UA121959C2 - Склад, який містить очищену рекомбінантну ідуронат-2-сульфатазу (i2s) - Google Patents

Abstract

Винахід стосується складу, який містить очищену рекомбінантну ідуронат-2-сульфатазу (I2S), що має амінокислотну послідовність SEQ ID NО:1, при цьому очищена рекомбінантна I2S має щонайменше 70 % перетворення залишків цистеїну, що відповідають Cys59 із SEQ ID NO:1 у Сα-формілгліцин (FGly), де очищена рекомбінантна I2S містить менше ніж 150 нг/мг білка клітини-хазяїна (БКХ).

Description

РОЗМОРОЖУВАННЯ НМ, 2-8 С

ГЛИБИННА ФІЛЬТРАЦІЯ

ВІРУСНА ІНАКТИВАЦІЯ

195 ПОЛІСОРБАТУ 80, 0,395 ТИВР

ІЮ ХРОМАТОГРАФІЯ !

О СЕФАРОЗАЮ САРТО

" ГІДРОКСНАПАТИТОВА

ХРОМАТОГРАФІЯ й ТИПУ

БО см

ІЮ ХРОМАТОГРАФІЯ

ФР СЕФАРОЗА ЕЕ

БО см

ХРОМАТОГРАФІЯ

З ФЕНІЛ СЕФАРОЗОЮ ЕЕ

50 см

ВІРУСНА ФІЛЬТРАНІЯ

РІАМОУА

УФІДф У ЛІКАРСЬКИЙ БУФЕР (2 мг/млі

ММ ФОСТФАТУ НАТРІЮ

137 мм масі, рн 6.0 0.2 МІКРОННА ФІЛЬТРАЦІЯ

ЛІКАРСЬКА РЕЧОВИНА

ФІГ.

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

ЇО001| Ця заявка заявляє приорітет за попередньою заявкою на патент США 61/666733, поданою на реєстрацію 29 червня 2012 р., яка в повному обсязі включена в цей документ шляхом посилання.

Перелік послідовностей (0002) Цей винахід посилається на Перелік послідовностей, поданий в електронній формі у вигляді файлу АЗС ХІ під назвою "2006685-0342 5ЕО |І5Т" 27 червня 2013 р. Файліхі був створений 25 червня 2013 р., його розмір становить 15 КБ. Повний вміст Переліку послідовностей включений в цей документ шляхом посилання.

Рівень техніки 0003) Мукополісахаридоз І! типу (МПС Ії, синдром Хантера) - це пов'язане з Х-хромосомою рецесивне захворювання з групи лізосомних хвороб накопичення, причиною якого є дефіцит ферменту ідуронат-2-сульфатази (125). І25 відщеплює термінальні 2-О-сульфатні компоненти від глікозаміногліканів (ЗАС) дерматансульфату та гепарансульфату. Внаслідок відсутності або дефективності ферменту І25 у пацієнтів з синдромом Хантера САС поступово накопичується в лізосомах різних типів клітин, що призводить до клітинного переповнення, органомегалії, руйнування тканин та систематичної дисфункції органів. 0004 Зазвичай фізичні прояви синдрому Хантера у людей включають як соматичні, так і нейрональні симптоми. Наприклад, в деяких випадках синдрому Хантера ураження центральної нервової системи призводить до затримки в розвитку та проблем нервової системи. Хоча при народженні симптоми синдрому Хантера, не пов'язані з нервовою системою, зазвичай відсутні, з часом постійне накопичення БАС в клітинах тіла може сильно впливати на перифіричні тканини тіла. Накопичення САС в перифіричній тканині призводить до характерної грубості рис обличчя пацієнта та обумовлює випираюче чоло, сплощене перенісся та збільшений язик - відмітні ознаки пацієнта з синдромом Хантера. Аналогічно, накопичення БАС може негативно впливати на системи органів тіла. Від початку виявляючись у вигляді потовщення стінок серця, легенів та дихальних шляхів, а також патологічного збільшення печінки, селезінки та нирок, ці кардинальні зміни можуть, кінець кінцем, призвести до загальної катастрофічної недостатності органів. Як наслідок, синдром Хантера завжди є важким, прогресуючим та обмежуючим час життя захворюванням.

ІЇО00О5| Ферментозамісна терапія (ФЗ3Т) є схваленою терапією для лікування синдрому

Хантера (МПС ІІ), яка включає введення екзогенного замісного ферменту І25 пацієнтам з синдромом Хантера.

Суть винаходу

ІО0О6| У цьому винаході, серед іншого, запропоновані вдосконалені способи очищення білка

І25, отриманогорекомбінантним способом, для ферментозамісної терапіїї. Цейвинахід частково оснований на несподіваному відкритті, що рекомбінантний білок І25 може бути очищений з необроблених біологічних матеріалів, таких як клітинне культуральнесередовище, що містить

І25, за допомогою способу, що включає застосуваннявсього лише чотирьох хроматографічних колонок.Існуючий загальноприйнятий спосіб очищення рекомбінантного 125 для ферментозамісної терапії включає застосування 6 хроматографічних колонок.Як описано в розділі Прикладів, рекомбінантні білки І25, очищені чотирьохколонковим способом згідно з винаходом, відповідають ринковим вимогам до ступеню очищення у США і багатьох інших країнах. До того ж, рекомбінантний ферменті25, очищений відповідно до цього винаходу, зберігає високий відсоток Се-формілгліціну (ЕСІу) (наприклад, вище 70 95 та аж до 100 95), що є важливим для активності ферменту 125, і такі відмітні характеристики, яквміст сіалової кислоти ікарта гліканів, які можуть поліпшити біодоступність та/або лізосомне націлювання рекомбінантного білка І25.Отже, в цьому винаході запропонований ефективний, менш витратний та більш швидкий спосіб очищення рекомбінантного білкаІ25.Цей винахід є особливо доцільним для очищення рекомбінантного білкаї25, що виробляється в безсироватковому середовищі.

Ї0О007| Таким чином, в одному аспекті в цьому винаході запропонований спосіб очищення рекомбінантного білкаї25 з неочищеного препарату за допомогою процесу, основаного на одному або більше способах з аніонообмінної хроматографії, катіонообмінної хроматографії, хроматографіїз комбінованим режимом та хроматографії з гідрофобною взаємодією.У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згіднозцим винаходом включає менше 6 (наприклад, менше 5, менше 4 або менше 3) хроматографічних етапів.У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згідно зцим винаходом включає 2, 3, 4 або 5 хроматографічних етапів.У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згіднозцим бо винаходом включає 4 хроматографических етапи.У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гіднозцим винаходом містить менше ніж 100 нг/мг білку клітини-хазяїна(БКхХ) (наприклад, менше ніж 90 нг/мг БКХ, менше ніж 80 нг/мг БКХ, менше ніж 70 нг/мг БКХ, менше ніж 60 нг/мг БКХ, менш ніж 50 нг/мг БКХ, менше ніж 40 нг/мг БКХ, менше ніж 30 нг/мг БКХ, менше ніж 20 нг/мг БКХ, менше ніж 10 нг/мг БКХ).

ЇО0ОО8| У деяких варіантах реалізації винаходу придатним видом аніонообмінної хроматографії є с хроматографія.У деяких варіантах реалізації винаходу придатнимвидом катіонообменної хроматографії є 5Р хроматографія.У деяких варіантах реалізації винаходу придатнимвидом хроматографії з комбінованим режимом є гідроксиапатитова (НА) хроматографія.У деяких варіантах реалізації винаходу придатним видом хроматографії з гідрофобною взаємодією є хроматографія з фенілом.

ЇО009| Передбачається, що аніонообмінну хроматографію (наприклад, О-колонку), катіонообмінну хроматографію (наприклад, 5Р-колонку), хроматографію з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонку) та хроматографію з гідрофобною взаємодією (наприклад, колонку з фенілом) можна проводити в будь-якому порядку.У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб згідно зцим винаходом включає проведення зазначених етапів у такому порядку: аніонообмінна хроматографія (наприклад, сО-колонка), катіонообмінна хроматографія (наприклад, 5Р-колонка), хроматографія з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонка) та хроматографія з гідрофобною взаємодією (наприклад, колонка з фенілом).

ЇОО10| У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням у аніонообмінну хроматографічну колонку (наприклад, О-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до рівня рН, що становить приблизно 5,0-7,0 (наприклад, приблизно5,0, 5,5, 6,0, 6,5 або 7,0), і провідності, що становить приблизно 10-20 мсм/см (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 мсм/см).У деяких варіантах реалізації винаходу рН доводять, застосовуючи! М ацетат натрію.У деяких варіантах реалізації винаходу провідність доводять, застосовуючи5 М хлорид натрію.У деяких варіантах реалізації винаходу аніонообмінну хроматографічну колонку після завантаження промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить концентрацію солі (наприклад, Масі) в діапазоні від приблизно140 ммдо200 мм (наприклад, приблизно140 мм, 145 мм, 150 мм, 155 мм, 160 мм, 165 мм, 170 мм, 175 мм, 180 мм, 185 мм, 190 мм, 195 мм або200 мм) з рН, що становить приблизно 5,0-7,0 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 або 7,0). У деяких варіантах реалізації винаходу аніонообміннухроматографічну колонку елююють, застосовуючиелююючий буфер, який характеризується лінійним градієнтом солі (наприклад, Масі).У деяких варіантах реалізації винаходу придатний лінійний градієнт Мас! характеризується діапазоном, що становить приблизноб0-500 ммМасі (наприклад, приблизно 0-400 мм, приблизно 0-350 мм, приблизно 0-300 мм, приблизно 50-500 мм, приблизно 150-500 мм, приблизно 150-450 мм, приблизно 150-400

ММ).

ЇОО11| У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням "у катіонообміннухроматографічну колонку (наприклад, ЗР-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до провідності в діапазоні між приблизно 1 мем/см та 20 мсм/см (наприклад, між приблизно 1 мсм/см та 15 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см та 10 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см та 8 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см та 6 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см та 4 мсм/см, між приблизно 2 мсм/см та 4 мсм/см).У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням у катіонообміннухроматографічну колонку (наприклад, 5Р-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до провідності в діапазоні між приблизно2 мсм/см та 4 мсм/см (наприклад, 2, 2,5, З, 3,5 або 4 мсм/см).У деяких варіантах реалізації винаходу значення провідності доводять, розводячи елюат з аніонообмінної хроматографічної колонки Н2О у співвідношенні, що становить приблизно1-2:1 (наприклад, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1,1,7:1, 1,811, 1,91 або 2:1).У деяких варіантах реалізації винаходу значення провідності доводять діафільтрацією.У деяких варіантах реалізації винаходу катіонообмінну хроматографію проводять на колонці при рівні рН, що становить приблизно5,0-6,5 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0 або 6,5).У деяких варіантах реалізації винаходу катіонообмінну хроматографію проводять на колонці з буфером, що містить концентрацію фосфату (наприклад, МаРОз) в діапазоні від приблизно 0,01 Мдо приблизно 0,1 М (наприклад, приблизноб0,0О1 М, 0,02 М, 0,03 М, 0,04 М, 0,05 М, 0,06 М, 0,07 М, 0,08 М, 0,09 М абоб,1 М).У деяких варіантах реалізації винаходу відповідний рівень рН становить приблизно 5,0-6,5 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0 або 6,5).

ЇО012| У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням у колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонку)неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до концентрації фосфату (наприклад, 60 МаРозх) в діапазоні від приблизно 0,001 Мдо приблизноб0,01 М (наприклад, приблизно 0,001 М,

0,002 М, 0,003 М, 0,004 М, 0,005 М, 0,006 М, 0,007 М, 0,008 М, 0,009 М абоб,01 М) тарівня рН, що становить приблизно 5,0-6,5 (наприклад, приблизно5,0, 5,5, 6б,0або 6,5).У деяких варіантах реалізації винаходу колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА- колонку) після завантаження промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить фосфат (наприклад, 1-10 мм фосфат натрію або калію) з нейтральним або практично нейтральним рН.У деяких варіантах реалізації винаходу завантажену колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонку) промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить концентрацію фосфату в діапазоні, що становить приблизно10-20 мм (наприклад, приблизної 0- 18 мм, 10-16 мм, 10-15 мм, 12-20 мм, 14-18 мм, 14-16 мм). У деяких варіантах реалізації винаходу завантажену колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА- колонку) промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить фосфат в концентрації більшій, ніж 10 мм, 11 мм, 12 мм, 13 мм, 14 мм, 15 мм, 16 мм, 17 мм, 18 мм, 19 мм, 20 мм. У деяких варіантах реалізації винаходу елюювання з колонки для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонки) проводять за допомогою градієнтного фосфатного буферу. У деяких варіантах реалізації винаходу придатнийелююючий буферможе характеризуватися фосфатним градієнтом, що становить приблизно1-400 мм (наприклад, 1-300 мм, 1-200 мм, 1- 150 мм, 1-100 мм, 10-350 мм, 10-300 мм, 10-250 мм, 10-200 мм, 10-150 мм, 10-140 мм, 10-130 мм, 10-120 мм, 10-110 мм, 10-100 мм, 10-90 мм, 10-80 мм, 10-70 мм, 10-60 мм, 10-50 мм) фосфату натрію або фосфату калію.У деяких варіантах реалізації винаходу елюювання з НА- колонки проводять за допомогою ступеневого підвищення концентрації фосфату в буфері для елюювання.У деяких варіантах реалізації винаходу ступінчасті буфери для елюювання можуть містити фосфат (наприклад, фосфат натрію) в концентрації, вибраної з 10 мм, 20 мм, 30 мм, 40 мм, 50 мм, 60 мм, 70 мм, 80 мм, 90 мм, 100 мм, 110 мм, 120 мм, 130 мм, 140 мм, 150 мм, 200 мм, 250 мм, 300 мм, 350 мм, 400 мм. У деяких варіантах реалізації винаходу елюювання з колонки для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА- колонки) проводять за допомогою буферу для елюювання, що містить фосфат (наприклад, фосфат натрію) в концентрації в діапазоні від приблизно 50 ммдо150 мм (наприклад, вибраної з концентрацій фосфату (наприклад, фосфату натрію), що складають5бо мм, 60 мм, 70 мм, 80 мм, 90 мм, 100 мм, 110 мм, 120 мм, 130 мм, 140 мм, 150 ммта їх комбінацій).

Зо ЇО013| Вдеякихваріантахреалізаціївинаходуперед завантаженням у колонку для хроматографії з гідрофобною взаємодією (наприклад, колонку з фенілом) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до концентрації солі (наприклад, масі) в діапазоні від приблизно0,5 Мдо приблизно2,0 М (наприклад, приблизноб0,5 М, 1,0 М, 1,1 М, 1,2

М, 1,3 М, 1,4 М, 1,5 М, 1,6 М, 1,7 М, 1,8 М, 1,9 М або2,0 ММасі) та рівня рН, що становить приблизно4,5-6,0 (наприклад, приблизно 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0).

Вдеякихваріантахреалізаціївинаходи колонку для хроматографії З гідрофобною взаємодієюпісля завантаження промивають, застосовуючи відмивний буфер, що міститьконцентрацію солі (наприклад, Масі)) в діапазоні від приблизноб0,5 Мдо2,0 М (наприклад, приблизноб,5 М, 1,0 М, 1,1 М, 1,2 М, 1,3 М, 1,4 М, 1,5 М, 1,6 М, 1,7 М, 1,8 М, 1,9 М або2,0 МмМасі) при рівні рН, що становить приблизно 4,5-6,0 (наприклад, приблизно 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0).Удеякихваріантахреалізаціївинаходу колонку для хроматографії з гідрофобною взаємодією елююють, застосовуючи елююючий буфер, що містить концентрацію солі (наприклад, масі) в діапазоні від приблизно0,ї Мдо приблизноб0,5 М (наприклад, приблизноб,1 М, 0,2 М, 0,3 М, 0,4

М, абоб0,5 ММасі) при рівні рН, що становить приблизно 4,5-6,0 (наприклад, приблизно 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0).

ЇО014| У деякихваріантахреалізацівинаходи кожна з колонок для аніонообмінної хроматографії, катіонообмінної хроматографії, хроматографіїз комбінованим режимом та хроматографії з гідрофобною взаємодією має висоту в діапазоні, що становить 14-25 см (наприклад, 15-25 см, 15-20 см, 14-24 см, 14-22 см, 14-20 см або 16-18 см)У деякихваріантахреалізаціїввинаходи кожна з колонок для аніонообмінної хроматографії, катіонообмінної хроматографії, хроматографіїз комбінованим режимом та хроматографії з гідрофобною взаємодією має висоту, що становить приблизної14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 см.

ЇО015| У деякихваріантахреалізаціївинаходи зазначений спосіб згідно зцим винаходом включає етап вірусної інактивації перед завантаженням неочищеного препарату в першу хроматографічну колонку.У деякихваріантахреалізаціївинаходу етап вірусної інактивації включає додавання в неочищений препарат детергенту.У деякихваріантахреалізаціївинаходу зазначений спосіб згідно з цим винаходом включає етап вірусного видалення після останньої хроматографічної колонки.У деякихваріантахреалізаціївинаходуспосіб згідно з винаходом бо додатково включає етап ультрафільтрації та/або діафільтрації. У деякихваріантахреалізаціївинаходу етап ультрафільтрації та/або діафільтрації включає переміщення очищеного рекомбінантного білка І25 в буфер лікарського препарату. 0016) У деякихваріантахреалізаціїцей винахід застосовують для очищення рекомбінантного білка І25, що має амінокислотну послідовність щонайменше на приблизно50О 95 (наприклад, щонайменше наприблизно 55 95, 60 95, 65 Зо, 70 90, 75 90, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 Фо, 97 9, 98 Фо, 99 95) ідентичнузЕОІЮМО:1. У деякихваріантахреалізаціїцей винахід застосовується для очищення рекомбінантного білка І25, що має амінокислотну послідовність, ідентичнуєЕОІЮ МО :1.

ЇО017|, У деякихваріантахреалізаціїцей винахід застосовують для очищення рекомбінантного білка І25, що виробляється клітинами ссавців, культивованими у суспензії в безсироватковому середовищі.У деякихваріантахреалізації винаходу в безсироватковомусередовищі, придатному для цілей винаходу, відсутні компоненти тваринного походження.У деякихваріантахреалізації винаходу безсироватковесередовище, придатне для цілей винаходу, є хімічно визначеним середовищем.У деякихваріантахреалізації винаходу клітини ссавців культивують у біореакторі.У деякихваріантахреалізації винаходу клітини ссавців коекспресують рекомбінантний білок 125 і формілгліцін-утворюючий фермент (ЕСЕ).У деякихваріантахреалізації винаходу клітини ссавців є клітинами людини. 0018) У деякихваріантахреалізації винаходу неочищений препарат, що застосовується в способі згідно з винаходом, отримують з безсироватковогосередовища, що містить рекомбінантний білок І25, який секретується з клітин ссавців.У деякихваріантахреалізації винаходу неочищений препарат, що застосовується в способі згідно з винаходом, одержують, розморожуючи заморожений препарат середовища. 00191 У деякихваріантахреалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гідно з цим винаходом в середньому містить 16-22 (наприклад, 16-21, 16-20, 16-19, 17-22, 17-21, 17-20, 17- 19) сіалових кислот на молекулу. У деякихваріантахреалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гідно з цим винаходом в середньому містить 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 сіалових кислот на молекулу. 00201 У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гідно з цим винаходом містить щонайменше приблизно 70905 (наприклад, щонайменше приблизно

Зо 75 У, 80 90, 85 о, 90 о, 95 95, 96 Фо, 97 95, 98 Ус, 99 95) залишків цистеїну, які відповідають Суз59 людського І25 (ЗЕОІЮОМО: 1), перетворених у Сое-формілгліцін (ЕСІуУ). У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25з3гідно з цим винаходом містить практично 100 95 залишків цистеїну, які відповідають Суб59 людського І25 (5ЕОІЮМО-1), перетворених у Са-формілгліцін (ЕСІуУ). У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гідно зцим винаходом характеризується специфічною активністю, яка становить щонайменше приблизно 20 Од/мг, 30 Од/мг, 40 Од/мг, 50 Од/мг, 60 Од/мг, 70 Од/мг, 80 Од/мг, 90 Од/мг або 100 Од/мг, визначеної за допомогою іп мігоаналізу активності виділення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду. 00211 У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гідно з цим винаходом характеризується клітинним поглинанням, що становить більше ніж 70 Фо, 75 9, 80 95, 85 95, 90 Уо, 95 ую, визначеним за допомогою іп мігоаналізу поглинання. (0022| У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253гідно зцим винаходом характеризується картою гліканів, що містить групи 3 семи піків, які відповідають нейтральному (група піків 1), моносіальованому (група піків 2), дисіальованому (група піків 3), монофосфорильованому (група піків 4), трисіальованому (група піків 5), тетрасіальованому (група піків 6) та дифосфорильованому (група піків 7) білку І25, відповідно. У деяких варіантах реалізації винаходу карта гліканів отримана після розщеплення нейрамінідазою. В інших варіантах реалізації винаходу карта гліканів отримана після розщеплення лужною фосфатазою.

