JP6749042B2 - 汚染物質たる宿主細胞タンパク質を含む材料からの組換えヒトα−ガラクトシダーゼAの精製方法 - Google Patents
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Description
1.組換えヒトα-ガラクトシダーゼAの製造方法であって,
(a)無血清培地中で組換えヒトα-GalA産生哺乳類細胞を培養して組換えヒトα-GalAを培地中に分泌させるステップ,
(b)上記ステップ(a)で得られた培養物から細胞を除去することにより培養上清を回収するステップ,
(c)上記ステップ(b)で回収された培養上清を,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(d)上記ステップ(c)で回収された画分を,疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(e)上記ステップ(d)で回収された画分を,リン酸残基に親和性を有する材料を固相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(f)上記ステップ(e)で回収された画分を,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(g)上記ステップ(f)で回収された画分を,色素親和性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,及び
(h)上記ステップ(g)で回収された画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ
をこの順序で含んでなるものである,方法。
2.前記1の方法であって,該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂が弱陽イオン交換樹脂である,方法。
3.前記2の方法であって,該弱陽イオン交換樹脂が疎水性相互作用と水素結合形成との双方に基づく選択性を有するものである,方法。
4.前記2又は3の方法であって,該弱陽イオン交換樹脂が,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を有するものである,方法。
5.前記1〜4の何れかの方法であって,色素親和性クロマトグラフィーにおいて用いられる色素がブルートリアジン色素である,方法。
6.前記1〜5の何れかの方法であって,リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである,方法。
7.上記6の方法であって,リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイトである,方法。
8.前記1〜7の何れかの方法であって,該哺乳類細胞が,EF−1(α)プロモーターの制御下に組換えヒトα-GalAを発現するように設計された発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞である,方法。
9.上記1〜8の何れかの方法により製造される組換えヒトα-GalA組成物。
10.前記9の組成物を含んでなる,患者に定期的に投与される医薬。
11.前記10の医薬であって,注射により患者に投与されるものである医薬。
pEF/myc/nuc ベクター(Invitrogen)をKpnI及びNcoIで消化してEF-1(α)プロモーターとその第1イントロンとを含んだ断片を切り出し,これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した。こうして調製されたDNA断片を,BglIIとEcoRIで消化し次いでT4 DNAポリメラーゼ平滑末端化しておいたpC1-neoベクター(Invitrogen)に挿入した。これに,上述のEF-1(α)プロモーター及びその第1イントロンを含んだ平滑末端化断片を挿入し,pE-neo7ベクターを得た(図1)。
CHO細胞(CHO-K1:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手)を,次の方法により,LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)を用いて上述の発現ベクターpE-gs/hGHpA(α-GalA)で,トランスフェクトした。概略するに,トランスフェクションの2日前に,5%FCSを含有するD-MEM/F12培地FCS (D-MEM/F12/5%FCS) 3mLを含んだ3.5cmの培養皿に2.5×105 個のCHO-K1細胞を播種し,細胞を5%CO2及び95%空気からなる湿潤雰囲気下37℃で培養した。2日間の培養の後,細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し,新鮮な血清不含D-MEM/F12培地1mLを加えた。次いで,細胞を,Opti-MEMTM I培地(Life Technologies)で20倍稀釈したLipofectamine%TM 2000溶液とOpti-MEMTM I培地で20μg/mLに希釈したpE-gs/hGHpA(α-GalA)溶液との1:1混合液の200μLを添加してトランスフェクトし,続いて,5%CO2及び95%空気の加湿雰囲気下に37℃で5時間培養した。トランスフェクション後,培地をD-MEM/F12/5%FCSに交換し,更に24時間培養した。
上記の細胞を解凍して4×105 個/mLの密度に希釈し,10 mg/Lのインスリン,40 mg/Lのチミジン,100 mg/Lのヒポキサンチン及び100 μmol/LのMSXを補充したCD-OptiCHOTM培地(CD培地)で3〜4日間培養し,次いでCD培地で2×105 個/mLの密度に希釈し,3〜4日間培養した。これらの細胞を,再度CD培地で2×105 個/mLの密度に希釈し,更に3〜4日間培養した。
約75Lの上記濃縮培養上清に,リン酸トリ−n−ブチル(TNBP)及びポリソルベート80を,それらの終濃度がそれぞれ0.3%(v/v)及び1%(v/v)となるように加え,この混合液を次いで,室温にて3〜4時間,緩やかに撹拌した。
上記のウイルス不活化後の溶液のpHを,1Mトリス緩衝液(pH8.8)の添加により7.5に調整し,次いで,1M塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.0)の添加により,電気伝導度を,50 mM塩化ナトリウムを含有する10 mMリン酸緩衝液(pH7.5)のそれに調整した。次いで,Durapore OpticapTM XL10(Millipore)により溶液を濾過し,次いで,50 mM塩化ナトリウムを含む10 mMリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化しておいた陰イオン交換カラムであるQ Sepharose Fast Flow カラム(カラム体積:約19.2 L,ベッド高:約20 cm,GE Healthcare)に流速150 cm/時で負荷して,rh α-GalAをカラムに吸着させた。次いで,カラム体積の3倍量の,同じ流速で供給される同じ緩衝液でカラムを洗浄し,次いで吸着されていたrh α-GalAを,カラム体積の6倍量の225 mM塩化ナトリウム含有10 mMリン酸緩衝液(pH7.5)で,そして引き続きカラム体積の3倍量の1M 塩化ナトリウム含有50 mMリン酸緩衝液(pH7.0)で溶出させ,rh α-GalA含有画分を回収した。
