CN113667034B - 一种复合酶提取柑橘果胶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用复合酶提取柑橘果胶的方法，将预处理后的柑橘皮粉末与水混合，调节pH为3.5‑6.0，调节温度至35‑60℃，添加复合酶，于恒温磁力搅拌器中浸提反应，得到柑橘果胶粉末；所述复合酶是由纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶组成，其果胶得率为22.25％，果胶得率较单一酶提取提高了18.4％‑41.7％，半乳糖醛酸含量高达(83.1±0.7)％。本发明方法操作简单便捷、提取条件温和、能耗低、污染小，提取得到的柑橘果胶酯化度小于50％，是一种低酯果胶，具有更好的流变性、乳化性和胶凝性，可广泛应用于低糖和低热量食品中。

Description

一种复合酶提取柑橘果胶的方法

(一)技术领域

本发明涉及食品生产提取工艺技术领域，尤其涉及一种复合酶法提取柑橘果胶的方法。

(二)技术背景

“果胶”一词源自希腊语

意为“凝结物”。1825年，法国科学家HenriBraconnot首次从胡萝卜中提取出果胶物质。果胶是一类结构复杂的植物细胞壁多糖，呈弱酸性，分子量在20-400kDa之间。根据国际编号系统，果胶已被定义为食品添加剂(代码E440)，可用于糖果、果汁和果酱、蜜饯、甜味剂、可可和巧克力制品、婴儿食品和谷类食品等，果胶还被应用于生物医学领域，包括生物活性化合物的靶向递送、伤口愈合和组织工程。因此，果胶在商品化产品和人类健康中都起着至关重要的作用。

柑橘(Citrus reticulata Blanco)是芸香科柑橘属植物的果实，主要分布于亚洲(44％)、欧洲(20％)和南美洲(18％)地区，是世界上产量最大的水果。随着柑橘工业的发展，柑橘类水果通常被制成各种柑橘类加工产品应用于食品领域，如罐装水果、柑橘风味饮品和柑橘果酱等，但与此同时也产生了大量的柑橘加工副产物，主要包括果皮、果核和囊泡残膜等。研究表明，柑橘皮渣中含有果胶类物质、色素、类黄酮、精油和膳食纤维等生物活性成分，具有广阔的开发价值和应用前景。

传统的果胶提取方法多以强酸强碱作为溶剂进行提取，存在对提取设备要求高、对环境污染大的问题。鉴于此，我们探究一种复合酶法高效提取柑橘果胶的方法，并将其与化学法提取的果胶得率进行了比较，不仅果胶得率提高了13.0-59.1％，还减少了反应的料液比和时间，为其未来工业化生产高品质果胶提供技术支撑。

(三)发明内容

本发明的目的是为了弥补目前单一酶法提取果胶得率低的缺陷，提供一种复合酶法提取柑橘果胶的方法，特别是纤维素酶，木聚糖酶和酸性蛋白酶组成的复合酶，使用该种方法提取得到的果胶得率和半乳糖醛酸含量更高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种复合酶法提取柑橘果胶的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)柑橘皮的预处理：将新鲜柑橘皮经沸水煮沸10min灭原酶活后，再用流动的清水漂洗(优选3次)，以除去部分橘皮色素，将漂洗后的橘皮于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，再粉碎，过40目筛，获得预处理后的柑橘皮粉末；

(2)柑橘果胶的酶法提取：将预处理后的柑橘皮粉末与水混合，调节pH为3.5-6.0，调节温度至35-60℃，添加复合酶，于恒温磁力搅拌器中100-500rpm(优选450rpm)浸提反应0.5-4h，反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将浸提液离心(优选于4℃，10000rpm条件下离心10min)，除去底层橘皮果渣沉淀，上清液过滤(优选经200目筛网过滤)，滤液减压浓缩至上清液体积的10-30％(优选25％)后，加入乙醇(优选乙醇加入体积为浓缩后滤液体积的1.5倍)静置沉淀2h后，过滤(优选经200目筛网过滤)，滤饼用无水乙醇洗涤(优选3次)除去表面杂质后，干燥至恒重(优选于60℃鼓风式恒温干燥箱烘干至恒重)，磨粉(优选过200目筛)，得到柑橘果胶粉末；所述复合酶是由纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶组成。