ІО0О23| Серед іншого, в цьому винаході запропонований очищений рекомбінантний білок 125, описаний в цьому документі, та фармацевтичнікомпозиції або препарати, що їх містять. У деяких варіантах реалізації винаходу препарат виготовлений для внутрішньовенного, підшкірного та/або інтратекального введення. У цьому винаході також запропоновані способи лікування синдрому Хантера шляхом введення суб'єкту, який потребує лікування, очищеного рекомбінантного білкуІ25, фармацевтичноїкомпозиції або препарату, що його містить. (00241 Терміни "білок 1257", "І25", "фермент 125", які використовуються в цьому документі, або їх граматичні еквіваленти належать до одержання молекул рекомбінантного білку І25, якщо не вказане інше. (00251 Терміни "приблизно" та "близько", які використовуються в цій заявці, застосовуються бо як еквівалентні. Мається на увазі, що будь-які чисельні значення, наведені в цій заявці з або без приблизно/близько, включають будь-які нормальні відхилення, очевидні для фахівця у відповідній галузі техніки.

І002б| Інші ознаки, об'єкти та переваги цього винаходу стануть зрозумілими з нижченаведеного детального опису винаходу. При цьому варто розуміти, що детальний опис, хоча і вказує варіанти реалізації цього винаходу, наведений виключно з ілюстративною, але не обмежуючою метою. Для фахівців в цій галузі техніки різні зміни та модифікації, які входять в об'єм винаходу, стануть зрозумілими з детального опису.

Короткий опис графічних матеріалів

І0027| Описані нижче Фігури, які є Графічними матеріалами, наведені виключно з ілюстративною, але не обмежуючою метою.

І0028| На Фігурі 1 проілюстрована типова схема очищення рекомбінантного І25, що виробляється в безсироватковому середовищі.

І0О29| На Фігурі 2 проілюстровані типові пептидні карти очищеного рекомбінантного 125 АЕ у порівнянні з контрольним 125.

ЇООЗО|Ї На Фігурі З проілюстрований типовий ДСН-ПААГ-аналіз (зі сріблом) очищеного рекомбінантного І25 АРК.

ЇООЗ1| На Фігурі 4 проілюстрований типовий аналіз профілю заряду очищеного рекомбінантного І25 АЕ за допомогою іонообмінної хроматографії.

І0ООЗ2І| На Фігурі 5 проілюстровані типові профілі карт гліканів очищеного рекомбінантного

І25 АК. 0033) На Фігурі 6 проілюстрований типовий аналіз активності (Од/мг) після етапу вірусної інактивації НМ освітленого збору рекомбінантного 125. 0034 На Фігурі 7 проілюстрований типовий аналіз ЕХ-ВЕРХ після етапу вірусної інактивації

НМ освітленого збору рекомбінантного 125.

Ї0ОЗ5| На Фігурі 8 проіїлюстрований типовий ДСН-ПААГ з обробкою срібним барвником очищеного рекомбінантного білка 125.

І0ООЗ6| На Фігурі 9 проілюстрована типова пептидна карта для очищеного рекомбінантного ферменту І25, що виробляється клітинної лінією І25-АЕ 20, яка вирощуєтьсяу безсироваткових умовах культивування (верхня панель), у порівнянні з контролем.

Зо І0037| На Фігурі 10 проілюстровані типові профілі гліканів, отримані для очищених рекомбінантних ферментів І25, що виробляються клітинними лініями І25-АЕ 20 та 40, які вирощуютьсяубезсироватковихумовах культивування, порівняно з контролем.

ІЇ00З38| На Фігурі 11 проілюстрірований типовий профіль заряду для очищеного рекомбінантного ферменту 125, що виробляється клітинної лінією 125-АЕ 20, яка вирощуєтьсяубезсироватковихумовах культивування, порівняно з контролем.

Визначення

Ї0039| Для кращого розуміння цього винаходу нижче наведені визначення деяких термінів.

Додаткові визначення для нижченаведених термінів та інших термінів, наведені в продовження всього опису винаходу.

Ї0040| Приблизно або близько. Термін "приблизно" або "близько", який використовується в цьому документі, застосовується відносно однієї або більше величин, якістановлять інтерес, позначає величину, яка є схожою із зазначеною заданою величиною. У певних варіантах реалізації винаходу термін "приблизно" або "близько" належить до діапазону величин, який потрапляє в межі 25 то, 20 то, 19 то, 18 то, 17 то, 16 то, 15 то, 14 то, 13 то, 12 то, 11 то, 10 то, 9 то, 890, 7 90,6 90, 5 о, 4 о, З Зо, 2 ую, 1 ую або менше в обидва боки (більше ніж або менше ніж) від зазначеної заданої величини, якщо не вказане інше або інше не очевидне з контексту (за винятком випадку, коли таке число перевищувало 6 100 95 від можливої величини).

Ї00411| Біологічно активний: Фраза "біологічно активний", яка використовується в цьому документі, належить до характеристики будь-якої речовини, яка має активність в біологічній системі (наприклад, клітинній культурі, організмі і так далі). Наприклад, речовина, яка при введенні в організм чинить на цей організм біологічний ефект, вважається біологічно активною.

Біологічну активність також можна визначити за допомогою методів іпміїго аналізу (наприклад, іп міго ферментного аналізу, такого як аналіз вивільнення сульфату). У конкретних варіантах реалізації винаходу якщо білок або поліпептид є біологічно активним, частина цього білку або поліпептиду, яка має щонайменше один вид біологічної активності білку або поліпептиду, зазвичай називають "біологічно активною" частиною. У деяких варіантах реалізації винаходу білок отримують та/або очищують від клітинної культуральної системи, яка проявляє біологічну активність за введення суб'єктові. У деяких варіантах реалізації винаходу білок потребує додаткового процесингу для того, щоб стати біологічно активним. У деяких варіантах реалізації 60 винаходу білок, для того, щоб стати біологічно активним, потребує посттрансляційних модифікацій, таких як, без обмежень, глікозилювання (наприклад, сіалювання), фарнезилювання, розщеплювання, фолдинг, конверсія у формілгліцин та комбінації переліченого вище. У деяких варіантах реалізації винаходу білок, отриманий у вигляді проформи (тобто, незрілої форми), може потребувати додаткової модифікації для того, щоб стати біологічно активним. 0042) Катіон-незалежний рецептор манозо-6-фосфату (СІ-МРЕА). Термін "катіон-незалежний рецептор манозо-6-фосфату (СІ-МРНА)", який використовується в цьому документі, належить до клітинного рецептору, щозв'язує манозо-6-фосфатні (МбР) мітки попередника кислої гідролази в апараті Гольджі, які відповідають за транспорт у лізосоми. Крім манозо-6-фосфатів СІ-МРА також зв'язує інші білки, включаючи ІСЕ-ІІ. СІ-МРЕ відомий також під назвами "МбР/ЛОБР-1Ї рецептора", "СІ-МРАЛОБ-ІЇ рецептора", "ІС Е-ІЇ рецептора" або "ІСЕ2 рецептора". Ці терміни та їхні абревіатури використовуються в цьому документі взаємозамінно. 0043) Хроматографія. Термін "хроматографія", який використовується в цьому документі, належить до способу розділення сумішей. Як правило, суміш розчиняють в рідині, яканазивається "рухомою фазою", за допомогою якої її проводять через структуру, що містить іншу речовину, яканазівається "стаціонарною фазою". Колонкова хроматографія являє собою спосіб розділення, в якому нерухомий шар знаходиться в трубці, тобто, колонці.

І0044| Розріджувач. Термін "розріджувач", який використовується в цьому документі, належить до фармацевтично прийнятної (наприклад, безпечноїта нетоксичної для застосування на людях) речовини для розрідження, яка застосовується для одержання відновленого препарату. Типові розріджувачі включають стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (БВДІ), рН буферні розчини (наприклад, фосфатно-сольовий буферний розчин), стерильний сольовий розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози.

Ї0045| Елюювання. Термін "елюювання", який використовується в цьому документі, належить до процесу екстракції однієї речовини з іншої шляхом промивання розчином.

Наприклад, в іонообмінній хроматографії елюювання - це процес, призначений для промивання завантажених смол для видалення захоплених іонів.

ІЇ0046| Елюат. Термін "елюат", який використовується в цьому документі, належить до комбінації "носія" рухомої фази та аналізованого матеріалу, який виявляють в результаті

Зо хроматографії, як правило, в результаті елюювання.

ІЇ0047| Ферментозамісна терапія (ФЗ3Т): Термін "ферментозамісна терапія (ФЗ3Т), який використовується в цьому документі, належить до будь-якої терапевтичної стратегії, яка ліквідує дефіцит ферментів за допомогою введення необхідних ферментів. Після введення фермент захоплюється клітинами та транспортується у лізосому, де фермент діє так, щоб знищити матеріал, який накопичився у лізосомах внаслідок дефіциту ферментів. Як правило, для того, щоб лізосомна ферментозамісна терапія була ефективною, терапевтичний фермент доставляють у лізосоми відповідних клітин тканин-мішеней, в яких виявляється дефект накопичення. 0048) Врівноважувати або врівноваження. Терміни "врівноважувати" та "врівноваження", які використовується в цьому документістосовно хроматографії, належать до процесу наведення першої рідини (наприклад, буфера) в баланс з іншою, в загальному випадку для того, щоб досягти стабільного та однакового розділення компонентів рідини (наприклад, буферу).

Наприклад, в деяких варіантах реалізації винаходу хроматографічну колонку можна врівноважити за допомогою пропускання одного або більше об'ємів необхідної рідини (наприклад, буферу) через колонку.

Ї0049| Покращуватися, підвищуватися або знижуватися. Під час використання в цьому документі за допомогою термінів "покращуватися", "підвищуватися" або "знижуватися" або їхніх граматичних еквівалентів, оцінюють величини відносно базового вимірювання, такого як вимірювання, проведене для однієї й тієї ж особи до початку лікування, описаного в цьому документі, або вимірювання, проведене для контрольної особи (або декількох контрольних осіб) у відсутності лікування, описаного в цьому документі. "Контрольною особою" є особа, уражена тією самою формою лізосомної хвороби накопичення, що й особа, яка проходить лікування, приблизно того самого віку, що й особа, яка проходить лікування, (для гарантії того, що стадії захворювання у особи, яка проходить лікування, та контрольної(их) особи(іб) можна порівняти). 0050) Домішки. Термін "домішки", який використовується в цьому документі, належить до речовин, що знаходяться в обмеженому об'ємі рідини, газу або твердого тіла, які відрізняються за хімічноюкомпозицією від цільової речовини або сполуки. Домішки називають також забруднюючими речовинами. 00511 Лінкер. Термін "лінкер", який використовується в цьому документіщодозлитого білка, 60 належить до амінокислотної послідовності, відмінної від тієї, яка знаходиться в даній конкретній позиції в природному білку, і в загальному випадку сконструйований гнучким або з можливістю розміщення його в структуру, як, наприклад, а-спіраль між двома білковими компонентами.

Лінкер також називають спейсером.

І0052| Завантаження. Термін "завантаження" який використовується в цьому документіу випадку хроматографії, належить до додавання рідини, що містить зразки, або твердофазної речовини у колонку. У деяких варіантах реалізації винаходу конкретні компоненти зразка, який завантажується у колонку, згодом захоплюються при проходженні завантаженого зразка через колонку. У деяких варіантах реалізації винаходу конкретні компоненти зразка, який завантажується у колонку, не захоплюються або "протікають через" колонку при проходженні завантаженого зразка через колонку.

Ї0О053| Поліпептид. У контексті цього документу "поліпептид" в загальному випадку являє собою ланцюг із щонайменше двох амінокислот, з'єднаних одна з одною пептидним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу поліпептид може містити щонайменше 3-5 амінокислот, кожна з яких з'єднана з іншими за допомогою щонайменше одного пептидного зв'язку. Фахівцям у цій галузі техніки зрозуміло, що іноді поліпептиди включають амінокислоти "неприродного походження" або інші сполуки, які здатні інтегруватися в поліпептидний ланцюг.

Ї0054| Об'єднання. Термін "об'єднання", який використовується в цьому документі щодохроматографії, належить до об'єднання однієї або більше фракцій рідини, які пройшли через колонку. Наприклад, в деяких варіантах реалізації винаходу одну або більше фракцій, що містять необхідний компонент зразка, який був відокремлений за допомогою хроматографії (наприклад, "пікові фракції", можна "об'єднувати" разом для отримання єдиної "об'єднаної" фракції.

ЇО055| Замісний фермент. Термін "замісний фермент", який використовується в цьому документі, належить до будь-якого ферменту, який може діяти таким чином, щоб щонайменше частково замістити дефіцитний або відсутній фермент при захворюванні, лікування якого проводиться. У деяких варіантах реалізації винаходу термін "замісний фермент" належить до будь-якого ферменту, який може діяти так, щоб щонайменше частково замістити дефіцитний або відсутній лізосомний фермент за лізосомної хвороби накопичення, лікування якої проводиться. У деяких варіантах реалізації винаходу замісний фермент здатний знижувати

Зо кількість накопиченого матеріалу в лізосомах ссавців або може знімати або полегшувати один або більше симптомів лізосомної хвороби накопичення. Замісні ферменти, придатні для винаходу, включають лізосомні ферменти як дикого типу, так і модифіковані, і можуть бути одержані за допомогою рекомбінантних та синтетичних способів або очищені з природних джерел. Замісний фермент може бути рекомбінантним, синтетичним, таким, що генно- активується, або природним ферментом. 0056) Розчинний. Термін "розчинний", який використовується в цьому документі, належить до здатності терапевтичної речовини утворювати гомогенний розчин. У деяких варіантах реалізації винаходу розчинність терапевтичної речовини в розчині, в який вонавводитьсята за допомогою якого вона доставляється до цільової ділянки дії, достатня для того, щоб зробити можливою доставку терапевтично ефективної кількості терапевтичної речовини до цільового ділянці дії. На розчинність терапевтичних речовин можуть впливати кілька факторів. Наприклад, фактори, які можуть впливати на розчинність білка, включають іонну силу, амінокислотну послідовність та наявність інших спільно розчинних речовин або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації винаходу терапевтичні речовини згідно зцим винаходом розчиняються у відповідних фармацевтичних композиціях.

Ї0057| Стабільність.Термін "стабільність" який використовується в цьому документі, належить до здатності терапевтичної речовини (наприклад, рекомбінантного ферменту) зберігати терапевтичну ефективність (наприклад, всю або більшу частину своєї очікуваної біологічної активності та/або фізиохімічної функції) на протязі тривалих періодів часу.

Стабільність терапевтичної речовини і здатність фармацевтичноїкомпозиції підтримувати стабільність такої терапевтичної речовини може бути досягнута на протязі тривалих періодів часу (наприклад, на протязі щонайменше 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців або більше). У контексті виготовлення препаратів стабільним препаратом є такий, у якому терапевтична речовина зберігає свої фізичні та/або хімічні функції та біологічну активність за зберіганнята під час обробки (наприклад, заморожування/розморожування, механічного змішування та ліофілізації). Стабільність білків можна визначити за утворенням високомолекулярних (ВМ) агрегатів, втратою ферментативної активності, утворенням пептидних фрагментів та зсуву профілів заряду. 0058) Вірусна обробка. Термін "вірусна обробка", який використовується в цьому документі, 60 належить до "вірусного видалення", під час якого віруси просто видаляють із зразка, або

"вірусної інактивації", під час якої віруси залишаються у зразку, але в неактивній формі. У деяких варіантах реалізації винаходу для вірусного видалення, серед іншого, можна застосовувати нанофільтрацію та/або хроматографічні методи. У деяких варіантах реалізації винаходу для вірусної інактивації, серед іншого, можна застосовувати інактивацію розчином, інактивацію детергентом, пастеризацію, інактивацію кислотним рН та/або інактивацію ультрафіолетом.

Детальний опис винаходу

Ї0ОО59| У цьому винаході, серед іншого, запропонований спосіб очищення рекомбінантного білка І25 для ферментозамісної терапії на основі процесу, що включає менше 6 хроматографічних етапів. У деяких варіантах реалізації винаходу в цьому винаході запропонований спосіб очищення рекомбінантного білка І25 з неочищеного препарату за допомогою процесу на основі одного або більше способів з аніонообмінної хроматографії, катіонообмінної хроматографії, хроматографії з комбінованим режимом та хроматографії з гідрофобною взаємодією. У деяких варіантах реалізації винаходу в цьому винаході запропонований спосіб очищення рекомбінантного білка 25 з неочищеного препарату за допомогою С) хроматографії, гідроксиапатитової (НА) хроматографії, 5Р хроматографії та хроматографії з фенілом. У цьому винаході додатково запропонований очищений рекомбінантний білок І25та спосіб його застосування.

ЇООб6О| Різні аспекти винаходу детально описані в нижченаведених підрозділах.

Використання підрозділів не обмежує винахід. Кожний підрозділ можна застосовувати до будь- якого аспекту винаходу. У цій заявці використання "або" позначає "та/або", якщо не вказане інше.

Рекомбінантний білок І25 0061 Під час використання в цьому документі білок І25 є будь-яким білком або частиною білку, який може щонайменше частково замінити активність білку ідуронат-2-сульфатази (125) природного походження або зняти одне або більше клінічних проявів або симптомів, пов'язаних з дефіцитом І25. Терміни "фермент 125" та "білок І25", які використовуються в цьому документі, та їх граматичні еквіваленти використовуються взаємозамінно.

Ї0062| Як правило, людський білок І25 виробляється у формі попередника. Форма попередника людського 125 містить сигнальний пептид (амінокислотні залишки 1-25 повнорозмірного попередника), пропептид (амінокислотні залишки 26-33 повнорозмірного попередника) та ланцюг (залишки 34-550 повнорозмірного попередника), який може бути додатково процесованим у 42 кДа ланцюг (залишки 34-455 повнорозмірного попередника) і 14 кДа ланцюг (залишки 446-550 повнорозмірного попередника). Зазвичай форму попередника називають також повнорозмірним попередником або повнорозмірним білком І25, який містить 550 амінокислот. Амінокислотні послідовності зрілої форми (ЗЕО ІЮ МО: 1) з видаленим сигнальним пептидом та повнорозмірний попередник (5ЕО ІЮ МО:2) типового білку І25 дикого типу або природного походження наведені в Таблиці 1. Сигнальний пептид виділений підкресленням. Додатково, в Таблиці 1 також наведені амінокислотні послідовності ізоформ а та р попередника людського білку І25, ЗЕО ІЮ МО:3З та 4, відповідно.

іІзблипя і «Нодська ілуронат-2 сульфатаза

Зріла форма 5ЕТОАМУТТПАГМУТІ ПУТ ВРЕГОСУСИОКІУВІВМНЮ.

АЗНЗБЕЕМЗМАБАОСАУСАРВЯНУВЕ ТОВАРОВ ОЕКУХ

УКХ НАСПТУЕЗІТЕРОУЕКЕМОСтУТМ5УСЕУЕПРОНУЯМН ТОВ

РУБ УБЕРРЖПРУБЕКТЕМІКТСЕОРІОСВ ПАМ ЕСРУВУВЄ І

УРКПІРОКО5ТЕОАЦИГЕКМЕТЗАЗРЕБТ А УСУНЕНІ

ЕУРКЕРОКІТРІЕМІТАРВПРЕУРІЮНТ РРУА ХРАМИ ОКЕ

ПУПАГКБУРУСРІРУПРОККІКОВУРГАУВУ БГОУСНІІ В

АГ СОСКА МОТНАРТЗ НОЖА СЕНС АКУВКЕПУАТН

УРІЕХУВОСВТАБІЕРЕАСЕКТ ЕЕ БПРЕОЗАЗОГУМЕРСКОВМ

ПЕУНЕУВГЕРІТТАСІ АОТОУВВЕСВУВХЕНУВ СВОЮ ЖК

НЕВЕВГЛЕЕПРУТРОМРЕБІТА УК ТУУВЕРУПІРОХУМЗІОКРАК

ПІЕМОСУМІВТЮУВУТУ М УСЕМВОВБЕЕАМЕВІННАСЕЖВУ

О5ЮРІЮДБВНУМУ МОСС МАЕ ББО ТО МІ

Повннерезмінний МРРРЕТСВСТІЛУ СУТ я5УСУА ОЗЕТОАМВТТОАТМУТІ, попередник ПУПОГВРУОСУСОКІ УВЯРМІШЮОТАЗНУІГЕОМАРАОЮВАУ ізоформа з) САРЯВУБЕІТОВЕРОТТНІ УПЕМУЖВУНАЮМЕ5ТІРОУЕКЕ

І І МОЗ УМА УСКУБНРИВВМН ТППБРУУХУЗЕРРУПРЕЗЕА ЕМ

ТКТСВОРОСБІЕНАМІ ТТ СРУБУТОУВЕОСТЕРЕЖОЧТЕОАНІ,

ЕКМЕТЗАЗРЕВБАУСУНЕРНРЕВУВКЕРОСВІ УРЕ АРІ

РЕУРЕСТЕРЕРУАУМРА УМА СЕЕПУСАТМІЗУВУСРІРУ ПРОВ.

КІВ УБАУВІ ОТО УСВЕ ГЕ ЗАГБОГСМ АМЕТНАБТ5ОНСО

ЖАБЛЕНОСВЖАКУЗМЕВМАТНУРІІЕУУРОНТАВІРЕАСЕКІ,

ЕРХІТПРЕПХАКОЇ МЕРОВОЗМІЯ УБЕАУ ЗБЕРІ АСТАСЄСТОУР

ВВСРУРЗЕНУВІСЕВОКМІКНЕВЕВІЯ ЕЕПРУТ ВОМРЕЕІ ТА

ЖООХРЕРЕГЯМРОМЖМООКРЗЕЖТЛЕ УС УЗІВ Оу ТУ КУЄ

ЕМРОБЕВББАМРЕВОНА СВК У ДЕРЕ ООН М УМОВНЕ

ОБЕА5ВО МО

Нопередник, МРЕРЕТОКСТІЛУБАК І БВУСУАТОСЗЕТОАМОТТПАГМУТЕ, ізофорха В ПУТ ЕРА ОСУСОКГУВУРМН ЮА ТОМА КАСЄЮАУ

САРЕБУБГІТОКАРЕТТВЕЛ ЕМО КУВУПАСМЕБТІРОЖТК В.

