CN101880307A - 利用微生物提取茶皂素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用微生物提取茶皂素的方法。先用外源添加的高淀粉类物质与复合酶、酒精酵母混合发酵，使外源高淀粉类物质中的淀粉充分被酒精酵母利用产生酒精，形成醪液，然后将一定量的粉碎好的油茶饼粕粉浸泡到发酵好的醪液中混匀培养，几天后，进行固液分离，再对分离所得液体的上层清夜进行浓缩干燥得到最终产物茶皂素。本发明充分利用油茶饼粕中原有的多糖类物质，酒精酵母发酵产生一定的酒精度，并能有效促进茶皂素的溶出，茶皂素的提取率可达80％以上；而且消耗掉大量可溶性糖，粗提物中的茶皂素含量高，可达60％以上，提取的茶皂素安全性高；提取茶皂素后的分离粕，是优质饲料，提高了饼粕的经济价值和经济效益；工艺简单，提取成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物提取茶皂素的方法，属于农、林副产品深加工领域。
背景技术
茶皂素是一种五环三萜类皂苷，是由皂苷元(即配基)、糖体和有机酸形成的结构复杂的混合物。从茶皂素中一共分离出7种皂苷配基。茶皂素最早是由日本学者青山新次郎于1931年从茶树种子中分离出来的。提纯后的茶皂素为乳白色或淡黄色固体无定形粉末，具有吸湿性，味苦辛辣，有刺激鼻粘膜的特性。在乳化、分散、湿润、发泡、稳泡、去污等方面具有良好的活性，是一种天然表面活性剂。茶皂素不仅具有表面活性，而且具有生物活性。在抗菌杀菌、抗渗透和消炎、祛痰止咳、解酒等多方面功效显著。所以茶皂素具有广泛的用途。日用化工上可用作洗发、洗浴剂；建材工业上可作起泡稳泡剂；农业上可用于防治病虫害的生物农药；养殖上可用作清池剂，清除虾池中的敌害鱼类，还可对钉螺的成螺、幼螺和螺卵进行浸杀等等。油茶籽饼粕中含有茶皂素13％左右。而我国是一个茶油生产大国，每年有100多万吨的油茶籽，产生的油茶饼粕80多万吨，可生产茶皂素近10万吨。但目前国类茶皂素生产处于一种不稳定状态。一方面尚没有形成成熟的茶皂素市场，茶皂素的应用开发不够；另一方面也是最主要的一个因素是茶皂素的提取方法不够理想，成本太高，造成茶皂素进一步的开发利用成本的上升，制约了茶皂素这一天然生物活性物质的开发应用。
我国于1979年首次以工业方法从茶籽饼粕中分离出茶皂素，1980年投入生产，但至今仍未能有较大的突破。寻找简便实用的茶皂素提取方法是近二十年来各方面研究的热点。茶皂素易溶于含水的甲醇、乙醇、正丁醇及冰醋酸中，能溶于热水、热醇，难溶于冷水、无水甲醇、无水乙醇，不溶于乙醚、氯仿、石油醚及苯等溶剂中。根据茶皂素的溶解特性，茶皂素的提取方法一是水浸提法。用热水浸提、澄清、过滤、浓缩、脱色、烘干等。生产设备简单，但生产过程中水处理量大，后续分离困难，产品纯度低，能耗大，渣的处理也较困难。二是有机溶剂提取法，主要是醇提法，常见的有甲醇提取和乙醇提取。用甲醇或乙醇浸取，所得浆料经浓缩、烘干得到茶皂素粉料。但甲醇溶剂不仅易燃易爆、沸点低，且毒性大，安全生产要求高；乙醇也是易燃易爆品，其提取工艺也较复杂、投资较大，乙醇价格也相对较高，而且乙醇提取物具有难闻的气味。这在很大程度上限制了茶皂素的开发应用。
从1990年至2009年二十年间，陆续有21项茶皂素提取相关的专利申请(参见中国知识产权网——专利信息服务www.cnipr.com)。除4项是涉及茶皂素精制的方法外，其余均为从原料中提取粗皂素的方法。华东地质学院应用技术研究所王廷吉、魏俊峰(1990年CN90101339.0)提出一步浸取饼粕中油脂和茶皂素工艺。油脂在无水低级醇中有一定溶解度，在含水低级醇中溶解度很小，而茶皂素刚好相反。根据低级醇(乙醇或异丙醇等)不同浓度对油脂与茶皂素溶解度不同，进行梯级浸取。湖南省林业科学院张新生等(1999年CN99115525.4)直接采用90％正丁醇浸提。