CN109851687B - 一种从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,包括将海带粉碎、水提、沉淀、收集固液、调节pH、用褐藻胶裂解酶酶解、透析、浓缩、冻干,以便得到岩藻多糖和褐藻胶。从而从海带中高效地分离制备高纯度的岩藻多糖和同时获得褐藻胶;分离得到的副产物褐藻胶可以去进一步的加工利用,是一种经济高效的分离方式。
Description
技术领域
本发明涉及海带深加工的技术领域,具体涉及一种从海带中分离制备高纯度岩藻多糖和同时获得褐藻胶的方法。
背景技术
海带,(Laminaria japonica)别名昆布、江白菜,褐藻纲,海带科。孢子体大型,褐色,扁平带状,最长可达20m,是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物,属海藻类植物。海带是一种营养物质非常丰富的海洋蔬菜,其中含有大量的对人体有益的物质。在《本草纲目》,《神农本草经》中均有记载,具有重要的食用、药用价值,常被称为“长寿菜”,深受到大家喜欢。
岩藻多糖,也称褐藻糖胶、墨角藻多糖、岩藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸酯等,来源于海洋褐藻,主要是由含硫酸基的L-岩藻糖(L-fucose)所构成的多糖类物质。岩藻多糖具有多种生物学功能,如抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫机能等,无毒副作用,目前已被广泛地应用于现代医药、食品和化妆品工业领域。
现今工业生产岩藻多糖主要是通过海洋褐藻类(如海带、裙带菜等)进行提取,生产工艺大多采用热水抽提-乙醇沉淀的方法(乙醇终浓度50%-90%),这意味着岩藻多糖在生产过程中须大量的使用乙醇,如此,给生产企业造成较大的经济负担,并且大量储备和使用乙醇会给安全生产带来较大的隐患,增加了岩藻多糖的生产代价。
因此,改进传统的水提醇沉法,使用一种合适的、高效的岩藻多糖的制备方法迫在眉睫。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。
为此,本发明提出了一种从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其包括以下步骤:
粉碎:海带除沙洗净晾干后,粉碎过筛,以便得到海带粉;
水提:向所述海带粉加入30~45倍重量的蒸馏水,在70~100℃的热水浴条件下提取1~4h,离心,分离固液,以便得到上清液;
沉淀:将所述上清液的pH调节至0.6~0.8后,放置于4℃层析柜中过夜沉淀;
收集固液:将经过沉淀处理的溶液放入高速离心机中,离心,分离固液,分离得到的凝胶为褐藻胶,分离得到的液体为褐藻胶与岩藻多糖的混合液;
调节pH:所述褐藻胶凝胶用水复溶,调节其pH至中性;所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;
酶解:调节pH处理后,在所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液中,加入褐藻胶裂解酶,酶活调节至5~15U/ml,50℃下酶解2~4h,加热,离心,除去褐藻胶裂解酶沉淀,以便得到岩藻多糖溶液;
透析:将经过调节pH处理的褐藻胶溶液与所述岩藻多糖溶液,分别装入透析袋中透析5~8次,除去小分子杂质;
浓缩、冻干:将透析处理的褐藻胶溶液和岩藻多糖溶液旋蒸,除去70%水分后,分装,冷冻干燥,以便得到岩藻多糖和褐藻胶。
根据本发明的一种从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,取消了传统提取方法中醇沉的步骤,避免了生产企业大量储备和使用高浓度的乙醇,使本发明在工业生产中的应用更加安全。本发明利用褐藻胶裂解酶使残留在岩藻多糖中的褐藻胶更好的清除,以获得高纯度的岩藻多糖。在提取过程中,发明人发现传统醇沉法主要利用大多数多糖在有机溶剂中的溶解度小的原理,向提取液中加入阳离子表面活性剂如乙醇或季胺盐类等,使水溶性多糖沉淀析出,但其特异性不高。所以,采用醇沉法难以去除岩藻多糖溶液中残留的少(微)量褐藻胶。而本发明的褐藻胶裂解酶是通过在底物的非还原末端的β消去机制降解褐藻胶,其作用位点是1-4糖苷键;在酶解过程中,褐藻胶裂解酶有目的地、特异性地切断岩藻多糖溶液中残留的少(微)量褐藻胶的糖苷键,生成分子量小于2.0KDa的单糖、二糖、三糖或四糖,以便后续可以采用透析方法将其去除,使样品中的褐藻胶被去除地更加彻底,获得的岩藻多糖产品品质较高。