МОЗ УМА УСКУБНРИОІВВМН ТІ БРУУХУЗЕРРУПРЕБЕА ЕМ

ТКІСЕСРОСКТНАМГ СРУБВУЄТУРЕСТЕ РОК ОХТЕОА КТГ.

ЕКМКТЗАЗРЕКАУСУНКРНРЕВУРКЕРВОКІЖРЕЕМІТТАРО

РЕУРІЮТЕРУАУМРАМОВОВЕОУСАІРІЧУРУИРІРУЮВЕОВ

РОБЕТОЕНІКІЧЕТЕК УК (ЗВО МО:3І

Попередник, МЕРЕНТОВОСТІЛЛ СН АТ Я УСУАТОЯЕТОАМЯТТОАТОЛ І,

Ізоферма є ПУПОТ ЕР ОСТОПКІУВЗРМИНЯ АХНЯТ І БОМАБАСОАУ

САРЗБУ5ЕЕТСВЕРІМІВІ ТІМ УВУНАСМЕВІ1РОХРКЕ

МОхУТМБУСКМЕНРОСІЗЕМН ТП ОБРУМУВЕРРУЦНРЕБЕК УМ

ТЕТСЕСРОСВЕПНАМО СРУПВУТПУРЕСТ РЕЖОВТЕОАЮТЬ,

ЕКМКТЗАБРЕРАУСУНКРНИРЕВТРЕБВОКОЖВЕМТТАРІЗ

ЕЕУРІКН РЕУАУМРА МЕН ОКЕ ПУ САТКІВУВУСРІВРУ ПЕС

КЕІКОЗУВАВУІ ПТОУСВЕЗАТІНМ КИ ОТГ АМОУТПАКТЕВНОСВ

ІМВІМТОВО Ю Мо)

Ї0ОО6З| Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 є зрілим людським білком І25 (ЗЕОІОМО:1). Як розкрито в цьому документі, 5ЕОІЮМО:1 являє собою канонічну амінокислотну послідовність людського білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу білок (25 може являти собою сплайс-ізоформу та/або варіант 5ЕОІОМО:1, які утворюються в результаті транскрипції на іншій ділянці ініціації в межах 5" ОТА гену І25. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок 25 може бути гомологом або аналогом зрілого людського білку І25. Наприклад, гомолог або аналог зрілого людського білку

І25 може бути модифікованим зрілим людським білком І25, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з білком І25 дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ МО:1), та при цьому зберігати значну частину активності білку І25. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок

І25 є в значній мірі гомологічним зрілому людському білку 25 (5ЕБЕО ІЮ МО:1). У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 містить амінокислотну послідовність щонайменше на 50 Зо, 55 9б, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 У, 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 9595, 96 95, 97 965, 98965, 9995 або більше гомологічну 5ЕБЕО ІО МО:1. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок (25 є в значній мірі ідентичним зрілому людському білку 25 (5ЕБЕО ІЮ МО:1). У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 містить амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 90, 60 95, 65 У, 70 Уо, 75 Чо, 80 Фо, 85 9», 90 95, 91 90, 92 95, 93 9, 94 90, 95 95, 96 95, 97 У, 98 90, 99 90 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:1. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 містить фрагмент або частину зрілого людського білку І25. 00641) В альтернативному варіанті рекомбінантнийбілок І25 є повнорозмірним білком 125. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок 25 може бути гомологом або аналогом повнорозмірного людського білку 125. Наприклад, сгомолог або аналог повнорозмірного людського білку 25 може бути модифікованим повнорозмірним людським білком І25, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з повнорозмірним білком І25 дикого типу або природного походження (наприклад,

ЗЕО ІО МО:2), і при цьому зберігати значну частину активності білку І25. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 є в значній мірі гомологічним повнорозмірному людському білку 25 (5ЕО ІЮ МО:2). Наприклад, рекомбінантнийбілок І25 може містити амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 95, 60 95, 65 Уо, 70 95, 75 о, 80 то, 85 то, 90 зо, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або більше гомологічну

ЗЕО ІЮ МО:2. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 є в значній мірі ідентичним 5ЕО ІЮ МО:2. Наприклад, рекомбінантнийбілок 25 може містити амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 95, бО Зо, 65 У, 70905, 7595, 80 У, 8595, 90 90, 91 о, 92 96, 93 о, 94 90, 95 Уо, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ МО:2. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 містить фрагмент або частину повнорозмірного людського білка І25. У контексті цього документу повнорозмірний білок І25 зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.

Ї0065| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок 25 є ізоформою а людського білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 може бути

Зо гомологом або аналогом ізоформи а людського білку І25. Наприклад, гомолог або аналог ізоформи а людського білку І25 може бути модифікованою ізоформою а людського білку 125, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій у порівнянні з ізоформою а людського білку І25 дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ

МО:3), і при цьому зберігати значну частину активності білку 125. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 є в значній мірі гомологічною ізоформою а людського білку І25 (5ЕО ІЮ МО:3). Наприклад, рекомбінантнийбілок 25 може містити амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 905, 60 95, 65 95, 70 90, 75 95, 80 95, 85 о, 90 оо, 91 96, 92 95, 93 95, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Уо, 98 95, 99 95 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ

МО:3. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 є в значній мірі ідентичним ЗЕО ІЮ МО:3. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 містить амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 90, 60 95, 65 У, 70 Уо, 75 Чо, 80 Фо, 85 9», 90 95, 91 90, 92 95, 93 9, 94 90, 95 95, 96 95, 97 У, 98 90, 99 90 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ

МО:3. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25, придатний для цілей цього винаходу, містить фрагмент або частину ізоформи а людського білку І25. У контексті цього документу ізоформа а людського білку І25 зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.

Ї0О6б6| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок 25 є ізоформою Б людського білку І25. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 може бути гомологом або аналогом ізоформи Б людського білку І25. Наприклад, гомолог або аналог ізоформи р людського білку І25 може бути модифікованою ізоформою Б людського білку 125, що містить одну або більше амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій в порівнянні з ізоформою р людського білку І25 дикого типу або природного походження (наприклад, ЗЕО ІЮ

МО:4), і при цьому зберігати значну частину активності білку 125. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок 25 є в значній мірі гомологічним ізоформі Б людського білку І25 (ЗЕО ІЮ МО:4). Наприклад, рекомбінантнийбілок І25 може містити амінокислотну послідовність щонайменше на 50 95, 55 905, 60 95, 65 95, 70 90, 75 95, 80 95, 85 о, 90 оо, 91 96, 92 95, 93 95, 94 95, 95 90, 96 Уо, 97 Уо, 98 95, 99 95 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ

МО:4. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент 125 є в значній мірі ідентичним ЗЕО ІЮ

МО 4. У деяких варіантах реалізації винаходу фермент І25 містить амінокислотну послідовність щонайменше на 50 Зо, 55 9б, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 У, 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, бо 95 Фо, 96 о, 97 У, 98 95, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮ МО:4. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантнийбілок І25 містить фрагмент або частину ізоформи Б людського білку

І25. У контексті цього документу ізоформа р людського білку І25 зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.

Ї0067| Гомологи або аналоги людських білків І25 можна отримати відповідно до способів зміни поліпептидної послідовності, відомих фахівцеві в цій галузі техніки, такими як ті, що можна знайти в посиланнях, які описують подібні способи. У деяких варіантах реалізації винаходу консервативні амінокислотні заміни включають заміни, що проводяться для амінокислот в межах наступних груп: (а) М, І, С, М; (Б) Е, М, УМ; (с) К, ЕК, Н; (9) А, о; (є) 5, Т; (0, М; та (9УЕ, О. У деяких варіантах реалізації винаходу "консервативна амінокислотна заміна" належить до амінокислотної заміни, яка не призводить до зміни відносного заряду або характерних розмірів білку, в якому проводиться амінокислотна заміна. 0068) У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні білки І25 містять компонент, який зв'язується з рецептором на поверхні клітин-мішеней для того, щоб полегшити клітинне поглинання та/або лізосомне націлювання. Наприклад, таким рецептором може бути катіон- незалежний манозо-б6-фосфатний рецептор (СІ-МРЕ), який зв'язує залишки манозо-6-фосфату (МбР). Додатково, СІ-МРК також зв'язує інші білки, включаючи ІСЕ-ІЇ. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 містить залишки МбР на поверхні білка. Зокрема, рекомбінантний білок 125 може містити біс-фосфорильовані олігосахариди, які характеризуються більш високою аффинністю зв'язування з СІ-МРЕК. У деяких варіантах реалізації винаходу придатний фермент в середньому містить до приблизно 2095 біс- фосфорильованих оолігосахаридів на фермент. В інших варіантах реалізації винаходу придатний фермент може містити приблизно 10 95, 15 95, 18 95, 20 95, 25 95, ЗО Ус, 35 Ус, 40 Об, 45 ув, 50 95, 55 9о, 60 95 біс-фосфорильованих олігосахаридів на фермент.

Ї00О69| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні ферменти І25 можуть бути зшиті з компонентом для лізосомного націлювання, який здатний зв'язуватися з рецептором на поверхні клітин-мішеней. Компонентом, придатним для лізосомного націлювання, може бути

ІСЕ-І, 1ЕБ-ІІ, КАР, ро, а також їхні варіанти, гомологи або фрагменти (наприклад, включаючи ті пептиди, що містять послідовність, щонайменше на 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 96 або 95 95 ідентичну пептидним послідовностям зрілих людських ІСБ-Ї, ІСБ-ІЇ, КАР, р9е7 дикого типу).

Зо Компонент для лізосомного націлювання може бути кон'юЮгованим або зшитим з білком або ферментом І25у М-кінці, С-кінці або з внутрішньої сторони.

Одержання рекомбінантних білків І25

ЇО0О70| Цей винахід можна застосовувати для очищення рекомбінантного білку/25, одержаного різними способами. Наприклад, білок І25 може бути одержаний рекомбінантним способом за допомогою системи клітин-хазяїв, сконструйованих для експресії нуклеїнової кислоти, кодуючої І25. В альтернативному варіанті білокі25 може бути одержаний шляхом активації ендогенного гену25.

ЇО0О71| Передбачається, що цей винахід можна застосовувати для очищення рекомбінантного білкуї25, отриманого за допомогою різних експресійних систем. Придатні експресійні системи включають, наприклад, яйцеклітини, клітини бакуловірусів, рослин, дріжджів або ссавців. 00721 У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні ферменти І25 виробляються в клітинах ссавців. Необмежуючі приклади клітин ссавців, які можна застосовувати відповідно до цього винаходу, включають лінію мієломи мишей штаму ВАСВ/с (МБО/Л, ЕСАСС Мо:85110503); ретинобласти людини (РЕК.Сб (СтгисСеїЇ, І еідеп, Те Меїйпегіапа5)); ниркову лінію мавп СМ1, трансформовану 540 (СО5-7, АТСС СК 1651); ембріональну ниркову лінію людини (клітини 293 або 293, субклонованідлявирощуваннявсуспензійний культурі, сгапат еї аї., У. Сеп Мігої., 36:59 (1977)); клітинну лінію фібросаркоми людини (наприклад, НТ1080); клітини нирок новонародженого хом'яка (ВНК, АТСС СС 10); клітини яєчників китайського хом'яка ж/- ОНЕВ (СНО, Опаць Апа Спавіп, Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА, 77:4216 (1980)); клітиниСертолімиші (ТМА,

Маїпег, Віої. Аергод., 23:243-251 (1980))) клітининирокмавпи (СМ! АТС СС 70); клітининирокафриканськоїзеленоїмавпи (МЕНО-76, АТОС СВІ-1587); клітиникарциномишийкиматкилюдини (Не а, АТОС СО 2); клітининироксобаки (МОСК, АТОС

СС 34); клітинипечінкисірогощура (ВНІ ЗА, АТОС СВІ 1442); клітинилегенівлюдини (М/138,

АТСС СОЇ 75); клітинипечінкилюдини (Нер 2, НВ 8065); пухлинамолочноїзалозимиші (ММТ 060562, АТОС СІ 51); клітини ТВІ (Маїнег вї а!., АппаЇє МУ Асад. 5сі., 383:44-68 (1982)); клітини

МАС 5; клітини Е54; талініюгепатомилюдини (Нер С).

ІО0ОО7ЗІ Удеякихваріантахреалізаціївинаходузазначеніспособизгідно З цим винаходомзастосовуютьдляочищеннярекомбінантнихферментіві25, отриманихзклітинлюдини бо (наприклад, НТ1080). У деяких варіантах реалізації винаходу зазначені способи згідно зцим винаходом застосовують для очищення рекомбінантних ферментів І25, одержаних з клітин сно. 00741 Як правило, клітини, які сконструйовані для експресії рекомбінантного І25, можуть містити трансген, кодуючий описаний в цьому документі рекомбінантний білок І25. Слід враховувати, що нуклеїнові кислоти, кодуючі рекомбінантний І25 можуть містити регуляторні послідовності, регуляторні послідовності генів, промотори, некодуючі послідовності та/або інші придатні послідовності для експресії рекомбінантного І25. Як правило, кодуюча область функціонально зв'язана з одним або більше з цих компонентів нуклеїнової кислоти. 0075) "Регуляторні послідовності", як правило, належать до нуклеотидних послідовностей, розташованих вище (5'некодуючі послідовності), в межах або нижче (З'некодуючі послідовності) кодуючої послідовності, які впливають на транскрипцію, процесинг або стабільність РНК або трансляцію асоційованої з нею кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати промотори, трансляційні лідерні послідовності, інтрони та послідовності впізнавання поліаденілювання. У деяких випадках "регуляторні послідовності" також називають "регуляторними послідовностями генів".

І0076| "Промотором" зазвичай називають нуклеотидну послідовність, здатну управляти експресією кодуючої послідовності або функціональної РНК. У загальному випадку кодуюча послідовність розташована у напрямку З'відносно послідовності промотора. Послідовність промотора складається з близькорозташованихта більш віддалених вищерозташованих елементів, при цьому останні часто називають енхансерами. Відповідно, "енхансер" являє собою нуклеотидну послідовність, яка може стимулювати активність промоторута може бути природним елементом промотору або гетерологічним елементом, доданим для того, щоб підвищити рівень або тканинну специфічність промотору. Промотори можуть бути цілком одержані з нативного гену або можуть бути складені з різних елементів, одержаних з різних промоторів природного походження, або навіть містити синтетичні нуклеотидні сегменти.

Фахівцям у цій галузі техніки зрозуміло, що різні промотори можуть управляти експресією гену в різних тканинах або типах клітин, або на різних стадіях розвитку, або у відповідь на різні зовнішні умови.

Ї0077| "З'некодуючими послідовностями" зазвичай називаються нуклеотидні послідовності, які розташовані нижче кодуючої послідовності, і включають послідовності впізнавання поліаденілювання та інші послідовності, кодуючі регуляторні сигнали, здатні впливати на процесинг мРНК або експресію генів. Сигнал поліаденілювання зазвичай характеризується впливом на додавання трактів поліаденілової кислоти до З'кінця попередника мРНК.

ІЇ0078| "Трансляційною лідерною послідовністю" або "б'некодуючими послідовностями" зазвичай називаються нуклеотидні послідовності, розташовані в гені між послідовністю промоторута кодуючою послідовністю. Трансляційна лідерна послідовність присутня в повністю процесованій мРНК вище послідовності ініціації трансляції. Трансляційна лідерна послідовність може впливати на процесинг первинного транскрипту в мРНК, стабільність мРНК або трансляційну ефективність. 0079 Як правило, термін "функціонально зв'язаний" належить до з'єднання двох або більше нуклеотидних фрагментів в один нуклеотидний фрагмент таким чином, що один фрагмент впливає на функціонування іншого. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він здатний впливати на експресію цієї кодуючої послідовності (тобто, якщо кодуюча послідовність знаходиться під транскрипційним управлінням промотора). Кодуючі послідовності можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями в смисловій або антисмисловій орієнтації.

Ї0О80| Кодуюча область трансгену може містити одну або більше мовчазних мутацій для оптимізації частоти використання кодонів для конкретного типу клітин. Наприклад, кодони трансгенуї25 можна оптимізувати для експресії в клітинах хребетних. У деяких варіантах реалізації винаходу кодони трансгенуІ25 можна оптимізувати для експресії в клітинах ссавців. У деяких варіантах реалізації винаходу кодони трансгенуІ25 можна оптимізувати для експресії в клітинах людини. 0081 У деяких випадках конструкція може містити додаткові компоненти, такі як один або більше з наступних елементів: сайт сплайсингу, послідовність енхансеру, ген маркеру, що селектується, під управлінням відповідного промотору, ген маркеру, що амплифікується, під управлінням відповідного промоторута ділянка прикріплення до матриксу (ДПМ) або будь-який інший відомий в ційгалузі техніки елемент, який підвищує експресію області, в яку він вставлений. 00821 Після трансфікування або трансдукування в клітини-хазяїніпридатний вектор може бо експресувати позахромосомо (епісомально) або інтегруватися в геном клітини-хазяїна.

Активація рекомбінантних білків І25 0083) Як правило, рекомбінантний білок 25 активують за допомогою посттрансляційної модифікації консервативного цистеїну (відповідного амінокислоті 59 зрілого людського І25) в формілгліцін, також відомий під назвою 2-аміно-3-оксопропіонової кислоти або оксо-аланіну.

Таку посттрансляційну модифікацію можна здійснити за допомогою ферменту, відомого під назвою формілгліцін-утворюючого ферменту (ЕСЕ). Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантні ферменти І25 виробляються в клітинах, які експресують також білок

ЕСЕ. У конкретних варіантах реалізації винаходу рекомбінантні ферменти І25 виробляються в клітинах, які характеризуються підвищеною або посиленою експресією білка ЕСЕ. Наприклад, клітини можна сконструювати для надекспресії ЕСЕ в комбінації з рекомбінантним І25 для полегшення одержання препаратів І25, що містять високі рівні активного ферменту. У деяких варіантах реалізації винаходу надекспресію ЕСЕ досягають за допомогою експресії (наприклад, надекспресії) екзогенного ЕСЕ за допомогою стандартних рекомбінантних технологій. У деяких варіантах реалізації винаходу надекспресію ЕОЕ досягають за допомогою активації або посилення експресії ендогенного ЕСЕ, наприклад, активуючи або посилюючи промотор ендогенного гену ЕСЕ. У деяких випадках нуклеїнова кислота, кодуча рекомбінантний 125, та нуклеїнова кислота, кодуюча рекомбінантний білок ЕСЕ, зв'язані нуклеїнової кислотою (наприклад, спейсерною послідовністю), що має послідовність, відповідну ділянці внутрішньої посадки рибосоми.

ЇОО84| У цьому винаході можна застосовувати будь-який ЕСЕ, що має здатність перетворювати цистеїн у формілгліцін. Типові нуклеотидні та амінокислотні послідовності білків

ЕСЕ наведені у 05 2004-0229250, повний вміст якої, що відноситьсядо таких послідовностей, та самі послідовності в повному обсязі включені в цей документ шляхом посилання. Слід враховувати, що нуклеїнові кислоти, кодуючі рекомбінантний ЕСЕ можуть містити регуляторні послідовності, регуляторні послідовності генів, промотори, некодуючі послідовності та/або інші придатні послідовності для експресії рекомбінантного ЕСЕ. Як правило, кодуюча область функціонально зв'язана з одним або більше з цих компонентів нуклеїнової кислоти.

Середовища та умови для культивування клітин 0085) Для отримання рекомбінантного білка І25 можна застосовувати різні середовища та

Зо умови для культивування клітин. Наприклад, рекомбінантний білок 25 можна отримати у середовищі, що містить сироватку або безсироватковому середовищі. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок 25 отримують убезсироватковомусередовищі. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 отримують унетваринному середовищі, тобто, середовищі, в якому відсутні компоненти тваринного походження. У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок 25 отримують в хімічно визначеному середовищі. Термін "хімічно визначенеживильне середовище", який використовується в цьому документі, належить до середовища, практично всі хімічні компоненти якого відомі. У деяких варіантах реалізації винаходу хімічно визначене живильне середовище не містить компонентів тваринного походження, таких як сироватка, сироваткові білки (наприклад, альбумін або фетуїн) та інші компоненти. У деяких випадках хімічно визначене середовище містить один або більше білків (наприклад, білкових факторів росту або цитокінів). У деяких випадках хімічно визначене живильне середовище містить один або більше білкових гідролізатів. В інших випадках хімічно визначене живильне середовище є безбілюювим середовищем, тобто, безсироватковим середовищем, яке не містить білків, гідролізатів або компонентів з невідомоюкомпозицією. 0086) Вдеяких варіантах реалізації винаходу хімічно визначене живильне середовище може бути доповненим одним або більше компонентами тваринного походження. Такі компоненти тваринного походження включають, але не обмежуються цим, фетальну телячу сироватку, кінську сироватку, козлячу сироватку, ослячу сироватку, людську сироватку та сироваткові білки, такі як альбуміни (наприклад, бичачий сироватковий альбумін або людський сироватковий альбумін).

Ї0087| Для отримання рекомбінантних білків 25 у промислових масштабах можна застосовувати різні умови клітинного культивування, включаючи, але не обмежуючись цим, культивування в ролерних флаконах, періодичне культивування в біореакторах та культивування з підживленням в біореакторах.Удеяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 отримують за допомогою клітин, культивованих в суспензії. Удеяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний білок І25 отримують за допомогою адгезивних клітин. 0088) Типові середовища для клітин та умови культивування описані в розділі Прикладів.

