CN111683540A - 生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-i的果胶多糖分离物的方法 - Google Patents

生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-i的果胶多糖分离物的方法 Download PDF

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Abstract

一种生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖‑1的水解果胶多糖分离物的方法，包括：提供在不使用有机溶剂从植物材料获得的富含果胶底物，富含果胶底物包含果胶多糖的至少3重量％的干物质；对富含果胶底物进行酶促处理以部分地水解果胶多糖，酶促处理包括使用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.173)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一或多种果胶酶；使用截留分子量在5至100kDa范围内的超滤膜对部分水解的果胶多糖进行超滤；及回收超滤渗余物。还涉及通过本方法获得的水解果胶多糖分离物，及制备选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料或药物产品的产品的方法，方法包括添加上述水解果胶多糖分离物。

Description

生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-I的果胶多糖分离物的方法
发明领域
本发明涉及一种生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RG-1)多糖的果胶多糖分离物的方法。更特别地，本发明涉及一种通过酶促水解富含果胶的底物之后进行超滤和截留物的回收来生产这种多糖分离物的方法，所述富含果胶的底物是在不使用有机溶剂的情况下从植物材料获得的，并且包含大量的RG-1多糖。
发明背景
果胶是存在于陆生植物的原代细胞壁中的结构性杂多糖。果胶多糖组成和精细结构取决于植物来源和所应用提取条件而大有不同。果胶多糖的生物活性高度依赖于其精细结构。
果胶多糖是包括不同量的以下多糖组分的多糖的异质组：
(i)同型半乳糖醛酸聚糖(HG)，
(ii)木糖半乳糖醛酸聚糖(XG)，
(iii)芹半乳糖醛酸聚糖(AG)
(iv)鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)，以及
(v)鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)。
图1提供果胶多糖的结构的示意性表示，包括前述4种多糖组分。注意，多糖组分AG、XG和RG-II通常代表果胶多糖的仅较小级分。
多糖组分HG、XG和RG-II各自包括由α-(1-4)-连接的D-半乳糖醛酸单糖单元的直链组成的骨架。
仅RG-I包括由以下重复的二糖单元的直链组成的骨架：4)-α-D-半乳糖醛酸-(1,2)-α-L-鼠李糖-(1。在图2中示出RG-I的结构的示意性表示。
同型半乳糖醛酸聚糖结构域可具有高达约100个连续D-GalA残基的长度。包含侧链的RG-I结构域通常被称为“分枝区”或“毛状区”，而同型半乳糖醛酸聚糖结构域(两个RG-I结构域之间)通常不被低聚糖取代。
RG-I中的GalA残基通过1和4位置连接至Rha残基，而Rha残基通过异头位置和2-OH位置连接至GalA残基。一般来说，约20-80％的Rha残基在4-OH位置处分支(这取决于植物来源和分离方法)，带有中性和酸性侧链。这些侧链主要由以各种方式连接的Ara残基和Gal残基组成，从而构成称为阿拉伯半乳聚糖I(AG-I)和/或AG-II的聚合物。AG I由β-(1,4)-连接的D-Gal骨架构成，所述骨架在3-OH处是α-L-阿拉伯糖基取代物；Gal骨架可具有间隔的α(1,5)-L-Ara单元。AG-II由高度分枝的半乳聚糖组成，主要内部是β(1,3)连接的D-Gal，外部是短(1,6)连接链的取代物。后者具有(1,3)-和/或α(1,5)-连接的L-Ara的另外的附着体。低聚糖侧链可以是直链或支链的，并且这些侧链中的一些可被α-L-岩藻糖苷、β-D-葡糖醛酸苷和4-O-甲基β-D-葡糖醛酸残基封端。
Khodaei和Karboune(“Extraction and structural characterisation ofrhamnogalacturonan I-type pectic polysaccharides from potato cell wall”。FoodChemistry,1:39(2013),第617-623页)描述了使用碱性(NaOH和KOH)和酶促(来自黑曲霉(Aspergillus niger)的内聚半乳糖醛酸酶)方法提取富含半乳聚糖的鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)型果胶多糖。
Khodaei和Karboune(“Enzymatic extraction of galactan-richrhamnogalacturonan I from potato cell wall by-product”.LWT-Food Science andTechnology，第57期(2014版)，第207-216页)进一步研究了各种参数对使用来自黑曲霉的内切聚半乳糖醛酸酶来酶促提取富含半乳聚糖的鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG I)的影响。
WO 2015/192247描述了一种通过从马铃薯浆中提取鼠李半乳糖醛酸聚糖内容物、用多酶促混合物来消化所提取鼠李半乳糖醛酸聚糖内容物，以从所提取鼠李半乳糖醛酸聚糖内容物得到不可消化的低聚糖；以及分离不可消化的低聚糖，来从马铃薯浆中分离不可消化的低聚糖的方法。
WO 2016/132130描述了一种用于从马铃薯浆中制备RG-I片段的方法和将其用于向受试者提供免疫调节活性的用途。所述方法包括以下步骤：
-提供从马铃薯的酶促提取获得的RG-I；
-通过选择性地解聚所述RG-I从而提供片段来制备所述RG-I片段，所述片段具有在5kDa至30kDa的范围内的平均分子量，其中所述片段具有包括以下的单糖组成：
阿拉伯糖7-13％，
鼠李糖5-10％，
木糖0-1％，
半乳糖醛酸20-40％，以及
半乳糖35-60％。
CN 102784193 A描述了一种从红芪中分离多糖的方法。
KR 2017/053144 A描述了从大麦叶中提取多糖级分。多糖级分被描述为呈现免疫功能促进活性。
发明概述
发明人发现，富含带有高生物功能性的鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)的多糖分离物可通过包括以下的方法获得：
·将已在不使用有机溶剂的情况下从植物材料获得并且包含大量的RG-I多糖的富含果胶的底物进行酶促水解，以部分地水解所述RG-I多糖；
