BR112014032567B1

BR112014032567B1 - Composições compreendendo iduronato-2-sulfatase (i2s) recombinante purificada e seu uso

Info

Publication number: BR112014032567B1
Application number: BR112014032567-7A
Authority: BR
Inventors: Dave Nichols
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies, Inc
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2022-09-13
Also published as: HK1249027A1; NZ743910A; RS58005B1; HK1209767A1; PH12014502871A1; AU2016200469B2; PE20150720A1; KR20140004603A; PH12015502408A1; EA034549B1; KR20220002227A; CN107596358A; MX2019008914A; HK1249026A1; ZA201803289B; CL2014003567A1; AU2013282395A1; CR20140588A; AU2013282395C1; EP2867245A2

Abstract

COMPOSIÇÃO E FORMULAÇÃO COMPREENDENDO IDURONATO-2-SULFATASE (I2S) RECOMBINANTE PURIFICADA, SEU USO E MÉTODO. A presente invenção fornece, entre outras coisas, métodos aperfeiçoados para purificar proteína I2S produzida recombinantemente para terapia de reposição de enzima. A presente invenção é, em parte, baseada na descoberta surpreendente que a proteína I2S recombinante pode ser purificada de materiais biológicos não processados, tal como, meio de cultura de célula contendo I2S usando um processo envolvendo tão pouco quanto quatro colunas de cromatografia.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/666.733, depositado em 29 de junho de 2012; cuja totalidade é aqui incorporada por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente relatório descritivo faz referência a uma Listagem de Sequências apresentada em formato eletrônico como um arquivo ASCII.txt chamado "2006685-0342_SEQ_LIST" em 27 de junho de 2013. O arquivo .txt foi gerado em 25 de junho de 2013 e é de 15 KB em tamanho. A totalidade do conteúdo da Listagem de Sequências está aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES

[0003] Mucopolissacaridose tipo II (MPS II, síndrome de Hunter) é uma doença de armazenamento lisossômico recessiva ligada ao cromossomo X que resulta em uma deficiência na enzima iduronato-2- sulfatase (I2S). I2S cliva as frações de terminal 2-O-sulfato de glicosaminoglicanos (GAG) dermatan sulfato e heparan sulfato. Devido à falta da enzima I2S ou defeituosa em pacientes com síndrome de Hunter, GAG se acumulam progressivamente nos lisossomos de uma variedade de tipos de células, causando congestão celular, organomegalia, destruição dos tecidos e disfunção orgânica.

[0004] Em geral, as manifestações físicas para pessoas com síndrome de Hunter incluem sintomas somáticos e neuronais. Por exemplo, em alguns casos de síndrome de Hunter, o envolvimento do sistema nervoso central leva a atrasos e problemas de desenvolvimento do sistema nervoso. Embora os sintomas não neuronais de Síndrome de Hunter sejam geralmente ausentes no momento do nascimento, ao longo do tempo a acumulação progressiva de GAG nas células do corpo pode ter um impacto dramático nos tecidos periféricos do corpo. O acúmulo de GAG no tecido periférico leva a uma aspereza distintiva nas características faciais de um paciente e é responsável pela testa proeminente, canal nasal achatado e língua alargada, as características definidoras de um paciente Hunter. Da mesma forma, o acúmulo de GAG pode afetar adversamente os sistemas de órgãos do corpo. Manifestando-se inicialmente como um espessamento da parede do coração, os pulmões e vias respiratórias, e o alargamento anormal do fígado, baço e rins, estas alterações profundas em última instância podem conduzir à falha catastrófica generalizada de órgãos. Como resultado, a síndrome de Hunter é sempre grave, progressiva, e ameaçadora à vida.

[0005] A terapia de reposição de enzima (ERT) é uma terapia aprovada para o tratamento da síndrome de Hunter (MPS II), que envolve a administração exógena da enzima I2S em substituição aos pacientes com síndrome de Hunter. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção proporciona, entre outras coisas, métodos melhorados para a purificação de proteínas I2S produzidas de forma recombinante para a terapia de reposição enzimática. A presente invenção é, em parte, baseada na surpreendente descoberta de que a proteína I2S recombinante pode ser purificada a partir de materiais biológicos não processados, como, meio de cultura de células contendo I2S, utilizando um processo que envolve apenas quatro colunas de cromatografia. Processo de purificação existente aprovado de I2S recombinante para terapia de reposição enzimática envolve 6 colunas de cromatografia. Como descrito na seção de Exemplos, as proteínas recombinantes I2S purificadas utilizando um processo de quatro colunas de acordo com a invenção está de acordo com os requisitos de pureza para a comercialização nos EUA e muitos outros países. Além disso, a enzima I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção mantém a alta percentagem de Cα-formilglicina (FGly) (por exemplo, maior do que 70% e até 100%), o que é importante para a atividade da enzima I2S, e características distintas, como o teor de ácido siálico e mapa de glicano que pode facilitar a biodisponibilidade e/ou de direcionamento lisossomal da proteína recombinante I2S. Portanto, a presente invenção fornece um processo eficaz, econômico e mais rápido para a purificação de proteína I2S recombinante. A presente invenção é particularmente útil para a purificação de proteína I2S recombinante produzida em meio isento de soro.

[0007] Assim, em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de purificação da proteína I2S recombinante a partir de uma preparação impura utilizando um processo com base em um ou mais de cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca de cátions, cromatografia de modo misto, e cromatografia de interação hidrofóbica. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção envolve menos do que 6 (por exemplo, menos do que 5, menos do que 4, ou menos do que 3) etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção envolve 2, 3, 4 ou 5 etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção envolve 4 etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, a proteína recombinante purificada I2S de acordo com a presente invenção contém menos do que 100 ng/mg de proteína celular hospedeira (HCP) (por exemplo, menos do que 90 ng/mg de HCP, menos do que 80 ng/mg de HCP, menos do que 70 ng/mg de HCP, menos do que 60 ng/mg de HCP, menos do que 50 ng/mg de HCP, menos do que 40 ng/mg de HCP, menos do que 30 ng/mg de HCP, menos do que 20 ng/mg de HCP, menos do que 10 ng/mg HCP).

[0008] Em algumas modalidades, uma cromatografia de troca aniônica adequada é a cromatografia Q. Em algumas modalidades, uma cromatografia de troca catiônica apropriada é a cromatografia de SP. Em algumas modalidades, uma cromatografia de modo misto adequada é a cromatografia por hidroxiapatita (HA). Em algumas modalidades, uma cromatografia de interação hidrofóbica adequada é a cromatografia de fenil.

[0009] Considera-se que a cromatografia de troca aniônica (por exemplo, coluna O), cromatografia de troca de cátions (por exemplo, coluna SP), cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA), e cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, coluna de fenil) podem ser realizadas em qualquer ordem. Em algumas modalidades, um método de acordo com a presente invenção realiza cromatografia de troca aniônica (por exemplo, coluna O), cromatografia de troca de cátions (por exemplo, coluna SP), cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA), e cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, coluna de fenil) nesta ordem.

[0010] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato de intermediário ou de fluxo é ajustada para pH de cerca de 5,07,0 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0) e a condutividade de cerca de 10-20 mS/cm (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 mS/cm) antes do carregamento para a coluna de cromatografia de troca aniônica (por exemplo, coluna Q). Em algumas modalidades, o pH é ajustado usando acetato de sódio 1M. Em algumas modalidades, a condutividade é ajustada utilizando cloreto de sódio 5M. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de troca aniônica, uma vez carregada, é lavada usando um tampão de lavagem que compreende sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 140 mM a 200 mM (por exemplo, cerca de 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM, ou 200 mm) com pH de cerca de 5,0-7,0 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de troca aniônica é eluída usando um tampão de eluição que compreende um gradiente de sal linear (por exemplo, NaCl). Em algumas modalidades, um gradiente de NaCl linear adequado contém uma faixa de cerca de 0-500 mM de NaCl (por exemplo, cerca de 0-400 mM, cerca de 0-350 mm, cerca de 0-300 mM, cerca de 50-500 mM, cerca de 150-500 mM, cerca de 150-450 mM, cerca de 150-400 mM).

[0011] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada para a condutividade variando entre cerca de 1 mS/cm e 20 mS/cm (por exemplo, entre cerca de 1 mS/cm e 15 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 10 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 8 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 6 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 4 mS/cm, entre cerca de 2 mS/cm e 4 mS/cm) antes de carregar para a coluna de cromatografia de troca catiônica (por exemplo, coluna SP). Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada para a condutividade variando entre n de cerca de 2 mS/cm e 4 mS/cm (por exemplo, 2, 2,5, 3, 3,5, ou 4 mS/cm) antes de carregar para a coluna de cromatografia de troca catiônica (por exemplo, coluna SP). Em algumas modalidades, a condutividade é ajustada por diluição do eluato da coluna de cromatografia de troca aniônica com H2O em proporção de cerca de 1-2:1 (por exemplo, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, ou 2:1). Em algumas modalidades, a condutividade é ajustada por dialfiltração. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de troca catiônica é realizada a um pH de cerca de 5,06,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0 ou 6,5). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de troca catiônica é executada com um tampão de fosfato que compreende (por exemplo, NaPO4) em concentração variando desde cerca de 0,01 M a cerca de 0,1 M (por exemplo, cerca de 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, ou 0,1 M). Em algumas modalidades, um valor de pH adequado é de cerca de 5,0-6,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, ou 6,5).

[0012] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou por fluxo é ajustada para fosfato (por exemplo, NaPO4) em concentração que varia entre cerca de 0,001 M a cerca de 0,01 M (por exemplo, cerca de 0,001 M, 0,002 M, 0,003 M, 0,004 M, 0,005 M, 0,006 M, 0,007 M, 0,008 M, 0,009 M, ou 0,01 M) e o pH de cerca de 5,0-6,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, ou 6,5) antes de carregar para a coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA), uma vez carregada, é lavada com um tampão de lavagem contendo fosfato (por exemplo, 1-10 mM de sódio ou fosfato de potássio) a pH neutro ou próximo. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de modo misto carregado (por exemplo, coluna HA) é lavada com um tampão de lavagem que tem uma concentração de fosfato que varia entre cerca de 10-20 mM (por exemplo, cerca de 10-18 mM, 10-16 mM, 10-15 mM, 12-20 mM, 14 -18 mM, 14-16 mM). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de modo misto carregada (por exemplo, coluna HA) é lavada com um tampão de lavagem que tem um concentração de fosfato superior a 10 ou mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM. Em algumas modalidades, a eluição de uma coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA) é conseguida com um gradiente de tampão de fosfato. Em algumas modalidades, um tampão de eluição adequado pode ter um gradiente de fosfato de cerca de 1-400 mM (por exemplo, 1-300 mM, 1-200 mM, 1-150 mM, 1-100 mM, 10-350 mM, 10-300 mM, 10-250 mM, 10-200 mM, 10-150 mM, 10- 140 mM, 10-130 mM, 10-120 mM, 10-110 mM, 10-100 mM, 10-90 mM, 10-80 mM, 10-70 mM, 10-60 mM, 10-50 mM) fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Em algumas modalidades, a eluição de uma coluna HA é conseguida por aumento gradual da concentração de fosfato no tampão de eluição. Em algumas modalidades, os tampões de eluição por etapas podem ter um fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em concentração selecionada a partir de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mm, 120 mm, 130 mm, 140 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM. Em algumas modalidades, a eluição de uma coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA) é obtida através de um tampão de eluição tendo um fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em concentração variando desde cerca de 50 mM a 150 mM (por exemplo, selecionado de entre o fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em concentração de 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, e combinação dos mesmos).

[0013] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada ao sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 0,5 M a cerca de 2,0 M (por exemplo, cerca de 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M ou 2,0 M de NaCl) a um pH de cerca de 4,5-6,0 (por exemplo, cerca de 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0) antes de carregar na coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, coluna de fenil). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de interação hidrofóbica, uma vez carregada, é lavada usando um tampão de lavagem que compreende o sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 0,5 M a 2,0 M (por exemplo, cerca de 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M ou 2,0 M de NaCl) a um pH de cerca de 4,5-6,0 (por exemplo, cerca de 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de interação hidrofóbica é eluída utilizando um tampão de eluição que compreende o sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M (por exemplo, cerca de 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, ou 0,5 M de NaCl) a um pH de cerca de 4,5-6,0 (por exemplo, cerca de 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0).

[0014] Em algumas modalidades, cada coluna de cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de modo misto, e cromatografia de interação hidrofóbica tem uma altura que varia de 14-25 cm (por exemplo, 15-25 cm, 15-20 cm, 14-24 cm, 14-22 cm, 14-20 cm, ou 16-18 cm). Em algumas modalidades, cada uma de coluna de cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de modo misto, e cromatografia de interação hidrofóbica tem uma altura de aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 cm.

[0015] Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção inclui uma etapa de inativação viral antes de carregar a preparação impura sobre a primeira coluna de cromatografia. Em algumas modalidades, a etapa de inativação viral inclui a adição de um detergente para a preparação impura. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a invenção inclui ainda uma etapa de remoção de vírus após a última cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, um método da invenção inclui ainda uma etapa de ultrafiltração e/ou dialfiltração. Em algumas modalidades, a etapa de ultrafiltração e/ou dialfiltração inclui trocar a proteína I2S recombinante purificada em um tampão de formulação de fármaco.

[0016] Em algumas modalidades, a presente invenção é usada para purificar uma proteína I2S recombinante tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 50% (por exemplo, pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) idêntica com a SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a presente invenção é usada para purificar uma proteína I2S recombinante possuindo uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO:1.

[0017] Em algumas modalidades, a presente invenção é usada para purificar uma proteína I2S recombinante produzida por células de mamíferos em cultura em suspensão em meio isento de soro. Em algumas modalidades, um meio isento de soro adequado para a presente invenção carece de componentes de origem animal. Em algumas modalidades, um meio isento de soro adequado para a presente invenção é um meio quimicamente definido. Em algumas modalidades, as células de mamífero são cultivadas em um biorreator. Em algumas modalidades, as células de mamífero coexpressam a proteína recombinante I2S e enzima geradora formilglicina (FGE). Em algumas modalidades, as células de mamíferos são as células humanas.