Додаткові типові способи такомпозиції для отримання рекомбінантного білка І25 описані в бо попередній заявці під назвою "Способи та композиціїдля отримання рекомбінантної ідуронат-2-

сульфатази", поданої на реєстрацію одночасно з цим документом, повний вміст якої включений в цей документ шляхом посилання.

Очищення рекомбінантного білка І25

Ї0089| У деяких варіантах реалізації винаходу в цьому винаході запропонований спосіб очищення рекомбінантного білка І25 з неочищеного препарату за допомогою процесу на основі одного або більше способів з аніонообмінної хроматографії, катіонообмінної хроматографії, хроматографії з комбінованим режимом та хроматографії з гідрофобною взаємодією. У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згідно зцим винаходом включає менше 6 (наприклад, менше 5, менше 4, або менше 3) хроматографічних етапів. У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згідно зцим винаходом включає 2, 3, 4 або 5 хроматографічних етапів. У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згідно зцим винаходом включає 4 хроматографічних етапи. У деяких варіантах реалізації винаходу зазначений спосіб згідно зцим винаходом включає проведення хроматографічних етапів в такому порядку: аніонообмінна хроматографія, хроматографія з комбінованим режимом, катіонообмінна хроматографія та хроматографія з гідрофобною взаємодією.

Неочищений препарат

ЇО090| У контексті цього документу неочищений препарат може являти собою будь-який біологічний матеріал, включаючи необроблений біологічний матеріал, що містить рекомбінантний білок І25. Наприклад, неочищений препарат може являти собою необроблене клітинне культуральне середовище, що містить рекомбінантний білок І25, який секретується з клітин (наприклад, клітин ссавців), що виробляють білок І25, або вихідні клітинні лізати, що містять білок І25. У деяких варіантах реалізації винаходу неочищений препарат може являти собою частково оброблене клітинне середовище або клітинні лізати. Наприклад, клітинне середовище або клітинні лізати можна концентрувати, розводити, обробляти шляхом вірусної інактивації, вірусної обробки або вірусного видалення. У деяких варіантах реалізації винаходу для вірусного видалення, серед іншого, можна застосовувати нанофільтрацію та/або хроматографічні методи. У деяких варіантах реалізації винаходу для вірусної інактивації, серед іншого, можна застосовувати інактивацію розчином, інактивацію детергентом, пастеризацію, інактивацію кислотним рН та/або інактивацію ультрафіолетом. Клітинне середовище або

Ко) клітинні лізати також можна обробляти протеазами, ДНКазами та/або РНКазами для того, щоб знизити рівень білка та/або нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК або РНК) клітини-хазяїна. У деяких варіантах реалізації винаходу необроблені або частково оброблені біологічні матеріали (наприклад, клітинне середовище або клітинний лізат) можна заморожувати та зберігати при обраній температурі (наприклад, 2-8 "С, -4 С, -25 70, -757С) на протязі деякого часу, а потім розморожувати для очищення. У контексті цього документа неочищеним препаратом також називають стартовий матеріал або завантажувальний матеріал.

Аніонообмінна хроматографія

ЇО0О91| У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані способи очищення рекомбінантного білка І25 включають аніонообмінну хроматографію. Коротко, аніонообмінна хроматографія являє собою хроматографічний спосіб, заснований на заряд-зарядових взаємодіях між негативно зарядженоюсполукоюта позитивно зарядженою смолою. У деяких варіантах реалізації винаходу аніонообмінна хроматографія являє собою сильну аніонообмінну хроматографію. У деяких варіантах реалізації винаходу аніонообмінну хроматографію застосовують на першому етапі очищення терапевтичного білку (наприклад, рекомбінантного

І25). 00921 Типові аніонообмінні смоли включають, але не обмежуються цим, четвертинні смоли амінів або "О-смоли" (наприклад, Капто"М-О0, С-Сефарозу?7, ОАЕ Сефадекс?); діетиламіноетанові (ДЕАЕ) смоли (наприклад, ДЕАЕ-Трисакрил?, ДЕАЕ Сефарозуг?, бензоїльований нафтоїльований ДЕАЕ, діетиламіноетил Сефацель-У); смоли Атрбегієї?; смоли

БО Атрепувзі?; смоли Атрегійе"(наприклад, АтрепйесбІвА-67, сильноосновну Атренпіїе?, слабоосновну Атрепіїеє?), холестирамінову смолу, смоли РгоРас"(наприклад, РгоРасе5БАХ- 10,РгоРасем/АХ-10, РгоРасемуСхХ-10); смоли Т5К-СЕЇ (наприклад, Т5Кає! ОЕАБ-МРЕА; Т5Каєв!

РЕАБ-5РМУ); та смоли Ассіаїт-. У певних варіантах реалізації винаходу аніонообмінною смолою є 0О-смола.

Ї0О093| Типові рухомі фази для аніонообмінної хроматографії включають відносно полярні розчини, такі як вода, ацетонітрил, органічні спирти, такі як метанол, етанол і ізопропанол, або розчини, що містять 2-(М-морфоліно)-етансульфонову кислоту (МЕС). Таким чином, в певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза містить приблизно 0 95, 1 95, 2 9, 4 90, 6 95, 8 У, 10 ув, 12 Фо, 14 У, 16 У, 18 У, 20 У, 25 Ую, ЗО У, 35 У, 40 95, 45 У, 50 95, 55 У, 60 90, 65 о, 70 90, 60 756, 8095, 8595, 90 95, 9595 або приблизно 10095 полярного розчину.Впевних варіантах реалізаціївинаходурухома фаза міститьвідприблизно 1 95 до приблизно 100 95, від приблизно 596 до приблизно 9595, від приблизно 1095 до приблизно 90 95, від приблизно 2095 до приблизно 80 95, від приблизно 30 95 до приблизно 70 95 або від приблизно 40 95 до приблизно 60 95 полярного розчину в будь-який заданий час протягом етапу поділу. 0094) У загальному випадку рухома фаза містить сіль. Наприклад, сіль (наприклад, хлорид натрію) може елююватизв'язаний білок з аніонообмінної колонки (наприклад, хлорид є протиїоном та відбувається його обмін з цільовим білком, який згодом виділяється). У деяких варіантах реалізації винаходу рухома фаза містить концентрацію солі від приблизно 0 до приблизно 1,0 М, наприклад, від приблизно 0 до приблизно 0,8 М, від приблизно 0 до приблизно 0,6 М, від приблизно 0 до приблизно 0,5 М, від приблизно 0 до приблизно 0,4 М, від приблизно 0,05 М до приблизно 0,50 М, від приблизно 0,10 М до приблизно 0,45 М, від приблизно 0,10 М до приблизно 0,40 М або від приблизно 0,15 М до приблизно 0,40 М.Удеяких варіантах реалізаціївинаходурухома фаза містить концентрацію солі, що міститьприблизно 0,01 М, 0,02 М, 0,03М,0,04М,0,05М,0,06М,0,07 М,0,08М,0,09М,0,1М,02М,0,3М,0,4М,0,5М,0,6 М, 0,7

М, 0,8 М, 0,9 М або 1,0 М.Вдеяких варіантах реалізації винаходу концентрація солі в рухомій фазі є градієнтною (наприклад, лінійно- або нелінійно-градієнтною).Вдеяких варіантах реалізації винаходу концентрація солі в рухомій фазі є постійною.Вдеяких варіантах реалізації винаходу концентрація солі в рухомій фазі може покроково підвищуватися або знижуватися.

Ї0095| Як правило, рухома фаза є забуференою.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза не є забуференою.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН від приблизно 5 до приблизно 14. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН від приблизно 5 до приблизно 10. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН від приблизно 5 до приблизно 7. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН, що становить приблизно 6,5.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рнН, що становить приблизно 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 або 10.

ЇО096| У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням "у аніонообміннухроматографічну колонку (наприклад, О-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до рівня рН, що становить приблизно 5,0, 5,5,6,0, 6,5, 7,0 або 7,5, і провідності, що становить приблизно 2 мсм/см, 4 мсм/см, 6 мсм/см, 8 мем/см, 10 мем/см, 12 мем/см, 14 мсм/см, 16 мсм/см, 18 мсм/см або 20 мсм/см. рН можна доводити, застосовуючи ацетат натрію (наприклад, 1 М), а провідність можна доводити, застосовуючи хлорид натрію (наприклад, 5 М). Після завантаження аніонообміннухроматографічну колонку можна промивати, застосовуючи відмивний буфер, що містить концентрацію солі (наприклад, Масі) в діапазоні від приблизно 140 ммдо200 мм (наприклад, приблизно 140 мм, 145 мм, 150 мм, 155 мм, 160 мм, 165 мм, 170 мм, 175 мм, 180 мм, 185 мм, 190 мм, 195 мм або 200 мм) з рН, що становить приблизно 5,0-7,5 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0або 7,5). Аніонообміннухроматографічну колонку можна елюювати, застосовуючи елююючий буфер, який характеризується лінійним градієнтом Масі.

Придатний лінійний градієнт Мас! може характеризуватися діапазоном, що становить приблизно 0-500мм Масі (наприклад, приблизно 0-400 мм, приблизно 0-350 мм, приблизно 0- 300 мм, приблизно 50-500 мм, приблизно 150-500 мм, приблизно 150-450 мм, приблизно 150- 400 мм).

Катіонообмінна хроматографія

ЇО0О97| У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані способи очищення рекомбінантного білка (25 включають катіонообмінну хроматографію. Коротко, катіонообмінна хроматографія являє собою хроматографічний спосіб, заснований на заряд-зарядових взаємодіях між позитивно зарядженоюсполукоюта негативно зарядженою смолою. У деяких варіантах реалізації винаходу катіонообмінна хроматографія являє собою сильну катіонообмінну хроматографію. 0098) На практиці катіонообмінну хроматографію в загальному випадку проводять як з сильною, так і зі слабкою катіонообмінною колонкою, що містить сульфонієві іони, або зі слабким катіонообмінником, який зазвичай містить карбоксиметильну (КМ) або карбоксилатну (ККС) функціональну групу. Багато придатних катіонообмінних смол відомі в цій галузі техніки і є комерційно доступними, включаючи, але не обмежуючись цим, 5Р-Сефарозу?, СМ Сефарозу?є; смоли Атрегієї?; смоли Атрегіузі?; смоли Атрегійе"(наприклад, АтрегпПедІкА120); смоли

РгоРасУ(наприклад, РгоРасе5ОСХ-10, РгоРасемубх-10, РгоРасемусх-10); смоли ТекК-

СЕЇ З(наприклад, Т5оКавеї! ВіоАввіві 5; ТОКдвє! 5Р-2 ЗМУ, Т5Кавєї! 5Р-5 РМ; Т5Кадеє! 5Р-МРА; Т5Каєеїі

ЗОоХ; ТеКавєї 5Р-5ТАТ; Т5Кде! СМ-5РМУ; Т5Кдеє!ї ОАрак-А; Т5Кдеї СМ-25МУ, Т5Кде! СМ-3З5МУ і 60 ТеКадєї СМ-5ТАТ); і смоли Ассіайїте.Впевних варіантах реалізації винаходу катіонообмінною смолою є смола 5Р-Сефароза?.

Ї0099| Типові рухомі фази для катіонообмінної хроматографії включають відносно полярні розчини, такі як вода, ацетонітрил, органічні спирти, такі як метанол, етанол та ізопропанол, або розчини, що містять 2-(М-морфоліно)-етансульфонову кислоту (МЕС). Таким чином, в певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза містить приблизно 0 95, 1 95, 2 9, 4 90, 6 95, 8 У, ув, 12 Фо, 14 У, 16 У, 18 У, 20 У, 25 Ую, ЗО У, 35 У, 40 95, 45 У, 50 95, 55 У, 60 90, 65 о, 70 90, 756, 8095, 8595, 90 95, 9595 або приблизно 10095 полярного розчину.Впевних варіантах реалізаціївинаходурухома фаза міститьвідприблизно 1 95 до приблизно 100 95, від приблизно 596 до приблизно 9595, від приблизно 1095 до приблизно 90 95, від приблизно 2095 до 10 приблизно 80 95, від приблизно 30 95 до приблизно 70 95 або від приблизно 40 95 до приблизно 60 95 полярного розчину в будь-який заданий час протягом етапу розділення. 00100) У загальному випадку рухома фаза містить сіль. Наприклад, сіль (наприклад, хлорид натрію, фосфат натрію тощо) може елююватизв'язаний білок з катіонообмінної колонки (наприклад, натрій є протиїоном та відбувається його обмін з цільовим білком, який згодом виділяється). В деяких варіантах реалізації винаходу рухома фаза містить концентрацію солі від приблизно 0 до приблизно 1,0 М, наприклад, від приблизно 0 до приблизно 0,8 М, від приблизно

О до приблизно 0,6 М, від приблизно 0 до приблизно 0,5 М, від приблизно 0 до приблизно 0,4 М, від приблизно 0,05 М до приблизно 0,50 М, від приблизно 0,10 М до приблизно 0,45 М, від приблизно 0,10 М до приблизно 0,40 М або від приблизно 0,15 М до приблизно 0,40 М.В деяких варіантах реалізації винаходу рухома фаза містить концентрацію солі, яка становить приблизно 0,01М,0,02М,0,03М,0,04 М, 0,05М,0,06 М,0,07 М, 0,08 М,0,09М,0,1М,02М,03М, 04 М, 0,5 М,0,6 М, 0,7 М, 0,8 М, 0,9 М або 1,0 М.Вдеяких варіантах реалізації винаходу концентрація солі в рухомій фазі є градієнтною (наприклад, лінійно- або нелінійно-градієнтною).Вдеяких варіантах реалізації винаходу концентрація солі в рухомій фазі є постійною.Вдеяких варіантах реалізації винаходу концентрація солі в рухомій фазі може покроково підвищуватися або знижуватися.

Ї00101| Як правило, рухома фаза є забуференою.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза не є забуференою.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН від приблизно 5 до приблизно 14. У певних варіантах реалізації винаходу

Зо рухома фаза забуферена до рН від приблизно 5 до приблизно 10. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН від приблизно 5 до приблизно 7. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рН, що становить приблизно 6,5.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза забуферена до рнН, що становить приблизно 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 або 10.

ЇО0102| У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням "у катіонообміннухроматографічну колонку (наприклад, ЗР-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до провідності в діапазоні між приблизно 1 мем/см і 20 месм/см (наприклад, між приблизно 1 мсм/см і 15 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см і 10 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см і 8 мсм/см, між приблизно 1 мсм/см і б мсм/см, між приблизно 1 мсм/см і 4 мсм/см, між приблизно 2 мсм/см і 4 мсм/см). У конкретних варіантах реалізації винаходу перед завантаженням у катіонообміннухроматографічну колонку (наприклад, 5Р-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до провідності в діапазоні між приблизно 2 мсм/см та 4 мсм/см (наприклад, 2, 2,5, З, 3,5 або 4 мсм/см). Значення провідності можна доводити, розводячи неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію Н2О у співвідношенні, що становить, наприклад, 1:1, 1,1:1, 1,21, 1,3:1, 1,41, 1,5:1, 2,0:1,2,5:1, 3,0:1, 4,0:1, 5,0:1 або 10:1. Значення провідності також можна доводити діафільтрацією у відповідний буфер. Провідність також можна доводити за допомогою діафільтрації у відповідний буфер. У деяких варіантах реалізації винаходу катіонообмінну хроматографію проводять на колонці за рівня рН, що становить приблизно 5,0- 6,5 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0 або 6,5). У деяких варіантах реалізації винаходу катіонообмінну хроматографію проводять на колонці з буфером, що містить концентрацію фосфату (наприклад, МаРох) в діапазоні від приблизно 0,01 М до приблизно 0,1 М (наприклад, приблизно 0,01 М, 0,02 М, 0,03 М, 0,04 М, 0,05 М, 0,06 М, 0,07 М, 0,08 М, 0,09 М або 0,1 М). У деяких варіантах реалізації винаходу придатний рівень рН становить приблизно 5,0-6,5 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0 або 6,5).

Хроматографія з комбінованим режимом

ІЇ00103| Вважається, що гідроксиапатитова хроматографія (НА) є "псевдоаффинною" хроматографією або іонообмінною хроматографією з "комбінованим режимом", і може застосовуватися відповідно до цього винаходу. Гідроксиапатит являє собою унікальну форму бо фосфату кальцію, застосовувану для фракціонування та очищення біологічних молекул. У деяких випадках можна застосовувати кристалічний гідроксиапатит, проте неміцність кристалів може обмежувати швидкості потоків та/або довговічність колонки. Два типи хімічно чистого керамічного гідроксиапатиту - керамічний огідроксиапатит для СНтТ типів ШІ - є макропористимита сферичними та можуть застосовуватися при високих швидкостях потоків та тисках. Тип І зазвичай характеризується високою здатністю зв'язування білків, у той час як тип ЇЇ зазвичай характеризується більш низькою здатністю зв'язування білків. Загальною формулою гідроксиапатиту є Сас(РОз)(ОН)(Каугазакі, еї а!1985). Функціональні групи містять позитивно заряджені пари іонів кальцію кристалу (С-ділянки) та кластери з шести негативно заряджених атомів кисню, зв'язані з триплетами фосфатів кристалу (Р-ділянки). С-ділянки, Р-ділянки та гідроксили розподілені в визначеному порядку на кристалічній поверхні, що в загальному випадку призводить до складної взаємодії з білками та іншими молекулами. 00104) Зразок можна завантажувати в НА-колонку в фосфатний буфер зі слабкою іонною силою (наприклад, 1-40 мм фосфат натрію або калію) або при нейтральному або практично нейтральному рн. У деяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням у колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонку) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до концентрації фосфату (наприклад,

МаРозх) в діапазоні від приблизно 0,001 М до приблизно 0,01 М (наприклад, приблизно 0,001 М, 0,002 М, 0,003 М, 0,004 М, 0,005 М, 0,006 М, 0,007 М, 0,008 М, 0,009 М або 0,01 М) та рівня рН, що становить приблизно 5,0-6,5 (наприклад, приблизно 5,0, 5,5, 6,0 або 6,5). Завантажену НА- колонку зазвичай промивають відмивним буфером з концентрацією фосфату, порівняною з відповідною концентрацією для завантажувального буфера. У деяких варіантах реалізації винаходу колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонку) після завантаження промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить фосфат (наприклад, 1- 10 мм фосфат натрію або калію) з нейтральними або практично нейтральним рН. Наприклад, придатнийвідмивнийбуфер може містити концентрацію фосфату, що становить приблизно 1 мм, 2 мм, З мм, 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм або 10 мм. У деяких варіантах реалізації винаходу може бути доцільно збільшувати кількість фосфату увідмивному буфері для того, щоб створити більш жорсткі умови від відмивання. Передбачається, що рівні МЄР, зокрема, рівні ди-

МБбР, на поверхні білків І25 важливі для лізосомного націлювання. Підвищена концентрація

Зо фосфату в відмивному буфері може вибірково утримувати білки І25 з високими рівнями МбР, зокрема, ди-МбР, на НА-колонці. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу доцільний відмивний буфер може містити концентрацію фосфату більшу, ніж 10 мм, 11 мм, 12 мМ, 13 мм, 14 мм, 15 мм, 16 мм, 17 мм, 18 мм, 19 мм, 20 мм. У деяких варіантах реалізації винаходу завантажену колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА- колонку) промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить концентрацію фосфату в діапазоні, що становить приблизно 10-20 мм (наприклад, приблизно 10-18 мм, 10-16 мм, 10-15 мм, 12-20 мм, 14-18 мм, 14-16 мм). У деяких варіантах реалізації винаходу завантажену колонку для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонку) промивають, застосовуючи відмивний буфер, що містить концентрацію фосфату більшу, ніж 10 мм, 11 мм, 12 мм, 13 мм, 14 мм, 15 мм, 16 мм, 17 мм, 18 мм, 19 мм, 20 мм.

