BR112020008076A2 - método para produzir um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado que é enriquecido em ramnogalacturonana-i, isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado e processo para preparar um produto - Google Patents
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Abstract
A invenção fornece um método para produzir um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado que é enriquecido em ramnogalacturonana-I, o dito método compreendendo as etapas de: fornecer um substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico, o dito substrato rico em pectina contendo pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos; submeter o substrato rico em pectina ao tratamento enzimático para hidrolisar parcialmente os polissacarídeos pécticos, o dito tratamento enzimático compreendendo o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), ramnogalacturonana galacturonohidrolase (EC 3.2.1.173), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82); submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 5 a 100 kDa; e recuperar o retentato de ultrafiltração. A presente invenção refere-se ainda ao isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado obtido pelo presente método e a um processo para preparar um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, o dito processo compreendendo a adição do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado anteriormente mencionado.
Description
PARA PREPARAR UM PRODUTO Campo Técnico da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir um isolado de polissacarídeo péctico que é enriquecido em polissacarídeo ramnogalacturonana-l (RG-lI). Mais particularmente, a invenção refere-se a um método para produzir esse isolado de polissacarídeo por hidrólise enzimática de um substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico e que contém uma quantidade significativa de polissacarídeo RG-l, seguido por ultrafiltração e recuperação do retentato.
Antecedentes da Invenção
[002] A pectina é um polissacarídeo heteroestrutural presente nas paredes celulares primárias de plantas terrestres. A composição de polissacarídeo péctico e a estrutura fina variam amplamente dependendo da fonte vegetal e das condições de extração aplicadas. A atividade biológica do polissacarídeo péctico é altamente dependente de sua estrutura fina.
[003] Polissacarídeos — pécticos são um grupo heterogêneo de polissacarídeos que compreende quantidades variáveis dos seguintes componentes polissacarídeos: (i) homogalacturonana (HG), (ii) xilogalacturonana (XG), (iii) apiogalacturonana (GA), (iv) ramnogalacturonana-l| (RG-I) e (v) ramnogalacturonana-ll (RG-II).
[004] A Figura 1 fornece uma representação esquemática da estrutura de polissacarídeos pécticos, incluindo os 4 componentes polissacarídeos anteriormente mencionados. Nota-se que os componentes polissacarídeos AG, XG e RG-l tipicamente representam apenas uma pequena fração dos polissacarídeos pécticos.
[005] Os componentes polissacarídeos HG, XG e RG-ll compreendem, cada um, uma cadeia principal que consiste em uma cadeia linear de unidades de monossacarídeo de ácido D-galacturônico ligadas a-(1-4).
[006] Somente RG-I compreende uma cadeia principal que consiste em uma cadeia linear das unidades de dissacarídeo de repetição: 4)-ácido a-D- galacturônico-(1,2)-a-L-ramnose-(1. Uma representação esquemática da estrutura do RG-| é mostrada na Figura 2.
[007] O domínio homogalacturonana pode ter um comprimento de até cerca de 100 resíduos de D-Gala consecutivos. O domínio RG-| que contém as cadeias laterais é geralmente chamado de “região ramificada” ou “região cabeluda”, enquanto o domínio homogalacturonana (entre dois domínios RG-I) não é tipicamente substituído por oligossacarídeos.
[008] Os resíduos de GalA no RG-l estão ligados aos resíduos de RhA através das posições 1 e 4, enquanto o resíduo de RhA está ligado ao resíduo de GalA através das posições anoméricas e 2-OH. Em geral, cerca de 20 a 80% dos resíduos de RHA são ramiíficados na posição 4-OH (dependendo da fonte vegetal e do método de isolamento), com cadeias laterais neutras e ácidas. Essas cadeias laterais consistem principalmente em resíduos de Ara e Gal ligados de várias maneiras, constituindo polímeros conhecidos como arabinogalactana | (AG-I) e/ou AG-Il. AG | é composto de uma cadeia principal D-Gal ligada em beta-(1,4) com substituições em 3-OH de grupos alfa-L- arabinosil; a cadeia principal Gal pode ter unidades alfa(1,5)-L-Ara. AG-II consiste em galactana altamente ramificada com interior predominantemente D- Gal ligado beta(1,3) com substituições de cadeias curtas ligadas (1,6) exteriormente. Este último tem ainda anexos de L-Ara ligados alfa (1,3) e/ou (1,5). As cadeias laterais de oligossacarídeos podem ser lineares ou ramiíficadas, e algumas dessas cadeias laterais podem ser terminadas com resíduos alfa-L- fucosídeos, beta-D-glucuronídeos e 4-O-metil beta-D-glucuronil.
[009] Khodaei e Karboune (“Extraction and structural characterisation of rhamnogalacturonan I-type pectic polysaccharides from potato cell wall”. Food Chemistry, 1:39 (2013), págs. 617-623) descreveram a extração de polissacarídeos pécticos tipo ramnogalacturonana | (RG-I) ricos em galactana com o uso de métodos alcalinos (NaOH e KOH) e métodos enzimáticos (endopoligalacturonase de Aspergillus niger).
[010] Khodaei e Karboune (“Enzymatic extraction of galactan-rich rhamnogalacturonan | from potato cell wall by-product”. LWT - Food Science and Technology, 57 (2014), págs. 207-216) investigaram ainda os efeitos de parâmetros variáveis na extração enzimática de ramnogalacturonana | (RG |) rico em galactana com o uso de endopoligalacturonase de Aspergillus niger.
[011] O documento WO 2015/192247 descreve um processo para isolar oligossacarídeos não digeríveis a partir de polpa de batata, extrair o conteúdo de ramnogalacturonana da polha de batata, digerir o conteúdo de ramnogalacturonana extraído com uma mistura multienzimática para produzir oligossacarídeos não digeríveis do conteúdo de ramnogalacturonana extraído; e isolar os oligossacarídeos não digeríveis.
[012]O documento WO 2016/132130 descreve um processo para a preparação de um fragmento de RG-l a partir da polpa de batata e seu uso para fornecer atividade imunomodulatória a um sujeito. O processo compreende as etapas de: - fornecer RG-lI obtido a partir da extração enzimática de batata; - preparar um fragmento do dito RG-l, o fragmento tendo um peso molecular médio na faixa de 5k Da a 30k Da, por despolimerização seletiva do dito RG-I| para fornecer o fragmento em que o fragmento tem uma composição de monossacarídeos que compreende: - Arabinose 7 a 13%, - Ramnose 5 a 10%, - Xilose 0 a 1%, - Ácido galacturônico 20 a 40%, e - Galactose 35 a 60%.
[013] A patente CN 102784193 A descreve um método para isolar polissacarídeos a partir de Hedysarum polybotrys.
[014] A patente KR 2017/053144 A descreve a extração de uma fração de polissacarídeo a partir de folhas de cevada. A fração de polissacarídeo é descrita como apresentando atividade de promoção da função de imunidade.
Descrição Resumida da Invenção
[015] Os inventores descobriram que um isolado de polissacarídeo enriquecido em polissacarídeo ramnogalacturonana-| (RG-l) com alta funcionalidade biológica pode ser obtido por um método que compreende: .º submeter um substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico e que contém uma quantidade significativa de polissacarídeo RG-| à hidrólise enzimática para hidrolisar parcialmente o polissacarídeo RG-I; .º submeter o polissacarídeo RG-Il parcialmente hidrolisados à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um corte na faixa de 5 a 100 kDa; .º e recuperar o retentato de ultrafiltração.
[016] A hidrólise enzimática é realizada com a ajuda de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC4.2.2.10), pectato liase (EC
4.2.2.2), — ramnogalacturonana — galacturonohidrolase — (EC —3.2.1.173), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC
3.2.1.82).
