JPH07501937A - 精製キチンデアセチラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キチンは、セルロースに次いで世界で最も豊富で、容易に得られ、そして再生可 能な生物材料である。それは、広範な種類の生物によって合成される天然産物で ある。この物質は、毎年数十像トン生産されている。

キチンは、炭水化物のポリマーであり、β（ｌ→４）結合Ｎ−アセチルグルコサ ミンのＮ−アセチルポリマー、すなわちポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンである 。植物では、キチンはセルロースに置き換わる細胞壁の構成物であり、また時に は、セルロースと共に出現する細胞壁の構成成分である。

動物では、通常キチンは上皮組織の一方の表面の表皮として構成される。セルロ ースに構造的に類似するけれども、キチンは明確に異なった化学的性曽を有する 。それは、極端に不溶性の物質であり、その産業上の利用可能性は制限されてい る。

キチンのデアセチル化誘導体であるキトサンは、はるかに扱い易い物質であり、 広範な、そしてすばらしい実用的利用性を有している。キトサンは、陽性に荷電 しており、従って、それは蛋白の沈澱剤および金属キレート剤として用いること ができる。それは、溶液、ゲル、膜、フィルムまたは、繊維の形態をとることが できる。このような形態は、例えば、貴重な金属の回収、あるいは、穀物の保護 、クロマトグラフィー、及び酵素の固定化の分野で有用である。キトサンは、生 体に悪影響を及ぼさず、かつ非免疫原性の素材であり、農産業、食品産業、医薬 品産業、及び化粧品産業における使用に理想的とされる。それは、例えば、コラ ーゲンおよびケラチンのような他の天然ポリマーとコンプレックスを形成し、独 特の生体臨床医学的諸性質を持つ素材を形成することができる。例えば、そのよ うな素材は、創傷治癒促進剤として、人工皮膚及び血管の成分として、抗血液凝 固剤として、及び薬物放出制御ビーイクルとして用いることができる。

現在、世界的に生産されているキトサンのほとんどは、甲殻類の殻物質から調製 されている。キチンは、甲殻類の表皮の乾燥重量の約２０〜５０％を占め、その バランスは、主として、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム及び他の蛋白質である 。キチンは、最初に粉砕した甲殻類の殻を希酸及び希アルカリで処理し、蛋白及 びミネラルを除去することによって、単離される。この祖のキチンは、次いで高 温で濃アルカリに曝すことによりデアセチル化されてキトサンとなる。このよう にして生産されたキトサンは、多くの有用な特性を存しているが、この生産過程 を効率的に制御することは不可能であり、従って、広い範゛囲にわたる分子量を 持ち、そしてデアセチル化の程度の異なった物質を生産することになる。このよ うな生産物は、あまり価値はない。なぜなら、重要な用途になると考えられるも のの多く、特に生体臨床医学の分野においては、極めて特異的な物理的、化学的 な諸性質を有する均一な素材が必要とされるからである。

発明の要旨 本発明は、キチンデアセチラーゼの本質的に純粋な製品、及びこれを細胞抽出物 から単離する方法に関する。加えて、本発明は、キチンデアセチラーゼと特異的 に反応する免疫グロブリンに関する。他の面において、本発明は、キチンをキト サンに転換する方法における精製した本酵素の利用、及びこの方法によって生産 される生産物に関する。

この精製酵素は、例えばキチンのキトサンへの変換において有用である。キチン のキトサンへの酵素的な変換は、一部について上述したような種々の技術的欠点 を有する現在使用されている化学的方法に替わる魅力的な別法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、フェニールセファロース＠ＣＬ−４Ｂカラムからの溶出プロフィールを 表わす図である。

図２は、Ｑセファロース■ファストフローカラムからの溶出プロフィールを表わ す図である。

図３は、Ｓセファロース０フアストフローカラムからの溶出プロフィールを表わ す図である。

図４は、キチンデアセチラーゼ活性の温度依存性を表わす図である。

図５は、キチンデアセチラーゼ活性のｐＨ依存性を表わす図である。

発明の詳細な説明 本発明は、キチンデアセチラーゼを生産する生物の細胞抽出物からキチンデアセ チラーゼを精製する方法の発見によって可能とされた。この酵素キチンデアセチ ラーゼは、例えばキチンデアセチラーゼを得るための好ましい原料（５ｏｕｒｃ ｅ）は、糸状菌の菌糸の細胞壁である。このような菌糸は、（ｆｕｎｇｕｓ）を 利用することは、多くの利点を生ずる。

この生物は、安価な栄養素を用いて生育できる。大規模発酵システム中で、高細 胞密度（培地ｌリットル当たりの乾燥国体重量のグラム数）に生育することがで きる。高細胞密度を達成するのに必要な培養時間は、バッチ当たり１２時間程度 と短い。

まず、細胞抽出物はキチンデアセチラーゼを生産する生物液の存在下で、破砕さ れる。この抽出緩衝液は、プロテアーゼインヒビター、他の分解酵素のインヒビ ター及び酵素活性を維持してその抽出を容易にするための安定剤を含んでいても よい。不溶性の物質は、例えば、濾過、または遠心分離によって抽出混合物の液 相から除去される。