正丁醇除对茶皂素的溶解度比甲醇、乙醇强外，对其它有机物质如糖等溶解度很小，所以提取的粗茶皂素纯度相对较高。中国农科院油料作物研究所黄凤洪等(2005年CN200510018694.2)采用超声波制备茶皂素的方法。在使用有机溶剂浸泡提取茶皂素时，辅助超声波处理，促进茶皂素的溶出。广东韶关学院张卫国(2009年3月CN200910037987.3)提出直接从油茶籽中提取茶皂素的方法。先用甲醇、乙醇或丙酮(90％以下)直接浸提粉碎的油茶籽仁，分离得茶皂素提液与残渣，残渣再进行榨油。之后不久(2009年6月200910040666.9)张卫国又将上述专利(CN200910037987.3)低级醇浸提时置于微波环境中辅助提取。这两项专利方法变成了从油茶籽中先提茶皂素后提油。与这两项专利方法类似的还有浙江神茗山茶业科技有限公司与大连八达空间科学应用技术研究所的崔永堂等(2009年4月CN200910082997.9)、福建省福州市台江区侯梦斌(2009年5月CN200910111839.1)用热水从油茶籽中直接提取茶皂素。茶皂素的精制就是粗提茶皂素的去杂过程。西南石油学院赵晓东等(1995年CN95113044.7)采用苯乙烯型共聚树脂吸附的方法提纯茶皂素。相关的精制技术还有无锡绿色分离应用技术研究所有限公司俞铮、彭奇均(2008年CN200810196711.5)采用先合成专用螯合树脂来分离茶皂素中的杂糖。江苏南通市的黄宝生(2001年CN01113794.0)，则采用热水浸提后，在浸提液中加入酵母发酵的方法，去掉茶皂素浸提液中糖及蛋白质，达到提纯目的。
发明内容
本发明公开一种利用微生物发酵产生一定的酒精度，溶解油茶饼粕中的茶皂素，再进行分离，浓缩、干燥得到粗茶皂素的一个方法。本发明的主要特点是利用油茶饼粕中丰富的多糖类物质，采用酒精酵母进行发酵，消耗糖类物质，产生酒精，促进茶皂素的溶出。但油茶饼粕中的酒精酵母可利用糖毕竟较少，为了提高酒精度达到茶皂素溶出的目的，外源添加一定量的高淀粉类物质(如玉米粉等)。混合培养发酵与上述专利CN01113794.0方法有着本质的不同。专利CN01113794.0是利用发酵去除粗皂素中部分糖及蛋白质，提纯茶皂素。本发明是利用发酵产生一定的酒精度，溶解油茶饼粕中的茶皂素。而且，随着发酵时对糖的消耗及部分多糖类物质的分解，促进饼粕中的茶皂素加快溶出，达到提取的目的。
茶皂素有抗菌消炎的生物活性对酒精酵母有抑制作用。据报道，茶皂素浓度有24-50mg/l时，可以防止酵母的生长。鉴于茶皂素的这一特性，直接在饼粕中进行酵母发酵几乎不可能。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案：
一种利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：先用外源添加的高淀粉类物质与复合酶、酒精酵母混合发酵，使外源高淀粉类物质中的淀粉充分被酒精酵母利用产生酒精，形成醪液，然后将一定量的粉碎好的油茶饼粕粉浸泡到发酵好的醪液中混匀培养，若干天后，进行固液分离；上清液部分进行浓缩、干燥，得到粗茶皂素1；固体部分用清水清洗，分离清洗液、浓缩干燥，也能得到粗茶皂素2。
所述的利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：所述的高淀粉类物质包括但不限于玉米粉、山芋粉、小麦粉、高粱粉或大米粉。
所述的利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：复合酶选自糖化酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶中的一种或多种。