·使用具有在5至100kDa的范围内的截留值的超滤膜来对部分水解的RG-I多糖进行超滤；
·以及回收超滤渗余物。
·借助选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛水解酶(EC 3.2.1.173)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶进行酶促水解。
因此，本发明的第一方面涉及提供一种生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-1的水解果胶多糖分离物的方法，所述方法包括以下步骤：
·提供已在不使用有机溶剂的情况下从植物材料中获取的富含乳胶的底物，所述富含乳胶的底物包含具有由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的果胶多糖的至少3重量％的干物质，所述鼠李糖残基包含在由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架中，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·将所述富含果胶的底物进行酶解处理以部分地水解所述果胶多糖，所述处理酶解处理包括使用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛水解酶(EC 3.2.1.173)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶；
·使用具有5至100kDa的截留分子量的超滤膜来对部分水解的果胶多糖进行超滤；以及
·回收超滤渗余物。
发明人发现，使用前述果胶酶中的一种或多种部分地酶促水解果胶多糖，之后去除包括水解期间的小分子的小分子组分，得到表现出异常高的生物功能的水解果胶多糖分离物。
虽然发明人不希望受理论束缚，但相信，这种高生物功能是通过去除包含在底物中的果胶多糖的同型半乳糖结构域的至少一部分并通过移除诸如纤维素和半纤维素的非活性组分实现的。去除同型半乳糖醛酸聚糖结构域改变果胶多糖的理化性质，从而产生与肠道中和人外周血单核细胞上的所谓模式识别受体更有效地相互作用的三维分子构型。从果胶多糖去除同型半乳糖醛酸结构域增加RG-I结构域的含量。相信，RG-I多糖结构域与在肠道细胞和其他免疫活性细胞上表达的模式识别受体的相互作用可调节它们的功能反应性，这通过介体的产生和免疫活性细胞的再循环可改善对肠道以及体内包括口腔、呼吸道、泌尿道、阴道和皮肤的其他部位的感染的抵抗力。
本方法进一步提供的优点在于，高度活性的水解果胶多糖是从已在不使用有机溶剂的情况下产生的富含果胶的底物获得的。因此，不像利用有机溶剂沉淀来辅助分离果胶多糖的一些现有技术方法，本方法采用未与有机溶剂接触的富含果胶的底物，并且根据本方法对这种底物的进一步处理并不需要使用有机溶剂。
本发明进一步涉及通过本方法获得的水解果胶多糖分离物并且涉及制备选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料或药物产品的产品，所述方法包括添加前述水解果胶多糖分离物。
发明详述
因此，本发明的第一方面涉及一种提供富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-I的水解果胶多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
·提供已在不使用有机溶剂的情况下从植物材料中获取的富含乳胶的底物，所述富含乳胶的底物包含具有由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的果胶多糖的至少3重量％的干物质，所述鼠李糖残基包含在由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架中，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·将所述富含果胶的底物进行酶解处理以部分地水解所述果胶多糖，所述处理酶解处理包括使用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛水解酶(EC 3.2.1.173)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶；
·使用具有5至100kDa的截留分子量的超滤膜来对部分水解的果胶多糖进行超滤；以及
·回收超滤渗余物。
本方法中所用的富含果胶的底物已在不使用有机溶剂的情况下从植物材料获得，这意味着这种底物是在植物材料不与有机溶剂接触的情况下从植物材料获得的。因此，富含果胶的底物不是通过有机溶剂的提取或沉淀获得的。
如本文所用，术语“骨架链”和“骨架”是同义词。
如本文所用的术语“糖类”涵盖单糖、双塘、低糖和多糖。
如本文所用的术语“低聚糖”是指包含3-10个单糖残基的糖类聚合物。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“多糖”是指包含至少11个单糖残基的糖类聚合物。
如本文所用的术语“果胶多糖”是指具有至少10kDa的分子量并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基。除非另外指明，否则如本文所用的术语“果胶多糖”也涵盖具有至少10kDa的分子量的水解果胶多糖。
如本文所用的术语“分支多糖”是指包括通过糖苷键连接结合在一起的单糖单元线性骨架链的多糖，其中骨架链内的至少一个单糖单元携带一个或多个糖苷连接的单糖单元的侧链。
如本文所用的术语“片段(stretch)”是指多糖骨架内两个糖苷连接的单糖单元的序列，不包括其所附着到的任何侧链。
如本文所用的术语“结构域”是指一个片段加上附着到所述片段的任何侧链。
术语“鼠李半乳糖醛酸聚糖-I片段”或“RG-I片段”是指由半乳糖醛酸(GalA)和鼠李糖(Rha)对组成的片段，其中GalA残基通过1位置和4位置连接至Rha残基，而Rha残基通过异头位置和2-OH位置连接至GalA残基相连，即交替的α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基。RG-I结构域可包括侧链，诸如例如半乳聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖侧链。
术语“鼠李半乳糖醛酸聚糖-I”或“RG-I”多糖是指任选分支的果胶多糖，其包括包含一个或多个鼠李半乳糖醛酸聚糖-I片段的骨架。
术语“α(1，4)-连接的半乳糖醛酸片段”是指由α(1→4)-半乳糖醛酸残基组成的片段。
除RG-I结构域之外，通过本发明的方法获得的水解果胶多糖分离物可包含一个或多个以下结构域：
·同型半乳糖醛酸聚糖(HG)，
·木糖半乳糖醛酸聚糖(XG)，
·芹半乳糖醛酸聚糖(AG)
·鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)。
结构域XG、AG和RG-II通常代表RG-I多糖的仅较小级分。
任选存在于本发明的RG-I多糖中的HG结构域、XG结构域、AG和RG-II结构域包括由两个或更多个α-(1-4)-连接的D-半乳糖醛酸的直链组成的骨架。