細胞抽出物は、望ましくない蛋白質（即ち、キチンデアセチラーゼ以外の蛋白質 ）の沈澱を起こさせる熱的なサイクリング過程に付される。例えば以下の実施例 に述べるように、この抽出物は、約５０°Ｃで約１５−３０分の期間インキュベ ートすることができる。沈澱した蛋白質は、続いて例えば、濾過、または遠心分 離により除去される。

高塩濃度の溶液中では、蛋白質の溶解性は、大きな範囲で変動することがよく知 られている。この溶解性における差を利用して高イオン強度における沈澱により 、溶液中の蛋白質の分離を達成することができる。多くの塩が、この目的に利用 できるが、硫酸アンモニウムがｐＨを顕著に変えず、溶解性が極めて高く、そし て蛋白質を不安定化しないことから好ましい。

出願人らは、約２．１Ｍの硫酸アンモニウム濃度が上述の液相から多種類の蛋白 質を効果的に沈澱させ、キチンデアセチラーゼを沈澱させないことを確認した。

約２．１Ｍの硫酸アンモニウム濃度中で沈澱する蛋白質は、標準の技術（例えば 、濾過または遠心分離）により、溶液から除去される。

硫酸アンモニウム沈澱に続いて回収される液相は、疎水的相互作用クロマトグラ フィーにかけられる。疎水的相互作用クロマトグラフィーは、荷電を持たないゲ ルマトリックスに結合している疎水基の疎水性相互作用の強度が異なることに基 づいて、巨大分子の精製に広く用いられている。この技術は、通常比較的高い濃 度のアンチカオトロピック（ａｎｔｉ−ｃｈｏｔｒｏｐｉｃ）な塩の存在下で行 われる（塩促進吸着クロマトグラフィー）。いくつかの因子が、疎水的吸着剤上 での蛋白質及びペプチド類のクロマトグラフ的挙動に影響する。これらの因子の 中には、リガンド構造、リガンド密度、試料の特性、流速、堰折効果、イオン強 度、温度及びｐＨが含まれる。疎水的カラム樹脂の一例は、フェニールセファロ ース■６フアストフローである。疎水的吸着剤により結合された物質は、例えば 、水をカラムに通すことにより、カラムから除去される。

疎水的相互作用クロマトグラフィーに続いて、キチンデアセチラーゼを含む溶液 は、さらにイオン交換クロマトグラフィーにより精製される。イオン交換体は、 それにイオンが静電的に結合される、化学的に結合した荷電グループを有する固 体の支持体である。陰性に荷電したグループは、陽性のイオンと交換し、従って カチオン交換体となる。陽性に荷電したグループは、陰性イオンと交換し、従っ て、アニオン交換体となる。

イオン交換体は、強イオン交換体と弱イオン交換体として特徴づけられる。強イ オン交換体は、広いｐＨ範囲に渡って機能し、従ってイオン化するために非常に 低い又は高いｐＨが必要となる弱イオン化性物質を分離するのに有用である。

疎水カラムから回収される物質のｐＨは、約８に調整され、強アニオン交換カラ ム（例えば、Ｑセファロース［Ｆ］ファストフロー）を通過させる。フラクショ ンを集め、以下の実施例の部に述べるように、キチンデアセチラーゼ活性につい て試験する。キチンデアセチラーゼ活性を有するフラクションを集め、そしてプ ールしたフラクションのｐＨを約３．５に調整する。

次いで、この溶液を強力チオン交換樹脂（例えは、Ｓセファロース０フアストフ ロー）を含むカラムに通し、そして通過液を集める。ポリアクリルアミドゲル電 気泳動により分析すると、この通過フラクシヨンは、電気泳動的に均一な蛋白種 を含んでいる。本質的に純粋という語は、ここで用いるときは、ゲル電気泳動に よる分析で実質的に単一バンドとして分離するキチンデアセチラーゼ調製物を指 す。

精製の第２の方法においては、出願人はキチンデアセチラーゼと特異的に反応す る精製免疫グロブリンを用いた。所望の性質を有する免疫グロブリンは、本質的 に純粋なキチンデアセチラーゼで動物を免疫することにより生産することができ る。所望の性質を有する免疫グロブリンを免疫吸着剤を作るために、固体の支持 体に結合させることができる。この免疫吸着剤は次いで、従来法により粗抽出物 がら酵素を精製するために用いることができる。

ここに述べたようにして調製されたキチンデアセチラーゼは、キチンをキトサン に変換するための方法に使用することができる。酵素活性に影響する反応パラメ ーターは、実施例中で討論する。

実施例 実施例１：キチンデアセチラーゼを精製するための第一の方法Ｍｕｃｏｒ　ｒｏ ｕｘｉｉの発酵 Ｍｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （ＡＴＣＣ２４９０５）から入手した。このかびを、バルトニキーガルシアと二 カーソン（Ｂａｒｔｎｉｃｋｉ−Ｇａｒｃｉａ　ａｎｄ　Ｎ１ｃｋｅｒｓ。

