CN106008730A - 一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法 - Google Patents

一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法，包括以下步骤：首先将海带原料进行粉粹、加水浸泡；然后加入复合酶A进行一步复合酶解，再加入复合酶B进行二步复合酶解；灭酶活，进行固液分离，得到的固体即为海带膳食纤维粗品，得到的液体用来提取海藻酸、褐藻糖胶和甘露醇；其中，所述酶A包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶等中的任意四种或四种以上；所述复合酶B包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或任意两种。本发明最突出的有益效果采用上述专用复合酶解技术能够从海带中同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和功能性膳食纤维四种产品。

Description

一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法
技术领域
本发明涉及一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法，属于海洋资源深加工技术领域。
背景技术
海带是食药两用的褐藻类植物，其营养很丰富，富含多种对人体有益的活性成分如碘、甘露醇、海藻酸、褐藻糖胶、膳食纤维、多种维生素以及钙、铁等。我国是海带资源与综合利用大国，海带是我国非常重要的海洋植物资源，是褐藻工业的主要原料之一，已经形成了以海藻酸、甘露醇、碘为主要产品的褐藻工业产品体系。但是由于我国目前海带加工业以粗加工为主，精深加工及合理有效的综合利用海带资源的成熟生产工艺路线相对缺乏的现状造成海带的综合利用率仅在30％(按干物质计)左右，还有50％以上的海带活性成分作为废弃物未得到充分的利用。不但浪费了大量的海带资源，而且带来了一系列的环境污染问题。
多年来，国内外特别是我国对于海带的开发一直是碘、海藻酸和甘露醇的“老三样”，产业总体上处于低档次、低水平、低附加值、低效益的状态，产品和企业市场竞争力较弱。因此开发提高海带资源综合利用率高、产品附加值高、工艺技术水平高的海带加工技术路线是行业工作者当前的首要课题。近年来，随着生物工程技术的快速发展，生物酶制剂在工业领域应用日趋成熟。生物酶制剂以其反应快速、条件温和等优点，将其应用于海带加工领域的研究和专利逐渐增多。但目前相关报道结果：采用酶解的方法，海带的多种功能性成分提取率不高，且提取种类少，多为1～2种，海带综合利用率并不突出，例如：文献“用复合酶酶解提取海带岩藻聚糖硫酸酯的工艺研究”(作者何云海)，申请号为201310621906.0的中国专利“一种酶解法提取海藻酸钠的方法”等。因此需要能够高效、多种功能性产品同时提取的海带综合利用专用酶解工艺技术。
发明内容
针对目前生物酶制剂在海带加工领域应用效率低、功能性产品提取效果不好、技术体系不成熟等不足，本发明通过大量的研究解决了上述难题，提供了一种可同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维四种功能性产品的高效海带综合利用专用复合酶解提取技术。
本发明采用的技术方案如下：
一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法，包括以下步骤：
首先将海带原料进行粉粹、加水浸泡；然后加入复合酶A进行一步复合酶解，再加入复合酶B进行二步复合酶解；再将二步复合酶解之后的酶解液灭酶活，进行固液分离，得到的固体即为海带膳食纤维粗品，得到的液体用来提取海藻酸、褐藻糖胶和甘露醇；其中，所述酶A包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、碱性纤维素酶、戊聚糖酶、葡聚糖酶、阿魏酸酯酶中的任意四种或四种以上；所述复合酶B包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或任意两种。
优选的，得到的液体用来提取海藻酸、褐藻糖胶和甘露醇的方法包括：所述液体采用氯化钙溶液沉淀法分离得到海藻酸钙产品；然后将沉淀分离海藻酸钙后的上清液进行醇沉得到褐藻糖胶粗品；再将醇沉分离褐藻糖胶的上清液经除杂、脱盐、脱乙醇，得到甘露醇成品。
具体的操作步骤如下：
(1)原料预处理：将海带原料进行粉粹，然后将粉碎后的原料加入设定比例的水混匀、浸泡；
