CN110387380A - 一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法 - Google Patents

一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基因重组蛋白Tat‑hMsrA的生产方法，其包括如下步骤：构建含融合蛋白Trx‑Tat‑hMsrA的重组质粒；将重组质粒电转化至宿主枯草芽孢杆菌中，进行菌株培养，获取阳性表达菌；将阳性表达菌进行诱导培养，获得含Tat‑hMsrA的表达产物液，酶切，复性，纯化，即得。该基因重组蛋白Tat‑hMsrA的生产方法可获得活性较高的Tat‑hMsrA。

Description

一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法。
背景技术
蛋氨酸亚砜还原酶A是继超氧化物歧化酶之后的另一种引起广泛关注的抗氧化酶。与超氧化物歧化酶相比，蛋氨酸亚砜还原酶A不仅有在细胞内发挥清除氧化因素的作用，还可以对受损蛋白质进行有效修复。
蛋氨酸亚砜还原酶A(MrsA)是一种很强的抗氧化酶。细胞穿透肽Tat安全无毒，可穿透细胞、血脑屏障，两者结合获得的人源性重组蛋白Tat-hMrsA可有望用于化妆品、保健品和药品中。
论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中指出：使用基因工程的方法构建pet32a-Tat-hMsrA质粒，并从BL21(DE3)、gammi、rosseta、gold筛选最合适的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，然后进行蛋白的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，发现目标蛋白主要在包涵体表达，需要进行目标蛋白的变形和复性。但是从包涵体得到纯化目标蛋白，检测后无活性。
发明内容
基于此，有必要提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，可获得活性表达的Tat-hMsrA。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，包括如下步骤：
构建含信号肽SacB基因、融合蛋白Trx-Tat-hMsrA以及酶切位点EcoR I和BamH I的目的基因；
将所述目的基因和穿梭载体pGJ148分别用EcoR I和BamH I双酶切，胶回收后，经T4连接酶作用，获得连接产物，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；
将所述重组质粒电转化至宿主枯草芽孢杆菌中，进行菌株培养，获取阳性表达菌；
将所述阳性表达菌进行诱导培养，获得含Tat-hMsrA的表达产物液；
将所述含Tat-hMsrA表达产物液进行酶切，得酶切产物液；
将所述酶切产物液进行复性，得复性混合物；
将所述复性混合物纯化，即得。
优选地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。
在其中一个实施例中，所述菌株培养的条件为：含终浓度15-20μg/mL的新霉素、终浓度3-7μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养8-14h。
在其中一个实施例中，所述诱导培养的条件为：含1-15％麦芽糖的LB培养基，培养1-2天。
在其中一个实施例中，所述酶切的步骤为：将所述含Tat-hMsrA的表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切。
在其中一个实施例中，所述复性所采用的复性溶液为含0.7-1.0mg/mL溶菌酶、1.0-2.0mg/L谷氨酰胺和0.1-0.5mol/L氯化锌的磷酸缓冲液。
在其中一个实施例中，所述纯化包括如下步骤：将所述复性混合物经柱层析洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
在其中一个实施例中，采用离子交换层析进行洗脱。
优选地，所述离子交换柱层析采用0、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰。
上述任一项所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法制备获得的Tat-hMsrA。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法可获得有活性的Tat-hMsrA。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
Tat-hMsrA的基因序列为：
GGCTATGGCCGGAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGCTTAGAAGGCAACTCGGCCTCGAACATCGTCAGCCCCCAGGAGGCCTTGCCGGGCCGGAAGGAACAGACCCCTGTAGCGGCCAAACATCATGTCAATGGCAACAGAACAGTCGAACCTTTCCCAGAGGGAACACAGATGGCTGTATTTGGAATGGGATGTTTCTGGGGAGCTGAAAGGAAATTCTGGGTCTTGAAAGGAGTGTATTCAACTCAAGTTGGTTTTGCAGGAGGCTATACTTCAAATCCTACTTATAAAGAAGTCTGCTCAGAAAAAACTGGCCATGCAGAAGTCGTCCGAGTGGTGTACCAGCCAGAACACATGAGTTTTGAGGAACTGCTCAAGGTCTTCTGGGAGAATCACGACCCGACCCAAGGTATGCGCCAGGGGAACGACCATGGCACTCAGTACCGCTCGGCCATCTACCCGACCTCTGCCAAGCAAATGGAGGCAGCCCTGAGCTCCAAAGAGAACTACCAAAAGGTTCTTTCAGAGCACGGCTTCGGCCCCATCACTACCGACATCCGGGAGGGACAGACTTTCTACTATGCGGAAGACTACCACCAGCAGTACCTGAGCAAGAACCCCAATGGCTACTGCGGCCTTGGGGGCACCGGCGTGTCCTGCCCAGTGGGTATTAAAAAA。
