CN103980344A - 一种分离纯化含几丁质结合结构域的融合蛋白的方法 - Google Patents

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张怡
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Abstract

本发明将一种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白。其原理是通过NaOH碱液加热处理，使几丁质发生脱乙酰作用，此后再通过乙酸处理使其乙酰化，从而得到部分脱乙酰化的几丁质衍生物，将这种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域的融合蛋白，可以很好地改善其对含有几丁质结合域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白的特异性吸附效果。

Description

一种分离纯化含几丁质结合结构域的融合蛋白的方法
技术领域
本发明属于基因工程产品下游分离纯化领域，涉及将部分脱乙酰的几丁质衍生物应用于特异性吸附分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白。
背景技术
当采用基因工程技术表达一些外源性多肽或小分子蛋白时，表达产物往往会由于被宿主细胞内的蛋白酶降解而造成表达量大大降低。为了有效解决这一问题，目前普遍采用融合表达技术。所谓融合表达就是通过基因重组技术将外源小分子蛋白(多肽)拼接于融合伴侣(标签)下游进行表达，然后通过酶切或化学切割释放出目的小分子蛋白(多肽)的技术。在进行基因拼接融合时应保持目的小分子蛋白(多肽)编码基因与融合伴侣(标签)编码基因阅读框架一致。此外，在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间需要设计1个或1个以上的蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子(intein)，这样就可以在融合蛋白表达出来之后通过酶切或化学切割或诱导自切割等手段释放出目的小分子蛋白(多肽)。
采用融合伴侣(标签)进行融合表达的优点在于：(1)对分子量较小的外源目的小分子蛋白(多肽)进行融合表达可增强表达产物的稳定性，减少或避免宿主细胞蛋白酶对表达产物的降解；(2)某些融合伴侣(标签)可以增强目的蛋白或多肽的可溶性；(3)方便目的蛋白的分离纯化。
目前普遍使用在低等生物或细菌中，以可溶性状态高表达的蛋白作为融合伴侣(标签)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表达量、可溶性及稳定性，采用的融合伴侣(标签)有曼氏血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST，28kDa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP，40kDa)、蛋白二硫化物异构酶(NusA，55kDa)、大肠杆菌二硫键异构酶(Dsb A，21kDa)等。
除了上述融合伴侣以外，环状芽孢杆菌几丁质结合结构域(Chitin BindingDomain，CBD，5kDa)也是一种较为理想的分子融合伴侣，与之进行融合表达的产物便可以通过与几丁质的特异性吸附进行分离纯化。
然而，天然几丁质是一种由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的直链多聚体，性质比较稳定，不溶于水、稀碱、稀酸以及大部分有机溶剂，直接应用于含几丁质结合域融合蛋白的分离纯化其吸附效果往往不够理想。
由于天然几丁质结构中含有大量的-OH和-NH2基团，可以对其进行化学修饰制备各种衍生物，以改善其理化性质。为此，本发明通过将几丁质进行脱乙酰化作用以及乙酰化作用对其活化后，将之应用于含几丁质结合结构域的融合蛋白的吸附分离纯化，大大改善了其对含有几丁质结合结构域的融合蛋白的吸附效果。
发明内容
本发明将一种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白。其原理是通过NaOH碱液加热处理，使几丁质发生脱乙酰作用，此后再通过乙酸处理使其乙酰化，从而得到部分脱乙酰化的几丁质衍生物，将这种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域的融合蛋白，可以很好地改善了其对含有几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白的特异性吸附效果。
附图说明
图1、本发明构建的pTWIN1-1un融合表达质粒图谱。CBD：几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)基因；intein splicing site为Ssp DnaB蛋白内含子自切割位点；LUN为lunasin编码基因
图2、CBD-Ssp DnaB intein-lunasin融合蛋白的基因编码序列。CBD：几丁质结合结构域基因序列；Ssp DnaB intein：可自切割的蛋白内含子基因序列；lunasin：lunasin编码基因
图3、融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin在培养基中表达的15％SDS-PAGE电泳图。泳道M：分子量标准蛋白质(kDa)，分子量分别为116.0,66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4(自上而下)；泳道1：未经乳糖诱导的发酵液菌体破菌上清；泳道2：经0.2％(w／v)乳糖诱导表达的发酵液菌体破菌上清