进一步，步骤(2)水的体积用量以预处理后的柑橘皮粉末质量计为10-35mL/g，优选21.7mL/g。

进一步，步骤(2)pH优选为4.8，温度优选为51℃，时间优选为2.9h。

进一步，步骤(2)乙醇体积为浓缩液体积的1-2倍(优选1.5倍)。

进一步，步骤(2)复合酶中纤维素酶添加量以预处理后的柑橘皮粉末质量计为1-8％，木聚糖酶添加量以预处理后的柑橘皮粉末质量计为1-13％，酸性蛋白酶添加量以预处理后的柑橘皮粉末质量计为1-3％，优选纤维素酶质量添加量为6％，木聚糖酶质量添加量为10％，酸性蛋白酶质量添加量为2％。

纤维素酶通过从分子内部作用于β-1,4糖苷键，使植物细胞壁中的纤维素降解，从纤维糊精非还原性末端β-1,4糖苷键生成纤维二糖，进而水解成葡萄糖，有利于果胶的释放。

木聚糖类半纤维素在木质组织中占总量的50％，木聚糖酶可降解植物细胞壁中的半纤维素为低聚寡糖，从而促进植物细胞纤维间质凝胶多糖——果胶的释放。

植物细胞壁结构中也存在着少量蛋白质与果胶物质交缠，酸性蛋白酶水解蛋白质可降低果胶附近连接强度，有利于果胶的释放。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供了一种采用复合酶法提取柑橘果胶的新方法，在单一酶提取果胶的单因素实验基础上，初步确定了三种酶的最佳提取条件范围，为提高试验效率，减少次数，采取正交试验法对复合酶添加量进行了优化。经验证试验得到最佳复合酶添加比例为6％纤维素酶，10％木聚糖酶和2％酸性蛋白酶，其果胶得率为22.25％，果胶得率较单一酶提取提高了18.4％-41.7％，半乳糖醛酸含量高达(83.1±0.7)％。本发明方法操作简单便捷、提取条件温和、能耗低、污染小，提取得到的柑橘果胶酯化度小于50％，是一种低酯果胶，具有更好的流变性、乳化性和胶凝性，可广泛应用于低糖和低热量食品中。

(四)附图说明

图1为复合酶提取pH(a)、时间(b)、温度(c)和料液比(d)对果胶得率的影响。

图2为不同提取方法所得果胶的红外光谱图；JCP-碱热法提取的柑橘果胶；XCP—纤维素酶提取的柑橘果胶；MCP—木聚糖酶提取的柑橘果胶；DCP—酸性蛋白酶提取的柑橘果胶；FCP—复合酶提取的柑橘果胶；SCP—酸热法提取的柑橘果胶；CCP—商品柑橘果胶。

图3为柑橘皮渣和复合酶法提取果胶的电子扫描显微镜图。

图4为复合酶法提取的不同质量浓度果胶溶液对流变特性的影响。

图5为复合酶法提取的果胶质量浓度对其凝胶强度的影响。

(五)具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：

本发明实施例中柑橘(Citrus reticulata Blanco)是被子植物门、双子叶植物纲、芸香科、柑橘属植物，具体选自湖南沅江的早秋柑橘品种。

本发明常温是指25-30℃。

本发明所述纤维素酶购自浙江一诺生物科技有限公司，酶活为20913U/g；木聚糖酶和酸性蛋白酶均购于南宁庞博生物工程有限公司(酶活力分别为18990U/g，87660U/g)

本发明所用的符号表示一下含义：

XCP——纤维素酶提取的柑橘果胶；MCP——木聚糖酶提取的柑橘果胶；DCP——酸性蛋白酶提取的柑橘果胶；FCP——复合酶提取的柑橘果胶；JCP——碱热法提取的柑橘果胶；SCP——酸热法提取的柑橘果胶；CCP——商品柑橘果胶。