HG结构域不包含任何侧链。HG结构域的骨架内的半乳糖醛酸残基的羧基可被酯化。酯化的半乳糖醛酸可以甲酯或乙酰酯的形式出现。
XG结构域的骨架包含一个或多个D-木糖形式的侧链。
AG结构域的骨架包含由一个或多个D-芹菜糖残基构成的一个或多个侧链。
RG-II的骨架包含并非仅由D-木糖或D-芹菜糖构成的侧链一个或多个。RG-II结构域的骨架内的半乳糖醛酸残基的羧基可被酯化。酯化的半乳糖醛酸可以甲酯或乙酰酯的形式出现。
术语“乙酰化程度”是指每个半乳糖醛酸残基的乙酰基残基数目，以百分比表示。
术语“甲基化程度”是指每个半乳糖醛酸残基的甲基残基数目，以百分比表示。
可通过技术人员已知的分析技术来确定不同多糖的浓度及其单糖组成。在甲烷水解之后，单糖组成可通过与脉冲安培检测组合的高性能阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)来适当地测定。
分子大小分布可通过高效排阻色谱法(使用折射率(RI)检测(浓度)、光散射检测(分子质量检测)、UV检测(指示蛋白质的存在)和差压检测(固有粘度检测)来确定。
上述分析方法在以下期刊中有所描述：Analytical Biochemistry，第207卷，第1期，1992版，第176页(用于甲基分解和中性糖分析)；以及Mol.Nutr.Food Res.，第61卷，第1期，2017版，1600243(用于半乳糖醛酸分析和分子大小分布)。
本文所用的术语“果渣”或“饼”是指在榨汁或榨油之后的水果、蔬菜或种子的任选干燥的残留物。术语“油饼”是指从种子、水果或蔬菜中去除油之后获得的饼状物。
除非另外陈述，否则本文提及的所有百分比是指重量百分比。
本方法优选地不采用任何有机溶剂。换句话说，在不使用有机溶剂的情况下从植物材料获得的富含果胶的底物在不使用有机溶剂的情况下被进一步处理(酶促处理和超滤)以产生所需水解果胶多糖分离物。
本方法中所用的富含果胶的底物优选地包含果胶多糖的至少4重量％的干物质，更优选地至少6重量％的干物质，甚至更优选地少8重量％的干物质。
优选地，富含果胶的底物中的果胶多糖的特征在于至少100kDa，更优选地至少150kDa，最优选地至少200kDa的质量加权平均分子量,
富含果胶的底物中的果胶多糖通常具有以果胶多糖的总单糖组成计算的至少0.1mol.％，更优选至少0.5mol.％，甚至更优选至少1mol.％，并且最优选至少2mol.％的平均鼠李糖含量。
本方法中采用的富含果胶的底物可从不同的作物获得。在优选实施方案中，富含果胶的底物是从选自水果(包括番茄)、胡萝卜、橄榄、豌豆、甜菜、菊苣、大豆、向日葵、油菜籽和玉米的一种或多种作物获得的。更优选地，富含果胶的底物是从选自苹果、梨、柑橘、胡萝卜、甜菜和菊苣的一种或多种作物获得的。更优选地，富含果胶的底物是从选自苹果、梨、胡萝卜和菊苣的一种或多种作物获得的。根据特别优选的实施方案，富含果胶的底物是从胡萝卜和/或苹果获得的。
富含果胶的作物材料可用作本方法中的诸如富含果胶的底物。应将这种作物材料粉碎来产生浆或汁，以便使果胶酶分解底物中的果胶多糖。粉碎的作物材料可在用于本方法之前进行干燥或浓缩。
优选地，富含果胶的底物是作为来自使用作物材料作为起始材料的生产方法的侧流获得的，并且其中直到生成侧流的过程阶段一直不采用有机溶剂或化学反应。根据本方法的特别优选的实施方案，富含果胶的底物选自果渣、果渣的水性提取物、油饼、油饼的水性提取物、刮板、外皮、果皮、果核、种子，和它们的组合。最优选地，富含果胶的底物选自果渣、果渣的水性提取物和它们的组合。
本方法中采用的富含果胶的底物可适当地通过包括研磨、加热、微波、干燥或破坏细胞壁结构以促进果胶多糖的酶促水解的替代技术的程序获得的。
富含果胶的底物优选地具有不大于15重量％，更优选不大于10重量％，并且最优选不大于8重量％的含水量。
富含果胶的底物优选地以水性液体的形式进行酶促处理，所述水性液体包含富含果胶的底物并且具有0.5-40重量％，更优选地为1-30重量％，甚至更优选地2-20重量％，最优选地3-15重量％的干物质含量。这种水性液体可适当地通过将富含果胶的底物与水混合来制备。
富含果胶的底物优选地构成进行酶促处理的水性液体中所包含的至少50重量％，更优选地至少75重量％，并且最优选地至少85重量％的干物质。
根据本发明的方法的酶促处理优选地在3.0至7.5的范围内进行，更优选地在4至7.5的范围内，甚至更优选地在4.5至7的范围内，最优选地在5至7的范围内的pH下进行。
用于部分地水解果胶多糖的处理优选地采用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)和外聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶。
根据一个优选实施方案，果胶多糖是使用选自内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)和外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶部分地水解的。
根据另一个优选的实施方案，果胶多糖是使用选自果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)和果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)的一种或多种果胶酶部分地水解的。果胶多糖通过这些裂解酶进行的水解不可避免地产生包含末端不饱和非还原性半乳糖醛酸残基的多糖片段。
在本发明方法中，优选地使用前述一种或多种果胶酶和一种或多种果胶酯酶(EC3.1.1.11)的组合将果胶多糖水解。一种或多种果胶酯酶可在一种或多种果胶酶之前或与此同时采用。果胶酶和果胶酯酶的组合使用在所采用果胶酶选自内聚半乳糖醛酸酶、外聚半乳糖醛酸酶以及它们的组合的情况下特别有利。结合使用果胶酶和果胶酯酶通常产生甲基化程度降低并且乙酰化/甲基化比提高的部分水解的果胶多糖。
根据特别优选的实施方案，在使用一种或多种果胶酶部分水解之前或与此同时，将富含果胶的底物进行酶促处理，包括使用一种或多种果胶酯酶(EC 3.1.1.11)。最优选地，用果胶酯酶进行酶促处理和用一种或多种果胶酶进行酶促处理同时进行。
在本方法中，在用果胶酶进行酶促处理之前或作为所述处理的一部分，可将富含果胶的底物适当地用纤维素酶和/或半纤维素酶(EC 3.2.1.4、EC 3.2.1.176、EC3.2.1.203)处理。用纤维素酶和/或半纤维素酶进行处理破坏底物中的植物细胞壁，从而诱导这些细胞壁内包含的果胶的释放，因此使得这些果胶更易用于果胶酶。
用一种或多种果胶酶对富含果胶的底物的酶促处理优选地在15至70℃，更优选地25至55℃的温度下进行。酶促处理的持续时间优选地为至少10分钟，更优选地为20分钟至3小时。
本方法可适当地使用富含果胶的底物，所述底物含有相对大量的或多或少完整的植物细胞壁材料。通常，这种富含果胶的底物包含选自纤维素、半纤维素及它们的组合的纤维素材料的至少40重量％的干物质。通常，这些底物中的大部分果胶多糖是水不溶性的，即，被捕获在植物细胞壁(碎片)的纤维素/半纤维素基质中的果胶多糖。优选地，存在于底物中的至少50重量％的果胶多糖在1g/l的果胶多糖浓度下不溶于45℃和pH 5.5的蒸馏水。