(2)一步复合酶解：向步骤(1)中浸泡后的料液中加入复合酶A进行酶解反应；
(3)二步复合酶解：向步骤(2)中的酶解液加入复合酶B继续进行二次酶解反应；
(4)将步骤(3)中的酶解液灭酶活；
(5)固液分离：将灭酶活的料液进行固液分离，得到的固体为海带膳食纤维粗品，得到的液体用于后续的分离提取；
(6)沉淀海藻酸：向步骤(5)中的液体加入过量的氯化钙溶液，所得沉淀为海藻酸钙产品，得到的液体用于后续分离提取；
(7)除Ca2+：向步骤(6)中的液体加入过量的Na2CO3溶液，混匀，过滤去除沉淀，所得液体用于后续的分离提取；
(8)向步骤(7)中的液体加入乙醇溶液进行沉淀，所得沉淀为褐藻糖胶粗品，所得液体用于后续分离提取；
(9)分离提取甘露醇：步骤(8)的液体经超滤除杂、纳滤浓缩脱盐脱乙醇，干燥得到甘露醇成品。
步骤(1)中，所述原料包括干海带、鲜海带或者海带裙边、海带根等海带工业废弃物。
本发明中的海带原料干料粉碎至粒度20～40目，湿料粉碎至颗粒直径小于2mm。
优选的，料水比为：干料1:15～1:30；湿料1:10～1:20。
优选的，浸泡时间为1～2h。
步骤(2)中，优选的，所述一步复合酶解时间为12-18h。
优选的，一步复合酶解温度为：50～55℃。
优选的，一步复合酶解pH为：4.7～5.1。
优选的，复合酶A的添加量为：0.2％～0.8％(以海带干重计)。
优选的，所述复合酶A是由下述重量百分比的成分组成的：纤维素酶：20％～55％；半纤维素酶：10％～40％；果胶酶：0-30％；淀粉酶：0～2％；木聚糖酶：0～20％；碱性纤维素酶：0～10％；戊聚糖酶：0～10％；β-葡聚糖酶：0～5％；阿魏酸酯酶：0～2％，其中所述果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、碱性纤维素酶、戊聚糖酶、β-葡聚糖酶和阿魏酸酯酶中的重量百分比至少两个不为零。海带产品中的有效成分复杂，本发明基于对海带中四种有效成分的考虑，为最大程度的减少活性成分降解，优选上述配比关系各酶制剂组成的酶A，使得四种有效物质的提取效果较好。
进一步优选的，本发明中所述复合酶A中组分的酶活性如下纤维素酶：50万U/g；半纤维素酶：10万U/g；果胶酶：30万U/g；淀粉酶：10000U/g；木聚糖酶：10万U/g；戊聚糖酶：10万U/g；β-葡聚糖酶：20万U/g；碱性纤维素酶：10万U/g；阿魏酸酯酶：1000U/g。
步骤(3)中，优选的，所述二步复合酶解的时间为1～2h。
优选的，二步复合酶解温度为：50～60℃。
优选的，二步复合酶解pH为：7.0～8.5。
优选的，复合酶B的添加量为：0.05％～0.15％(以海带干重计)。
优选的，本发明中所述复合酶B中组分的酶活性如下：碱性蛋白酶：50万U/g；中性蛋白酶：10万U/g；木瓜蛋白酶：80万U/g；胰蛋白酶：50万U/g；酸性蛋白酶：80万U/g；胃蛋白酶10万U/g。
步骤(4)中，具体的灭酶活的方法为：将步骤(3)中完成二步复合酶解的料液加热至80～90℃(优选的90℃)，保温30～60min，灭酶活后降温至室温。
步骤(5)中，具体的固液分离方法为：将灭酶活并降温后的料液进行固液分离，4000～6000r/min离心10～15min(优选10min)，并用水洗涤沉淀，4000～6000r/min离心10～15min(优选10min)，所得沉淀为海带膳食纤维粗品，合并所有离心所得上清液用于后续分离提取。
步骤(6)中，具体沉淀海藻酸的方法为：向步骤(5)中所得液体中加入过量的CaCl2溶液，充分混合均匀后，4000～6000r/min离心15～20min(优选15min)，并用上清液设定体积倍数的水(1～2倍)洗涤沉淀数次(优选两次)，4000～6000r/min离心15～20min(优选15min)，所得沉淀用体积分数为90～95％(优选95％)乙醇溶液洗涤，干燥后为海藻酸钙产品，合并所有离心所得上清液用于后续分离提取。
步骤(7)中，除Ca2+之后进行浓缩，除Ca2+、浓缩的具体方法为：向步骤(6)中液体加入过量的Na2CO3溶液沉淀反应后，采用4000～6000r/min离心15～20min(优选15min)，并用上清液设定倍数体积的水(优选1～2倍)洗涤沉淀若干次(优选两次)，去沉淀，合并所有离心所得上清液用盐水调pH至中性并将体积浓缩10～15倍，以减少后续分离提取所需乙醇用量。
步骤(8)中，向步骤(7)中所得浓缩液中加入4～6倍体积的90～95％(优选95％)乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，4000～6000r/min离心15～20min(优选15min)，所得沉淀用适量体积的90～95％(优选95％)乙醇溶液洗涤若干次(优选两次)，所得沉淀为褐藻糖胶粗品，合并所有离心所得上清液，用于后续分离提取甘露醇。
