JP2012244993A5

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Publication number: JP2012244993A5
Application number: JP2012119327A
Authority: JP
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2015-04-09
Anticipated expiration: 2032-05-25

Claims

無血清および無コレステロール培地において増殖するよう適応されており、組換えタンパク質を発現するよう操作されている改変されたＮＳ０細胞であって、無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる改変されたＮＳ０細胞。
コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１６，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
フェドバッチ法が、追加される容積が最初の細胞培養物容積の割合を表す、次のスケジュール：

に従って追加される流加培地を添加することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の改変されたＮＳ０細胞。
１３日間のフェドバッチ法において少なくとも１００Ｌの培養物中２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
無コレステロール培地において増殖される場合、１３日間のフェドバッチ法において１，０００Ｌの培養物中２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項５に記載の改変されたＮＳ０細胞。
無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１６，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項５に記載の改変されたＮＳ０細胞。
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を発現するのに有用な核酸で安定的にトランスフェクトされる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体が、配列番号２の２１位から２３３位に配列が一致するＶ_Ｌ鎖および配列番号４の２０位から４６５位に配列が一致するＶ_Ｈ鎖を含む、請求項８に記載の改変されたＮＳ０細胞。
ベクターｐＡｂＸ．ｇｐｔを用いて形質転換される、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥを用いて形質転換される、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
請求項１から１１のいずれか一項に記載の改変されたＮＳ０細胞を培養することを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
請求項１２に記載の方法であって、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を、または１３日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を生産する条件下で、改変されたＮＳ０細胞が培養される、請求項１２に記載の方法。
改変されたＮＳ０細胞が、血清およびコレステロールの非存在下で培養される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
改変されたＮＳ０細胞が、トロポロンおよびヒドロコルチゾンの非存在下で培養される、請求項１４に記載の方法。
改変されたＮＳ０細胞が、１０−３５ｇ／Ｌグルコースを含有する基本および／または流加培地において培養される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
改変されたＮＳ０細胞が、１５ｇ／Ｌグルコースを含有する基本培地および／または２８ｇ／Ｌグルコースを含有する流加培地において培養される、請求項１６に記載の方法。
基本培地が、ＰＦＢＭ２±１０％成分で構成されている、請求項１７に記載の方法。
流加培地が、ＰＦＦＭ３±１０％成分で構成されている、請求項１７に記載の方法。
細胞が基本培地において１−３日間、次に流加培地において１０−１３日間培養される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
流加培地が、表７において概説されているスケジュール±１０％に従って追加される、請求項１８に記載の方法。
哺乳動物細胞において作動可能である選択可能なマーカーの発現を推進する弱いプロモーターおよび対象のタンパク質の発現を推進する強いプロモーターを含む、対象のタンパク質を組換え的に発現するのに有用なベクター。
対象のタンパク質が治療抗体である、請求項２２に記載のベクター。
治療抗体が抗ＣＤ２５抗体である、請求項２３に記載のベクター。
抗ＣＤ２５抗体がダクリズマブのＣＤＲを含む、請求項２４に記載のベクター。
抗ＣＤ２５抗体がダクリズマブである、請求項２５に記載のベクター。
対象のタンパク質の高い容積生産性を有する哺乳動物宿主細胞を得るための方法であって、細胞に請求項２２から２６のいずれか一項に記載のベクターをトランスフェクトし、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／日対象のタンパク質を、または１３日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を生産することができる細胞を選択することを含む、対象のタンパク質の高い容積生産性を有する哺乳動物宿主細胞を得るための方法。
ダクリズマブがｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ連結アイソフォームおよび／またはＱ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームの存在により特徴付けられる、ダクリズマブを含む組成物。
ｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ３−１７％または６−１５％を構成する、請求項２８に記載の組成物。
ｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ５−１２％または７−１２％を構成する、請求項２８に記載の組成物。