根据本方法的特别优选的实施方案，在酶促处理之后和超滤之前，通过将包含部分水解的果胶多糖的水性液体进行固液分离，将水溶性果胶多糖与非水溶性固体分离。可采用的固液分离技术的实例包括沉降、倾析、离心、水力旋流和/或过滤。这个特定实施方案提供的优点在于，可得以实现期望果胶多糖的高收率。
在本方法的一个实施方案中，富含果胶的底物包含选自果胶、纤维素、半纤维素和它们的组合的细胞壁多糖的10-80重量％的干物质。更优选地，底物包含细胞壁多糖的20-70重量％的干物质。最优选地，底物包含细胞壁多糖的30-60重量％的干物质。果渣是可用于本发明方法并且包含相对大量细胞壁多糖的富含果胶的底物的实例。
果渣通常包含具有小于20kDa分子量的碳水化合物的2-50重量％的干物质，优选地5-40重量％的干物质，更优选地10-30重量％的干物质。
果渣的蛋白质含量通常在0-20重量％干物质的蛋白质范围内，更优选地在1-18重量％干物质的蛋白质，甚至更优选地2-16重量％干物质的蛋白质范围内。
在其中富含果胶的底物是果渣或油饼的本方法的实施方案中，优选地在超滤之前从酶促处理的果渣或酶促处理的油饼中去除未溶解材料(粒度＞5μm)。优选地通过固液分离，更优选地通过倾析、离心和/或过滤去除未溶解材料。
在本方法的另一实施方案中，富含果胶的底物是果胶分离物，其包含果胶多糖的至少10重量％的干物质，优选地至少20重量％的干物质，更优选地至少40重量％的干物质，和选自纤维素、半纤维素和它们的组合的细胞壁多糖的小于20重量％的干物质。更优选地，果胶分离物包含的细胞壁多糖的浓度小于10重量％的干物质，甚至更优选地小于5重量％的干物质。果渣的水性提取物和油饼的水性提取物是可在本发明方法中用作富含果胶的底物的果胶分离物的实例。
优选地，果渣水性提取物通过一系列水性提取步骤，更优选地至少两个水性提取步骤获得。因此，第一提取步骤优选地包括将果渣与水混合，之后进行固液分离。第二步骤优选地包括将回收的固体部分与水混合，之后进行另一固液分离。合适的固液分离方法是例如倾析、离心和过滤。
优选地，在2.0至8.5的pH范围内，更优选地在4.5至7.5的pH范围内，甚至更优选地在6.0至7.0的pH范围内进行水性提取。
在本方法的特别优选的实施方案中，使用分子量截留值在6-50kDa范围内，优选地在7-40kDa范围内，更优选地在8-30kDa范围内的超滤膜，对部分水解的果胶多糖进行超滤。
可使用选自喷雾干燥、冷冻干燥、空气干燥、辊式干燥、平板干燥、带式干燥和鼓式干燥的一种或多种干燥技术来适当地干燥回收的超滤渗余物。
优选地，将回收的超滤渗余物干燥至小于15重量％，更优选地小于13重量％，甚至更优选地小于11重量％，并且最优选地小于9重量％的含水量。
回收的超滤渗余物优选地包含摩尔比不大于6:1，更优选地不大于5:1，甚至更优选地不大于4:1，并且最优选地不大于3.5:1的半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基。
存在于回收的超滤渗余物中的果胶多糖优选地具有以果胶多糖的总单糖组成计算的至少4％，更优选地5-50％，甚至更优选地6-45％，再更优选地6.5-40％，并且最优选地7-30％的平均鼠李糖含量。
回收的超滤渗余物优选地包含果胶多糖的至少5重量％的干物质，优选地至少15重量％的干物质，更优选地至少25重量％的干物质，最优选地至少50重量％的干物质，所述果胶多糖具有以果胶多糖的总单糖组成计算的至少4mol.％的平均鼠李糖含量。
根据另一优选实施方案，回收的渗余物中的果胶多糖具有大于20kDa，更优选地大于30kDa，甚至更优选地大于40kDa，最优选地大于50kDa的重量加权平均分子量。
本发明的方法优选地得到如以下指定的水解果胶多糖分离物。
本发明的第二方面涉及一种通过根据本发明的方法获得的水解果胶多糖分离物。
水解果胶多糖分离物通常具有至少85重量％，更优选地为至少90重量％，并且最优选地为至少95重量％的干物质含量。
优选地，水解果胶多糖分离物包含果胶的至少10重量％的干物质，更优选地至少20重量％的干物质，甚至更优选地至少40重量％的干物质，所述果胶多糖具有以果胶多糖的总单糖组成计算的至少4mol.％的平均鼠李糖含量。
根据特别优选的实施方案，水解的果胶多糖具有大于20kDa，更优选地大于30kDa，甚至更优选地大于40kDa，最优选地大于50kDa的质量加权平均分子量。
在特定实施方案中，水解果胶多糖分离物包含具有小于2.5kDa的分子量的小于15重量％，小于10重量％，更优选地小于5重量％，最优选地小于1重量％的糖类(多糖、低聚糖、二糖和单糖)。
优选地，水解的果胶多糖包含具有小于20kDa的分子量的小于30重量％，更优选地小于20重量％，最优选地小于10重量％的材料。
通常，水解果胶多糖分离物包含选自纤维素、半纤维素、木质素和淀粉的不溶性多糖的小于15重量％的干物质，优选地小于10重量％的干物质，更优选地小于5重量％，最优选地小于1重量％的干物质。
水解果胶多糖分离物的蛋白质含量优选地不超过干物质的15重量％，更优选地在干物质的0.5-10重量％的范围内，并且最优选地在干物质的1-5重量％的范围内。
优选地，水解果胶多糖分离物包含果胶多糖的至少10重量％的干物质，优选地至少20重量％的干物质，更优选地至少30重量％的干物质，所述果胶多糖具有以果胶多糖的总单糖组成计算的至少5mol.％，更优选地6％的平均鼠李糖含量。
通常，半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、阿拉伯糖残基和半乳糖残基的组合构成水解果胶多糖分离物中所包含糖类中存在的单糖残基的至少50mol.％。更优选地，此组合构成水解果胶多糖分离物中所包含糖类中的单糖残基的至少60mol.％，甚至更优选地至少65mol.％，还更优选地至少70mol.％，并且最优选地至少75mol.％。
在水解果胶多糖分离物的特别优选的实施方案中，半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基的组合代表水解果胶多糖分离物中所包含糖类中存在的单糖残基的至少15mol.％，更优选地17-70mol.％，最优选地18-60mol.％。
半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基优选地以不大于6:1，更优选地不大于5:1，甚至更优选地不大于4:1，最优选地不大于3.5:1的摩尔比存在于水解果胶多糖分离物中。
鼠李糖残基通常代表水解果胶多糖分离物中存在的果胶多糖中所包含的所有单糖残基的5-50％，更优选地6-45％，甚至更优选地6.5-40％，并且最优选地7-30％。
半乳糖醛酸残基通常代表水解果胶多糖分离物中存在的果胶多糖中所包含的所有单糖残基的5-80％，更优选地8-60％，并且最优选地10-50％。
分离物中的果胶多糖优选地具有不大于800kDa的质量加权平均分子量。更优选地，果胶多糖具有为22kDa至500kDa，最优选地25kDa至250kDa的质量加权平均分子量。
在特定实施方案中，本发明分离物中的果胶多糖优选地具有至少10％，更优选地20-110％，甚至优选地25-100％，并且最优选地30-80％的平均乙酰化程度。