本发明经过大量实验验证与分析，选择合适的酶制剂与添加量进行复合酶解，并创新性的将复合生物酶提取技术应用于海带工业副产品的高值化利用，显著提高目标产品得率，减少活性成分降解，建立了最大程度的同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和功能性膳食纤维四种产品的高效率、低能耗、清洁型生产技术。
采用本发明的复合酶A和复合酶B的两次酶解技术，使得四种活性成分的提取率均能达到90％以上，相比于现有技术中的其他酶制剂在海带降解中的应用，本发明采用所述复合酶系不仅得到的活性成分的种类多，而且各活性成分的提取率也较高。另外，经过上述优化后的工艺条件和参数，使得提取效果更加优异。
本发明的有益效果是：
(1)本发明是专用于海带综合利用的复合酶解技术，可以有效处理鲜海带、干海带、海带加工废弃物等各种类型的海带底物，实现了海带资源的高效综合利用。
(2)本发明最突出的有益效果采用上述专用复合酶解技术能够从海带中同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和功能性膳食纤维四种产品，且四种活性成分的提取率均达到90％(以海带干重计)以上，这显著提高了海带资源的综合利用率，极大的增加了海带加工产业的产品附加值，提高相关产品的技术水平。
(3)本发明技术采用原料预处理技术，大大降低了酶解时间，与现有酶解技术相比能耗降低50％以上同时提高了目标产物的提取率。
(3)本发明技术采用食品级生物复合酶解，反应条件温和、迅速，安全可靠，极大程度降低酸碱的使用量，对于提高相关食品安全和环境保护有显著效果。
(4)本发明的技术工艺简单、安全、易于操作和控制，非常适合工业化大规模生产，提高海带产业经济效益。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)原料
以干海带为原料。
(2)原料预处理
将海带原料粉碎至颗粒度40目左右；
将粉碎后的原料按料水比1:20加水充分混合均匀后，静置浸泡2h。
(3)一步复合酶解
将步骤(2)中静置浸泡完的料液加热至53℃，调节料液pH至4.9，添加复合酶A0.5％(以海带干重计)，维持温度53℃酶解14h，所述酶A是由以下质量分数的组分组成：纤维素酶50％，半纤维素酶30％，果胶酶5％，淀粉酶1％，木聚糖酶14％。
(4)二步复合酶解
将步骤(3)中所得一步复合酶解液加热至58℃，调节其pH至7.8，添加复合酶B 0.15％(以海带干重计)，维持温度58℃酶解1.5h，复合酶B的组成为：碱性蛋白酶70％，中性蛋白酶30％。
(5)灭酶活
将步骤(4)中完成二步复合酶解的料液加热至90℃，保温45min，灭酶活后降温至室温。
(6)固液分离
将灭酶活并降温后的料液进行固液分离，5000r/min离心10min，并用1.5倍体积的水洗涤沉淀两次，5000r/min离心10min，所得沉淀为海带膳食纤维粗品，合并3次离心所得上清液用于后续分离提取。
(7)沉淀海藻酸
向步骤(6)中所得上清液中加入过量的CaCl2溶液，充分混合均匀后，5000r/min离心15min，并用上清液1倍体积的水洗涤沉淀两次，5000r/min离心15min，所得沉淀用95％乙醇溶液洗涤，烘干后为海藻酸钙产品，合并三次离心所得上清液用于后续分离提取。
(8)除Ca2+并浓缩
向步骤(7)中所得上清液中加入过量的Na2CO3溶液，充分混合均匀沉淀除去Ca2+，5000r/min离心15min，并用上清液1倍体积的水洗涤沉淀两次，去沉淀，合并3次离心所得上清液用盐水调pH至中性并将体积浓缩10～15倍，以减少后续分离提取所需乙醇用量。
(9)沉淀褐藻糖胶
向步骤(8)中所得浓缩液中加入5倍体积的95％乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，6000r/min离心15min，所得沉淀用适量95％乙醇溶液洗涤两次，所得沉淀为褐藻糖胶粗品，合并三次离心所得上清液，用于后续分离提取甘露醇。
(10)分离提取甘露醇
步骤(9)所得上清液经超滤除杂、纳滤浓缩脱盐脱乙醇，干燥得甘露醇成品。
(11)通过以上步骤最终以海带干物质计褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的综合提取率在93.5％，海带资源的综合利用率达到83.2％。
实施例2