图4、融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin的Western Blot鉴定分析图谱。一抗为兔抗lunasin抗体，二抗为羊抗兔抗体。泳道1：大肠杆菌宿主菌E.coliBL21(DE3)发酵液菌体破菌上清(对照组)；泳道2：工程菌pTWIN1-1un／E.coliBL21(DE3)经0.2％(w／v)乳糖诱导表达的发酵液菌体破菌上清
图5、本发明制备的部分脱乙酰化的几丁质衍生物层析柱纯化产物的Tricine／SDS-PAGE电泳图。泳道M：分子量标准蛋白质(kDa)，分子量分别为100,30,25,20,15,10,5,3.4(自上而下)；泳道1-4：部分脱乙酰化的几丁质衍生物层析柱纯化产物
图6、本发明制备的部分脱乙酰化的几丁质衍生物柱层析及RP-HPLC纯化后的lunasin质谱鉴定图
具体实施方式
实施例1部分脱乙酰化的几丁质衍生物柱材的制备
取30g几丁质(阿拉丁试剂(上海)有限公司)于1000mL烧杯中，加200mL双蒸水浸泡过夜；倾倒掉双蒸水，加入500mL2mol／L HCl浸泡2h，抽滤，之后水洗至中性；再加500mL l mol／L NaOH浸泡，并将烧杯至于100℃水浴锅中水煮1h，抽滤，再水洗至中性；再加500mL0.01mol／LNaOH浸泡，将烧杯至于50℃水浴锅中水煮1h，抽滤，水洗至中性；再加500mL0.01mol／LCH3COOH，将烧杯至于50℃水浴锅中水煮0.5h，抽滤，水洗至中性。最后将经过处理的几丁质置于真空干燥器中进行真空干燥处理，真空干燥器温度不宜超过80℃，完全干燥之后将几丁质置于研钵中进行研磨，常温真空干燥保存，备用。
实施例2含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白的设计与克隆
根据lunasin多肽的氨基酸序列，采用OPTIMIZER(http：／／genomes.urv.es／OPTIMIZER)和Gene Designer(http：／／www.DNA20.com)软件以及大肠杆菌偏爱的密码子设计了lunasin多肽的基因编码序列，并在其两侧添加了Sap I和Pst I酶切位点。通过重叠延伸PCR方法得到了两侧含Sap I和Pst I酶切位点的lunasin多肽编码基因序列，并TA-克隆到pMDTM19-T SimpleVector(TaKaRa Biotech(大连)公司产品)中，Sap I和Pst I双酶切后，再亚克隆到pTWIN1载体(New England Biolabs公司产品)中，得到重组质粒pTWIN1-1un(图1)，其中融合表达基因依次包括几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)基因、Ssp DnaB蛋白内含子基因以及lunasin编码基因(图2)。该融合表达质粒转化大肠杆菌宿主E.coli BL21(DE3)菌感受态细胞得到pTWIN1-1un／E.coli BL21(DE3)基因工程菌。
实施例3大肠杆菌摇瓶表达CBD-Ssp DnaB intein-lunasin蛋白及产物鉴定
挑取阳性克隆pTWIN1-1un／E.coli BL21(DE3)单菌落至50ml LBA(LB培养基中加入25μl20％(w／v)Amp)液体种子培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h之后，种子培养基以1％(v／v)接种量接种于200ml表达培养基中(含80μl微量元素培养基，100μl20％(w／v)Amp)(1L表达培养基中含甘油25g；酵母粉15g；蛋白胨15g；(NH4)3PO4·3H2O4g；KH2PO48g；K2HPO4·3H2O7g；MgSO4·7H2O1g；1L微量元素培养基中含HCl5ml；CaCl2·2H2O9g；CoCl2·6H2O6g；CuCl2·2H2O2.125g；FeCl3·6H2O135g；H3BO30.75g；MnCl2·4H2O5g；Na2MoO4·2H2O12g；ZnO5g)，37℃，220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6-0.7，此时加入2ml20％(w／v)乳糖至终浓度为0.2％(w／v)，继续37℃，220rpm进行诱导表达3h。CBD-Ssp DnaB intein-lunasin蛋白表达情况如图3所示。同时，采用兔抗lunasin多克隆抗体作为一抗，对摇瓶表达产物作Western Blot分析检测，结果显示表达的蛋白能与兔抗lunasin多克隆抗体发生特异性反应(图4)，说明该蛋白条带为CBD-Ssp DnaB intein-lunasin融合蛋白。
实施例4融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin在7L发酵罐中诱导表达