此外,在提取制备过程中,岩藻多糖可能会与少量褐藻胶互相缠绕,形成三股螺旋结构,采用传统的醇沉法难于除去此类褐藻胶。在酶解过程中,褐藻胶裂解酶有目的地、特异性地切断褐藻胶的糖苷键,可能使缠绕在岩藻多糖上的褐藻胶被有效降解,生成分子量小于2.0KDa的单糖、二糖、三糖或四糖,后续再采用透析方法可有效将其去除,提高岩藻多糖产品的品质。通过本发明方法制备得到的岩藻多糖,得率较高,品质较好,分离得到的副产物褐藻胶也可以去进一步的加工利用,是一种经济高效的分离方式。
另外,根据本发明上述实施例提出的一种从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,还可以具有如下附加的技术特征:
根据本发明实施例,在透析步骤中,所述透析袋分子截留量为3.8KDa,透析8次,每次透析两小时,前六次采用自来水透析,后两次采用蒸馏水透析。
根据本发明实施例,在水提步骤中,向所述海带粉加入40倍重量的蒸馏水,在90℃的热水浴条件下提取2h。
根据本发明实施例,在收集固液步骤中,所述高速离心机设定离心力为3000g,离心20min。
根据本发明实施例,在粉碎步骤中,粉碎过60目筛,以便得到海带粉。
根据本发明实施例,在酶解步骤中,酶活调节至5U/ml,50℃下酶解3h,加热至100℃,离心,设定离心机的离心力为8000g,离心20min。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明:
图1为本发明实施例中提取温度对岩藻多糖得率的影响;
图2为本发明实施例中提取温度对褐藻胶得率的影响;
图3为本发明实施例中提取时间对岩藻多糖得率的影响;
图4为本发明实施例中提取时间对褐藻胶得率的影响;
图5为本发明实施例中液料比对岩藻多糖得率的影响;
图6为本发明实施例中液料比对褐藻胶得率的影响。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案,下面将更详细地描述本发明的示例性实施例,应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是,本发明涉及到的原材料均可以在市面上购买,其中,海带购自福建省厦门市集美区嘉庚农贸市场。
实施例1提取温度对岩藻多糖以及褐藻胶得率的影响
粉碎:海带除沙洗净晾干后,粉碎过60目筛,以便得到海带粉;
水提:称取四份100g的海带粉分别加入40倍重量的蒸馏水,分别在70℃、80℃、90℃、100℃的热水浴条件下提取2h,高速离心,分离固液,去除海带渣,以便得到上清液;
沉淀:将所述上清液的pH调节至0.8后,放置于4℃层析柜中过夜,使褐藻胶沉淀;
收集固液:过夜后的溶液放入高速离心机中,设定离心力为3000g,离心20min,分离固液,分离得到的凝胶为褐藻胶,分离得到的液体为褐藻胶与岩藻多糖的混合液;
调节pH:将褐藻胶凝胶用适量水复溶,然后用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;
酶解:调节pH处理后,在所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液中,加入褐藻胶裂解酶,酶活调节至5U/ml,50℃下酶解2h,之后,加热至100℃,设定离心机离心力为8000g,离心20min,除去褐藻胶裂解酶沉淀,以便得到岩藻多糖溶液;
透析:将经过调节pH处理的褐藻胶溶液与所述岩藻多糖溶液,分别装入透析袋中透析8次,除去小分子杂质,透析袋分子截留量为3.8KDa,透析8次,每次透析两小时,前六次采用自来水透析,后两次采用蒸馏水透析;
浓缩、冻干:将透析处理的褐藻胶溶液和岩藻多糖溶液用旋转蒸发仪旋蒸,除去70%水分后,分装入离心管,放进冰柜进行冷冻,结冰冻实之后,将其放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥,以便得到岩藻多糖和褐藻胶,将所得产物称重(M2),除以海带粉重量(M1),计算出岩藻多糖与褐藻胶得率。结果如图1和图2所示,在70~90℃的热水浴条件下提取,岩藻多糖和褐藻胶的得率均提高,到90℃时,岩藻多糖和褐藻胶的得率最高,超过90℃,得率变化不明显,因此,最适提取温度为90℃。
实施例2提取时间对岩藻多糖以及褐藻胶得率的影响
粉碎:海带除沙洗净晾干后,粉碎过60目筛,以便得到海带粉;
水提:称取四份100g的海带粉分别加入40倍重量的蒸馏水,分别在90℃的热水浴条件下提取1~4h(选取1h、2h、3h、4h四个梯度),高速离心,分离固液,去除海带渣,以便得到上清液;