ｎ）（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　８４：　８４１−８５８（１９６２））により記述 されたように、最小培地中で、１６リツトルバツチで成育させた。培地にリット ル当たり２Ｘ１０”・胞子を接種し、２８°Ｃで２４時間滅菌空気を通気し攪拌 した。対数増殖期中期に濾過により菌糸を収穫した。この培養により、リットル 当たり約２０ｇ（湿菌重量）の菌糸が得られた。

４００ｇの菌糸を６００ｇのガラスピーズ及び５０ｍＭ　）リスＨＣＩ（ｐＨ７ ゜８）　、ｌｏｏｍＭのＮａＣｌおよび０．２ｍ＆ｌのＰＭＳＦを含む抽出緩衝 液７゜Ｏｍｌ　と共に氷上にて１時間ブレンドすることにより抽出を行った。抽 出が完了した後、ガラスピースを沈めて除去し、抽出液を４°Ｃにて８０００ｇ 　、３０分間の遠心分離にかけた。この上清（７５０ｍｌ）を粗抽出液と呼ぶ。

粗抽出液は、次いで５０°Ｃに設定された水浴中で３θ分間インキュベートし、 沈澱した物質を４°Ｃにて８０００［ｉ　、　３０分間の遠心分離により除去し た。５０″Ｃのインキュベーションにより得られた上清に硫酸アンモニウムを２ ．１Ｍとなるように加え、沈澱する蛋白質をｌ００００ｇで４５分間遠心分離す ることにより除去した。この上１（８５０ｍｌ）を、２．１１ｉ１硫酸アンモニ ウムを含む２０ｍＭトリス）ＩＣｌ　（ｐＨ７，５）で平衡化したフェニルセフ ァロース０ＣＬ−４Ｂのカラム（４４ｘ２３０ｍｍ）に通過させた。このカラム を上記の緩衝液で洗浄した後、漸減する直線濃度勾配の硫酸アンモニウム水２１ ００ｒａ／で、保持されたの蛋白質を溶出した。流速は２５０ｍ１／ｈであり、 １４ｍ１ずつ分画し集めた。この溶出プロフィルを図１に示す。キチンデアセチ ラーゼ活性は画分１９５−２９５に検出された。これらをプールし、さらに精製 した。蛋白質含量は２８０ｎｍでＵＶモニターにより追跡した。

キチンデアセチラーゼ活性は、Ｎ−アセチル基に放射探識した部分的に０−ヒド ロキシエチル化したキチン（グリコールキチン）を基質として用いて測定した。

この基質の調製及び試験条件は、次のような修正を加えたうえで、アラキとイト −試験混合液は、２５ｍＭグルタミン酸ナトリウムでｐＨ４゜５（５０°Ｃ）に 緩衝化された０、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有した。インキュベーション時間は ５０″Ｃで３０分間であった。

前の段階で部分的に精製されたキチンデアセチラーゼのサンプルを、２０ｍＭト リスＨＣＩ　（ｐＨ８）に対して透析し、次いで同じ緩衝液で平衡化したＱセフ ァロース０ファストフォローカラム（２６ｘ３４０ｍｍ）に通過させた。このカ ラムを洗った後、２０ｍＭ）リスＭＣＩ　（ｐＨ８）で緩衝化したＮａＣ１の直 線勾配（２０００ｍｔ’、０−０．７５Ｍ）で溶出した。流速は３００ｍ１／ｈ であった。１１．５ｍｌずつ分画し集めた。溶出プロフィルを図２に示す。キチ ンデアセチラーゼ活性は、約０．１３ＭのＮａＣ１に対応する両分１０５−１５ ０中、に検出された。これらの両分をプールし、さらに処理を進めた。

プールした画分を、２５ｍＭのギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，’５）に対して 透析し、このサンプルを同じ緩衝液で平衡化したＳセファロース■ファストフロ ーカラム（２６Ｘ２８０ｍｍ）にかけた。このカラムから、上記の緩衝液中、Ｎ ａｃｌの直線勾配（２０００ｍｌ、Ｏ−１，２Ｍ）で、２５０　ｍ　ｌ　／　ｈ の流速により溶出した。１２ｍ１ずつ分画し集めた。溶出プロフィルを図３に示 す。キチンデアセチラーゼ活性の大部分はこのカラムに保持されず、電気泳動的 に均一な精製工程の結果を表１に要約する。この操作により精製された酵素は、 ネイティブおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥの両方の試験により、電気泳動的に均一であ ると判定された。勾配（５−２０％）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、この 酵素のバンドは、約７５　ｋＤａの分子量に対応する距離に移動した。

精製キチンデアセチラーゼをセファクリルのＳ−２００ＨＲでゲル濾過を行うと 、この酵素は約８０ｋＤａの見掛けのサイズを持った単一ピークとして溶出され た。このことは、天然型の酵素がモノマーとして存在することを示す。

