CN106591405A - 一种c末端为酪氨酸的海带小分子ace抑制肽制备方法 - Google Patents
一种c末端为酪氨酸的海带小分子ace抑制肽制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106591405A CN106591405A CN201610857806.1A CN201610857806A CN106591405A CN 106591405 A CN106591405 A CN 106591405A CN 201610857806 A CN201610857806 A CN 201610857806A CN 106591405 A CN106591405 A CN 106591405A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thallus
- small molecule
- ace inhibitory
- kelp
- tyr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 title claims description 54
- 101000984728 Chiropsoides quadrigatus Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide Proteins 0.000 title claims description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 19
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 21
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 6
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 2
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 241000015177 Saccharina japonica Species 0.000 claims 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims 1
- -1 there is KY Natural products 0.000 claims 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 abstract description 36
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 abstract description 16
- 241001474374 Blennius Species 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 9
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000021822 hypotensive Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 33
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 33
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 description 3
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 3
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000004531 blood pressure lowering effect Effects 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
- C07K5/06095—Arg-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明旨在提供一种以海藻粗蛋白为原料，通过混合蛋白酶生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，该方法简便易行，具有较高的制备效率，且利于扩大生产，为海藻类降血压功能性制品的开发提供一种可行思路。制备具有较高ACE抑制活性的C末端为Tyr的小分子降血压肽，降血压效果显著。所制备的小分子降血压肽为白色粉末，易溶于水，且易吸收、毒副作用小、安全性高，可作为降血压防治药物的一种高效原料。
Description
技术领域
本发明属于植物血管紧张素转换酶（ACE）抑制寡肽制备领域，具体涉及一种以海带粗蛋白为原料生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法。
背景技术
我国的海带等海藻产量、加工量巨大。然而海带等海藻加工多以中小型企业为主，加工设备与生产技术较为落后，产品品种少，质量参差不齐，集中于初级加工产品形式，导致海藻类产品的价格及海藻企业的利润也相应较低，产值不容乐观。资料显示，海带等海藻的加工副产物中含有5%～20%的蛋白质，这些副产物未经加工被直接遗弃，造成了资源的极大浪费；若能变废为宝，将其深度开发为具有降血压活性的ACE抑制肽，将大大提高海藻类生物的附加值。大多数食用蛋白可通过蛋白酶酶解方法获取具有ACE抑制活性的降血压肽，且其降血压功效已通过动物实验或临床试验证实。研究结果显示，C末端含有Tyr的小分子活性肽具有较强的降血压活性，因此制备C末端含Tyr的小分子活性肽成为制备ACE抑制肽的特征条件。蛋白酶具有专一性，不同蛋白酶的酶切位点不同，导致酶解产物各不相同，因此选择合适的蛋白酶将有助于酶解产生更多、活性更强的ACE抑制肽。据文献资料显示，使用单一蛋白酶作用于蛋白会使蛋白水解液中多肽的相对分子质量较大，且分布范围较广；而高活性的ACE抑制肽的相对分子质量较小且有一定的范围。以该理论为出发点，混合蛋白酶酶解液中得到的ACE抑制肽的活性将远远高于单一蛋白酶酶解液的活性。
碱性蛋白酶是一种内切蛋白酶，倾向于催化裂解不带电荷的侧链氨基酸（如phe，Tyr，Trp等）的C端肽键，末端形成具有较强ACE抑制活性的疏水性氨基酸，且酶解速度较快。胰蛋白酶能水解N端的Lys，得到具有较高ACE抑制率的N端为Lys的系列肽段，但是酶解速度较慢。木瓜蛋白酶具有较宽的底物特异性，可切开全部蛋白质分子内部肽键，生成小分子多肽类，以便碱性蛋白酶与胰蛋白酶专一性切割为高活性的降血压小肽。将此三种蛋白酶混合理论上可高效制备C末端含有Tyr的小分子降血压活性肽。然而，目前国内外尚未发现有关海藻类食物源C末端含有Tyr的小分子降血压活性肽的混合酶解转化制备工艺研究。本发明针对以上关键技术进行探究优化，以从海藻粗蛋白中高效制备C末端含有Tyr的小分子降血压活性肽。利用多酶体系进行海带蛋白生物转化，分步优化生物酶自身酶解特性和最佳酶解工艺参数，进而确定海带小分子ACE抑制肽的最佳制备工艺。以期为功能性食品领域提供一种质优价廉的降血压原料制备方法，同时为海带等海藻的高附加值研究开发提供一定的理论基础和实践指导。
发明内容
本发明旨在提供一种以海带等海藻粗蛋白为原料，通过混合蛋白酶生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，该方法简便易行，具有较高的制备效率，且利于扩大生产，为海带等海藻类降血压功能性制品的开发提供一种可行思路。
针对以上技术问题，本发明提供一种以酪氨酸为C末端的海带小分子ACE抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料预处理：
新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过100~200目筛，备用；
（2）海带粗蛋白的制备：