[0018] Em algumas modalidades, uma preparação impura usado em um método da invenção é preparada a partir do meio isento de soro contendo proteína I2S recombinante secretada a partir de células de mamíferos. Em algumas modalidades, uma preparação impura usada em um método da invenção é descongelada a partir de uma preparação de meio congelado.

[0019] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção contém, em média, 1622 (por exemplo, 16-21, 16-20, 16-19, 17-22, 17-21, 17-20, 17-19) ácidos siálicos por molécula. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção contém, em média, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 ácidos s por molécula.

[0020] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%), em conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO:1) para Cα- formilglicina (FGly). Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção tem substancialmente 100% de conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO:1) de Cα- formilglicina (FGly). Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção possui uma atividade específica de pelo menos 20 U/mg, 30 U/mg, 40 U/mg, 50 U/mg, 60 U/mg, 70 U/mg; 80 U/mg, 90 U/mg, ou 100 U/mg, conforme determinado por um ensaio de atividade de liberação de sulfato in vitro utilizando dissacarídeo de heparina como substrato.

[0021] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção caracteriza-se com a absorção celular de mais do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, como determinado por ensaio de absorção in vitro.

[0022] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção é caracterizada com um mapa de glicano compreendendo sete grupos de picos indicativos de proteína I2S neutra (grupo de pico 1), mono-sialiladas (grupo de pico 2), di-sialiladas (grupo de pico 3), monofosforilada (grupo de pico 4), tri- sialilado (grupo de pico 5), tetra-sializada (grupo de pico 6), e difosforilada (grupo de pico 7), respectivamente. Em algumas modalidades, o mapa de glicano é gerado após uma digestão com neuraminidase. Em outras modalidades, o mapa de glicano é gerado após uma digestão com fosfatase alcalina.

[0023] Entre outras coisas, a presente invenção proporciona proteína I2S recombinante purificada, como aqui descrito, e as composições farmacêuticas ou formulação que contém a mesma. Em algumas modalidades, uma formulação é formulada para administração intravenosa, subcutânea e/ou a administração intratecal. A presente invenção também fornece métodos de tratamento de síndrome de Hunter, por administração a um sujeito em necessidade de tratamento, de uma composição farmacêutica de I2S recombinante purificada ou formulação que contém a mesma.

[0024] Como aqui utilizados, os termos "proteína I2S," "I2S," "enzima I2S," ou equivalentes gramaticais, referem-se a uma preparação de moléculas de proteínas recombinantes I2S, a menos que de outro modo especificamente indicado.

[0025] Como utilizado neste pedido, os termos "cerca de" e "aproximadamente", são usados como equivalentes. Quaisquer números utilizados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente destinam-se a cobrir quaisquer variações normais apreciadas por uma pessoa com conhecimentos correntes da técnica relevante.

[0026] Outras características, objetos e vantagens da presente invenção são evidentes na descrição detalhada que se segue. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada, enquanto indicando modalidades da presente invenção, é dada a título de ilustração apenas, e não de limitação. Várias alterações e modificações dentro do escopo da invenção se tornarão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

[0027] As figuras descritas abaixo, que, juntas, compõem o desenho, são apenas para fins ilustrativos, e não para limitação.

[0028] A Figura 1 descreve um esquema de purificação exemplificativo para I2S recombinante produzida em meio isento de soro.

[0029] A Figura 2 ilustra um exemplar de mapas de peptídeos de I2S recombinante purificada de AF, em comparação com uma I2S de referência.

[0030] A Figura 3 representa uma análise exemplar de SDS-PAGE (Silver) de I2S recombinante purificada de AF.

[0031] A Figura 4 representa uma análise do perfil de carga exemplar de I2S recombinante purificada de AF avaliada por cromatografia de troca iônica.

[0032] A Figura 5 ilustra os perfis de glicano mapa exemplares de I2S recombinante purificada de AF.

[0033] A Figura 6 representa uma análise exemplar da atividade (U/mg), após uma etapa UPB de inativação viral de uma colheita clarificada de I2S recombinante.

[0034] A Figura 7 representa uma análise exemplar de SEC-HPLC após uma etapa UPB de inativação viral de uma colheita clarificada de I2S recombinante.

[0035] A Figura 8 representa SDS-PAGE exemplar tratada com mancha de prata de proteína I2S recombinante purificada.

[0036] A Figura 9 mostra um mapa de peptídeos exemplar para uma enzima I2S recombinante purificada produzida a partir da linhagem celular I2S-AF 2D cultivada sob condições de cultura isenta de soro (painel superior), em comparação com uma referência.

[0037] A Figura 10 representa perfis de glicano exemplares gerados por enzimas I2S recombinantes purificadas produzidas usando as linhagens celulares I2S-AF 2D e 4D cultivadas sob condições de cultura celular isenta de soro, em comparação com uma referência.

[0038] A Figura 11 representa um perfil de carga exemplar gerado por enzima I2S recombinante purificada produzida utilizando a linhagem celular I2S-AF 2D cultivada sob condições de cultura celular isenta de soro, em comparação com um controle I2S de referência.

DEFINIÇÕES

[0039] Para que a presente invenção seja mais facilmente compreendida, certos termos são definidos abaixo primeiro. Definições adicionais para os seguintes termos e outros termos são estabelecidas ao longo do relatório descritivo.

[0040] Aproximadamente ou cerca de: Como aqui utilizado, o termo "aproximadamente" ou "cerca de," como é aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor que é semelhante a um valor de referência determinado. Em certas modalidades, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" refere-se a uma faixa de valores que caem dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos, em ambas as direções (superior ou inferior) do referido valor de referência, a menos que indicado de outra forma ou de outra forma evidente a partir do contexto (exceto se tal número seria superior a 100% de um valor possível).

[0041] Biologicamente ativa: Como aqui utilizada, a frase "biologicamente ativa" refere-se a uma característica de qualquer substância que tem atividade em um sistema biológico (por exemplo, cultura de células, órgão, etc.). Por exemplo, uma substância que, quando administrada a um organismo, tem um efeito biológico sobre esse organismo, é considerada como sendo biologicamente ativa. A atividade biológica também pode ser determinada por ensaios in vitro (por exemplo, ensaios enzimáticos in vitro como ensaios de liberação de sulfato). Em modalidades particulares, em que uma proteína ou polipeptídeo é biologicamente ativo, uma porção da referida proteína ou polipeptídeo que partilha pelo menos uma atividade biológica da proteína ou polipeptídeo é tipicamente referida como uma porção "biologicamente ativa". Em algumas modalidades, uma proteína é produzida e/ou purificada a partir de um sistema de cultura celular, que exibe atividade biológica quando administrada a um sujeito. Em algumas modalidades, uma proteína requer processamento adicional, a fim de se tornar ativa biologicamente. Em algumas modalidades, uma proteína requer a modificação pós-tradução, como, entre outras, glicosilação (por exemplo, sialiação), farnisilação, clivagem, dobra, conversão em formilglicina e combinações dos mesmos, a fim de se tornar ativa biologicamente. Em algumas modalidades, uma proteína produzida como proforma (isto é, forma imatura), pode necessitar modificação adicional para se tornarem biologicamente ativas.

[0042] Receptor de manose-6-fosfato independente de cátions (CI- MPR): Como aqui utilizado, o termo "receptor de manose-6-fosfato independente de cátions (CI-MPR)" refere-se a um receptor celular que se liga a tags de manose-6 fosfato (M6P) em precursores de hidrolases ácidas no aparelho de Golgi que são destinadas para o transporte para o lisossoma. Além de manose-6-fosfato, CI-MPR também se liga a outras proteínas, incluindo o IGF-II. O CI-MPR é também conhecido como "receptor de M6P/IGF-II", "receptor de CI-MPR/IGF-II", "receptor do IGF-II" ou "receptor de IGF2." Estes termos e as abreviaturas dos mesmos são aqui utilizados indiferentemente.

[0043] Cromatografia: Como aqui utilizado, o termo "cromatografia" refere-se a uma técnica para a separação de misturas. Tipicamente, a mistura é dissolvida em um fluido chamado "fase móvel", o que a leva através de uma estrutura de um outro material que prende a chamada "fase estacionária." A cromatografia de coluna é uma técnica de separação em que o leito estacionário está dentro de um tubo, isto é, da coluna.

[0044] Diluente: Como aqui utilizado, o termo "diluente" refere-se a um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um ser humano) diluindo substância útil para a preparação de uma formulação reconstituída. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução de pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[0045] Eluição: Como aqui utilizado, o termo "eluição" refere-se ao processo de extração de um material de outro por lavagem com um solvente. Por exemplo, na cromatografia de troca iônica, a eluição é um processo para lavar as resinas carregadas para remover os íons capturados.

[0046] Eluato: Como aqui utilizado, o termo "eluato" refere-se a uma combinação de fase móvel "carreadora" e a substância a analisar que emergem a partir da cromatografia, tipicamente como resultado da eluição.

[0047] Terapia de substituição de enzima (ERT): Como aqui utilizado, o termo "terapia de reposição de enzimas (ERT)" refere-se a qualquer estratégia terapêutica que corrige uma deficiência enzimática, proporcionando a enzima em falta. Uma vez administrada, a enzima é absorvida pelas células e transportada para o lisossoma, onde a enzima atua para eliminar o material que tenha acumulado nos lisossomas devido à deficiência da enzima. Tipicamente, para a terapia de reposição de enzimas do lisossoma ser eficaz, a enzima terapêutica para os lisossomas é liberada nas células apropriadas em tecidos alvo, onde o defeito de armazenamento é manifesto.

[0048] Equilibrar ou Equilíbrio: Como aqui utilizados, os termos "equilibrar" ou "equilíbrio" em relação à cromatografia referem-se ao processo de colocar um primeiro líquido (por exemplo, tampão) em equilíbrio com o outro, geralmente para alcançar uma distribuição estável e igual dos componentes do líquido (por exemplo, tampão). Por exemplo, em algumas modalidades, uma coluna cromatográfica pode ser equilibrada por passagem de um ou mais volumes de coluna de um líquido desejado (por exemplo, tampão) através da coluna.

[0049] Melhorar, aumentar ou reduzir: Como aqui utilizados, os termos "melhorar", "aumentar" ou "reduzir", ou seus equivalentes gramaticais, indicam que os valores são relativos a uma medição de linha de base, como uma medição no mesmo indivíduo, antes do início do tratamento aqui descrito, ou uma medição em um indivíduo de controle (ou múltiplo indivíduos de controle), na ausência do tratamento aqui descrito. Um "indivíduo de controle" é um indivíduo que sofre com a mesma forma de doença de armazenamento lisossomal que o indivíduo a ser tratado, que tem aproximadamente a mesma idade que o indivíduo a ser tratado (para que as diferentes fases da doença no indivíduo e controle tratados individuais sejam comparáveis).

[0050] Impurezas: Como aqui utilizado, o termo "impurezas" refere- se a substâncias de uma quantidade confinada de líquido, gás, ou sólido, que diferem a partir da composição química do material ou composto alvo. As impurezas são também denominadas como contaminantes.

[0051] Ligante: Como aqui utilizado, o termo "ligante" refere-se, em uma proteína de fusão, a uma sequência de aminoácidos diferente da que é mostrada em uma posição em particular na proteína natural e é geralmente concebida para ser flexível ou interpor uma estrutura, como de uma a-hélice, entre duas porções de proteína. Um ligante é também denominado como um espaçador.

[0052] Carga: Como aqui utilizado, o termo "carga" refere-se, na cromatografia, a adição de um líquido contendo a amostra ou sólido a uma coluna. Em algumas modalidades, os componentes particulares da amostra carregada na coluna são então capturados conforme a amostra carregada passa através da coluna. Em algumas modalidades, os componentes particulares da amostra carregada na coluna não são capturados por, ou "fluem", a coluna conforme a amostra carregada passa através da coluna.

[0053] Polipeptídeo: Como aqui utilizado, um "polipeptídeo", de um modo geral, é uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos ligados um ao outro por uma ligação peptídica. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode incluir pelo menos 3-5 aminoácidos, cada um dos quais está ligado a outros por meio de pelo menos uma ligação peptídica. Os especialistas na técnica apreciarão que por vezes incluem "polipeptídeos não naturais" de aminoácidos ou outras entidades que, no entanto, são capazes de se integrar a uma cadeia de polipeptídeo, opcionalmente.

[0054] Pool: Como aqui utilizado, o termo "pool" em relação à cromatografia refere-se à combinação de uma ou mais frações de fluido que passaram através de uma coluna juntos. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais frações que contêm um componente desejado de uma amostra que foi separado por cromatografia (por exemplo, "frações de pico") podem ser "agrupados" em conjunto geram uma única fração de "pool".

[0055] Enzima de reposição: Como aqui utilizado, o termo "enzima de reposição" refere-se a qualquer enzima que pode atuar para substituir, pelo menos em parte, a enzima deficiente ou em falta em uma doença a ser tratada. Em algumas modalidades, o termo "enzima de reposição" refere-se a qualquer enzima que pode atuar para substituir, pelo menos em parte, a enzima lisossomal deficiente ou em falta em uma doença de armazenamento lisossomal a ser tratada. Em algumas modalidades, uma enzima de reposição é capaz de reduzir os materiais acumulados nos lisossomas ou de mamífero que podem resgatar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossomal. Enzimas adequadas para a substituição da invenção incluem tanto enzimas lisossomais de tipo selvagem quanto modificadas e podem ser produzidas utilizando métodos sintéticos e recombinantes ou purificadas a partir de fontes naturais. Uma enzima de reposição pode ser uma enzima sintética, natural ativada por gene ou recombinante.

