KR20170099406A

KR20170099406A - 오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 물질로부터의 재조합 인간 알파-갈락토시다아제 a 의 정제 방법

Info

Publication number: KR20170099406A
Application number: KR1020177022178A
Authority: KR
Inventors: 츠요시 후쿠이; 아츠코 가와사키; 유키치 하타노; 야에 이토; 가즈토시 미하라; 아츠시 스기무라
Original assignee: 니홍 케미칼 리써치 가부시키가이샤
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2017-08-31
Also published as: EP3247794A4; US10385325B2; US20180016564A1; KR102288264B1; JP6749042B2; EP3247794B1; WO2016116966A1; CN107208081A; CN107208081B; JP2018504121A; EP3247794A1; WO2016117341A1

Abstract

개시되는 것은 고순도로, 대규모로 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A (rh α-Gal A) 를 제조하는 방법이다. 상기 방법은 (a) 무혈청 배지에서 rh α-Gal A-생성 포유동물 세포를 배양하는 단계, (b) 배양 상청액을 수집하는 단계, (c) 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피에 배양 상청액을 적용하는 단계, (d) 소수성 컬럼 크로마토그래피 단계, (e) 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질을 고체 상으로서 사용하는 컬럼 크로마토그래피 단계, (f) 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피 단계, (g) 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피 단계, 및 (h) 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 단계를 순서대로 포함한다.

Description

오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 물질로부터의 재조합 인간 알파-갈락토시다아제 A 의 정제 방법 {METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN ALPHA-GALACTOSIDASE A FROM MATERIAL CONTAINING CONTAMINANT HOST CELL PROTEINS}

본 발명은 일반적으로 숙주 세포를 사용한 인간 알파-갈락토시다아제 A (rh α-Gal A) 의 제조 방법, 및 오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 물질로부터 제조된 rh α-Gal A 의 정제 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 무혈정 배지 중에서 rh α-Gal A-생성 포유동물 세포를 배양하는 것에 의한 rh α-Gal A 의 제조 방법, 및 이에 따라 제조된 rh α-Gal A 의 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 컬럼 크로마토그래피를 사용한 배양 상청액으로부터의 고수율로의 및 의약물로서 정제 단백질의 직접적 사용을 허용하는 정도의 높은 순도로의 정제 방법에 관한 것이다.

알파-갈락토시다아제 A (α-Gal A) 는 당지질 및 당단백질의 말단 알파-갈락토실 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 리소좀 효소이다. 3 개의 헥소오스 모이어티를 함유하는 트리헥소실세라마이드는 알파-갈락토시다아제 A 를 위한 기질 중 하나이고, 이의 말단 헥소오스 모이어티에서 효소에 의한 가수분해된다. 인간 α-Gal A 는 429 개의 아미노산을 포함하는 전구체 펩타이드로서 발현되고, 이 중 N-말단 31 개의 아미노산은 신호 펩타이드를 구성한다. 전구체는, 신호 펩타이드의 제거 이후 뒤에 남겨지는 398 개의 아미노산으로 이루어지는 성숙 펩타이드를 위해 처리되고, 한 쌍의 성숙 펩타이드 분자는 조건이 허용한다면 쉽게 호모다이머를 형성하는데, 이는 인간 α-Gal A 의 효소적 활성 형태이다. 인간 α-Gal A 는 만노오스-6-포스페이트 잔기를 함유하는 올리고당 사슬을 지니고, 만노오스-6-포스페이트 수용체를 통해 리소좀에 표적화될 수 있다.

패브리 질환 (Fabry's disease) 은 α-Gal A 를 인코딩하는 유전자의 선천적 비정상에 의해 야기되는 X-연결된 선천적 리소좀 저장 질환이다. 이러한 효소의 활성 결여는 다양한 조직에서 트리헥소실세라마이드의 축적을 야기하여, 신장 손상, 혈관각화종 및 심혈관 비정상, 예컨대 심실 확장 및 승모판 결손을 야기한다.

알파-갈락토시다아제 A 의 효소 활성이 패브리 질환을 갖는 환자의 조직에서 부족하게 또는 오로지 약하게만 검출된다는 것이 1960 년에 이미 공지되었다. 따라서 α-Gal A 를 인코딩하는 유전자의 일부 선천적 비정상이 패브리 질환의 원인이어야 한다는 것이 추측되었다. 이러한 추측을 기반으로, 패브리 질환을 위한 α-Gal A 대체 요법은 인간 혈장 또는 비장으로부터 추출 및 정제된 α-Gal A 를 환자에게 주입함으로써 수행되어, α-Gal A 대체 요법이 패브리 질환을 겪는 환자의 혈액 중 트리헥소실세라마이드의 수준을 저하시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (NPL 1, NPL 2, NPL 3 참조). 따라서, α-Gal A 효소 대체 요법은 패브리 질환과 관련하여 유망해야 하는 것으로 여겨졌다. 그러나 α-Gal A 대체 요법의 실질적 적용은 이러한 효소의 공급 결여로 인해 극히 제한되었다.

1986 년에, 인간 α-Gal A 를 인코딩하는 유전자가 단리되었고 (NPL 4 참조), 또한 1988 년에 인간 α-Gal A 발현 벡터에 의해 형질전환된 CHO 세포를 사용하는 것에 의한 rh α-Gal A 의 발현 및 제조 방법이 보고되었다 (NPL 5 참조). 재조합 기술을 이용하여, 이러한 발견은 인간 α-Gal A 를 대규모로 제조하고, 효소를 패브리 질환을 위한 효소 대체 요법용 약제로서 사용하는 것을 가능하게 한다. rh α-Gal A 는 곤충 세포에서 또한 발현되었다 (PTL 1).

또한, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스 컬럼 크로마토그래피, 수산화인회석 컬럼 크로마토그래피, 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피의 사용을 포함하는 rh α-Gal A 의 정제를 위한 일부 방법이 보고되었다 (PTL 2, PTL 3). 비록 PTL 2 또는 PTL 3 에 기재된 정제 방법에 의해 수득된 rh α-Gal A 의 순도가 충분히 높은 것으로 나타났기는 하지만, 이는 인체용으로 완전히 허용가능한 것으로 여겨지지는 않았다. 그 이유는, 환자에게 주입하고자 하는 임의의 약제는 오염물, 예컨대 특히 사용된 숙주 세포로부터 유래된 단백질이 없도록 요구되는 한편, PTL 2 또는 PTL 3 은 상기 오염물이 정제된 rh α-Gal A 에서 유지되는지 유지되지 않는지를 나타내지 못한다는 것이다. 그리고, 순서대로 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 고체 상으로서 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피, 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피의 이용을 포함하는 rh α-Gal A 의 정제 방법이 보고되었다 (PTL 4). 그러나, PTL 은 숙주 세포 단백질에 의한 rh α-Gal A 의 오염에 대해서는 언급하지 않는다.

현재, 활성 성분으로서 rh α-Gal A 를 함유하는 패브리 질환용 의약물은 상표명 예컨대 Replagal^TM 및 Fabrazyme^TM 로 시판되고 있다.

인용 목록

특허 문헌

PTL 1: WO 90/11353

PTL 2: WO 98/11206

PTL 3: WO 00/53730

PTL 4: WO 14/017088

비특허 문헌

NPL 1: Mapes et al: Science 169: 987-9 (1970)

NPL 2: Brady et al: N. Engl. J. Med. 289: 9-14 (1973)

NPL 3: Desnick et al: Proc Natl Acad Sci USA 76: 5326-30 (1979).

NPL 4: Bishop et al: Proc Natl Acad Sci USA 83: 4859-63 (1986)

NPL 5: Bishop et al: Lipid Storage Disorders - Biological and Medical Aspects, NY Plenum Press P809-823 (1988)

상기 배경에 대하여, 본 발명의 목적은 무혈청 배지에서 rh α-Gal A 생성 포유동물 세포의 배양으로 출발하여 재조합 인간 알파-갈락토시다아제 A (rh α-Gal A) 의 제조 및 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 컬럼 크로마토그래피를 통해 오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 배양 상청액으로부터 rh α-Gal A 를 고수율로 및 의약물로서 정제된 단백질의 직접적 사용을 허용하는 정도의 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 무혈청 배지 중 rh α-Gal A-생성 세포의 배양액의 상청액에 함유된 rh α-Gal A 가 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 컬럼을 사용한 크로마토그래피, 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피의 조합을 포함하는 정제 방법에 rh α-Gal A 를 적용함으로써, 오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 상청액으로부터 매우 고순도로 및 또한 매우 고수율로 정제될 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명은 상기 발견을 기반으로 추가 연구를 통해 완성되었다.