实施例1、单一酶法提取柑橘果胶的得率

根据纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶的适宜温度及pH范围，以果胶得率为参考指标进行单因素试验，分别研究酶添加量以预处理后的柑橘皮粉末质量计为：纤维素酶(1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％)、木聚糖酶(1％，3％，5％，7％，9％，11％，13％)和酸性蛋白酶(1％，1.5％，2％，2.5％，3％)、料液比以预处理后的柑橘皮粉末质量计为(10mL/g，15mL/g，20mL/g，25mL/g，30mL/g)、酶解时间(1h，2h，3h，4h，5h，6h)、温度(40℃，45℃，50℃，55℃，60℃)和pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5)这五个因素对果胶得率的影响。

1、柑橘皮的预处理：将新鲜柑橘皮经沸水煮沸10min灭原酶活后，再用流动的清水漂洗3次，以除去部分橘皮色素。将处理后的橘皮原料于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，再经中草药粉碎机打碎至粉末，过40目筛，获得预处理后的柑橘皮粉末，备用。

2、单一酶酶解方法：取10g预处理后柑橘皮粉末，按不同料液比加入水，以预处理后柑橘皮粉末质量计加入不同质量浓度酶，调节不同pH，在不同温度下酶解反应不同时间。反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将果胶浸提液于4℃，10000rpm条件下离心10min，除去底层桔皮果渣沉淀，上清液经200目筛网过滤后，减压浓缩至上清液体积的25％，倒入1.5倍体积的乙醇静置沉淀2h以析出果胶物质，经200目筛网过滤，得到絮凝状果胶物质，无水乙醇洗涤3次除去表面杂质后，于60℃鼓风式恒温干燥箱烘干至恒重。磨粉过200目筛，得到颗粒均匀的柑橘果胶粉末，根据公式计算柑橘果胶得率。

3、纤维素酶提取最优条件：称取10g预处理后柑橘皮粉末，以料液比25mL/g加入水，纤维素酶质量添加量以预处理后柑橘皮粉末质量计为6％，在温度50℃和pH 4.5条件下反应时间3h，果胶得率达到了最高16.4％。

4、木聚糖酶提取最优条件：称取10g预处理后柑橘皮粉末，按料液比25mL/g加入水，木聚糖酶添加量以预处理后柑橘皮粉末质量计为13％，在温度45℃和pH 5.0条件下酶解反应时间4h，果胶得率达到了最高15.7％

5、酸性蛋白酶提取最优条件：称取10g预处理后柑橘皮粉末，按料液比30mL/g加入水，酸性蛋白酶添加量以预处理后柑橘皮粉末质量计为3％，在温度40℃和pH 3.0条件下酶解反应1h，果胶得率达到了最高18.8％。

6、正交试验

根据单因素实验，在料液比25mL/g，pH 4.5，温度45℃，时间4h的条件下，选择纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶添加量设计表1的正交实验水平因素表，正交试验结果见表2。

表1正交试验设计表

①纤维素酶添加量；②木聚糖酶添加量；③酸性蛋白酶添加量

表2正交试验结果表

通过正交实验，探究单一酶复合添加比例对果胶得率的影响，从而获得最佳复合酶添加量。经验证试验得到最佳条件为料液比25mL/g，pH 4.5，温度45℃，时间4h的条件下，复合酶添加比例以预处理后柑橘皮粉末质量计分别为6％纤维素酶，10％木聚糖酶和2％酸性蛋白酶，其果胶得率为22.25％。