[0056] Solúvel: Como aqui utilizado, o termo "solúvel" refere-se à capacidade de um agente terapêutico para formar uma solução homogênea. Em algumas modalidades, a solubilidade do agente terapêutico na solução em que é administrada e pela qual ele é transportado para o local de ação alvo é suficiente para permitir a liberação de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente terapêutico para o sítio alvo de ação. Vários fatores podem influenciar a solubilidade dos agentes terapêuticos. Por exemplo, os fatores relevantes que podem ter impacto na solubilidade de proteínas incluem a força iônica, sequência de aminoácidos e a presença de outros agentes de cossolubilização ou sais (por exemplo, sais de cálcio). Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção são solúveis na sua composição farmacêutica correspondente.

[0057] Estabilidade: Como aqui utilizado, o termo "estável" refere- se à capacidade do agente terapêutico (por exemplo, uma enzima recombinante) para manter a sua eficácia terapêutica (por exemplo, a totalidade ou a maior parte da sua atividade biológica pretendida e/ou integridade físico-química) ao longo de períodos de tempo prolongados. A estabilidade de um agente terapêutico, e a capacidade de a composição farmacêutica em manter a estabilidade de um dito agente terapêutico pode ser avaliada ao longo de períodos de tempo prolongados (por exemplo, durante, pelo menos, 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses ou mais). No contexto de uma formulação, uma formulação estável é aquela em que o agente terapêutico retém nesta essencialmente a sua integridade física e/ou química e atividade biológica durante o armazenamento e durante os processos (como congelamento/descongelamento, mistura mecânica e liofilização). Para a estabilidade da proteína, esta pode ser medida através da formação de agregados de elevado peso molecular (HMW), perda de atividade enzimática, geração de fragmentos peptídicos e deslocamento dos perfis de carga.

[0058] Processamento viral: Como aqui utilizado, o termo "processamento viral" refere-se a "remoção viral", em que os vírus são simplesmente removidos da amostra, ou "inativação viral", em que os vírus permanecem em uma amostra, mas em uma forma não infecciosa. Em algumas modalidades, a remoção de vírus pode utilizar nanofiltração e/ou técnicas cromatográficas, entre outras. Em algumas modalidades, a inativação viral podem utilizar inativação por solvente, inativação por detergente, a pasteurização, inativação em pH ácido, e/ou inativação por ultravioleta, entre outros.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0059] A presente invenção proporciona, entre outras coisas, um método melhorado para a purificação de proteína I2S recombinante para terapia de reposição enzimática à base de um processo que envolve menos de seis etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método de purificação da proteína I2S recombinante a partir de uma preparação impura utilizando um processo com base em um ou mais de cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de modo misto, e cromatografia de interação hidrofóbica. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método de purificação da proteína I2S recombinante a partir de uma preparação impura através da realização de cromatografia Q, cromatografia de hidroxiapatita (HA), cromatografia SP, e cromatografia de fenil. A presente invenção proporciona ainda proteína I2S recombinante purificada e método de utilização.

[0060] Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhe nas seguintes subseções. O uso de subseções não se destina a limitar a invenção. Cada subseção pode ser aplicada a qualquer aspecto da invenção. Neste pedido de patente, o uso de "ou" significa "e/ou" a menos que indicado de outra forma.

Proteína I2S recombinante

[0061] Como aqui utilizado, uma proteína I2S é qualquer proteína ou uma porção de uma proteína que pode substituir para, pelo menos, a atividade parcial de iduronato-2-sulfatase (I2S) ou proteína de resgate que ocorre naturalmente, um ou mais fenótipos ou sintomas associados com deficiência de I2S. Como aqui utilizado, os termos "uma enzima I2S" e "uma proteína I2S" e seus equivalentes gramaticais, são utilizados indiferentemente.

[0062] Tipicamente, a proteína I2S humana é produzida como uma forma precursora. A forma precursora de I2S humana contém um peptídeo de sinal (resíduos de aminoácidos 1-25 do precursor de comprimento completo), um pró-peptídeo (resíduos de aminoácidos 2633 do precursor de comprimento completo), e uma cadeia (resíduos 34550 do precursor de comprimento completo) que podem ser adicionalmente processadas em cadeia de 42 kDa (resíduos 34-455 do precursor de comprimento completo) e as cadeias de 14 kDa (resíduos 446-550 do precursor de comprimento completo). Tipicamente, a forma precursora é também referida como precursor de comprimento completo ou proteína I2S de comprimento completo, que contém 550 aminoácidos. As sequências de aminoácidos da forma madura (SEQ ID NO:1) tendo o peptídeo de sinal removido e precursor de comprimento completo (SEQ ID NO:2) de um tipo selvagem típica ou proteína I2S humano de ocorrência natural estão apresentados na Tabela 1. O peptídeo de sinal está sublinhado. Além disso, as sequências de aminoácidos da proteína precursora de isoforma a e b de I2S humana são também fornecidas na Tabela 1, SEQ ID NO:3 e 4, respectivamente. Tabela 1. Iduronato-2-sulfatase humana

[0063] Assim, em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é a proteína I2S humana madura (SEQ ID NO:1). Como aqui divulgado, SEQ ID NO:1 representa a sequência de aminoácidos para a proteína canônica I2S humana. Em algumas modalidades, a proteína I2S pode ser uma isoforma de splice e/ou a variante de SEQ ID NO:1, resultante da transcrição a partir de um sítio de início alternativo dentro do 5’ de UTR do gene I2S. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante pode ser um homólogo ou um análogo da proteína I2S humana madura. Por exemplo, um homólogo ou um análogo da proteína I2S humana madura pode ser uma proteína I2S humana madura modificada contendo uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos, em comparação com um tipo selvagem ou de ocorrência natural da proteína I2S (por exemplo, SEQ ID NO:1), mantendo uma atividade substancial de proteína I2S. Assim, em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente homóloga à proteína madura I2S humana (SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia com a SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente idêntica à proteína madura I2S humana (SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante contém um fragmento ou uma porção da proteína I2S humana madura.

[0064] Alternativamente, uma proteína I2S recombinante é proteína I2S de comprimento completo. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante pode ser um homólogo ou um análogo da proteína I2S de comprimento completo humana. Por exemplo, um homólogo ou um análogo da proteína de comprimento completo I2S humana pode ser uma proteína I2S humana modificada de comprimento completo, contendo uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em comparação com um tipo selvagem ou de ocorrência natural da I2S proteína de comprimento completo (por exemplo, SEQ ID NO:2), enquanto retendo a atividade substancial da proteína I2S. Assim, em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente homóloga à proteína I2S humana de comprimento completo (SEQ ID NO:2). Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia com a SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente idêntica à SEQ ID NO:2. Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante contém um fragmento ou uma porção da proteína I2S humana de comprimento completo. Como aqui utilizado, uma proteína de comprimento completo I2S tipicamente contém sequência do peptídeo de sinal.

[0065] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é isoforma a de proteína I2S humana. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante pode ser um homólogo ou um análogo de isoforma a de proteína I2S humana. Por exemplo, um homólogo ou um análogo de isoforma a de proteína I2S humana pode ser uma isoforma humana, modificada, de proteína I2S contendo uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos, em comparação com um tipo selvagem ou de ocorrência natural da isoforma a da proteína I2S humana (por exemplo, SEQ ID NO:3), enquanto retendo a atividade substancial da proteína I2S. Assim, em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente homóloga à isoforma a de proteína I2S humana (SEQ ID NO:3). Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia com a SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente idêntica à SEQ ID NO:3. Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante contém um fragmento ou uma porção de isoforma a da proteína I2S humana. Como aqui utilizado, uma isoforma a da proteína I2S humana, tipicamente, contém uma sequência de peptídeo de sinal.

[0066] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é isoforma b de proteína I2S humana. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante pode ser um homólogo ou seu análogo da isoforma b de proteína I2S humana. Por exemplo, um homólogo ou um análogo da isoforma b de proteína I2S humana pode ser uma isoforma b de proteína I2S humana contendo uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos, modificada em comparação com um tipo selvagem ou de ocorrência natural da isoforma b da proteína I2S humana (por exemplo, SEQ ID NO:4), enquanto retendo a atividade substancial proteína I2S. Assim, em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente homóloga à isoforma b da proteína I2S humana (SEQ ID NO:4). Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia com a SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é substancialmente idêntica à SEQ ID NO:4. Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante contém um fragmento ou uma porção de isoforma b de proteína I2S humana. Como aqui utilizado, uma isoforma b de proteína I2S humana contém, tipicamente, uma sequência de peptídeo de sinal.

[0067] Os homólogos ou análogos de proteínas I2S humanas podem ser preparados de acordo com métodos para alterar a sequência do polipeptídeo conhecido dos especialistas na técnica, como são encontrados nas referências que compilam esses métodos. Em algumas modalidades, as substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre os aminoácidos, dentro dos seguintes grupos:(a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (f) Q, N; e (g) E, D. Em algumas modalidades, uma "substituição de aminoácidos conservativa" refere-se a uma substituição de um aminoácido que não altera as características de carga ou tamanho relativos da proteína em que a substituição de aminoácido é feita.

[0068] Em algumas modalidades, as proteínas I2S recombinantes podem incluir uma porção que se liga a um receptor na superfície das células-alvo para facilitar a absorção e/ou de direcionamento lisossomal celular. Por exemplo, um dito receptor pode ser o receptor de manose- 6-fosfato independente de cátions (CI-MPR) que se liga aos resíduos de manose-6-fosfato (M6P). Além disso, a CI-MPR também se liga a outras proteínas, incluindo o IGF-II. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante contém os resíduos de M6P sobre a superfície da proteína. Em particular, uma proteína I2S recombinante pode conter oligossacarídeos bis-fosforilados que possuem uma maior afinidade de ligação para a CI-MPR. Em algumas modalidades, uma enzima adequada pode conter até cerca de uma média de cerca de, pelo menos, 20% de oligossacarídeos bis-fosforilados por enzima. Em outras modalidades, uma enzima adequada pode conter cerca de 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% de oligossacarídeos bis-fosforilados por enzima.

[0069] Em algumas modalidades, as enzimas I2S recombinantes podem ser fundidas com uma porção de direcionamento lisossomal, que é capaz de se ligar a um receptor na superfície das células alvo. Uma porção de direcionamento lisossomal adequado pode ser o IGF-I, IGF- II, RAP, p97, e variantes, homólogos ou seus fragmentos (por exemplo, incluindo os peptídeos possuindo uma sequência de, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, ou 95% idêntica a uma de tipo selvagem de sequência humana madura de peptídeo IGF-I, IGF-II, RAP, p97). A porção de direcionamento lisossomal pode ser conjugada ou fundida com uma proteína ou enzima I2S na extremidade N-terminal, C-terminal ou internamente.

Produção de Proteínas I2S Recombinantes

[0070] A presente invenção pode ser utilizada para purificar uma proteína I2S recombinante produzida por vários meios. Por exemplo, uma proteína I2S pode ser produzida de forma recombinante, utilizando um sistema de células hospedeiras manipuladas para expressar um ácido nucleico que codifica a I2S. Alternativamente, uma proteína I2S pode ser produzida por ativação de um gene endógeno I2S.

[0071] É contemplado que a presente invenção pode ser utilizada para purificar uma proteína I2S recombinante produzida utilizando diversos sistemas de expressão. Os sistemas de expressão adequados incluem, por exemplo, ovo, baculovírus, plantas, leveduras, ou células de mamíferos.

[0072] Em algumas modalidades, enzimas I2S são produzidas em células de mamíferos. Exemplos não limitativos de células de mamífero que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem linhagem de mieloma de camundongos BALB/c (NSO/1, ECACC N.°:851 10503); retinoblastos humanos (PER.C6, Crucell, Leiden, Países Baixos); linhagem de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (HEK293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al, J. Gen. Virol, 36:59,1977); linhagem de células de fibrossarcoma humano (por exemplo, HT1080); células de rim de hamster bebê (BHK21 ATCC CCL 10); Células de ovário de hamster chinês +/- DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de Sertoli de camundongos (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251, 1980);. células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); Células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongos (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, Annals NY Acad Sci, 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

[0073] Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção são utilizados para purificar enzimas I2S recombinantes produzidas a partir de células humanas (por exemplo, HT1080). Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção são utilizados para purificar enzimas I2S recombinantes produzidas a partir de células CHO.

[0074] Tipicamente, as células que são modificadas para expressar I2S recombinante podem compreender um transgene que codifica uma proteína I2S recombinante aqui descrita. Deve notar-se que os ácidos nucleicos que codificam I2S recombinantes podem conter sequências reguladoras, sequências de controle de genes, promotores, sequências não codificadoras e/ou outras sequências apropriadas para a expressão das I2S recombinantes. Tipicamente, a região de codificação está operativamente ligada a um ou mais destes componentes de ácidos nucleicos.

[0075] "Sequências reguladoras" referem-se tipicamente a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências 5’ não codificadora), dentro ou a jusante (sequências 3' não codificadoras) de uma sequência codificadora, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA ou, ou a tradução da sequência codificadora associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder tradução, íntrons, e sequências de reconhecimento de poliadenilação. Às vezes, "sequências reguladoras" são também referidas como "sequências de controle do gene."

[0076] "Promotor" refere-se tipicamente a uma sequência de nucleotídeos capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou RNA funcional. Em geral, uma sequência de codificação está localizada em 3’ para uma sequência promotora. A sequência do promotor consiste em elementos a montante proximais e mais distais, os últimos elementos muitas vezes referidos como potencializadores. Por conseguinte, um "potencializador" é uma sequência de nucleotídeos que pode estimular a atividade do promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para realçar o nível ou especificidade de tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade a partir de um gene nativo, ou ser compostos por elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de nucleotídeos sintéticos. Deve ser compreendido pelos especialistas na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em tecidos ou tipos de células diferentes, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais.

[0077] "Sequências 3’ não codificadoras" normalmente referem-se às sequências nucleotídicas localizadas a jusante de uma sequência codificadora e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou a expressão do gene. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de extensões de ácido poliadenílico à extremidade 3’ do precursor de mRNA.