따라서 본 발명은 하기를 제공한다:

1. 하기 단계를 순서대로 포함하는, 재조합 인간 α-Gal A 의 제조 방법:

(a) 무혈청 배지에서 재조합 인간 α-Gal A-생성 포유동물 세포를 배양하여, 이것이 배지에 재조합 인간 α-Gal A 를 분비하게 하는 단계,

(b) 상기 단계 (a) 에서 수득되는 배양액으로부터 세포를 제거하여 배양 상청액을 수집하는 단계,

(c) 상기 단계 (b) 에서 수집된 배양 상청액을 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A -활성 분획을 수집하는 단계,

(d) 상기 단계 (c) 에서 수집된 분획을 소수성 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A-활성 분획을 수집하는 단계,

(e) 상기 단계 (d) 에서 수집된 분획을 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질을 고체 상으로서 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A-활성 분획을 수집하는 단계,

(f) 상기 단계 (e) 에서 수집된 분획을 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A -활성 분획을 수집하는 단계,

(g) 상기 단계 (f) 에서 수집된 분획을 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A -활성 분획을 수집하는 단계, 및

(h) 상기 단계 (g) 에서 수집된 분획을 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A-활성 분획을 수집하는 단계.

2. 상기 (1) 에 있어서,

양이온-교환 컬럼 크로마토그래피에서 사용된 양이온 교환체가 약한 양이온 교환체인 방법.

3. 상기 (2) 에 있어서,

약한 양이온 교환체가 소수성 상호작용 및 수소 결합 형성 모두를 기반으로 하는 선택성을 갖는 방법.

4. 상기 (2) 또는 (3) 에 있어서,

약한 양이온 교환체가 페닐 기, 아미드 결합 및 카르복실 기를 갖는 방법.

5. 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서,

염료-친화성 컬럼 크로마토그래피에서 사용된 염료가 청색 트리아진 염료인 방법.

6. 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서,

포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질이 수산화인회석 및 불화인회석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

7. 상기 (6) 에 있어서,

포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질이 수산화인회석인 방법.

8. 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서,

포유동물 세포가 EF-1(알파) 프로모터의 조절 하에 재조합 인간 α-Gal A 를 발현하도록 고안되는 발현 벡터에 의해 트랜스펙션된 CHO 세포인 방법.

9. 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 인간 α-Gal A 조성물.

10. 환자에게 주기적으로 투여되는 상기 (9) 에 따른 조성물을 포함하는 약제.

11. 상기 (10) 에 있어서,

환자에게 주사로 투여되는 약제.

본 발명은 오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 물질로부터 rh α-Gal A 의 정제를 가능하게 한다. 이에 따라 정제된 재조합 인간 α-Gal A 는 패브리 질환을 위한 효소 대체 요법 (ERT: enzyme replacement therapy) 에서의 약제로서 사용하기에 적합하다. 이러한 요법에서, rh α-Gal A 는 패브리 질환을 겪는 환자에게 주기적으로 투여되어야 한다. 따라서 α-Gal A 약제가 숙주 세포 단백질을 함유하는 경우, 약제를 사용한 ERT 는 숙주 세포 단백질에 대한 환자에서의 중증 항원-항체 반응 (즉, 과민증) 을 유도할 잠재적 위험성을 가질 수 있다. 상기 위험은, 약제로서 본 발명에 따라 정제된 rh α-Gal A 를 사용함으로써 최소화될 수 있다. 또한, 세포의 무혈청 배양으로 출발하여 rh α-Gal A 를 생성할 수 있게 되므로, 본 발명은 임의의 혈청-유래 오염물, 예컨대 병원성 제제 예컨대 바이러스 또는 프리온 (prion) 이 없는 rh α-Gal A 를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 수득된 rh α-Gal A 는 상기 병원성 제제에 대한 어떠한 노출 위험성도 없이 실질적으로 안전한 약제로서 신체에 투여될 수 있다. 또한, 실질적으로 유기 용매의 임의의 사용을 회피하면서 rh α-Gal A 의 정제가 가능해지므로, 본 발명은 다르게는 사용된 유기 용매에 대한 노출에 의해 야기될 수 있는 rh α-Gal A 의 변성 위험성을 제거한다. 또한 본 발명은, 이에 따른 정제 방법을 수행한 후에 남은 폐기액이 유기 용매를 함유하지 않고, 경제적 의미에서 또한 이는 다르게는 폐기액에 함유될 유기 용매의 처리를 위한 시설을 필요로 하지 않기 때문에 환경 친화적이다.

또한 본 발명은 그 올리고당 사슬에 만노오스-6-포스페이트 잔기를 갖는 rh α-Gal A 의 매우 선택적인 정제를 가능하게 한다. 인간 신체에 대한 투여 이후 이의 효소 활성을 발휘하기 위해, rh α-Gal A 는 그 표면에서 발현되는 만노오스-6-포스페이트 수용체를 통해 관련 세포에 의해 취해져야 한다. 따라서, 본 발명에 따라 달성된 매우 선택적인 정제는 극적으로 증가된 효능을 갖는 약제로서 rh α-Gal A 생성물을 생성할 것이다.

[도 1] 도 1 은 벡터 pE-neo/hGHpA 의 구축 방법을 설명하는 개략도를 나타낸다.
[도 2a] 도 2a 는 벡터 pE-gs/hGHpA(α-Gal A) 의 구축 방법을 설명하는 개략도의 제 1 부분을 나타낸다.
[도 2b] 도 2b 는 벡터 pE-gs/hGHpA(α-Gal A) 의 구축 방법을 설명하는 개략도의 제 2 부분을 나타낸다.
[도 3] 도 3 은 배양 배지에서 rh α-Gal A 의 농도 및 rh α-Gal A 의 발현을 위한 재조합 세포의 성장 곡선을 나타낸다.
[도 4] 도 4 는 정제된 rh α-Gal A 의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타낸다. 레인 1 에, 5 ㎍ 의 정제된 rh α-Gal A 가 적용되었다.
[도 5] 도 5 는 정제된 rh α-Gal A 의 SE-HPLC 차트를 나타낸다. 세로 및 가로 축은 각각 215 nm 에서의 흡광도 및 체류 시간을 나타낸다.

본 발명에서, 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A (rh α-Gal A) 는 바람직하게는 인간 야생형 α-Gal A 의 재조합 단백질이고, rh α-Gal A 가 인간 야생형 α-Gal A 의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 갖는 돌연변이형 단백질임이 제외되지 않는다. 인간 야생형 α-Gal A 을 위한 DNA 서열 및 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열, 예컨대 N-말단 신호 서열은 각각 SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14 로 나타내어진다. N-말단 신호 서열은 31 개의 아미노산으로 이루어지고, 번역후 제거된다.

본 발명에서, 용어 "재조합 인간 α-Gal A-생성 포유동물 세포" 또는 "rh α-Gal A-생성 포유동물 세포" 는, 인간 α-Gal A 를 인코딩하는 유전자를 발현, 또는 강하게 발현하도록 인공적으로 조작된 포유동물 세포를 의미한다. 일반적으로 강하게 발현되는 유전자가, 유전자가 편입되는 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에 도입되지만 (형질전환), 이는 또한 강하게 발현되는 인공적으로 변형된 내인성 유전자일 수 있다. 그 자체를 강하게 발현하게 하기 위해 내인성 유전자를 인공적으로 변형하는 방법의 예는, 비제한적으로, 유전자의 발현을 강하게 유도하는 프로모터에 의한 내인성 유전자의 프로모터 업스트림의 대체를 포함한다. 상기 방법은 여러 문헌 (즉 WO94/12650, WO95/31560) 에 개시되어 있다. 비록 표유동물 세포가 이용되는데 특별한 제한이 없기는 하지만, 바람직한 것은 인간-, 마우스- 또는 중국 햄스터-기원의 것이고, 특히 중국 햄스터 난소 세포로부터 기원하는 CHO 세포가 특히 바람직하다.

본 발명에서, 용어 "재조합 인간 α-갈락토시다아제 A" 또는 "rh α-Gal A" 는 배양 동안 배지에서 상기-언급된 재조합 인간 α-Gal A-생성 포유동물 세포에 의해 분비되는 인간 α-갈락토시다아제 A 를 의미한다.

본 발명에서, 용어 "올리고당 사슬" 은 α-Gal A 의 펩타이드 사슬에 공유 결합된 올리고당의 사슬, 예컨대 α-Gal A 의 아스파라긴 잔기에 공유 결합된 아스파라긴 유형 당 사슬을 의미한다.