实施例2、复合酶法提取柑橘果胶单因素实验

(1)pH

称取10g实施例1方法预处理后柑橘皮粉末，以料液比25mL/g的量与水混合，调节至不同pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)，升温至50℃后，添加0.6g纤维素酶、1g木聚糖酶和0.2g酸性蛋白酶，于恒温磁力搅拌器中450rpm均匀反应3h。反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将果胶浸提液于4℃，10000rpm条件下离心10min，除去底层桔皮果渣沉淀，上清液经200目筛网过滤后，减压浓缩至上清液体积的25％，倒入1.5倍体积的乙醇静置沉淀2h以析出果胶物质，经200目筛网过滤，得到絮凝状果胶物质，无水乙醇洗涤3次除去表面杂质后，于60℃鼓风式恒温干燥箱烘干至恒重。磨粉过200目筛，得到颗粒均匀的柑橘果胶粉末，采用实施例1方法计算柑橘果胶得率。

结果见图1中(a)，果胶得率在pH 4-5之间均在20％以上，且当pH 4.5时得率最高。结合单一酶的单因素试验可知，在酸性蛋白酶的适宜pH 3.5环境下，果胶得率处于低值，推断在pH小于4环境下，纤维素酶和木聚糖酶酶活性低，无法协同蛋白酶发挥作用。当pH为4-5范围时，即达到了纤维素酶和木聚糖酶的适宜pH，且蛋白酶在此条件下仍能发挥良好的协同作用，从而共同促使果胶物质的释放。

(2)提取时间

将步骤(1)中pH改为4.5，提取时间改为0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h，3.5h，4.0h，其他操作相同，结果见图1中(b)，果胶得率随提取时间的延长逐渐上升，在3h达到峰值22.87％，之后便趋于平缓。随反应时间的增加，存在充足的柑橘皮渣原料与复合酶添加剂反应释放出果胶，但随着酶提取时间进一步延长，原料底物含量下降，产物中单糖、氨基酸等小分子物质开始大量增加，导致果胶溶出受阻，得率上升缓慢或略有下降。

(3)温度

将步骤(1)中pH改为4.5，提取温度改为35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，其他操作相同，结果见图1中(c)，当温度在35℃-50℃范围内时，果胶得率随温度上升逐渐增加，在50℃时，果胶得率达到最大值23.22％。然而，进一步升温则导致果胶得率急剧下降，这种现象是由于温度升高影响了复合酶活性，使其部分失活而逐步丧失催化水解能力，减缓了纤维素、半纤维素和蛋白质等大分子物质的降解，从而影响了果胶从植物细胞壁中解离和溶出。

(4)料液比

将步骤(1)中pH改为4.5，料液比改为10mL/g，15mL/g，20mL/g，25mL/g，30mL/g，35mL/g，其他操作相同，结果见图1中(d)，当料液比为25mL/g时，果胶得率最大为23.22％。料液比继续增大后，果胶得率呈快速下降趋势，原因可能是溶剂过多导致复合酶浓度被稀释，影响其酶活性，同时也存在因溶液体系增大而造成的果胶产物收集损失。为发挥复合酶添加剂的高效酶活和获得高得率果胶，需要对料液比进行优化调整为进一步扩大试验应用做铺垫。

复合酶单因素试验结果表明，最佳提取条件为复合酶添加量(纤维素酶6％、木聚糖酶10％、酸性蛋白酶2％)，料液比25mL/g，时间3h，温度45℃和pH4.5，对应柑橘果胶得率为23.22％。与单一酶提取相比，提取时间减少了1h，柑橘果胶得率提高了23.5％-47.9％。因此，复合酶提取可有效提高果胶产率并降低果胶提取时间。

实施例3、复合酶法提取工艺的响应面优化设计

由柑橘果胶得率为响应值进行比较，在复合酶单因素试验结果的基础上，以料液比(A)、温度(B)、pH(C)、时间(D)为考察对象，进行响应面优化试验。因素水平表见表3。

