JP2018504121A

JP2018504121A - 汚染物質たる宿主細胞タンパク質を含む材料からの組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡの精製方法

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Publication number: JP2018504121A
Application number: JP2017538733A
Authority: JP
Inventors: 福井　剛; 剛福井; 敦子川崎; 勇吉秦野; 八重伊藤; 和敏三原; 厚杉村
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2018-02-15
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: EP3247794A4; US10385325B2; US20180016564A1; KR20170099406A; KR102288264B1; JP6749042B2; EP3247794B1; WO2016116966A1; CN107208081A; CN107208081B; EP3247794A1; WO2016117341A1

Abstract

組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（rh α-GalＡ）を大きな規模で，高純度を以て製造するための方法が開示されている。当該方法は，（ａ）無血清培地中で組換えヒトα-GalＡ産生哺乳類細胞を培養し，（ｂ）培養上清を回収し，（ｃ）培養上清を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し，（ｄ）疎水性カラムクロマトグラフィーに付し，（ｅ）リン酸残基に親和性を有する材料を固相として用いたカラムクロマトグラフィーに付し，（ｆ）陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し，（ｇ）色素親和性カラムクロマトグラフィーに付し，そして（ｈ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付すステップを，この順序で含んでなる。

Description

本発明は，一般的には，宿主細胞を用いたヒトα−ガラクトシダーゼＡ（rh α-GalＡ）の製造方法，及びそれにより製造されたrh α-GalＡを，汚染物質たる宿主細胞タンパク質を含んだ材料から精製する方法に関する。より具体的には，本発明は，rh α-GalＡ産生哺乳類細胞を無血清培地中で培養することによるrh α-GalＡの製造方法に，並びにこうして製造されたrh α-GalＡを培養上清から，色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーを用いて，高収率で，且つ精製済タンパク質が医薬品として直接に使用可能である高純度にまで，精製する方法に関する。

α−ガラクトシダーゼＡ（α-GalＡ）は，糖脂質及び糖タンパク質の末端α−ガラクトシル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素である。トリヘキソシルセラミドは，３個のヘキソース部分を含んでおり，α−ガラクトシダーゼＡの基質の１つであり，当該酵素により末端ヘキソース部分で加水分解を受ける。ヒトα−ガラクトシダーゼＡは４２９個のアミノ酸を含んでなる前駆体ペプチドとして発現され，そのうちＮ−末端の３１個のアミノ酸はシグナルペプチドを構成する。この前駆体はプロセシングされて成熟ペプチドとなり，これは，シグナルペプチドの除去後に残された３９８個のアミノ酸からなり，そして一対の成熟ペプチド分子は，条件が許せばいつでも容易にホモ二量体を形成し，これがヒトα−ガラクトシダーゼＡの酵素としての活性型である。ヒトのα-GalＡは，マンノース−６−リン酸残基を含んだオリゴ糖鎖を有しており，マンノース−６−リン酸受容体を介してライソソームへと標的化させることができる。

ファブリー病はＸ連鎖性の遺伝的ライソソーム病の１つであり，α-GalＡをコードする遺伝子の異常を遺伝的に受け継ぐことによって引き起こされる。この酵素の活性欠如は種々の組織においてトリヘキソシルセラミドの蓄積を引き起こし，腎不全，血管皮膚病変，及び心室肥大や僧帽弁不全を含む心血管異常をもたらす。

１９６０年代には既に，ファブリー病患者の組織中においてα−ガラクトシダーゼＡの酵素活性が，殆ど又は僅かにしか検出されないことが報告されていた。このため，α-GalＡをコードする遺伝子の何らかの遺伝的異常がファブリー病の原因であろうと推測されていた。この推測に基づいて，ヒト血漿又は脾臓から抽出又は精製したα-GalＡを患者に注入することによる，ファブリー病のα-GalＡ補充療法が行われ，その結果，α-GalＡ補充療法によってファブリー病患者の血中のトリヘキソシルセラミドのレベルを低下させ得ることが確認された（非特許文献１〜３を参照のこと）。従って，α-GalＡ酵素補充療法は，ファブリー病に対して有望に違いないと考えられていた。しかしながら，実際のα-GalＡ補充療法の適用は，この酵素の供給欠如のため，極度に限定されていた。

１９８６年に，ヒトα-GalＡをコードする遺伝子が単離され（非特許文献４を参照のこと），更に１９８８年にはヒトα-GalＡ発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細胞を用いてrh α-GalＡを発現させ産生させるための方法が報告された（非特許文献５を参照のこと）。これらの発見は，組換え技術を利用してヒトα-GalＡを大規模に製造しファブリー病の治療のための酵素補充療法に医薬として使用することを可能にした。rh α-GalＡはまた，昆虫細胞中においても発現された（特許文献１）。

更に，疎水性カラムクロマトグラフィー，ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーの使用を含むrh α-GalＡの精製方法が幾つか報告された（特許文献２，特許文献３）。特許文献２又は特許文献３に記載された精製方法によって得られるrh α-GalＡの純度は十分に高いことが示されたが，ヒトへの使用には完全には受け入れられないものと考えられていた。その理由は，患者に注入される如何なる医薬も，汚染物，特に例えば，使用した宿主細胞由来のタンパク質のような汚染物を含まないことが要求される一方で，特許文献２及び特許文献３は，精製されたrh α-GalＡにそのような汚染物質が残っているか否かを示せていないからである。更には，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，リン酸残基に対する親和性を有する材料を固相として用いたカラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーをこの順で用いたrh α-GalＡの精製方法が報告されている（特許文献４）。しかしながら，これらの特許文献は，宿主細胞タンパク質によるrh α-GalＡの汚染について何も述べていない。

現在，活性成分としてrh α-GalＡを含有するファブリー病のための医薬品が，Replagel^TM及びFabrazyme^TM等の名で市販されている。

ＷＯ９０／０１１３５３ＷＯ９８／０１１２０６ＷＯ００／０５３７３０ＷＯ１４／０１７０８８

Mapes et al: Science 169: 987-9 (1970) Brady et al: N. Engl. J. Med. 289: 9-14 (1973) Desnick et al: Proc Natl Acad Sci USA 76: 5326-30 (1979). Bishop et al: Proc Natl Acad Sci USA 83: 4859-63 (1986) Bishop et al: Lipid Storage Disorders - Biological and Medical Aspects, NY Plenum Press P809-823 (1988)

上記背景の下で，本発明の一目的は，無血清培地中でのrh α-GalＡ産生哺乳類細胞の培養から開始して，組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（rh α-GalＡ）を製造し精製するための方法を提供することである。

本発明の別の一目的は，汚染物である宿主細胞タンパク質を含んだ培養上清から，色素親和性カラムクロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーにより，rh α-GalＡを，高収率で，且つ精製されたタンパク質を医薬として直接に用いることができるような高い純度で，精製する方法を提供することである。