본 발명에서, rh α-Gal A-생성 포유동물 세포가 배양되는 바람직한 무혈청 배지의 예는 하기를 포함하는 하기 배지이다: 3-700 mg/㎖ 의 아미노산, 0.001-50 mg/L 의 비타민, 0.3-10 g/L 의 단당류, 0.1-10000 mg/L 의 무기 염, 0.001-0.1 mg/L 의 미량 원소, 0.1-50 mg/L 의 뉴클레오사이드, 0.001-10 mg/L 의 지방산, 0.01-1 mg/L 의 바이오틴, 0.1-20 ㎍/L 의 히드로코르티손, 0.1-20 mg/L 의 인슐린, 0.0-10 mg/L 의 비타민 B₁₂, 0.01-1 mg/L 의 푸트레신, 10-500 mg/L 의 나트륨 피루베이트, 및 수용성 철 화합물. 원하는대로, 이는 또한 티미딘, 하이포잔틴, 통상적 pH 지시약 및 항생제를 포함할 수 있다.

또한, DMEM/F12 배지, DMEM 및 F12 로 이루어지는 혼합 배지는 또한 기초 무혈청 배지 (basic serum-free medium) 로서 사용될 수 있다. 이러한 배지 모두는 당업자에 익히 공지되어 있다. 무혈청 배지로서 DMEM(HG)HAM 변형된 (R5) 배지가 또한 사용될 수 있고, 이는 나트륨 히드로겐 카르보네이트, L-글루타민, D-글루코오스, 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 디아미노부탄, 히드로코르티손, 제2철 (II) 술페이트, 아스파라긴, 아스파르트산, 세린 및 폴리비닐 알코올을 함유한다. 또한, 시판되는 무혈청 배지, 예컨대 CDoptiCHO^TM, CHO-S-SFM II 또는 CD CHO (Invitrogen), IS CHO-V^TM 또는 IS CHO-V-GS^TM (Irvine Scientific), EX-CELL^TM325 PF CHO 또는 EX-CELL^TM CD (SIGMA) 등이 또한 기초 배지로서 사용될 수 있다.

본 발명에서, rh α-Gal A-생성 포유동물 세포는 5 일 이상 동안, 더 바람직하게는 8 내지 14 일 동안 배양 배지에서 rh α-Gal A 생성을 위해 배양된다. 이후 rh α-Gal A 를 함유하는 배양 상청액이 수집되고, rh α-Gal A 의 정제 방법에 제공된다.

오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 배양 상청액으로부터 rh α-Gal A 의 정제를 위한 크로마토그래피 과정 각각은, 필요한 경우 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 비이온성 계면활성제의 존재 하에 수행될 수 있다. 비록 비이온성 계면활성제가 이용되는데 특별한 제한은 없으나, 폴리소르베이트-기반 계면활성제가 바람직하게는 사용되고, 더 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20 이 사용된다. 상기 비이온성 계면활성제의 농도는 바람직하게는 0.005% (w/v) 내지 0.05% (w/v), 더 바람직하게는 약 0.01% (w/v) 이다.

rh α-Gal A 의 정제 방법은 실온에서 또는 저온에서, 바람직하게는 저온에서, 특히 1-10 ℃ 에서 수행될 수 있다.

정제 방법의 제 1 크로마토그래피 단계에서, 배양 상청액의 pH 는 바람직하게는 7.0-8.0, 더 바람직하게는 pH 7.2-7.8, 보다 바람직하게는 약 pH 7.5 로 조정된다. 이후 배양 상청액은, rh α-Gal A 가 컬럼에 결합하게 하기 위해 염으로 보강된 인산염 완충액에 의해 평형화된 음이온-교환 컬럼에 적용된다. 이러한 인산염 완충액의 pH 는 바람직하게는 7.0-8.0, 더 바람직하게는 약 7.2-7.8, 더욱 더 바람직하게는 약 7.5 이다. 비록 염이 인산염 완충액에 첨가되는데에 특별한 제한은 없지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 5-100 mM 범위, 더 바람직하게는 10-60 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 50 mM 이다.

rh α-Gal A 가 결합되는 음이온-교환체 컬럼이 세척된 이후, rh α-Gal A 는 증가된 염 농도를 갖는 인산염 완충액을 사용하여 용리된다. 염이 사용되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 125-500 mM 범위, 더 바람직하게는 175-350 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 225 mM 이다.

또한, 비록 음이온-교환체 수지가 사용되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 강한 음이온 교환체 수지가 바람직하게는 사용될 수 있다. 시판되는 수지, 예컨대 Q 세파로오스 패스트 플로우 (Q Sepharose Fast Flow) (GE Healthcare) 가 바람직하게는 사용될 수 있다.

소수성 컬럼 크로마토그래피, 정제 방법의 제 2 단계는, 수지에 부착된 소수성 리간드와 rh α-Gal A 사이의 소수성 상호작용을 사용하는 오염물의 제거 단계이다. 소수성 리간드가 소수성 컬럼 크로마토그래피에서 사용되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 바람직한 것은 페닐 기를 함유하는 리간드이고, 더 바람직한 것은 스페이서 암 (arm) 을 통해 수지에 부착된 페닐 기를 함유하는 리간드, 예컨대 식 R-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-C₆H₅ 에 의해 나타내어지는 것 (식 중, R 은 수지를 나타냄) 이다. 이에 특히 바람직한 컬럼 물질은 페닐 세파로오스 6 패스트 플로우 (GE Healthcare) 이고, 여기서 페닐 기는 특정 스페이서 암을 통해 세파로오스 6 패스트 플로우 매트릭스에 공유결합적으로 고정된다.

소수성 컬럼 크로마토그래피 컬럼은 염으로 보강된 인산염 완충액에 의해 평형화된다. 이러한 인산염 완충액의 pH 는 바람직하게는 6.5-7.5, 더 바람직하게는 약 6.7-7.3, 더욱 더 바람직하게는 약 7.0 이다. 비록 염이 인산염 완충액에 첨가되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 500 mM -1 M 범위, 더 바람직하게는 700-800 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 750 mM 이다. 동시에, Tris 완충액이 바람직하게는 30-70 mM, 더 바람직하게는 약 50 mM 의 농도로 인산염 완충액에 첨가될 수 있다.

이후, 제 1 단계에서 수득된 용리액의 rh α-Gal A-함유 분획은 컬럼에 적용된다. rh α-Gal A 가 결합되는 컬럼이 세척된 이후, rh α-Gal A 가 용리된다. 용리는 염으로 보강되지 않은 인산염 완충액에 의해 이루어질 수 있고, 여기서 인산염 완충액의 농도는 바람직하게는 3-10 mM, 더욱 더 바람직하게는 약 5mM 이다. 동시에, Tris 완충액은 바람직하게는 30-70 mM, 더 바람직하게는 약 50 mM 의 농도로 인산염 완충액에 첨가될 수 있다. 대안적으로 용리는 순수한 물에 의해 이루어질 수 있다.

포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 고체 상을 사용한 컬럼 크로마토그래피, 정제의 제 3 단계는 오염 단백질, 예컨대 카르복실 펩티다아제를 제거하는 단계이다. 비록 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 고체 상이 사용되는데 특별한 제한이 없기는 하지만, 수산화인회석 및 불화인회석이 바람직하게는 사용될 수 있고, 수산화인회석이 특히 바람직하다.

수산화인회석 컬럼이 사용되는 경우, 이는 염으로 보강된 인산염 완충액에 의해 평형화된다. 이러한 인산염 완충액의 pH 는 바람직하게는 6.5-7.5, 더 바람직하게는 약 6.8-7.2, 더욱 더 바람직하게는 약 7.0 이고, 인산염의 농도는 바람직하게는 3.0-20 mM, 더 바람직하게는 약 3-15 mM, 보다 바람직하게는 약 10 mM 이다. 비록 염이 인산염 완충액에 첨가되는데 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 800 mM 미만, 더 바람직하게는 10-200 mM 범위, 보다 바람직하게는 약 50 mM 이다. 동시에, Tris 완충액은 바람직하게는 30-70 mM, 더 바람직하게는 약 50 mM 의 농도로 인산염 완충액에 첨가될 수 있다.

이후 제 2 단계에서 수득된 용리액의 rh α-Gal A-함유 분획이 컬럼에 적용된다. rh α-Gal A 가 결합되는 컬럼이 세척된 이후, rh α-Gal A 가 용리된다. 용리는 염을 함유하는 인산염 완충액에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 인산염 완충액의 pH 는 바람직하게는 6.5-7.5, 더 바람직하게는 약 6.7-7.3, 더욱 더 바람직하게는 약 7.0 이고, 인산염의 농도는 바람직하게는 30-80 mM, 더 바람직하게는 40-60 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 45 mM 이다. 염이 사용되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 300 mM 미만, 더 바람직하게는 10-200 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 50 mM 범위이다.