取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0～9.5的缓冲液，按固液体积比1:35～1:50溶解，在45～60℃下匀速搅拌提取5～7 h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1 mol/L的盐酸将pH调节到4.3～4.7沉淀海带蛋白，在12000 r/min条件下离心10～15 min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；
（3）多酶体系生物转化：
取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:40～1:60加入pH为7.0～8.0的缓冲液作为提取液，加入3～5wt%的混合酶，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按照1:1:1～3:2:1的摩尔比混合而成；将反应体系置于50～65℃，500～800 r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5～8 h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15～20 min，在10000 r/min的高速离心机中离心10～15 min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；
（4）超滤：
将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000 Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液。
（5）ACE抑制活性检测：
将步骤（4）所得含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液过0.22µm的滤膜后采用高效液相色谱法进行体外ACE抑制活性检测，检测该生物转化液的降血压活性。
（6）冷冻干燥：
将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末。
所述的一种以酪氨酸为C末端的海带小分子ACE抑制肽粉末中主要含C末端为Tyr的小分子降血压肽，主要有KY，GKY，SKTY，AKY，AKYSY， KKFY，FY，KFKY八种，且该种抑制肽粉末的ACE抑制活性的IC50值为2.18 ～23.43mg/mL。
本发明的优点及益处在于：
1. 本发明利用我国高产量、低利用率的海带等海藻资源，多酶体系下生物转化制备具有较高ACE抑制活性的C末端为Tyr的小分子降血压肽，降血压效果显著，作用位点明确。
2. 本发明所制备的小分子降血压肽冷冻干燥后为白色粉末，易溶于水，且易吸收、毒副作用小、安全性高，可作为降血压保健品及预防药物的一种食品级天然原料。
3. 本发明利用酶工程技术，通过混合蛋白酶专一性生物转化方法，对海带等海藻粗蛋白进行深入的开发利用，高效制备具有降血压功效的小分子多肽物质；并通过分析检测技术检测得知该小分子多肽物质多为以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽，其中主要为KY，GKY，SKTY，AKY，AKYSY， KKFY，FY，KFKY八种小分子降血压肽。
4. 本发明的ACE抑制肽粉末的主要成分含有八种具有降血压活性的小分子肽（结构清楚，作用位点明确，详见附图），具有较高的ACE抑制活性，且其在消化道中难以被进一步消化酶解，可以在小肠中直接吸收利用，在人体中发挥较好的降血压功效，为海藻降血压功能性制品的开发提供了新的思路。
附图说明
图1 所用生物降解酶特性各影响因素交互作用的响应曲面图和等高线图
图2 降血压肽酶解制备工艺各影响因素交互作用的响应曲面图和等高线图
图3 各种小分子降血压活性肽与 ACE 的结合构象图：其中，图3A为小肽FY的结合构象图；图3B为小肽KY的结合构象图；图3C为小肽AKY的结合构象图；图3D为小肽GKY的结合构象图；图3E为小肽KFKY的结合构象图；图3F为小肽KKFY的结合构象图；图3G为小肽STKY的结合构象图；图3H为小肽AKYSY的结合构象图
图4小分子降血压肽FY与ACE受体蛋白结合构象。
具体实施例
实施例1：
一种海带粗蛋白生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料预处理：
新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过200目筛，备用；
（2）海带粗蛋白的制备：
取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.5的缓冲液，按固液体积比1:50溶解，在45℃下匀速搅拌提取5 h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1 mol/L的盐酸将pH调节到4.4沉淀海带蛋白，在12000 r/min条件下离心10 min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；
（3）生物转化：
取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:40加入pH为7.5的缓冲液作为提取液，加入3wt%的混合酶，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按照2:1:1的摩尔比混合而成；将反应体系置于55℃，600 r/min的水浴摇床中匀速振荡反应6 h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15 min，在10000 r/min的高速离心机中离心15 min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；
（4）超滤：
将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000 Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液。
（5）ACE抑制活性检测：
将步骤（4）所得含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液过0.22µm的滤膜后采用高效液相色谱法进行体外ACE抑制活性检测，检测该生物转化液的ACE抑制活性的半数抑制率IC50为4.78 mg/mL；
（6）冷冻干燥：
将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末，该粉末ACE抑制活性的IC50为4.78 mg/mL。所得八种小分子降血压肽的氢键作用位点如表1所示。
表1 各种小分子降血压肽的氢键作用位点
实施例2：
一种海带粗蛋白生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料预处理：
新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在65℃条件下烘干至恒重，粉碎后过100目筛，备用；
（2）海带粗蛋白的制备：
取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0的缓冲液，按固液体积比1:45溶解，在45℃下匀速搅拌提取6 h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1 mol/L的盐酸将pH调节到4.4沉淀海带蛋白，在12000 r/min条件下离心10 min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；
（3）生物转化：
取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:50加入pH为7.5的缓冲液作为提取液，加入4wt%的混合酶，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按照2:2:1的摩尔比混合而成；将反应体系置于55℃，500 r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5 h，反应结束后置于105 ℃的恒温水浴锅中灭酶15 min，在10000 r/min的高速离心机中离心15 min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；