从高产菌株的平板上挑取单菌落接种至50ml LBA液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，此为一级种子液；取2ml一级种子液转接至200ml LBA液体培养基中，37℃，220rpm培养10h，此为二级种子液。将培养好的200ml二级种子液，按4％转接量转接至7L发酵罐(瑞士比欧生物工程公司)中，其中含5L已灭菌的发酵培养基，1L发酵培养基中含甘油25g；酵母粉15g；蛋白胨15g；(NH4)3PO4·3H2O4g；KH2PO48g；K2HPO4·3H2O7g；MgSO4·7H2O1g；NaOH调节pH至7.8。此外，当发酵培养基灭菌后需向5L发酵培养基添加微量元素培养基2ml(1L微量元素培养基含HCl5m1；CaCl2·2H2O9g；CoCl2·6H2O6g；CuCl2·2H2O2.125g；FeCl3·6H2O13.5g；H3BO30.75g；MnCl2·4H2O5g；Na2MoO4·2H2O12g；ZnO5g)，8mL20％(w／v)Amp(Kim M，Elvin C，Brownlee A，et a1.2007，52(1)：230-236.)。
当OD600nm达到3时，向发酵罐中添加50ml20％(w／v)乳糖至终浓度为0.2％(w／v)，以诱导目的蛋白表达。同时开始流加碳源(50％(w／v)甘油，0.1％(w／v)MgSO4·7H2O，10％(w／v)乳糖)，通过流加碳源以及调整搅拌速度和通气量，使溶氧水平维持在40％-60％，此过程约消耗碳源160ml。通过25％(w／w)NH4OH将pH控制在7.5-8.0。整个发酵过程持续约7.5h。在乳糖诱导表达2，3，3.5，4.5h时，取50ml发酵液离心(5000rpm，4℃，10min)，测量细胞湿重、OD600 nm等数据绘制生长曲线，15％SDS-PAGE分析发酵过程中蛋白的表达情况。
实施例5融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin的亲和层析、柱上自切割及目的多肽Lunasin的释放
融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin粗提物的制备：将实施例4发酵液经5000rpm，4℃离心10分钟，收集菌体，称量菌体重量，1g菌体加入10ml破菌缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,l mM EDTA2Na·2H2O,0.1％(v／v)TritonX-100，pH8.5)，将菌体完全溶解，采用JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)200watts破菌10min(10s超声破碎，10s间停，30个循环)，破菌完成后，13000rpm，4℃离心30min，收集破菌上清，然后用0.22μm的超滤膜过滤除去细胞碎片。
几丁质衍生物亲和层析及柱上自切割：将实施例1制备的几丁质衍生物装柱(55mm×90mm)，用10倍柱体积的平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，1mM EDTA2Na·2H2O，pH8.5)平衡后，在4℃条件下，将除去细胞碎片的破菌上清以0.5ml／min的流速常压上样；上样完成后静置吸附12h左右，在4℃，用10倍柱体积的平衡缓冲液4ml／min洗杂蛋白，再用3倍柱体积的pH调节缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl,1mM EDTA2Na·2H2O,pH6.5)调节柱内pH为6.5，之后将几丁质衍生物柱于16℃静置40h，诱导融合蛋白发生自剪切，最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl,1mMEDTA2Na·2H2O，pH6.5)进行洗脱，流速为1ml／min，分部收集，Tricine／SDS-PAGE分析后，合并含目的多肽lunasin的收集液。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化：为了制得纯度大于95％的lunasin样品，可将经过几丁质衍生物亲和层析收集的含目的多肽lunasin的样品经过RP-HPLC进一步纯化。采用Bio-Rad公司DuoFlow制备型高效液相色谱系统，色谱柱为Kromasil C18(10×250mm)色谱柱，流动相A相为含0.1％TFA的H2O，B相为含0.1％TFA的CH3CN。洗脱梯度：15％-65％B相，60min；65％-100％B相，5min；流速为1ml／min。在39％-41％B相浓度时，出现lunasin目的蛋白峰，收集并进行Tricine／SDS-PAGE分析。
实施例6目的产物质谱分析及生物活性检测
经部分脱乙酰化的几丁质衍生物亲和层析及制备型RP-HPLC反相色谱分离纯化制得的纯度大于95％的lunasin样品进行质谱分析(中科院上海蛋白质组研究中心上海中科新生命生物技术有限公司完成)，结果显示测试值与计算机预测的理论分子量完全一致(图6)。
采用MTT法(Hwang H，Biswas R，Chung P S，et a1.Journal of Photochemistryand Photobiology B：Biology,2013，128：70-77.)对制得的纯度大于95％的lunasin样品进行活性分析，结果显示制备的lunasin对人结肠癌细胞HCT-116及人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有细胞抑制作用，其50％抑制作用(IC50)的浓度分别为64.25μM和56.73μM，且呈剂量依赖性。对正常人晶状体上皮细胞SRA01／04没有毒性作用。

Claims (1)

1.一种将部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(ChitinBinding Domain，CBD)的融合蛋白的方法。
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