양이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 정제 방법의 제 4 단계는 오염 단백질을 제거하기 위한 단계이다. 양이온-교환체가 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피에서 사용되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 약한 양이온 교환체가 바람직하고, 더 바람직한 것은 소수성 상호작용 및 수소 결합 형성 모두를 기반으로 하는 선택성을 갖는 약한 양이온 교환체이다. 예를 들어, 페닐 기, 아미드 결합 및 카르복실기를 갖고 소수성 상호작용 및 수소 결합 형성 모두를 기반으로 하는 선택성을 갖는 약한 양이온 교환체, 예컨대 Capto MMC (GE Healthcare) 등이 사용될 수 있다.

양이온-교환 컬럼 크로마토그래피에서, 컬럼은 염으로 보강된 아세테이트 완충액으로 평형화된다. 이러한 아세테이트 완충액의 pH 는 바람직하게는 4.5-6.5, 더 바람직하게는 약 5.0-6.0, 더욱 더 바람직하게는 약 5.5 이다. 염이 인산염 완충액에 첨가되는데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화칼슘이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 50-250 mM 범위, 더 바람직하게는 100-200 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 150 mM 이다.

이후 제 3 단계에서 수득된 용리액의 rh α-Gal A-함유 분획이 컬럼에 적용된다. rh α-Gal A 가 결합되는 컬럼이 세척된 이후, rh α-Gal A 는 증가된 pH (이는 바람직하게는 약 5.5-7.5 범위, 더 바람직하게는 약 6.0-7.0 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 6.5 임) 를 갖는 인산염 완충액을 사용해 용리된다.

염료-친화성 크로마토그래피, 정제의 제 5 단계는 오염물, 즉 숙주 세포 단백질 (HCP) 을 제거하는 방법이다. 청색 트리아진 염료가 바람직하게는 사용되지만, 다른 트리아진 염료가 또한 적합하다. 특히 바람직한 것은 하기 도식에 나타낸 블루 세파로오스 6 FF, 패스트 플로우 (GE Healthcare) (이는 염료, Cibacron^TM 블루 F3GA 가 공유 결합에 의해 부착된 세파로오스 6 패스트 플로우 매트릭스로 이루어짐) 이다.

도식 1

염료-친화성 크로마토그래피 컬럼은, 염으로 보강된 인산염 완충액에 의해 중성 pH, 바람직하게는 pH 6.8-7.2, 더 바람직하게는 약 pH 7.0 에서 또는 그 근처에서 평형화된다. 염이 인산염 완충액에 첨가되는 데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 50-150 mM 범위, 더 바람직하게는 100-150 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 125 mM 이다.

이후, 제 4 단계에서 수득된 용리액의 분획은 컬럼에 적용된다. rh α-Gal A 가 결합되는 컬럼이 세척된 이후, rh α-Gal A 는 증가된 농도의 염을 함유하는 인산염 완충액을 사용해 용리된다. 염이 인산염 완충액에 첨가되는 데에 특별한 제한이 없기는 하지만, 염화나트륨 및 염화칼륨이 바람직하다. 염화나트륨이 사용되는 경우, 이의 농도는 바람직하게는 400-750 mM 범위, 더 바람직하게는 400-500 mM 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 450 mM 이다. 트로메타몰 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄) 은 바람직하게는 40-60 mM, 더 바람직하게는 약 50 mM 의 농도로 완충액에 동시에 첨가될 수 있다.

겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 정제 방법의 제 6 단계는, 저분자량 불순물, 예컨대 내독소, 및 다량체성 착물 또는 rh α-Gal A 의 분해 생성물의 제거 단계이다. 따라서, 실질적으로 순수한 rh α-Gal A 는 정제 방법의 제 1 단계 내지 제 6 단계를 통해 수득된다.

추가로 하나 더 컬럼 크로마토그래피가 음이온-교환 크로마토그래피, 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 고체 상을 사용한 컬럼 크로마토그래피, 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 상기 언급된 정제 방법에 포함될 수 있다. 상기 추가 컬럼 크로마토그래피는 바람직하게는 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피이고, 이는 원하는 대로 상기 언급된 정제 방법의 두 인접 단계 사이에서 사용될 수 있다.

바이러스 불활성화 단계는 임의로는 본 발명의 정제 방법에 추가될 수 있다. 바이러스 불활성화 방법이 적용되는데 특별한 제한이 없기는 하지만, 용매-세제 방법이 바람직하게는 적용될 수 있다. 이를 위해, 비이온성 계면활성제가 rh α-Gal A 를 함유하는 용액에 첨가되고, 생성된 혼합물이 3 시간 초과 동안 인큐베이션된다. 계면활성제가 사용되는데 특별한 제한이 없기는 하지만, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 및 트리(n-부틸)포스페이트가 바람직하게는 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있고, 더 바람직하게는 폴리소르베이트 80 및 트리(n-부틸)포스페이트의 조합이 사용될 수 있다.

상기 추가 바이러스 불활성화 단계는 정제 방법 이전에 또는 상기 언급된 정제 방법의 임의의 두 인접한 단계 사이에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 또한 오염 숙주 세포 단백질을 함유하는 물질로부터 rh α-Gal A 의 정제 방법을 제공한다. 이 방법은 rh α-Gal A 를 제조하는데 사용된 숙주 세포에 내재하는 단백질 및 rh α-Gal A 를 함유하는 용액이 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피에 적용되는 단계를 포함한다. 이러한 단계의 주요 목적은 오염 숙주 세포 단백질을 제거하기 위한 것이다. 단계는 임의의 순서로 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 고체상을 사용한 컬럼 크로마토그래피 (즉 수산화인회석 컬럼 크로마토그래피) 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피로부터 선택된 하나 이상의 다른 정제 단계와 조합될 수 있다. 바람직하게는, 조합은 순서대로 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 고체 상을 사용하는 컬럼 크로마토그래피, 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피이다.

본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 인간 α-Gal A 조성물은 환자에게 주기적으로 투여되는 약제의 제조에서 사용하기에 적합하다. 약제는 정맥내 주사, 더 바람직하게는 정맥내 주입에 의해 투여되고, 바람직하게는 매주 1 회 내지 2 내지 4 주 마다 1 회, 더 바람직하게는 2 주 마다 1 회 환자에게 투여될 수 있다. 환자에 대한 1 회 투여에서 rh α-Gal A 의 양은 바람직하게는 0.1 내지 2 mg/체중 1 kg, 더 바람직하게는 0.1 내지 2 mg/체중 1 kg 일 수 있다. 약제는 사전충전된 주사기의 형태로 공급될 수 있다.

본 발명은 실시예와 관련하여 이하 더 상세하게 기재된다. 그러나, 본 발명이 실시예에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.

실시예 1

pE-gs/hGHpA(α-Gal A), rh α-Gal A 발현 벡터의 구축

pEF/myc/nuc 벡터 (Invitrogen) 를 KpnI 및 NcoI 에 의해 소화시켜, EF-1(알파) 프로모터 및 이의 제 1 인트론을 포함하는 DNA 단편을 절단하였고, 이를 이후 T4 DNA 폴리머라아제에 의해 평활 말단화 (blunt-ended) 하였다. 이후 이에 따라 제조된 DNA 단편을 pC1-neo 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하고, 이를 BglII 및 EcoRI 로 소화시킨 후, T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화하였다. 이에 삽입되는 것은 상기-언급된 평활 말단화 단편 예컨대 EF-1(α) 프로모터 및 이의 제 1 인트론이어서, pE-neo7 벡터를 생성한다 (도 1).

인간 성장 호르몬 유전자의 폴리 아데닐화 신호 서열을 함유하는 DNA 단편을 하기 4 개의 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 합성하였다: (a) hGH-f1 (ID NO:1), (b) hGH-r1 (SEQ ID NO:2), (c) hGH-f2 (SEQ ID NO:3), 및 (d) hGH-r2 (SEQ ID NO:4). 이에 따라 제조된 DNA 단편을 pE-neo7 의 MluI 및 KpnI 부위 사이에 삽입하여, pE-neo/hGHpA 벡터를 생성하였다 (도 1).

중국 햄스터 글루타민 합성효소 ("Ch GS" 또는 "GS") 코딩 영역의 5' 절반 (half) 을, 프라이머 세트, GS-1 (SEQ ID NO:5) 및 GS-3 (SEQ ID NO:6), 및 주형으로서, CHO 세포로부터 추출된 RNA 로부터 제조된 ssDNA 를 사용한 PCR 에 의해 증폭시켰다. Ch GS 코딩 영역의 3' 절반을 프라이머 세트, GS-2 (SEQ ID NO:7) 및 GS-4 (SEQ ID NO:8), 및 주형으로서, CHO 세포로부터 추출된 RNA 로부터 제조된 ssDNA 를 사용한 PCR 에 의해 증폭시켰다. 이후 증폭된 Ch GS 코딩 영역의 5' 절반을 pT7blue-T 벡터 (EMD Millipore) 에 라이게이션시켰다. 이렇게 수득된 벡터를 EcoRV 및 BamHI 로 소화시킨 후, EcoRV 및 BamHI 에 의한 소화 이후 증폭된 CH GS 코딩 영역의 3' 절반을 소화된 벡터에 삽입하여, Ch-GS 를 위한 전장 cDNA 를 함유하는 플라스미드 벡터를 수득하였다. 수득된 플라스미드는 pT7blue(GS) 로 지정하였다 (도 2a).