本発明者らは，無血清培地中におけるrh α-GalＡ産生細胞の培養物の上清中に含まれるrh α-GalＡが，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，リン酸残基に親和性を有するカラムを用いたクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，色素親和性カラムクロマトグラフィー，及びゲル濾過クロマトグラフィーを含む精製工程に当該rh α-GalＡを付すことによって，宿主細胞タンパク質を含んだ上清から，非常に高い純度で，且つ非常に高い収率で，精製できることを見出した。本発明は，この発見に基づく更なる研究を通じて完成されたものである。

即ち本発明は，次のものを提供する。
１．組換えヒトα-ガラクトシダーゼＡの製造方法であって，
（ａ）無血清培地中で組換えヒトα-GalＡ産生哺乳類細胞を培養して組換えヒトα-GalＡを培地中に分泌させるステップ，
（ｂ）上記ステップ（ａ）で得られた培養物から細胞を除去することにより培養上清を回収するステップ，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）で回収された培養上清を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｄ）上記ステップ（ｃ）で回収された画分を，疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｅ）上記ステップ（ｄ）で回収された画分を，リン酸残基に親和性を有する材料を固相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｆ）上記ステップ（ｅ）で回収された画分を，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｇ）上記ステップ（ｆ）で回収された画分を，色素親和性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，及び
（ｈ）上記ステップ（ｇ）で回収された画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ
をこの順序で含んでなるものである，方法。
２．前記１の方法であって，該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂が弱陽イオン交換樹脂である，方法。
３．前記２の方法であって，該弱陽イオン交換樹脂が疎水性相互作用と水素結合形成との双方に基づく選択性を有するものである，方法。
４．前記２又は３の方法であって，該弱陽イオン交換樹脂が，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を有するものである，方法。
５．前記１〜４の何れかの方法であって，色素親和性クロマトグラフィーにおいて用いられる色素がブルートリアジン色素である，方法。
６．前記１〜５の何れかの方法であって，リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである，方法。
７．上記６の方法であって，リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイトである，方法。
８．前記１〜７の何れかの方法であって，該哺乳類細胞が，ＥＦ−１（α）プロモーターの制御下に組換えヒトα-GalＡを発現するように設計された発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞である，方法。
９．上記１〜８の何れかの方法により製造される組換えヒトα-GalＡ組成物。
１０．前記９の組成物を含んでなる，患者に定期的に投与される医薬。
１１．前記１０の医薬であって，注射により患者に投与されるものである医薬。

本発明は，汚染物である宿主細胞タンパク質を含んだ材料からのrh α-GalＡの精製を可能にする。こうして精製された組換えヒトα-GalＡは，ファブリー病の酵素補充療法（ＥＲＴ）において医薬として使用するのに適している。この療法においては，rh α-GalＡはファブリー病の患者に定期的に投与されなければならない。従って，もしα-GalＡ医薬が宿主細胞タンパク質を含んでいると，その医薬を用いたＥＲＴには，患者に重篤な抗原抗体反応（即ち，アナフィラキシー）を誘発するという潜在的なリスクがあり得る。そのようなリスクは，本発明により精製されるrh α-GalＡを医薬として用いることにより，最小限にすることができる。また，本発明は，細胞の無血清培養から開始してrh α-GalＡを製造することを可能にしたことから，ウイルスやプリオンのような病原因子等の如何なる血清由来の汚染物も含まないrh α-GalＡを提供する。従って，本発明により得られるrh α-GalＡは，そのよう病原因子に曝露する如何なるリスクも実質的に伴わない安全な医薬として人体に投与することができる。更には，本発明は，如何なる有機溶媒の使用も実質的に回避しつつrh α-GalＡの精製を可能にしたことから，そうでなければ使用した有機溶媒への曝露によって引き起こされ得るrh α-GalＡの変性のリスクを，本発明は取り除く。尚も更には，本発明による精製工程を行った後に残された廃液が有機溶媒を含有しないことから，本発明は，環境に好適であり，また，さもなければ排液に含まれることとなっていた有機溶媒を処理するための施設を，本発明は必要としないから，経済的意味においても好適である。

更には，本発明は，オリゴ糖鎖中にマンノース−６−リン酸残基を有するrh α-GalＡの高度に選択的な精製を可能にする。人体に投与された後にその酵素活性を発揮するためには，rh α-GalＡは関係する細胞に，その表面上に発現されているマンノース−６−受容体を介して取り込まれなければならない。従って，本発明により達成される高度に選択的な精製は，劇的に増大した有効性を有する医薬としてrh α-GalＡを提供する。

図１は，ベクターpE-neo/hGHpAを構築するための方法を図解した模式図を示す。図２−１は，ベクターpE-neo/hGHpA（α-GalＡ）を構築するための方法を図解した模式図の第１の部分を示す。図２−２は，ベクターpE-neo/hGHpA（α-GalＡ）を構築するための方法を図解した模式図の第２の部分を示す。図３は，rh α-GalＡの発現用の組換え細胞の増殖曲線及び培地中のrh α-GalＡの濃度を示す。図４は，精製された組換えrh α-GalＡのSDA-PAGE電気泳動結果を示す。レーン１では，５μｇの精製されたrh α-GalＡが適用された。図５は，精製されたrh α-GalＡのSE-HPLCチャートを示す。縦軸及び横軸は，215nmでの吸光度及び保持時間を，それぞれ示す。

本発明においては，組換えヒトα-ガラクトシダーゼＡ（rh α-GalＡ）は好ましくは，ヒトの野生型のα-GalＡの組換えタンパク質であるが，rh α-GalＡが，ヒトの野生型α-GalＡの配列と比べて，１個又は２個以上のアミノ酸の，１個又は２個所以上の置換，欠失，付加及び／又は挿入を有する変異型のタンパク質であることを排除はしない。ヒトの野生型α-GalＡのＤＮＡ配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列が，Ｎ末端シグナル配列を含んで，配列番号１３及び配列番号１４に，それぞれ示されている。このＮ末端シグナル配列は，３１個のアミノ酸からなり，翻訳後に除去される。

本発明において，「組換えヒトα-GalＡ産生哺乳類細胞」又は「rh α-GalＡ産生哺乳類細胞」の語は，ヒトのα-GalＡをコードする遺伝子を発現するように，又は強く発現するように人工的に操作された哺乳動物細胞を意味する。一般には，そのような強く発現される遺伝子は，当該遺伝子が組み込まれた発現ベクターを用いて哺乳類細胞に導入（形質転換）される遺伝子であるが，強く発現されるように人工的に改変された固有の遺伝子であってもよい。強く発現するように遺伝子を人工的に改変する手段の例としては，固有の遺伝子の上流のプロモーターを当該遺伝子の発現を強く誘導するプロモーターで置換することが挙げられるが，これに限定されない。そのような方法は数種の文献に開示されている（即ち，ＷＯ９４／１２６５０，ＷＯ９５／３１５６０）。哺乳類細胞としてどれを用いるかについて特に限定なはいが，好ましいのはヒト，マウス，又はチャイニーズハムスター由来のものであり，それらのうちでも，ＣＨＯ細胞が特に好ましく，これはチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である。