ЇО0О105| Елюювання з НА-колонки зазвичай проводять за допомогою градієнтного фосфатного буферу. Наприклад, придатнийелююючий буфер може характеризуватися фосфатним градієнтом, що становить приблизно 1-400 мм (наприклад, 1-300 мм, 1-200 мм, 1- 150 мм, 1-100 мм, 10-350 мм, 10-300 мм, 10-250 мм, 10-200 мм, 10-150 мм, 10-140 мм, 10-130 мм, 10-120 мм, 10-110 мм, 10-100 мм, 10-90 мм, 10-80 мм, 10-70 мм, 10-60 мм, 10-50 мм) фосфату натрію або фосфату калію. У деяких варіантах реалізації винаходу елюювання з НА- колонки проводять за допомогою ступінчастого підвищення концентрації фосфату в буфері для елюювання. У деяких варіантах реалізації винаходу ступінчасті буфери для елюювання можуть містити концентрацію фосфату, вибрану з 10 мм, 20 мм, 30 мм, 40 мм, 50 мм, 60 мм, 70 мм, 80 мм, 90 мм, 100 мм, 110 мм, 120 мм, 130 мм, 140 мм, 150 мм, 200 мм, 250 мм, 300 мм, 350 мм, 400 мм. У деяких варіантах реалізації винаходу елюювання з колонки для хроматографії з комбінованим режимом (наприклад, НА-колонки) проводять за допомогою буферу для елюювання, що містить концентрацію фосфату (наприклад, фосфату натрію) в діапазоні від приблизно 50 ммдо150 мм (наприклад, вибраної з концентрацій фосфату (наприклад, фосфату натрію), що становлять 50 мм, 60 мм, 70 мм, 80 мм, 90 мм, 100 мм, 110 мм, 120 мм, 130 мм, 140 мм, 150 ммта їхніх комбінацій). 00106) Слід враховувати, що відомо багато різних комбінацій умов для НА-хроматографії, які можна застосовувати для доведення параметрів до величин, придатних для конкретного білка, що становить інтерес (наприклад, рекомбінантного 125). бо Хроматографія з гідрофобною взаємодією

Ї00107| Хроматографія з гідрофобною взаємодією (ХГВ) являє собою спосіброзділення, в якому властивості гідрофобності використовуються для відділення білків один від одного. У випадку цього типу хроматографії до стаціонарної колонки прикріплені гідрофобні групи, такі як феніл, октил або бутил. Білки, які проходять через колонку та які містять на поверхні гідрофобні амінокислотні бічні ланцюги здатні взаємодіяти та зв'язуватися з гідрофобними групами на колонці. Відомі ХГВ-колонки включають, наприклад, феніл-сефарозу. 00108) Для ХГВ-розділення часто застосовують умови, протилежні тим, які застосовувалися в іонообмінній хроматографії. У загальному випадку в колонці спочатку застосовують буфер, що характеризується високою іонною силою, зазвичай - сульфат амонію. Сіль в буфері знижує сольватацію розчинених у зразку компонентів, таким чином, коли сольватація знижується, гідрофобні ділянки, що стали відкритими, адсорбуються середовищем. Стаціонарна фаза в загальному випадку підібрана таким чином, щоб створювати гідрофобні взаємодії з іншими молекулами. Такі взаємодії зазвичай занадто слабкі у воді, проте додавання солей (наприклад,

Ма?5О», К»БО»ї, (МНа)»5Ох, Масі, МНАСІ, МаВг і МазсмМм) в буфер призводить до появи гідрофобних взаємодій. У деяких варіантах винаходу рухома фаза містить концентрацію солі від приблизно 0,1 М до приблизно 3,0 М, наприклад, від приблизно 0,1 М до приблизно 1,5 М, від приблизно 0,2 М до приблизно 0,8 М або від приблизно 0,3 М до приблизно 0,5 М.

ЇО0109| Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза є забуференою.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза не є забуференою.Впевних варіантах реалізації винаходу рухома фаза є забуференою до рН від приблизно 5 до приблизно 14. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза є забуференою до рН від приблизно 5 до приблизно 10. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза є забуференою до рН від приблизно 5 до приблизно 7. У певних варіантах реалізації винаходу рухома фаза є забуференою до рН, що становить приблизно 5,0.

ЇОО110| Удеяких варіантах реалізації винаходу перед завантаженням у колонку для хроматографії з гідрофобною взаємодією (наприклад, колонку з фенілом) неочищений препарат або проміжний елюат, або проточну фракцію доводять до концентрації солі (наприклад, Масі) в діапазоні від приблизно 0,5 М до приблизно 2,0 М (наприклад, приблизно 0,5 М, 1,0 М, 1,1 М, 1,2

М, 1,3 М, 14 М, 1,5 М, 1,6 М, 1,7 М, 1,8 М, 1,9 М або 2,0 М Масі) та рівня рН, що становить

Ко) приблизно 4,5-6,0 (наприклад, приблизно 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0). Після завантаження колонку для хроматографії з гідрофобною взаємодією можна промивати, застосовуючи відмивний буфер, що містить концентрацію солі (наприклад, МасСі) в діапазоні від приблизно 0,5 Мдо2,0 М (наприклад, приблизно 0,5М,1,0М,1,1 М,1,2М,1,3М,1,4М,1,5М,16М,1,7 М, 1,8 М, 1,9 М або 2,0 М) при рівні рН, що становить приблизно 4,5-6,0 (наприклад, приблизно 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0).Вдеяких варіантах реалізації винаходу колонку для хроматографії з гідрофобною взаємодією елююють, застосовуючи елююючий буфер, що містить концентрацію солі (наприклад, Масі) в діапазоні від приблизно 0,1 М до приблизно 0,5 М (наприклад, приблизно 01 М, 0,2 М, 0,3 М, 0,4 М або 0,5 М Масі) при рівні рН, що становить приблизно 4,5-6,0 (наприклад, приблизно 4,5, 5,0, 5,5 або 6,0).

Визначення характеристик очищених білків І25 00111) Визначити характеристики очищеного рекомбінантного білкуї25 можна за допомогою багатьох різних способів.

Ступінь очищення

Ї00112| Ступінь очищення очищеного рекомбінантного білкуї25 зазвичай визначають за рівнем різних домішок (наприклад, білку клітини-хазяїна або ДНК клітини-хазяїна), присутніх в кінцевому продукті. Наприклад, рівень білку клітини-хазяїна(БКХ) можна визначити за допомогою ЕЕГ ІЗА або ДСН-ПААГ.Вдеяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25 містить менше 150 нг БКХ /мг білка І25 (наприклад, менше 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 30, 20, 10 нг БКХ /мг білка І25).Вдеяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25припроведенні ДСН-ПААГ із забарвленням сріблом не має нових смуг з інтенсивністю більшою, ніж 0,05 Фо, 0,01 9», 0,15 9», бе, 02595, 0,396, 0,359, 0,495, 0,4595 або 0,595 від контрольного зразка. Можна використовувати різні контрольні зразки, зокрема ті, які затверджені регуляторними органами, такими як ЕВА.

Специфічна активність 00113) Характеристики очищеного рекомбінантного білка І25 можна отримати, оцінюючи його функціональну та/або біологічну активність. Ферментативну активність композиції, що містить рекомбінантний І25, можна визначити за допомогою відомих в ційгалузі техніки способів. Як правило, зазначені способи включають детекцію видалення сульфату із бо синтетичного субстрату, останній способ відомий під назвою аналізу виділення сульфату. Один з прикладів аналізу ферментативної активності включає застосування іонної хроматографії. У цьому способі оцінюють кількість сульфат-іонів, які ферментативно вивільняються рекомбінантним 125 з субстрату. Субстрат може бути природним субстратом або синтетичним субстратом. У деяких випадках субстратом є гепарин сульфат (наприклад, гепарин дисахарид), дерматан сульфат або їхній функціональний еквівалент. Як правило, виділений сульфат-іон аналізують за допомогою іонної хроматографії із застосуванням детекторуз провідності. У цьому прикладі результати можна наводитиуОд/мг білку, де 1 одиниця відповідає кількості ферменту, необхідного для вивільнення з субстрату 1 мкмолю сульфат-іонів на годину. У деяких варіантах реалізації винаходу специфічна активність очищеного рекомбінантного білка (25, визначена за допомогою іп мігоаналізу активності виділення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду, знаходиться в діапазоні приблизно 0-100 Од/мг, приблизно 10-100 Од/мг, приблизно 10-80 Од/мг, приблизно 20-80 Од/мг, приблизно 20-70

Од/мг, приблизно 20-60 Од/мг, приблизно 20-50 Од/мг, приблизно 30-100 Од/мг, приблизно 30- 90 Од/мг, приблизно 30-80 Од/мг, приблизно 30-70 Од/мг, приблизно 30-60 Од/мг, приблизно 40- 100 Од/мг, приблизно 40-90 Од/мг, приблизно 40-80 Од/мг, приблизно 40-70 Од/мг, приблизно 40-60 Од/мг. У деяких варіантах реалізації винаходу специфічна активність очищеного рекомбінантного білка І25, визначена за допомогою іп мійгоаналізу активності виділення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду, становить щонайменше приблизно 5 Од/мг, приблизно 10 Од/мг, приблизно 15 Од/мг, приблизно 20 Од/мг, приблизно 25

Од/мг, приблизно 30 Од/мг, приблизно 35 Од/мг, приблизно 40 Од/мг, приблизно 45 Од/мг, приблизно 50 Од/мг, приблизно 55 Од/мг, приблизно 60 Од/мг, приблизно 65 Од/мг, приблизно 70 Од/мг, приблизно 75 Од/мг, приблизно 80 Од/мг, приблизно 85 Од/мг, приблизно 90 Од/мг, приблизно 95 Од/мг або приблизно 100 Од/мг. Типові умови для проведення визначення іп міго активності вивільнення сульфату із застосуванням в якості субстрату гепарин дисахариду наведені нижче. Як правило, в цьому методі визначають здатність І25 вивільняти сульфат-іони з субстрату природного походження - гепарин дисахариду. Кількість вивільненого сульфату можна визначити за допомогою іонної хроматографії. В деяких випадках іонна хроматографія включає використання детектору з провідності. В якості необмежуючого прикладу можна навести схему, в якій зразкам спочатку замінюють буфер на 10 мм ацетату Ма, рН 6, для

Зо усунення пригнічення фосфат-іонами в буферній суміші. Потім зразки розводять до 0,075 мг/млреакційним буфером (10 мм ацетату Ма, рН 4,4) та інкубують протягом 2 г при 372С з гепарин дисахаридом за співвідношення ферменту та субстрату, відповідному 0,3 мкг І25/100 мкг субстрату в 30 мкл реакційному об'ємі. Потім реакцію зупиняють шляхом нагрівання зразків при 10020 протягом З хв. Аналіз проводять, використовуючи аналітичну колонку біопех ІопРас

А5І18 з передколонкою ІопРас АС18. Застосовують ізократичний метод з 30 мм гідроксиду калію при 1,0 мл/хв протягом 15 хвилин. Кількість сульфату, вивільненого зразком І25, розраховують, використовуючи лінійно-регресійний аналіз сульфатних проб в діапазоні від 1,7 до 16,0 нмоль.

Величину, що фіксується, виражають в одиницях на мг білку, де 1 одиниця відповідає 1 мкмолю сульфату, що вивільняється на годину, а концентрацію білку визначають за допомогою вимірів А280. 00114) У деяких варіантах реалізації винаходу ферментативну активність рекомбінантного білку І25 можна також визначити за допомогою багатьох інших способів, відомих в цій галузі техніки, таких як, наприклад, аналіз з 4-МОРЕ, в якому оцінюють гідроліз 4-метилумбеліферил- сульфату на сульфат і природний флуоресцентний 4-метилумбеліферил (4-МОР). У деяких варіантах реалізації винаходу визначена за допомогою іпмійто аналізу з 4-МОЕЄ придатна ферментативна активність отриманого рекомбінантного білку І25становить щонайменше приблизно 0,5 Од/мг, 1,0 Од/мг, 1,5 Од/мг, 2 Од/мг, 2,5 Од/мг, З Од/мг, 4 Од/мг, 5 Од/мг, 6 Од/мг, 7 Од/мг, 8 Од/мг, 9 Од/мг, 10 Од/мг, 12 Од/мг, 14 Од/мг, 16 Од/мг, 18 Од/мг або 20 Од/мг. У деяких варіантах реалізації винаходу визначена за допомогою іпмйго аналізу з 4-МОЕ придатна ферментативна активність отриманого рекомбінантного білку І25 знаходиться в діапазоні, що становить приблизно 0-50 Од/мг (наприклад, приблизно 0-40 Од/мг, приблизно 0-30 Од/мг, приблизно 0-20 Од/мг, приблизно 0-10 Од/мг, приблизно 2-50 Од/мг, приблизно 2-40 Од/мг, приблизно 2-30 Од/мг, приблизно 2-20 Од/мг, приблизно 2-10 Од/мг, приблизно4-50 Од/мг, приблизно 4-40 Од/мг, приблизно 4-30 Од/мг, приблизно 4-20 Од/мг, приблизно 4-10 Од/мг, приблизно 6-50 Од/мг, приблизно 6-40 Од/мг, приблизно 6-30 Од/мг, приблизно 6-20 Од/мг, приблизно 6-10 Од/мг). Типові умови для проведення іп міго аналізу з 4А-МОЕ наведені нижче.

Як правило, за допомогою аналізу з 4-МОЕ визначають здатність білку І25 здійснювати гідроліз 4-метилумбеліферил-сульфату (4-МОБ-504) на сульфат та природний флуоресцентний 4- метилумбеліферил (4-МОР). Одна міліодиниця активності відповідає кількості ферменту, бо необхідного для перетворення одного наномолю 4-МОБ-505 в 4-МОЕ на одну хвилину при

37 "С. Як правило, згенеровані пробними зразками з відомою активністю середні одиниці флуоресценції (СОФ) можна застосовувати для побудови стандартної кривої, яку можна використовувати для розрахунку ферментативної активності зразку, який становить інтерес.

Потім специфічну активність можна визначити, розділивши ферментативну активність на концентрацію білка. 00115) У будь-якому прикладі концентрацію білку в композиції, що містить рекомбінантний

І25, можна визначити будь-яким відомим в ційгалузі техніки придатним способом для визначення концентрації білку. У деяких випадках концентрацію білку визначають за поглинанням ультрафіолетового світла. Подібний аналіз поглинання зазвичай проводять на довжині хвилі приблизно 280 нм (Агво).

Профіль заряду 00116) Очищений рекомбінантний білок І25 можна охарактеризувати асоційованим з білком профілем заряду. Як правило, профіль заряду білка відображає схему зарядів бічних ланцюгів, які зазвичай присутні на поверхні білку. Профіль заряду можна визначити шляхом проведення для білка іонообмінної (10) хроматографії (наприклад, ВЕРХ). У деяких варіантах реалізації винаходу "профілем заряду" називають групу величин, що представляють кількість білку, що елююється з іонообмінної колонки в момент часу після додавання в колонку рухомої фази, що містить обмінні іони. 00117) Як правило, придатноюіонообмінною колонкою є аніонообмінна колонка. Наприклад, профіль заряду можна визначити за допомогою сильної аніонообмінної хроматографії (САХ), застосовуючи систему для високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). У загальному випадку рекомбінантний І25 адсорбується на фіксованому позитивному заряді сильної аніонообмінної колонки, а градієнт зростаючої іонної сили із застосуванням рухомої фази із заданою швидкістю потоку елюює групи рекомбінантного І25 з колонки пропорційно силі їх іонної взаємодії з позитивно зарядженої колонкою. Більш негативно заряджені (більш кислі) групи І25 елююються пізніше, ніж менш негативно заряджені (менш кислі) групи 125.

Концентрації білку в елюаті визначають за поглинанням ультрафіолетового світла (на 280 нм).

ЇО0О118| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний І25 адсорбується при значенні рН приблизно 8,0 в 20 мм Трис-НС1 на фіксованому позитивному заряді колонки

Зо МіпісоРЕ, а градієнт зростаючої іонної сили із застосуванням рухомої фази, що містить 20 мм

Трис-НСІ, 1 М хлорид натрію, рН 8,0, зі швидкістю потоку 0,8 мл/хв елююють групи рекомбінантного І25 з колонки пропорційно силі їх іонної взаємодії з позитивно зарядженою колонкою. 00119) У деяких варіантах реалізації винаходу профіль заряду може бути поданий у вигляді хроматограми, що ілюструє залежність одиниць поглинання від часу, що пройшов після елюювання з ВЕРХ-колонки. Хроматограмма може містити групу з одного або декількох піків, де кожний пік в групі відповідає субпопуляції рекомбінантних 125 зкомпозиції, які мають аналогічні поверхневі заряди. 00120) У деяких варіантах реалізації винаходу профіль заряду для композиції, що містить очищений білок І25, характеризується щонайменше шістьма піками. Типовий профіль заряду

І25 проілюстрований в розділі Прикладів та на Фігурі 11. Як проілюстровано на Фігурі 11, шість піків позначені (від А до Е) у порядку зростання величини негативного заряду і зниження вкладу в загальну пікову площу на хроматограмі. У деяких варіантах реалізації винаходу профіль заряду для композиції, що містить очищений рекомбінантний білок І25, характеризується різною кількістю, розміром, формою або часовими інтервалами піків в залежності від кількості негативних або позитивних зарядів на поверхні білку. У деяких варіантах реалізації винаходу композиція, що містить рекомбінантний білок І25, має профіль заряду, який характеризується менше ніж 6 (наприклад, менше ніж 5, 4, З або 2) піками. У деяких варіантах реалізації винаходу профіль заряду рекомбінантного І25 може мати 5, 4, 3, 2 або 1 (пік)и. Наприклад, будь-які один,

БО два, три, чотири або п'ять піків А, В, С, 0, Е їі Е можуть бути відсутніми або бути меншими за розміром вкомпозиції, що містить очищений рекомбінантний білок І25. Як правило, вважається, що профіль заряду є більш гомогенним у разі меншої кількості піків.

Картування гліканів 00121) У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25 можна охарактеризувати за композицією його протеогліканів, а відповідний спосіб звичайно називають картуванням гліканів. Не прив'язуючись до будь-якої конкретної теорії, вважається, що гліканові зв'язки разом з формою та складністю розгалуженої структури можуть впливати на іп мімокліренс, лізосомне націлювання, біодоступність та/або ефективність. (00122) Як правило, карту гліканів можна отримати за допомогою ферментного розщеплення бо та подальшого хроматографічного аналізу Для ферментного розщеплення можна застосовувати різні ферменти, включаючи, але не обмежуючись цим, придатні глікосилази, пептидази (наприклад, ендопептидази, екзопептидази), протеази та фосфатази. У деяких варіантах реалізації винаходу придатним ферментом є лужна фосфатаза. У деяких варіантах реалізації винаходу придатнимферментом є нейрамінідаза. Глікани (наприклад, фосфоглікани) можна детектувати за допомогою хроматографічного аналізу. Наприклад, фосфоглікани можна детектувати за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії з імпульсним амперометричнимдетектуванням (ВЕАДОХ-ІАД) або ексклюзійнної високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Кількість гліканів (наприклад, фосфогліканів), що представляється кожним піком на карті гліканів, можна розрахувати за допомогою стандартної кривої гліканів (наприклад, фосфогліканів) відповідно до відомих в цій галузі техніки і розкритими в цьому документі способами.

ІЇО0123| Вдеяких варіантах реалізації винаходу очищений І253гідно зцим винаходом характеризується картою гліканів, що містить групи з семи піків, відповідних нейтральному (група піків 1), моносіальованому (група піків 2), дисіальованому (група піків 3), монофосфорильованому (група піків 4), трисіальованому (група піків 5), тетрасіальованому (група піків 6) та дифосфорильованому (група піків 7) білку І25, відповідно. Типові карти гліканів для І25 проілюстровані на Фігурі 10. У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний І25 характеризується картою гліканів, яка містить менше 7 груп піків (наприклад, картою гліканів з 6, 5, 4, З або 2 групами піків). Удеяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний І25 характеризується картою гліканів, яка містить понад 7 груп піків (наприклад, 8, 9, 10, 11, 12 або більше). 00124) Відносну кількість гліканів, відповідну кожній групі піків, можна визначити на основі площі групи піків відносно відповідної площі групи піків в зумовленому еталонному зразку.Вдеяких варіантах реалізації винаходу група піків 1 (нейтральні) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні, що становить приблизно 40-120 95 (наприклад, приблизно 40- 115 95, приблизно 40-110 95, приблизно 40-100 95, приблизно 45-120 95, приблизно 45-115 95, приблизно 45-110 95, приблизно 45-105 95, приблизно 45-100 95, приблизно 50-120 95, приблизно 50-110 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу, група піків 2 (моносіальовані) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні, що становить приблизно 80-140 95 (наприклад, приблизно 80-135 95, приблизно 80- 130 95, приблизно 80-125 956, приблизно 90-140 95, приблизно 90-135 95, приблизно 90-130 95, приблизно 90-120 95, приблизно 100-140 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу, група піків З |(дисіальовані) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні що становить приблизно 80-110 95 (наприклад, приблизно 80-105 95, приблизно 80-100 95, приблизно 85-105 95, приблизно 85- 100 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу, група піків 4 (монофосфорильовані) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні, що становить приблизно 100-550 95 (наприклад, приблизно 100-525 95, приблизно 100-500 95, приблизно 100-450 95, приблизно 150-550 95, приблизно 150-500 95, приблизно 150- 45095, приблизно 200-550 95, приблизно 200-500 95, приблизно 200-450 95, приблизно 250- 55095, приблизно 250-500 95, приблизно 250-45095 або приблизно 250-400 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу, група піків 5 (трисіальовані) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні, що становить приблизно 70-110 95 (наприклад, приблизно 70-105 95, приблизно 70-100 95, приблизно 70-95 95, приблизно 70-90 95, приблизно 80-110 95, приблизно 80-105 95, приблизно 80-100 95 або приблизно 80-95 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу, група піків 6 (тетрасіальовані) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні, що становить приблизно 90-130 95 (наприклад, приблизно 90-125 95, приблизно 290-120 95, приблизно 990-115 95, приблизно 990-110 95, приблизно 100-130 95, приблизно 100-125 95 або приблизно 100-120 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У деяких варіантах реалізації винаходу, група піків 7 (дифосфорильовані) може характеризуватися площею групи піків в діапазоні, що становить приблизно 70-130 95 (наприклад, приблизно 70-125 95, приблизно 70-120 95, приблизно 70-115 95, приблизно 70- 110 95, приблизно 80-130 96, приблизно 80-125 95, приблизно 80-120 95, приблизно 800-115 95, приблизно 80-110 95, приблизно 90-130 95, приблизно 90-125 95, приблизно 90-120 95, приблизно 90-115 95, приблизно 90-110 95) відносно відповідної площі групи піків в еталонному зразку. У цій області техніки відома велика кількість еталонних зразків для картування гліканів, які можна застосовувати для практичної реалізації цього винаходу. Як правило, група піків "7 (дифосфорильовані) відповідає рівню ди-МбР на поверхні очищеного рекомбінантного білка (510) І25.