인간 α-Gal A 코딩 영역의 5' 절반을, 프라이머 세트, GAL-Mlu (SEQ ID NO:9) 및 GAL-Sca2 (SEQ ID NO:10), 및 주형으로서, 인간 태반 Quick-Clone^TM cDNA (Clontech) 를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다. 인간 α-Gal A 코딩 영역의 3' 절반을, 프라이머 세트, GAL-Sca1 (SEQ ID NO:11) 및 GAL-Xba (SEQ ID NO:12), 및 주형으로서, 인간 태반 Quick-Clone^TM cDNA (Clontech) 를 사용한 PCR 에 의해 증폭시켰다. 이후 모든 PCR 생성물을 pBluescriptSK(+) 벡터의 EcoRV 부위에 라이게이션시켰다. 인간 α-Gal A 코딩 영역의 5' 절반을 이후 이에 따라 수득된 벡터로부터 MluI 및 ScaI 를 사용한 소화에 의해 절제하고, 인간 α-Gal A 코딩 영역의 3' 절반을 벡터로부터 ScaI 및 NotI 을 사용한 소화에 의해 절제하였다. 이후 절제된 단편을 pE-neo 벡터에서 멀티 클로닝 부위의 MluI 및 NotI 부위에 동시에 삽입하여, 인간 α-Gal A 에 대한 전장 cDNA 를 수득하였다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pE-neo(α-Gal A) 로 지정하였다 (도 2b).

pE-neo/hGHpA 를 AfIII 및 BstXI 로 소화시키고, 이에 따라 소화된 벡터에 Ch-GS cDNA 를 삽입하고, 이를 AfIII 및 BstXI 을 사용한 소화에 의해 pT7blue(GS) 로부터 절제하였다. 수득된 플라스미드를 pE-gs/hGHpA 로 지정하였다 (도 2a). pE-gs/hGHpA 벡터를 MluI 및 NotI 로 소화시키고, 이에 따라 소화된 벡터에 pE-neo(α-Gal A) 로부터 MluI 및 NotI 을 사용한 소화에 의해 절제된 인간 α-Gal A cDNA 를 삽입하였다. pE-gs/hGHpA (α-Gal A) 로 지정된 수득한 플라스미드를 추가 실험에서 rh α-Gal A 발현 벡터로서 사용하였다 (도 2b).

실시예 2

rh α-Gal A 의 발현을 위한 재조합 세포의 제조

하기 방법에 따라 Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 상기-언급된 발현 벡터 pE-gs/hGHpA(α-Gal A) 에 의해 CHO 세포 (CHO-K1: American Type Culture Collection 로부터 구입) 를 트랜스펙션하였다. 간략하게, 트랜스펙션 2 일 전에, 5 % FCS 를 함유하는 3 ㎖ 의 D-MEM/F12 배지를 함유하는 3.5-cm 배양 접시 (D-MEM/F12/5%FCS) 에 2.5 x 10⁵개의CHO-K1 세포를 파종하고, 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습 분위기 하에 37 ℃ 에서 세포를 배양하였다. 배양 2 일 이후, 세포를 PBS 로 세척하고, 1 ㎖ 의 신선한 무혈청 D-MEM/F12 배지를 첨가했다. 이후 Opti-MEM^TM I 배지에 의해 20 ㎍/㎖ 으로 희석된 pE-gs/hGHpA(α-Gal A) 및 Opti-MEM^TM I 배지 (Life Technologies) 로 20 배 희석된 Lipofectamine^TM 2000 용액으로 이루어지는 1:1 혼합물 용액 200 ㎕ 의 첨가, 이후 5 시간 동안 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습 분위기 하에 37 ℃ 에서의 인큐베이션에 의해 세포를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 이후, 배지를 D-MEM/F12/5 % FCS 로 대체하고, 24 시간 동안의 배양이 뒤따랐다.

이후, 1 x GS 보충물 (SIGMA), 10% 투석된 FBS 및 30 마이크로몰/L 메티오닌 술폭시민 (MSX) 으로 보강된 무(無)글루타민 GMEM-S 배지 (SIGMA) 로 배지를 대체하고, 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습 분위기 하에 37 ℃ 에서 선택적 배양을 수행하였다. 선택적 배양을 위해 배지에서 성장된 세포를, 배지에서의 계대배양의 여러 연속적 라운드 (succesive round) 에 적용하여, 재조합 세포를 생성하였다. 선택적 배양 과정에서, 삽입된 재조합 유전자를 증폭시키기 위해 배지 중 MSX 의 농도를 단계적으로 상승시켰다. 마지막으로 300 마이크로몰/L MSX 을 갖는 배지에서 안정적으로 성장되는 벌크 세포를, 상승된 MSX 농도 (100 및 300 마이크로몰/L MSX) 에서의 2 단계 계대배양 이후 수득하였다.

이후, 제한 희석 기술에 따라, 증폭된 재조합 유전자를 갖는 세포를, 웰 마다 1 개 이하의 세포가 파종되는 방식으로 96-웰 플레이트에 증폭된 재조합 유전자를 갖는 세포를 파종하였다. 세포를 이후 약 10 일 동안 배양하여, 이들 각각이 단클론성 콜로니를 형성하게 하였다. 단클론성 콜로니가 형성된 웰에서 배양 상청액을 각각 샘플링하고, 이하 기재된 바와 같이 인간 α-Gal A 활성을 조사하고, 인간 α-Gal A 에 대해 높은 활성을 발현하는 것으로 밝혀진 세포주를 선택하였다.

무혈청 현탁액 세포 배양에 대한 적합화를 위해, 시판되는 무혈청 배지, 10 mg/L 인슐린, 40 mg/L 티미딘, 100 mg/L 히폭산틴 및 100 마이크로몰/L MSX 로 보강된 CD-OptiCHO^TM 배지 (Invitrogen) 중에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습 분위기 하에 37 ℃ 에서 세포가 안정적으로 성장할 때까지 선택된 세포주를 각각 배양하였다. 세포를 이후 10 mg/L 인슐린, 40 mg/L 티미딘, 100 mg/L 히폭산틴, 100 마이크로몰/L MSX 및 10% DMSO 로 보강된 CD-OptiCHO^TM 배지 (Invitrogen) 에 현탁시키고, 액체 질소 중에 종자 세포로서 저장하였다.

실시예 3

rh α-Gal A 의 발현을 위한 재조합 세포의 배양

상기 종자 세포를 해동하고, 4 x 10⁵ 개의 세포/㎖ 의 밀도로 희석하고, 10 mg/L 인슐린, 40 mg/L 티미딘, 100 mg/L 히폭산틴 및 100 마이크로몰/L MSX 로 보충된 CD-OptiCHO^TM 배지 (CD 배지) 에 의해 3 내지 4 일 동안 배양한 후, CD 배지에 의해 2 x 10⁵ 개의 세포/㎖ 의 밀도로 희석하고, 3 내지 4 일 동안 배양하였다. 이러한 세포를 또다시 CD 배지에 의해 2 x 10⁵ 개의 세포/㎖ 의 밀도로 희석하고, 3 내지 4 일 동안 추가 배양하였다.

이에 따라 배양된 세포의 수를 계수하고, 세포 배양액을 2 x 10⁵ 개의 세포/㎖ 의 밀도로 CD 배지에 의해 희석하고, 이후 1 ℓ 의 희석된 배양액 중의 세포를 수 일 동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양 부피가 200 L 를 달성할 때까지 배양 규모를 확대시켰다.

이후 세포의 수를 계수하고, 10 mg/L 인슐린, 40 mg/L 티미딘, 100 mg/L 히폭산틴 및 0.1% HY soy (Invitrogen) 로 보충된 1800 ℓ 의 CD-OptiCHO^TM 배지에 의해 2 x 10⁵ 개의 세포/㎖ 의 밀도로 세포를 희석하고, 11 일 동안 배양하였다. CD-OptiCHO^TM 중 8.84 g 인슐린, 35.2 mmol 히폭산틴, 5.6 mmol 티미딘 및 1.8 kg HY soy 를 함유하는 22.4 ℓ 의 공급 용액을 제 3 일, 제 5 일, 제 7 일 및 제 9 일째에 첨가하였다. 배양 동안 샘플링은 매일 이루어졌고, 세포 갯수, 생존율, 글루코오스 농도 및 발현된 rh α-Gal A 의 양에 대해 측정을 수행하였다. 글루코오스 농도가 3 g/ℓ 미만이 되는 경우, 농도가 3.5 g/ℓ 를 달성하도록 30% 글루코오스 용액을 첨가하였다. 배양 11 일 동안, 생세포 밀도 및 rh α-Gal A 의 농도를 매일 모니터링하였다. 생세포 밀도는 배양 제 6-7 일째에 약 6 x 10⁶ 개의 세포/㎖ 를 달성하여, 고밀도 세포 배양이 성공적으로 달성되었음을 나타냈다 (도 3). 아래에 기재된 ELISA 에 의해 측정되는 바와 같이, 세포에 의해 분비된 rh α-Gal A 의 배지 중 농도는 시간에 걸쳐 증가하였고, 제 6 일째에 거의 140 mg/ℓ 를 달성하였다 (도 3).