本発明において，「組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ」又は「rh α-GalＡ」の語は，上述の組換えヒトα-GalＡ産生哺乳類細胞によって培養中に培地に分泌されるヒトα-GalＡを意味する。

本発明において，「オリゴ糖鎖」の語は，α-GalＡのペプチド鎖に共有結合で結合しているオリゴ糖の鎖を意味しており，アスパラギン型の糖鎖を包含し，これはα-GalＡのアスパラギン残基に共有結合で結合している。

本発明において，rh α-GalＡ産生哺乳類細胞が培養される好ましい血清不含培地の一例として，3〜700 mg/mL のアミノ酸，0.001〜50 mg/L のビタミン類，0.3〜10 g/Lの単糖類，0.1〜10000 mg/L の無機塩類，0.001〜0.1 mg/L の微量元素，0.1〜50 mg/L のヌクレオシド類，0.001〜10 mg/L の脂肪酸，0.01〜1 mg/L のビオチン， 0.1〜20 μg/L のハイドロコーチゾン，0.1〜20 mg/L のインスリン，0.0〜10 mg/L のビタミンB₁₂, 0.01〜1 mg/Lのプトレシン，10〜500 mg/L のピルビン酸ナトリウム，及び水溶性鉄化合物を含んでなる培地が挙げられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬，及び抗生物質も加えてよい。

更に，DMEM/F12培地，即ちDMEMとF12とからなる混合培地も，基本的な無血清培地として用いてよい。これらの培地は両方とも当業者に周知である。無血清培地としては，DMEM(HG)HAM改良(R5)培地もまた使用でき，これは炭酸水素ナトリウム，L-グルタミン， D-グルコース，インスリン，亜セレン酸ナトリウム，ジアミノブタン，ハイドロコーチゾン，硫酸鉄(II)，アスパラギン，アスパラギン酸，セリン，及びポリビニルアルコールを含む。尚も更には，市販の無血清培地も基本培地として使用でき，例えば，CDoptiCHO^TM, CHO-S-SFM II 又は CD CHO (Invitrogen), IS CHO-V^TM 又は IS CHO-V-GS^TM (Irvine Scientific), EX-CELL^TM 325 PF CHO or EX-CELL^TM CD (SIGMA)等が挙げられる。

本発明において，rh α-GalＡ産生哺乳類細胞は，rh α-GalＡの産生のために培地中で少なくとも５日間，より好ましくは８〜１４日間培養される。次いでrh α-GalＡを含む培養上清が回収されrh α-GalＡの精製のための方法に供される。

汚染物である宿主細胞タンパク質を含んだ培養上清からrh α-GalＡを精製するためのクロマトグラフィー手順の各々は，必要なら，当該タンパク質の非特異的結合を防止するために非イオン性界面活性剤の存在下に行うことができる。どの非イオン性界面活性剤を用いるかにつき特段の限定はないが，ポリソルベート系界面活性剤が好ましく用いられ，より好ましくはポリソルベート80又はポリソルベート20が用いられる。そのような非イオン性界面活性剤の濃度は，好ましくは0.005% (w/v)〜0.05% (w/v)，より好ましくは約0.01% (w/v)である。

rh α-GalＡの精製のための方法は，室温でも又はより低温でも行うことができるが，好ましくはより低温，特に１〜１０℃で行うことができる。

精製方法の第１のクロマトグラフィーステップにおいて，培養上清のｐＨは，好ましくは７．０〜８．０，より好ましくは７．２〜７．８，更に好ましくは約ｐＨ７．５に調整される。この培養上清は，rh α-GalＡをカラムに結合させるために塩類を補充したリン酸緩衝液で平衡化された陰イオン交換カラムに適用される。このリン酸緩衝液のｐＨは好ましくは７．０〜８．０，より好ましくは７．２〜７．８，尚もより好ましくは約７．５である。リン酸緩衝液にどの塩類を加えるについて特段の限定はないが，塩化ナトリウム及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムが用いられる場合，その濃度は好ましくは５〜１００ｍＭの範囲，より好ましくは１０〜６０ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約５０ｍＭである。

rh α-GalＡの結合した陰イオン交換カラムを洗浄後，rh α-GalＡは，塩類濃度を高めたリン酸緩衝液を用いて溶出される。どの塩類を用いるかについて特段の制限はないが，塩化ナトリウム及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムを用いる場合，その濃度は好ましくは１２５〜５００ｍＭの範囲，より好ましくは１７５〜３５０ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約２２５ｍＭである。

更には，どの陰イオン交換樹脂を用いるかについて特段の限定はないが，市販のQ Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)等のような強陰イオン交換樹脂が好ましく使用できる。

疎水性カラムクロマトグラフィーは，精製方法の第２ステップであり，rh α-GalＡと当該樹脂に取り付けられた疎水性リガンドとの間の疎水性相互作用を利用して汚染物を除去するためのステップである。疎水性カラムクロマトグラフィーにおいてどの疎水性リガンドを用いるかについて特段の制限はないが，好ましくはフェニル基を有するリガンドであり，より好ましくはスペーサーアームを介して樹脂に取り付けられたフェニル基を含むリガンドであり，例えば，式Ｒ−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_５（ここに，Ｒは樹脂を表す）で示される。このための特に好ましいカラム材料は，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）であり，これにおいてフェニル基は，スペーサーアームを介してSepharose 6 Fast Flowマトリックスに共有結合で固定化されている。

疎水性カラムクロマトグラフィーのカラムは，塩類を補充したリン酸緩衝液で平衡化される。このリン酸緩衝液のｐＨは，好ましくは６．５〜７．５，より好ましくは約６．７〜７．３，尚もより好ましくは約７．０である。このリン酸緩衝液にどの塩類を加えるかについて特段の限定はないが，塩化ナトリウム及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムが用いられる場合，その濃度は好ましくは５００ｍＭ〜１Ｍの範囲，より好ましくは７００〜８００ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約７５０ｍＭである。リン酸緩衝液には，同時に，トリス緩衝液も，好ましくは３０〜７０ｍＭ，より好ましくは約５０ｍＭの濃度で加えることができる。

第１のステップで得られた溶出液のrh α-GalＡ含有画分が，次いで，このカラムに適用される。rh α-GalＡの結合したカラムは，洗浄後，rh α-GalＡが溶出される。溶出は，塩類を補充していないリン酸緩衝液によって行うことができ，ここでの塩類非補充のリン酸緩衝液の濃度は，好ましくは３〜１０ｍＭ，より好ましくは約５ｍＭである。リン酸緩衝液には，同時に，トリス緩衝液も，好ましくは３０〜７０ｍＭ，より好ましくは約５０ｍＭの濃度で加えてよい。代わりとして，溶出は，純水で行うこともできる。