表１ キチンデアセチラーゼの精製 幾つかの証拠により、キチンデアセチラーゼが糖蛋白であることが示唆されてい る。電気泳動の後、この酵素のバンドはポリアクリルアミドゲル上で過ヨウ素酸 −シフフ試薬により隈性の染色を示した。この酵素は、コンカナバリンＡ−セフ ァロース＠４Ｂのカラムに保持され、そしてα−メチルマンノサイドの勾配によ る溶出により約２５ｍＭに対応する位置に単一ピークとして回収された。表２に 示すように、この酵素の直接の炭水化物分析により、この蛋白質は、−分子につ き６残基のフコース、８５残基のマンノースおよび２２残基のＮ−アセチルグル コサミンを含み、この蛋白質の分子量の約３０％を占めていることが明らかにさ れた。シアル酸および他の糖類は有意の量では発見されなかった。

モノサッカライド分析は、ガスー液体クロマトグラフィー及びガスー液体クロマ トグラフィー−マススペクトロメトリーによって行った。試料は４Ｍ）リフルオ ロ酢酸中、１００°Ｃで４時間加水分解した。分子量たりの炭水化物のモル比は 直接の炭水化物分析およびアミノ酸組成分析により見積もった。

Ｃ）イン　ビトロ翻訳産物の免疫沈降 別の方法により、キチンデアセチラーゼのポリペプチド鎖の大きさを決定するた めに、この酵素をコードするｍ　ＲＮ　Ａをイン　ビトロで翻訳させ、次いで免 疫沈降を行った。ｍＲＮＡを、対数増殖期の初期に採取した菌糸（湿菌体量１５ ｇ）から、液体窒素中で摩砕することにより抽出した。ｍＲＮＡはチャーウィン ら（Ｃｈｉｒｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）（Ｂｉｏｃｈｅｍ、上８：５２９４−５２ ９９　（１９７９））のグアニジウムチオシアネート法により精製し、次いで塩 化セシウム中で超遠心分離にかけペレット状とした。アビ４１２（１９７２）） により記述されたように、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを３回通してポリ （Ａ）′″ＲＮＡ（約１２０μｇ）を単離した。全てのｍ　ＲＮ　Ａのイン　ビ ト三翻訳は、ヌクレアーゼ処理したウサギの網状赤血球溶解物を製造業者の説明 書に従って用いて行った。イン　ビトロ翻訳産物は、３″Ｓ−メチオニンで標識 した。

ポリクローナル抗血清は、精製キチンデアセチラーゼ（５００μｇ、ＰＢＳ中１ ｍｇ／ｍｌ）を等量のフロイントの完全アジュバントと共に乳化することにより 調製された。この混合物を、免疫前の血清を得た後、兎に皮肉注射した。この動 物をフロイントの不完全アジュバント中の２００μｇの酵素を皮肉注射して再免 疫し、４及び６週後に採血した。得られた抗血清について、ＥＬＴＳＡおよび酵 素活性阻害試験により、抗キチンデアセチラーゼ抗体の存在をモニターした。

イン　ビトロ翻訳反応が完了した後、免疫前の血清の１０μｌを添加し、反応液 を室温で３０分間インキュベートした。

この反応液にプロティンＡ−セファロース０のｌｏμｌを加えて吸着させた後、 抗原−抗体複合体を遠心分離により除去した。次いで、特異的ポリクローナル抗 血清（１０μｍ）を上清に加え、続いて上記のようにインキュベートした。新た に生じた抗原−抗体複合体をプロティンＡ−セファロース０を用いて遠心分離に より集め、次いで２５ｍＭ）リスＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１５０ｍＭＮａＣ１の ２０倍量で洗浄、再懸濁およびペレット化を３回行った。免疫沈降物を５ＤＳ− ＰＡＧＥ用緩衝液中で５分間煮沸し、ゲル電気泳動により分析した。このゲルを １０％酢酸及び３０％メタノール中で３０分間固定し、ＥＮ’　ＨＡＮＣＥ＠に ューイングランド・ヌクレア社製）中で３０分間インキュベートし、次いで風乾 した。

イン　ビトロ翻訳産物を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、オー トラジオグラフィーにかけた。特異的抗血清により免疫沈降された物質は、翻訳 後の修飾を受ける前のポリペプチド鎖の大きさを表わす約４９０００ｋＤａの分 子量に対応する一つのバンドを示した。

ｄ）酵素活性の特性 この酵素活性の最適温度は、上述のように基質として標識化されたグリコールキ チンを用いて、約５０°Ｃであると評価された。キチンデアセチラーゼ活性の温 度依存性を図１にグラフとして示す。最適ｐＨは、図２に図示するように、オー バーラツプした緩衝液の組合せを用いて約４．５と評価された。キチンデアセチ ラーゼ（５ｍＵ）は、化学的に部分デアセチル化されたキトサン（８１％）の１ ｍｇと１時間インキュベートすると、脱アセチル化度で約５．３％の増加に相当 する０、２２μモルの酢酸を遊離した。この酵素は、微結晶性キチン（コロイド 状キチン）にも、カルボキシメチルキチン（可溶性誘導体）にも活性を示した。