[017] Dessa forma, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado que é enriquecido em ramnogalacturonana-l, o dito método compreendendo as etapas de: .º fornecer um substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico, o dito substrato rico em pectina contendo pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos que têm uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os resíduos de ramnose estando contidos em uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1—4)-galacturônico-alfa(1—2)-ramnose; .º submeter o substrato rico em pectina ao tratamento enzimático para hidrolisar parcialmente os polissacarídeos pécticos, o dito tratamento enzimático compreendendo o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), ramnogalacturonana galacturonohidrolase (EC 3.2.1.173), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82); .º submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 5 a 100 kDa; e .º recuperar o retentato de ultrafiltração.
[018] Os inventores descobriram que a hidrólise enzimática parcial dos polissacarídeos pécticos com o uso de uma ou mais das pectinases anteriormente mencionadas, seguida pela remoção de pequenos componentes moleculares, incluindo pequenas moléculas produzidas durante a hidrólise, produz um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado que exibe uma funcionalidade biológica excepcionalmente alta.
[019] Embora os inventores não desejem se vincular à teoria, acredita-se que essa alta funcionalidade biológica seja obtida removendo pelo menos parte dos domínios homogalacturonanas dos polissacarídeos pécticos contidos no substrato, e removendo componentes inativos, como celulose e hemicelulose. A remoção dos domínios homogalacturonanas altera as propriedades físico- químicas dos polissacarídeos pécticos, resultando em configurações tridimensionais da molécula que pode interagir mais efetivamente com os chamados receptores de reconhecimento padrão no trato intestinal e nas Células Mononucleares do Sangue Periférico humano. A remoção de domínios homogalacturonanas dos polissacarídeos pécticos aumenta o conteúdo de domínios RG-lI. Acredita-se que a interação dos domínios de polissacarídeos RG-| com receptores de reconhecimento padrão expressos nas células intestinais e outras células imunologicamente ativas possa modular sua responsividade funcional, que através da produção de mediadores e recirculação de células imunologicamente ativas, pode melhorar a resistência a infecções no trato intestinal, bem como em outros locais do corpo, incluindo a cavidade oral, o trato respiratório, o trato urinário, a vagina e a pele.
[020] O presente método oferece ainda a vantagem de que o polissacarídeo péctico hidrolisado altamente ativo é obtido a partir de um substrato rico em pectina, que foi produzido sem o uso de solvente orgânico. Dessa forma, diferente de alguns métodos de da técnica anterior que utilizam precipitação de solvente orgânico para auxiliar no isolamento de polissacarídeos pécticos, o presente método emprega um substrato rico em pectina que não foi colocado em contato com solvente orgânico, e o processamento adicional desse substrato de acordo com o presente método não necessita do uso de solvente orgânico.
[021] A presente invenção refere-se ainda ao isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado obtido pelo presente método e a um processo para preparar um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, o dito processo compreendendo a adição do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado anteriormente mencionado.
Descrição Detalhada da Invenção
[022] Consequentemente, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado que é enriquecido em ramnogalacturonana-l, o dito método compreendendo as etapas de: O fornecer um substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico, o dito substrato rico em pectina contendo pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos que têm uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os resíduos de ramnose estando contidos em uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1—4)-galacturônico-alfa(1—2)-ramnose; .º submeter o substrato rico em pectina ao tratamento enzimático para hidrolisar parcialmente os polissacarídeos pécticos, o dito tratamento enzimático compreendendo o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), ramnogalacturonana galacturonohidrolase (EC 3.2.1.173), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82); .º submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 5 a 100 kDa; e .º recuperar o retentato de ultrafiltração.
[023] O substrato rico em pectina que é usado no presente método foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico, o que significa que este substrato foi obtido a partir de material vegetal sem que o material vegetal tivesse sido colocado em contato com solvente orgânico. Dessa forma, o substrato rico em pectina não é obtido através de extração ou precipitação com solvente orgânico.
[024] Como usado no presente pedido, os termos “cadeia principal” e “esqueleto” são sinônimos.
[025] O termo “sacarídeo”, como usado no presente pedido, engloba mono, di-, oligo- e polissacarídeos.
[026] O termo “oligossacarídeo”, como usado no presente pedido, refere-se a um polímero de sacarídeo contendo 3 a 10 resíduos de monossacarídeo.
[027] O termo “polissacarídeo”, como usado no presente pedido, a menos que indicado de outro modo, refere-se a um polímero de sacarídeo contendo pelo menos 11 resíduos de monossacarídeo.
[028] O termo “polissacarídeo péctico”, como usado no presente pedido,
refere-se a polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular de pelo menos 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1->4)- galacturônicos-alfa(1—2)-ramnose. O termo “polissacarídeo péctico”, como usado no presente pedido, a menos que indiciado de outro modo, também engloba polissacarídeos pécticos hidrolisados que têm um peso molecular de pelo menos 10 kDa.
[029] O termo “polissacarídeo ramificado”, como usado no presente pedido, refere-se a um polissacarídeo que compreende uma cadeia principal linear de unidades de monossacarídeos ligadas em conjunto por ligações glicosídicas, em que pelo menos uma das unidades de monossacarídeos dentro da cadeia principal carrega uma cadeia lateral de uma ou mais unidades de monossacarídeos glicosidicamente ligadas.
[030] O termo trecho, como usado no presente pedido, refere-se a uma sequência de duas unidades de monossacarídeos glicosidicamente ligadas dentro da cadeia principal de um polissacarídeo, excluindo quaisquer cadeias laterais que estejam anexadas a esta.
[031] O termo “domínio”, como usado no presente pedido, refere-se a um trecho mais quaisquer cadeias laterais que estejam anexadas ao dito trecho.
[032] O termo “trecho de ramnogalacturonana-l” ou “trecho de RG-I" refere- se a um trecho que consiste em pares de ácido galacturônico (GalA) e ramnose (RhA), em que os resíduos de GalA estão ligados aos resíduos de Rha através das posições 1 e 4, enquanto que os resíduos de RhA estão ligados ao resíduo de GalA através das posições anoméricas e 2-OH, isto é, resíduos alternados de alfa(1—4)-galacturônico-alfa(1—-2)-ramnose. O domínio RG-I pode compreender cadeias laterais como, por exemplo, cadeias laterais de galactana, arabinana e arabinogalactana.
[033] O termo “polissacarídeo ramnogalacturonana-l” ou “polissacarídeo RG-I” refere-se a polissacarídeos pécticos opcionalmente ramificados que compreendem uma cadeia principal que contém um ou mais trechos de ramnogalacturonana-l.
[034] O termo “trecho de ácido galacturônico ligado em alfa(|,4)" refere-se a um trecho que consiste em resíduos de alfa(1—4)-galacturônico.
[035] Além dos domínios RG-l, o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado obtido pelo método da presente invenção pode conter um ou mais dos seguintes domínios: .º homogalacturonana (HG), .º xilogalacturonana (XG), .º apiogalacturonana (AG), .º ramnogalacturonana-ll (RG-IlI).
[036] Os domínios XG, AG e RG-ll tipicamente representam somente uma pequena fração dos polissacarídeos RG-l.
[037] Os domínios HG, domínios XG, domínios AG e RG-ll que estão opcionalmente presentes nos polissacarídeos RG-| da presente invenção compreendem uma cadeia principal que consiste em uma cadeia linear de dois ou mais ácidos D-galacturônicos ligados a-(14).
[038] Os domínios HG não contêm nenhuma cadeia lateral. Os grupos carboxila de resíduos de ácido galacturônico dentro da cadeia principal de domínios HG podem ser esterificados. O ácido galacturônico esterificado pode ocorrer sob a forma de éster metílico ou éster acetílico.
[039] A cadeia principal dos domínios XG contém uma ou mais cadeias laterais na forma de D-xilose.
[040] A cadeia principal de domínios AG contém uma ou mais cadeias laterais que são compostas por um ou mais resíduos de D-apiose.