在另一特定实施方案中，分离物中的果胶多糖具有优选不大于60％，更优选地不大于50％，并且最优选地5-30％的平均甲基化程度。
分离物中果胶多糖的骨架可包括一个或多个侧链。这些侧链可包含阿拉伯糖和/或半乳糖的残基，以及少量的单体岩藻糖、葡萄糖、葡糖醛酸、木糖和/或糖醛酸的残基。一个或多个侧链优选地选自半乳聚糖侧链、阿拉伯聚糖侧链和阿拉伯半乳聚糖侧链。
阿拉伯聚糖侧链包括至少一个或多个α(1,5)-连接的阿拉伯糖残基，并且取代于RG-I结构域中鼠李糖残基的4-OH位置。阿拉伯聚糖侧链可以是直链或支链的。如果侧链是直链的，则侧链由α(1,5)-连接的阿拉伯糖残基组成。在阿拉伯聚糖侧链是支链侧链的情况下，一个或多个α-阿拉伯糖残基连接至α(1,5)连接的阿拉伯糖的2-OH和/或3-OH。
半乳聚糖侧链包含至少一个或多个β(1,4)-连接的半乳糖残基，并且取代于RG-I结构域中的鼠李糖残基的4-OH位置处。
阿拉伯半乳聚糖侧链取代于RG-I结构域中的鼠李糖残基的4-OH位置处，并且可以是I型阿拉伯半乳聚糖(AGI)或II型阿拉伯半乳聚糖(AGII)。AGI由(1→4)-β-D-Galp骨架构成，在其上可发生单体Galp单元在O-6或O-3位置处的取代。AGI进一步被α-L-Araf-p残基和/或(1→5)-α-L-Araf短侧链取代。AGII由装饰有(1→6)-β-D-Galp二次链的α(1→3)-β-D-Galp骨架构成，这些二次链是阿拉伯糖基化的。
阿拉伯糖残基通常代表水解果胶多糖分离物中存在的果胶多糖中所包含的所有单糖残基的0-50％，更优选地3-48％，并且最优选地5-46％。
半乳糖残基通常代表水解果胶多糖分离物中存在的果胶多糖中所包含的所有单糖残基的0-50％，更优选地3-35％，并且最优选地5-25％。
半乳糖残基和鼠李糖残基优选地以小于4:1，更优选地小于3:1，最优选地小于2:1的摩尔比存在于果胶多糖中。
本发明的第三方面涉及一种制备选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料或药物产品的产品的方法，所述方法包括以最终产品中所包含的至少0.1重量％的干物质的浓度添加根据本发明的水解果胶多糖分离物。
水解果胶多糖分离物优选地以最终产品中所包含的至少0.2％，更优选0.3-95％，最优选1-80重量％的干物质的浓度添加。
本发明的产品可包含痕量的在水解果胶多糖分离物的获得方法中使用的一种或多种果胶酶。这些果胶酶可以活性和/或非活性形式存在于产品中。
在特别优选的实施方案中，水解果胶多糖分离物的果胶多糖代表最终产品中存在的果胶多糖总量的至少20重量％，更优选地至少30重量％，甚至更优选地60重量％，最优选地至少80重量％。
通过以下非限制性实施例来进一步说明本发明。
实施例
实施例1：
将从果汁获得的500kg干燥胡萝卜果渣(蛋白质14-15％、碳水化合物73％(糖16-18％、膳食纤维55％)、灰分3-4％、脂肪6-7％)在搅拌下分散在4500L 45℃的水中。将5kg酶制剂(PectinexTM Ultra Mash，来自诺维信公司(Novozymes)，主要活性果胶裂解酶和聚半乳糖醛酸酶)添加到混合物中(总5000L的0.1％)，之后在45℃温育2小时。温育通过使酶灭活(90℃下30s)，之后在倾析器中进行液固分离来完成。
使用1μm的过滤器过滤如此获得的液体，以去除聚集体/固体。随后，使用10kDa聚醚砜膜(Microdyn Nadir；UP010)通过超滤将液体浓缩至原始体积的1/3。接下来，将渗余物用水稀释至原始体积，并再次浓缩至原始体积的1/3。
通过蒸发浓缩如此获得的渗余物以增加固体含量，然后进行喷雾干燥。
表1显示了如此获得的水解果胶多糖分离物的基本组成。
表1
碳水化合物 蛋白质 脂质 水分 灰分 原纤维
81 6 0.5 6.0 6.0 1.0
分离物的单糖组成使用以下描述的分析方法来测定：Analytical Biochemistry，第207卷，第1期，1992版，第176页(中性糖分析)；以及Mol.Nutr.Food Res.，第61卷，第1期，2017版，1600243(用于糖醛酸分析和分子大小分布)。表2给出结果。
表2
Rha GalA Ara Gal Glc Man Xyl
17 23 33 20 4 0 1
实施例2
将2kg干燥的苹果果渣(蛋白质6.5-8％、碳水化合物71％(糖11％、膳食纤维60％)、灰分1.0-1.5％、脂肪3.0-4.0％。)溶于25L不锈钢容器中的18L水中，并且置于45℃的水浴中。连续地搅拌混合物，以便使不溶组分保持分散。在苹果果渣分散液达到45℃之后，添加20g PectinexTM Ultra Mash。温育持续2小时。在这2小时之后，将容器置于冰浴中。接下来，将分散体填充到离心桶中，并以6000g离心5分钟。在通过10μm过滤器过滤之后，将上清液收集在25L不锈钢容器中。将容器置于98℃的水浴中。在分散体达到90℃的温度之后，将混合物再加热10分钟以使酶失活。接下来，通过将容器置于冰浴中，将混合物冷却至50℃。
通过添加33％(m/m)的NaOH溶液，将混合物的pH设定至pH 5.0。接下来，将混合物浓缩5倍，并在50℃下使用配备有10kDa聚醚砜膜(Microdyn Nadir；UP010)的LAB20装置在超滤膜上用200％的水洗涤。在超滤/渗滤之后，使用实验室规模的冷冻干燥机将分离物冷冻干燥。
分离物的单糖组成在表3中示出。
表3
Rha GalA Ara Gal Glc Man Xyl
8 18 48 9 10 0 6
实施例3
将实施例1的干燥胡萝卜果渣分散在软化水(100g/l)中，并使用3种不同的酶解条件在实验室规模下进行酶促水解：
1.来自诺维信公司的
Figure BDA0002502245630000161
Yield Mash(总分散体的0.2％)
2.来自诺维信公司的
Figure BDA0002502245630000162
Ultra Mash(总分散体的0.2％)
3.来自诺维信公司的
Figure BDA0002502245630000163
Ultra Mash(总分散体的0.05％)
通过在90℃加热10分钟来终止酶解(45℃，120分钟)，然后使用10kDa的聚醚砜膜(Microdyn Nadir；UP010)进行离心和上清液的大量透析。
通过将干燥的胡萝卜渣引入水(100g/l)中，将溶液在90℃的温度下保持120分钟，离心，并以与酶解的分散体相同的渗析对上清液进行渗析，来产生参考分离物。
实施例4
实施例3的非水解胡萝卜RG-I多糖(参考)和实施例3的酶促水解的胡萝卜RG-I多糖(样品1至3)的单糖组成以与实施例1相同的方式来测定
单糖分析的结果示于表4中(Rha＝鼠李糖；GalA＝半乳糖醛酸；Ara＝阿拉伯糖；Gal＝半乳糖。
表4
Figure BDA0002502245630000164
实施例5
使用人外周血单核细胞(PBMC)来测定实施例3的非水解胡萝卜RG-I多糖(参考)和实施例3的酶解胡萝卜RG-I多糖(样品1至3)的免疫调节活性。
免疫调节测定。