Ｑ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ１−１５％を構成する、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
Ｑ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ３−１２％を構成する、請求項３１に記載の組成物。
ダクリズマブの重鎖が次のＮ末端アイソフォーム：

に存在する、請求項２８に記載の組成物。
ダクリズマブの重鎖が次のＮ末端アイソフォーム：

に存在する、請求項２８に記載の組成物。
ダクリズマブが、図１８の陽イオン交換クロマトグラフィーアイソフォームプロファイルと実質的に類似する陽イオン交換クロマトグラフィーアイソフォームプロファイルにより特徴付けられる、請求項２８に記載の組成物。
ダクリズマブがＤＡＣＨＹＰである、請求項２８に記載の組成物。
ダクリズマブを含む組成物であって、１つがオリゴ糖Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃに一致し１つがオリゴ糖Ｇ０に一致する２つの主要ピークを含有するＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルによりダクリズマブが特徴付けられ、これら２つのピークの合わせたＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７５−１００％、約８０−１００％、約８５−１００％または約８８−９９．５％を構成する、ダクリズマブを含む組成物。
Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約５−２０％、約５−１８％を構成し、Ｇ０ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７０−９９％、約７５−９２％または約７５−９０％を構成する、請求項３７に記載の組成物。
Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約６−１６％または約７−１５％を構成し、Ｇ０ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７８−９０％または約８１−８８％を構成する、請求項３８に記載の組成物。
Ｎ連結グリコシル化プロファイルが約３％未満のＭａｎ５を有する、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｎ連結グリコシル化プロファイルが約０．５％未満のＧ２、Ｍａｎ６および／またはＭａｎ７を有する、請求項４０に記載の組成物。
Ｎ連結グリコシル化プロファイルがシアル酸付加オリゴ糖に一致する第三のピークを含有し、シアル酸付加オリゴ糖ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの１％以下を構成する、請求項３７に記載の組成物。
Ｎ連結グリコシル化プロファイルがオリゴ糖Ｇ１に一致する第三のピークを含有し、Ｇ１ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満または約１−５％、約１−４％もしくは約１−３％を構成する、請求項３７に記載の組成物。
Ｇ１ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約１−２％を構成する、請求項４３に記載の組成物。
ダクリズマブが、図１９のＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルにまたは図２１の下のパネルのＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルに実質的に類似しているＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルを有する、請求項３７に記載の組成物。
ダクリズマブがＤＡＣＨＹＰである、請求項３７に記載の組成物。
ダクリズマブを含む組成物であって、少なくとも３体の健康なドナー由来のエフェクター細胞および標的細胞としてＫｉｔ２２５Ｋ６細胞を使用して、１μｇ／ｍＬのダクリズマブ濃度および約２５対１の該エフェクター細胞対該標的細胞比で、インビトロ細胞アッセイにおいて測定される、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満のＡＤＣＣ平均細胞傷害性を示すダクリズマブを含む組成物。
ダクリズマブが、前記アッセイにおいて５％から３０％、５％から２５％、１０％から３０％、１０％から２５％または１５％から２５％のＡＤＣＣ平均細胞傷害性を示す、請求項４７に記載の組成物。
前記アッセイが少なくとも６体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、請求項４７または請求項４８に記載の組成物。
前記アッセイが少なくとも１０体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、請求項４７または請求項４８に記載の組成物。
ダクリズマブがＤＡＣＨＹＰである、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の組成物。
ダクリズマブ製剤を作製するのに有用な組成物であって、約１５０−１９０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブと、希釈緩衝液を用いた組成物の希釈により、約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有し、かつ約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有する希釈組成物を生じるような量の賦形剤を含み、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である、ダクリズマブ製剤を作製するのに有用な組成物。
希釈緩衝液で希釈した際に希釈組成物が約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、請求項５２に記載の組成物。
希釈緩衝液で希釈した際に希釈組成物が約１５０±１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、請求項５２に記載の組成物。
ダクリズマブの０．１％以下がアグリゲート形態である、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む組成物。
ダクリズマブの最大２．５％がアグリゲート形態である、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を、弱陽イオン交換樹脂上のカラムクロマトグラフィーにより精製することによって得られる、請求項５５に記載の組成物。