[041] A cadeia principal de RG-ll contém uma ou mais cadeias laterais que não são exclusivamente compostas de D-xilose ou D-apiose. Os grupos carboxila de resíduos de ácido galacturônico dentro da cadeia principal de domínios RG- Il podem ser esterificados. O ácido galacturônico esterificado pode ocorrer sob a forma de éster metílico ou éster acetílico.
[042] A terminologia “grau de acetilação” refere-se ao número de resíduos de acetila por resíduo de ácido galacturônico, expresso como porcentagem.
[043] A terminologia “grau de metilação” refere-se ao número de resíduos de metila por resíduo de ácido galacturônico, expresso como percentagem.
[044] A concentração de diferentes polissacarídeos e sua composição de monossacarídeos pode ser determinada por técnicas analíticas conhecidas pelo técnico no assunto. Após metanólise, a composição de monossacarídeos pode ser adequadamente determinada por Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência combinada com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAEC-PAD).
[045] A distribuição de tamanho molecular pode ser determinada por Cromatografia de Exclusão por Tamanho de Alto Desempenho com o uso de índice refrativo (RI), detecção (concentração), detecção de espalhamento de luz (detecção de massa molecular), detecção de UV (indicativo para presença de proteínas) e detecção de pressão diferencial (detecção de viscosidade intrínseca).
[046]Os métodos analíticos mencionados acima são descritos em: Analytical Biochemistry Vol. 207, Edição 1, 1992, pág. 176 (para metanólise e análise de açúcar neutro) e em Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Edição 1, 2017, 1600243 (para a análise de ácido galacturônico e distribuição de tamanho molecular).
[047] O termo “bagaço” ou “torta”, como usado no presente pedido, refere- se aos resíduos de frutas, hortaliças ou sementes, opcionalmente secos, que permanecem depois de se pressionar para suco ou óleo. O termo “torta de óleo” refere-se à torta que é obtida após a remoção de óleo a partir de sementes, frutas ou hortaliças.
[048] Todas as porcentagens mencionadas no presente pedido, a menos que estabelecido de outra forma, referem-se à porcentagem, em peso.
[049] O presente método preferencialmente não emprega nenhum solvente orgânico. Em outras palavras, o substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico é ainda processado
(tratamento enzimático e ultrafiltração) para produzir o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado desejado, sem o uso de solvente orgânico.
[050] O substrato rico em pectina usado no presente método contém preferencialmente pelo menos 4%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 6%, em peso, de matéria seca, ainda mais preferencialmente pelo menos 8%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos.
[051] Os polissacarídeos pécticos no substrato rico em pectina são preferencialmente caracterizados por um peso molecular ponderal médio de pelo menos 100 kDa, mais preferencialmente pelo menos 150 kDa, com a máxima preferência pelo menos 200 kDa.
[052] Os polissacarídeos pécticos no substrato rico em pectina têm tipicamente um teor médio de ramnose de pelo menos 0,1%, em mol, mais preferencialmente de pelo menos 0,5%, em mol, até mais preferencialmente de pelo menos 1%, em mol, calculado sobre a composição total de monossacarídeos dos polissacarídeos pécticos.
[053] O substrato rico em pectina que é empregado no presente método pode ser obtido a partir de diferentes culturas. Em uma realização preferencial, o substrato rico em pectina é obtido a partir de uma ou mais culturas selecionadas a partir de frutas (incluindo tomate), cenoura, azeitona, ervilhas, beterraba — sacarina, chicória, soja, girassol, colza e milho. Mais preferencialmente, o substrato rico em pectina é obtido a partir de uma ou mais culturas selecionadas a partir de maçã, pera, cítricos, cenoura, beterraba sacarina e chicória. Ainda mais preferencialmente, o substrato rico em pectina é obtido a partir de uma ou mais culturas selecionadas de maçã, pera, cenoura e chicória. De acordo com uma realização particularmente preferencial, o substrato rico em pectina é obtido a partir de cenoura e/ou maçã.
[054] O material de cultura rico em pectina pode ser usado como substrato rico em pectina no presente método. Esse material de cultura deve ser triturado para produzir uma polpa ou suco, a fim de permitir que as pectinases quebrem os polissacarídeos pécticos no substrato. O material de cultura triturado pode ser seco ou concentrado antes do uso no presente método.
[055] Preferencialmente, o substrato rico em pectina é obtido como um fluxo secundário de um processo de produção que usa material de cultura como material de partida e em que nenhum solvente orgânico ou reações químicas são empregadas até o estágio do processo no qual o fluxo secundário é gerado. De acordo com uma realização particularmente preferencial do presente método, o substrato rico em pectina é selecionado a partir de bagaço, extrato aquoso de bagaço, torta de oleaginosas, extrato aquoso de torta de oleaginosas, raspas, cascas, caroços, sementes e combinações dos mesmos. Com a máxima preferência, o substrato rico em pectina é selecionado a partir de bagaço, extrato aquoso de bagaço e combinações dos mesmos.
[056] O substrato rico em pectina que é empregado no presente método pode ser adequadamente obtido por um procedimento que inclui moagem, aquecimento, micro-ondas, secagem ou técnicas alternativas que interrompem as estruturas da parede celular para facilitar a hidrólise enzimática dos polissacarídeos pécticos.
[057] O substrato rico em pectina tem preferencialmente um teor de água não maior que 15%, mais preferencialmente não maior que 10%, e com a máxima preferência não maior que 8%.
[058] O substrato rico em pectina é preferencialmente submetido ao tratamento enzimático sob a forma de um líquido aquoso contendo o substrato rico em pectina e que tem um teor de matéria seca de 0,5 a 40%, em peso, mais preferencialmente de 1 a 30%, em peso, até mais preferencialmente de 2 a 20%, em peso, com a máxima preferência de 3 a 15%, em peso. Este líquido aquoso pode ser adequadamente preparado combinando o substrato rico em pectina com a água.
[059] O substrato rico em pectina preferencialmente constitui pelo menos 50%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 75%, em peso, e com a máxima preferência pelo menos 85%, em peso, da matéria seca que está contida no líquido aquoso que é submetido ao tratamento enzimático.
[060] O tratamento enzimático do método de acordo com a invenção é preferencialmente realizado a um pH na faixa de 3,0 a 7,5, mais preferencialmente na faixa de 4 a 7,5, até mais preferencialmente na faixa de 4,5 a 7, com a máxima preferência, na faixa de 5a7.
[061] O tratamento usado para hidrolisar parcialmente os polissacarídeos pécticos preferencialmente emprega uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15) e exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC
3.2.1.82).
[062] De acordo com uma realização preferencial, os polissacarídeos pécticos são parcialmente hidrolisados com o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de endopoligalacturonase (EC 32115) e exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82).
[063] De acordo com outra personificação preferida, os polissacarídeos pécticos são parcialmente hidrolisados usando uma ou mais pectinases selecionadas de pectina liase (EC 4.2.2.10) e pectato liase (EC 4.2.2.2). À hidrólise de polissacarídeos pécticos por essas liases inevitavelmente produz fragmentos de polissacarídeos que contêm um resíduo de ácido galacturônico sem redução insaturado terminal.
[064] Os polissacarídeos pécticos são preferencialmente hidrolisados no presente processo com o uso de uma combinação de uma ou mais pectinases e uma ou mais pectinesterases anteriormente mencionadas (EC 3.1.1.11). Uma ou mais pectinesterases podem ser empregadas antes ou simultaneamente com uma ou mais pectinases. O uso combinado de pectinases e pectinesterases é particularmente vantajoso no caso da pectinase empregada ser selecionada a partir de endopoligalacturonase, exopoligalacturonase e combinações das mesmas. O uso combinado de pectinases e pectinesterases tipicamente produz polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados que têm um grau reduzido de metilação e uma razão aumentada de acetilação/metilação.