表3响应面设计试验的因素和水平表

根据表3进行正交实验，实验结果见表4。

表4响应面设计试验的具体方案和结果

本试验采用Design Expert 8.0.6软件对试验结果进行整理和分析，对表4的数据进行二次多项式拟合，得到二次多元回归模型为：

果胶得率＝24.02+1.07A-0.31B+2.44C-0.38D-0.13AB+0.13AC+2.5AD+1.23BC+0.60BD-0.11CD-1.67A2-0.92B2-2.28C2-0.94D2。

对果胶得率进行验证试验，得到优化的提取工艺：

按果胶得率的最优工艺进行3组平行验证试验，根据实际情况对最优条件进行调整，即复合酶添加量为6％纤维素酶、10％木聚糖酶、2％酸性蛋白酶，料液比21.7mL/g、温度51℃、pH4.8及时间2.9h，在该配比下得到的果胶得率为24.98％，与用Design-Expert8.0.6软件进行多元回归分析得到的理论预测值24.9328％相近。

实施例4、复合酶法提取的柑橘果胶结构性质的测定：

对实施例3最优条件下提取的柑橘果胶进行结构性质的测定。

(1)分子量的测定：

采用HPSEC法测定果胶的相对分子量，色谱条件为HPLC系统Waters 1525与示差折光检测器Waters 2414联用；凝胶色谱柱：TSKGEL G3000PWXL和G5000PWXL系列色谱柱联用；流动相：0.2M硝酸钠水溶液；进样量20μL，流速0.5mL/min，柱温40℃，洗脱时间60min。

经本实验优化提取条件的复合酶法提取的果胶分子量为421.7±1.1kDa，低于单一酶最优条件下提取果胶(纤维素酶提取的果胶(XCP)分子量为547.9±1.5kDa、木聚糖酶提取的果胶(MCP)分子量为698.9±0.9kDa、酸性蛋白酶提取的果胶(DCP)分子量为624.5±0.3kDa)。这可能是由于单一酶提取未能充分将果胶从柑橘皮渣中解离，而是夹杂了一些关联物质，如蛋白质、纤维素、半纤维素等，从而导致分子量增大。

(2)酯化度的测定：

酯化度采用滴定法(Kazemi M,Khodaiyan F,Hosseini S S.Eggplant peel as ahigh potential source of high methylated pectin:Ultrasonic extractionoptimization and characterization[J].LWT,2019,105:182-9.)测定，经本实验优化提取条件的复合酶法提取的果胶酯化度为(45.7±0.1)％，说明它为低酯果胶，可被广泛应用于低糖和低热量食品。

(3)单糖组成的测定：

色谱条件为高效液相色谱(HPLC)系统Waters e2695和紫外/可见检测器Waters2489联用；色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈：醋酸铵水溶液(0.1M，pH 5.5)＝22：78，v/v。进样量10μL，流速1.0mL/min，UV检测波长245nm，进样时间60min。

经测定复合酶法提取的果胶中单糖组成及含量见表5。其中半乳糖醛酸GalA占单糖的比例最高，范围为66.5％-83.1％，且GalA含量均大于65％，说明该品种柑橘皮提取的果胶的GalA含量符合果胶纯度特性标准(GalA≥65％)。果胶中还含有(6.8±0.2)％的甘露糖、(0.8±0.02)％的鼠李糖、(2.3±0.09)％的半乳糖、(5.3±0.0)％的阿拉伯糖以及(1.7±0.06)％的岩藻糖。与单一酶法提取相比，复合酶法提取果胶的GalA含量最高，表明其以直链为主，侧链较少。

表5不同方法提取的果胶中单糖的相对含量和单糖比率

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(4)粒径、Zeta电位和电导率测定：

利用纳米粒径电位分析仪(型号Zetasizer Nano ZS，购自马尔文帕纳科公司)测定果胶粒径分布、Zeta电位和电导率。配制浓度为0.01％的果胶样品溶液，采用动态光散射(DLS)测定其等效粒径，温度和波长分别为25℃和633nm。取适量0.01％的果胶样品溶液于测样管中，设置折射率为1.33，于25℃平衡样品30s后进行Zeta电位和电导率测定。测定结果见表6。