リン酸残基に親和性を有する固相を用いたカラムクロマトグラフィーは，精製の第３ステップであり，カルボキシルペプチダーゼ等のような汚染物タンパク質を除去するためのステップである。リン酸残基に親和性を有する固相としてどれを用いるかについて特段の制限はないが，ハイドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトを好ましく用いることができ，ヒドロキシアパタイトが特に好ましい。

ハイドロキシアパタイトカラムを用いる場合，それは塩類を補充したリン酸緩衝液で平衡化される。このリン酸緩衝液のｐＨは，好ましくは６．５〜７．５，より好ましくは約６．８〜約７．２，尚もより好ましくは約７．０であり，リン酸塩の濃度は，好ましくは３．０〜２０ｍＭ，より好ましくは約３〜１５ｍＭ，更に好ましくは約１０ｍＭである。このリン酸緩衝液にどの塩類を加えるかについて制限はないが，塩化ナトリウム，及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムを用いる場合において，その濃度は，好ましくは８００ｍＭ未満であり，より好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲であり，特に好ましくは約５０ｍＭである。同時に，リン酸緩衝液には，トリス緩衝液を，好ましくは３０〜７０ｍＭ，より好ましくは約５０ｍＭの濃度で加えてもよい。

次いで，第２ステップで得られた溶出液のrh α-GalＡ含有画分が，カラムに加えられる。rh α-GalＡの結合したカラムを洗浄後，rh α-GalＡは溶出される。溶出は，塩類を含んだリン酸緩衝液によって行われる。このリン酸緩衝液のｐＨは，好ましくは６．５〜７．５，より好ましくは約６．７〜７．３，尚もより好ましくは約７．０であり，リン酸塩の濃度は，好ましくは３０〜８０ｍＭの範囲，より好ましくは４０〜６０ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約４５ｍＭである。どの塩類を用いるかについて特段の限定はないが，塩化ナトリウム及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムが用いられる場合，その濃度は，好ましくは３００ｍＭ未満，より好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約５０ｍＭである。

陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは，精製方法の第４ステップであり，汚染物タンパク質を除去するステップである。この陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいてどの陽イオン交換樹脂を用いるかについて特段の限定はないが，弱陽イオン交換樹脂が好ましく，より好ましいのは，疎水性相互作用と水素結合形成の双方に基づく選択性を有する陽イオン交換樹脂である。例えば，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を有し且つ疎水性相互作用と水素結合形成の双方に基づく選択性を有する弱陽イオン交換樹脂，例えばCapto MMC (GE Healthcare)等を用いることができる。

この陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムは，塩類を補充した酢酸緩衝液によって平衡化される。この酢酸緩衝液のｐＨは，好ましくは４．５〜６．５，より好ましくは約５．０〜６．０，尚も更に好ましくは約５．５である。この緩衝液にどの塩類を加えるかについて特段の制限はないが，塩化ナトリウム，塩化カリウム及び塩化カルシウムが好ましい。塩化ナトリウムが用いられる場合，その濃度は好ましくは５０〜２５０ｍＭの範囲，より好ましくは１００〜２００ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約１５０ｍＭである。

次いで，第３ステップで得られた溶出液のrh α-GalＡ含有画分が，カラムに適用される。rh α-GalＡの結合したカラムを洗浄後，rh α-GalＡが，高めたｐＨ，好ましくは約５．５〜７．５の範囲，より好ましくは約６．０〜７．０の範囲，尚もより好ましくは約６・５のリン酸緩衝液を用いて溶出される。

色素親和性クロマトグラフィーは，精製の第５ステップであり，諸々の汚染物，例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去するステップである。ブルートリアジン色素が好ましく用いられるが，他のトリアジン色素も使用できる。特に好ましいのは，次の概略式で示されるBlue Sepharose 6 FF, Fast Flow (GE Healthcare)であり，これは色素Cibacron^TM Blue F3GAが共有結合で取り付けられたSepharose 6 FF, Fast Flowマトリックスからなる。

色素親和性クロマトグラフィーカラムは，塩類を補充したリン酸緩衝液によって中性ｐＨ付近，好ましくはｐＨ６．８〜７．２，より好ましくは約ｐＨ７．０で平衡化される。どの塩類をリン酸緩衝液に加えるかについて特段の制限はないが，塩化ナトリウム及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムが用いられる場合，その濃度は，好ましくは，５０〜１５０ｍＭの範囲内，より好ましくは１００〜１５０ｍＭの範囲内であり，尚もより好ましくは約１２５ｍＭである。

次いで，第４ステップで得られた溶出液の画分がカラムに適用される。rh α-GalＡの結合したカラムを洗浄後，塩類濃度を高めたリン酸緩衝液を用いてrh α-GalＡが溶出される。どの塩類をリン酸緩衝液に加えるかについて特段の制限はないが，塩化ナトリウム及び塩化カリウムが好ましい。塩化ナトリウムが用いられる場合，その濃度は，好ましくは４００〜７５０ｍＭの範囲，より好ましくは４００〜５００ｍＭの範囲，尚もより好ましくは約４５０ｍＭである。トロメタモール〔トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン〕を，同時に緩衝液に，好ましくは４０〜６０ｍＭ，より好ましくは約５０ｍＭの濃度で加えることができる。

ゲル濾過カラムクロマトグラフィーは，精製方法の第６ステップであり，低分子量の汚染物，例えばエンドトキシン，並びにrh α-GalＡの多量化複合体又は分解産物を除去するためのステップである。こうして，精製方法の第１〜第６のステップによって，実質的に純粋なrh α-GalＡが得られる。

加えて，１種又は２種以上のカラムクロマトグラフィーを，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，色素親和性カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，リン酸残基に親和性を有する固相を用いたカラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，及びゲル濾過を含む上記精製方法に組み込んでもよい。そのような追加のカラムクロマトグラフィーは，好ましくは色素親和性カラムクロマトグラフィーであり，これは本発明の精製工程の隣接する２つのステップの間で用いてよい。

ウイルス不活化のためのステップを所望により本発明の精製方法に加えてもよい。ウイルス不活化のためのどのようなステップを適用するかについて特段の制限はないが，溶媒−界面活性剤法が好ましく適用できる。このためには，rh α-GalＡを含有する溶液に非イオン性界面活性剤が加えられ，次いで得られた混合物が３時間以上インキュベートされる。どの界面活性剤を用いるかについて特段の制限はないが，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０，トリトンＸ−１００，及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）を，単独で又は任意の組合せで，好ましく用いることができ，より好ましくは，ポリソルベート８０とリン酸トリ（ｎ−ブチル）との組合せを用いることができる。