(1)高淀粉类物质发酵培养：将高淀粉类物质和水按一定比例混匀，然后向混合物种添加一定量复合酶和酒精酵母，所述的高淀粉类物质中复合酶添加量为：糖化酶200U/g、纤维素酶10U/g、果胶酶5U/g、酸性蛋白酶10U/g，28-32℃左右培养3-5天，形成醪液，其中高淀粉类物质和水的重量比为1∶(1-5)；高淀粉类物质和酒精酵母的重量比为100∶(0.18-0.21)；
(2)饼粕粉碎：将块状饼粕粉碎成粒径为10-20目小颗粒；
(3)饼粕浸泡培养：将粉碎的油茶饼粕粉添加到醪液中，混匀培养1-3天；或者将醪液离心分离，在分离得到的上层清液中添加粉碎好的油茶饼粕粉，混匀培养1-3天；其中油茶饼粕粉的添加量，按所述的玉米粉与油茶饼粕粉重量比为1∶1-3的比例添加；
(4)固液分离：采用过滤或离心分离方法将步骤(3)中培养结束的饼粕的浸泡液进行固液分离；
(5)将步骤(4)所得的液体上层清液部分进行浓缩、干燥，得粗茶皂素1，同时回收酒精；
(6)将步骤(4)所得的固体部分用等重量的清水清洗1-2次，分离清洗液，浓缩、干燥，得粗茶皂素2，分离的固体做饲料。
步骤(5)、(6)中所述的浓缩上层清液的方法为用低于60℃的热空气挥发酒精与部分水，冷凝收集酒精；所述的干燥浓缩液的方法为将热空气温度降至50℃以下慢慢挥干，或用阳光晒干。
本发明的有益效果在于：
1、充分利用油茶饼粕中原有的多糖类物质，酒精酵母发酵产生一定的酒精度，并能有效促进茶皂素的溶出，茶皂素的提取率可达80％以上。而且消耗掉大量可溶性糖，粗提物中的茶皂素含量高，可达60％以上，免去了精制工艺或为进一步的精提简化了程序；
2、提取的茶皂素安全性高，提取过程没有接触工业低级醇等化学物质，除少量酶制剂外，发酵为食品级别，为茶皂素在食品和医药中的应用提供了保障。
3、提取茶皂素后的分离粕，富含蛋白与多糖类物质，而且气味香甜，是优质的饲料，提高了饼粕的经济价值和经济效益；
4、工艺简单，提取成本低，开始使用的高淀粉类物质(玉米粉等)及饼粕发酵所产生的酒精可以作为副产品回收，未发酵利用的部分留在残粕中做饲料。
具体实施方式
实施例1
超市售玉米粉100g放入500ml三角锥形瓶中，加入2.6倍水，再加入复合酶(10万U/g糖化酶200mg，8万U/g酸性蛋白酶12.5mg，8000U/g纤维素酶125mg，3万U/g果胶酶16.7mg。)和0.2g干酵母(活化)，瓶口用保鲜膜轻轻朦上，30℃±2℃下培养，间歇振荡。每天称重记载C02失重量。89小时后失重基本停止。在醪液中加入100g饼粕粉，摇匀，30℃±2℃下继续培养，间歇振荡。46小时后，失重基本停止，反应结束，获得培养液437.35g。取培养液100g，离心分离(4000转/分，5分钟)，取上清液，粕用50ml水洗离心，重复一次。合并不清液，定容150ml。以75％茶皂素为标样，液相色谱法测得溶液茶皂素含量为22.11mg/ml。培养液相当于75％茶皂素13.61g，100％茶皂素10.21g。油茶饼粕中茶皂素的提率为80.20％。
实施实例2
超市售玉米粉100g放入500ml三角锥形瓶中，加入2.6倍水，再加入复合酶(10万U/g糖化酶200mg，8万U/g酸性蛋白酶12.5mg，8000U/g纤维素酶125mg，3万U/g果胶酶16.7mg。)和0.2g干酵母(活化)，瓶口用保鲜膜轻轻朦上，30℃±2℃下培养，间歇振荡。每天称重记载CO2失重量。培养30小时后断电10小时，培养温度下降至7℃，重新调节培养温度至30℃±2℃，延长培养时间至110小时后，失重基本停止。在醪液中加入100g饼粕粉，摇匀，30℃±2℃下继续培养，间歇振荡。48小时后，失重基本停止，反应结束。将全部培养液离心分离(4000转/分，5分钟)，上清液55℃下烘干，得粗皂素12.47g，茶皂素含量46.38％，相当于100％茶皂素5.78g。粕用100ml水洗离心，重复一次。合并不清液，55℃下烘干，得干物质7.61g，茶皂素含量40.47％，相当于100％茶皂素3.08g。