（4）超滤：
将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000 Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液。
（5）ACE抑制活性检测：
将步骤（4）所得含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液过0.22µm的滤膜后采用高效液相色谱法进行体外ACE抑制活性检测，检测该生物转化液的ACE抑制活性的半数抑制率IC50为4.08 mg/mL；
（6）冷冻干燥：
将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末，该粉末ACE抑制活性的IC50为4.08 mg/mL。
实施例3：
一种海带粗蛋白生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料预处理：
新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过200目筛，备用；
（2）海带粗蛋白的制备：
取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0的缓冲液，按固液体积比1:50溶解，在45℃下匀速搅拌提取6 h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1 mol/L的盐酸将pH调节到4.4沉淀海带蛋白，在12000 r/min条件下离心10 min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；
（3）生物转化：
取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:60加入pH为8.0的缓冲液作为提取液，加入4wt%的混合酶，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按照1:2:1的摩尔比混合而成；将反应体系置于55℃，600 r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5 h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15 min，在10000 r/min的高速离心机中离心15 min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；
（4）超滤：
将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000 Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液。
（5）ACE抑制活性检测：
将步骤（4）所得含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液过0.22µm的滤膜后采用高效液相色谱法进行体外ACE抑制活性检测，检测该生物转化液的ACE抑制活性的半数抑制率IC50为2.36mg/mL；
（6）冷冻干燥：
将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末，该粉末ACE抑制活性的IC50为2.36 mg/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料预处理：
新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过100~200目筛，备用；
（2）海带粗蛋白的制备：
取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0～9.5的缓冲液，按固液体积比1:35～1:50溶解，在45～60℃下匀速搅拌提取5～7 h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1 mol/L的盐酸将pH调节到4.3～4.7沉淀海带蛋白，在12000 r/min条件下离心10～15 min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；
（3）多酶体系生物转化：
取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:40～1:60加入pH为7.0～8.0的缓冲液作为提取液，加入3～5wt%的混合酶，将反应体系置于50～65℃，500～800 r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5～8 h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15～20 min，在10000 r/min的高速离心机中离心10～15 min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；
（4）超滤：
将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000 Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液；
（5）冷冻干燥：
将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末。
2.权利要求1所述的一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法，其特征在于：所述混合酶是基于海带蛋白质组学进行酶切位点分析，针对性地选取蛋白酶，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按照1:1:1～3:2:1的摩尔比混合而成。
3.权利要求1所述的一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法，其特征在于：所制备的ACE抑制肽的C末端为酪氨酸，主要有KY，GKY，SKTY，AKY，AKYSY， KKFY，FY，KFKY八种小分子降血压肽。
4.权利要求1所述的一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法，其特征在于：该海带生物转化液的ACE抑制活性在2.58～20.63 mg/mL，活性作用位点明确。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610857806.1A CN106591405A (zh) | 2016-09-28 | 2016-09-28 | 一种c末端为酪氨酸的海带小分子ace抑制肽制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610857806.1A CN106591405A (zh) | 2016-09-28 | 2016-09-28 | 一种c末端为酪氨酸的海带小分子ace抑制肽制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106591405A true CN106591405A (zh) | 2017-04-26 |
Family
ID=58556069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610857806.1A Pending CN106591405A (zh) | 2016-09-28 | 2016-09-28 | 一种c末端为酪氨酸的海带小分子ace抑制肽制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106591405A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416228A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-09-21 | 大连工业大学 | 一种从脱胶海带粉中提取海带蛋白的方法 |