96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc)の各ウェルに,0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH9.6)で25 mg/mLに希釈した100μLのマウス抗ヒトα-GalAモノクローナル抗体を加え,プレートを室温で少なくとも1時間,又は2〜8℃で終夜静置して,抗体をウェルに吸着させた。次いで, PBS-T(0.05%のTween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS),pH7.4)で各ウェルを洗浄した後,1%のBSAを含有するPBS-T 300μLを加え,プレートを室温にて少なくとも1時間静置した。次いで,PBS-Tで各ウェルを3回洗浄した後,0.5%のBSA及び0.05%のTween 20を含んだPBS(PBS-BT)で所望により希釈しておいた試験サンプル又はヒトα-GalA標準の100μLをウェルに加え,プレートを室温にて少なくとも1時間静置した。次いで,各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後,PBS-Tで希釈したセイヨウワサビ・パーオキシダーゼ標識化兎抗ヒトα-GalAポリクローナル抗体の100μLを添加して,プレートを室温にて少なくとも1時間静置した。次いで,各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後,0.009%過酸化水素を含有する0.4 mg/mLのo−フェニレンジアミン含有リン酸−クエン酸緩衝液(pH5.0)をウェルに加え,室温にてプレートを10〜25分間静置した。次いで,各ウェルに1 mol/Lの硫酸0.1 mLを加えて反応を停止させ,96ウェルプレートリーダーにより490 nmでの吸光度を測定した。
希釈用緩衝液(26.7 mM クエン酸−44.8mMリン酸緩衝液,pH4.6,0.1 mg/mL BSAを含有)に0〜200μmol/Lの濃度で4−メチルウンベリフェロンを溶解することにより,標準溶液を調製した。基質溶液は,4−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトピラノシド(SIGMA)を希釈用緩衝液に終濃度5 mMになるように溶解させることにより,調製した。希釈用緩衝液で希釈した各標準溶液又は標準溶液の10μLを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた(FluoroNunc Plate, Nunc)。希釈された試験サンプル又は標準溶液を含んだ各ウェルに。75μLの基質溶液を加え,プレートを37℃にて少なくとも1時間,暗所に静置した。このインキュベーションの後,200μLのStop Buffer (0.2M グリシン−水酸化ナトリウム, pH10.6)を各ウェルに加えた。次いで,各ウェルの蛍光強度を,96ウェルプレートリーダーにより,波長335 nmの励起光及び波長460 nmの蛍光で測定した。
上記で精製されたrh α-GalAの5 mgを,還元性の加熱(70℃10分)条件下でのSDS-PAGE電気泳動に付した。クマシーブリリアントブルーで染色したゲルは,SuperdexTM 200pg 画分中のrh α-GalAに対応する単一バンドを示した(図4)。
精製ステップ1〜6の各々において回収されたrh α-GalAのプール中に存在する汚染物である宿主細胞タンパク質の量をELIZAにより慣用の仕方で測定し,当該プールに含まれるrh α-GalAの量と比較した。結果を,「HCP/rh α-GalA(ppm)」として表1に示しており,これはrh α-GalAに対するHCPsの質量の比率である。表1に示されたように,この比率は,最終ステップの精製後には,20 ppmと低く,このrh α-GalAを注射により反復してヒトに投与する医薬として使用することを許容するに十分低いレベルである。
配列番号2=hGH-r1,合成配列
配列番号3=hGH-f2,合成配列
配列番号4=hGH-r2,合成配列
配列番号5=プライマーGS-1,合成配列
配列番号6=プライマーGS-3,合成配列
配列番号7=プライマーGS-2,合成配列
配列番号8=プライマーGS-4,合成配列
配列番号9=プライマーGAL-Mlu,合成配列
配列番号10=プライマーGAL-Sca2,合成配列
配列番号11=プライマーGAL-Sca1,合成配列
配列番号12=プライマーGAL-Xba,合成配列
Claims (8)
- 組換えヒトα-ガラクトシダーゼAの製造方法であって,
(a)無血清培地中で組換えヒトα-GalA産生哺乳類細胞を培養して組換えヒトα-GalAを培地中に分泌させるステップ,
(b)上記ステップ(a)で得られた培養物から細胞を除去することにより培養上清を回収するステップ,
(c)上記ステップ(b)で回収された培養上清を,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(d)上記ステップ(c)で回収された画分を,疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(e)上記ステップ(d)で回収された画分を,リン酸残基に親和性を有する材料を固相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(f)上記ステップ(e)で回収された画分を,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,
(g)上記ステップ(f)で回収された画分を,100〜150 mMの塩化ナトリウムを加えたリン酸緩衝液によってpH 6.8〜7.2で平衡化された色素親和性クロマトグラフィーカラムを用いた色素親和性カラムクロマトグラフィーに付し,400〜750 mMの塩化ナトリウム及び40〜60 mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを加えたリン酸緩衝液で溶出することにより組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ,及び
(h)上記ステップ(g)で回収された画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-GalA活性画分を回収するステップ
をこの順序で含んでなるものである,方法。 - 請求項1の方法であって,該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂が弱陽イオン交換樹脂である,方法。
- 請求項2の方法であって,該弱陽イオン交換樹脂が疎水性相互作用と水素結合形成との双方に基づく選択性を有するものである,方法。
- 請求項2又は3の方法であって,該弱陽イオン交換樹脂が,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を有するものである,方法。
- 請求項1〜4の何れかの方法であって,色素親和性クロマトグラフィーにおいて用いられる色素がブルートリアジン色素である,方法。
- 請求項1〜5の何れかの方法であって,リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである,方法。
- 請求項6の方法であって,リン酸残基に親和性を有する材料がハイドロキシアパタイトである,方法。
- 請求項1〜7の何れかの方法であって,該哺乳類細胞が,EF−1(α)プロモーターの制御下に組換えヒトα-GalAを発現するように設計された発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞である,方法。
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