ウイルス不活化のためのそのような追加のステップは，精製方法に先立って，又は上述の精製方法の任意の隣接ステップ間で，用いることができる。

更に，本発明は，汚染物である宿主細胞タンパク質を含んだ材料からのrh α-GalＡの精製方法も提供する。当該方法は，rh α-GalＡとrh α-GalＡの産生に用いた宿主細胞に固有のタンパク質とを含んだ溶液を，色素親和性カラムクロマトグラフィーに付すステップを含む。このステップの主たる目的は，汚染物質である宿主細胞のタンパク質を除去することである。このステップは，他の精製ステップ，即ち，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，リン酸残基に親和性を有する固相を用いたカラムクロマトグラフィー（即ち，ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー），及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーから選ばれるステップと，任意の順序で組み合わせることができる。好ましくは，この組合せは，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，リン酸残基に親和性を有する固相を用いたカラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，色素親和性カラムクロマトグラフィー，及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーで，この順である。

本発明の方法により製造される組換えヒトα-GalＡ組成物は，患者に定期的に投与される医薬製剤の調製のために使用するのに適している。この医薬は患者に，好ましくは静脈注射で，より好ましくは静脈内注入で投与され，そして患者に，好ましくは週１回から２〜４週毎に１回，より好ましくは２週間に１回投与される。患者への１回の投与におけるrh α-GalＡの量は，好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重である。この医薬は，充填済みシリンジの形態で共有してよい。

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明する。しかしながら，本発明がそれらの実施例に限定されることは意図しない。

rh α-GalＡ発現ベクターpE-gs/hGHpA(α-GalA)の構築
pEF/myc/nuc ベクター(Invitrogen)をKpnI及びNcoIで消化してEF-1(α)プロモーターとその第１イントロンとを含んだ断片を切り出し，これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した。こうして調製されたDNA断片を，BglIIとEcoRIで消化し次いでT4 DNAポリメラーゼ平滑末端化しておいたpC1-neoベクター（Invitrogen）に挿入した。これに，上述のEF-1(α)プロモーター及びその第1イントロンを含んだ平滑末端化断片を挿入し，pE-neo7ベクターを得た（図１）。

ヒト成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナル配列を含んだDNA断片を，次の４つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって合成した：(a) hGH-f1（配列番号１），(b) hGH-r1（配列番号２），(c) hGH-f2（配列番号３），及び (d) hGH-r2（配列番号４）。こうして調製されたDNA断片をpE-neo7のMluI及びKpnI部位に挿入して，pE-neo/hGHpAベクター（図１）を得た。

チャイニーズハムスターのグルタミン合成酵素（「Ch GS」又は「GS」）のコード領域の５’側半分を，ＰＣＲにより，プライマーセットとしてGS-1（配列番号５）及びGS-3（配列番号６）を，そして鋳型としてＣＨＯ細胞から抽出されたRNAから調製した一本鎖DNAを用いて，増幅した。Ch GSのコード領域の３’側半分を，ＰＣＲにより，プライマーセットとしてGS-2（配列番号７）及びGS-4（配列番号８）を，そして鋳型としてＣＨＯ細胞から抽出されたRNAから調製した一本鎖DNAを用いて，増幅した。増幅したCh GSコード領域の５’側半分を，pT7blue-Tベクター（EMD Millipore）にライゲーションした。こうして得られたベクターをEcoRV及びBamHで消化し，次いで，消化されたベクターに，増幅されたCh GSコード領域の３’側半分をEcoRV及びBamHIで消化後に挿入して，Ch-Gsの全長cDNAを含んだプラスミドベクターを得た。このプラスミドをpT7blue(GS)と命名した（図２−１）。

ヒトα-GalＡコード領域の５’側半分を，ＰＣＲで，プライマーセットとしてGAL-Mlu（配列番号９）及びGAL-Sca2（配列番号１０）を，また鋳型としてヒト胎盤Quick-Clone^TM cDNA（Clontech）を用いて，増幅した。ヒトα-GalＡコード領域の３’側半分を，ＰＣＲにより，プライマーセットとしてGAL-Sca1（配列番号１１）及びGAL-Xba（配列番号１２）を，また鋳型としてヒト胎盤Quick-CloneTM cDNA (Clontech)を用いて増幅した。次いで，両ＰＣＲ産物をpBluescriptSK(+) ベクターのEcoRV部位にライゲーションした。こうして得られたベクターから，MluI及びScaI消化によりヒトα-GalＡコード領域の５’側半分を切り出し，またScaI及びNotIで消化することによりベクターからヒトα-GalＡコード領域の３’側半分を切り出した。次いで，切り出したこれら断片を，pE-neoベクターのマルチクローニングサイトのMluI及びNotI部位に同時に挿入して，ヒトα-GalＡの全長cDNAを得た。こうして得られたプラスミドを，pE-neo(α-GalA)と命名した（図２−２）。

pE-neo/hGHpAをAfIII及びBstXIで消化し，こうして消化されたベクターに，pT7blue(GS)からAfIII及びBstXIによる消化で切り出しておいたCh-GS cDNAを挿入した。得られたプラスミドをpE-gs/hGHpAと命名した（図２−１）。pE-gs/hGHpAベクターをMluI及びNotIで消化し，この消化されたベクターに，pE-neo(α-GalA)からMluI及びNotIにより切り出しておいたヒトα-GalA DNAを挿入した。得られたこのプラスミドをpE-gs/hGHpA(α-GalA)と命名し，これをrh α-GalA発現ベクターとして更なる実験に用いた（図２−２）。

rh α-GalAの発現用の組換え細胞の製造
ＣＨＯ細胞（CHO-K1：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を，次の方法により，Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen)を用いて上述の発現ベクターpE-gs/hGHpA(α-GalＡ)で，トランスフェクトした。概略するに，トランスフェクションの２日前に，５％FCSを含有するD-MEM/F12培地FCS (D-MEM/F12/5%FCS) ３mLを含んだ3.5ｃｍの培養皿に2.5×10⁵個のCHO-K1細胞を播種し，細胞を5%ＣＯ_２及び95%空気からなる湿潤雰囲気下37℃で培養した。２日間の培養の後，細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し，新鮮な血清不含D-MEM/F12培地1mLを加えた。次いで，細胞を，Opti-MEM^TM I培地（Life Technologies）で20倍稀釈したLipofectamine%^TM 2000溶液とOpti-MEM^TM I培地で20μg/mLに希釈したpE-gs/hGHpA(α-GalＡ)溶液との１：１混合液の200μLを添加してトランスフェクトし，続いて，5%ＣＯ_２及び95％空気の加湿雰囲気下に37℃で５時間培養した。トランスフェクション後，培地をD-MEM/F12/5%FCSに交換し，更に24時間培養した。