(1)原料
以鲜海带为原料。
(2)原料预处理
将海带原料粉碎颗粒直径小于2mm；
将粉碎后的原料按料水比1:10加水充分混合均匀后，静置浸泡1h。
(3)一步复合酶解
将步骤(2)中静置浸泡完的料液加热至54℃，调节料液pH至5.0，添加复合酶A0.6％(以海带干重计)，维持温度54℃酶解15h，所述酶A是由以下质量分数的组分组成：纤维素酶48％，半纤维素酶40％，淀粉酶0.8％，木聚糖酶8％，戊聚糖酶3.2％。
(4)二步复合酶解
将步骤(3)中所得一步复合酶解液加热至57℃，调节其pH至8.2，添加复合酶B 0.12％(以海带干重计)，维持温度57℃酶解2h，复合酶B的组成为：碱性蛋白酶100％。
(5)灭酶活
将步骤(4)中完成二步复合酶解的料液加热至90℃，保温60min，灭酶活后降温至室温。
(6)固液分离
将灭酶活并降温后的料液进行固液分离，4500r/min离心10min，并用1.5倍体积的水洗涤沉淀两次，4500r/min离心10min，所得沉淀为海带膳食纤维粗品，合并3次离心所得上清液用于后续分离提取。
(7)沉淀海藻酸
向步骤(6)中所得上清液中加入过量的CaCl2溶液，充分混合均匀后，5000r/min离心15min，并用上清液1倍体积的水洗涤沉淀两次，5000r/min离心15min，所得沉淀用95％乙醇溶液洗涤，烘干后为海藻酸钙产品，合并三次离心所得上清液用于后续分离提取。
(8)除Ca2+并浓缩
向步骤(7)中所得上清液中加入过量的Na2CO3溶液，充分混合均匀沉淀除去Ca2+，6000r/min离心15min，并用上清液1倍体积的水洗涤沉淀两次，去沉淀，合并3次离心所得上清液用盐水调pH至中性并将体积浓缩10～15倍，以减少后续分离提取所需乙醇用量。
(9)沉淀褐藻糖胶
向步骤(8)中所得浓缩液中加入5倍体积的95％乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，6000r/min离心15min，所得沉淀用适量95％乙醇溶液洗涤两次，所得沉淀为褐藻糖胶粗品，合并三次离心所得上清液，用于后续分离提取甘露醇。
(10)分离提取甘露醇
步骤(9)所得上清液经超滤除杂、纳滤浓缩脱盐脱乙醇，干燥得甘露醇成品。
(11)通过以上步骤最终以海带干物质计褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的综合提取率在92.4％，海带资源的综合利用率达到81.7％。
实施例3
(1)原料
以海带工业产生的废海带渣原料
(2)原料预处理
原料按料水比1:25加水充分混合均匀后，静置浸泡2h。
(3)一步复合酶解
将步骤(2)中静置浸泡完的料液加热至53℃，调节料液pH至4.8，添加复合酶A0.75％(以海带干重计)，维持温度53℃酶解12h，所述酶A是由以下质量分数的组分组成：纤维素酶35％，半纤维素酶35％，果胶酶10％，淀粉酶1％，木聚糖酶19％。
(4)二步复合酶解
将步骤(3)中所得一步复合酶解液加热至58℃，调节其pH至7.8，添加复合酶B 0.15％(以海带干重计)，维持温度58℃酶解1.5h，复合酶B的组成为：碱性蛋白酶70％，中性蛋白酶30％。
(5)灭酶活
将步骤(4)中完成二步复合酶解的料液加热至90℃，保温40min，灭酶活后降温至室温。
(6)固液分离
将灭酶活并降温后的料液进行固液分离，4000r/min离心10min，并用1.5倍体积的水洗涤沉淀两次，4000r/min离心10min，所得沉淀为海带膳食纤维粗品，合并3次离心所得上清液用于后续分离提取。
(7)沉淀海藻酸
向步骤(6)中所得上清液中加入过量的CaCl2溶液，充分混合均匀后，6000r/min离心15min，并用上清液1倍体积的水洗涤沉淀两次，6000r/min离心15min，所得沉淀用95％乙醇溶液洗涤，烘干后为海藻酸钙产品，合并三次离心所得上清液用于后续分离提取。
(8)除Ca2+并浓缩
向步骤(7)中所得上清液中加入过量的Na2CO3溶液，充分混合均匀沉淀除去Ca2+，4500r/min离心15min，并用上清液1倍体积的水洗涤沉淀两次，去沉淀，合并3次离心所得上清液用盐水调pH至中性并将体积浓缩10～15倍，以减少后续分离提取所需乙醇用量。
(9)沉淀褐藻糖胶
向步骤(8)中所得浓缩液中加入5倍体积的95％乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，6000r/min离心15min，所得沉淀用适量95％乙醇溶液洗涤两次，所得沉淀为褐藻糖胶粗品，根据原料来源如含有甘露醇则合并三次离心所得上清液，用于后续分离提取甘露醇。