[0078] A "sequência líder de tradução" ou "sequências 5’ não codificadoras" tipicamente refere-se a uma sequência de nucleotídeos situada entre a sequência do promotor de um gene e a sequência de codificação. A sequência líder de tradução está presente nos mRNA totalmente processados a montante da sequência de iniciação da tradução. A sequência líder de tradução pode afetar o processamento do transcrito primário de mRNA, a estabilidade do mRNA ou a eficiência da tradução.

[0079] Tipicamente, o termo "operativamente ligada" ou "operativamente ligado" refere-se à associação de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo a que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação se for capaz de afetar a expressão daquela sequência de codificação (ou seja, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Sequências de codificação podem ser operativamente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[0080] A região de codificação de um transgene pode incluir uma ou mais mutações silenciosas para otimizar a utilização do códon para um tipo particular de células. Por exemplo, os códons de um transgene I2S podem ser otimizados para a expressão em uma célula de vertebrado. Em algumas modalidades, os códons de um transgene I2S podem ser otimizados para a expressão em uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, os códons de um transgene I2S podem ser otimizados para a expressão em uma célula humana.

[0081] Opcionalmente, uma construção pode conter componentes adicionais, como um ou mais dos seguintes: um local de splice, uma sequência potencializadora, um gene marcador selecionável sob o controle de um promotor adequado, um gene marcador amplificável, sob o controle de um promotor adequado e uma região de ligação à matriz (MAR) ou outro elemento conhecido na técnica que aumenta a expressão da região onde está inserido.

[0082] Uma vez transfectadas ou transduzidas nas células hospedeiras, um vetor adequado que pode expressar extracromossomicamente (epissoma) ou integrar no genoma da célula hospedeira.

Ativação de proteínas I2S recombinantes

[0083] Tipicamente, uma enzima I2S recombinante é ativada pela modificação pós-tradução de uma cisteína conservada (correspondente ao aminoácido 59 de I2S humana madura) para formilglicina, também conhecido como ácido 2-amino-3-oxopropiónico, ou oxo alanina. Tais modificações pós-tradução podem ser realizadas por uma enzima conhecida como Enzima Geradora de Formilglicina (FGE). Assim, em algumas modalidades, as enzimas I2S recombinantes são produzidas em células que expressam também a proteína FGE. Em modalidades particulares, as enzimas I2S recombinantes são produzidas em células que aumentaram ou melhoraram a expressão da proteína de FGE. Por exemplo, as células podem ser manipuladas para sobre expressar FGE em combinação com I2S recombinantes para facilitar a produção de preparações de I2S possuindo níveis elevados de enzima ativa. Em algumas modalidades, a sobre-expressão de FGE é conseguida pela expressão (por exemplo, a sobre-expressão) de uma FGE exógena utilizando tecnologia recombinante convencional. Em algumas modalidades, a sobre-expressão de FGE é conseguida por expressão ativada ou aumentada de uma FGE endógena por, por exemplo, ativação ou potencialização do promotor do gene FGE endógeno. Em alguns casos, o ácido nucleico que codifica I2S recombinante e um ácido nucleico que codifica proteína FGE recombinante são ligados por um ácido nucleico (por exemplo, uma sequência espaçadora) que possui uma sequência correspondente a um local de entrada ribossômica interna.

[0084] Qualquer FGE com capacidade para converter a cisteína em formilglicina pode ser utilizada na presente invenção. Sequências de ácido nucleico e de aminoácidos para as proteínas de FGE exemplificativas estão descritas em US 2004-0229250, todo o conteúdo relacionado com tais sequências e as sequências aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Deve notar-se que os ácidos nucleicos que codificam para FGE recombinante podem compreender sequências reguladoras, sequências de controle de genes, promotores, sequências não codificadoras e/ou outras sequências apropriadas para a expressão da FGE. Tipicamente, a região de codificação está operativamente ligada a um ou mais destes componentes de ácidos nucleicos.

Meio e Condição de Cultura Celular

[0085] Vários meios e condições de cultura de células podem ser usados para produzir uma proteína I2S recombinante. Por exemplo, uma proteína I2S recombinante pode ser produzida em meio contendo soro ou isento de soro. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é produzida em meio isento de soro. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é produzida em um meio isento de animais, ou seja, um meio que carece de componentes de origem animal. Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante é produzida em um meio quimicamente definido. Como aqui utilizado, o termo "meio nutriente quimicamente definido" refere-se a um meio em que substancialmente todos os componentes químicos são conhecidos. Em algumas modalidades, um meio nutriente definido quimicamente é livre de componentes de origem animal, como soro, proteínas derivadas do soro (por exemplo, albumina ou fetuína), e outros componentes. Em alguns casos, um meio quimicamente definido compreende uma ou mais proteínas (por exemplo, fatores de crescimento proteicos ou citocinas). Em alguns casos, um meio nutriente quimicamente definido compreende um ou mais hidrolisados de proteínas. Em outros casos, um meio nutriente quimicamente definido é um meio isento de proteína, isto é, um meio isento de soro que não contém proteínas, hidrolisados ou componentes de composição desconhecida.

[0086] Em algumas modalidades, um meio quimicamente definido, pode ser completado por um ou mais componentes de origem animal. Tais componentes derivados de animais incluem, entre outros, soro fetal de bezerro, soro de cavalo, soro de cabra, soro de burro, soro humano, e as proteínas derivadas do soro, como albuminas (por exemplo, albumina de soro bovino ou albumina do soro humano).

[0087] As várias condições de cultura de células podem ser usadas para produzir proteínas I2S recombinantes em grande escala, incluindo, entre outras, culturas em frascos giratórios, culturas em biorreator de lote e culturas de biorreator de batelada alimentada. Em algumas modalidades, a proteína I2S recombinante é produzida pelas células em cultura em suspensão. Em algumas modalidades, a proteína I2S recombinante é produzida por células aderentes.

[0088] As condições e meios de cultura de células e exemplificativos estão descritos nas seções Exemplos. Outros exemplos de métodos e composições para a produção de proteína I2S recombinante são descritos no pedido provisório intitulado "Methods and Compositions for Producing Recombinant Iduronate-2-Sulfatase" depositado juntamente na mesma data, a revelação completa do qual é aqui incorporada por referência.

Purificação de proteína I2S recombinante

[0089] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método de purificação da proteína I2S recombinante a partir de uma preparação impura utilizando um processo com base em um ou mais de cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de modo misto, e cromatografia de interação hidrofóbica. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção envolve menos do que 6 (por exemplo, menos do que 5, menos do que 4, ou menos do que 3) etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção envolve 2, 3, 4 ou 5 etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção envolve 4 etapas de cromatografia. Em algumas modalidades, um método da invenção de acordo com a presente invenção conduz a cromatografia de troca aniônica, cromatografia de modo misto, cromatografia de troca catiônica, e cromatografia de interação hidrofóbica nesta ordem.

Preparação Impura

[0090] Como aqui utilizado, uma preparação impura pode ser qualquer material biológico, incluindo o material biológico não processado que contém a proteína I2S recombinante. Por exemplo, uma preparação impura pode ser meio de cultura de células não processadas contendo proteína I2S recombinante secretada a partir das células (por exemplo, células de mamífero) que produz proteína I2S ou lisados celulares brutos, contendo a proteína I2S. Em algumas modalidades, uma preparação impura pode ser meio celular parcialmente processado ou lisados celulares. Por exemplo, o meio celular ou lisados de células podem ser concentrados, diluídos, tratados com inativação viral, processamento viral ou remoção viral. Em algumas modalidades, a remoção de vírus pode utilizar nanofiltração e/ou técnicas cromatográficas, entre outros. Em algumas modalidades, a inativação viral pode utilizar inativação por solvente, inativação por detergente, pasteurização, inativação em pH ácido, e/ou inativação em ultravioleta, entre outros. Meio celular ou de lisados de células também pode ser tratados com protease, DNases e/ou RNases para reduzir o nível de proteína da célula hospedeira e/ou ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA). Em algumas modalidades, materiais biológicos não processados ou parcialmente processados (por exemplo, meio de células ou lisado de células) podem ser congelados e armazenados em uma temperatura desejada (por exemplo, 2-8°C, -4°C, -25°C, -75°C) durante um período de tempo e em seguida descongelados para purificação. Como aqui utilizado, uma preparação impura é também referida como material de partida ou material de carga.

Cromatografia de troca aniônica

[0091] Em algumas modalidades, métodos previstos para purificar I2S recombinantes incluem a cromatografia de troca aniônica. Em breve, a cromatografia de troca aniônica é uma técnica cromatográfica que se baseia em interações de carga-carga entre um composto carregado negativamente e uma resina carregada positivamente. Em algumas modalidades, a cromatografia de troca aniônica é cromatografia de troca aniônica forte. Em algumas modalidades, a cromatografia de troca aniônica é utilizada como uma primeira etapa de purificação para uma proteína terapêutica (por exemplo, I2S recombinante).

[0092] Exemplos de resinas de troca aniônica incluem, entre outras, resinas de amina quaternária ou "resinas-Q" (por exemplo, Capto™-Q, Q-Sepharose®, QAE Sephadex®); resinas dietilaminoetano (DEAE) (por exemplo, DEAE-Trisacryl®, DEAE Sepharose®, DEAE benzoilada naftoilada, dietilaminoetil Sephacel®); resinas Amberjet®; resinas Amberlyst®; Resinas Amberlite® (por exemplo, Amberlite IRA-67, Amberlite® fortemente básica, Amberlite® fracamente básica), resina colestiramina, resinas ProPac® (por exemplo, ProPac® SAX-10, ProPac® WAX-10, ProPac® WCX-10); resinas TSK-GEL® (por exemplo, TSKgel DEAE-NPR; TSKgel DEAE-5PW); e resinas Acclaim®. Em certas modalidades, a resina de troca aniônica é uma resina Q.

[0093] As fases móveis típicas para a cromatografia de troca aniônica incluem soluções relativamente polares, como água, acetonitrila, álcoois orgânicos, como metanol, etanol, e isopropanol, ou soluções contendo ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES). Assim, em certas modalidades, a fase móvel inclui cerca de 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou cerca de 100% de solução polar. Em certas modalidades, a fase móvel compreende entre cerca de 1% a cerca de 100%, cerca de 5% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 90%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 30% a cerca de 70%, ou cerca de 40% a cerca de 60% de solução polar em qualquer momento durante o curso da separação.

[0094] De um modo geral, uma fase móvel inclui um sal. Por exemplo, um sal (por exemplo, cloreto de sódio) pode eluir uma proteína ligada a partir de uma coluna de troca aniônica (por exemplo, o contraíon é cloreto e é trocado para a proteína alvo, que é então liberada). Em algumas modalidades, a fase móvel compreende uma concentração de sal entre cerca de 0 a cerca de 1.0M, por exemplo, entre cerca de 0 e cerca de 0,8M, entre cerca de 0 e cerca de 0,6M, entre cerca de 0 a cerca de 0,5 M, entre cerca de 0 a cerca de 0,4 M, entre cerca de 0,05 M a cerca de 0,50 m, entre cerca de 0,10 M a cerca de 0,45 M, entre cerca de 0,10 M a cerca de 0,40 m, ou entre cerca de 0,15 a cerca de 0,40 m. Em algumas modalidades, a fase móvel compreende uma concentração de sal de cerca de 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 H, 0,5M, 0,6M, 0,7M, 0,8M, 0,9M ou 1,0M. Em algumas modalidades, a concentração de sal na fase móvel é um gradiente (por exemplo, gradiente linear ou não linear). Em algumas modalidades, a concentração de sal na fase móvel é constante. Em algumas modalidades, a concentração de sal na fase móvel pode aumentar ou diminuir em etapas.

[0095] Normalmente, a fase móvel é tamponada. Em certas modalidades, a fase móvel não é tamponada. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 14. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 10. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 7. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH de cerca de 6,5. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH de cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, ou 10.

[0096] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada para pH de cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 ou 7,5 e a condutividade de cerca de 2 mS/cm, 4 mS/cm, 6 mS/cm, 8 mS/cm, 10 mS/cm, 12 mS/cm, 14 mS/cm, 16 mS/cm, 18 mS/cm, ou 20 mS/cm, antes do carregamento, para a coluna de cromatografia de troca aniônica (coluna por exemplo, Q). O pH pode ser ajustado utilizando acetato de sódio (por exemplo, 1M) e a condutividade pode ser ajustada utilizando cloreto de sódio (por exemplo, 5M). Uma vez carregada, uma coluna de cromatografia de troca aniônica pode ser lavada com um tampão de lavagem que compreende o sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 140 mM a cerca de 200 mM (por exemplo, cerca de 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM, ou 200 mm) com pH de cerca de 5,07,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 ou 7,5). Uma coluna de cromatografia de troca aniônica pode ser eluída utilizando um tampão de eluição que compreende um gradiente linear de NaCl. Um exemplar de gradiente linear de NaCl adequado pode conter uma faixa de cerca de 0-500 mM de NaCl (por exemplo, cerca de 0-400 mM, cerca de 0350 mM, cerca de 0-300 mM, cerca de 50-500 mM, cerca de 150-500 mM, cerca de 150-450 mM, cerca de 150-400 mM).

Cromatografia de troca catiônica

[0097] Em algumas modalidades, métodos previstos para purificar I2S recombinantes incluem a cromatografia de troca catiônica. Em breve, a cromatografia de troca catiônica é uma técnica cromatográfica que se baseia em interações de carga-carga entre um composto carregada positivamente e uma resina carregada negativamente. Em algumas modalidades, a cromatografia de troca catiônica é a cromatografia de troca catiônica forte.