表6复合酶法提取果胶的粒径、Zeta电位和电导率

粒径大小与分子量存在一定关联，分子量较小的复合酶法提取果胶，粒径也比其他种类果胶更小。此外，果胶的粒径大小也会影响其乳化和起泡性能，而乳液的稳定性对于商业食品和饮料的货架期至关重要。Zeta电位与胶体分布的稳定性相关，小分子或分散的颗粒所在溶液的zeta电位绝对值更高，且溶液更加稳定。溶液的电导率表示溶液的稳定性随时间的变化。低电导率匹配较小的分子运动，这将延迟溶液的相分离速度，从而确保溶液的稳定性。复合酶法提取的果胶溶液的电导率为(0.0031±0.0001)mS/cm，这表明复合酶法提取的果胶具有优异的稳定性。

(5)红外光谱的测定：

碱热法提取的柑橘果胶(JCP)：取250mL烧杯，加入10g实施例1方法预处理后的柑橘皮粉末，倒入200mL 50mM NaOH水溶液，于85℃恒温磁力搅拌器均匀反应1h。其他操作同实施例1单一酶法提取。

酸热法提取的柑橘果胶(SCP)：取250mL烧杯，加入10g预处理后的柑橘皮粉末，倒入200mL 50mM HCl水溶液，于85℃恒温磁力搅拌器均匀反应1h。其他操作同实施例1单一酶法提取。

分别以实施例1最优条件下提取的柑橘果胶(XCP—纤维素酶提取的柑橘果胶；MCP—木聚糖酶提取的柑橘果胶；DCP—酸性蛋白酶提取的柑橘果胶)，实施例3最优条件下提取的柑橘果胶(FCP—复合酶提取的柑橘果胶)，JCP-碱热法提取的柑橘果胶；SCP-酸热法提取的柑橘果胶和商品柑橘果胶(CCP-商品柑橘果胶，购自浙江锦绣生物科技有限公司)为果胶样品进行红外光谱检测。

将1mg干燥的果胶样品与100mg干燥的KBr粉末充分研磨混匀后，放入压片机中制成透明薄片状样品，取出样品置于红外光谱仪NEXUS-670的样品室中进行红外光谱扫描。频率范围为4000-400cm^-1，分辨率为4cm^-1，使用OMNIC软件对光谱进行优化降噪处理。

红外光谱测定结果见图2，本发明所有不同方法提取的柑橘果胶在3427、2935和1148cm^-1处均具有独特的化学位移，这是由于果胶物质中的O-H，C-H，CH₂，CH₃和C-O-C存在分子间和分子内氢拉伸。1745cm^-1和1640cm^-1附近的吸收峰依次是由于果胶中存在酯化和非酯化的-C＝O基团。

(6)扫描电子显微镜的测定：

使用扫描电子显微镜对实施例1方法预处理后的柑橘皮粉末和实施例3最优条件下复合酶法提取的果胶样品的微观结构进行观察，扫描电压为5kV，柑橘皮渣的放大倍率为10k倍，果胶的放大倍率均为50k倍。

本发明通过扫描电子显微镜观察了柑橘皮粉末和复合酶法提取的柑橘果胶的微观结构，结果如图3所示，由图可知，柑橘皮渣原料存在多种成分缠结的状态。这些物质可能包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶。且未提取果胶的皮渣表面是粗糙的，具有明显的皱纹和不规则颗粒。而复合酶法提取果胶的表面存在较小空隙，是由于其分子量较低且粒径较小。

实施例5、复合酶法提取的柑橘果胶功能特性的测定

(1)流变功能特性：

本发明探究了不同质量分数复合酶法提取的果胶溶液对流变特性的影响，将实施例3最优条件下提取的柑橘果胶用水配制成不同质量浓度(1％、1.5％、2％、2.5％、3％)的柑橘果胶溶液，采用流变仪(型号MCR52，厂家奥地利安东帕公司)检测，设定流变仪温度为25℃，剪切速率为1-100s^-1，平板间隙为1mm，结果见图4。柑橘果胶溶液的粘度随剪切速率增大而减弱表现出显著的假塑性流体行为，且复合酶法提取的果胶溶液质量分数越高，其粘度越大。质量分数为1％的复合酶法提取的果胶溶液粘度仅为154mPa·s，而质量分数增大到3％时，溶液粘度为290mPa·s。导致其变化的原因是果胶质量分数的增加能够减小溶液中果胶分子之间的空隙，从而加强分子间作用力，阻碍流体流动，使粘度增强。可在酸奶、果冻和糖果中作应用。