为了评估多糖材料对免疫功能的影响，将它们与新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)一起温育。简而言之，使用Ficoll-plaque(Amersham)从血沉棕黄层中分离PBMC。将PBMC(2*10E6细胞/mL)在含有300μg RG-I多糖的RPMI培养基(GibcoTM RPMI 1640培养基)中温育20小时(5％CO2，37℃)。随后，收集上清液，并根据制造商的说明，使用在流式细胞仪(BD FACSCANTO II)上测量的珠子阵列(CBA人炎症试剂盒，BD-Bioscience)来测量细胞因子。将RPMI用作阴性对照，并将LPS(来自大肠杆菌-Sigma L3012-5mG)用作参考，将结果以LPS作为100％进行标准化。数据表示为相对于LPS诱导的反应标准化的百分比，是针对4种不同细胞因子及其总和的3个不同供体的平均值。
表5示出免疫调节测定的结果
表5
样本 TNF IL10 IL6 IL1B 总计
参考文献 23 6 22 17 69
1 200 68 91 81 441
2 367 106 142 214 828
3 435 124 124 150 832
实施例6
水解果胶多糖分离物是从不同来源在经果胶酶处理和未经果胶酶处理的情况下制备的。将通过铃状椒、胡萝卜渣、苹果果渣、柑桔浆、糖用甜菜渣、越橘果渣、红葡萄果渣、白葡萄果渣、菊苣果渣、橄榄果核和橄榄饼的磨碎和干燥获得的粉末分散在去离子水中(100g/L)，然后使用Rapidase C600(包括果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、纤维素酶和半纤维素酶活性的酶混合物，Militz，H.Wood Sci.Technol。(1993)28:9)在45℃下以1g/100mL的总分散体的酶浓度在实验室规模上进行酶促水解120分钟。
通过在100℃下加热10分钟，之后进行离心(18.000g，10分钟)并使用具有12-14kDa的截留值的膜(Visking，伦敦，英国)对上清液进行广泛透析来终止酶解。
通过将干燥的胡萝卜果渣引入水(100g/l)中，将溶液在90℃的温度下保持120分钟，离心，并以与酶解的分散体相同的渗析对上清液进行渗析，来产生参考分离物。
使用人外周血单核细胞(PBMC)测定法以300μg/mL的浓度测定经果胶酶促处理和未经果胶酶促处理产生的分离物的免疫调节活性，如针对实施例3所述。
表6示出免疫调节测定的结果
表6
Figure BDA0002502245630000181
单糖分析的结果示于表7中(Rha＝鼠李糖；GalA＝半乳糖醛酸；Ara＝阿拉伯糖；Gal＝半乳糖。
表7
Figure BDA0002502245630000191
实施例7
使用来自诺维信公司的酶
Figure BDA0002502245630000192
Ultra Mash(条件：总分散体的0.1％w/w，45℃，2小时，酶失活：90℃下10分钟)来按不同规模即在20L(样品1)、5000L(样品2)和10000L(样品3)下重复实施例3。在样品2和3中，不进行离心，使用倾析来使固体与液体分离。使用10kDa膜对上清液进行超滤，以去除小分子组分。
使用与实施例1中相同的方法来分析水解的多糖材料的单糖组成。
分析的结果在表8中示出。
表8
样本 Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] [Gal]:[Rha] [Ara]:[Rha]
1 17 28 30 22 1.6 1.3 1.7
2 17 23 33 20 1.4 1.2 2.0
3 15 28 29 19 1.8 1.2 1.9
乙酰化和甲基化程度如下测定：用氢氧化钠(0.1M，过夜，20℃)处理多糖样品(2-5mg)。使用配备有DB-WAX ETR柱、Cryo Focus-4冷阱和FID检测(改编自Huisman等人，FoodHydrocolloids，18，4，4，2004，665-668)的顶空GC来测量所释放甲醇。
将样品中和(1M HCl)，然后使用配备有带保护柱和R1检测(改编自Voragen等人，Food Hydrocolloids，1,1,1986,65-70)的Aminex HPX 87H柱的HPLC来对所释放乙酰基进行定量测量。酯化程度表示为释放的甲醇和乙酸的摩尔量，以糖醛酸的量的百分比表示。
酯化程度分析的结果在表9中示出。
表9
DM％<sup>1</sup> DA％<sup>2</sup> DA:DM
2 16 42 2.6
3 21 36 1.7
1甲基化程度
2乙酰化程度
实施例8
使用针对实施例5所述的人外周血单核细胞(PBMC)测定来测定实施例7的酶促水解胡萝卜RG-I多糖(样品1至3)的免疫调节活性。结果如表10中所示。
表10
TNF IL10 IL6 IL1B 总计
1 131 61 105 72 368
2 181 70 124 136 511
3 107 35 97 72 311
实施例9
实施例7的样品2的水解多糖材料被进一步水解，之后进行高分子量级分的分离。将多糖材料溶解在去离子水(100g/l)中，并进行进一步的酶促水解(来自诺维信公司的
Figure BDA0002502245630000211
Ultra Mash，45℃，14小时)。通过加热至90℃达10分钟来终止酶解。
使用半制备尺寸排阻色谱法将一部分酶解多糖溶液进行分级分离，以产生包含分子量大于70k Da的多糖的级分。
以与实施例1相同的方式来分析未分级水解多糖和分离的高分子级分的单糖组成。
分析的结果在表11中示出。
表11
Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] Ara:Rha Gal:Rha
未分级 23 31 14 19 1.3 0.6 0.8
＞70kDa 15 23 17 38 1.5 1.1 2.5
使用实施例5中描述的方法来测定酶解多糖及其高分子级分的免疫调节活性。结果在表12中示出。
表12
14小时酶解 TNF IL10 IL6 IL1B 总计
未分级 295 95 130 158 678
＞70kDa级分 302 112 139 174 726
实施例10
将干燥和研磨的豌豆壳粉末(来自Cosucra,Warcoing,Belgium)分散在去离子水(100g/L)中，并在90℃下用热稳定的α-淀粉酶(Megazyme)进行酶促预水解30分钟，并使用果胶酶进行进一步水解(2小时45℃，0.2v/v％的
Figure BDA0002502245630000221
Ultra Mash，Novozymes)。通过在100℃加热10min，之后进行离心(18.000g，10min)并使用具有12-14kDa的截留值的膜(Visking，伦敦，英国)对上清液进行广泛透析来终止酶解。然后将材料冻干。
以与豌豆粉相同的方式处理磨碎的糖用甜菜浆粉末(来自Suiker Unie，Dinteloord，NL)，不同的是省去了α-淀粉酶预温育步骤。
分离物的单糖组成使用与实施例1相同的方法来确定。结果在表13中示出。
表13
样本 Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] [Gal]:[Rha] [Ara]：[Rha]
豌豆 8 57 14 6 7.1 1.8 0.8