弱陽イオン交換樹脂がＣＭ−６５０Ｍである、請求項５６に記載の組成物。
ＣＭ−６５０Ｍ樹脂が約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する平衡化緩衝液、ｐＨ４．４−４．６を用いて平衡化されており、ダクリズマブが約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約７５ｍＭの硫酸ナトリウムを含有する溶出緩衝液、ｐＨ４．４−４．６を用いて溶出される、請求項５７に記載の組成物。
クロマトグラフィーが、約１０−３０ｃｍまたは約１７−１９ｃｍの高さを有する樹脂床を使用して円筒形カラムにおいて実施され、ダクリズマブが約４−２２℃または約１８−２２℃の範囲の温度で、約５０−２００ｃｍ／時または９０−１１０ｃｍ／時の範囲の流速で溶出される、請求項５８に記載の組成物。
ヒト投与に適した組成物であって、約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび約０．０２−０．０４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含み、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である、ヒト投与に適した組成物。
サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される、ダクリズマブの少なくとも約９９％が単量体形態である、請求項６０に記載の組成物。
約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６０に記載の組成物。
約１００ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０から本質的になり、２５℃で約６．０のｐＨを有する、請求項６２に記載の組成物。
約１３５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６０に記載の組成物。
約１５０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０から本質的になり、２５℃で約６．０のｐＨを有する、請求項６４に記載の組成物。
請求項６４に記載の組成物であって、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を適切な緩衝液中での限外濾過により濃縮して、約８５−１８０ｍｇ／ｍＬの範囲のダクリズマブ濃度を達成するステップ、および、場合によって、濃縮された組成物を希釈緩衝液で希釈するステップを含む方法により得られる、請求項６４に記載の組成物。
約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含み、約２−８℃の範囲の温度での約１２ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態のダクリズマブの百分率が約３％を超えない、皮下投与に適した医薬組成物。
約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６７に記載の医薬組成物。
約１３５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
約２−８℃の範囲の温度での約１２ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態のダクリズマブの百分率が約２％を超えない、請求項６８または請求項６９に記載の医薬組成物。
約２−８℃の範囲の温度での約１８ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態のダクリズマブの百分率が約３％を超えない、請求項６８または請求項６９に記載の医薬組成物。
細胞培養物から組換えタンパク質を収穫するための方法であって、
（ｉ）組換えタンパク質を発現し分泌する細胞培養物のｐＨを、約ｐＨ４．５−５．５の範囲のｐＨに調整するステップ、
（ｉｉ）ｐＨ調整された細胞培養物を約４から１５℃の範囲の温度で約３０−９０分間インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）インキュベートされたｐＨ調整細胞培養物を遠心分離して細胞残渣を除去するステップ
を含む、細胞培養物から組換えタンパク質を収穫するための方法。
精製されたダクリズマブ組成物を生産するための方法であって、
（ｉ）未精製ダクリズマブ調製物から親和性クロマトグラフィー樹脂上にダクリズマブを吸着させるステップ、
（ｉｉ）親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して混入物を除去するステップ、
（ｉｉｉ）吸着したダクリズマブを溶出緩衝液で溶出させるステップ、
（ｉｖ）ｐＨを約３−４の範囲のｐＨに調整することにより溶出液中のウイルスを不活化し、ｐＨ調整された溶出液を規定温度でウイルスを不活化するのに十分な期間インキュベートするステップ、
（ｖ）ウイルス不活化溶出液を約ｐＨ７．７−７．９（２５℃で測定したもの）の範囲のｐＨまで中和するステップ、
（ｖｉ）中和された溶出液を強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通して流すステップ、
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）の溶出液のダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上に吸着させるステップ、および
（ｖｉｉｉ）吸着したダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させるステップ
を含む、精製されたダクリズマブ組成物を生産するための方法。
未精製ダクリズマブ調製物が細胞培養物から収穫される、請求項７３に記載の方法。
ダクリズマブが請求項７２に記載の方法を使用して収穫される、請求項７３に記載の方法。
請求項７３に記載の方法であって、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の溶出されたダクリズマブ組成物を濾過して、ウイルスを除去するステップ、および
（ｘ）濾過された溶液を限外濾過により濃縮して、約８５−１８０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む精製されたダクリズマブ組成物を得るステップ
をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