[065] De acordo com uma realização particularmente preferencial, o substrato rico em pectina é submetido ao tratamento enzimático que compreende o uso de uma ou mais pectinesterases (EC 3.1.1.11) antes ou simultaneamente à hidrólise parcial com o uso de uma ou mais pectinases. Com a máxima preferência, o tratamento enzimático com pectinesterases e o tratamento enzimático com uma ou mais pectinases são realizados simultaneamente.
[066] No presente método, o substrato rico em pectina pode ser adequadamente tratado com celulase e/ou hemicelulase (EC 3.2.1.4, EC
3.2.1.176, EC 3.2.1.203) antes do tratamento enzimático com pectinase ou como parte do dito tratamento. O tratamento com celulase e/ou hemicelulase quebra as paredes celulares das plantas no substrato e, assim, induz a liberação das pectinas contidas nessas paredes celulares, tornando essas pectinas mais acessíveis para pectinases.
[067] O tratamento enzimático do substrato rico em pectina com uma ou mais pectinases é preferencialmente realizado a uma temperatura na faixa de 15 a 70 ºC, mais preferencialmente de 25 a 55 ºC. A duração do tratamento enzimático —preferencialmente é de pelo menos 10 minutos, mais preferencialmente 20 minutos a 3 horas.
[068] O presente método pode empregar adequadamente um substrato rico em pectina que contém uma quantidade relativamente alta de material de parede celular da planta mais ou menos intacto. Tipicamente, esse substrato rico em pectina contém pelo menos 40%, em peso, de matéria seca de material de celulose selecionado a partir de celulose, hemicelulose e combinações das mesmas. Tipicamente, uma grande fração dos polissacarídeos pécticos nesses substratos é insolúvel em água, isto é, os polissacarídeos pécticos que estão presos na matriz de celulose/hemicelulose da parede celular da planta (fragmentos). — Preferencialmente, pelo menos 50%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no substrato não se dissolvem em água destilada a 45 ºC e pH 5,5 em uma concentração de polissacarídeo péctico de 1 g/L.
[069] De acordo com uma realização particularmente preferencial do presente método, após o tratamento enzimático e antes da ultrafiltração, os polissacarídeos pécticos solúveis em água são separados dos sólidos não solúveis em água, submetendo um líquido aquoso contendo os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados à separação sólido-líquido. Exemplos de técnicas de separação sólido-líquido que podem ser empregadas incluem sedimentação, decantação, centrifugação, hidrociclones e/ou filtração. Esta realização particular oferece a vantagem de que uma alta produção dos polissacarídeos pécticos desejados pode ser obtida.
[070] Em uma realização do presente método, o substrato rico em pectina contém 10 a 80%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos de parede celular selecionados a partir de pectinas, celulose, hemicelulose e combinações das mesmas. Mais preferencialmente, o substrato contém 20 a 70%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos da parede celular. Com a máxima preferência, o substrato contém 30 a 60%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos de parede celular. O bagaço é um exemplo de um substrato rico em pectina que pode ser usado no presente método e que contém uma quantidade relativamente alta de polissacarídeos de parede celular.
[071] O bagaço tipicamente contém 2 a 50%, em peso, de matéria seca, preferencialmente 5 a 40%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente a 30%, em peso, de matéria seca, de carboidratos que têm peso molecular menor que 20 kDa.
[072] O teor de proteína do bagaço típico está na faixa de O a 20% de proteína, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente 1 a 18% de proteína, em peso, de matéria seca, ainda mais preferencialmente 2 a 16% de proteína, em peso, de matéria seca.
[073] Na realização do presente método no qual o substrato rico em pectina é bagaço ou torta de oleaginosas, preferencialmente, o material não dissolvido (tamanho da partícula > 5 um) é removido do bagaço tratado enzimaticamente ou da torta de oleaginosas tratada enzimaticamente antes da ultrafiltração. O material não dissolvido é preferencialmente removido por meio de separação sólido-líquido, mais preferencialmente por decantação, centrifugação e/ou filtração.
[074] Em outra realização do presente método, o substrato rico em pectina é um isolado de pectina contendo pelo menos 10%, em peso, de matéria seca, preferencialmente pelo menos 20%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 40%, em peso, de matéria seca, dos polissacarídeos pécticos, e menos que 20%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos de parede celular selecionados a partir de celulose, hemicelulose e combinações das mesmas. Mais preferencialmente, o isolado de pectina contém polissacarídeos de parede celular em uma concentração menor que 10%, em peso, de matéria seca, ainda mais preferencialmente menor que 5%, em peso, de matéria seca. Os extratos aquosos de bagaço e extratos aquosos de torta de oleaginosa são exemplos de isolados de pectina que podem ser empregados no presente método como substrato rico em pectina.
[075] Preferencialmente, o extrato aquoso de bagaço é obtido por uma sequência de etapas de extração aquosa, mais preferencialmente pelo menos duas etapas de extração aquosa. Consequentemente, a primeira etapa de extração compreende preferencialmente a mistura de bagaço com água seguida de separação sólido-líquido. A segunda etapa preferencialmente compreende misturar a fração sólida recuperada com água, seguida por outra separação sólido-líquido. Métodos adequados de separação sólido-líquido são, por exemplo, decantação, centrifugação e filtração.
[076] Preferencialmente, a extração aquosa é realizada a um pH na faixa de 2,0 a 8,5, mais preferencialmente a um pH na faixa de 4,5 a 7,5, ainda mais preferencialmente a um pH na faixa de 6,0 a 7,0.
[077] Em uma realização particularmente preferencial do presente método, os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados são submetidos à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 6 a 50 kDa, preferencialmente na faixa de 7 a 40 kDa, mais preferencialmente na faixa de 8 a 30 kDa.
[078] O retentato de ultrafiltração recuperado pode ser adequadamente seco com o uso de uma ou mais técnicas de secagem selecionadas a partir de secagem por aspersão, liofilização, secagem por ar, secagem em rolo, secagem em leito plano, secagem em esteira e secagem em tambor.
[079] Preferencialmente, o retentato de ultrafiltração recuperado é seco até um teor de água menor que 15%, em peso, mais preferencialmente menor que 13%, em peso, até mais preferencialmente menor que 11%, em peso, e com a máxima preferência menor que 9%, em peso.
[080] O retentato de ultrafiltração recuperado contém preferencialmente resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose em uma razão molar não maior que 6:1, mais preferencialmente não maior que 5:1, até mais preferencialmente não maior que 4:1, com a máxima preferência não maior que 3,5:1.
[081] Os polissacarídeos pécticos que estão presentes no retentato de ultrafiltração recuperado têm preferencialmente um teor médio de ramnose de pelo menos 4%, mais preferencialmente 5 a 50%, até mais preferencialmente 6 a 45%, ainda mais preferencialmente 6,5 a 40%, e com a máxima preferência 7 a 30%, calculado sobre a composição total de monossacarídeos dos polissacarídeos pécticos.
[082] O retentato de ultrafiltração recuperado contém preferencialmente pelo menos 5%, em peso, de matéria seca, preferencialmente pelo menos 15%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 25%, em peso, de matéria seca, com a máxima preferência pelo menos 50%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos, os ditos polissacarídeos pécticos tendo um teor médio de ramnose de pelo menos 4%, em mol, calculado sobre a composição total de monossacarídeos dos polissacarídeos pécticos.
[083] De acordo com uma realização ainda preferencial, os polissacarídeos pécticos no retentato recuperado têm um peso molecular ponderal médio de mais de 20 kDa, mais preferencialmente de mais de 30 kDa, ainda mais preferencialmente de mais de 40 kDa, com a máxima preferência de mais de 50 kDa.
[084] O método da presente invenção preferencialmente produz um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado, conforme especificado abaixo.