[0098] A cromatografia de troca de cátions é geralmente praticada com uma coluna forte ou fraca de troca de cátions, contendo um íon sulfônio, ou com um trocador de cátions fraco, tendo geralmente um grupo funcional carboximetil (CM) ou carboxilato (CX). Muitas resinas de troca catiônica adequadas são conhecidas na técnica e estão disponíveis comercialmente e incluem, entre outras SP-Sepharose®, CM-Sepharose®; resinas Amberjet®; resinas Amberlyst®; resinas Amberlite® (por exemplo, Amberlite® IRA120); resinas Propac® (por exemplo, ProPac® SCX-10, ProPac® WCX-10, ProPac® WCX-10); resinas TSK-GEL® (por exemplo, TSKgel BioAssist S; TSKgel SP-2SW, TSKgel SP-5PW; TSKgel SP-NPR; TSKgel SCX; TSKgel SP-STAT; TSKgel CM-5PW; TSKgel OApak-A; TSKgel CM-2SW, TSKgel CM- 3SW, e TSKgel CM-STAT); e resinas Acclaim®. Em certas modalidades, a resina de troca aniônica é uma resina SP-Sepharose®.

[0099] As fases móveis típicas para a cromatografia de troca catiônica incluem soluções relativamente polares, como água, acetonitrila, álcoois orgânicos, como metanol, etanol, e isopropanol, ou soluções contendo ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES). Assim, em certas modalidades, a fase móvel inclui cerca de 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou cerca de 100% de solução polar. Em certas modalidades, a fase móvel inclui entre cerca de 1% a cerca de 100%, cerca de 5% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 90%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 30% a cerca de 70%, ou cerca de 40% a cerca de 60% de solução polar em qualquer momento durante o curso da separação.

[0100] De um modo geral, uma fase móvel inclui um sal. Por exemplo, um sal (por exemplo, cloreto de sódio, fosfato de sódio, etc.) pode eluir uma proteína ligada a partir de uma coluna de troca catiônica (por exemplo, o contraíon é o sódio e é trocado para a proteína alvo, que é então liberada). Em algumas modalidades, a fase móvel compreende uma concentração de sal entre cerca de 0 a cerca de 1,0M, por exemplo, entre cerca de 0 e cerca de 0,8M, entre cerca de 0 e cerca de 0,6M, entre cerca de 0 a cerca de 0,5 M, entre cerca de 0 a cerca de 0,4 M, entre cerca de 0,05 M a cerca de 0,50 m, entre cerca de 0,10 M a cerca de 0,45 M, entre cerca de 0,10 M a cerca de 0,40 m, ou entre cerca de 0,15 a cerca de 0,40 m. Em algumas modalidades, a fase móvel compreende uma concentração de sal de cerca de 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M ou 1,0 M. Em algumas modalidades, a concentração de sal na fase móvel é um gradiente (por exemplo, gradiente linear ou não linear). Em algumas modalidades, a concentração de sal na fase móvel é constante. Em algumas modalidades, a concentração de sal na fase móvel pode aumentar ou diminuir por etapas.

[0101] Normalmente, a fase móvel é tamponada. Em certas modalidades, a fase móvel não é tamponada. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 14. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 10. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 7. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH de cerca de 6,5. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH de cerca de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, ou 10.

[0102] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada para a condutividade variando entre cerca de 1 mS/cm e 20 mS/cm (por exemplo, entre cerca de 1 mS/cm e 15 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 10 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 8 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 6 mS/cm, entre cerca de 1 mS/cm e 4 mS/cm, entre cerca de 2 mS/cm e 4 mS/cm) antes de o carregar para a coluna de cromatografia de troca catiônica (por exemplo, coluna SP). Em modalidades particulares, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada para a condutividade que varia entre cerca de n 2 mS/cm e 4 mS/cm (por exemplo, 2, 2,5, 3, 3,5, ou 4 mS/cm) antes de carregar para a coluna de cromatografia de troca catiônica (por exemplo, coluna SP). A condutividade pode ser ajustada por diluição de uma preparação impura ou um eluato intermediário ou por fluxo com H2O em proporção, por exemplo, de 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 4,0:1, 5,0:1, ou 10:1. A condutividade pode também ser ajustada por dialfiltração para um tampão desejado. Em algumas modalidades, uma coluna de cromatografia de troca catiônica é realizada a um pH de cerca de 5,0-6,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0 ou 6,5). Em algumas modalidades, uma coluna de cromatografia de troca catiônica é executada com um tampão de fosfato que compreende (por exemplo, NaPO4) em concentração variando desde cerca de 0,01 M a cerca de 0,1 M (por exemplo, cerca de 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, ou 0,1 M). Em algumas modalidades, um valor de pH adequado é de cerca de 5,0-6,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, ou 6,5).

Cromatografia de modo misto

[0103] A cromatografia em hidroxiapatita (HA) é considerada como sendo de "pseudoafinidade" ou cromatografia "de modo misto" de troca iônica e pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. A hidroxiapatita é uma forma única de fosfato de cálcio utilizada em fraccionamento e purificação de moléculas biológicas. Em alguns casos, hidroxiapatita cristalina pode ser usada, embora a fragilidade dos cristais pode limitar as taxas de fluxo e/ou longevidade da coluna. Dois tipos de hidroxiapatita cerâmica quimicamente pura, hidroxiapatita cerâmica CHT Tipos I e II são macroporosas, esféricas e podem ser utilizadas em altas taxas de fluxo e pressões. Tipo I geralmente tem uma capacidade de ligação elevada de proteínas, enquanto Tipo II geralmente tem uma baixa capacidade de ligação para as proteínas. Em geral, a fórmula de hidroxiapatita é Ca10(PO4)6(OH)2 (Kawasaki, et al 1985). Os grupos funcionais incluem pares de íons de cálcio cristal carregados positivamente (C-sítios) e aglomerados de seis átomos de oxigênio carregados negativamente associados com tripletos de fosfatos cristal (P-sítios). C-sítios, P-sítios e hidroxilas são distribuídos em um padrão fixo na superfície do cristal, geralmente levando a interações complexas com proteínas e outras moléculas.

[0104] Uma amostra pode ser carregada em uma coluna HA em tampão de fosfato de força iônica baixa (por exemplo, 1-10 mM de sódio ou fosfato de potássio) a pH neutro ou próximo. Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou por fluxo é ajustado para fosfato (por exemplo, NaPO4) em concentração que varia entre cerca de 0,001 M a cerca de 0,01 M (por exemplo, cerca de 0,001 M, 0,002 M, 0,003 M, 0,004 M, 0,005 M, 0,006 M, 0,007 M, 0,008 M, 0,009 M, ou 0,01 M) e o pH de cerca de 5,0-6,5 (por exemplo, cerca de 5,0, 5,5, 6,0, ou 6,5) antes de carregar na coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA). A coluna HA carregada é tipicamente lavada com um tampão de lavagem que tem uma concentração de fosfato comparável à do tampão de carga. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA), uma vez carregada, é lavada com um tampão de lavagem contendo fosfato (por exemplo, 1-10 mM de sódio ou fosfato de potássio) a pH neutro ou próximo. Por exemplo, um tampão de lavagem adequado pode ter uma concentração de fosfato de cerca de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ou 10 mM. Em algumas modalidades, pode ser desejável aumentar a quantidade de fosfato no tampão de lavagem para criar uma condição de lavagem mais rigorosa. É contemplado que os níveis de M6P, nomeadamente os níveis de di-M6P, na superfície de proteínas I2S são importantes para direcionamento lisossomal. O aumento da concentração de fosfato no tampão de lavagem pode reter seletivamente proteínas I2S com elevados níveis de M6P, em particular, di-M6P sobre a coluna HA. Assim, em algumas modalidades, um tampão de lavagem desejado, pode ter uma concentração de fosfato de ou superior a 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mm. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de modo misto carregada (por exemplo, coluna HA) é lavada com um tampão de lavagem que tem uma concentração de fosfato que varia entre cerca de 10-20 mM (por exemplo, cerca de 10-18 mM, 10-16 mM, 10- 15 mM, 1220 mM, 14-18 mM, 14-16 mM). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de modo misto carregada (por exemplo, coluna HA) é lavada com um tampão de lavagem que tem uma concentração de fosfato de ou superior a 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM.

[0105] A eluição de uma coluna HA é tipicamente conseguida com um gradiente de tampão de fosfato. Por exemplo, um tampão de eluição adequado pode ter um gradiente de fosfato de cerca de 1-400 mM (por exemplo, 1-300 mM, 1-200 mM, 1-150 mM, 1-100 mM, 10-350 mM, 10300 mM, 10-250 mM, 10-200 mM, 10- 150 mM, 10-140 mM, 10-130 mM, 10-120 mM, 10-110 mM, 10-100 mM, 10-90 mM, 10-80 mM, 10-70 mM, 10-60 mM, 10-50 mM) de fosfato de sódio. Em algumas modalidades, a eluição de uma coluna HA é conseguida por aumento gradual da concentração de fosfato no tampão de eluição. Em algumas modalidades, os tampões de eluição por etapas podem ter uma concentração de fosfato selecionada a partir de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM. Em algumas modalidades, a eluição de uma coluna de cromatografia de modo misto (por exemplo, coluna HA) é obtida através de um tampão de eluição tendo um fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em concentração variando desde cerca de 50 mM a cerca de 150 mM (por exemplo, selecionado de entre um fosfato (por exemplo, fosfato de sódio) em concentração de cerca de 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, e combinação dos mesmos).

[0106] Será apreciado que muitas combinações diferentes das condições para a cromatografia de HA são conhecidas e podem ser utilizadas para ajustar os parâmetros para serem adequados para uma determinada proteína de interesse (por exemplo, I2S recombinante).

Cromatografia de Interação Hidrofóbica

[0107] Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) é uma técnica de separação que utiliza as propriedades de hidrofobicidade para separar as proteínas a partir de outra. Neste tipo de cromatografia, grupos hidrofóbicos como fenila, octila ou butila, estão ligados à coluna estacionária. As proteínas que passam através da coluna, que tem cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicas sobre as suas superfícies são capazes de interagir com e de ligar-se aos grupos hidrofóbicos na coluna. Colunas de HIC são conhecidas, e incluem, por exemplo, Fenil Sepharose.

[0108] As separações de HIC são muitas vezes desenhadas utilizando as condições opostas daquelas utilizadas em cromatografia de troca iônica. Em geral, um tampão com uma força iônica alta, normalmente sulfato de amônio, é inicialmente aplicada à coluna. O sal no tampão reduz a solvatação de solutos de amostra, assim como diminuições, regiões de solvatação hidrofóbicas que se tornam expostas são adsorvidas pelo meio. A fase estacionária é geralmente concebida de modo a formar interações hidrofóbicas com outras moléculas. Estas interações são, geralmente, demasiado fracas em água, no entanto, a adição de sais (por exemplo, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, NaCl, NH4Cl, NaBr, e NaSCN) para os resultados de tampão em interações hidrofóbicas. Em algumas modalidades, a fase móvel compreende uma concentração de sal entre cerca de 0,1M e cerca de 3,0M, por exemplo, entre cerca de 0,1M e cerca de 1,5M, entre cerca de 0,2 M a cerca de 0,8 M, ou entre cerca de 0,3M e cerca de 0,5M.

[0109] Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada. Em certas modalidades, a fase móvel não é tamponada. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 14. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 10. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH entre cerca de 5 a cerca de 7. Em certas modalidades, a fase móvel é tamponada a um pH de cerca de 5,0.

[0110] Em algumas modalidades, uma preparação impura ou um eluato intermediário ou de fluxo é ajustada ao sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 0,5 M a cerca de 2,0 M (por exemplo, cerca de 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M ou 2,0 M) a um pH de cerca de 4,5-6,0 (por exemplo, cerca de 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0) antes do carregamento da coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, coluna de fenil). Uma vez carregada, uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica pode ser lavada usando um tampão de lavagem que compreende o sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 0,5 M a cerca de 2,0 M (por exemplo, cerca de 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M ou 2,0 M) a um pH de cerca de 4,5-6,0 (por exemplo, cerca de 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia de interação hidrofóbica é eluída utilizando um tampão de eluição que compreende o sal (por exemplo, NaCl) em concentração variando de cerca de 0,1 M a cerca de 0,5 M (por exemplo,. cerca de 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, ou 0,5 M) a um pH de cerca de 4,5-6,0 (por exemplo, cerca de 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0).

Caracterização de Proteínas I2S purificadas

[0111] A proteína I2S purificada recombinante pode ser caracterizada utilizando diferentes métodos.

Pureza

[0112] A pureza da proteína I2S recombinante purificada é tipicamente medida pelo nível de várias impurezas (por exemplo, proteína da célula hospedeira ou DNA da célula hospedeira) presentes no produto final. Por exemplo, o nível de proteína da célula hospedeira (HCP) pode ser medido por ELISA ou SDS-PAGE. Em algumas modalidades, a proteína I2S recombinante purificada contém menos do que 150 ng HCP/mg de proteína I2S (por exemplo, menos do que 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 30, 20, 10 ng HCP/mg de proteína I2S). Em algumas modalidades, a proteína I2S recombinante purificada, quando submetida a SDS-PAGE com coloração de prata, não tem novas bandas com intensidade superior a 0,05%, 0,01%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% ou 0,5% controle de ensaio. Podem ser utilizados vários controles do ensaio, em particular, aqueles aceitáveis pelas agências reguladoras como FDA.