І00125| Передбачається, що схема глікозилювання очищеного І25 впливає на лізосомне націлювання. У цій галузі техніки відома велика кількість видів аналізу іп мігоклітинного поглинання, які можна застосовувати для практичної реалізації цього винаходу. Наприклад, для оцінки поглинання /25 рецепторами МбР проводять аналіз клітинного поглинання із застосуванням людських фібробластів, експресуючих зі своєї поверхні рецептори МбР. Кількість

І25, що інтерналізується, можна визначити за методом ЕГІЗА. У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25з3гідно зцим винаходом характеризується клітинним поглинанням, визначеним за допомогою аналізу іп мігопоглинання, що перевищує 70 чо, 75 Усю, 80 95, 85 Ус, 90 9, 95 У.

Пептидне картування 00126) Вдеяких варіантах реалізації винаходу можна застосовувати пептидне картування для характеристики амінокислотноїкомпозиції, посттрансляційних модифікацій та/або клітинного процесингу, такого як відщеплення сигнального пептиду, перетворення у формілгліцін та/або глікозилювання. Як правило, рекомбінантний білок можна розбити на окремі пептидні фрагменти шляхом контрольованого або випадкового поділу для того, щоб отримати відповідну схему або пептидну карту. У деяких випадках перед аналітичною оцінкою очищений білок І25 можна спочатку піддати ферментному розщепленню. Розщеплення перед аналітичною оцінкою можна проводити, застосовуючи пептидазу, глікозидгідролазу, фосфатазу, ліпазу або протеазу та/або їх комбінації. Структурнукомпозицію пептидів можна визначити, застосовуючи добре відомі в цій галузі техніки способи. Типові способи включають, але не обмежуються цим, мас- спектрометрію, ядерний магнітний резонанс (ЯМР) або ВЕРХ.

Відсоток конверсії у формілгліцін

І00127| Для визначення відсотку конверсії у ЕСІу можна застосовувати пептидне картування.

Як обговорювалося вище, для активації І25 необхідна конверсія цистеїну (відповідного позиції 59 зрілого людського І25) у формілгліцін за допомогою формілгліцін-утворюючого ферменту (ЕСЕ) як показано нижче: (НО)

НВ Од : Фермілглиіин і

ХххкхеСуахххривякххАтахкхххх 0 ЖЕХХххРОЇухххитохххАтцххххкх (бегр (Ав) утворюючий Шермент (АВ)

Зо Отже, відсоток конверсії у формілгліцін (90ФГ) можна розрахувати, застосовуючи наступну формулу:

Кількість активних молекул 25 зав (125)-5Б- Й НМУ х100

Загальна кількість (активних гнеактивних) молекул 125 00128) Для розрахунку»оФГ рекомбінантний білок І25 можна розщепити на короткі пептиди за допомогою протеаз (наприклад, трипсину або хімотрипсину). Короткі пептиди можна розділититаотримати їхні характеристики за допомогою, наприклад, високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Можна визначити характеристики пептиду, до складу якого входить позиція, яка відповідає позиції 59 зрілого людського І25, щоб визначити, чи був Суз у позиції 59 перетворений у ЕСіу, впорівнянні з контролем (наприклад, білком І25 без конверсії у ЕСІу або білком І25 з 100 95 конверсією у ЕСІу). На основі відповідних пікових площ можна визначити кількість пептидів, що містять ЕсСіІу (відповідну кількості активних молекул 125), і загальну кількість пептидів, що містять ЕСіу та Су (відповідну загальній кількості молекул 125), і розрахувати співвідношення, що відображаєздофг. 00129) У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І253згідно зцим винаходом містить щонайменше приблизно 70 95 (наприклад, щонайменше приблизно 77 Чо, 80 У, 85 Фо, 90 о, 95 95, 96 Фо, 97 95, 98 Фо, 99 95) залишків цистеїну, які відповідаютьСув 59 людського І25 (5ЕОІОМО:1), перетворених уУСа-формілгліцін (ЕСміу). У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25згідно зцим винаходом містить

БО практично 100 95 залишків цистеїну, які відповідаютьСузх 59 людського І25 (5ЕОІЮМО-1), перетворених уУСе-формілгліцін (ЕСпУу).

Вміст сіалової кислоти 00130) У деяких варіантах реалізації винаходу очищений рекомбінантний білок І25 можна охарактеризувати за композицією його сіалової кислоти. Не прив'язуючись до будь-якої конкретної теорії, вважається, що залишки сіалової кислоти в білках можуть запобігати, знижувати або пригнічувати швидке іплімовиведення асіалоглікопротеїновими рецепторами, присутніми на гепатоцитах. Таким чином, вважається, що рекомбінантні білки, які мають відносно високийвміст сіалової кислоти, зазвичай характеризуються відносно тривалим часом циркуляції іпмімо.

ЇО0131| У деяких варіантах реалізації винаходу вміст сіалової кислоти в очищеному рекомбінантному білкуї25 можна визначити за допомогою добре відомих в цій галузі техніки способів. Наприклад, вміст сіалової кислоти в очищеному рекомбінантному білкуї25 можна визначити за допомогою ферментного розщеплення і подальшого хроматографічного аналізу.

Ферментне розщеплення можна проводити за допомогою придатної сіалідази. У деяких випадках розщеплення проводять ферментом глікозидгідролази, таким як нейрамінідаза.

Сіалову кислоту можна детектувати за допомогою хроматографічного аналізу, такого як, наприклад, високоефективна аніонообмінна хроматографія з імпульсним амперометричним детектуванням (ВЕАОХ-ІАД). Кількість сіалової кислоти у композиції, що містить рекомбінантний

І25, можна розрахувати за допомогою стандартної кривої сіалової кислоти відповідно до відомих в цій галузі техніки і розкритихв цьому документі способів.

ІЇ00132| У деяких варіантах реалізації винаходу вміст сіалової кислоти в очищеному рекомбінантному білкуІ25 може бути більшим, ніж 16 моль/моль. У контексті сіалової кислоти одиниці "моль/моль" позначають кількість молей залишків сіалової кислоти, що припадають на один моль ферменту. У деяких випадках вміст сіалової кислоти в рекомбінантному білкуі25 вище, ніж приблизно 16,5 моль/моль, приблизно 17 моль/моль, приблизно 18 моль/моль, приблизно 19 моль/моль, приблизно 20 моль/моль, приблизно 21 моль/моль, приблизно 22 моль/моль або більше. У деяких варіантах реалізації винаходу вміст сіалової кислоти в очищеному рекомбінантному білкуі25 може відповідати діапазону приблизно 16-20 моль/моль, 16-21 моль/моль, приблизно 16-22 моль/моль, 16-23 моль/моль, 16-24 моль/моль, приблизно 16-25 моль/моль, приблизно 17-20 моль/моль, 17-21 моль/моль, приблизно 17-22 моль/моль,

Ко) 17-23 моль/моль, 17-24 моль/моль або приблизно 17-25 моль/моль.

Фармацевтичнакомпозиція та введення 00133) Очищений рекомбінантний білок І25 можна вводити пацієнтові з синдромом Хантера відповідно до відомих способів. Наприклад, очищений рекомбінантний білок 25 може бути доставлений внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньом'язовим, парентеральним, трансдермальним або трансмукозальним (наприклад, оральним або назальним) шляхом.

ЇО0О134| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний 125 або фармацевтичнукомпозицію, що його містить, вводять суб'єктові шляхом внутрішньовенного введення.

ЇОО135| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний 25 або фармацевтичнукомпозицію, що його містить, вводять суб'єктові шляхом інтратекального введення. Термін "інтратекальне введення" або "Іінтратекальна ін'єкція", який використовується в цьому документі, належить до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можна застосовувати різні способи, включаючи, без обмежень, латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через отвір бору або цистернальну або поперекову пункцію і так далі. У деяких варіантах реалізації винаходу "інтратекальне введення" або "Інтратекальна доставка" згідно цього винаходу належить до ІТ введення або доставки через поперекову область або ділянку, тобто, поперекового Ії введення або доставки. Термін "поперекова область" або "поперекова ділянка", який використовується в цьому документі, належить до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями та,

БО точніше, до І 2-51 ділянці хребта.

ЇОО1З36| У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний 125 або фармацевтичнукомпозицію, що його містить, вводять суб'єктові шляхом підшкірного (тобто, під шкірний покрив) введення. В цьому випадку препарат можна інжектувти за допомогою шприца.

При цьому доступні й інші пристрої для введення препарату, такі як пристрої для ін'єкції (наприклад, пристрої ІМЛЕСТ-ЕАБЕ"М ії СЕМОЕСТ"М); ручки-ін'єктори (такі як СепРеп"М); безголкові пристрої (наприклад, Медідесіо! М ії Віоуесіо! М); та підшкірні системи доставки на основі пластиру.

ЇО0137| У деяких варіантах реалізації винаходу можна застосовувати інтратекальне введення спільно з іншими способами введення (наприклад, внутрішньовенним, підшкірним, 60 внутрішньом'язовим, парентеральним, трансдермальним або трансмукозальним (наприклад,

оральним або назальним)).

ЇО0138| У цьому винаході передбачається як одноразове, так і багаторазове введення терапевтично ефективної кількості рекомбінантного І25 або фармацевтичноїкомпозиції, що його містить, описаних в цьому документі. Рекомбінантний І25 або фармацевтичнукомпозицію, що його містить, можна вводити через регулярні інтервали залежно від природи, тяжкості та тривалості хворобливого стану суб'єкта (наприклад, лізосомній хвороби накопичення). У деяких варіантах реалізації винаходу рекомбінантний І25 або фармацевтичнукомпозицію, що його містить, можна вводити періодично через регулярні інтервали (наприклад, раз на рік, раз на шість місяців, раз на п'ять місяців, раз на три місяці, кожні два місяці (раз на два місяці), щомісячно (раз на місяць), кожні два тижні (раз на два тижні), кожного тижня, щодня або постійно).

ЇО0139| Рекомбінантний І25 або фармацевтичнукомпозицію, що його містить, можна змішувати з фізіологічно прийнятним носієм або допоміжною речовиною для отримання фармацевтичноїкомпозиції. Носій та терапевтична речовина можуть бути стерильними.

Препарат повинен відповідати способу введення.

Ї00140| Фармацевтично прийнятні придатні носії включають, але не обмежуються цим, сольові розчини (наприклад, масі), фізіологічний розчин, забуферений фізіологічний розчин, спирти, гліцерол, етанол, гуміарабік, рослинні олії, бензилові спирти, полієтиленгліколі, желатин, вуглеводи, такі як лактозу, амілозу або крохмаль, цукри, такі як маніт, цукрозу або інші, декстрозу, стеарат магнію, тальк, кремнієву кислоту, вазелін, парфюмерну олію, ефіри жирних кислот, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон і т. п., а також їх комбінації. Фармацевтичні препарати за необхідності можна змішувати з допоміжними речовинами (наприклад, лубрикантами, консервантами, стабілізаторами, змочуючими агентами, емульсифікаторами, солями для зміни осмотичного тиску, буферами, фарбниками, ароматизаторами та/або ароматичними речовинами і т. п.), які не вступають в небажані реакції з активними компонентами або не впливають на їх активність. У деяких варіантах реалізації винаходу застосовують водорозчинний носій, придатний для внутрішньовенного введення.

Ї00141| Композиція або лікарський препарат за необхідності може також містити невеликі кількості змочуючих та емульсуючих агентів або буферних агентів для зміни рН. Композиція

Зо може бути рідким розчином, суспензією, емульсією, пігулкою, пілюлею, капсулою, препаратом сповільненого вивільнення або порошком. Також композиція може бути виготовлений у вигляді суппозиториї з традиційними зв'язуючими речовинами і носіями, такими як тригліцериди.

Препарат для перорального вживання може містити стандартні носії, такі як рармацевтичної ступіні чистоти маніт, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, полівінілпіролідон, сахарин натрію, целюлоза, карбонат магнію і так далі. 001421) Композицію або лікарський препарат можна виготовити відповідно до стандартних процедур у вигляді фармацевтичноїкомпозиції, придатної для введення людям. Наприклад, в деяких варіантах реалізації винаходу композиція для внутрішньовенного введення зазвичай є розчином в стерильному ізотонічному водному буфері. За необхідності композиція також може містити розчинник та місцевий анестетик для зниження больових відчуттів в місці ін'єкції. У загальному випадку інгредієнти або додають окремо, або змішують разом в одиничній формі дозування, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично закритому контейнері, такому як ампула або пакет з вказівкою кількості активної речовини. Якщо композиція призначена для інфузійного введення, його можна розвести в інфузійному флаконі, що містить стерильну фармацевтичної ступіні чистоти воду, сольовий розчин або декстрозу/воду. Якщо композиція призначена для ін'єкційного введення, до нього може додаватися ампула зі стерильною водою для ін'єкції або сольовим розчином так, що інгредієнти можна змішувати перед введенням.

Ї00143| Термін "терапевтично ефективна кількість", який використовується в цьому документі, визначається, головним чином, на підставі загальної кількості терапевтичної речовини, що міститься у фармацевтичних композиціях згідно з цим винаходом. У загальному випадку терапевтично ефективної кількості вистачає, щоб досягти помітного позитивного ефекту для пацієнта (наприклад, лікування, модуляції, зцілення, запобігання та/або полегшення першопричинного захворювання або хворобливого стану). Наприклад, терапевтично ефективна кількість може бути кількістю, достатньою для досягнення необхідного терапевтичного та/або профілактичного ефекту, такого як кількість, достатня для модуляції лізосомних ферментних рецепторів або їх активності, яка призводить до лікування лізосомної хвороби накопичення або її симптомів (наприклад, зниженню або виключенню появи "пінистих клітин" або клітинної вакуолізації після введення суб'єктові композицій згідно з цим винаходом). У загальному бо випадку кількість терапевтичної речовини (тобто, рекомбінантного лізосомного ферменту), що вводиться суб'єктові, яий потребує цього, залежить від характеристик суб'єкта. Такі характеристики включають хворобливий стан, тяжкість захворювання, загальний стан здоров'я, вік, стать і масу тіла суб'єкта. Для фахівця в цій галузі техніки не важко буде визначити відповідні дозування залежно від цих та інших чинників. Додатково, для визначення оптимальних діапазонів дозувань можна застосовувати як об'єктивний, так і суб'єктивний аналіз. 00144) Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять в режимі дозування, який може включати множинне дозування. Терапевтично ефективна кількість (та/або відповідне одиничне дозування в межах ефективного режиму дозування) може варіюватися для кожного конкретного терапевтичного білку, наприклад, залежно від способу введення або від комбінування з іншими фармацевтичними речовинами. Також певна терапевтично ефективна кількість (та/або одиничне дозування) у випадку кожного конкретного пацієнта може залежати від безлічі чинників, включаючи порушення, лікування якого проводиться, і ступінь тяжкості цього порушення; активність визначеної фармацевтичної речовини, яка застосовується; визначенакомпозиція, яка застосовується; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і спосіб харчування пацієнта; час введення, спосіб введення та/або швидкість виведення або метаболізму певного злитого білку, що застосовується; тривалість лікування; і тому подібні чинники, які добре відомі в галузях техніки медицини. 00145) Додаткові типові фармацевтичні композиції та способи введення описані в публікації згідно РСТ УМО2011/163649 під назвою "Способи і композиції для ЦНС доставки ідуронат-2- сульфатази" та попередній заявці Мо 61/618,638 під назвою "Підшкірне введення ідуронат-2- сульфатази", поданої на реєстрацію 30 березня 2012 р., повний зміст яких включений в цей документ в якості посилання. 00146) Також слід розуміти, що у випадку кожного конкретного суб'єкта відповідні режими дозування мають бути з часом погоджені відповідно до індивідуальних вимог і професійної оцінки фахівця, який здійснює застосування або контролює застосування ферментозамісної терапії, а наведені в цьому документі діапазони дозувань є лише прикладами та не обмежують об'єму або практичної реалізації винаходу, який заявляється.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Захоплення та процес очищення рекомбінантного І25АЕ

Зо Ї00147| У цьому прикладі наведено спрощений процес прямого очищення, який можна застосовувати для захоплення та очищення рекомбінантного І25, що виробляється в безсироватковому середовищі. Типова схема очищення проілюстрована на фігурі 1. 00148) Розробляли клітинну лінію, стабільно експресуючу фермент ідуронат-2-сульфатази (25) та формілгліцін-утворюючий фермент (ЕСЕ). Генерація та характеристики типових клітинних ліній описані в попередній заявці на патент США під назвою "Клітини для отримання рекомбінантної ідуронат-2-сульфатази", поданої на реєстрацію одночасно з цим документом, повний вміст якої включено в цей документ шляхом посилання. Коротко, людську клітинну лінію сконструювали для коекспресії людського білку І25 з амінокислотною послідовністю, наведеною в ЗЕБЕО ІЮ МО:2, і людського формілгліцин-утворюючого ферменту (РОЕ) з амінокислотною послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮ МО:5.

ЗЕО Ір МО » Повнорозмірний попередник ідуронат-2-сульфатази

МРРРАТОаВаИат У СІ МІ 55МСМАЇ ЗЕТОАМЗТТОАГММО ПМООГ АРІ ЯСМОарКІ МАЗРМІВОЇ А

ЗНЗИ ГОМАГАООСАМСАРБЗАУЗЕЇ ТавВе!еРОТТВІ МОЄМУ ВУНАСМЕЗТІРОМЕКЕМО УТ М5УС

КУМЕНРОІЗ5МНТВОЗРУБМЗЕРРУНРЗЗЕКМЕМТКТОСВОаРОСЕЇ НАМИ СРУОМІ ОМРЕСТІ РОКОБ

ТЕОАЛІО ГЕКМКТЗАЗРЕБІ АМаУНКРНІРЕВУРКЕРОКІ МРІ ЕМП АРОРЕМРОСІ РРМАММРУ МОЇ

ВОВЕОРМОАЇ МІЗМРМаРІРМОРОВКІВОЗУБАБУБМІ ОТОМОаВИ ЗАГОВІ ОЇ АМЗТПАєТЗОНОИМА.

СЕНСЕМАКУЗМЕОМАТНУРІИ ІЕМУРОИВТАБІ РЕАСЕКІ ЕРМІ ОРЕОБАБОЇ МЕРИВОБЗМОЇІ МЕЇ МБ

ЕРТ АС АС ОМРРАСРУРБЗЕНМЕЇ СВЕСКМИ КНЕВЕВОЇ ЕЕОРМІ РЕМРАЕПАМЗОМРАРБОЇІРО

М/МЗОКРБОЇ КОІКІМСМУІВТОМАМГУМУМИагМРОЕНБ АМЕЗОІНАСЕЇ МЕМОЗОРІ ОБНММУМОЗОС

СОРОМ

ЗЕО І МО:5

Повнорозмірний попередник людського ЕОБЕ:

МААРАЇ СІ МСЯВАСРЕГ СІ МІ ЛІ БІ І СЛААаБОБєАХатТаАсАабІ АаЗСОаСОаТРОВРОаАНИаЗБАА

АНАУЗАЕЕАМАРЕРУРСЕВОЇ АНЗКМУРІРАСМЕТМатрОРОІКОВСЕАРАВВМТІВАРУМОАМЕМ5

МТЕРЕКЕУМЗТОамМІ ТЕАЕКЕЯОЗЕМЕЕСМІ БЕОМКТМООСАМАААРММІ РУКОАМУВНРЕСРОЗТІ

ГНАРОНРМІ НУБУУМОАМАУСТУМ АОКВАІ РТЕАЕМ ЕУЗСВИасі НМА ЕРМСМКІ ОРКСОИОНМАМММО

СЕЕРУТМТаЕраРОСТАРМОАЕРРМИаМаї УМІМЕАМАМ ЕМ ТОМУ ТУННЗМУЕЕТІ МРКаРРЗОаКОВ

УуккаазУмМоснАЗУСУВАУВСААВЗОМТРОБЗЗАЗМІ аЕВСААОВІ РТМО бо Ї00149| Після синтезу повнорозмірного ферменту І25 видаляли 25-амінокислотний сигнальний пептид, після чого розчинний зрілий фермент І25 секретувався з клітини.

ЇО0150| В процесі, що проходить в біореакторі, застосовували хімічно визначене середовище (що не містить сироватку/цо не містить компоненти тваринного походження; АБ).

Ї00151| Кожний індивідуальний матеріал для збору зменшували в обсязі та проводили заміну буферу за допомогою процесу ультрафільтрації/діафільтрації. Кожний окремий збір матеріалу, що називається неочищеної масою (НМ), заморожували при -502С. Процес прямого очищення починався з розморожування та об'єднання неочищеної маси і включав успішну вірусну інактивацію, етапи аніонообмінної хроматографії (Саріо 0), хроматографії з комбінованим режимом (керамічний гідроксиапатит), катіонообмінної хроматографії (5Р- сефароза) та хроматографії з гідрофобною взаємодією (феніл сефароза) з подальшою вірусною фільтрацієюта етапом кінцевої концентрації та діафільтрації. Зокрема, в даному процесі очищення застосовували хроматографічні способи із застосуванням С), гідроксиапатиту,

ЗР та фенілу. Хроматографію з протеїном С і ексклюзійну хроматографію, що традиційно застосовуються в процесі очищення І25, опускали. Типові етапи наведені в Таблиці 3.

Таблиця З

Тинові стани пронесу очищення

Зар

УФІДФ

Зберігання в замороженому вигляді

Розморожування, об'єднання та глибинна фільтрашя

Вірусна інактивація розчинником летергентом я ся я і х

Аніоснообмінна хроматографія

Хроматографня з комбінованим режимом

Развгедення с 1-1.2-разовеї а з і к

Катонособмінна хроматографія

Хроматографія з гідроФфосною взаємолією

Фільтранія для вірусного вилалення

УЧ

ЗНкарська речовина

Ї00152| Ступінь очищення очищеного білка І25 оцінювали за допомогою пептидного картування, ДСН-ПААГ (зі сріблом), ексклюзійної ВЕРХ. Специфічну ферментативну активність, вміст формілгліціну, вміст сіалової кислоти, карту гліканів, профілі зарядів визначали за допомогою стандартних способів. Типові результати наведені в Таблиці 4.