[085]UmM segundo aspecto da invenção refere-se a um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado obtido pelo método de acordo com a invenção.
[086] O isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado tipicamente tem um teor de matéria seca de pelo menos 85%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 90%, em peso, e com a máxima preferência pelo menos 95%, em peso.
[087] Preferencialmente, o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado contém pelo menos 10%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 20%, em peso, de matéria seca, até mais preferencialmente pelo menos 40%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos, os ditos polissacarídeos pécticos tendo um teor médio de ramnose de pelo menos 4%, em mol, calculado sobre a composição total de monossacarídeos dos polissacarídeos pécticos.
[088] De acordo com uma realização particularmente preferencial, os polissacarídeos pécticos hidrolisados têm um peso molecular ponderal médio de mais de 20 kDa, mais preferencialmente de mais de 30 kDa, ainda mais preferencialmente de mais de 40 kDa, com a máxima preferência de mais de 50 kDa.
[089] Em uma realização particular, o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado contém menos de 15%, em peso, menos de 10%, em peso, mais preferencialmente menos de 5%, em peso, com a máxima preferência menos de 1%, em peso, de sacarídeos (polissacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos e monossacarídeos) que têm peso molecular menor que 2,5 kDa.
[090] Preferencialmente, o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado contém menos de 30%, em peso, mais preferencialmente menos de 20%, em peso, até mais preferencialmente menos de 10%, em peso, de substâncias orgânicas que têm um peso molecular menor que 20 kDa.
[091] Tipicamente, o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado contém menos de 15%, em peso, de matéria seca, preferencialmente menos de 10%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente menos de 5%, com a máxima preferência menos de 1%, em peso, de matéria seca, de polissacarídeos insolúveis selecionados a partir de celulose, hemicelulose, lignina e amido.
[092] O teor de proteína do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado preferencialmente não excede 15%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente está na faixa de 0,5 a 10%, em peso, de matéria seca e com a máxima preferência na faixa de 1 a 5%, em peso, de matéria seca.
[093] Preferencialmente, o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado contém pelo menos 10%, em peso, de matéria seca, preferencialmente pelo menos 20%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 30%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos, os ditos polissacarídeos pécticos tendo um teor médio de ramnose de pelo menos 5%, em mol, mais preferencialmente pelo menos 6%, calculado sobre a composição total de monossacarídeos dos polissacarídeos pécticos.
[094] Tipicamente, a combinação de resíduos de ácido galacturônico, resíduos de ramnose, resíduos de arabinose e resíduos de galactose constitui pelo menos 50%, em mol, dos resíduos de monossacarídeo presentes nos sacarídeos que estão contidos no isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado. Mais preferencialmente, esta combinação constitui pelo menos 60%, em mol, até mais preferencialmente pelo menos 65%, em mol, ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, em mol, e com a máxima preferência pelo menos 75%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos no isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado.
[095]EM uma realização particularmente preferencial do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado, a combinação de resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose representa pelo menos 15%, em mol, mais preferencialmente 17 a 70%, em mol, com a máxima preferência 18 a 60%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos presentes nos sacarídeos que estão contidos no isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado.
[096] Resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose estão preferencialmente presentes em um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado em uma razão molar não maior que 6:1, mais preferencialmente não maior que 5:1, até mais preferencialmente não maior que 4:1, com a máxima preferência não maior que 3,5:1.
[097] Os resíduos de ramnose tipicamente representam 5 a 50%, mais preferencialmente 6 a 45%, até mais preferencialmente 6,5 a 40%, e com a máxima preferência 7 a 30% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos pécticos que estão presentes no isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado.
[098] Os resíduos de ácido galacturônico tipicamente representam 5 a 80%, mais preferencialmente 8 a 60%, e com a máxima preferência 10 a 50% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos pécticos que estão presentes no isolado de polissacarídeos pécticos hidrolisados.
[099] Os polissacarídeos pécticos no isolado preferencialmente têm um peso molecular ponderal médio não maior que 800 kDa. Mais preferencialmente, os polissacarídeos pécticos têm um peso molecular ponderal médio entre 22 kDa e 500 kDa, com a máxima preferência entre 25 kDa e 250 kDa.
[0100] Em uma realização particular, os polissacarídeos pécticos no isolado da presente invenção têm preferencialmente um grau médio de acetilação de pelo menos 10%, mais preferencialmente de 20 a 110%, até preferencialmente de 25 a 100% e com a máxima preferência de 30 a 80%.
[0101] Em uma realização particular adicional, os polissacarídeos pécticos no isolado preferencialmente têm um grau médio de metilação não maior que 60%, mais preferencialmente não maior que 50%, e com a máxima preferência de 5 a 30%.
[0102] A cadeia principal dos polissacarídeos pécticos no isolado pode compreender uma ou mais cadeias laterais. Essas cadeias laterais podem conter resíduos de arabinose e/ou galactose, e pequenas quantidades de resíduos dos monômeros de fucose, glicose, ácido glucurônico, xilose e/ou ácido urônico. Uma ou mais cadeias laterais são preferencialmente selecionadas a partir de cadeias laterais de galactana, cadeias laterais de arabinano e cadeias laterais de arabinogalactana.
[0103] A cadeia lateral de arabinana compreende pelo menos um ou mais resíduos de arabinose ligados alfa(1,5) e é substituída na posição 4-OH de resíduos de ramnose no domínio RG-l. A cadeia lateral de arabinana pode ser linear ou ramificada. No caso da cadeia lateral ser linear, a cadeia lateral consiste em resíduos de arabinose ligados alfa(1,5). No caso da cadeia lateral de arabinana ser uma cadeia lateral ramificada, um ou mais resíduos de alfa- arabinose estão ligados em 2-OH e/ou 3-OH de arabinoses ligadas alfa(1,5).
[0104] A cadeia lateral de galactana compreende pelo menos um ou mais resíduos de galactose ligados alfa(1,4) e é substituída na posição 4-OH de resíduos de ramnose no domínio RG-l.
[0105] A cadeia lateral de arabinogalactana é substituída na posição 4- OH de um resíduo de ramnose no domínio RG-|l e pode ser uma arabinogalactana tipo | (AGI) ou uma arabinogalactana tipo Il (AGII). AGI é composta por uma cadeia principal (1—4)-B-D-Galp na qual podem ocorrer substituições por unidades monoméricas de Galp na posição O-6 ou O-3. AGI é ainda substituída por resíduos a-L-Araf-p e/ou por cadeias laterais curtas (1—5)- a-L-Araf. AGII é composta por cadeia principal a(1—3)-B-D-Galp decorada com cadeias secundárias (1—6)-B-D-Galp , as quais são arabinosiladas.
[0106] Os resíduos de arabinose tipicamente representam O a 50%, mais preferencialmente 3 a 48%, e com a máxima preferência 5 a 46% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos pécticos que estão presentes no isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado.
[0107] Os resíduos de galactose tipicamente representam de O a 50%, mais preferencialmente 3 a 35%, e com a máxima preferência 5 a 25% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos pécticos que estão presentes no isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado.
[0108] Os resíduos de galactose e ramnose estão preferencialmente presentes nos polissacarídeos pécticos do isolado em uma razão molar menor que 4:1, mais preferencialmente menor que 3:1, com a máxima preferência menor que 2:1.
[0109] Um terceiro aspecto da invenção refere-se a um processo para preparar um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, o dito processo compreendendo a adição do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado de acordo com a invenção em uma concentração de pelo menos 0,1%, em peso, da matéria seca que está contida no produto final.
[0110] O isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado é preferencialmente adicionado em uma concentração de pelo menos 0,2%, mais preferencialmente 0,3 a 95%, com a máxima preferência 1 a 80%, em peso, da matéria seca que está contida no produto final.