次いで，培地を，１×GSサプリメント（SIGMA），10%透析FBS及び30μmol/Lのメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を補充したグルタミン不含GMEM-S培地（SIGMA）に交換し，5%ＣＯ_２及び95%空気の湿潤雰囲気下で選択培養を行った。選択培養用の培地中で増殖した細胞を当該培地中で数回の連続した継代培養に付し，組換え細胞を得た。挿入された組換え遺伝子を増幅させるために，選択培養の過程で，培地中のMSXの濃度が段階的に高められた。高めたMSX濃度（100及び300μmol/L MSX）での２ステップの継代培養の後，最終的に，300μmol/L MSXを含む培地中において安定して増殖する細胞が得られた。

次いで，限界稀釈法により，増幅された組換え遺伝子を有する細胞を，96ウェルプレートに，ウェルあたり１個以下の細胞となるように播種した。細胞を，次いで，約10日間培養してそれらの各々にモノクローナルコロニーを形成させた。モノクローナルコロニーが形成されたウェルの培養上清を各々サンプリングしてヒトα-GalＡ活性を下記のようにして調べ，ヒトα-GalＡについて高活性を発現していることの判明した細胞株を選択した。

無血清懸濁細胞培養への順化のために，選択された細胞株をそれぞれ，10 mg/Lのインスリン，40 mg/Lのチミジン，100 mg/Lのヒポキサンチン及び100 μmol/LのMSXを補充した市販の無血清培地CD-OptiCHO^TM培地(Invitrogen)で，5%ＣＯ_２及び95％空気の加湿雰囲気下に37℃にて，細胞が安定して増殖するまで培養した。次いで，細胞を，10 mg/Lのインスリン，40 mg/Lのチミジン，100 mg/Lのヒポキサンチン，100 μmol/LのMSX，及び10%のDMSOを補充したCD-OptiCHO^TM培地(Invitrogen)に懸濁させ，液体窒素中に種細胞として貯蔵した。

rh α-GalAの発現用の組換え細胞の培養
上記の細胞を解凍して4×10⁵ 個/mLの密度に希釈し，10 mg/Lのインスリン，40 mg/Lのチミジン，100 mg/Lのヒポキサンチン及び100 μmol/LのMSXを補充したCD-OptiCHO^TM培地（CD培地）で３〜４日間培養し，次いでCD培地で2×10⁵ 個/mLの密度に希釈し，３〜４日間培養した。これらの細胞を，再度CD培地で2×10⁵ 個/mLの密度に希釈し，更に３〜４日間培養した。

こうして培養した細胞の個数をカウントし，細胞培養物をCD培地で2×10⁵ 個/mLの密度に希釈し，次いで希釈した培地１Ｌ中の細胞を，数日間振盪培養した。培養液量が200Ｌに達するまで，培養規模を拡大した。

次いで細胞数をカウントし，10 mg/Lのインスリン，40 mg/Lのチミジン，100 mg/Lのヒポキサンチン，及び0.1%のHY soy (Invitrogen)を補充したCD-OptiCHO^TM培地1800Ｌで細胞を2×10⁵個/mLの密度に希釈し，11日間培養した。CD-OptiCHO^TM培地中に8.84 gのインスリン，35.2 mmolのヒポキサンチン， 5.6 mmolのチミジン，及び1.8 kgのHY soyを含有するフィード溶液の22.4Ｌが，第３，第５，第７及び第９日目に添加された。サンプリングは培養中毎日行い，細胞数，生存率，グルコース濃度，及び発現されたrh α-GalＡの量を測定した。グルコース濃度が３g/Lを下回った場合，濃度が3.5g/Lに達するように30％グルコース溶液を添加した。11日に及ぶ培養中，生存細胞密度及びrh α-GalＡ濃度を毎日モニターした。培養の第６又は７日目に，生存細胞密度は約6×10⁶ 個/mLに達し，このことは，高密度細胞培養が首尾よく達成されたことを示している（図３）。下記のようにしてELIZAによって測定したこところによると，細胞によって分泌されたrh α-GalＡの培地中濃度は，経時的に上昇して第６日目にはほぼ140 mg/Lに達した（図３）。

上記培養の完了後，細胞培養物を集め，Millistak+^TM HC Pod Filter grade D0HC, (Millipore), Millistak+^TM HC Pod Filter grade X0HC (Millipore), 及び次いでDurapore Opticap^TM XLT20 (0.22μm, Millipore)で順次濾過して，培養上清を得た。得られた培養上清をPS膜（ポリスルホン膜）を備えた中空繊維モジュールによって元の液量の1/13まで濃縮した。

ウイルス不活化
約75Ｌの上記濃縮培養上清に，リン酸トリ−ｎ−ブチル（TNBP）及びポリソルベート80を，それらの終濃度がそれぞれ0.3%(v/v)及び1%(v/v)となるように加え，この混合液を次いで，室温にて３〜4時間，緩やかに撹拌した。

rh α-GalＡの精製のための方法
上記のウイルス不活化後の溶液のｐＨを，1Mトリス緩衝液（pH8.8）の添加により7.5に調整し，次いで，1M塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸緩衝液（pH7.0）の添加により，電気伝導度を，50 mM塩化ナトリウムを含有する10 mMリン酸緩衝液（pH7.5）のそれに調整した。次いで，Durapore Opticap^TM XL10（Millipore）により溶液を濾過し，次いで，50 mM塩化ナトリウムを含む10 mMリン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化しておいた陰イオン交換カラムであるQ Sepharose Fast Flow カラム（カラム体積：約19.2 L，ベッド高：約20 cm，GE Healthcare）に流速150 cm/時で負荷して，rh α-GalＡをカラムに吸着させた。次いで，カラム体積の３倍量の，同じ流速で供給される同じ緩衝液でカラムを洗浄し，次いで吸着されていたrh α-GalＡを，カラム体積の６倍量の225 mM塩化ナトリウム含有10 mMリン酸緩衝液（pH7.5）で，そして引き続きカラム体積の３倍量の1M 塩化ナトリウム含有50 mMリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させ，rh α-GalＡ含有画分を回収した。

上記Q Sepharose Fast Flow カラムクロマトグラフィーで回収された画分に1/4量の2M 塩化ナトリウムを添加して塩化ナトリウム濃度を約500 mMに調整し，続いて酢酸を添加してpHを7.0に調整した。得られた溶液を，750 mM塩化ナトリウムを含有する50 mMトリス塩酸，5 mM リン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化しておいた疎水性カラムであるPhenyl Sepharose 6 Fast Flow カラム（カラム体積：19.2 L，ベッド高：約20 cm，GE Healthcare）に負荷し，線流速150 cm/時でrh α-GalＡをカラムに吸着させた。次いで，カラム体積の３倍量の同じ緩衝液を同じ流速で供給してカラムを洗浄し，カラム体積の９倍量の50 mMトリス塩酸と5 mMリン酸とからなる緩衝液（pH 7.0）で，そしてこれに続いてカラム体積の３倍量の純水で，吸着されたrh α-GalＡを溶出させ，rh α-GalＡ含有画分を回収した。