ｅ）アミノ酸組成 キチンデアセチラーゼのアミノ酸組成を表３に示す。塩基性アミノ酸は全アミノ 酸の約８％に過ぎず、平均より約４０％低い値を示す。

精製キチンデアセチラーゼのアミノ酸組成は、１００　’Ｃにて６ＭＨＣ］で２ ４時間加水分解した後決定された。この値は、二つの異なる試料についての測定 の平均値である。蛋白から得た免疫沈降産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子 量である４９０００Ｄａに基づくものである。

表３ 実施例２：キチンデアセチラーゼに反応性の抗体の生産と晴成熟白色雄二ニジ− ランド・ラビットを、実施例１に記述したようにかびＭｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉ から調製した精製キチンデアセチラーゼ５００μｇ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）で 免疫した。この酵素は、全容量が１ｍｌになるように等量のフロイントの完全ア ジュバントと共に乳化し、この動物に皮肉投与した。さらに、フロイントの完全 アジュバント中で乳化した１５０μｇのキチンデアセチラーゼのブースター量を 、４週間の間隔で３回投与した。耳の周辺血管（ｍａｒｇｉｎａｌ　ｅａｒ　ｖ ｅｉｎ）から採血し、ＥＬＩＳＡにより血清抗体の力価をモニターするために用 いた。対照の血清は、免疫前に採取した。

作成した抗血清の特異性は、キチンデアセチラーゼ阻害試験で分析した。キチン デアセチラーゼ活性は、水溶性キチン誘導体であるグリコール〔アセチル−３Ｈ ）キチンから遊離される〔５Ｈ〕−酢酸の放射活性を測定することにより決定さ れた。反応混合物は、４８μｇのグリコール〔アセチル−３Ｈ〕キチン、１ｍＭ の塩化マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含み、２５ｍＭのグルタミン 酸ナトリウム（ｐＨ４５）で緩衝化し、全量を５０μｌとした。５０°Ｃで１５ 分間インキュベートした後、１６μｌのＨＣＩ、４μｌの酢酸及び８０μｍの水 を添加して反応を終了させた。この混合物に酢酸エチル（０，５ｍ１）を添加し 、ポルテックス・ミキサーで５分間激しく攪拌し、１４０００ｒｐｍで遠心分離 した。この有機層溶液２００μｌにトルエンを主とする液体シンチレーション・ カクテルの４．５ｍｌを加え攪拌した。

この溶液をバイアルに移し、液体シンチレーション・カウンターで放射活性を測 定した。酵素の１単位は、上記の条件下で１分間にグリコールキチンから酢酸！ 、０μモルを遊離する。比活性は、蛋白質１ｍｇ当たりの酵素の単位として定義 した。蛋白質は、牛血清アルブミンを標準として使用し、いわゆるロウリー（Ｌ ｏｗｒｙ）法により試験した。

抗体の力価は、非競合的ＥＬＩＳＡによりモニターした。

キチンデアセチラーゼを、０．０５Ｍの炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウ ムを含む「コーティングＪ緩衝液の２μｇ／ｍ！中で、４°Ｃにて１夜インキユ ベートすることにより、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉ　５ｏｒｐ、Ｎｕ ｎｃ。

Ｄｅｎｍａｒｋ）上に固定化した。ウェルをトウイーン８０の０．０５％水溶液 で洗浄し、続いて蒸留水で２回洗浄した。

その後、各ウェルに２００μｍのブロッキング剤を入れ、室温で１時間インキュ ベートした。ブロッキング剤は、０．０１０ＭのＰＢＳ　（ｐＨ７，４）１００ ｍｌ中にＩｇの牛血清アルブミンを溶解したものであった。ウェルは前と同様に 洗浄した。ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼに結合した抗−ラビットＴｇ Ｇは、固定化キチンデアセチラーゼに結合した（ｃｏｎ　ｊｕｇａ　ｔ　ｅｄ） 特異的１ｇＧを間接的に検出するために用いた。この結合物（ｃｏｊｕｇａｔｅ ）は、０゜０１０ＭのＰＢＳ　（ｐＨ７，４）で１００００倍に希釈し、そして 各ウェルに１００μｌ注入し、室温で１時間インキュベートした。前と同様にウ ェルを水／トウィーン８０溶液で洗浄し、続いて蒸留水で２回洗浄した。ウェル から吸引し、使用直前に次のようにしてｍ製された基質／発色物質溶液の１００ μｍとインキュベートした。反応は、ウェル当たり５０μｌの４Ｍ硫酸を添加す ることにより、１５分後に停止させた。吸光度は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ読み取り機を 用い、４５０ｎｍで測定した。抗血清の種々の量とインキュベートした後、精製 キチンデアセチラーゼの一定量の酵素活性を測定した。これらの実験により、抗 血清の一成分がキチンデアセチラーゼと特異的に反応することが確認された。