[0111] O produto da presente invenção pode conter traços de uma ou mais pectinases empregadas no método para obter o isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado. Essas pectinases podem estar presentes no produto na forma ativa e/ou inativa.
[0112] Em uma realização particularmente preferencial, os polissacarídeos pécticos do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado representam pelo menos 20%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 30%, em peso, até mais preferencialmente 60%, em peso, e com a máxima preferência pelo menos 80%, em peso, da quantidade total de polissacarídeos pécticos presentes no produto final.
[0113] A invenção é ainda ilustrada pelos Exemplos não limitantes a seguir.
Exemplos Exemplo 1
[0114] 500 kg de bagaço de cenoura seco (proteínas 14 a 15%, carboidratos 73% (açúcares 16 a 18%, fibra dietética 55%), cinzas 3 a 4%, gordura 6 a 7%) obtido a partir de prensagem de suco foram dispersos em 4500 L de água a 45 ºC, sob agitação. 5 kg de preparação enzimática (PectinexTY Ultra Mash, ex Novozymes, atividade principal de pectina liase e poligalacturonase) foram adicionados à mistura (0,1% do total de 5.000 L), seguido por incubação a 45 ºC por 2 horas. A incubação foi concluída por inativação da enzima (90 ºC por 30 s), seguida por separação líquido-sólido em um decantador.
[0115] O líquido assim obtido foi filtrado com o uso de um filtro de 1 um, para remover agregados/sólidos. Subsequentemente, o líquido foi concentrado para 1/3 do volume original por ultrafiltração com o uso de uma membrana de polietersulfona de 10 kDa (Microtyn Nadir; UPO010). Em seguida, o retentato foi diluído para o volume original com água e novamente concentrado para 1/3 do volume original.
[0116] O retentato obtido foi concentrado por evaporação para aumentar o teor de sólidos e, em seguida, seco por aspersão.
[0117] A Tabela 1 mostra a composição básica do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado assim obtido.
Tabela 1 LL 8 | 6 | os | 60 | 60 | 10 |
[0118] A composição de monossacarídeos do isolado foi determinada com o uso dos métodos analíticos descritos em: Analytical Biochemistry Vol. 207, Edição 1, 1992, pág. 176 (análise de açúcar neutro) e em Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Edição 1, 2017, 1600243 (para a análise de ácido urônico e distribuição de tamanho molecular). A Tabela 2 mostra os resultados.
Tabela 2 LL 17 | 23 | 3 | 2 | a | o | 1 |) Exemplo 2
[0119] 2 kg de bagaço de maçã seco (proteína 6,5 a 8%, carboidratos 71% (açúcares 11%, fibra dietética 60%), cinzas 1,0 a 1,5%, gordura 3,0 a 4,0%) foram dissolvidos em 18 kg de água em um recipiente de aço inoxidável de 25L e colocados em um banho de água de 45 ºC. A mistura foi agitada continuamente a fim de manter os componentes insolúveis em dispersão. 20 g de PectinexT" Ultra Mash foram adicionado após a dispersão de bagaço de maçã ter atingido 45 ºC. A incubação continuou por 2 horas. Após essas 2 horas, o recipiente foi colocado em um banho de gelo. Em seguida, a dispersão foi preenchida em recipientes de centrífuga e centrifugada por 5 minutos a 6000 g. Os sobrenadantes foram coletados em um recipiente de aço inoxidável de 25 L após filtração em um filtro de 10 um. O recipiente foi colocado em um banho de água de 98 ºC. Após a dispersão ter atingido a temperatura de 90 ºC, a mistura foi aquecida por mais 10 min para inativar a enzima. Em seguida, a mistura foi resfriada até 50 ºC, colocando o recipiente em um banho de gelo.
[0120] O pH da mistura foi ajustado para pH 5,0 adicionando uma solução de NaOH a 33% (m/m). Em seguida, a mistura foi concentrada por um fator 5 e lavada com 200% de água sobre uma membrana de ultrafiltração usando uma configuração LAB20 equipada com membrana de polietersulfona de 10 kDa (Microtyn Nadir; UPO010) a 50 ºC. Após ultrafiltração/diafiltração, o isolado foi liofiizado com o uso de um liofilizador em escala laboratorial.
[0121] A composição de monossacarídeos do isolado é mostrada na Tabela 3.
Tabela 3 LL 8 | 18 [| 48 | 98 [| 1% | o | 6 | Exemplo 3
[0122] O bagaço de cenoura seco do Exemplo 1 foi disperso em água desmineralizada (100 g/L) e submetido à hidrólise enzimática em escala laboratorial usando 3 diferentes condições de enzimólise:
1. —Pectinexº Yield Mash ex Novozymes (0,2% p/p de dispersão total)
2. —Pectinexº Ultra Mash ex Novozymes (0,2% p/p de dispersão total)
3. —Pectinexº Ultra Mash ex Novozymes (0,05% p/p de dispersão total)
[0123] A enzimólise (45 ºC, 120 minutos) foi concluída aquecendo a 90 ºC por 10 min, seguida de centrifugação e diálise extensiva do sobrenadante com o uso de uma membrana de polietersulfona de 10 kDa (Microtyn Nadir; UPO010).
[0124] Um isolado de referência foi produzido por introdução do bagaço de cenoura seco em água (100 g/L), mantendo a solução por 120 minutos a uma temperatura de 90 ºC, centrifugação e diálise do sobrenadante por meio de diálise da mesma maneira que as dispersões de enzimólise.
Exemplo 4
[0125] A composição de monossacarídeos do polissacarídeo RG-| de cenoura não hidrolisado do Exemplo 3 (Referência) e do polissacarídeo RG-| de cenoura hidrolisado enzimaticamente do Exemplo 3 (Amostras 1 a 3) foi determinada da mesma forma que no Exemplo 1
[0126] Os resultados da análise de monossacarídeos são mostrados na Tabela 4 (Rha = ramnose; GalA = ácido galacturônico; Ara = arabinose; Gal = galactose.
Tabela 4 ro [STE a [ga eram Teia [enres Rha GalA Ara Gal | Referência | 6 | 62 | 14 [16 | 13 | 27 | 23 | | 1 | 10 [45 [19 [23 [| 46 | 23 | 20 | Exemplo 5
[0127] A atividade imunomoduladora dos polissacarídeos RG-| de cenoura não hidrolisados do Exemplo 3 (Referência) e dos polissacarídeos RG- | de cenoura hidrolisados enzimaticamente do Exemplo 3 (Amostras 1 a 3) foi determinada com o uso de um ensaio de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC).
Ensaio de Imunomodulação
[0128] Para avaliar o efeito dos materiais de polissacarídeos na função imune eles foram incubados com Células Mononucleares de Sangue Periférico recém-isoladas (PBMC). Em resumo, as PBMC foram isoladas a partir de camadas leucoplaquetárias de sangue com o uso da placa Ficoll (Amersham). As PBMC (2*10E6 células/mL) foram incubadas em meio RPMI (WMeio Gibco'Y" RPMI 1640) com 300 ug de polissacarídeos RG-| por 20 h (CO2 5%, 37 ºC). Subsequentemente, os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram medidas com o uso de um arranjo de microesferas (kit de inflamação humana CBA, BD-Bioscience), medidas em um citômetro de fluxo (BD FACSCANTO Il), de acordo com as instruções do fabricante. RMI foi usado como controle negativo e LPS (de E. coli - Sigma L3012-5mG) como referência à qual os resultados foram normalizados com LPS como 100%. Os dados são expressos como % normalizadas para a resposta induzida por LPS, com média de 3 doadores diferentes para 4 citocinas diferentes e sua soma.
[0129] A Tabela 5 mostra os resultados desse ensaio de imunomodulação.