상기 배양 완료 이후, 세포 배양액을 수집하고, 연속하여 Millistak+^TM HC Pod Filter grade D0HC (Millipore), Millistak+^TM HC Pod Filter grade X0HC (Millipore), 및 이후 Durapore Opticap^TM XLT20 (0.22 ㎛, Millipore) 를 통해 여과하여, 배양 상청액을 생성하였다. 수득된 배양 상청액을 PS 막 (폴리술폰 막) 이 장착된 중공 섬유 모듈에 의해 본래의 부피의 1/13 으로 농축하였다.

실시예 4

바이러스 불활성화

상기 기재된 약 75 ℓ 의 농축된 배양 상청액에 트리-n-부틸 포스페이트 (TNBP) 및 폴리소르베이트 80 을 이의 최종 농도가 각각 0.3 %(v/v) 및 1 %(w/v) 이도록 첨가하고, 이러한 혼합물 용액을 이후 3 내지 4 시간 동안 실온에서 가볍게 교반하였다.

실시예 5

rh α-Gal A 의 정제 방법

상기 바이러스-불활성화된 용액의 pH 를 이후 1 M Tris-완충액 (pH 8.8) 의 첨가에 의해 7.5 로 조정하고, 이후 전도도를 1 M NaCl 을 함유하는 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 의 첨가에 의해 50 mM NaCl 을 함유하는 10 mM 인산염 완충액 (pH7.5) 의 것으로 조정하였다. 이후 용액을 Durapore Opticap^TM XL10 (Millipore) 를 통해 여과하고, 이후 컬럼에 의해 rh α-Gal A 가 흡착되게 하기 위해 150 cm/hr 의 선형 유속으로 50 mM NaCl 을 함유하는 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.5) 에 의해 평형화된 Q 세파로오스 패스트 플로우 컬럼 (컬럼 용적: 약 19.2 L, 층 높이: 약 20 cm, GE Healthcare), 음이온-교환 컬럼에 로딩하였다. 이후, 컬럼을 동일한 유속으로 공급된 동일한 완충액 컬럼 용적 3 배로 세척하고, 흡착된 rh α-Gal A 를 225 mM NaCl 을 함유하는 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.5) 컬럼 용적 6 배, 이후 1 M NaCl 을 함유하는 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 컬럼 용적 3 배로 용리시키고, rh α-Gal A 를 함유하는 분획을 수집하였다.

상기 Q 세파로오스 패스트 플로우 컬럼 크로마토그래피 단계에서 수집된 분획에, 1/4 부피의 2 M NaCl 을 첨가하여, NaCl 의 농도를 약 500 mM 로 조정하고, 이후 아세트산을 첨가하여, pH 를 7.0 으로 조정하였다. rh α-Gal A 가 컬럼에 의해 흡착되는 것을 허용하는 150 cm/hr 의 선형 유속으로, 50 mM Tris-HCl, 750 mM NaCl 을 함유하는 5 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화된 페닐 세파로오스 6 패스트 플로우 컬럼 (컬럼 용적: 19.2 L, 층 높이: 약 20 cm, GE Healthcare), 소수성 컬럼에 수득된 용액을 로딩하였다. 컬럼을 동일한 유속으로 공급된 컬럼 용적 3 배의 동일한 완충액으로 세척한 이후, 흡착된 rh α-Gal A 를 컬럼 용적 9 배의 50 mM Tris-HCl 및 5 mM 인산염으로 이루어지는 완충액 (pH 7.0), 및 이후 컬럼 용적 3 배의 순수한 물로 용리시키고, rh α-Gal A 를 함유하는 분획을 수집하였다.

상기 페닐 세파로오스 6 패스트 플로우 컬럼 크로마토그래피 단계에서 수집된 분획을, rh α-Gal A 가 컬럼에 의해 흡착되게 하는 150 cm/hr 의 선형 유속으로, 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl 을 함유하는 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화된 CHT-I 세라믹 수산화인회석 컬럼 (컬럼 용적: 19.2 L, 층 높이: 약 20 cm, Bio-Rad Laboratories), 수산화인회석 컬럼에 로딩하였다. 이후, 컬럼을 동일한 유속으로 공급된 동일한 완충액 컬럼 용적 5 배로 세척하고, 흡착된 rh α-Gal A 를 이후 50 mM Tris-HCl, 45 mM 나트륨 포스페이트 및 50 mM NaCl 을 함유하는 완충액 (pH 7.0) 컬럼 용적 9 배로, 및 이후 200 mM 인산염 완충액 (pH7.0) 컬럼 용적 3 배로 용리시키고, rh α-Gal A 를 함유하는 분획을 수집하였다.

상기 CHT-I 세라믹 수산화인회석 컬럼 크로마토그래피 단계에서 수집된 분획에, 아세트산을 첨가하여 pH 를 5.5 로 조정하였다. 이에 의해 형성된 침전물을 Opticap^TM SHC XL5 (0.22 ㎛, Millipore) 를 통해 여과 제거하였다. 수득된 용액을, rh α-Gal A 가 컬럼에 의해 흡착되게 하는 300 cm/hr 의 선형 유속으로 150 mM NaCl 을 함유하는 50 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5) 으로 평형화된 Capto^TM MMC 컬럼 (컬럼 용적: 6.3 L, 층 높이: 약 20 cm, GE Healthcare), 소수성 상호작용 및 수소 결합 형성 모두를 기반으로 하는 선택성을 갖는 양이온-교환 컬럼에 로딩하였다. 이후 컬럼을 동일한 유속으로 공급된 동일한 완충액 컬럼 용적 4 배로 세척한 후에, 흡착된 rh α-Gal A 를 50 mM 인산염 완충액 (pH6.5) 컬럼 용적 5 배, 및 이후 1 M NaCl 을 함유하는 50 mM 인산염 완충액 (pH7.0) 컬럼 용적 3 배로 용리시키고, rh α-Gal A 를 함유하는 분획을 수집하였다.

상기 Capto^TM MMC 컬럼 크로마토그래피 단계에서 수집된 분획에, 1M Tris 완충액 (pH8.8) 을 첨가하여, pH 를 7.0 으로 조정하였다. 수득된 용액의 절반을, rh α-Gal A 가 컬럼에 의해 흡착되는 것을 허용하는 150 cm/hr 의 선형 유속으로 공급된 125 mM NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화된 블루 세파로오스 6FF 컬럼 (컬럼 용적: 약 19.2 L, 층 높이: 약 20 cm, GE Healthcare) 에 로딩하였다. 그리고 이후, 컬럼을 동일한 유속으로 공급된 125 mM NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 컬럼 용적 3 배로 세척하고, 흡착된 rh α-Gal A 를 이후 동일한 유속으로 공급된 450 mM NaCl 을 함유하는 50mM Tris-HCl / 5 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 컬럼 용적 4 배로 용리하고, rh α-Gal A 를 함유하는 분획을 수집하였다. 용액의 다른 절반을 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 순차적으로 처리하였다. rh α-Gal A 를 함유하는 수집된 분획을 추가 정제를 위해 합쳤다.

상기 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피 단계에서 수집된 분획을, 총 부피가 1 ℓ 미만이 될 때까지 Biomax^TM 30 막 (Millipore) 이 장착된 Pellicon^TM 3 카세트를 사용하여 농축하였다. 농축된 용액의 1/3 을, 137 mM NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액 (pH 5.8) 으로 평형화된 Superdex^TM 200 prep 등급 컬럼 (컬럼 용적: 약 58 L, 층 높이: 약 30 cm x 2, GE Healthcare) 에 로딩하였다. 동일한 완충액을 이후 25 cm/hr 의 선형 유속으로 공급하고, 280 nm 에서의 흡광도에 의해 관찰된 주요 피크에 해당하는 분획을 정제된 rh α-Gal A 를 함유하는 분획으로서 수집하였다. 이러한 크로마토그래피를 3 회 수행하여, 상기 농축 용액 모두를 정제하고, 각 런에 의해 수집된 분획을 합쳤다.