实施例1
本实施例提供一种获取含Tat-hMsrA目的基因的阳性枯草芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：
S1，构建含信号肽SacB基因、融合蛋白Trx-Tat-hMsrA以及酶切位点EcoR I和BamHI的目的基因。
S2，将目的基因和穿梭载体pGJ148分别用EcoR I和BamH I双酶切，胶回收后，经T4连接酶作用，获得连接产物，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，提取重组质粒。
S3，将重组质粒电转化至宿主枯草芽孢杆菌中，进行菌株培养，获取阳性表达菌。
实施例2
本实施例提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，包括如下步骤：
S1，对实施例1获取的阳性枯草芽孢杆菌表达菌进行培养，培养条件为：含终浓度15μg/mL的新霉素、终浓度7μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养12h。
S2，将经步骤S1培养后的阳性枯草芽孢杆菌表达菌置于含10％麦芽糖的LB培养基中进行诱导培养，培养2天，获得含Tat-hMsrA的表达产物液。
S3，将步骤S2获得含Tat-hMsrA表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切，得酶切产物液。
S4，向步骤S3获得的酶切产物液加入含0.7mg/mL溶菌酶、2.0mg/L谷氨酰胺和0.1mol/L氯化锌的磷酸缓冲液，进行复性，得复性混合物。
S5，将步骤S4获得的复性混合物进行离子交换层析，以0、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
实施例3
本实施例提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，包括如下步骤：
S1，实施例1获取的阳性枯草芽孢杆菌表达菌进行培养，培养条件为：含终浓度20μg/mL的新霉素、终浓度3μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养12h。
S2，将经步骤S1培养后的阳性枯草芽孢杆菌表达菌置于含10％麦芽糖的LB培养基中进行诱导培养，培养2天，获得含Tat-hMsrA的表达产物液。
S3，将步骤S2获得含Tat-hMsrA表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切，得酶切产物液。
S4，向步骤S3获得的酶切产物液加入含1.0mg/mL溶菌酶、1.0mg/L谷氨酰胺和0.5mol/L氯化锌的磷酸缓冲液，进行复性，得复性混合物。
S5，将步骤S4获得的复性混合物进行离子交换层析，以0、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
实施例4
本实施例提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，包括如下步骤：
S1，实施例1获取的阳性枯草芽孢杆菌表达菌进行培养，培养条件为：含终浓度18μg/mL的新霉素、终浓度5μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养12h。
S2，将经步骤S1培养后的阳性枯草芽孢杆菌表达菌置于含10％麦芽糖的LB培养基中进行诱导培养，培养2天，获得含Tat-hMsrA的表达产物液。
S3，将步骤S2获得含Tat-hMsrA表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切，得酶切产物液。
S4，向步骤S3获得的酶切产物液加入含0.85mg/mL溶菌酶、1.5mg/L谷氨酰胺和0.3mol/L氯化锌的磷酸缓冲液，进行复性，得复性混合物。
S5，将步骤S4获得的复性混合物进行离子交换层析，以0、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，纯化，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
实施例5
本实施例提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，包括如下步骤：
S1，实施例1获取的阳性枯草芽孢杆菌表达菌进行培养，培养条件为：含终浓度18μg/mL的新霉素、终浓度5μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养12h。
S2，将经步骤S1培养后的阳性枯草芽孢杆菌表达菌置于含10％麦芽糖的LB培养基中进行诱导培养，培养2天，获得含Tat-hMsrA的表达产物液。
S3，将步骤S2获得含Tat-hMsrA表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切，得酶切产物液。
