CN103864954B - 一种花生粕多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种花生粕多糖的提取方法，包括预处理、酶解蛋白、灭酶处理：复合酶提取多糖、分离纯化五个步骤，其复合酶为纤维素酶、溶菌酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶的组合，本方法有效去除其中的蛋白质，最大限度的保留了多糖的功能特性，避免有机溶剂的污染，提高多糖的提取率，并提高多糖的纯度，其具有广阔的应用前景。

Description

一种花生粕多糖的提取方法

技术领域本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种花生粕多糖的提取方法。

背景技术

我国是世界上最重要的花生主产国之一，产量全世界总产量的40％以上。据统计，我国花生的年产量达1522万吨，已超过大豆(1520万吨)，成为我国油料作物之首，总产、单产和出口量均居国际第一位。除了本国利用以外，我国大量的花生都是作为原料出口，花生深加工产业较为薄弱。以花生出口占全国70％的山东省为例，目前有18个花生食品专业加工厂，28条生产线；而花生产量只有我国0.1％的日本拥有上千家花生食品生产厂，人均花生食品占有量为我国的3-4倍。

我国对花生的深度开发利用起步较晚，目前花生的消费利用比例大致为榨油占50％～60％，直接食用和食品加工占25-35％(其中深加工的只占10％左右)，出口3-5％，用种占8％左右。花生榨油是我国花生最主要的利用途径，榨油后剩下的饼粕由于蛋白过度变性使得营养价值降低通常作为家畜饲料、肥料。而美国所产花生主要以加工系列消费食品为主(约60％)，仅15％的花生用于榨油。花生粕含有丰富的蛋白质资源以及一些不溶性的花生纤维成分，具有很高的利用价值。

除了粗蛋白外，花生粕中多糖含丰富，高达32.50%。多糖是指一类由10个以上单糖分子聚合而成的天然高分子化合物，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。广泛存在于动物、植物、微生物（细菌和真菌）和藻类地衣中。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗。1984年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了荚膜多糖用作疫苗，受到与会者的极大兴趣。近年来，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们逐步提高了对植物多糖的关注。植物多糖研究比较深入的是茶多糖、胖大海多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、银杏叶多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品领域已经取得很好的应用。多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景。

随着对多糖生物学功能认识的深入，多糖生物学研究已经成为国际争夺生物化学研究的制高点。以多糖为重点的糖工程研究可能是继蛋白质、基因工程后生物化学和分子生物学领域中的前沿科学。

目前国内提取多糖大多采用的方法是：水提法或者用强酸强碱提取法。水提法虽然工艺简单，多糖食品安全性高，但得率很低。使用强酸或者强碱提取花生多糖，虽然可以获得较高的得率，但由于反应作用条件强烈，对多糖的食品安全性造成一定的影响，而且生产过程产生的废水会造成一定的环境污染，因此需要开发一种能高效、绿色的将多糖从花生粕中提取出来的方法。

酶法提取是目前新兴的一种绿色环保、高效的生物提取技术，通过酶法破坏植物细胞壁，增加多糖等有效成分的溶出率来提高提取效率。与传统提取方法相比，酶法的优点主要有：①反应条件温和，产物不易变性；②提高提取率,缩短提取时间；③降低成本。环保节能；④工艺简单可行。本发明通过对复合酶法提取花生粕中多糖技术的研究、不同提取方式花生多糖理化性质及结构的比较、不同提取方法对花生体外抗氧化性的影响，建立花生粕多糖酶法高效提取技术，为开发利用我国的花生粕多糖资源提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于使用高效的生物复合酶提取花生粕中的多糖，有效去除其中的蛋白质，最大限度的保留了多糖的功能特性，避免有机溶剂的污染，提高多糖的提取率，并提高多糖的纯度；

本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：

一种花生粕多糖的提取方法，包括如下步骤：

（1）预处理：取花生粕原料，粉碎至500－1000目，按照1∶5～1∶10的料液比（kg/L）加入浓度为70％乙醇溶液，然后在30～40℃和搅拌速度为150～260r/min的条件下，充分搅拌30min，抽滤，取滤渣；

（2）酶解蛋白：取预处理后滤渣，加入8－10倍重量的培养液，配制悬浊液，以利于酶的充分结合，然后添加中性蛋白酶Neutralprotease（诺维信），酶的添加量按照0.3g/ml悬浊液添加，酶解温度为25－30℃，pH值5－7，酶解时间为2小时；

所述培养液为（每升）：(NH₄)₂SO₄0.3g，FeSO₄·7H₂O0.02g，MnSO₄·H₂O0.03g，MgSO₄0.02g，KH₂PO₄0.1g，pH值6.0；