Таблиня 4

Аналіз озищеного рекомбінантного білка 135

Міетоз аналізу ЄОчишенни 125 (Бл об'ємі

Мін-Максе (ті

І 100-101 - 3 о ЯК-10096 (п - 3)

ТПентидне и молю іа їй З картування БО 96-15 М - їл1А 102-10355іва - 3 їі? НИ-10155іп - 3 130 102-10355(в- 31

Блок клітини- «бах (п- 5) хазлІна

ДЕН-ПААГ зі й й ге ц й Відповіддяє сгрізломі іІонообмінна. са Тих А ба-бать їз 7 Кк

ВЕРХ ве Інк в як (- 8 зак ЕЕ Не іа - вина 900-090 095 (п - 5)

Клітинне 85,0595 та 9795 постичавня | бі - 3)

Созоднале й

Де 87-05 - В

Фе сормілівнну й Й

Спевифічна 53-78 (п - 5) активне й ові 72-11095(п-5) кит стели Пк огрп б порти

Карта гліканів Пктрп?7 12НІЗ щи ві п- 5

Запитьна ТЕЛ (в) а4-11550і1п- 5 ппоща

Сюлова кнелата 15-22 (п - 4)

Ендотоксин «0-05 - 3

Еонавантаження 0.000003 - 23 00153) Типова пептидная карта у порівнянні з комерційно доступним контрольним зразком

І25 проілюстрована на Фігурі 2. Результати типового ДСН-ПААГ-аналізу (зі сріблом) проілюстровані на фігурі 3. Як правило, при застосуванні описаного в цьому документі способу, концентрація БКХ в лікарському речовині (ЛР) становила «100 м.д., що задовольняє технічній вимозі«ІОО м.д., загальноприйнятійнабагатьохринках, включаючи США. Результат ЕХ для

ЛРестановив 299,5 95, який також задовольняє загальноприйнятій на сьогоднішній день на багатьох ринках технічній вимозі »99,3 95. Типовий профіль заряду проілюстрований на фігурі 4.

Типова карта гліканів проілюстрована на Фігурі 5. Зокрема, карта гліканів для очищеного І25 містить сім груп піків, які елююються відповідно до збільшення кількості негативних зарядів, отриманих із залишків сіалової кислоти та манозо-6-фосфату, і представлених у порядку елюювання: нейтральні, моно-, дисіальовані, монофосфорильовані, трисіальовані та гібридні (моносіальованіта блоковані МбР), тетрасіальовані та гібридні (дисіальованіта блоковані МбР) та дифосфорильовані глікани.

Ї00154| В цілому, цей приклад демонструє, що спрощений чотирьохколонковий спосіб очищення можна успішно застосовувати для очищення рекомбінантного І25, що виробляється у промислових масштабах у середовищі, що не містить тваринних компонентів.

Приклад 2. Дослідження стабільності збору та вірусної інактивації рекомбінантного І25АЕ

Ї00155| Метою цього дослідження була оцінка впливу вмісту при заданій температуріта циклів заморожування-розморожування на стабільність освітленого збору рекомбінантного 125. 00156) Зразки освітленого збору зберігали в умовах зовнішнього середовища тапри 2-87 до семи діб, а вірусно-інактивовані зразки НМ містили в умовах зовнішнього середовища до 24 годин. Зразки освітленого збору для заморожування-розморожування заморожували при-20 "С, -50 С та -80 "С та проводили до трьох циклів заморожування-розморожування. Стабільність оцінювали за допомогою Вестерн-блотинга, ЕХ ВЕРХ та аналізу активності.

Ї00157| Матеріал для збору І25-АЕ отримували з клітинної лінії 20 за допомогою ССРО із застосуванням 20 л біореактору В. Вгашп з центрифужним ретенційним пристроєм та заданою швидкістю потоків. Для дослідження вмісту зразків при заданій температурі кожний освітлений збір зберігали в умовах зовнішнього середовища при2-8 "С та брали зразки в обрані моменти часу. Кількісні характеристики зразків та час збору зразків наведені в Таблиці 5. Зразки для заморожування-розморожування зберігали при -20 С, -507С та -80"С і розморожували за допомогою водяної бані при 25 "С.

Таблиця 5

Стабільність освітленого збору в задані часові точки 11111110 | Зразки | Температуравмісту | Часутримання (діб) о Т-0, 24 год., 76 год., й ТО, 24 год., 76 год.,

Заморожування / 9х0,5 мл -2090, -509С та -809С розморожування 1, 2 таз о ТО, 24 год., 76 год., й ТО, 24 год., 76 год.,

Заморожування / 9х0,5мл -20 96, -50 С та -80 С розморожування 1, 2 таз

Ї0О0158) Етап вірусної інактивації відбувався на етапі, що включає неочищену масу, до завантаження першої колонки. НМ отримували за допомогою концентрації та заміни буферу освітленого збору. УФ/ДФ проводили за допомогою системи Раї! Сепігатаїге 1 кв. фут., а буфер міняли на 10 мм МЕМ, 155 мм масі, рн-6,5. На етапі вірусної інактивації проводили додавання 1 95 Твін 80 та 0,3 95 ТоВР ї фільтрацію за допомогою шприцевих фільтрів Оигароге для кожної часової точки. Зразки брали для кожної часової точки з перерахованих в Таблиці б та заморожували при -80 "С. Зразки з досліджень освітленого збору в задані часові точки та досліджень із заморожуванням-розморожуванням досліджували за допомогою Вестерн- блотингу та аналізу активності (аналізу з 4-МО). Ступінь очищення зразків НМ на етапі вірусної інактивації визначали за допомогою ЕХ ВЕРХ. У результатах, що відображають активність в заданій часовій точці, для Збору 12 і Збору 18, наведених у Таблиці 5, не спостерігали значних

Зо змін при утриманні їх протягом 7 діб в умовах зовнішнього середовища тапри 2-80. В активності, реєстрованої для Збору 12, не спостерігали помітних змін після З циклів заморожування-розморожування і зберігання при -20 "С, -50 "С і -80 "С.

Таблиця 6

Вірусна інактивація неочищеної маси 11111111 | Зразки | Температуравмісту | Часутримання (діб) контроль 7 ее оаня венаня вірусна інактивація 00159) 00160) Активність та результати ЕХ-ВЕРХ для стабільності на етапі вірусної інактивації НМ проілюстровані на Фігурах 6 і 7. На базі даних активності та ступеню очищення на протязі 24 годин показано, що в стабільності вірусної інактивації не було змін.

Ї00161| Підводячи підсумок, можна сказати, що за результатами описаного в цьому документі аналізу стабільності, освітлений збір можна зберігати при 2-8 7С (наприклад, на протязі 7 діб) без значних змін якості збору. Освітлені збори можна піддавати багаторазовим циклам заморожування-розморожування та зберігати при температурі -20 "С, -50 "С і -80 "С без значних змін в стабільності. На базі отриманих за допомогою ЕХ ВЕРХ результатів за ступенем очищення можна сказати, що вірусна інактивація на етапі НМ може відбуватися при температурі навколишнього середовища (наприклад, протягом 24 годин) без змін в активності і ступеню очищення.

Приклад 3. Проведення очищення та аналізу середовища І СО, щоне містить тваринних компонентів

Ї00162| Метою цього дослідження було проведення очищення об'єднаного збору І25-АЕ, отриманого з хімічно визначеного середовища, що не містить тваринних компонентів, із застосуванням перфузії та отримання характеристик лікарської речовини.

Ї00163)| У цьому дослідженні оцінювали спосіб проведення очищення І25-АЕ і лікарської речовини (ЛР), отриманих за допомогою біореактора, що містить хімічно визначене середовище.

Клітинна культура

Ї00164| Матеріал І25-АР отримували з клітинної лінії 20, експресуючої фермент І25та формілгліцін-утворюючий фермент (БСЕ), як описано в Прикладі 1. Матеріал отримували в

ССРО в 1 л біореакторі з віддентровим фільтром баз бір із застосуванням хімічно визначеного безсироваткового середовища. Окремі мішки з кожним освітленим збором (НІ-21) брали замороженими при -20 "С та розморожували при 2-8 "С протягом ночі. Однакові об'єми кожного очищеного збору об'єднували для того, щоб отримати пул повного збору, потім фільтрували із

Зо застосуванням 0,2 мкм фільтру та концентрували за допомогою 30 кД касети РаїїЇ Отеда

Сепігатаїгйе із загальною площею мембрани 1 фут-. Неочищену масу (НМ) перед застосуванням фільтрували із застосуванням 0,2 мкм фільтру та заморожували.

Очищення 00165) Типові характеристики колонки і завантаження наведені в Таблиці 7. 2) сефарозу завантажували при заданого титру З г/л. Наступні колонки завантажували на 100 Фо відносно елюату з попередніх колонок, не видаляючи матеріал.

Таблиця 7

Характеристики колонок та завантаження . ' Завантаження

Розміри колонки Об'єм колонки Завантаження смоли 125) НАтипуї,бОмкм | 16х30 | 60 2 | 55 | 330

Ї00166| Одне очищення проводили для НМ з об'єднаних зборів 1-21 з біореактора. НМ розморожували при 2-8 "С протягом ночі та об'єднували однакові об'єми, взяті з кожного збору.

Ї00167| Окремі етапи колонкового процесу та состави буферів наведені в таблиці 8-11.

Об'єднану НМ фільтрувализадопомоюсистемипляшкових 0,2 мкм фільтрів, доводили до рнН 6,5 за допомогою 1 М ацетату натрію, а провідність доводили до 16 мсм/см за допомогою 5 М хлориду натрію перед завантаженням у колонку зОсефарозою ЕР. ЕлюатОсефарози доводилидо0,001 М МаРОззадопомогою 0,25 М МарРо»х, рн 5,5, і фільтрувализадопомогою 0,22 мкм пляшкового фільтру з РЕ5 мембраною перед завантаженням у НА-колонку. Провідність елюату НА доводилидо1ї1,55 М Мас! за допомогою 5 М Масі, а рН доводили до рН 5,5 за допомогою 1 М ацетату натрію. Час доведення становив приблизно 1 годину. Доведений пул фільтрувализадопомогою 0,22 мкм пляшковогофільтрузРЕЗ мембраною перед завантаженням у колонку з феніл сефарозою. Феніл-елюат концентрували 4Х та діафільтрували бХу0, 2 М

МмаРо», 0,137 М Масі, рн 6,0. Діафільтрованийпродуктдоводили до 2,0 г/лтазмішували з 0,2 95 полісорбатом 20, щоб отримати пробну лікарську речовину. Для отримання додаткових характеристик створювали пробний пул НІ1-20 з НМ.

Таблиця 8

Типові технічні деталі для хроматографії зосефарозоювЕ

Етап процесу Швидкість ОК Буфери потоку (см/год.) 0,5 М маон 0,01 М МЕМ, 0,155 М Масі, рі 6,5 0,01 М МЕМ, 0,155 М Масі, рі 6,5 0,01 М МЕМ, 0,155 М Масі, рі 5,5 0,01 М МЕМ, 0,50 М Масі, рі 5,5

Очищення /Зняття 1,0 М Маон, 2 М масі 0 о м маон

Таблиця 9

Типові технічні деталі для НА-хроматографії

Швидкість потоку 0,5 мМ маон 0,250 М МаРО», рН 5,5 . 0,01М МЕМ, 0,001мММаРох, . 0,01М МЕМ, 0,001мММаРох, 0,01М МЕМ, 0,08ММаРОо», рН 5,5 0,4М МаРОгрнН 12 0,5 М маон 0,1 м маон

Зо

Таблиця 10

Типові технічні деталі для хроматографії з феніл сефарозою

Швидкість потоку 0,5 м маон 0,02 М МЕМ, 1,5 М Масі, рН 5,5 0,02 М МЕМ, 1,5 М Масі, рН 5,5 0,02 М МЕМ, 0,2 М масі, рН 5,5

РО/ОІ Вода

Відмивання о 0,5 м маон 0,01 М маон

Таблиця 11

Типова діафільтрація феніл-елюційного пулу

Фільтраційний пристрій Сепігісоп Різ 70

Діафільтраційний буфер 0,02 М МаРох», 0,137 М Масі, рН 6,0

Об'єми діафільтрації бх-вХ

Ступінь очищення в ході процесу, що визначається за БКХ за допомогою ЕГІЗА 00168) У Таблиці 12 наведені дані по видаленню БКХ на кожному етапі в ході процесу.

Результати по видаленню БКХ в ході процесу були високими, а найбільше видалення відбувалося на етапі НА.

Таблиця 12

Дані по видаленню БКХ в ході процесу

БКХ (нг/мг) Кратність БКХ 46,392 51,957 . 5,876

Характеристики лікарської речовини 00169) Результати для типової партії лікарської речовини наведені в Таблиці 13. Як можна бачити, в очищеному матеріалі лікарська речовина має високу специфічну активність та 95Фг.

Типові характеристики лікарської речовини наведені в Таблиці 13. Вміст БКХ було зменшено від 1870 нг/мг до 372 нг/мг на кінцевому УФ/ДФ етапі.

Таблиця 13

Типова партія лікарської речовини о Картаглканів///////7777111111111111111Ї11111111111111111111

ОВЕРЕХЇ111111111С111

Клітиннепоглинанняд/ //-/:77777111111Ї111111111111111111111119811111111сссСсСс2сС

Приклад 4. Фізико-хімічні та біологічні характеристики рекомбінантного ферменту 125

Ї00170| Метою даного прикладу було отримання детальних характеристик рекомбінантного білка І25, очищеного вищеописаними способами.

ДСН-ПААГ

ЇО0171| Для даного експерименту рекомбінантний білок отримували, застосовуючи людські клітинні лінії 20 та 40 у двох окремих безсироватковихклітинних культуральних реакціях. Зразки збирали та очищали за допомогою вищеописаних способів. Очищений фермент 125 аналізували за допомогою ДСН-ПААГ та обробляли срібним барвником для візуалізації. Типові результати проілюстровані на Фігурі 8. Як видно з Фігури 8, схеми смуг для рекомбінантного білка І25, очищеного вищеописаними способами, можна порівняти з контрольним зразком 125, очищеним стандартним способом.

Пептидна карта

Ї00172| Рекомбінантний білок І25, отриманий з клітинноїлініїй25-АБ 20, очищали за допомогою вищеописаних способів. Зразок очищеного рекомбінантного І25 і контрольний зразок людського І25 піддавали протеолітичному розщепленню і досліджували за допомогою

ВЕРХ-аналізу. Типова пептидна карта в порівнянні з відповідною картою для контрольного І25 проілюстрована на Фігурі 9.

Відсоток конверсії уформілгліцін

ЇО0173| Для визначення відсотка ЕСіу-конверсії можна застосовувати пептидне картирування. Для активації І25 необхідна конверсія цистеїну (відповідного позиції 59 зрілого людського І25) у формілгліцин за допомогою формілгліцин-утворюючого ферменту (ЕСЕ) як показано нижче: (НО) а Оси Й

Формілтліпни

ХххХюбузккхйтахххАгаХххмхх сом ХухХхх Оу хххвтОоХххАтахххКхх (Зетр (АВ) утворюючий ферменх (АЇВі

Отже, відсоток конверсії у формілгліцин (96ФГ) можна розрахувати, використовуючи наступну формулу:

Коо)

Кількість активних молекул І25 вав 35)-ЗМВ ЗЗ-ЗЖШНКИМ 6 ШМХ-ШЗШЗЗ333НЧНЧНЧЧ х100

Загальна кількість (активних "неактнЕних) молекул 125

Ї00174| Наприклад, 5095 ФГ означає те, що половина очищеного рекомбінантного 125 ферментативно неактивна та не надає терапевтичного ефекту.

ІЇ00175| Для розрахунку 90ФГ застосовували пептидне картування. Коротко, очищений рекомбінантний білок І25 розщеплювали на короткі пептиди за допомогою протеаз (наприклад, трипсину або хімотрипсину). Короткі пептиди розділяли та отримували їх характеристики за допомогою НРІС. Пептид, до складу якого входить позиція, відповідна позиції 59 зрілого людського І25, вибирали, щоб визначити, чи був Суб у позиції 59 перетворений у ЕСІУу, в порівнянні з контролем (наприклад, білком І25 без конверсії у ЕСІу або білком І25 з 100 95 конверсією у ЕСІУу). На підставі відповідних пікових площ можна визначити кількість пептидів, що містять ЕСІу (відповідну кількості активних молекул І25), та загальну кількість пептидів, що містять ЕСіу та Суз (відповідну загальній кількості молекул 125), і розрахувати співвідношення, що відображає 9ФГ. Типові результати наведені в Таблиці 14.

Карта гліканів - вміст манозо-б-фосфату та сіалової кислоти

Ї00176| Проводили визначення составу гліканів та сіалової кислоти для очищеного рекомбінантного білку 125. Кількісну оцінку составу гліканів проводили за допомогою аніонообмінної хроматографії. Як описано нижче, карта гліканів рекомбінантного І25, очищеного в умовах, що описуються в цьому документі, складається з семи пікових груп, які елююються відповідно до росту кількості негативних зарядів, щонайменше частково належать глікоформам сиалової кислоти та манозо-6-фосфату, отриманих в результаті ферментного розщеплювання.

Коротко, очищений рекомбінантний І25 з безсироватковоїклітинної культури (безсироваткова

І25-АЕ 20 та безсироваткова І25-АЕ 40), та контрольний рекомбінантний І25 обробляли (1) очищеним ферментом нейрамінідазою (виділеною з Агіпгобасіег Огеагасієп5 (10 мЕ/мк/Л), Коспе

Віоспетіса! (Індіанаполіс, Індіана), Саї. Ж 269 611 (1 Е/ЛО00 мкЛ)) для видалення залишків сиалової кислоти, (2) алкалінфосфатазою на протязі 2 годин при 37-1"С для повного вивільнення залишків манозо-6-фосфату, (3) алкалінфосфатазою «т нейрамінідазою або (4) не проводили обробку. Кожне ферментативне розщеплювання аналізували за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії з імпульсним амперометричним детектуванням

Зо (НРАЕ-РАЮ), використовуючи аналітичну колонку СагроРас РА Апаїуїйса! Соіштп з передколонкою Оіопех СагроРас РАТ. У кожному аналізі використовували еталонні групи сиалової кислоти та манозо-б6-фосфату в діапазоні, що становить від 4,0 до 2,0 нмоль.

Застосовували ізократичний спосіб із застосуванням 48 мм ацетату натрію в 100 мм гідроксиду натрію на протязі як мінімум 15 хвилин при швидкості потоку 1,0 мл/хв при зовнішній температурі колонки для елюювання кожного піку. Дані, отримані для кожного окремого етапу для зразків І25-АЕ та контрольного І25, об'єднували на одній хроматограмі, щоб отримати карту гліканів для кожного відповідного рекомбінантного білку. Як проілюстровано на фігурі 10, на типовій карті гліканів для І25, очищеного з безсироваткового середовища, представлені типові елюційні піки (в порядку елюювання), відповідні нейтральним, моно-, дисиальованим, монофосфорильованим, трисиальованим та гібридним (моносиальованим та кепованому манозо-6-фосфату), тетрасиальованим та гібридним (дисиальованим та кепованому манозо-6- фосфату) та дифосфорильованим гліканам. Типові карти гліканів проілюстровані на Фігурі 10.

І00177| Середній вміст сіалової кислоти (кількість молей сіалової кислоти, що припадає на один моль білку) для кожного зразка рекомбінантного І25 розраховували з лінійно-регресійного аналізу стандартних значень для сіалової кислоти. Кожну отриману хроматограму візуалізовували за допомогою програмного забезпечення РеакмМеї 6. Стандартні значення для сіалової кислоти, значення для сіалової кислоти, виділеної з контрольного рекомбінантного

І2оОта досліджуваних зразків, знаходяться в одному піку. Кількість сіалової кислоти (у нмоль) для І25 розраховували як вихідну величину за допомогою наступної формули: о фймолей сіалової кислотні

СК, Снолей на моль Г25 ОС ОЗ272НсІ

Де С - концентрація білку (в мг/мл) у зразку або контрольному зразку рекомбінантного І25.

Скореговану величину для сіалової кислоти в молях сіалової кислоти на один моль білку для кожного досліджуваного зразка розраховували, застосовуючи наступну формулу:

«Вихідна значення йля 000 Нонановлена значення

Скореговане - Ї п сіалокоїкцєлюоти 7 х. бляідурсульфази значення для СК с Вихідне значення |) для ідурсульфати

Ї00178| Типові дані, що представляють вміст сіалової кислоти в рекомбінантному 125, очищеному з клітинних ліній І25-АЕ 20 або 40, наведені в Таблиці 14.

Таблиця 14

Типові характеристики рекомбінантного 125, очищеного з безсироватковій клітинній культури (Безсироваткова о Пептиднекартуванняд//-/:///1111111111Ї1111111111111111111сСсСсС опквЕР 71111110

Специфічна активність (Од/мг) (аналіз виділення поко НН сульфату) 64 о Трисіальованіо/////777777771111111111111111111111111Ї11111111111111111891111сСс21С

Специфічна активність

Ї00179| Специфічну активність рекомбінантного ферменту І25, очищеного описаними в цьому документі способами, аналізували за допомогою іп мігоаналізу виділення сульфату або аналізу з 4 МОР.