Tabela 5 | Referênia | 23 | 6 | 2 | 17 | 6 | LL 1 | 20 | 6 | 9 | 8 | 44 | Exemplo 6
[0130] Isolados de polissacarídeos pécticos hidrolisados foram preparados a partir de diferentes fontes, com e sem tratamento de pectinase. Os pós obtidos por trituração e secagem de pimentão, bagaço de cenoura, bagaço de maçã, polpa de cítricos, polpa de beterraba sacarina, bagaço de bilberry, bagaço de uva vermelha, bagaço de uva branca, bagaço de chicória, caroços de azeitona e torta de azeitona foram dispersos em água desmineralizada (100 g/L) e submetidos à hidrólise enzimática em escala laboratorial com o uso de Rapidase C600 (uma mistura enzimática contendo atividade de pectina liase, poligalacturonase, pectina esterase, celulase e hemicelulase, Militz, H. Wood Sci. Technol. (1993) 28: 9) com concentração enzimática de 1 g/100 mL de dispersão total, a 45 ºC, por 120 minutos.
[0131] A enzimólise foi concluída aquecendo a 100 ºC por 10 min, seguida por centrifugação (18.000 g, 10 min) e por diálise extensiva do sobrenadante com o uso de uma membrana com um corte de 12 a 14 kDa (Visking, Londres, Reino Unido).
[0132] Isolados de referência foram produzidos introduzindo os pós secos em água (100 g/L), mantendo a solução por 120 minutos a uma temperatura de 90 ºC, centrifugação e diálise do sobrenadante por meio de diálise da mesma maneira que as dispersões de enzimólise.
[0133] A atividade imunomoduladora dos isolados produzidos com e sem tratamento de pectinase foi determinada com o uso do ensaio de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) em uma concentração de 300 microg/mL, conforme descrito para o Exemplo 3.
[0134] A Tabela 6 mostra os resultados desse ensaio de imunomodulação.
Tabela 6 Fonte Enzima TNF 110 I1L6 11B | Soma | Pimentão Não 53 19 67 80 219 Sim E) 21 75 89 275 Cenoura Não 23 6 22 38 89 Sim 480 58 85 132 755 Bagaço de maçã Não 15 8 21 18 57 gas S sim 70 26 64 42 202 Polpa de cítricos Não 9 1 4 vv 22 P' Sim 181 37 87 123 428 Polpa de beterraba Não o o o 3 3 sacarina Sim 4 2 7 20 33 ; Não o o 2 10 12 Uva vermelha Não 43 17 47 22 129 Sim 167 54 106 88 415 Uva branca Não 100 20 61 34 215 Sim 108 49 79 51 287 Caroço de azeitona Não 83 55 Sô So 274 & Sim 162 87 108 EX 448 Torta d it Não 51 9 49 19 128 ora de azeitona Sim 87 29 77 34 227 Polpa de chicória Não 24 3 38 12 82 Pp Sim 128 62 94 73 357
[0135] Os resultados da análise de monossacarídeos são mostrados na Tabela 7 (Rha = ramnose; GalA = ácido galacturônico; Ara = arabinose; Gal = galactose. Tabela 7 Mol% | Mol% | Mol% | Mol% | (GalA): (Ara): Rha GalA Arà Gal Rha Rha) Pimentão Não 6 71 8 7 12,1 13 13 Sim 1 46 8 18 4,3 1,2 o,7 C Não 6 62 14 16 10,6 2,8 24 enoura Sim 14 47 13 18 34 13 1,0 Bagaço de Não 2 31 33 E 19,9 67 211 maçã Sim 8 14 46 10 18 13 6,0 Polpa de Não 4 39 32 13 9,9 3,3 8,2 cítricos Sim 8 30 37 10 3,9 13 4,9 made | Não 4 54 32 7 131 18 | 78 : sim 8 39 36 u 4,7 13 44 sacarina Bagaço de Não 3 75 8 6 26,8 2,3 2,7 Bilben Sim 15 35 20 u 2,4 0,8 13 Uva Não 7 32 24 15 4,8 2,3 3,6 vermelha Sim 8 19 15 19 2,2 2,2 17 Uva b Não 7 48 15 14 6,8 1,9 21 vapranea o sim 8 39 E 16 47 1,9 14 Caroço de Não 3 30 14 5 8,9 1,6 4,2 azeitona Sim 8 31 8 9 4,1 11 11 Torta de Não 8 25 29 9 3,2 11 3,7 azeitona Sim 11 29 24 12 27 11 2,2 Polpa de Não 1 68 19 68,0 5,0 19,0 chicória Sim 8 35 48 4,4 11 6,0 Exemplo 7
[0136] O Exemplo 3 foi repetido em diferentes escalas, isto é, em 20 litros (amostra 1), 5.000 litros (amostra 2) e 10.000 litros (amostra 3), com o uso da enzima Pectinexº Ultra Mash ex Novozymes (condições: 0,1% p/p de dispersão total, 45 ºC, 2 h, inativação enzimática: 90 ºC por 10 min). Nas amostras 2 e 3, ao invés de centrifugação, a decantação foi usada para separar os sólidos do líquido. O sobrenadante foi submetido à ultrafiltração, com o uso de uma membrana de 10 kDa, para remover pequenos componentes moleculares.
[0137] A composição de monossacarídeos dos materials de polissacarídeos hidrolisados foi analisada da mesma forma que no Exemplo 1.
[0138] Os resultados das análises são mostrados na Tabela 8. Tabela 8 [o a eua | ara | ga [oo [O [9 Rha GalA Ara Gal
[0139] O grau de acetilação e metilação foi determinado da seguinte forma: Amostras de polissacarídeos (2 a 5mg) foram tratadas com hidróxido de sódio (0,1 M, durante a noite, 20 ºC). O metanol liberado foi medido com o uso de GC de espaço vazio equipada com uma coluna DB-WAX ETR, Cryo Focus-4 cold trap e detecção FID (adaptado de Huisman et al., Food Hydrocolloids, 18, 4, 2004, 665-668).
[0140] As amostras foram neutralizadas (HCL 1M) e, em seguida, o acetil liberado foi quantificado com o uso de HPLC equipada com uma coluna Aminex HPX 87H com coluna guarda e detecção RI
[0141] (adaptado de Voragen et al.Food Hydrocolloids,1, 1, 1986, 65- 70). O grau de esterificação é expresso como quantidade molar de metanol e ácido acético liberado como porcentagem da quantidade de ácido urônico.
[0142] Os resultados das análises do grau de esterificação são mostrados na Tabela 9.
Tabela 9 1 grau de metilação 2? grau de acetilação Exemplo 8
[0143] A atividade imunomoduladora dos polissacarídeos RG-| de cenoura hidrolisados enzimaticamente do Exemplo 7 (Amostras 1 a 3) foi determinada com o uso de um ensaio de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC), conforme descrito para o Exemplo 5. Os resultados são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10 Exemplo 9
[0144] O material de polissacarídeo hidrolisado da Amostra 2 do Exemplo 7 foi ainda hidrolisado, seguido por isolamento de uma fração de alto peso molecular. O material polissacarídeo foi dissolvido em água desmineralizada (100 g/L) e submetido à hidrólise enzimática adicional (Pectinexº Ultra Mash ex Novozymes, 45 ºC, 14 horas). A enzimólise foi concluída aquecendo a 90 ºC por 10 min.
[0145] Uma parte das soluções de polissacarídeos de enzimólise foi submetida ao fracionamento por cromatografia de exclusão por tamanho semipreparativa para produzir uma fração contendo polissacarídeos tendo um peso molecular maior que 70 kDa.
[0146] A composição de mossacarídeos do polissacarídeo hidrolisado não fracionado e da fração molecular de alto peso molecular isolada foi analisada da mesma forma que no Exemplo 1.