（3）灭酶处理：酶解结束后，将反应体系置于90－100℃，10min，使中性蛋白酶失活，离心15min，沉淀即为去除蛋白的花生粕残渣；

（4）复合酶提取多糖：向步骤（3）制备的残渣中添加10倍重量的培养液，配制悬浊液，添加复合酶制剂酶解，调整酶解反应温度40－45℃，pH6.5，分别加入纤维素酶3kg/m³，溶菌酶2kg/m³，β-葡聚糖酶5kg/m³，淀粉酶1kg/m³缓慢搅拌，酶解时间6h后，置于100℃，10min，灭酶，获得酶解液，

（5）分离纯化：酶解液离心15min取上清液，并浓缩，浓缩液体积为上清液的1/3,加入4倍体积的95%乙醇，醇沉7～8h，离心，弃上清液，留沉淀，沉淀经乙醇、丙酮反复冲洗后，冷冻干燥。

所述花生粕原料优选热榨花生粕；

本发明技术方案通过对现有技术的改进，带来一系列的有益效果：

1、本发明采用复合生物酶和酶解工艺从热榨花生粕中提取花生多糖，其反应条件温和，而且也能够最大限度的提高多糖的提取效率、使多糖活性最大限度的得到保留，避免了传统强酸强碱等有机溶剂对多糖活性及安全性的破坏，为工业副产物的综合利用提供了一条高效、可循环、环保低碳的途径。

2、本发明人通过创造性劳动及多因子实验对酶解反应的酶解体系、添加量、PH、温度等进行大量实验，得出最佳的酶解反应参数体系，从大量酶解蛋白酶中确定最佳复合酶组合为纤维素酶、溶菌霉、β-葡聚糖酶、淀粉酶且确定了其最佳添加比例，该组合酶酶解反应条件温和，酶解液营养保持完整，更能协作互应，提高反应效率及转化率；本发明酶的种类、用量及添加顺序的选择均不是偶然选择，而是发明人经过大量的劳动获得，酶及培养液及比例的调整均会影响最终多糖的提取率，将酶的添加量、反应体系加以改变，均得不到最大的多糖提取率。

酶反应结果随PH值的改变而发生显著的变化，每个酶促反应均存每一酶促反应均存在一个最适宜作用pH值，在低于最适pH值时，酶解率随pH值的增大而增大，当达到最适pH值后，随pH值的增大，酶解率反而下降。本发明确定复合酶的最佳酶解PH为6.5；酶量的增大会提高酶对底物的作用能力，由此可引起酶解率的提高，当酶加量增大到一定数值时，蛋白质分子对酶的需求量达到饱和，酶不再是提高蛋白质酶解率的限制性因素，所以酶解率随着酶加量的增大变得平缓，进一步增大，其酶解率反而下降，本研究确定最佳复合酶添加量为；纤维素酶3kg/m³，溶菌酶2kg/m³，β-葡聚糖酶5kg/m³，淀粉酶1kg/m³，酶促反应对温度也极为敏感，在保持酶活力的情况下，蛋白质酶解率随温度升高而升高，达最高峰后，继续升高温度，酶活力开始减小，酶解速度迅速下降，蛋白质酶解率随之下降。本研究确定最佳反应温度为45℃；

3现有技术提取花生多糖的纯度较低，原因失花生粕里面含有大量蛋白，要获得高纯度的花生粕多糖应有效去除花生粕里的蛋白质，本发明采用加入10倍重量的培养液，配制悬浊液，以利于酶的充分结合，然后添加中性蛋白酶Neutralprotease（诺维信），酶的添加量按照0.3g/ml悬浊液添加，酶解温度为25－30℃，pH值5－7，酶解时间为2小时；所述培养液为（每升）：(NH₄)₂SO₄0.3g，FeSO₄·7H₂O0.02g，MnSO₄·H₂O0.03g，MgSO₄0.02g，KH₂PO₄0.1g，pH值6.0；能够有效去除其中的蛋白质，从而提高花生粕多糖的纯度。

4本发明采用按照1∶5～1∶10的料液比加入浓度为70％乙醇溶液，然后在30～40℃和搅拌速度为150～260r/min的条件下，充分搅拌30min，有效去除其中的黄酮、色素等物质，经预处理后的花生粕中粗脂肪、色素、黄酮和多酚类物质被去除，只剩下部分的粗蛋白和淀粉以及半纤维素和粗纤维素等成分，利于后续酶解的进行。采用苯酚硫酸法测得花生多糖的提取率高达49.67%,纯度高达95.20%。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一种花生粕多糖的提取方法，包括如下步骤：

（1）预处理：取热榨花生粕原料，粉碎至500-1000目，按照1∶5（kg/L）的料液比加入浓度为70％乙醇溶液，然后在温度为30℃，搅拌速度为150～260r/min的条件下，充分搅拌30min，抽滤，取滤渣；

（2）酶解蛋白：取预处理后滤渣，加入8倍重量的培养液，配制悬浊液，以利于酶的充分结合，然后添加中性蛋白酶Neutralprotease（诺维信），酶的添加量按照0.3g/ml悬浊液添加，酶解温度为25℃，pH值6，酶解时间为2小时；