| CN113527534A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-22 | 大连工业大学 | 一种联合制备海藻酸钠和海带蛋白的方法 |
| CN116916765A (zh) * | 2021-02-23 | 2023-10-20 | 庆尚国立大学校 产学协力团 | 包含末端具有酪氨酸的肽作为有效成分的用于预防、改善或治疗由蛋白质硝化引起的疾病的组合物 |
| US12102661B2 (en) | 2020-11-23 | 2024-10-01 | Northeast Agricultural University | ACE inhibitory peptide composition derived from ginkgo protein and preparation method and application thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104256252A (zh) * | 2014-09-15 | 2015-01-07 | 福建农林大学 | 一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法 |
| CN105768111A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-07-20 | 厦门三九生物科技有限公司 | 一种海洋多肽-钙螯合物的制备方法与应用 |
| CN105838766A (zh) * | 2016-05-11 | 2016-08-10 | 陕西科技大学 | 一种胰凝乳蛋白酶酶解魔芋飞粉制备ace抑制肽的方法 |
-
2016
- 2016-09-28 CN CN201610857806.1A patent/CN106591405A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104256252A (zh) * | 2014-09-15 | 2015-01-07 | 福建农林大学 | 一种分步提取与生物转化偶联制备海带降血压制品的方法 |
| CN105768111A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-07-20 | 厦门三九生物科技有限公司 | 一种海洋多肽-钙螯合物的制备方法与应用 |
| CN105838766A (zh) * | 2016-05-11 | 2016-08-10 | 陕西科技大学 | 一种胰凝乳蛋白酶酶解魔芋飞粉制备ace抑制肽的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FENG-JUN WANG等: ""Separation and purification of angiotensin-I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from walnuts (Juglans regia L.) meal"", 《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》 * |
| 陈继承等: ""海带中酪氨酸末端小分子降血压肽液相色谱检测方法研究"", 《2015年福建省水产学会学术年会暨省科协第十五届学术年会卫星会议论文集》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12102661B2 (en) | 2020-11-23 | 2024-10-01 | Northeast Agricultural University | ACE inhibitory peptide composition derived from ginkgo protein and preparation method and application thereof |
| CN116916765A (zh) * | 2021-02-23 | 2023-10-20 | 庆尚国立大学校 产学协力团 | 包含末端具有酪氨酸的肽作为有效成分的用于预防、改善或治疗由蛋白质硝化引起的疾病的组合物 |
| CN116916765B (zh) * | 2021-02-23 | 2025-08-19 | 庆尚国立大学校产学协力团 | 包含肽作为有效成分的用于预防、改善或治疗由蛋白质硝化引起的疾病的组合物 |
| CN113527534A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-22 | 大连工业大学 | 一种联合制备海藻酸钠和海带蛋白的方法 |
| CN113416228A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-09-21 | 大连工业大学 | 一种从脱胶海带粉中提取海带蛋白的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103052717B (zh) | 一种工业化生产玉米降压活性肽的方法 | |
| CN104745663B (zh) | 一种猪血红蛋白综合利用的方法 | |
| CN102808010A (zh) | 一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法 | |
| CN111685286B (zh) | 一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用 | |
| CN104513843B (zh) | 一种多糖和蛋白肽的联合制备方法 | |
| CN104031967B (zh) | 一种沙丁鱼降血压肽及其制备方法与应用 | |
| CN102250997B (zh) | 一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法 | |
| CN110724178A (zh) | 一种金枪鱼白肉ace抑制肽及其制备方法 | |
| CN106591405A (zh) | 一种c末端为酪氨酸的海带小分子ace抑制肽制备方法 | |
| CN102191306A (zh) | 海蜇降压肽的酶法制备方法 | |
| CN104762358A (zh) | 贻贝蛋白降压肽的快速制备方法 | |
| CN112813126B (zh) | 一种火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法和一种具有降尿酸作用的多肽液及其应用 | |
| CN102174626A (zh) | 一种玉米肽的制备方法 | |
| JP2012244930A (ja) | かつおの中骨を原料とするコラーゲンペプチドの製造方法 | |
| CN108893515A (zh) | 高f值寡肽及其制备方法 | |
| CN112080542A (zh) | 一种低苯丙氨酸蛋清蛋白肽的制备方法 | |
| CN108795906A (zh) | 用于水解蛋壳膜的复合酶、蛋壳膜的水解方法、蛋壳膜水解产物及其提取方法 | |
| CN107232572A (zh) | 一种利用金针菇菇脚生产食品级鲜味剂的方法 | |
| CN110759965A (zh) | 一种金枪鱼红肉ace抑制肽及其制备方法 | |
| CN102533917A (zh) | 一种从胶原蛋白制备rgd活性多肽的方法 | |
| CN1896267B (zh) | 利用蚕蛹制取降血压肽的方法 | |
| CN114395603A (zh) | 一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备小分子肽的方法 | |
| CN107494886A (zh) | 一种利用鱼溶浆生产的蛋白粉产品 | |
| CN101215594A (zh) | 连续酶膜反应制备马氏珠母贝降血压肽的方法 | |
| CN102864200A (zh) | 复合酶水解大米分离蛋白制备ace抑制肽的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170426 |