請求項７６に記載の方法であって、約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび約０．０２−０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である組成物が得られるように、精製されたダクリズマブ組成物を希釈緩衝液で希釈するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
得られる組成物が、ダクリズマブの組換え供給源由来の５０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、１０ｐｐｍ未満のプロテインＡを有し、組成物中のダクリズマブの３％以下がアグリゲート形態である、請求項７７に記載の方法。
基本培地ＰＦＢＭ２。
流加培地ＰＦＦＭ３。
ダクリズマブが培養培地中に分泌される条件下で、請求項１から１１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法により得られる、ダクリズマブ組成物。
請求項８１に記載のダクリズマブ組成物であって、方法が、分泌されたダクリズマブを細胞培養培地から単離するステップをさらに含む、請求項８１に記載のダクリズマブ組成物。
約１００−５００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１０−３０ｍＭのＮａＯＨおよび約０．５−３％（ｖ／ｖ）ベンジルアルコールを含む、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂を衛生化するのに有用な緩衝液。
カラムを衛生化するのに十分な流速および期間で、請求項８３に記載の衛生化緩衝液を用いてカラムを洗浄することを含む、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法。
カラムを、約１５０ｃｍ／時の流速でおよそ１．８カラム容積の衛生化緩衝液を用いて洗浄し、洗浄したカラムを約３０−４５分の期間流動なしでインキュベートし、次に平衡化緩衝液を用いて平衡化する、請求項８４に記載の方法。
平衡化緩衝液が、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７（２５℃で）のｐＨを有する、請求項８５に記載の方法。
治療効果を与えるのに十分な量のＤＡＣＨＹＰ組成物を患者に投与することを含む、多発性硬化症に罹っている患者を治療する方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が静脈内投与される、請求項８７に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、約０．８−０．９ｍｇ／ｋｇのＤＡＣＨＹＰに相当する量で投与される、請求項８８に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、約１ｍｇ／ｋｇのＤＡＣＨＹＰに相当する量で投与される、請求項８９に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰが、少なくとも６週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間の期間、週あたり１回投与される、請求項８７から９０のいずれか一項に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰが単独療法として投与される、請求項８７から９１のいずれか一項に記載の方法。
請求項９２に記載の方法であって、患者がインターフェロンベータを用いた前治療に反応しなかったか、またはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、請求項９２に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、請求項８７から９１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＡＣＨＹＰ組成物が皮下投与される、請求項８７に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、約１ｍｇ／ｋｇのＤＡＣＨＹＰに相当する量で投与される、請求項９５に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が２週間に１回投与される、請求項９６に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が合計で約２４週間投与される、請求項９７に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、約２ｍｇ／ｋｇのＤＡＣＨＹＰに相当する量で投与される、請求項９５に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、４週間に１回投与される、請求項９９に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、合計で約２４週間投与される、請求項１００に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、７５ｍｇから３００ｍｇのＤＡＣＨＹＰに相当する量で投与される、請求項１０１に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、１５０ｍｇに相当する量で投与される、請求項１０２に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、３００ｍｇに相当する量で投与される、請求項１０２に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、４週間に１回投与される、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰ組成物が、合計で少なくとも４８週間投与される、請求項１０５に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰが単独療法として投与される、請求項１０１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
請求項１０７に記載の方法であって、患者がインターフェロンベータを用いた前治療に反応しなかったか、またはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、請求項１０７に記載の方法。
ＤＡＣＨＹＰがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、請求項１０１から１０６のいずれか一項に記載の方法。