实施实例3
超市售玉米粉100g放入500ml三角锥形瓶中，加入2.6倍水，再加入复合酶(10万U/g糖化酶200mg，8万U/g酸性蛋白酶12.5mg，8000U/g纤维素酶125mg，3万U/g果胶酶16.7mg。)和0.2g干酵母(活化)，瓶口用保鲜膜轻轻朦上，30℃±2℃下培养，间歇振荡。每天称重记载CO2失重量。培养30小时后断电10小时，培养温度下降至7℃，重新调节培养温度至30℃±2℃，延长培养时间至110小时后，失重基本停止。在醪液中加入150g饼粕粉，摇匀，30℃±2℃下继续培养，间歇振荡。48小时后，失重基本停止，反应结束。将全部培养液离心分离(4000转/分，5分钟)，上清液55℃下烘干，得粗皂素14.43g，茶皂素含量62.37％，相当于100％茶皂素9.00g。粕用100ml水洗离心，重复一次。合并不清液，55℃下烘干，得干物质12.04g，茶皂素含量41.48％，相当于100％茶皂素5.00g。
Claims (5)
1.一种利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：先用外源添加的高淀粉类物质与复合酶、酒精酵母混合发酵，使外源高淀粉类物质中的淀粉充分被酒精酵母利用产生酒精，形成醪液，然后将一定量的粉碎好的油茶饼粕粉浸泡到发酵好的醪液中混匀培养，若干天后，进行固液分离；上清液部分进行浓缩、干燥，得到粗茶皂素1；固体部分用清水清洗，分离清洗液、浓缩干燥，也能得到粗茶皂素2。
2.根据权利要求1所述的利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：所述的高淀粉类物质包括但不限于玉米粉、山芋粉、小麦粉、高粱粉或大米粉。
3.根据权利要求1所述的利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：复合酶选自糖化酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1、2或3所述的利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)高淀粉类物质发酵培养：将高淀粉类物质和水按一定比例混匀，然后向混合物种添加一定量复合酶和酒精酵母，所述的高淀粉类物质中复合酶添加量为：糖化酶200U/g、纤维素酶10U/g、果胶酶5U/g、酸性蛋白酶10U/g，28-32℃左右培养3-5天，形成醪液，其中高淀粉类物质和水的重量比为1∶(1-5)；高淀粉类物质和酒精酵母的重量比为100∶(0.18-0.21)；
(2)饼粕粉碎：将块状饼粕粉碎成粒径为10-20目小颗粒；
(3)饼粕浸泡培养：将粉碎的油茶饼粕粉添加到醪液中，混匀培养1-3天；或者将醪液离心分离，在分离得到的上层清液中添加粉碎好的油茶饼粕粉，混匀培养1-3天；其中油茶饼粕粉的添加量，按所述的玉米粉与油茶饼粕粉重量比为1∶1-3的比例添加；
(4)固液分离：采用过滤或离心分离方法将步骤(3)中培养结束的饼粕的浸泡液进行固液分离；
(5)将步骤(4)所得的液体上层清液部分进行浓缩、干燥，得粗茶皂素1，同时回收酒精；
(6)将步骤(4)所得的固体部分用等重量的清水清洗1-2次，分离清洗液，浓缩、干燥，得粗茶皂素2，分离的固体做饲料。
5.根据权利要求1所述的利用微生物提取茶皂素的方法，其特征在于：步骤(5)、(6)中所述的浓缩上层清液的方法为用低于60℃的热空气挥发酒精与部分水，冷凝收集酒精；所述的干燥浓缩液的方法为将热空气温度降至50℃以下慢慢挥干，或用阳光晒干。
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