ＩｇＧは、製造者の説明書に従ってシアノーゲンブロミドー活性化セファロース ４Ｂ（ファルマシア社＄２）に固定化されたキチンデアセチラーゼを用い、ラビ ット血清から親和性により精製された。精製キチンデアセチラーゼ１０ｍｇを含 む溶液を、Ｏ，１Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む「カップ リング緩衝液Ｊ　（ｐＨ８，３）の２１ｔに対して透析した。カップリング緩衝 液で平衡化した、予め膨潤させたシアノーゲンブロミドー活性化セファロース４ Ｂをキチンデアセチラーゼ（１，４ｍｇ蛋白質／ゲルｍｌ）と混合し、４°Ｃで 一夜回転攪拌した。この混合物をすり合わせガラスロートに移し、真空下で吸引 乾燥した。この溶液を回収し、カップリング効率を評価するため蛋白質について 試験した。このゲルをカップリング緩衝液で完璧に洗浄し、前述したようにトリ ス−ＨＣｌ緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ８，０）を室温にて２時間混合した。ゲルを 吸収乾燥し、カップリング緩衝液で洗浄した。ゲルに非共有結合により吸着した 蛋″白質は、低ｐＨ（０，１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ ４，０）と高ｐＨ（０，ＩＭ）リス、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８，３）の 緩衝液で交互に洗浄することにより除去された。キチンデアセチラーゼー結合セ ファロース４Ｂをミ二カラムに移し、０．０２５Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４ ）で洗浄し、これを４°Ｃで保存する間は、上のトリス−ＭＣＩに０．０２％の アジドナトリウムを含ませた。

溶液中の抗体の濃度は、光路長１ｃｍのセルを用い、１ｍｇｍ１−’蛋白の抗体 に対する平均吸光係数として１．４を用いたＡｔｔｏの測定値から計算すること ができる。

種々の採血により得られたキチンデアセチラーゼに対するラビット抗血清を、硫 酸アンモニウムの４０％飽和により別個に沈澱させた。沈澱物を含む免疫グロブ リンを溶解し、０．０２５Ｍ）リス（ＰＨ７，４）　、０．２Ｍ塩化ナトリウム に対して充分に透析し、続いてキチンデアセチラーゼー結合セファロース４Ｂカ ラム（プロテアーゼ阻害剤を含む）を通過させた。このゲルをカラムの１０倍量 の０．０２５Ｍ　トリスおよび０．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，４）で洗浄し 、集めた画分が２８０ｎｍでの読みを示さなくなるまで洗浄した。非特異的に結 合した蛋白質は、６．０２５Ｍ）リス、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐ）１７．４で溶 出された。ＩｇＧの１つのバッチは、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２， ８）の２倍カラム量で溶出された。より高親和性のＩｇＧの別のバッチが０．２ Ｍグリシン−塩酸、ｐＨ２，２の２倍カラム量で溶出された。ここで用いる親和 性という用語１よ、ポリクローナル抗体が用いられたときの機能的親和性（結合 活性）を意味する。すべての両分はただちにＩＭ’）リス−〇ＣＩ（ｐＨ９，０ ）でｐＨ７，０に調整した。ｔｇＧ画分の二つのグループを別々に集め、Ｏ，９ ２５Ｍ　）リス（ｐＨ７゜４）に対して透析する前に限外濾過により濃縮した。

精製したこの特異的１ｇＧは５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて特徴的なラビット＋’ｇ ｃのパターンを示す。純粋な特異的ｔｇＧは、０．０１０Ｍトリス”、Ｏ，１Ｍ 塩化ナトリウム（ｐ）１７．４）中、＞　１＋ｒ＋ｇ／ｍｌの濃度で一２０°Ｃ にて貯蔵する。

キチンデアセチ多−ゼのシアノーゲンブロミドー活性化セファロース４Ｂへのカ ップリングは、９０％の効率であり、ゲル１ｍｌ当たり１．４ｍｇのキチンデア セチラーゼを有するキチンデアセチラーゼー結合セファロース４Ｂを調製した。

ここに提示する方法により、抗血清１０ｍ１につき約２．０−６．５ｍｇの純粋 な特異的１ｇＧが、ｐＨ２，８の溶出により単離された（これは、硫酸アンモニ ウム沈澱後の総蛋白質の２．０−５．０％である）。単離された特異的ＸｇＧの 総量は、硫酸アンモニウム沈澱後の総蛋白質量の４．５％から８．０％を占める 。抗キチンデアセチラーゼ抗体に対するキチンデアセチラーゼー結合セファロー ス４Ｂの結合容量は、ゲルの１ｍｌ当たり１゜４ｍｇのＩｇＧであることが測定 された。

実施例３：キチンデアセチラーゼを精製する第二の方法実施例１に記述したと同 様に調製した凍結菌糸（２ｇ）を解凍し、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、０．１ｍ−Ｍ のＮＥＭおよび１５０ｍＭのＮａＣ］を含む０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ ｐＨ７，４）の１０ｍ１中において、即席に作ったガラスピーズ摩砕機を用い、 摩砕し、ホモジナイズした（湿菌糸１ｇ当たり２ｇのガラスピーズを使用）。全 てのステップは４℃で行った。こうしてホモジネートを得た。これを１０．００ Ｏｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。この上清（１２，２ｍ１　：　４．６ ｍｇ／ｍｌ　；　５６．Ｏｍｇ）を粗抽出液と呼ぶ。