Atividade Específica

[0113] A proteína I2S purificada recombinante pode também ser caracterizada por avaliação da atividade funcional e/ou biológica. A atividade enzimática de uma composição I2S recombinante pode ser determinada utilizando métodos conhecidos na técnica. Tipicamente, os métodos envolvem a detecção da remoção do sulfato a partir de um material sintético, o qual é conhecido como ensaio de liberação de sulfato. Um exemplo de um ensaio de atividade de enzima envolve a utilização de cromatografia iônica. Este método quantifica a quantidade de íons sulfato que são enzimaticamente liberados por I2S recombinantes a partir de um substrato. O substrato pode ser um substrato natural ou um substrato sintético. Em alguns casos, o substrato é o sulfato de heparina (por exemplo, heparina dissacarídeo), sulfato de dermatano, ou um seu equivalente funcional. Tipicamente, o íon de sulfato liberado é analisado por cromatografia de íons com um detector de condutividade. Neste exemplo, os resultados podem ser expressos em U/mg de proteína em que uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para libertar 1 μmol de íons sulfato por hora a partir do substrato. Em algumas modalidades, a proteína I2S recombinante purificada tem uma atividade específica, medida pelo ensaio de atividade de liberação in vitro utilizando sulfato de heparina dissacarídeo como substrato, variando de cerca de 0-100 U/mg, cerca de 10-100 U/mg, cerca de 10-80 U/mg, cerca de 20-80 U/mg, cerca de 20-70 U/mg, cerca de 20-60 U/mg, cerca de 20-50 U/mg, cerca de 30100 U/mg, cerca de 30-90 U/mg, cerca de 30-80 U/mg, cerca de 30-70 U/mg, cerca de 30-60 U/mg, cerca de 40-100 U/mg, cerca de 40-90 U/mg, cerca de 40-80 U/mg, cerca de 40-70 U/mg, cerca de 40-60 U/mg. Em algumas modalidades, a proteína I2S recombinante purificada tem uma atividade específica, medida pelo ensaio de atividade de liberação in vitro utilizando sulfato de heparina dissacarídeo como substrato, de pelo menos cerca de 5 U/mg, cerca de 10 U/mg, cerca de 15 U/mg, cerca de 20 U/mg, cerca de 25 U/mg, cerca de 30 U/mg, cerca de 35 U/mg, cerca de 40 U/mg, cerca de 45 U/mg, cerca de 50 U/mg, cerca de 55 U/mg, cerca de 60 U/mg, cerca de 65 U/mg, cerca de 70 U/mg, cerca de 75 U/mg, cerca de 80 U/mg, cerca de 85 U/mg, cerca de 90 U/mg, cerca de 95 U/mg, ou cerca de 100 U/mg. Exemplos de condições para a realização de ensaio de atividade de liberação utilizando sulfato de heparina dissacarídeo como substrato in vitro são fornecidos abaixo. Tipicamente, este ensaio mede a capacidade de I2S para liberar íons sulfato de um substrato, dissacarídeo de heparina de origem natural. O sulfato liberado pode ser quantificado por cromatografia de íons. Em alguns casos, cromatografia iônica é equipada com um detector de condutividade. Como um exemplo não limitativo, as amostras são primeiro trocadas de tampão para 10 mM de acetato de Na, pH de 6 para remover a inibição por meio de íons de fosfato no tampão de formulação. As amostras são, em seguida, diluídas a 0,075 mg/ml com tampão de reação (acetato de Na 10 mM, pH 4,4) e incubadas durante 2 horas a 37°C com heparina dissacarídeo em uma razão de enzima para substrato de 0,3 μg I2S/100 μg de substrato em 30 μl de volume de reação. A reação é então parada por aquecimento das amostras a 100°C durante 3 min. A análise é realizada com base em uma coluna analítica Dionex IonPac AS 18 com uma coluna IonPac AG 18 guard. Um método isocrático é usado com hidróxido de potássio a 30 mM a 1,0 ml/min durante 15 minutos. A quantidade de sulfato liberada pela amostra de I2S é calculada a partir da análise de regressão linear de padrões de sulfato na faixa de 1,7-16,0 nmoles. O valor reportado é expresso como unidades por mg de proteína, em que 1 unidade é definida como 1 μimol de sulfato liberado por hora e a concentração de proteína é determinada por medições de A280.

[0114] Em algumas modalidades, a atividade enzimática da proteína I2S recombinante pode também ser determinada utilizando vários outros métodos conhecidos na técnica como, por exemplo, ensaio 4-MUF que mede a hidrólise de 4-metil-umbeliferil-sulfato naturalmente fluorescente e 4-metilumbeliferona sulfato (4-MUF). Em algumas modalidades, uma atividade enzimática desejada, como medida pelo ensaio in vitro de 4-MUF, da proteína I2S recombinante produzida é pelo menos cerca de 0,5 U/mg, 1,0 U/mg, 1,5 U/mg, 2 U/mg, 2,5 U/mg, 3 U/mg, 4 U/mg, 5 U/mg, 6 U/mg, 7 U/mg, 8 U/mg, 9 U/mg, 10 U/mg, 12 U/mg, 14 U/mg, 16 U/mg, 18 U/mg, ou 20 U/mg. Em algumas modalidades, uma atividade enzimática desejada, como medida pelo ensaio in vitro de 4-MUF, das faixas de proteína I2S recombinantes produzidas a partir de cerca de 0-50 U/mg (por exemplo, cerca de 0-40 U/mg, cerca de 0-30 U/mg, cerca de 0-20 U/mg, cerca de 0-10 U/mg, cerca de 2-50 U/mg, cerca de 2-40 U/mg, cerca de 2-30 U/mg, cerca de 2-20 U/mg, cerca de 2-10 U/mg, cerca de 4-50 U/mg, cerca de 4-40 U/mg, cerca de 4-30 U/mg, cerca de 4-20 U/mg, cerca de 4-10 U/mg, cerca de 6-50 U/mg, cerca de 6-40 U/mg, cerca de 6-30 U/mg, cerca de 6-20 U/mg, cerca de 6-10 U/mg). Exemplos de condições para a realização de ensaio in vitro de 4-MUF são fornecidos abaixo. Tipicamente, um ensaio 4-MUF mede a capacidade de uma proteína I2S para hidrolisar 4-metilumbeliferil-sulfato (4-MUF-SO4) e 4- metilumbeliferona sulfato naturalmente fluorescente (4-MUF). Uma miliunidade de atividade é definida como a quantidade de enzima necessária para converter um nanomole de 4-MUF-SO4 a 4-MUF em um minuto a 37°C. Tipicamente, as unidades de fluorescência médias (MFU) geradas por amostras I2S de ensaio com atividade conhecida podem ser usadas para gerar uma curva padrão, que pode ser usada para calcular a atividade enzimática de uma amostra de interesse. A atividade específica pode então ser calculada dividindo-se a atividade da enzima pela concentração de proteína.

[0115] Em ambos exemplos, a concentração de proteína de uma composição I2S recombinante pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na técnica para determinar as concentrações de proteína. Em alguns casos, a concentração de proteína é determinada por um ensaio de absorção de luz ultravioleta. Tais ensaios de absorbância são tipicamente conduzidos a cerca de um comprimento de onda de 280 nm (A280).

Perfil de Carga

[0116] I2S recombinantes purificadas podem ser caracterizadas pelo perfil de carga associada com a proteína. Tipicamente, o perfil de taxa de proteína reflete o padrão de cargas das cadeias laterais de resíduos, tipicamente presentes na superfície da proteína. Perfil de carga pode ser determinado através da realização de uma cromatografia de troca iônica (IEX) (por exemplo, HPLC) na proteína. Em algumas modalidades, um "perfil de carga" refere-se a um conjunto de valores que representam a quantidade de proteína que elui a partir de uma coluna de troca iônica a um ponto no tempo após a adição à coluna de uma fase móvel contendo uma troca iônica.

[0117] Tipicamente, uma coluna de troca iônica adequada é uma coluna de troca aniônica. Por exemplo, um perfil de carga pode ser determinado por cromatografia de troca aniônica forte (SAX) utilizando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Em geral, I2S recombinante adsorve sobre a carga positiva fixa de uma coluna de troca de ânions forte e um gradiente de força iônica crescente, usando uma fase móvel com uma vazão predeterminada elui espécies I2S recombinantes a partir da coluna em proporção à força da sua interação iônica com a coluna positivamente carregada. Espécies I2S mais negativamente carregadas (mais ácidas) eluem mais tarde do que espécies de I2S menos negativamente carregadas (menos ácidas). A concentração de proteínas no eluato é detectada por absorbância de luz ultravioleta (em 280 nm).

[0118] Em algumas modalidades, I2S recombinante adsorve a cerca de pH 8,0 em 20 mM TRIS-HCl para a carga positiva fixa de uma coluna Mini Q PE e um gradiente de força iônica crescente, utilizando uma fase móvel consistindo em 20 mM Tris-HCL, cloreto de sódio 1 M, pH 8,0 a uma taxa de fluxo de 0,8 ml/min elui espécies I2S recombinantes a partir da coluna em proporção à força da sua interação iônica com a coluna positivamente carregada.

[0119] Em algumas modalidades, um perfil de carga pode ser representado por um cromatograma de unidades de absorvência em função do tempo após a eluição a partir da coluna de HPLC. O cromatograma pode compreender um conjunto de um ou mais picos, com cada pico em conjunto identificando uma subpopulação de I2Ss recombinante da composição que têm cargas de superfície semelhantes.

[0120] Em algumas modalidades, a composição de proteína I2S purificada apresenta, pelo menos, seis picos no seu perfil de carga. Um perfil de carga de I2S exemplar é descrito na seção de Exemplos e na Figura 11. Como mostrado na Figura 11, seis picos são marcados (A a F) em ordem crescente de carga negativa e diminuindo a contribuição para a área total do pico do cromatograma. Em algumas modalidades, o perfil de carga para uma composição I2S recombinante purificada contém um número diferente, tamanho, forma ou intervalo de tempo de picos, dependendo da quantidade de cargas negativas ou positivas na superfície da proteína. Em algumas modalidades, uma composição I2S recombinante tem um perfil de carga que tem menos do que 6 (por exemplo, menos do que 5, 4, 3 ou 2) picos. Em algumas modalidades, um perfil de carga de I2S recombinante pode ter 5, 4, 3, 2, 1 ou picos. Por exemplo, qualquer um, dois, três, quatro, ou cinco dos picos A, B, C, D, E, e F podem ser reduzidos ou ausentes em uma composição de proteína I2S recombinante purificada. Tipicamente, um perfil de carga é considerado mais homogêneo se houver menos picos.

Mapeamento de glicano

[0121] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada pode ser caracterizada pela sua composição de proteoglicanos, normalmente referida como mapeamento glicano. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, acredita-se que a ligação de glicano junto com a forma e a complexidade da estrutura da ramificação ramo pode impactar depuração in vivo, direcionamento lisossomal, biodisponibilidade, e/ou eficácia.

[0122] Tipicamente, um mapa de glicano pode ser determinado por digestão enzimática e subsequente análise cromatográfica. Várias enzimas podem ser utilizadas para a digestão enzimática, incluindo, entre outras, glicosilases, peptidases adequadas (por exemplo, endopeptidases, Exopeptidases), proteases, e fosfatases. Em algumas modalidades, uma enzima adequada é a fosfatase alcalina. Em algumas modalidades, uma enzima adequada é a neuraminidase. Glicanos (por exemplo, fosfoglicanos) podem ser detectados por análise cromatográfica. Por exemplo, fosfoglicanos podem ser detectados por Cromatografia de Troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAE-PAD) ou cromatografia líquida de alta eficiência por exclusão de tamanho (HPLC). A quantidade de glicano (por exemplo, fosfoglicano) representada por cada pico em um mapa de glicano pode ser calculada utilizando uma curva padrão de glicano (por exemplo, fosfoglicano), de acordo com métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.

[0123] Em algumas modalidades, uma I2S purificada de acordo com a presente invenção apresenta um mapa de glicano compreendendo sete grupos de picos indicativos de neutro (grupo pico 1), mono-sialiladas (grupo pico 2), di-sialiladas (grupo pico 3), monofosforilado (pico grupo 4), tri-sialilado (pico grupo 5), tetra-sializada (grupo pico 6), e difosforilada (grupo pico 7) de proteína I2S , respectivamente. Exemplos de mapas de glicano de I2S estão representados na Figura 10. Em algumas modalidades, uma I2S recombinante purificada tem um mapa de glicano que tem menos do que 7 grupos de pico (por exemplo, um mapa de glicano com 6, 5, 4, 3, ou 2 grupos de picos). Em algumas modalidades, um I2S recombinante purificada tem um mapa de glicano que tem mais do que 7 grupos de pico (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais).

[0124] A quantidade relativa de glicano correspondente a cada grupo de pico pode ser determinada com base na área de pico de grupo em relação à área de pico correspondente no grupo de um padrão de referência predeterminado. Em algumas modalidades, o pico de grupo 1 (neutro) pode ter a área de pico de grupo variando entre cerca de 40120% (por exemplo, cerca de 40-115%, cerca de 40-110%, cerca de 40100%, cerca de 45-120%, cerca de 45-115%, cerca de 45-110%, cerca de 45-105%, cerca de 45-100%, cerca de 50-120%, cerca de 50-110%) em relação à área de pico correspondente ao grupo de um padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico de grupo 2 (monosialilada) podem ter a área de pico de grupo variando entre cerca de 80-140% (por exemplo, cerca de 80-135%, cerca de 80-130%, cerca de 80-125%, cerca de 90-140%, cerca de 90-135%, cerca de 90-130%, cerca de 90-120%, cerca de 100-140%) em relação à área de pico de grupo correspondente ao padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico de grupo 3 (disialilada) pode ter a área de pico de grupo variando de cerca de 80-110% (por exemplo, cerca de 80-105%, cerca de 80100%, cerca de 85-105%, cerca de 85-100%) relativa para a área de grupo de pico correspondente ao padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico de grupo 4 (monofosforilado) pode ter a área de pico de grupo variando de cerca de 100-550% (por exemplo, cerca de 100-525%, cerca de 100-500%, cerca de 100-450%, cerca de 150550%, cerca de 150-500%, cerca de 150-450%, cerca de 200-550%, cerca de 200-500%, cerca de 200-450%, cerca de 250-550%, cerca de 250-500%, cerca de 250-450%, ou cerca de 250-400%) em relação à área de grupo de pico correspondente ao padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico de grupo 5 (tri-sialilado) pode ter a área de pico de grupo variando entre cerca de 70-110% (por exemplo, cerca de 70-105%, cerca de 70-100%, cerca de 70-95%, cerca de 70-90%, cerca de 80-110%, cerca de 80-105%, cerca de 80-100%, ou cerca de 80-95%) em relação à área do pico do grupo correspondente ao padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico de grupo 6 (tetra- sializada) pode ter a área de pico de grupo variando entre cerca de 90130% (por exemplo, cerca de 90-125%, cerca de 90-120%, cerca de 90115%, cerca de 90-110%, cerca de 100-130%, cerca de 100-125%, ou cerca de 100-120%) em relação à área de grupo de pico correspondente ao padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico de grupo 7 (difosforilada) pode ter uma área de pico de grupo variando entre cerca de 70-130% (por exemplo, cerca de 70-125%, cerca de 70-120%, cerca de 70-115%, cerca de 70-110%, cerca de 80-130%, cerca de 80-125%, cerca de 80-120%, cerca de 80-115%, cerca de 80-110%, cerca de 90130%, cerca de 90-125%, cerca de 90- 120%, cerca de 90-115%, cerca de 90-110%) em relação à área de grupo de pico correspondente ao padrão de referência. Vários padrões de referência para o mapeamento de glicano são conhecidos na técnica e podem ser utilizados na prática da presente invenção. Normalmente, o pico de grupo 7 (Difosforilada) corresponde ao nível de di-M6P sobre a superfície da proteína I2S recombinante purificada.