(2)乳化功能特性：

本发明对实施例3最优条件下复合酶法提取的果胶的乳化活性(EA)和乳化稳定性(ES)进行了评估(Kazemi M,Khodaiyan F,Hosseini S S.Eggplant peel as a highpotential source of high methylated pectin:Ultrasonic extraction optimizationand characterization[J].LWT,2019,105:182-9.)，以探究其乳化功能特性。由表7可知，FCP的EA约为47.2％，略高于通过水热提取法从柑橘皮中提取的果胶(EA：46.5％，Pasandide B,Khodaiyan F,Mousavi Z E,et al.Optimization of aqueous pectinextraction from Citrus medica peel[J].Carbohydrate Polymers,2017,178:27-33.)。相比于常温贮存的乳化溶液，4℃低温贮存的溶液具有更加优异的乳化稳定性能，且随着贮存时间的延长，乳化稳定性略有下降。该结果与Ma等(Ma S,Yu S-J,Zheng X-L,etal.Extraction,characterization and spontaneous emulsifying properties ofpectin from sugar beet pulp[J].Carbohydrate polymers,2013,98(1):750-3.)的研究成果一致，均表明低温(4℃)更适合于果胶乳化剂的储存。

表7复合酶提取果胶的乳化性能

(3)凝胶功能特性：

将实施例3最优条件下提取的柑橘果胶用水配制成不同质量浓度(1％、1.5％、2％、2.5％、3％)的果胶溶液，采用质构仪(型号TA.TOUCH，厂家上海保圣实业发展有限公司)检测对流变特性的影响，结果见图5。质构特性测定参数设置：测前速度5.0mm/s，测试速度1.0mm/s，测后速度5.0mm/s，触发力5g，压缩距离4mm。由图5可知，复合酶法提取的果胶的凝胶强度随果胶质量分数的增大而增大，当其质量分数为1.0％-3.0％时，凝胶强度为34.2-91.6g/cm²。当复合酶法提取的果胶溶液的质量分数小于1.5％时，其凝胶强度变化不明显，原因是在低质量分数的果胶溶液中，果胶分子上的亲水基团分布间隙大，难以聚集形成氢键，影响了凝胶强度的加剧。当果胶溶液的质量分数大于1.5％后，其凝胶强度几乎呈线性增长，这是由于溶液中的果胶分子数量迅速增加，导致分子间间距缩小，分子间亲水基团更易结合形成稳固的凝胶结构，从而有利于凝胶强度的提高。

Claims (4)

1.一种复合酶法提取柑橘果胶的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)柑橘皮的预处理：将新鲜柑橘皮经沸水煮沸灭原酶活后，再用流动的清水漂洗除去部分橘皮色素，将漂洗后的橘皮于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，再粉碎，过40目筛，获得预处理后的柑橘皮粉末；

(2)柑橘果胶的酶法提取：将预处理后的柑橘皮粉末与水混合，调节pH为3.5-6.0，调节温度至35-60℃，添加复合酶，于恒温磁力搅拌器中100-500rpm浸提反应0.5-4h，反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将浸提液离心，上清液过滤，滤液减压浓缩至上清液体积的10-30％后，加入乙醇静置沉淀2h后，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤后，干燥至恒重，磨粉，得到柑橘果胶粉末；所述复合酶是由纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶组成；纤维素酶质量添加量为6％，木聚糖酶质量添加量为10％，酸性蛋白酶质量添加量为2％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)水的体积用量以预处理后的柑橘皮粉末质量计为10-35mL/g。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)pH为4.8，温度为51℃，时间为2.9h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)乙醇体积为浓缩液体积的1-2倍。

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