S4，向步骤S3获得的酶切产物液加入含0.85mg/mL溶菌酶、1.5mg/L谷氨酰胺和0.3mol/L氯化锌的磷酸缓冲液，进行复性，得复性混合物。
S5，将步骤S4获得的复性混合物依次进行凝胶排阻色谱和交联葡聚糖凝胶柱G50(以0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L的氯化钠溶液)洗脱，纯化，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
对比例1
本对比例提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，包括如下步骤：
S1，实施例1获取的阳性枯草芽孢杆菌表达菌进行培养，培养条件为：含终浓度18μg/mL的新霉素、终浓度5μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养12h。
S2，将经步骤S1培养后的阳性枯草芽孢杆菌表达菌置于含10％麦芽糖的LB培养基中进行诱导培养，培养2天，获得含Tat-hMsrA的表达产物液。
S3，将步骤S2获得含Tat-hMsrA表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切，得酶切产物液。
S4，将步骤S3获得的复性混合物进行交联葡聚糖凝胶柱G50，以0、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，纯化，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
分别对实施例2至5以及对比例1制备获得的目标蛋白Tat-hMsrA进行产量和活性测试，蛋白活性测定采用CN102094068A的专利所述的方法，统计结果见下表1：
表1实施例2至5以及对比例1的蛋白活性汇总表
试验例 产量 蛋白活性(U/g)
实施例2 28mg/每升诱导培养基 1100
实施例3 20mg/每升诱导培养基 1000
实施例4 33mg/每升诱导培养基 1800
实施例5 31mg/每升诱导培养基 1500
对比例1 15mg/每升诱导培养基 200
由表1可以明显看出，与对比例1相比，采用实施例2至5的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法可整体获得活性较高的重组基因蛋白Tat-hMsrA，纯度可达90％(电泳纯度)以上，可实现量产。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建含信号肽SacB基因、融合蛋白Trx-Tat-hMsrA以及酶切位点EcoR I和BamH I的目的基因；
将所述目的基因和穿梭载体pGJ148分别用EcoR I和BamH I双酶切，胶回收后，经T4连接酶作用，获得连接产物，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；
将所述重组质粒电转化至宿主枯草芽孢杆菌中，进行菌株培养，获取阳性表达菌；
将所述阳性表达菌进行诱导培养，获得含Tat-hMsrA的表达产物液；
将所述含Tat-hMsrA表达产物液进行酶切，得酶切产物液；
将所述酶切产物液进行复性，得复性混合物；
将所述复性混合物纯化，即得。
2.根据权利要求1所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。
3.根据权利要求1或2所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述菌株培养的条件为：含终浓度15-20μg/mL的新霉素、终浓度3-7μg/mL的氯霉素的LB培养基，37℃，培养8-14h。
4.根据权利要求1或2所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述诱导培养的条件为：含1-15％麦芽糖的LB培养基，培养1-2天。
5.根据权利要求4所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述酶切的步骤为：将所述含Tat-hMsrA的表达产物液离心，弃去沉淀菌体，向上清液中加入肠激酶酶切缓冲液进行酶切。
6.根据权利要求5所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述复性所采用的复性溶液为含0.7-1.0mg/mL溶菌酶、1.0-2.0mg/L谷氨酰胺和0.1-0.5mol/L氯化锌的磷酸缓冲液。
7.根据权利要求6所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述纯化包括如下步骤：将所述复性混合物经柱层析洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA。
8.根据权利要求7所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，采用离子交换层析进行洗脱。
9.根据权利要求8所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法，其特征在于，所述离子交换柱层析采用0、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰。
10.权利要求1至9任一项所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法制备获得的Tat-hMsrA。
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