浆pH调节至5.0，添加Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)进行50℃酶解，Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)重量比1:1，共10.5g，分三次加入，每次添加3.5g，每2h添加一次，共酶解6h；调节pH7.0，加入褐藻胶裂解酶进行45℃酶解，褐藻胶裂解酶用量21ml，分三次加入，每次加入7ml，每2h添加一次，共酶解6h。
升温至90℃，灭酶10min；4000r/min离心20min，上清液中固形物含量为143g。
膳食纤维得率(％)＝酶解后上清液固形物量/海带干物质量×100％＝143g/350g×100％＝40.9％。
对比例2
褐藻胶裂解酶的制备同实施例1。
干海带过夜浸泡脱盐，60℃烘干，粉碎，过80目筛；取800g烘干海带粉，料水比1:25充分溶解，得到海带浆。
向海带浆中加入5M HCl调节pH至4.0，100℃处理40min。
酸处理后的海带浆使用5M NaOH调节pH至5.0，添加Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)进行50℃酶解，Celluclast BG和Viscozyme L(诺维信)重量比1:1，共9g，分三次加入，每次添加3g，每1h添加一次，共酶解4h。
90℃10min灭酶，4000r/min离心20min，向上清液中加入2％重量的蔗糖，并且按1％的接种量接入干酪乳杆菌菌液(活菌数为2.0×108cfu/ml)，37℃发酵8h。
90℃保持10min灭菌，4000r/min离心20min，上清液70℃旋蒸，浓缩至固形物含量10％左右，离心去除沉淀后，将上清液进行5倍醇沉，离心，将沉淀冻干后进行GPC检测，结果如图3所示，与实施例3相比，对比例2有大分子糖存在，分子量为5500左右，且功能性褐藻胶寡糖峰面积减小，说明含量明显降低。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
atgaaagtaa gttgcgctgt cgtactgtct gcttgtattg ccagtgccaa cgcagacaac 60
aatggcgatg gcaaggccga ctccatcaag gaaaatgacc tgaatgcagg ctatgcagat 120
ggcacctact tctatactgc tgccgatggc ggcatggtgt tccgctgccc gatcgatggc 180
tataaaacat cgaccaacac gtcctatacc cgcaccgagc tgcgcgagat gctacgtcgt 240
ggcgacacca gcattgccac ccagggggtc aatggaaaca actgggtatt cggctccgca 300
cccgcttcgg cacgtgaagc agccggcggt gtcgacggtg ttttacgcgc aaccctcgcg 360
gtaaaccatg tcaccactac cggagatagc ggccaggttg gacgggtgat tgttggacag 420
attcacgcca acaacgacga accgctgcgt ctttactacc gcaagttacc gggccacagc 480
aaaggttctg tgtatatcgc ccatgagcca aacggcggca gcgacagctg gtacgacatg 540
attggcagcc gttccagcag cgcctcggac ccgtccgacg gtatcgcact ggatgaagtc 600
tggagctacg aggtcaaggt tgtcggtaac accctcaccg tgaccatctt ccgtgctggt 660
aaagacgatg tggtacaggt tgtggatatg ggcaacagcg gttacgacgt cgccgaccag 720
taccagtact tcaaggccgg ggtgtacaac cagaacaaca ccggcaatgc cagtgactat 780
gtccaggtga ccttctacgc cctggagcag tcgcacgatt aa 822
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
atgaaagtaa gttgcgctgt c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ttaatcgtgc gactgctcc 19
Claims (10)
1.一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)干海带浸泡脱盐后加水匀浆，得到海带浆；
(2)对海带浆进行酸处理；
(3)酸处理后的海带浆添加纤维素酶和褐藻胶裂解酶进行复合酶处理，复合酶处理后灭酶获得酶解液；
(4)将酶解液离心，向上清液中添加蔗糖并接种乳酸菌进行发酵；
(5)发酵后灭菌、离心，取上清液干燥即得海藻膳食纤维。
2.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述加水匀浆步骤中按照海带干物质与水重量比为1:15-1:30的比例进行匀浆。
3.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述酸处理条件为：pH 3-4，100-120℃条件下处理20-40min。
4.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶添加量为海带干物质的1％-3％，于pH 4.5-5.5、50℃条件下酶解4-6h。
5.根据权利要求1或4所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶为CelluclastBG与Viscozyme L 1:1重量比混合物。
6.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶添加量为海带干物质的1％-6％，于pH 6.5-7.5、45℃条件下酶解4-6h。
7.根据权利要求1或6所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因序列如SEQ ID NO:1所示。
8.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中向酶解液中添加重量百分比为1％-2％的蔗糖，接种1％-3％的乳酸菌，在37℃液体发酵状态下发酵6-12h。
9.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，海藻膳食纤维得率大于60％，每克海藻膳食纤维中功能性褐藻胶寡糖含量大于170mg。
10.根据权利要求1所述的一种富含褐藻胶寡糖的海藻膳食纤维的制备方法，其特征在于，制得的海藻膳食纤维的油脂吸附力大于2g/g，在酸性条件下对胆固醇的吸附力大于20mg/g，在中性条件下对胆固醇的吸附力大于3mg/g。
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