この抽出液を、次いで５０°Ｃに設定された水浴中で１５分間インキュベートし 、そして水中で急速に冷却した。沈澱した蛋白質を３５．００Ｏｒｐｍ、４℃で ４５分間遠心分離して除去した。

実施例２で述べた純粋なより低親和性のラビット［ｇＧの５ｍｇをカップリング 緩衝液（ｐＨ８，３）に対して透析し、そして膨潤したＣＮＢｒ−活性化セファ ロース４Ｂの５ｍｌと混合して免疫吸着剤を調製した。このＩｇＧは、キチンデ アセチラーゼのカップリングで述べた方法によりカップルさせた。活性化セフ了 ロース４ＢへのｔｇＧのカップリング・は８５％の効率であり、ゲル１ｍｌに対 し１ｍｇの［ｇＧが結合したＩｇＧ−結合セファロースが得られた。この免疫吸 着剤はキチンデアセチラーゼの精製に用いられた。

上述の上清（１１゜５ｍｌ　：　０．５４ｍｇ／ｍｌ　：　６．２ｍｇ）を、１ ５０ｍＭのＮａＣ１（緩衝液Ａ）を含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７ ，４）中で予め平衡化しておいた免疫吸着剤（２×１．６ｃｍの寸法のカラム中 に充填されたちの；５ｍ１）の上に載せた。このカラムを溶出液中に２８０ｎｍ の吸収が認められなくなるまで緩衝液Ａで洗浄した（非特異的に結合した蛋白質 は２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７，４、ＩＭＮａＣｌで溶出された）。特異的に 結合したキチンデアセチラーゼは、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２， ８）を用い、３５ｍ１／ｈの流速で溶出された。

溶出液は、ただちにＩＭ）−リス−ＨＣ１ｐＨ９，０でｐＨ７゜０に調整し、緩 衝液Ａに対し透析し、そして限外濾過で濃縮した（３００μｌ　；４０μｇ／ｍ ｌ　；　１２μｇ：　１８０ｍＵ）。

免疫吸着によるキチンデアセチラーゼの精製（表４）により脱着された酵素につ いて１５００ｍ単位／ｍｇの比活性が得られ、収率は約３０％であった。５ＤＳ −ＰＡＧＥによるキチンデアセチラーゼの純度の評価において、単一バンドが示 された。従来法による（表１）キチンデアセチラーゼの精製により、３．２３単 位／ｍｇの比活性を持つ純粋酵素が得られ、その収率は１１．８％であった。免 疫吸着剤の最大結合容量は、ゲルの１ｍｌ当たり４２μｇのキチンデアセチラー ゼであると測定された（共有結合によりマトリックスへ固定化した後、抗原結合 部位の４％が、抗原を結合するために利用可能な状態で残存している）。

表　４ 免疫吸着によるキチンデアセチラーゼの精製当業者であれば、単に常識的実験手 法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様に対する多くの均等物を知りまた確 認し得るであろう。これらのおよび他の全ての均等物は下記のクレームの範嗜に 含まれるものである。

Ｇ＋）　（Ｆ／琲粛）鴇要峯− ←ｅ−）　（Ｐ／鵡宜）萼雲峯姻 ←）夏η吟不躊：博ｔｔｏ８ｚ ←←）　（Ｆ／琲宜）′＠要峯掴 Ｏａ）　ｃｏｌ＜’ＪＯ ｙ　ＯＯロ　ロ　ロ （−’）　夏＄１９−１：１４二ｔｔＬｔｔｔ　Ｏ８ｇ図４ 温度　（”Ｃ） 図５ Ｈ 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　１９／２６ 　７４３２−４Ｂ／／　Ａ６１Ｋ　３１／７３　ＡＤＡ　９４５４−４Ｃ３９／ ３９５　Ｄ　９２８４−４Ｃ （Ｃ１２Ｎ　９／８０ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ 、ＳＥ ＦＩ （７２）発明者　ヴ−ルナキス、ジョン　ジェイ。