상기 Superdex^TM 200 prep 등급 컬럼 크로마토그래피 단계에서 풀링된 분획을, PS 막이 장착된 중공 섬유 모듈에 의해 농축하고, 농축된 용액에 폴리소르베이트 80 을 0.02% 의 최종 농도로 첨가하였다. 수득된 용액을 Viresolve^TM Pro Modus1.3 (0.07 m² 크기, Millipore) 을 통해 여과하여, 최종 생성물 중 바이러스 및 미생물에 의한 임의의 가능한 오염을 회피하였다.

각 정제 단계에서, 로딩된 물질에 함유된 rh α-Gal A 의 양 및 수집된 분획 중 회수된 rh α-Gal A 의 양을 이하 기재되는 바와 같이 ELISA 를 사용해 정량화하였다. 결과는 표 1 에 나타나 있다. 표에서, "rh α-Gal A 회수율/단계" 는 단계에서 로딩된 rh α-Gal A 의 것에 대한 단계에서 회수된 rh α-Gal A 의 양의 비율을 의미하고, "rh α-Gal A 회수율/총" 은 정제 방법에 적용되는 rh α-Gal A 의 초기 양에 대한 단계에서 회수된 rh α-Gal A 의 양의 비율을 의미한다. 정제 방법에 적용되는 rh α-Gal A 의 초기 양은 140.6 g 이었고, 이 중 91.4 g 이 마지막으로 회수되었고, 이에 따라 65.0% 만큼 높은 rh α-Gal A 회수율/총 을 산출하였다. 이러한 결과는 상기 기재된 정제 방법이 큰 제조 규모로 및 매우 고수율로의 rh α-Gal A 의 정제를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.

[표 1]

표 1. 각 정제 단계에서 rh α-Gal A 의 회수율

실시예 6

ELISA 에 의한 인간 α-Gal A 의 분석

0.05 M 카르보네이트-바이카르보네이트 완충액 (pH 9.6) 으로 0.25 ㎍/㎖ 로 희석된 100 ㎕ 의 마우스 항-인간 α-Gal A 단클론성 항체를, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 의 웰 각각에 첨가하고, 플레이트를 2-8 ℃ 에서 밤새 또는 실온에서 1 시간 이상 동안 건드리지 않고 두어, 항체가 웰에 의해 흡수되게 하였다. 이후, 각 웰을 0.05% Tween 20 (PBS-T) 을 함유하는 인산염 완충 염수, pH 7.4 (PBS) 로 세척하고, 1% BSA 를 함유하는 300 ㎕ 의 PBS-T 를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1 시간 동안 건드리지 않고 두었다. 이후, 각각의 웰을 PBS-T 로 3 회 세척한 후, 0.5% BSA 및 0.05% Tween 20 (PBS-BT) 을 함유하는 PBS 로 원하는 대로 희석된 100 ㎕ 의 시험 샘플 또는 인간 α-Gal A 표준을 웰에 첨가하고, 플레이트를 1 시간 이상 동안 실온에서 건드리지 않고 두었다. 이후, 각 웰을 PBS-T 로 3 회 세척한 후에, PBS-BT 로 희석된 100 ㎕ 의 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-표지된 토끼 항-인간 α-Gal A 다클론성 항체를 첨가하고, 플레이트를 1 시간 이상 동안 건드리지 않고 두었다. 이후, 각각의 웰을 PBS-T 로 3 회 세척한 후에, 0.009% 과산화수소를 함유하는 인산염-시트레이트 완충액 (pH 5.0) 과 함께 0.4 mg/㎖ o-페닐렌디아민 100 ㎕ 를 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10 내지 25 분 동안 건드리지 않고 두었다. 이후, 0.1 ㎖ 의 1 mol/ℓ H₂SO₄ 을 각 웰에 첨가하여 반응을 멈추고, 490 nm 에서의 광학 밀도를 96-웰 플레이트 리더에서 웰에 대해 측정하였다.

실시예 7

rh α-Gal A 의 활성의 측정

0 내지 200 마이크로몰/ℓ 의 농도로 희석 완충액 (26.7mM 시트레이트-44.8 mM 인산염 완충액, pH 4.6, 0.1 mg/㎖ BSA 함유) 에 4-메틸엄벨리페론을 용해시켜 표준 용액을 제조하였다. 5 mM 의 최종 농도로 희석 완충액에 4-메틸엄벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드 (SIGMA) 를 용해시켜 기질 용액을 제조하였다. 희석 완충액으로 희석된 시험 샘플 또는 표준 용액 각각 10 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (FluoroNunc Plate, Nunc) 의 각 웰에 첨가하였다. 희석된 시험 샘플 또는 표준 용액 중 어느 하나를 함유하는 각 웰에 75 ㎕ 의 기질 용액을 첨가하고, 플레이트를 1 시간 동안 37 ℃ 에서 어둠 하에 건드리지 않고 두었다. 이러한 인큐베이션 이후, 200 ㎕ 의 정지 완충액 (stop buffer) (0.2 M 글리신-NaOH, pH 10.6) 을 각 웰에 첨가하였다. 이후 각 웰에서 용액의 형광 강도를 335 nm 의 파장에서의 여기 광 및 460 nm 의 파장에서의 형광 광에 의해 96-웰 플레이트 리더에 의하여 측정하였다.

표준 용액의 측정된 형광 강도의 플롯팅하고 플롯팅된 데이터 지점 사이의 삽입에 의해 표준 곡선을 생성하였다. 각 샘플의 형광 강도는 표준 곡선을 사용한 방출된 4-MUF 의 농도에 해당하였다. 인간 α-Gal A 의 고유 활성을 Unit/mg 로 계산하였고, 여기서 활성 1 Unit 은 37 ℃ 에서 분 당 제조된 4-MUF 1 마이크로몰이었다. 공개된 US 특허 출원 (공개 번호 2004-0229250) 이 상기 rh α-Gal A 의 활성의 측정을 수행하기 위해 참조되었다. 상기 기재된 방법에 의해 정제된 rh α-Gal A 의 고유 활성은 약 50 U/mg (48.3 내지 53.7 U/mg) 인 것으로 밝혀졌다.

실시예 8

rh α-Gal A 의 순도 분석

상기 정제된 rh α-Gal A 5 ㎍ 을 환원성, 가열 (70 ℃ 10 min.) 조건 하에 SDS-PAGE 전기영동에 적용하였다. Coomassie brilliant blue 에 의한 겔-염색은 Superdex^TM 200pg 분획에서 rh α-Gal A 에 상응하는 단일 밴드를 나타냈다 (도 4).

또한, 상기 정제된 rh α-Gal A 를 크기-제거 HPLC (SE-HPLC) 에 의해 분석하였다. LC-20A 시스템, SPD-20AV UV/VIS 검출기 (Shimazu Corp.) 를 사용해 HPLC 를 수행하였다. SE-HPLC 분석의 경우, 상기 정제된 rh α-Gal A 2 mg/㎖ 를 함유하는 10 ㎕ 의 샘플 용액을, 0.5 ㎖/min 의 유속으로 25 mM 인산염 완충된 염수 (PBS) 로 평형화된 TSKgel G3000SW_XL컬럼 (7.8 mm I.D. x 30 cm, TOSOH) 에 적용하였다. 215 nm 에서의 흡광도를 모니터링하여 용리 프로파일을 생성하였다.

상기 정제된 rh α-Gal A 의 SE-HPLC 분석은 단일 피크를 단독으로 나타냈다 (도 5). 이 결과는 상기 수득된 rh α-Gal A 가 고순도이고 임의의 검출가능한 오염물이 없다는 것을 나타냈다. 이 결과는 상기 정제된 rh α-Gal A 가 의약물로서 직접 사용될 수 있는 정도의 고순도임을 입증한다.

실시예 9

숙주 세포 단백질 (HCP) 의 측정

각각의 정제 단계 1 내지 6 에서 수집된 rh α-Gal A-활성 분획의 풀에 존재하는 오염 숙주 세포 단백질 (HCP) 의 양을 통상적인 방식으로 ELISA 에 의해 정량화하고, 풀에 함유된 rh α-Gal A 의 양과 비교하였다. 결과는 rh α-Gal A 에 대한 HCP 의 질량비인 "HCP/rh α-Gal A (ppm)" 로서 표 1 에 나타냈다. 표 1 에 나타낸 바와 같이, 최종 정제 단계 이후 비율은 20 ppm (이에 따라 정제된 rh α-Gal A 가 주사에 의해 반복적으로 인간에게 투여되는 약제로서 사용되는 것을 허용하기에 충분히 낮은 수준) 만큼 낮았다.