沉淀:将所述上清液的pH调节至0.8后,放置于4℃层析柜中过夜,使褐藻胶沉淀;
收集固液:过夜后的溶液放入高速离心机中,设定离心力为3000g,离心20min,分离固液,分离得到的凝胶为褐藻胶,分离得到的液体为褐藻胶与岩藻多糖的混合液;
调节pH:将褐藻胶凝胶用适量水复溶,然后用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;
酶解:调节pH处理后,在所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液中,加入褐藻胶裂解酶,酶活调节至5U/ml,50℃下酶解2h,之后,加热至100℃,设定离心机离心力为8000g,离心20min,除去褐藻胶裂解酶沉淀,以便得到岩藻多糖溶液;
透析:将经过调节pH处理的褐藻胶溶液与所述岩藻多糖溶液,分别装入透析袋中透析8次,透析袋分子截留量为3.8KDa,透析8次,每次透析两小时,前六次采用自来水透析,后两次采用蒸馏水透析;
浓缩、冻干:将透析处理的褐藻胶溶液和岩藻多糖溶液用旋转蒸发仪旋蒸,除去70%水分后,分装入离心管,放进冰柜进行冷冻,结冰冻实之后,将其放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥,以便得到岩藻多糖和褐藻胶,将所得产物称重(M2),除以海带粉重量(M1),计算出岩藻多糖与褐藻胶得率。结果如图3和图4所示,提取时间为2h时,岩藻多糖的得率最高,超过2h,得率变化不明显,而对于褐藻胶,在1~3h的提取时间内,其得率变化不明显,超过3h,得率提高;因此,最适提取时间2h。
实施例3料液比对岩藻多糖以及褐藻胶得率的影响
粉碎:海带除沙洗净晾干后,粉碎过60目筛,以便得到海带粉;
水提:称取四份100g的海带粉分别加入30、35、40、45倍重量的蒸馏水,分别在90℃的热水浴条件下提取2h,高速离心,分离固液,去除海带渣,以便得到上清液;
沉淀:将所述上清液的pH调节至0.8后,放置于4℃层析柜中过夜,使褐藻胶沉淀;
收集固液:过夜后的溶液放入高速离心机中,设定离心力为3000g,离心20min,分离固液,分离得到的凝胶为褐藻胶,分离得到的液体为褐藻胶与岩藻多糖的混合液;
调节pH:将褐藻胶凝胶用适量水复溶,然后用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;
酶解:调节pH处理后,在所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液中,加入褐藻胶裂解酶,酶活调节至5U/ml,50℃下酶解2h,之后,加热至100℃,设定离心机离心力为8000g,离心20min,除去褐藻胶裂解酶沉淀,以便得到岩藻多糖溶液;
透析:将经过调节pH处理的褐藻胶溶液与所述岩藻多糖溶液,分别装入透析袋中透析8次,透析袋分子截留量为3.8KDa,透析8次,每次透析两小时,前六次采用自来水透析,后两次采用蒸馏水透析;
浓缩、冻干:将透析处理的褐藻胶溶液和岩藻多糖溶液用旋转蒸发仪旋蒸,除去70%水分后,分装入离心管,放进冰柜进行冷冻,结冰冻实之后,将其放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥,以便得到岩藻多糖和褐藻胶,将所得产物称重(M2),除以海带粉重量(M1),计算出岩藻多糖与褐藻胶得率。结果如图5和图6所示,在30:1~40:1的料液比下,岩藻多糖和褐藻胶的得率均提高,到40:1的料液比下,岩藻多糖和褐藻胶的得率最高,超过40:1的料液比,得率变化均不明显,因此,最适料液比为40:1,即添加海带粉40倍重量的蒸馏水。
实施例4制备岩藻多糖和褐藻胶
粉碎:海带除沙洗净晾干后,粉碎过60目筛,以便得到海带粉;
水提:向所述海带粉加入40倍重量的蒸馏水,在90℃的热水浴条件下提取2h,离心,分离固液,以便得到上清液;
沉淀:将所述上清液的pH调节至0.8后,放置于4℃层析柜中过夜沉淀;
收集固液:过夜后的溶液放入高速离心机中,设定离心力为3000g,离心20min,分离固液,分离得到的凝胶为褐藻胶,分离得到的液体为褐藻胶与岩藻多糖的混合液;
调节pH:将褐藻胶凝胶用适量水复溶,然后用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;
酶解:调节pH处理后,在所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液中,加入褐藻胶裂解酶,酶活调节至5U/ml,50℃下酶解2h,之后,加热至100℃,设定离心机离心力为8000g,离心20min,除去褐藻胶裂解酶沉淀,以便得到岩藻多糖溶液;