上記のPhenyl Sepharose 6 Fast Flow カラムクロマトグラフィーのステップで回収された画分を， 50 mM塩化ナトリウムを含有する50 mMトリス塩酸，10 mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させておいたハイドロキシアパタイトカラムであるCHT-Iセラミックハイドロキシアパタイトカラム（カラム体積：19.2 L，ベッド高：約20 cm，Bio-Rad Laboratories）に負荷し，線流速150 cm/時でrh α-GalＡをカラムに吸着させた。次いで，カラム体積の５倍量の同じ緩衝液を同じ流速で供給してカラムを洗浄し，次いでカラム体積の９倍量の50 mMトリス塩酸，45 mMリン酸ナトリウム及び50 mM塩化ナトリウムを含む緩衝液（pH7.0）で，続いて，カラム体積の３倍量の200 mMリン酸緩衝液（pH7.0）で，吸着されたrh α-GalAを溶出させて，rh α-GalAを含む画分を回収した。

上記のCHT-Iセラミックヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーのステップで回収された画分に酢酸を添加してpHを5.5に調整した。これによって形成された沈殿をOpticap^TM SHC XL5（0.22μm, Millipore）を用いた濾過により除去した。得られた溶液を，150 mMの塩化ナトリウムを含有する50 mM酢酸緩衝液（pH5.5）で平衡化させておいた疎水性相互作用及び水素結合形成に基づく選択性を有する陽イオン交換樹脂であるCapto^TM MMCカラム（カラム体積：6.3 L，ベッド高：約20 cm, GE Healthcare)に負荷し，線流速300 cm/時でrh α-GalＡをカラムに吸着させた。次いで，カラム体積の４倍量の，同じ流速で供給される同じ緩衝液でカラムを洗浄した後，吸着されたrh α-GalＡをカラム体積の５倍量の50 Mmリン酸緩衝液（pH6.5）で，そしてこれに続いてカラム体積の３倍量の１M塩化ナトリウムを含有する50 mMリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させて，rh α-GalＡを含む画分を回収した。

上記のCapto^TM MMCカラムクロマトグラフィーのステップで回収された画分に，1Mトリス緩衝液（pH8.8）を加えてpHを7.0に調整した。得られた溶液の半量を125 mM塩化ナトリウムを含有する20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させておいたBlue Sepharose 6FF カラム（カラム体積：約19.2 L，ベッド高：約20 cm, GE Healthcare)に負荷し，線流速150 cm/時で供給してrh α-GalＡをカラムに吸着させた。次いで， 125 mMの塩化ナトリウムを含有する20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）を同じ流速でカラム体積の３倍量供給してカラムを洗浄し，次いで，吸着されたrh α-GalＡを，450 mMの塩化ナトリウムを含有する50 mMトリス塩酸／5 mMリン酸緩衝液（pH7.0）を同じ流速でカラム体積の４倍量を供給して溶出させ，rh α-GalＡを含む画分を回収した。溶液の他の半量は，色素親和性カラムクロマトグラフィーにより，上述したのと同じ仕方で連続して処理した。rh α-GalＡを含む回収画分を，更なる精製のために合わせた。

上記色素親和性カラムクロマトグラフィーのステップで回収された画分を，Biomax^TM 30 膜（Millipore）を備えたPellicon^TM 3 カセットを用いて，全量が１Ｌ未満になるまで濃縮した。濃縮後の溶液の1/3を，137 mMの塩化ナトリウムを含有する20 mMリン酸緩衝液（pH5.8）で平衡化させておいたSuperdex^TM 200 prep grade カラム（カラム体積：約58 L，ベッド高：約30 cm×2，GE Healthcare）に負荷した。次いで，同じ緩衝液を25 cm/時の線流速で供給し，280 nmの吸光度により観察される主ピークに対応する画分を精製rh α-GalＡ含有画分として回収した。このクロマトグラフィーは，上記の溶液全てを精製するために３回行い，各回の操作で回収された画分を合わせた。

上記のSuperdex^TM 200 prep grade カラムクロマトグラフィーのステップでプールされた画分を，PS膜を備えた中空繊維モジュールによって濃縮し，この濃縮液にポリソルベート80を終濃度0.02%となるように加えた。得られた溶液を，ウイルスや微生物による最終製品の如何なる起こり得る汚染をも回避するために，Viresolve^TM Pro Modus1.3（0.07 m² サイズ，Millipore）で濾過した。

精製の各ステップにおいて，各材料に含有されるrh α-GalＡの量及び集められた画分中に回収されたrh α-GalＡの量を後述のようにしてELIZAで定量した。結果を表１に示す。表において，「rh α-GalＡ回収率／ステップ」は，当該ステップにおいて負荷されたrh α-GalＡの量に対する当該ステップで回収された量の割合を意味し，「rh α-GalＡ回収率／総計」は，精製方法に供されたrh α-GalＡの当初量に対する各ステップで回収されたrh α-GalＡの量の割合を意味する。精製方法に供されたrh α-GalＡの当初量は140.6ｇであり，そのうち最終的に91.4ｇが回収され，従って65.0%という高さのrh α-GalＡ回収率／総計が得られた。これらの結果は，上記の精製方法が，rh α-GalＡの非常に高収率且つ大きな生産規模での精製を可能にすることを示している。

ELIZAによるヒトα-GalＡの分析
96ウェルのマイクロタイタープレート（Nunc）の各ウェルに，0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH9.6）で25 mg/mLに希釈した100μLのマウス抗ヒトα-GalＡモノクローナル抗体を加え，プレートを室温で少なくとも１時間，又は２〜８℃で終夜静置して，抗体をウェルに吸着させた。次いで， PBS-T（0.05％のTween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS），pH7.4）で各ウェルを洗浄した後，１％のBSAを含有するPBS-T 300μLを加え，プレートを室温にて少なくとも１時間静置した。次いで，PBS-Tで各ウェルを３回洗浄した後，0.5％のBSA及び0.05％のTween 20を含んだPBS（PBS-BT）で所望により希釈しておいた試験サンプル又はヒトα-GalＡ標準の100μLをウェルに加え，プレートを室温にて少なくとも１時間静置した。次いで，各ウェルをPBS-Tで３回洗浄した後，PBS-Tで希釈したセイヨウワサビ・パーオキシダーゼ標識化兎抗ヒトα-GalＡポリクローナル抗体の100μLを添加して，プレートを室温にて少なくとも１時間静置した。次いで，各ウェルをPBS-Tで３回洗浄した後，0.009%過酸化水素を含有する0.4 mg/mLのｏ−フェニレンジアミン含有リン酸−クエン酸緩衝液（pH5.0）をウェルに加え，室温にてプレートを10〜25分間静置した。次いで，各ウェルに1 mol/Lの硫酸0.1 mLを加えて反応を停止させ，96ウェルプレートリーダーにより490 nmでの吸光度を測定した。