糖用甜菜 7 40 45 7 5.7 6.4 1.0
实施例11
通过将胡萝卜渣分散在水中(100g/L)来制备水解果胶多糖分离物。
样品1在不添加酶的情况下在90℃下提取120分钟(提取收率：4.8％)
样品2通过添加Rapidase C600(含有果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、纤维素酶和半纤维素酶活性的酶混合物，Militz，H.Wood Sci.Technol.(1993)28:9)在45℃下以1g/100mL的总分散体的酶浓度在实验室规模上进行酶促水解120分钟。通过在100℃下加热10分钟来终止酶解(提取收率：5.6％)
随后将两个样品进行离心处理(18.000g，10分钟)，并使用截留值为12-14kDa的膜(Visking，伦敦，英国)充分渗析上清液。在超滤/渗滤之后，使用实验室规模的冷冻干燥机将分离物冷冻干燥。
图3显示样品1和样品2的分子大小分布，通过HPSEC并通过折射率检测测定。
使用针对实施例1所述的方法来分析两个样品的单糖组成。分析的结果在表14中示出。
表14
Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] [Ara]：[Rha] [Gal]:[Rha]
样品1 3.7 47.5 8.0 11.5 12.8 3.1 2.2
样品2 8.4 34.7 7.3 12.2 4.1 1.5 0.9

Claims (21)

1.一种生产富含鼠李半乳糖醛酸聚糖-I的水解果胶多糖分离物的方法，所述方法包括以下步骤：
·提供已在不使用有机溶剂的情况下从植物材料中获取的富含乳胶的底物，所述富含乳胶的底物包含具有由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的果胶多糖的至少3重量％的干物质，所述鼠李糖残基包含在由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架中，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·将所述富含果胶的底物进行酶解处理以部分地水解所述果胶多糖，所述处理酶解处理包括使用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛水解酶(EC 3.2.1.173)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶；
·使用具有5至100kDa的截留分子量的超滤膜来对部分水解的果胶多糖进行超滤；以及
·回收超滤渗余物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述富含果胶的底物选自果渣、果渣的水性提取物、油饼、油饼的水性提取物和它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述富含果胶的底物是从选自水果、胡萝卜、橄榄、豌豆、甜菜、菊苣、大豆、向日葵、油菜籽、玉米的一种或多种作物获得的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述果胶分离物是从柑橘、苹果、梨、糖用甜菜、菊苣、胡萝卜获得的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富含果胶的底物包含选自纤维素、半纤维素及其组合的纤维素材料的至少10-80重量％的干物质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中存在于所述底物中的至少50重量％的果胶多糖在1g/l的果胶多糖浓度下不溶于45℃和pH 5.5的蒸馏水。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在酶促处理之后和超滤之前，对包含所述部分水解的果胶多糖的水性液体进行固液分离。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述富含果胶的底物是包含果胶多糖的至少10重量％的干物质的果胶分离物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基以不大于6:1的摩尔比存在于回收的超滤渗余物中。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富含果胶的底物以包含所述富含果胶的底物且具有0.5-40重量％的干物质含量的水性液体形式进行酶促处理。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶促处理在3.0至7.5的pH范围内进行。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种果胶酶选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)和外半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述富含果胶的底物进行酶促处理，所述处理包括在使用所述一种或多种果胶酶进行部分水解之前或与此同时使用一种或多种果胶酯酶(EC 3.1.1.11)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用具有6-50kDa的分子量截留值的超滤膜来对部分水解的果胶多糖进行超滤。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述回收的超滤渗余物干燥至小于15重量％的含水量。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述回收的超滤渗余物包含果胶多糖的至少20重量％的干物质，所述果胶多糖平均包含以所述果胶多糖的总单糖组成计算的至少4mol.％的鼠李糖残基。
17.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的水解果胶多糖分离物。
18.根据权利要求17所述的水解果胶多糖分离物，其中所述半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基以不大于6:1的摩尔比存在于所述水解果胶多糖分离物中。
19.根据权利要求17或18所述的水解果胶多糖分离物，其中所述分离物包含具有小于20kDa的分子量的小于5重量％的糖类。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的水解果胶多糖分离物，其中半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、阿拉伯糖残基和半乳糖残基的组合构成存在于所述水解果胶多糖分离物中所包含糖类中的单糖残基的至少50mol.％。