透析:将经过调节pH处理的褐藻胶溶液与所述岩藻多糖溶液,分别装入透析袋中透析8次,透析袋分子截留量为3.8KDa,透析8次,每次透析两小时,前六次采用自来水透析,后两次采用蒸馏水透析;
浓缩、冻干:将透析处理的褐藻胶溶液和岩藻多糖溶液用旋转蒸发仪旋蒸,除去70%水分后,分装入离心管,放进冰柜进行冷冻,结冰冻实之后,将其放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥,以便得到岩藻多糖和褐藻胶。
相较于传统的醇沉法(方法一)和非醇沉未酶解法(方法二),本申请中非醇沉酶解法(方法三)可从海带中高效提取分离制备高纯度的岩藻多糖以及得到副产物褐藻胶;三种方法的关键指标对比见下表1;本发明分离得到的岩藻多糖的单糖组成为:岩藻糖(40%~42%)、半乳糖(17%~21%)、甘露糖(8%~11%)、葡萄糖(1%~3%)、葡萄糖醛酸(1%~3%)。本发明方法优化了岩藻多糖的提取制备工艺,改进了传统的水提醇沉法,为岩藻多糖的工业化生产提供了一个安全的、高效的提取制备方法;并且,对比岩藻多糖的中华人民共和国水产行业标准(SC/T 3404-2012),本发明方法提取的岩藻多糖的总糖含量,硫酸基团含量以及L-岩藻糖含量均高于国家标准要求的含量,灰分,pH及游离硫酸根均符合国家标准(采用此标准规定的方法检测)。
表1:三种提取方法的关键指标
综上所述,通过本发明方法制备得到的岩藻多糖,得率较高,品质较好,分离得到的副产物褐藻胶也可以去进一步的加工利用,是一种经济高效的分离方式。。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其特征在于,包括以下步骤:
粉碎:海带除沙洗净晾干后,粉碎过筛,以便得到海带粉;
水提:向所述海带粉加入30~45倍重量的蒸馏水,在70~100℃的热水浴条件下提取1~4h,离心,分离固液,以便得到上清液;
沉淀:将所述上清液的pH调节至0.6~0.8后,放置于4℃层析柜中过夜沉淀;
收集固液:将经过沉淀处理的溶液放入高速离心机中,离心,分离固液,分离得到的凝胶为褐藻胶,分离得到的液体为褐藻胶与岩藻多糖的混合液;
调节pH:所述褐藻胶凝胶用水复溶,调节其pH至中性;所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液用氢氧化钠溶液调节其pH至中性;
酶解:调节pH处理后,在所述褐藻胶与岩藻多糖的混合液中,加入褐藻胶裂解酶,酶活调节至5~15 U/ml,50℃下酶解2~4h,加热,离心,除去褐藻胶裂解酶沉淀,以便得到岩藻多糖溶液;
透析:将经过调节pH处理的褐藻胶溶液与所述岩藻多糖溶液,分别装入透析袋中透析5~8次,除去小分子杂质;
浓缩、冻干:将透析处理的褐藻胶溶液和岩藻多糖溶液旋蒸,除去70%水分后,分装,冷冻干燥,以便得到岩藻多糖和褐藻胶。
2.如权利要求1所述的从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其特征在于,在透析步骤中,所述透析袋分子截留量为3.8KDa,透析8次,每次透析两小时,前六次采用自来水透析,后两次采用蒸馏水透析。
3.如权利要求1所述的从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其特征在于:在水提步骤中,向所述海带粉加入40倍重量的蒸馏水,在90℃的热水浴条件下提取2h。
4.如权利要求1所述的从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其特征在于,在收集固液步骤中,所述高速离心机设定离心力为3000g,离心20min。
5.如权利要求1所述的从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其特征在于,在粉碎步骤中,粉碎过60目筛,以便得到海带粉。
6.如权利要求1所述的从海带中分离制备岩藻多糖和褐藻胶的方法,其特征在于,在酶解步骤中,酶活调节至5 U/ml,50℃下酶解3h,加热至100℃,离心,设定离心机的离心力为8000g,离心20min。
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GR01 | Patent grant | ||
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