アメリカ合衆国　ニュー　ハンプシャー０３７５５　ハノバー、キャリッジ　レ イン（７２）発明者　マルティノウ、アゲリキギリシャ共和国　ヘラクリオン　 ジ−アール−７１４０９オルフェオス　あ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的に純粋なキチンデアセチラーゼ調製物。 ２．キチンデアセチラーゼが約７５−８０キロダルトンの分子量を有する請求項 １記載の本質的に純粋なキチンデアセチラーゼ調製物。 ３．キチンデアセチラーゼが約３．０のｐＩを示す請求項２記載の本質的に純粋 なキチンデアセチラーゼ調製物。 ４．ａ）かび培養物から菌糸抽出物を得て、ｂ）この抽出物に硫酸アンモニウム を約２．１Ｍの濃度になるまで加え、 ｃ）液相から不溶物質を除去し、 ｄ）ステップｃ）の液相を、疎水的カラムに通し、ｅ）疎水的カラムから結合し た物質を溶出し、ｆ）ステップｅ）で溶出した物質のｐＨを、ｐＨが約８の溶液 を得るように調整し、 ｇ）ステップｆ）で得た溶液を強アニオン交換体カラムに通し、 ｈ）強アニオン交換体カラムからの画分を集め、キチンデアセチラーゼ活性を持 つ画分をプールし、ｉ）ステップｈ）でプールした画分のｐＨを約３．５に調整 し、 ｊ）ステップｉ）で得た溶液を強カチオン交換体カラムに通し、その通過液を得 る ことによって調製された本質的に純粋なキチンデアセチラーゼ調製物。 ａ）キチンデアセチラーゼを産生する生物から細胞抽出物を得て、 ｂ）この細胞抽出物に硫酸アンモニウムを約２．１Ｍの濃度になるまで加え、 ｃ）液相から不溶物質を除去し、 ｄ）ステップｃ）の液相を、疎水的カラムに通し、ｅ）疎水的カラムから、結合 した物質を溶出し、ｆ）ステップｅ）で溶出した物質のｐＨを、ｐＨが約８の溶 液を得るように調整し、 ｇ）ステップｆ）で得た溶液を強アニオン交換体カラムに通し、 ｈ）強アニオン交換体カラムからの画分を集め、キチンデアセチラーゼ活性を持 つ画分をプールし、ｉ）ステップｈ）でプールした画分のｐＨを約３．５に調整 し、 ｊ）ステップｉ）で得た溶液を強カチオン交換体カラムに通し、その通過液を得 る ことから成る、本質的に純粋なキチンデアセチラーゼを該酵素を生産するかびか ら単離する方法。 ６．生物がＭｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉである請求項５記載の方法。 ７．ａ）かび培養物から菌糸を得て、 ｂ）抽出緩衝液中において菌糸を破壊し、ｃ）液相から不溶物質を除去し、 ｄ）ステップｃ）で得た液相を約５０℃の温度で約３０分間インキュベートし、 ｅ）液相から不溶物質を除去し、 ｆ）ステップｅ）で得た液相に硫酸アンモニウムを約２．１Ｍの濃度になるまで 加え、 ｇ）液相から不溶物質を除去し、 ｈ）ステップｇ）の液相を、疎水的カラムに通し、ｉ）疎水的カラムから、結合 した物質を溶出し、ｊ）ステップｊ）で溶出した物質のｐＨを、ｐＨが約８の溶 液を得るように調整し、 ｋ）ステップｊ）で得た溶液を強アニオン交換体カラムに通し、 ｌ）強アニオン交換体カラムからの画分を集め、キチンデアセチラーゼ活性を持 つ画分をプールし、ｍ）ステップｌ）でプールした画分のｐＨを約３．５に調整 し、 ｎ）ステップｍ）で得た溶液を強カチオン交換体カラムに通し、その通過液を得 る ことから成る、本質的に純粋なキチンデアセチラーゼを該酵素を生産するかびか ら単離する方法。 ８．かびがＭｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉである請求項７記載の方法。 ９．キチンデアセチラーゼに特異的な反応性を持つ抗血清。 １０．キチンデアセチラーゼに特異的な反応性を持つ精製免疫グロブリン。 １１．免疫グロブリンがインタイプＩｇＧである請求項１０記載の精製免疫グロ ブリン。 １２．ａ）キチンデアセチラーゼに特異的な反応性を持つ、固体支持体に結合し た免疫グロブリンから成る免疫吸着剤を得て、 ｂ）キチンデアセチラーゼが免疫吸着剤に特異的に結合するのに適した条件下で 、キチンデアセチラーゼを産生する生物の粗細胞抽出物を免疫吸着剤と接触させ 、 ｃ）免疫吸着剤を洗浄して非特異的に結合した物質を除去し、 ｄ）免疫吸着剤から、精製したキチンデアセチラーゼを溶出する ことから成るキチンデアセチラーゼの精製方法。 １３．ａ）かび培養物から菌糸を得て、ｂ）菌糸を破壊、可溶化し、 ｃ）液相から不溶物質を除去し、 ｄ）望ましくない蛋白を沈澱させる温度サイクリング工程を実施し、 ｅ）ステップｄ）で得た不溶性蛋白を除去し、ｆ）ステップｅ）の水相を、キチ ンデアセチラーゼと特異的に反応する、固体支持体に結合した免疫グロブリンか ら成る免疫吸着剤と、キチンデアセチラーゼと免疫吸着剤の特異的結合に適した 条件下で接触させ、ｇ）免疫吸着剤を洗浄して非特異的に結合した物質を除去し 、 ｈ）精製されたキチンデアセチラーゼを免疫吸着剤から溶出する ことから成る、該酵素を産生するかびからキチンデアセチラーゼを精製する方法 。 １４．かびがＭｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉである請求項１３記載の方法。 １５．キチンの酵素的デアセチル化に適した条件下で、キチンを本質的に純粋な キチンデアセチラーゼ調製物に接触させることから成るキトサンの製造方法。 １６．キチンの酵素的デアセチル化に適した条件下で、キチンを本質的に純粋な キチンデアセチラーゼ調製物に接触させることにより製造されたキトサン。