21.一种制备选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料或药物产品的产品的方法，所述方法包括以最终产品中至少0.1重量％的干物质的浓度添加根据权利要求17-20中任一项所述的水解果胶多糖分离物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061197A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 江南大学 一种制备富含阿拉伯糖侧链的rg-i果胶多糖的方法
WO2022217573A1 (zh) * 2021-04-16 2022-10-20 浙江大学 一种具有高rg-i结构含量果胶的制备方法
CN115960276A (zh) * 2023-03-10 2023-04-14 中国农业科学院农产品加工研究所 一种新型果胶寡糖及其制备方法和应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020002574A1 (en) * 2018-06-28 2020-01-02 Novozymes A/S Enzymatic processing of sugar beets
EP4021203A1 (en) * 2019-08-26 2022-07-06 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. High-fiber / low-sugar fruit snacks
CN115896209A (zh) * 2023-01-05 2023-04-04 西南科技大学 一种富含rg-i高酯的费约果果胶的提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072791A1 (en) * 2000-11-22 2004-04-15 Markwart Kunz Method for producing pectin hydrolysis products
CN102762597A (zh) * 2009-12-11 2012-10-31 联合利华公众股份有限公司 适合调节免疫应答的多糖
WO2016132130A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 Glycomar Limited Method for isolation of polysaccharides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06256198A (ja) * 1993-03-09 1994-09-13 Japan Tobacco Inc 血中コレステロール上昇抑制剤
WO2002082923A1 (en) * 2001-04-10 2002-10-24 Cp Kelco Aps Modified pectic substance
WO2004084652A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Novozymes A/S Method of producing vegetable puree
CL2008002960A1 (es) * 2007-10-04 2009-05-08 Bio Arch Lab Inc Método para producir 2-ceto-3-desoxi d-gluconato (kdg), basado en proporciopnar acido-desoxi l-eritro hexocelulosa uronico (dehu), y contactar dicha molecula con un microorganismo recombinante que codofica una dehu-hidrogenasa.
US9951148B2 (en) * 2011-04-29 2018-04-24 Nutrileads B.V. Method for isolation of polysaccharides
CN102784193A (zh) 2012-08-16 2012-11-21 魏舒畅 采用耦合技术制备红芪提取物的方法
WO2015192247A1 (en) * 2014-06-21 2015-12-23 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Enzymatic production of prebiotic oligosaccharides from potato pulp
KR101774566B1 (ko) 2015-11-05 2017-09-04 한국식품연구원 면역기능 증진 활성이 우수한 효소처리 보리잎 유래 다당 분획물 및 이의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072791A1 (en) * 2000-11-22 2004-04-15 Markwart Kunz Method for producing pectin hydrolysis products
CN102762597A (zh) * 2009-12-11 2012-10-31 联合利华公众股份有限公司 适合调节免疫应答的多糖
WO2016132130A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 Glycomar Limited Method for isolation of polysaccharides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYE-RYUNG PARK等: "Structural elucidation of anti-metastatic rhamnogalacturonan II from the pectinase digest of citrus peels (Citrus unshiu)", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》 *
NASTARAN KHODAEI等: "Extraction and structural characterisation of rhamnogalacturonan I-type pectic polysaccharides from potato cell wall", 《FOOD CHEMISTRY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061197A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 江南大学 一种制备富含阿拉伯糖侧链的rg-i果胶多糖的方法
WO2022217573A1 (zh) * 2021-04-16 2022-10-20 浙江大学 一种具有高rg-i结构含量果胶的制备方法
CN115960276A (zh) * 2023-03-10 2023-04-14 中国农业科学院农产品加工研究所 一种新型果胶寡糖及其制备方法和应用

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