[0147] Os resultados das análises são mostrados na Tabela 11. Tabela 11 ET TES era Ds er] Rha GalA Ara Gal (Rha) E 5 a [e e [as Ds os
[0148] A atividade imunomoduladora do polissacarídeo de enzimólise e da fração de alto peso molecular do mesmo foram determinadas com o uso da metodologia descrita no Exemplo 5. Os resultados são mostrados na Tabela 12.
Tabela 12 enzimólise Todos Não fracionado
Exemplo 10
[0149] O pó de cascas de ervilhas secas e moídas (ex Cosucra, Warcoing, Bélgica) foi disperso em água desmineralizada (100 g/L) e submetido à pré-hidrólise enzimática com uma alfa-amilase termoestável (Megazyme) a 90 ºC por 30 min e hidrólise adicional com pectinase (2 h 45 ºC, 0,2% v/v Pectinexº Ultra Mash, Novozymes). A enzimólise foi concluída aquecendo a 100 ºC por 10 min, seguida por centrifugação (18.000 g, 10 min) e por diálise extensiva do sobrenadante com o uso de uma membrana com um corte de 12 a 14 kDa (Visking, Londres, Reino Unido). O material foi então liofilizado.
[0150] O pó de polpa de beterraba sacarina (ex Suiker Unie, Dinteloord, NL) foi processado da mesma forma que o pó de ervilha, exceto que esta etapa de pré-incubação da a-amilase foi omitida.
[0151] A composição de monossacarídeos dos isolados foi determinada com o uso dos mesmos métodos analíticos que o Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 13.
Tabela 13 Rha GalA Ara Gal (Rha) (Rha) (Rha) | Enilha | 8 | 68 | mM | 6 | 71 [| 18 | 08 | Es De Ds Do Ds ds [0 Exemplo 11
[0152] Isolados de polissacarídeos pécticos hidrolisados foram preparados dispersando o bagaço de cenoura em água (100 g/L).
[0153] Amostra 11 foi extraída a 90 ºC por 120 minutos sem adição de enzima (rendimento do extrato: 4,8%)
[0154] Amostra 2 foi extraída adicionando Rapidase C600 (uma mistura enzimática contendo atividade de pectina liase, poligalacturonase, pectina esterase, celulase e hemicelulase, Militz, H. Wood Sci. Technol. (1993) 28: 9) com concentração enzimática de 1 g/100 mL de dispersão total, a 45 ºC, por 120 minutos. A enzimólise foi concluída aquecendo a 100 ºC por 10 min (rendimento do extrato: 5,6%).
[0155] Ambas as amostras foram subsequentemente centrifugadas (18.000 g, 10 min) e o sobrenadante foi amplamente dialisado com uma membrana com corte de 12 a 14 kDa (Visking, Londres, Reino Unido). Após ultrafiltração/diafiltração, o isolado foi liofiizado com o uso de um liofilizador em escala laboratorial.
[0156] A distribuição de tamanho molecular da Amostra 1 e Amostra 2, conforme determinado por HPSEC com detecção do índice de refração, é mostrada na Figura 3.
[0157] A composição de monossacarídeos das duas amostras foi analisada com o uso da metodologia descrita para o Exemplo 1. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14 RR ema | Ra [os [a | a | cera Rha GalA Ara Gal (Rha) (Rha) (Rha) | Amosta1 | 37 | 475 | 80 | 115 | 128 | 31 | 22 | [Camosta2 | 84 [| 347 | 73 [122 [41 [ 158 [ 0º]
Claims (16)
1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ISOLADO DE POLISSACARÍDEO
PÉCTICO HIDROLISADO QUE É ENRIQUECIDO EM RAMNOGALACTURONANA-|, caracterizado por dito método compreender as etapas de: . fornecer um substrato rico em pectina selecionado a partir de bagaço, extrato aquoso de bagaço, torta de oleaginosas, extrato aquoso de torta de oleaginosas e combinações dos mesmos, o dito substrato rico em pectina sendo obtido a partir de uma ou mais culturas selecionadas a partir de frutas, cenoura, azeitona, ervilhas, beterraba sacarina, chicória, soja, girassol, colza e milho sem o uso de solvente orgânico, o dito substrato rico em pectina contendo pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos que têm uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os resíduos de ramnose estando contidos em uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1—4)-galacturônico- alfa(1—2)-ramnose; .º submeter o substrato rico em pectina ao tratamento enzimático para hidrolisar parcialmente os polissacarídeos pécticos, o dito tratamento enzimático compreendendo o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.10), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82); . submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 5 a 100 kDa; e .º recuperar o retentato de ultrafiltração.
2. “MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo substrato rico em pectina ser selecionado a partir de bagaço, extrato aquoso de bagaço e combinações dos mesmos.
3. — MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2,
caracterizado pelo isolado de pectina ser obtido a partir de cítricos, maçã, pera, beterraba sacarina, chicória, cenoura.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo isolado de pectina ser obtido a partir de cenoura e/ou maçã.
5. — MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo substrato rico em pectina conter pelo menos 10 a 80%, em peso, de matéria seca de material de celulose selecionado a partir de celulose, hemicelulose e combinações das mesmas.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por pelo menos 50%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no substrato não se dissolverem em água destilada a 45 ºC e pH 5,5 em uma concentração de polissacarídeo péctico de 1 g/L.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por após o tratamento enzimático e antes da ultrafiltração, um líquido aquoso contendo os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados ser submetido à separação sólido-líquido.
8. “MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo substrato rico em pectina ser um isolado de pectina contendo pelo menos 10%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo substrato rico em pectina ser submetido ao tratamento enzimático sob a forma de um líquido aquoso contendo o substrato rico em pectina e que tem um teor de matéria seca de 0,5 a 40%, em peso.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo tratamento enzimático ser realizado a um pH na faixa de 3,0 a7,.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por uma ou mais pectinases serem selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15) e exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82).
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo substrato rico em pectina ser submetido ao tratamento enzimático, o dito tratamento enzimático compreendendo o uso de uma ou mais pectinesterases (EC 3.1.1.11) antes ou simultaneamente à hidrólise parcial com O uso de uma ou mais pectinases.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelos polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados serem submetidos à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 6 a 50 kDa.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo retentato de ultrafiltração recuperado ser seco até um teor de água menor que 15%, em peso.
15. ISOLADO DE POLISSACARÍDEO PÉCTICO HIDROLISADO, obtido pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo substrato rico em pectina ser obtido a partir de uma ou mais culturas selecionadas a partir de maçã, pera, cenoura, beterraba sacarina e chicória.
16. PROCESSO PARA PREPARAR UM PRODUTO selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, caracterizado pelo dito processo compreender a adição do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em uma concentração de pelo menos 0,1%, em peso, da matéria seca que está contida no produto final.
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Resumo
MÉTODO PARA PRODUZIR UM ISOLADO DE POLISSACARÍDEO PÉCTICO HIDROLISADO QUE É ENRIQUECIDO EM RAMNOGALACTURONANA-I,
ISOLADO DE POLISSACARÍDEO PÉCTICO HIDROLISADO E PROCESSO
PARA PREPARAR UM PRODUTO A invenção fornece um método para produzir um isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado que é enriquecido em ramnogalacturonana-l, o dito método compreendendo as etapas de: fornecer um substrato rico em pectina que foi obtido a partir de material vegetal sem o uso de solvente orgânico, o dito substrato rico em pectina contendo pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos; submeter o substrato rico em pectina ao tratamento enzimático para hidrolisar parcialmente os polissacarídeos pécticos, o dito tratamento enzimático compreendendo o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), ramnogalacturonana galacturonohidrolase (EC 3.2.1.173), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC
3.2.1.82); submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 5 a 100 kDa; e recuperar o retentato de ultrafiltração. A presente invenção refere-se ainda ao isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado obtido pelo presente método e a um processo para preparar um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, o dito processo compreendendo a adição do isolado de polissacarídeo péctico hidrolisado anteriormente mencionado.
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