rh α-GalＡの活性の測定
希釈用緩衝液（26.7 mM クエン酸−44.8mMリン酸緩衝液，pH4.6，0.1 mg/mL BSAを含有）に0〜200μmol/Lの濃度で４−メチルウンベリフェロンを溶解することにより，標準溶液を調製した。基質溶液は，４−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトピラノシド（SIGMA）を希釈用緩衝液に終濃度５ mMになるように溶解させることにより，調製した。希釈用緩衝液で希釈した各標準溶液又は標準溶液の10μLを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた（FluoroNunc Plate, Nunc）。希釈された試験サンプル又は標準溶液を含んだ各ウェルに。75μLの基質溶液を加え，プレートを37℃にて少なくとも１時間，暗所に静置した。このインキュベーションの後，200μLのStop Buffer （0.2M グリシン−水酸化ナトリウム, pH10.6）を各ウェルに加えた。次いで，各ウェルの蛍光強度を，96ウェルプレートリーダーにより，波長335 nmの励起光及び波長460 nmの蛍光で測定した。

標準溶液の蛍光強度をプロットし，プロットされたデータ点の間を外挿することにより，標準曲線を作成した。各サンプルの蛍光強度は，この標準曲線を用いて測定される，遊離された4-MUF濃度に対応した。ヒトα-GalＡの比活性は，単位/mgとして算出されるが，ここに，１単位の活性は，37℃において１分間あたりに産生される4-MUFの１μmol量に等しい。rh α-GalAの活性の上記測定を行うに当たり，公開された米国出願（公開番号2004-0229250）を参照した。上記方法で精製されたrh α-GalAの比活性は，約50単位/mg（48.3〜53.7単位/mg）であることが判明した。

rh α-GalＡの純度の分析
上記で精製されたrh α-GalＡの5 mgを，還元性の加熱（70℃10分）条件下でのSDS-PAGE電気泳動に付した。クマシーブリリアントブルーで染色したゲルは，Superdex^TM 200pg 画分中のrh α-GalＡに対応する単一バンドを示した（図４）。

更に，上記の精製rh α-GalＡをサイズ排除HPLC（SE-HPLC）により分析した。HPLCは，LC-20Aシステム，SPD-20AV UV/VIS 検出器（(株)島津製作所）を用いて行った。SE-HPLC分析用には，上記で精製されたrh α-GalＡを2 mg/mL含有するサンプル溶液の10μLを，25 mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で緩衝化させておいたTSKgel G3000SW_XLカラム（内径7.8 mm×30 cm, TOSOH）に適用して，流速0.5 mL/分で行った。215 nmの吸光度をモニターすることにより溶出プロフィールを作成した。

上記の精製rh α-GalＡのSE-HPLC分析は，単一ピークのみを示した（図５）。これらの結果は，上記で得られたrh α-GalＡが高度に精製されており，検出し得る汚染物を含んでいないことを明らかにしている。この結果は，上記で精製されたrh α-GalＡが医薬としてヒトに直接投与し得るような高い純度のものであることを実証している。

宿主細胞タンパク質（HCPs）の測定
精製ステップ１〜６の各々において回収されたrh α-GalＡのプール中に存在する汚染物である宿主細胞タンパク質の量をELIZAにより慣用の仕方で測定し，当該プールに含まれるrh α-GalＡの量と比較した。結果を，「HCP/rh α-GalＡ(ppm)」として表１に示しており，これはrh α-GalＡに対するHCPsの質量の比率である。表１に示されたように，この比率は，最終ステップの精製後には，20 ppmと低く，このrh α-GalＡを注射により反復してヒトに投与する医薬として使用することを許容するに十分低いレベルである。

精製方法のこれらのステップのうち，第５番目の色素親和性クロマトグラフィーは，rh α-GalＡからこれと共に含まれるHCPsを除去するのに最も効果的であった。即ち，このステップにおいて，HCPsの殆ど97%が除去され，HCPs/rh α-GalＡの比率は8.6×10³ ppmから2.5×10² ppmへと低下した。この結果は，rh α-GalＡ調製物からHCPsを除去するのに色素親和性クロマトグラフィーが効果的な方法であることを示している。

本発明は，rh α−ガラクトシダーゼＡ（rh α-GalＡ）を，大きな規模で，医薬としてファブリー病の患者に投与するのに十分高い純度で，産生するのに利用される。

配列番号１＝hGH-f1，合成配列
配列番号２＝hGH-r1，合成配列
配列番号３＝hGH-f2，合成配列
配列番号４＝hGH-r2，合成配列
配列番号５＝プライマーGS-1，合成配列
配列番号６＝プライマーGS-3，合成配列
配列番号７＝プライマーGS-2，合成配列
配列番号８＝プライマーGS-4，合成配列
配列番号９＝プライマーGAL-Mlu，合成配列
配列番号１０＝プライマーGAL-Sca2，合成配列
配列番号１１＝プライマーGAL-Sca1，合成配列
配列番号１２＝プライマーGAL-Xba，合成配列

Claims

組換えヒトα-ガラクトシダーゼＡの製造方法であって，
（ａ）無血清培地中で組換えヒトα-GalＡ産生哺乳類細胞を培養して組換えヒトα-GalＡを培地中に分泌させるステップ，
（ｂ）上記ステップ（ａ）で得られた培養物から細胞を除去することにより培養上清を回収するステップ，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）で回収された培養上清を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｄ）上記ステップ（ｃ）で回収された画分を，疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｅ）上記ステップ（ｄ）で回収された画分を，リン酸残基に親和性を有する材料を固相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｆ）上記ステップ（ｅ）で回収された画分を，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，
（ｇ）上記ステップ（ｆ）で回収された画分を，色素親和性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ，及び
（ｈ）上記ステップ（ｇ）で回収された画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalＡ活性画分を回収するステップ
をこの順序で含んでなるものである，方法。
請求項１の方法であって，該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂が弱陽イオン交換樹脂である，方法。
請求項２の方法であって，該弱陽イオン交換樹脂が疎水性相互作用と水素結合形成との双方に基づく選択性を有するものである，方法。
請求項２又は３の方法であって，該弱陽イオン交換樹脂が，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を有するものである，方法。
請求項１〜４の何れかの方法であって，色素親和性クロマトグラフィーにおいて用いられる色素がブルートリアジン色素である，方法。
請求項１〜５の何れかの方法であって，リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである，方法。
上記６の方法であって，リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイトである，方法。
請求項１〜７の何れかの方法であって，該哺乳類細胞が，ＥＦ−１（α）プロモーターの制御下に組換えヒトα-GalＡを発現するように設計された発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞である，方法。
上記１〜８の何れかの方法により製造される組換えヒトα-GalＡ組成物。
請求項９の組成物を含んでなる，患者に定期的に投与される医薬。
請求項１０の医薬であって，注射により患者に投与されるものである医薬。