[0125] Considera-se que o padrão de glicosilação de uma I2S purificada impacta o direcionamento lisossomal. Vários ensaios in vitro de captação celular são conhecidos na técnica e podem ser utilizados na prática da presente invenção. Por exemplo, para avaliar a absorção de I2S pelos receptores de M6P, ensaios de incorporação celular são realizados utilizando fibroblastos humanos que expressam os receptores de M6P na sua superfície. A quantidade internalizada de I2S pode ser medida por um método ELISA. Em algumas modalidades, uma proteína purificada I2S recombinante de acordo com a presente invenção é caracterizada com a absorção celular de mais do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, como determinado por um ensaio de absorção in vitro.

Mapeamento de peptídeo

[0126] Em algumas modalidades, o mapeamento de peptídeos pode ser utilizado para caracterizar a composição de aminoácidos, modificações pós-traducionais, e/ou processamento celular; como a clivagem de um peptídeo sinal, a conversão de formilglicina e/ou glicosilação. Tipicamente, uma proteína recombinante pode ser quebrada em fragmentos peptídicos discretos, por quebra controlada ou aleatória, para produzir um padrão ou mapa peptídico. Em alguns casos, uma proteína I2S purificada pode ser primeira submetida a digestão enzimática antes da análise analítica. A digestão pode ser realizada utilizando uma peptidase, glicosídeo hidrolases, fosfatase, lipase ou protease e/ou suas combinações, antes da análise analítica. A composição estrutural de peptídeos pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem, entre outros, espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear (RMN) ou por HPLC.

Percentual de Conversão em Formilglicina

[0127] Mapeamento de peptídeo pode ser usado para determinar a percentagem de conversão de FGly. Como discutido acima, I2S requer a ativação de Cisteína (correspondente à posição 59 da I2S humana madura) para conversão em formilglicina por enzima geradora de formilglicina (FGE), como mostrado abaixo:

[0128] Portanto, o percentual de conversão em formilglicina (% de FG) pode ser calculado através da seguinte fórmula:

[0129] Para calcular a % de FG, uma proteína I2S recombinante pode ser digerida em peptídeos curtos utilizando uma protease (por exemplo, tripsina ou quimotripsina). Peptídeos curtos podem ser separados e caracterizados utilizando, por exemplo, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por exclusão de tamanho (HPLC). O peptídeo contendo a posição correspondente à posição 59 das I2S humanas maduras pode ser caracterizado para determinar se a Cys na posição 59 foi convertida para uma FGly em comparação com um controle (por exemplo, uma proteína I2S sem conversão a FGly ou uma proteína I2S com 100% de conversão a FGly). A quantidade de peptídeos contendo FGly (correspondente ao número de moléculas I2S ativas) e a quantidade total de peptídeos com ambos FGly e Cys (correspondente ao número de moléculas de I2S totais) podem ser determinadas com base nas áreas dos picos correspondentes e a razão refletindo o % de FG pode ser calculada.

[0130] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção tem pelo menos cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%), de conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO:1) para Cαformilglicina (FGly). Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada de acordo com a presente invenção tem substancialmente 100% de conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO:1) para Cαformilglicina (FGly).

Conteúdo em ácido siálico

[0131] Em algumas modalidades, uma proteína I2S recombinante purificada pode ser caracterizada pela sua composição de ácido siálico. Sem pretender ser limitado pela teoria, é contemplado que os resíduos de ácido siálico em proteínas podem prevenir, reduzir ou inibir a sua rápida depuração in vivo por via de receptores asialoglicoproteína que estão presentes em hepatócitos. Assim, pensa-se que as proteínas recombinantes que têm teor relativamente elevado de ácido siálico têm tipicamente um tempo de circulação in vivo relativamente longo.

[0132] Em algumas modalidades, o teor de ácido siálico de uma proteína I2S recombinante purificada pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o teor de ácido siálico de uma proteína I2S recombinante pode ser determinado por digestão enzimática e subsequente análise cromatográfica. A digestão enzimática pode ser realizada utilizando qualquer uma de sialidase adequada. Em alguns casos, a digestão é realizada por uma enzima hidrolase de glicosídeo, como a neuraminidase. O ácido siálico pode ser detectado por meio de análise cromatográfica, como, por exemplo, Cromatografia de Troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAE-PAD). A quantidade de ácido siálico em uma composição I2S recombinante pode ser calculada utilizando uma curva padrão de ácido siálico, de acordo com métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.

[0133] Em algumas modalidades, o teor de ácido siálico de uma proteína I2S recombinante purificada pode ser superior a 16 mol/mol. As unidades "mol/mol" no contexto de teor de ácido siálico referem-se a moles de resíduos de ácido siálico por mole de enzima. Em alguns casos, o conteúdo de ácido siálico de uma proteína I2S recombinante é superior a cerca de 16,5 mol/mol, cerca de 17 mol/mol, cerca de 18 mol/mol, cerca de 19 mol/mol, cerca de 20 mol/mol, cerca de 21 mol/mol, cerca de 22 mol/mol ou mais. Em algumas modalidades, o teor de ácido siálico de uma proteína I2S recombinante purificada pode estar em uma faixa entre cerca de 16-20 mol/mol, 16-21 mol/mol, cerca de 16-22 mol/mol, 16-23 mol/mol, 16-24 mol/mol, cerca de 16-25 mol/mol, cerca de 17-20 mol/mol, 17-21 mol/mol, cerca de 17-22 mol/mol, 17-23 mol/mol, 17-24 mol/mol, ou cerca de 17-25 mol/mol.

Composição Farmacêutica e Administração

[0134] Proteína I2S purificada recombinante pode ser administrada a um paciente com Síndrome de Hunter, de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, a proteína I2S recombinante purificada pode ser liberada por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, transdérmica, ou transmucosa (por exemplo, por via oral ou por via nasal).

[0135] Em algumas modalidades, uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma é administrada a um indivíduo por administração intravenosa.

[0136] Em algumas modalidades, uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma é administrada a um indivíduo por administração intratecal. Como aqui utilizado, o termo "administração intratecal" ou "injeção intratecal" refere-se a uma injeção no interior do canal espinhal (espaço intratecal circunda a medula espinhal). Várias técnicas podem ser utilizadas, incluindo, sem limitação, a injeção cerebroventricular lateral por um orifício de trepanação ou punção cisternal ou lombar ou similares. Em algumas modalidades, "administração intratecal" ou "liberação intratecal" de acordo com a presente invenção refere-se a administração IT de ou liberação através da área ou região lombar, isto é, a administração ou liberação IT na lombar. Como aqui utilizado, o termo "região lombar" ou "zona lombar" refere-se à área entre a terceira e quarta vértebra lombar (parte inferior das costas) e, de forma mais abrangente, região da coluna de vértebras L2-S1.

[0137] Em algumas modalidades, uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma é administrada ao indivíduo por administração via subcutânea (ou seja, por baixo da pele). Para tais fins, a formulação pode ser injetada usando uma seringa. No entanto, outros dispositivos para a administração da formulação estão disponíveis, como dispositivos de injeção (por exemplo, dispositivos Inject-ease™ e Genject™); canetas injetoras (como a GenPen™); dispositivos sem agulha (por exemplo, MediJector™ e Biojector™); e sistemas de distribuição de adesivos subcutâneos.

[0138] Em algumas modalidades, a administração intratecal pode ser utilizada em conjunto com outras vias de administração (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, transdérmica, ou transmucosa (por exemplo, por via oral ou por via nasal)).

[0139] A presente invenção contempla única, bem como múltiplas administrações de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma aqui descrita. Uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma pode ser administrada em intervalos regulares, dependendo da natureza, gravidade e da extensão da condição do sujeito (por exemplo, uma doença de armazenamento lisossomal). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma podem ser administradas periodicamente a intervalos regulares (por exemplo, uma vez por ano, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada três meses, (bimensais uma vez a cada dois meses), mensal (uma vez por mês), quinzenal (uma vez a cada duas semanas), semanalmente, diariamente ou de forma contínua).

[0140] Uma I2S recombinante ou uma composição farmacêutica contendo a mesma pode ser formulada com um veículo ou excipiente fisiologicamente aceitável para preparar uma composição farmacêutica. O veículo e agente terapêutico podem ser estéreis. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.

[0141] Transportadores adequados, farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, água, soluções salinas (por exemplo, NaCl), solução salina, solução salina tamponada, álcoois, glicerol, etanol, goma arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietilenoglicóis, gelatina, carboidratos como lactose, amilose ou amido, açúcares, como manitol, sacarose ou outros, dextrose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, ésteres de ácidos graxos, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona, etc, bem como suas combinações. As preparações farmacêuticas podem, se desejado, ser misturadas com agentes auxiliares (por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, substâncias aromatizantes e/ou aromáticas e similares), que não reagem de forma prejudicial com os compostos ativos ou interferir com a sua atividade. Em algumas modalidades, um veículo solúvel em água adequado para administração intravenosa é utilizado.

[0142] A composição ou medicamento, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsionantes, ou agentes de tamponamento do pH. A composição pode ser uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação sustentada, ou pó. A composição também pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir veículos correntes como qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc.

[0143] A composição ou medicamento pode ser formulado de acordo com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração a seres humanos. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em tampão aquoso isotônico estéril. Sempre que necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente vedado como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição for administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de qualidade farmacêutica, solução salina ou dextrose/água. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[0144] Como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é determinado em grande parte de base na quantidade total do agente terapêutico contido nas composições farmacêuticas da presente invenção. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para alcançar um benefício significativo para o paciente (por exemplo, tratar, modular, curar, prevenir e/ou melhorar a doença ou condição subjacente). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva pode ser uma quantidade suficiente para conseguir um efeito terapêutico e/ou profilático pretendido, como uma quantidade suficiente para modular receptores de enzima lisossomal ou a sua atividade assim como para tratar a doença de armazenamento lisossomal ou dos seus sintomas (por exemplo, uma redução ou eliminação da presença ou a incidência de "corpos zebra" ou vacuolização celular após a administração das composições da presente invenção a um sujeito). Geralmente, a quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima lisossomal recombinante) administrada a um sujeito em necessidade do mesmo irá depender das características do sujeito. Tais características incluem a condição, a gravidade da doença, a saúde geral, idade, sexo e peso do corpo do sujeito. Um especialista na técnica será prontamente capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo destes e de outros fatores relacionados. Além disso, ambos os ensaios, objetivos e subjetivos podem, opcionalmente, ser empregues para identificar os intervalos de dosagem ideais.

[0145] Uma quantidade terapeuticamente eficaz é normalmente administrada em um regime de dosagem que pode compreender várias doses unitárias. Para qualquer proteína terapêutica particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz (e/ou uma unidade de dosagem apropriada dentro de um regime de dosagem eficaz) pode variar, por exemplo, dependendo da via de administração, em combinação com outros agentes farmacêuticos. Além disso, a quantidade terapeuticamente eficaz específica (e/ou de dose unitária) para qualquer paciente particular pode depender de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do agente farmacêutico específico empregado; a composição específica empregue; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração, e/ou a taxa de excreção ou metabolismo da proteína de fusão específico empregue; a duração do tratamento; e fatores semelhantes, como é bem conhecido nas técnicas médicas.

[0146] As composições farmacêuticas exemplares adicionais e métodos de gestão são descritos na publicação PCT WO2011/163.649 intitulado "Methods and Compositions for CNS Delivery of Iduronate-2- Sulfatase;" e pedido provisório número de série 61/618.638, intitulado "Subcutaneous administration of iduronate 2 sulfatase" depositado em 30 de Março de 2012, cujas descrições completas de ambas as quais são aqui incorporadas por referência.

[0147] Deve ser ainda entendido que para qualquer sujeito particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração da terapia de reposição de enzimas, e que as faixas de dosagem estabelecidas aqui apresentadas são apenas exemplos e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da invenção reivindicada.

EXEMPLOS Exemplo 1:Captura de AF I2S recombinante e Processo de purificação

[0148] Este exemplo demonstra um processo de purificação a jusante simplificado pode ser utilizado para capturar e purificar I2S recombinantes produzida em meio isento de soro. Um esquema de purificação exemplificativo está representado na Figura 1.

[0149] Uma linhagem celular que expressa estavelmente uma enzima iduronato-2-sulfatase (I2S) e enzima geradora de formilglicina (FGE) foi desenvolvida. Geração e caracterização das linhagens de células exemplares são descritas no Pedido Provisório US intitulado "Cells for Producing Recombinant Iduronate-2-sulfatase" depositado na mesma data, todo o conteúdo do qual é aqui incorporada por referência. Resumidamente, uma linhagem celular humana foi projetada para coexpressar a proteína I2S humana com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2 e enzima geradora de formilglicina humana (FGE) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:5.