Іп мігоаналіз виділення сульфату 00180) Іп мігоаналіз активності виділення сульфату проводили, застосовуючи в якості субстрату гепарин дисахарид. Зокрема, в цьому способі визначають здатність І25 вивільняти сульфат-іони з субстрату природного походження - гепарин дисахариду. Кількість вивільненого сульфату можна визначити за допомогою іонної хроматографії із застосуванням детекторуз провідності. Коротко, спочатку зразкам замінювали буфер на 10 мм ацетату Ма, рН 6, для усунення пригнічення фосфат-іонами в буферній суміші. Потім зразки розводили до 0,075 мг/млреакційним буфером (10 мм ацетату Ма, рН 4.4) і інкубували протягом 2 год. при 37 С з гепарин дисахаридом при співвідношенні ферменту та субстрату, відповідному 0,3 мкг І25/100 мкг субстрату, в 30 мкл реакційному обсязі. Потім реакцію зупиняли шляхом нагрівання зразків при 100 2С на потязі З хв. Аналіз проводили, застосовуючи аналітичну колонку біопех ІопРас

АБІ18 з передколонкою ІопРас АС18. Застосовували ізократичний метод з 30 мм гідроксиду калію при 1,0 мл/хв на протязі 15 хвилин. Кількість сульфату, вивільненого зразком 125, розраховували, застосовуючи лінійно-регресійний аналіз сульфатних проб в діапазоні від 1,7 до 16,0 нмоль. Фіксовану величину виражали в одиницях на мг білку, де 1 одиниця відповідає 1 мкмоль сульфату, що виділяється на годину, а концентрацію білку визначали за допомогою вимірювань А280. Типові результати наведені в Таблиці 14.

Аналіз з 4 МОЄ 00181) Специфічну активність рекомбінантного ферменту І25 також можна аналізувати за допомогою флуоресцентного аналізу з 4 МИР. Коротко, в цьому аналізі оцінюють гідроліз субстрату І25-4-метилумбеліферил-сульфату (4-МОР-505). Після розщеплення субстрату 4-

МИБ-504125 молекула перетворюється в сульфат та природний флуоресцентний 4- метилумбеліферил (4-МОР). В результаті ферментативну активність 25 можна визначити, оцінюючи загальну зміну флуоресцентного сигналу з часом.Вцьомуексперименті очищений білок І25 інкубували з розчином 4-метилумбеліферил-сульфату (4-МОБ-5054), сіллю калію,

Зідта Саї. й М-7133). Калібрування в цьому аналізі проводили, використовуючи групи контрольних зразків, що містять комерційно доступний фермент І25, розведений в матковому розчині у співвідношенні 1:100, 1:200 та 1:20000. Ферментний аналіз проводили при 37 "С за допомогою відкаліброваного флуорометру. Використовуючи значення флуоресценції, отримані для кожного еталонного зразка, відсотковий коефіцієнт варіації визначали за допомогою наступного виразу: кВ -Єтанадлрнинє відхиленнявихійного значиння флуоресценнії СМ - 3) Утоп

Сераедне зжечення флуоресценції

Ї00182| Потім відсоткові значення КВ застосовували для розрахунку скорегованого середньої флуоресценції для кожного зразка для того, щоб визначити реєстровану ферментативну активність, яка виражається в МЕ/мл, за допомогою наступної формули: ііїнмеольйі М лло у злімял б ігод БКімов3, о.

ВЕ /мл о іСЕФ -- З 2 - - 5 - (1-23 -------5-5- | - 65 А КР

І 1 ЗО Ед Кк М'мл А біл л Бохв Х нюале!с І

Зо СЕФ - негативна скорегована середня флуоресценція

КР - кратність розведення

ЇО0183| Одна міліодиниця активності відповідає кількості ферменту, необхідного для перетворення одного наномолю 4-метилумбеліферил-сульфатуу 4-метилумбеліферил на одну хвилину при 37 70.

Профіль заряду

Ї00184| У цьому експерименті визначали розподіл заряду для кожного очищеного рекомбінантного І25 за допомогою сильної аніонообмінної хроматографії (САХ), застосовуючи систему для високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). У даному способі варіанти рекомбінантного І25 у зразку поділяють на підставі відмінностей в поверхневих зарядах. При значенні рН 8,00 негативно заряджені групи адсорбуються на фіксованому позитивному заряді

САХ-колонки. Для того, щоб елюювати кожну групу білків пропорційно силі їх іонної взаємодії з колонкою застосовують градієнт зростаючої іонної сили. Сто мікрограмів очищеного 125, виділеного з клітинної лінії 20 у безсироваткових умовах росту, або контрольний рекомбінантний фермент І253авантажували в колонку Атегепат ВіозсіепсезМіпіоРЕ (4,6 х 50 мм), яку тримали при температурі навколишнього середовища, таурівноважували 20 мм Трис-

НСТ, рн 8,00. Градієнтне елюювання здійснювали за швидкості потоку 0,80 мл/хв, застосовуючи рухому фазу 20 мм Трис-НС1, 1,0 М хлориду натрію, рН 8,00. Концентрацію білку визначали безперервно в ході експерименту, вимірюючи поглинання світла зразка, який елююється, на довжині хвилі 280 нм. Типові результати, ілюструючі профілі зарядів, які спостерігали для рекомбінантного І25, виділеного з клітинних ліній 20 та 4 0, наведені на Фігурі 11.

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Склад, який містить очищену рекомбінантну ідуронат-2-сульфатазу (125), що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:1, при цьому очищена рекомбінантна І25 має щонайменше 70 95 перетворення залишків цистеїну, що відповідають Су559 із ЗЕО ІЮ МОЛ, в Са-формілгліцин (ЕСІу), який відрізняється тим, що очищена рекомбінантна І25 містить менше ніж 150 нг/мг білка клітини-хазяїна (БКХ).

2. Склад за п. 1, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок 125: ї) містить щонайменше 10 95 біс-фосфорилованих олігосахаридів на молекулу; і) містить в середньому щонайменше 16 сіалових кислот на молекулу; ії) містить карту гліканів, що характеризується сімома або менше піками, вибраними із груп піків, що відповідають нейтральному (група піків 1), моносіалованому (група піків 2), дисіалованому (група піків 3), монофосфорилованому (група піків 4), трисіалованому (група піків 5), тетрасіалованому (група піків 6) або дифосфорилованому (група піків 7) білку І25; їм) має специфічну активність, яка становить щонайменше 40 Од/мг, визначену за допомогою /п уйго аналізу активності виділення сульфату із застосуванням як субстрату гепарину дисахариду; або м) має специфічну активність, яка становить щонайменше 20 Од/мг, визначену за допомогою /л уйго аналізу перетворення 4-МОБ-505х у 4-МОР.

3. Склад за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок І25 містить менше ніж 100 нг/мг БКХ.

4. Склад за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок І25 містить менше ніж 80 нг/мг БКХ.

5. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищена рекомбінантна І25 містить щонайменше 50 95 біс-фосфорилованих олігосахаридів на молекулу.

б. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок 25 має специфічну активність, яка становить щонайменше 50 Од/мг, визначену за допомогою /л уйго аналізу активності виділення сульфату із застосуванням як субстрату гепарину дисахариду.

7. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок 25 має специфічну активність, яка становить щонайменше 60 Од/мг, визначену за допомогою /л у/го аналізу активності виділення сульфату із застосуванням як субстрату гепарину дисахариду.

8. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок І25 має специфічну активність, яка становить щонайменше 30 Од/мг, визначену за допомогою /л у/їго аналізу перетворення 4-МОБ-505 у 4-МОР.

9. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок 25 має специфічну активність, яка становить щонайменше 40 Од/мг, визначену за допомогою /л у/їго аналізу перетворення 4-МОБ-505 у 4-МОР.

10. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок І25 має специфічну активність, яка становить щонайменше 50 Од/мг, визначену за допомогою /л у/їго аналізу перетворення 4-МОБ-505 у 4-МОР.

11. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищений рекомбінантний білок 25 має специфічну активність, яка становить щонайменше 60 Од/мг, визначену за допомогою /л у/їго аналізу перетворення 4-МОБ-505 у 4-МОР.

12. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищена рекомбінантна І25 містить щонайменше 75 95 перетворення залишків цистеїну, що відповідають Суз59 із БЕО ІЮ МО-1, у Са-формілгліцин (ЕС1У).

13. Склад за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що очищена рекомбінантна І25 містить щонайменше 85 95 перетворення залишків цистеїну, що відповідають Суз59 із БЕО ІЮ МО-1, у Са-формілгліцин (ЕС1У).

14. Склад за будь-яким із пунктів 1-13 для застосування в лікуванні синдрому Хантера. Зб

РОЗМОРОЖУВАННЯ НМ, 2-8 5. ГЛИБИННА ФІЛЬТРАНІЯ ВІРУСНА ІНАКТИВАЦІЯ ГО ПО ЛІСОРБАТХ ВО 0 395 ТИВР Ю ХРОМАТОГРАФІЯ СО СЕФАРОЗАаАЮ САРТО 80 см ГІДРОКСНАНАТНТОВА АХРОМАТСОС БАЧНЯ ПОТУ Ба см ЗЕ СЕФАРОЗА БЕ БО см ХРОМАТ РАаАЧІЯ ЗВЕНІ СЕФАРОЗОЮ ЕЕ см ВІРУСНА ФІЛЬТРАЦІЯ РЕАКОМА УФІДФ У ЛІКАВСЬКНИ БУФЕР (2 мг/мл) г ММ ФОоОсСтТвВАТУ НАТРІЮ 137 мМ масі, рн во 02 МІКРОННА ФІЛЬТРАЦІЯ ЛІКАРСЬКА РЕЧОВИНА у ВЕ я Ж пі ден В ЯЗ - де НА 01 шВАК дих 5 5 та: я МОЖ г КО хм. ; Я ге Уже Я -

вва. - с о - 5 ре - ще З КЕ ОЇ їй ше Ж з 5 - МЕ і ще шо і Ка «ож РЕ у ТЯ ще ЕЕ: їх ме де ре. т сб їжу 3 ї ТІ щі ж ку дя ше -- Мб» ЩЕ Ж ще бе В тн шо ж и В іш ве ж п я М - Х пе ОКО Є Ат хз сх Я ШЕ гр я вва, іх ше Є п | - тя ій о м ще МУ. о : - 2 ж кі ІЗ ро УКИ є о ї г З ? ких ї сх МЕ оди Її. ще КУ мч МОХ : я 13.1 хх ри «5 Зав а о Во КЕ ї и шия ДН ЯН ов мі і КО ї ря і ТА ТАКЕ сіння оиячнкст в Кфнккжкечк нюху і ї. ї і Кі ї її І Я це й ї В Б Ян Б зекемо ди тки У ВХ ней ДА Модосююд нення І ке сх хї З їх як ШИ Ди дини ум са Хилядадам Ну Н ЗМ У ДЕК пи у Ки пу А дитин, и : не м Же СЯНУ ХИТ ви -Я х 5 ка ж ї Х Вот ше п. ї х їх Ко г в Ух хе КУ Н У Ж ЕІ ї вх ок В КН їх т х СК З еле кору читав ЕН : Е З ї ОЗ хх КОМЕРОЛЬНИМ МО ЕН Е дж З х х «КА ЕУ З Х З -ВНЯ Х і х ? Аа ї : «ОЛЯ: Е ; ев Її Н «ва 3 З " -пЖН в З Й ге с У у АТ КВ ї; я я я МФО 2000 Зоб «0006 Б0О0 бо0о ЯМЮ ВО БО Об НМ оо 13600 Ме щОа ВОБОо0 ТОЮ ОК зако МОЮ ЯМ НОЮ ХВИЛИНИ ко

ФІГ. КОНТР АКА ТІ «є у. я - м пен и НН НН їде ПЕ ОО й 7 киш в т с В -о І - ся по СМУГІ завад рітий Ка т ч зва с су ЗАНАНТАЖЕНИМ: ; ІЗАВАНТ и с кх ії зва РАВ Гете роя с і ВО ОБЖМ І ВІБОСОику 0 ШИК ЕК нн нн ї: ЗО сс Н пн СНУ И Я ТВ лслно : ОПО ОО СО ИН, я скоожт - й ї пт дп орди В Сх с 4 | ПОЧНІТЬ ПЛЮСИ рий й й ДНЯ 1 ОО о ОО ОО ! ще р пеухснох щита ія її, й зда Ма о З ОКУ 1 ВТОЗІНЕЗАБАРИЛЕНИМ пи ко бмка ; ; с ОО МОЯ І Корея п А КАК З ОМ п п ; У сн ПИВО ОУН снів т є зі Є щи ЇВ ВО еВ х ж п у син роти вся ДН ЕОМ ВХ ХХ ПОКИ, ут тшеите тт - . МИЛИ се слктеттня с ща В Б КОНТВОЛЬНИИ РАК БІ й МК ути а мЖ КОЖНОГО ПОЕМИ ЕКО ОМ МОЯ ї й пий ї . ' БО ОО ша ! й СИ Як ней я і ПЕШИИИЦИКИО в Я біди тт хорт сяяти Ук, яти Я що гуу її З КОНТРОЛЬНИЙ ЗРАЗОК в ДК пи: ЗВ пвав'кОжНОГгО ти ВКМ ММ ОКХ Н п и УНН пахне ие щі ос в п пили омжон. конте Б З долин в, шк Ул ву у з ПИ Нижи

0. 41 с талоннийзваюю СИ Шов з ж с ши но В ДЕН, ММ: Є с ще жі вешеякя Квт ет и р ОО я т я св р я Я йо с Я ОО ВО5Р ТТ НЕОБ СПАДОК і г коня пе й ос й а зн кон нн он нн Знання нин з а ОО 28 крем ля «ви й Н пінні їв а бровою лРОБН хе нмюше гЗ М М В й Н як га ій т К ХХ Й; ї і ЕЕ ше її КОНТР 5 р; жде ОО Б3Я А З ня Шу НКУ ; Е й о щі Укл, я шк ще Мав и ння Болаоослодаввлні онко о а КАК сон ТУ п шкі ТЗ кднтвОопь Я імснафосбоаритьсяяні тлетрамань їх дифосфери 125 контРоль мово ші тврилнітлікани , льсвзні : Зх трисівльовані че . НИ пмикани Я я ней в - тлію: і її хриікчлитьсваки тн , витральні . . тлікани і на ніч У тпікяни Ж - писвапвовяні и Ї шІОДНОЙ ЕЛІЖКаАНИ Е й ткани З | ва в їв. І! а КМ зАМА ЛА АД я щі вро чну . й 125-АК ЖОВ Без сироватки) ' їк їх у мА ААЛ А х І д шк, нан а в иа НН А 425-АЕ Я Без спроватют) ї ! Де п, «КД я х ! А КА, де АклакніА АК я ГЕ дна У Ман Ж МЛ М Я ен Коня Во пох ЗМК Зло я00 43 ядо 475 ОО 56 во БІя боб бо 5 вл Во хвилини в. 5

І АКТИВНІСТЬ (ОД/мг) ; пеня КОНТРОЛЬ КОНТРОЛЬ ОМ м м Т-0 Темтоя Т-0000 Тевтя Те Мтод ФІГ .6 ЕХ-ВЕРХ н нен ЛАН ня я ж; шо я; м я я я 1 й 2-53 п ші КОНТРОЛЬ КОНТРОЛЬ М М м т-о Тебатод Т-0 Т-бгодо Б-2Ятод я М й Є уки в. м ІКОНКИ ОО я ! ? лов ОМ с п п Он ЇМ М ж: АХ ПЕНЯ У с с о - он ие З КОМКЕ Ен КВК Ух ПОЗИК Ка Ки ПЕК ОК КОХ п ОМ ПЕН ХК ХНА, ПЕ КЕ КМЗ о Пари с с с НО пе я у, ОХ МІК ПК З ПК КЕ СУ КК ЗК АХ с В ОО ПАМ ОКО ВО Ме ММ МОХ Манн Я ПЕК ЕКО СПИНИ р Я ОО ше ЗЕСДО КЕКВ КО ПЕКІНА КН п о ( ГО о а о я По о ооо. і ППО ОО сис: ОО о. . . о 1 ОД ПМ МО 3 щ я

0 о. ОО ОО ДОХОЕ п. с с ОХ У Х ПОЗУ ПСЖ Х У ЗК БЕК ПИВ ХО ПИКА и ХК я . с хх КВК КК ПО КОХ ММ КК ЗХ МКК яия КАН : с З КОКО ну АМИЕ МАКОМ ЕВ о о; и ЗО МКК КЕ КК ПИТОМИХ І о в В я Я о ОМ я ОХ ОО Кв ден І М ХУ ККД КК МЕ - сн ПК о он. й п о шо ЩО М я СК Е: ОКА 2 КЕШ ПО ОЕКАКК нд о СУ Со МАКИИЙ ОКО ща Ов С з ИНА Е А ОО п о м де С ПОКИ ЕВ о о ПАК КВ ще ПУ А А Со оюи о ЕЕ АН А ОМА ЗУ ПАК И 1 00 . с ВО с о. я У ЗЕ хх ПЕКИ ВН КИ КАВА сх МОВАМИ щі ПЕН ОКОМ ДВ о о З У ОКХ КМ АН ОКОМ ПДК о. с ОХ ОМ СОМ МН ОК М 3 КК ХО що ОКО 0 ПАН МКК п ОКХ МЕ 75 п В о ЕВ Кия

З . с о с г

І |. . с ЕХ ОО ВУ чаКОО ХК ХЕКЛИ о о ОК По АНЯ ОК Нв ПОЕМ я СА РОКУ ОК Зя ях с С ЗК ОО КУКИ У х п ММК А ОХ ПЕВ

0. пон ОО ОВ МКК ОК КО НК ЕСЕ В о МЕС о М КІЗ Оу Кан с г ЗО НВ В я во а о о я я ОО в СО Се ПОМ КЕНЕ КЕКВ МО Кк, І о. ПЕК ПОН ПЕК ОО ПИ ММ ШЕ ЕКОН НМ ПОКИ В о деку . ЗК ЕК ПМК В В І . я ПЕ ОХ АК щ п І ОО у. с о По КВ Мк ДАВ З ЕК ов, о с МО о З І, ПОМ М ОМАН ние . . с У с ве МЕ ХХ аю йо МИША КО УЗН Я З ок о. о - Є ХЕ с в А ж Х ТЕН ПІНКЕЕ ВЕК ОК ня ПЕС ВДИ ПЕКИ ЕЕ о о. Я ЗК 5 с с я МЕН НЯ ПВА п В я КОНЯ КИТИ ПИЛИ ПО КВ КИТ КН Ух ОН З : о Он ПЕ ПЕК ОВО ПР с КЕ ПЕК ни с С і

0. В М ЗУ ша п ОО МК с кН КУ Оу УВКЯ М МО З ОО КЕН с о ду ех ДИКЕ, ЕК МОМ ОКО ОКЕАН В ОО х З . ЕН ВО ПИШИ ОК пи КВ, Ох ЗВ о я ОО КИ я 3 І В ЩІ ОО У Пон КК . о ДЕ М КУКИ ПОВИ ОН он г с п п їх КВН ПДК МЕСИЕ ВИ о , МОВО п КИ ке ОН. ПЕОО ЕН М п ПЕК В ЕТО КЕ ПЕК ви Пе о ше ОВК ПИ с а о в М М у Я ж 5 я с шо о В ОС К КОЯ ЗИ ЕЕ ЗЕ б рум ЖК МИШКИ ОО ПО За п о о.

5. о В и ОКХ ши КЕ ОО МО щ п КО КАМИ ЗАМКІВ ОК ПОПКАК Кн ОХ п ї ГУ ОО о шо В Є шин ш р Ти р. К, І : ! озететятх ОЗАВАНТІЇ оо. у мг : х З т. Ку уж я г | : ! : ; Е і ЗАВАНТАЖЕННІ в ВСВОКе : ет - . х. СМУГА) оразок ОБЄМ всього м І ЗваАзЗОВ : ва ї «льльльльльтьтьтьтьтьтьтьльтьтьтьтьть ІЙ «льльльльтьтьтьльльтьльльль вв фльтьтьтьтьтьтьт полк ллють Е І «льльльльльтьтьтьтьтьтьтьльтьтьтьтьть т В і «льльльльлььтьльльтьтьльльльльльтьтьтьтьтьтьтьтьтья ї ни ! ! Ти г Б - 5 Ї З мкА ОБО і І : Е ї їх й Е Е : ? Й | МКГ : х щи чїхї Ї : 1 шк ее т ТЯ і й Е "КОНТРОЛЬНИЙ . о мкв В і І Е й ! : а ї м ох ! " ЗРАжОК ІВ В і й : ї за ї Й ї си Й й Ти - я . КОНТРОЛЬНИЙ і сом зм ! а о що Ти й | РА ; Кк | ши кн ІЯ садили лликихияикя оккжккк 3 я ! | ; І ГЕТА Ти а Ммкп МКГ 00 ЕТАЛОННИЙ . : й ! Е у В 7 ї ит слив ЗВАЗОК 125 Шо й | тка у Я 143 авг х З ОБЕЗСИРОВАТКОВА 00 ода БВ ИПРОВА : Х б,

8. К й ; К КУЛЬТУРА ДАР 20 . Е Е: Е Е нення кино: ЯКЕ ПпКОВА . Я мк : ! ку ж Кт о А Ї МЕ Мкиа БЕЗСИРОВАТКОВ. 8 БЕЗСН Е Ї вуж нськ ех з А І пре ; В : "КУПЬТ УРА ІЗБ-АБ Я рпвкжвкнвки