所述培养液为（每升）：(NH₄)₂SO₄0.3g，FeSO₄·7H₂O0.02g，MnSO₄·H₂O0.03g，MgSO₄0.02g，KH₂PO₄0.1g，pH值6.0；

（3）灭酶处理：酶解结束后，将反应体系置于90－100℃，10min，使中性蛋白酶失活，离心15min，沉淀即为去除蛋白的花生粕残渣；

（4）复合酶提取多糖：向步骤（3）制备的残渣中添加10倍重量的培养液（同步骤（2）中的培养液），配制悬浊液，添加复合酶制剂酶解，调整酶解反应温度40℃，pH6.5，分别加入纤维素酶3kg/m³，溶菌酶2kg/m³，β-葡聚糖酶5kg/m³，淀粉酶1kg/m³缓慢搅拌，酶解时间6h后，置于100℃，10min，灭酶，获得酶解液，

（5）分离纯化：酶解液离心15min取上清液，并浓缩，浓缩液体积为上清液的1/3,加入4倍体积的95%乙醇，醇沉7～8h，离心，弃上清液，留沉淀，沉淀经乙醇、丙酮反复冲洗后，冷冻干燥。

采用苯酚硫酸法测得花生多糖的提取率为47.50%，纯度为94.85%

实施例2

一种花生粕多糖的提取方法，包括如下步骤：

（1）预处理：取热榨花生粕原料，粉碎至500－1000目，按照1∶10的料液比加入浓度为70％乙醇溶液，然后在40℃和搅拌速度为150～260r/min的条件下，充分搅拌30min，抽滤，取滤渣；

（2）酶解蛋白：取预处理后滤渣，加入10倍重量的培养液，配制悬浊液，以利于酶的充分结合，然后添加中性蛋白酶Neutralprotease（诺维信），酶的添加量按照0.3g/ml悬浊液添加，酶解温度为30℃，pH值7，酶解时间为2小时；

所述培养液为（每升）：(NH₄)₂SO₄0.3g，FeSO₄·7H₂O0.02g，MnSO₄·H₂O0.03g，MgSO₄0.02g，KH₂PO₄0.1g，pH值6.0；

（3）灭酶处理：酶解结束后，将反应体系置于90－100℃，10min，使中性蛋白酶失活，离心15min，沉淀即为去除蛋白的花生粕残渣；

（4）复合酶提取多糖：向步骤（3）制备的残渣中添加10倍重量的培养液，配制悬浊液，添加复合酶制剂酶解，调整酶解反应温度45℃，pH6.5，分别加入纤维素酶3kg/m³，溶菌酶2kg/m³，β-葡聚糖酶5kg/m³，淀粉酶1kg/m³缓慢搅拌，酶解时间6h后，置于100℃，10min，灭酶，获得酶解液，

（5）分离纯化：酶解液离心15min取上清液，并浓缩，浓缩液体积为上清液的1/3,加入4倍体积的95%乙醇，醇沉7～8h，离心，弃上清液，留沉淀，沉淀经乙醇、丙酮反复冲洗后，冷冻干燥。

采用苯酚硫酸法测得花生多糖的提取率为49.67%,纯度为95.20%；

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种花生粕多糖的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）预处理：取花生粕原料，粉碎至500-1000目，按照1∶5～1∶10的料液比加入浓度为70％乙醇溶液，所述料液比为kg/L，然后在温度为30～40℃，搅拌速度为150～260r/min的条件下，充分搅拌30min，抽滤，取滤渣；

（2）酶解蛋白：往步骤（1）的滤渣中加入8－10倍重量的培养液，配制成悬浊液，然后添加中性蛋白酶，酶的添加量按照0.3g酶：1ml悬浊液的比例添加，酶解温度为25-30℃，pH值5-7，酶解时间为2小时；

（3）灭酶处理：酶解结束后，将反应体系置于90-100℃，10min，使中性蛋白酶失活，然后离心15min，沉淀即为去除蛋白的花生粕残渣；

（4）复合酶提取多糖：向步骤（3）制备的花生粕残渣中添加10倍重量的培养液，配制成悬浊液，调整酶解反应温度40-45℃，pH6.5，分别加入纤维素酶3kg/m³，溶菌酶2kg/m³，β-葡聚糖酶5kg/m³以及淀粉酶1kg/m³缓慢搅拌，酶解6h后，置于100℃，10min，灭酶，获得酶解液；

（5）分离纯化：将步骤（4）获得的酶解液离心15min，取上清液，并浓缩，浓缩液体积为上清液的1/3,然后加入浓缩液4倍体积的95%乙醇，醇沉7～8h，离心，弃上清液，留沉淀，沉淀经乙醇、丙酮反复冲洗后，冷冻干燥即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液组成为：(NH₄)₂SO₄0.3g，FeSO₄·7H₂O0.02g，MnSO₄·H₂O0.03g，MgSO₄0.02g，KH₂PO₄0.1g，pH值6.0，余量为水，配成1L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述花生粕为热榨花生粕。