정제 방법 단계 중에서, 5 번째, 염료-친화성 크로마토그래피는, 이로 오염된 rh α-Gal A 로부터 HCP 를 제거하는데 가장 효과적이었다. 즉, 이 단계에서, 거의 97 % 의 HCP 가 제거되었고, HCP/rh α-Gal A 의 비율은 8.6 x 10³ ppm 로부터 2.5 x 10² ppm 로 감소하였다. 결과는 염료-친화성 크로마토그래피가 rh α-Gal A 제제로부터 HCP 를 제거하기에 현저하게 효과적인 방식임을 나타낸다.

산업상 이용가능성

본 발명은 패브리 증후군을 겪는 환자에게 약제로서 투여되기에 충분한 고순도로, rh α-갈락토시다아제 A (rh α-Gal A) 를 대규모로 제조하는데 사용된다.

서열 목록 자유 텍스트

SEQ ID NO:1 = hGH-f1, 합성 서열

SEQ ID NO:2 = hGH-r1, 합성 서열

SEQ ID NO:3 = hGH-f2, 합성 서열

SEQ ID NO:4 = hGH-r2, 합성 서열

SEQ ID NO:5 = 프라이머 GS-1, 합성 서열

SEQ ID NO:6 = 프라이머 GS-3, 합성 서열

SEQ ID NO:7 = 프라이머 GS-2, 합성 서열

SEQ ID NO:8 = 프라이머 GS-4, 합성 서열

SEQ ID NO:9 = 프라이머 GAL-Mlu, 합성 서열

SEQ ID NO:10 = 프라이머 GAL-Sca2, 합성 서열

SEQ ID NO:11 = 프라이머 GAL-Sca1, 합성 서열

SEQ ID NO:12 = 프라이머 GAL-Xba, 합성 서열

SEQUENCE LISTING <110> JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD FUKUI, Tsuyoshi KAWASAKI, Atsuko HATANO, Yukichi ITO, Yae MIHARA, Kazutoshi SUGIMURA, Atsushi <120> METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN ALPHA-GALACTOSIDASE A FROM MATERIAL CONTAINING CONTAMINANT HOST CELL PROTEINS <130> GP183-PCT <150> PCT/JP2015/000290 <151> 2015-01-22 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH-f1, synthetic sequence <400> 1 cgcgtgaatt cgcggccgct ctagacccgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc 60 tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaa 114 <210> 2 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH-r1, synthetic sequence <400> 2 tgatgcaact taattttatt aggacaaggc tggtgggcac tggagtggca acttccaggg 60 ccaggagagg cactggggag gggtcacagg gatgccaccc gggtctagag cggccgcgaa 120 ttca 124 <210> 3 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH-f2, synthetic sequence <400> 3 attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat aatagcgcag caccatggcc 60 tgaaataacc tctgaaagag gaacttggtt aggtac 96 <210> 4 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH-r2, synthetic sequence <400> 4 ctaaccaagt tcctctttca gaggttattt caggccatgg tgctgcgcta ttatagaagg 60 acacctagtc agacaaaa 78 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS-1, synthetic sequence <400> 5 cttaagatgg ccacctcagc aagtt 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS-3, synthetic sequence <400> 6 acgatatccc tgccataggc tttgtct 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS-2, synthetic sequence <400> 7 agacaaagcc tatggcaggg atatcgt 27 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS-4, synthetic sequence <400> 8 ccatcgtgat ggttagtttt tgtattggaa 30 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAL-Mlu, synthetic sequence <400> 9 ggtacgcgtg acaatgcagc tgagga 26 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAL-Sca2, synthetic sequence <400> 10 gtgattgcag tactgtcgga t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAL-Sca1, synthetic sequence <400> 11 atccgacagt actgcaatca c 21 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAL-Xba, synthetic sequence <400> 12 gagtctagat tttaaagtaa gtcttttaat gacat 35 <210> 13 <211> 1290 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1290) <400> 13 atg cag ctg agg aac cca gaa cta cat ctg ggc tgc gcg ctt gcg ctt 48 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 cgc ttc ctg gcc ctc gtt tcc tgg gac atc cct ggg gct aga gca ctg 96 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 gac aat gga ttg gca agg acg cct acc atg ggc tgg ctg cac tgg gag 144 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 cgc ttc atg tgc aac ctt gac tgc cag gaa gag cca gat tcc tgc atc 192 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 agt gag aag ctc ttc atg gag atg gca gag ctc atg gtc tca gaa ggc 240 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 tgg aag gat gca ggt tat gag tac ctc tgc att gat gac tgt tgg atg 288 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 gct ccc caa aga gat tca gaa ggc aga ctt cag gca gac cct cag cgc 336 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 ttt cct cat ggg att cgc cag cta gct aat tat gtt cac agc aaa gga 384 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 ctg aag cta ggg att tat gca gat gtt gga aat aaa acc tgc gca ggc 432 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 ttc cct ggg agt ttt gga tac tac gac att gat gcc cag acc ttt gct 480 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 gac tgg gga gta gat ctg cta aaa ttt gat ggt tgt tac tgt gac agt 528 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 ttg gaa aat ttg gca gat ggt tat aag cac atg tcc ttg gcc ctg aat 576 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 agg act ggc aga agc att gtg tac tcc tgt gag tgg cct ctt tat atg 624 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 tgg ccc ttt caa aag ccc aat tat aca gaa atc cga cag tac tgc aat 672 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 cac tgg cga aat ttt gct gac att gat gat tcc tgg aaa agt ata aag 720 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 agt atc ttg gac tgg aca tct ttt aac cag gag aga att gtt gat gtt 768 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 gct gga cca ggg ggt tgg aat gac cca gat atg tta gtg att ggc aac 816 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 ttt ggc ctc agc tgg aat cag caa gta act cag atg gcc ctc tgg gct 864 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 atc atg gct gct cct tta ttc atg tct aat gac ctc cga cac atc agc 912 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 cct caa gcc aaa gct ctc ctt cag gat aag gac gta att gcc atc aat 960 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 cag gac ccc ttg ggc aag caa ggg tac cag ctt aga cag gga gac aac 1008 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 ttt gaa gtg tgg gaa cga cct ctc tca ggc tta gcc tgg gct gta gct 1056 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 atg ata aac cgg cag gag att ggt gga cct cgc tct tat acc atc gca 1104 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 gtt gct tcc ctg ggt aaa gga gtg gcc tgt aat cct gcc tgc ttc atc 1152 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 aca cag ctc ctc cct gtg aaa agg aag cta ggg ttc tat gaa tgg act 1200 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 tca agg tta aga agt cac ata aat ccc aca ggc act gtt ttg ctt cag 1248 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 cta gaa aat aca atg cag atg tca tta aaa gac tta ctt taa 1290 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 14 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425

Claims

하기 단계를 순서대로 포함하는, 재조합 인간 α-Gal A 의 제조 방법:
(a) 무혈청 배지에서 재조합 인간 α-Gal A-생성 포유동물 세포를 배양하여, 이것이 배지에 재조합 인간 α-Gal A 를 분비하게 하는 단계,
(b) 상기 단계 (a) 에서 수득되는 배양액으로부터 세포를 제거하여 배양 상청액을 수집하는 단계,
(c) 상기 단계 (b) 에서 수집된 배양 상청액을 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A -활성 분획을 수집하는 단계,
(d) 상기 단계 (c) 에서 수집된 분획을 소수성 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A-활성 분획을 수집하는 단계,
(e) 상기 단계 (d) 에서 수집된 분획을 포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질을 고체 상으로서 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A-활성 분획을 수집하는 단계,
(f) 상기 단계 (e) 에서 수집된 분획을 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A -활성 분획을 수집하는 단계,
(g) 상기 단계 (f) 에서 수집된 분획을 염료-친화성 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A -활성 분획을 수집하는 단계, 및
(h) 상기 단계 (g) 에서 수집된 분획을 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 재조합 인간 α-Gal A-활성 분획을 수집하는 단계.
제 1 항에 있어서,
양이온-교환 컬럼 크로마토그래피에서 사용된 양이온 교환체가 약한 양이온 교환체인 방법.
제 2 항에 있어서,
약한 양이온 교환체가 소수성 상호작용 및 수소 결합 형성 모두를 기반으로 하는 선택성을 갖는 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
약한 양이온 교환체가 페닐 기, 아미드 결합 및 카르복실 기를 갖는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
염료-친화성 컬럼 크로마토그래피에서 사용된 염료가 청색 트리아진 염료인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질이 수산화인회석 및 불화인회석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제 6 항에 있어서,
포스페이트 기에 대한 친화성을 갖는 물질이 수산화인회석인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
포유동물 세포가 EF-1(α) 프로모터의 조절 하에 재조합 인간 α-Gal A 를 발현하도록 고안되는 발현 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포인 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 인간 α-Gal A 조성물.
환자에게 주기적으로 투여되는 제 9 항에 따른 조성물을 포함하는 약제.
제 10 항에 있어서,
환자에게 주사로 투여되는 약제.