(10)分离提取甘露醇
步骤(9)所得上清液经超滤除杂、纳滤浓缩脱盐脱乙醇，干燥得甘露醇成品。
(11)通过以上步骤最终以海带干物质计褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的综合提取率在90.5％，海带资源的综合利用率达到87.2％。

Claims (10)

1. 一种同时提取褐藻糖胶、海藻酸、甘露醇和海带膳食纤维的酶解方法，其特征是，包括以下步骤：
首先将海带原料进行粉粹、加水浸泡；然后加入复合酶A进行一步复合酶解，再加入复合酶B进行二步复合酶解；再将二步复合酶解之后的酶解液灭酶活，进行固液分离，得到的固体即为海带膳食纤维粗品，得到的液体用来提取海藻酸、褐藻糖胶和甘露醇；
其中，所述酶A包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、碱性纤维素酶、戊聚糖酶、葡聚糖酶、阿魏酸酯酶中的任意四种或四种以上；所述复合酶B包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或任意两种。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征是：所述得到的液体用来提取海藻酸、褐藻糖胶和甘露醇的方法包括：所得液体采用氯化钙溶液沉淀法分离得到海藻酸钙产品；然后将沉淀分离海藻酸钙后的上清液进行醇沉得到褐藻糖胶粗品；再将醇沉分离褐藻糖胶的上清液经除杂、脱盐、脱乙醇，得到甘露醇成品。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征是：所述复合酶A是由下述重量百分比的成分组成的：纤维素酶：20%~55%；半纤维素酶：10%~40%；果胶酶：0-30%；淀粉酶：0~2%；木聚糖酶：0~20%；碱性纤维素酶：0~10%；戊聚糖酶：0~10%；β-葡聚糖酶：0~5%；阿魏酸酯酶：0~2%，其中所述果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、碱性纤维素酶、戊聚糖酶、β-葡聚糖酶和阿魏酸酯酶中的重量百分比至少两个不为零。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征是：所述一步复合酶解时间为12~18h，一步复合酶解温度为：50~55℃，一步复合酶解pH为：4.7~5.1，复合酶A的添加量为：0.2%~0.8%，以海带干重计。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征是：所述二步复合酶解的时间为1~2h，二步复合酶解温度为：50~60℃，二步复合酶解pH为：7.0~8.5，复合酶B的添加量为：0.05%~0.15%，以海带干重计。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征是：将二步复合酶解之后的酶解液加热至80~90℃，保温30~60min，灭酶活后降温至室温。
7. 如权利要求2所述的方法，其特征是：具体沉淀海藻酸的方法为：向所得液体中加入过量的CaCl2溶液，充分混合均匀后，4000~6000r/min离心15~20min，并用上清液设定体积倍数的水洗涤沉淀数次，4000~6000r/min离心15~20min，所得沉淀用体积分数为90~95%乙醇溶液洗涤，干燥后为海藻酸钙产品，合并所有离心所得上清液用于褐藻糖胶和甘露醇的提取。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征是：将沉淀分离海藻酸钙后的上清液进行除Ca2+后再进行醇沉得到褐藻糖胶粗品，除Ca2+方法包括：向所述上清液中加入过量的Na2CO3溶液，混匀，过滤去除沉淀，所得液体用于褐藻糖胶和甘露醇的提取。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征是：将沉淀分离海藻酸钙后的上清液进行除Ca2+、浓缩后再进行醇沉得到褐藻糖胶粗品。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征是：所述得到褐藻糖胶粗品的具体方法包括：向所得浓缩液中加入4~6倍体积的90~95%乙醇溶液沉淀褐藻糖胶，4000~6000r/min离心15~20min，所得沉淀用乙醇溶液洗涤若干次，所得沉淀为褐藻糖胶粗品，合并所有离心所得上清液，用于后续分离提取甘露醇。
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