[0150] SEQ ID NO:2 >Precursor de iduronato 2-sulfatase de comprimento completo MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLTTVDDLRPSLGCYGDK LVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAG NFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCR GPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPH IPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPI PVDFQRKTRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTITAFTSDHGWALGEHGEW AKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVE LVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPREL IAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKTMGYSTRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHA GELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP

[0151] SEQ ID NO:5 Precursor de FGE humano de comprimento completo: MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQ RPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDG EAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTN TQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTTLHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGK RLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGT APVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGS YMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD

[0152] Após a síntese da enzima I2S de comprimento completo, o peptídeo de sinal de 25 aminoácidos é removido e uma enzima madura solúvel I2S é secretada a partir da célula.

[0153] O meio quimicamente definido (livre de soro/sem componente animal; AF) foi utilizado no processo de biorreator.

[0154] O material da colheita individual foi reduzido em volume e tampão foi trocado por meio de um processo de ultrafiltração/dialfiltração. O material, denominado granel não purificado (UPB) foi congelado a -50°C por colheita individual. O processo de purificação a jusante começou com o degelo e um pool de grandes quantidades não purificadas incluiu sucessivas inativações virais, etapas de cromatografia de troca aniônica (Capto Q), de modo misto (hidroxiapatita cerâmica), de troca de cátions (SP Sepharose) e interação hidrofóbica (fenil Sepharose) seguido por filtração viral, e concentração final e passada em diafiltração. Em particular, este processo de purificação utilizou modalidades cromatográficas de Q, hidroxiapatita, e SP Fenil. Cromatografia por Proteína G e Cromatografia por exclusão de tamanho usadas tradicionalmente em processo de purificação de I2S foram removidas. Etapas exemplificativas são apresentadas na Tabela 3. Tabela 3: Exemplos de etapas de purificação de processo

[0155] A proteína I2S purificada foi avaliada quanto à pureza por mapeamento do peptídeo, SDS-PAGE (Prata), HPLC de exclusão de tamanho. Atividade enzimática específica, o conteúdo de formilglicina, teor de ácido siálico, mapa de glicano, perfis de carga foram determinados utilizando métodos padrão. Exemplos de resultados são apresentados na Tabela 4.

[0156] Um mapa de peptídeo exemplar, em comparação com I2S de referência comercialmente disponível é mostrado na Figura 2. Exemplos de resultados de SDS-PAGE (prata) da análise são mostrados na Figura 3. Tipicamente, usando um processo aqui descrito, a concentração HCP de substância do fármaco (DS) foi <100 ppm, atendendo a especificação < 100 ppm necessária em muitos mercados, incluindo os EUA. A SEC de DS foi > 99,5%, além de atender a atual exigência de especificação de comercialização > 99,3% em muitos mercados. Perfil de carga exemplar é mostrado na Figura 4. Exemplos de mapa de glicano são mostrados na Figura 5. Em particular, o mapa de glicano de I2S purificada inclui sete grupos de pico, realizando a eluição de acordo com uma quantidade crescente de cargas negativas derivadas de ácido siálico e resíduos de manose-6-fosfato, representando em ordem de eluição, neutros, mono, disialilada, monofosforilado, e híbridos trisialilada (monosialilada e M6P capeado), tetrasialilada e híbrido (disialilada e M6P capeados) e glicanos difosforilados.

[0157] No seu conjunto, este exemplo demonstra que um processo de purificação de quatro colunas simplificado pode ser utilizado para purificar com sucesso I2S recombinantes produzidas em meio isento de animais em larga escala.

Exemplo 2: Estudos de Estabilidade de Colheita e inativação viral de I2S recombinante AF

[0158] O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tempo de espera de temperatura e ciclos de congelamento e descongelamento sobre a estabilidade da I2S recombinante colhida clarificada.

[0159] Amostras de colheita clarificadas foram armazenadas em temperatura ambiente e 2-8°C durante até sete dias e as amostras UPB foram inativadas por ciclos virais realizados em temperatura ambiente durante até 24 horas. Amostras de congelamento-descongelamento em colheitas clarificadas foram congeladas a -20°C, -50°C e -80°C e experimentaram congelamento-descongelamento por até três ciclos. Estabilidade foi averiguada por meio de Western Blot, SEC HPLC, e ensaio de atividade.

[0160] Material I2S-AF colhido foi produzido a partir da linhagem celular 2D por CCPD utilizando um biorreator de 20L B. Braun com um dispositivo de retenção e centrífuga e uma taxa de sangramento pretendida. Para o estudo da temperatura de manutenção, cada colheita clarificada foi armazenada em temperatura ambiente e 2-8°C e amostrada em tempos de espera selecionada. Quantidades de amostragem tempos de espera estão listados na Tabela 5. As amostras de congelamento-descongelamento foram armazenadas a -20°C, -50°C e -80°C e descongeladas utilizando um banho de água a 25°C. Tabela 5. Estabilidade em ponto de retenção de colheita clarificada

[0161] A etapa de inativação viral ocorreu na etapa a granel não purificada antes de carregar na primeira coluna. UPB foi produzido através da concentração e troca de tampão de colheita clarificada. UF/DF foi realizada utilizando um sistema Pall 1 sq. Ft Centramate e tampão foi trocado em MES 10 mM, NaCl 155 mM, pH = 6,5. A etapa de inativação viral adicionada 1% de Tween 80 e 0,3% de TnBP, filtrada utilizando filtros de seringa Durapore para cada ponto de tempo. As amostras foram tomadas em cada ponto de tempo indicadas na Tabela 6 e congeladas a -80°C. Amostras de colheita clarificada do ponto de espera e estudos de congelamento-descongelamento foram testadas pelo Western blot e atividade (ensaio 4-MU). As amostras UPB de inativação viral foram testadas quanto à pureza por SEC HPLC. Os resultados da atividade ponto de espera a partir da colheita de 12 e 18 na Tabela 5 não apresentaram alterações significativas até 7 dias de armazenamento em ambiente e 2-8° C para ambas as colheitas. Não houve mudanças significativas observadas na atividade da Colheita 12 até ao máximo de 3 ciclos de congelamento-descongelamento armazenados a -20°C, -50°C e -80°C.

[0162] Atividade e SEC-HPLC para a estabilidade da etapa UPB de inativação viral são descritas nas Figuras 6 e 7. Isto demonstra que não houve problemas em termos de estabilidade de inativação viral com base na atividade e pureza de até 24 horas.

[0163] Em resumo, com base na análise de estabilidade aqui descrita, colheita clarificada pode ser armazenada a 2-8°C (por exemplo, durante até 7 dias) sem alterações significativas na qualidade da colheita. Colheitas clarificadas podem experimentar ciclos múltiplos de congelamento-descongelamento e guardadas a temperaturas de - 20°C, -50°C, e -80°C sem alterações significativas na estabilidade. Com base em resultados de pureza de SEC HPLC, etapa UPB de inativação viral pode ocorrer em temperatura ambiente (por exemplo, durante até 24 horas) sem nenhuma alteração na atividade e pureza.

Exemplo 3: Purificação e Análise de corrida de confirmação de meio CD IL isento de animais

[0164] O objetivo deste estudo foi realizar a purificação da colheita combinada de I2S-AF produzida em uma perfusão livre de animal utilizando meios quimicamente definidos e para caracterizar a substância medicamentosa.

[0165] Este estudo avaliou desempenho do processo de purificação de I2S-AF e de substância medicamentosa (DS) produzida a partir de um biorreator com meio quimicamente definido.

Cultura celular

[0166] O material I2S-AF foi produzido a partir de linhagem de células 2D expressando I2S e enzima geradora de formilglicina (FGE)) como descrito no Exemplo 1. O material foi produzido em CCPD em um biorreator de 1L Das Gip spin filtro utilizando um meio livre de soro quimicamente definido. Bolsas individuais de cada colheita clarificada (HI-21) foram recebidas congeladas a -20°C e descongeladas à temperatura de 2-8°C durante a noite. Volumes iguais de cada colheita clarificada foram reunidos para representar um pool de colheita completo, em seguida, filtradas a 0,2μm e concentradas usando cassete 30 kD Pall Omega Centramate com uma área total da membrana de 1 ft2. O bulk não purificado (UPB) foi filtrado por 0,2 μm e congelado antes de usar.

Purificação

[0167] Exemplos de especificações de coluna e de carga encontram- se descritos na Tabela 7. A Q Sepharose foi carregada a um alvo de 3 g/L por titulação. Colunas subsequentes foram carregadas em 100% a partir de eluição em coluna anterior e nenhum material removido.

[0168] Uma corrida de purificação foi realizada utilizando UPB de colheitas de agrupamento 1 a 21 do biorreator. UPB foi descongelado a 2-8°C durante a noite e agrupadas por um volume igual de cada colheita.

[0169] Etapas do processo individual de coluna e formulações de tampão podem ser encontradas nas Tabelas 8-11. A UPB reunido foi filtrado utilizando um sistema de filtro de 0,2 μm de garrafa giratória ajustado para pH 6,5 utilizando 1 M de acetato de sódio, e a condutividade ajustada a 16 mS/cm, com cloreto de sódio 5 M, antes do carregamento sobre a coluna de Q Sepharose FF. A eluição de Q Sepharose foi ajustada a 0,001 M NaPO4 usando 0,25 M NaPO4, pH 5,5 e filtrada com uma garrafa PES de filtro superior de 0,22 μm antes do carregamento sobre a coluna HA. A condutividade da eluição de HA foi ajustada para 1,55 M de NaCl com 5 M de NaCl e pH ajustado para pH 5,5 com 1 M de acetato de sódio. O tempo de ajustamento foi de aproximadamente 1 hora. O pool ajustado foi filtrado utilizando um filtro superior de garrafa PES de 0,22 μm antes de carregar em uma coluna de Fenil Sepharose. A eluição Fenil foi concentrada 4X e diafiltrada 6X em 0,02 M NaPO4, 0,137 M de NaCl, pH 6,0. O produto diafiltrado foi ajustada a 2,0 g/L e formulado com 0,2% de Polissorbato 20, para gerar substância do fármaco simulada. O pool simulado de H1-20 do DS foi criado para caracterização adicional. Tabela 8. Exemplos de Detalhes de Processo para Cromatografia Q Sepharose FF

Tabela 9. Exemplos de Detalhes de Processo para Cromatografia HA

Tabela 10. Exemplos de detalhes de Processo para Cromatografia fenil Sepharose

Tabela 11. Diafiltração exemplar do pool de eluição em fenil

Pureza em Processo por HCP por ELISA

[0170] A Tabela 12 descreve a remoção de HOP em processo para cada etapa. Os resultados em processo de HCP foram elevados com a maioria de remoção na etapa HA. Tabela 12. Remoção HCP em Processo

Caracterização da substância de fármaco

[0171] Resultados de liberação de lote de substâncias de fármaco exemplar são listados na Tabela 13. Como pode ser visto, a substância do fármaco tinha uma atividade específica elevada % de FG no material purificado. Atributos de caracterização do fármaco exemplar são mostrados na Tabela 13. HCP foi reduzida de 1.870 ng/mg para 372 ng/mg na etapa final de UF/DF. Tabela 13. Exemplos de substância do fármaco Lote de lançamento

Exemplo 4. Caracterização físico-química e biológica da enzima I2S recombinante purificada

[0172] O objetivo do exemplo foi realizar uma caracterização detalhada da proteína I2S recombinante purificada utilizando os métodos descritos acima.

SDS-PAGE

[0173] Para o experimento, a proteína I2S recombinante foi gerado usando Linhagens de células humanas 2D e 4D, em duas reações separadas de cultura de células livres de soro. As amostras foram recolhidas e purificadas utilizando métodos descritos acima. A enzima I2S purificada foi analisada por SDS-PAGE, e tratada com coloração de prata para visualização. Exemplos de resultados são mostrados na Figura 8. Como pode ser visto a partir da Figura 8, a proteína I2S recombinante purificada utilizando métodos aqui descritos apresenta padrões de bandas comparáveis, em comparação com a amostra de referência I2S purificada usando o método padrão.

Mapa de Peptídeo

[0174] A proteína I2S recombinante produzido pela linhagem celular de I2S-AF 2D foi purificada utilizando métodos como descritos acima. I2S recombinante purificada e uma amostra de referência de I2S humana foram, cada uma, submetidas à digestão proteolítica e examinada por análise de HPLC. Um mapa de peptídeo exemplar quando comparado com um de uma referência I2S é mostrado na Figura 9.

Percentual de Conversão a Formilglicina

[0175] O mapeamento de peptídeo pode ser usado para determinar a percentagem de conversão de FGly. Ativação de I2S requer cisteína (correspondente à posição 59 da I2S humana madura) para conversão em formilglicina pela enzima geradora de formilglicina (FGE), conforme mostrado abaixo:

Portanto, o percentual de conversão de formilglicina (% FG) pode ser calculado através da seguinte fórmula: Número de moléculas I2S ativas

[0176] Por exemplo, 50% de FG significa metade da I2S recombinante purificada é enzimaticamente inativa sem qualquer efeito terapêutico.

[0177] O mapeamento de peptídeos foi usado para calcular a % de FG. Resumidamente, uma proteína I2S recombinante purificada foi digerida em pequenos peptídeos usando uma protease (por exemplo, tripsina ou quimotripsina). Peptídeos curtos foram separados e caracterizados utilizando HPLC. O peptídeo contendo a posição que corresponde à posição 59 da I2S humana madura foi caracterizada para determinar se a Cys na posição 59 foi convertida para uma FGly em comparação com um controle (por exemplo, uma proteína I2S sem conversão a FGly ou uma proteína I2S com 100% de conversão a FGly). A quantidade de peptídeos contendo FGly (correspondente ao número de moléculas ativas I2S) e a quantidade total de peptídeos com ambos FGly e Cys (correspondente ao número de moléculas de I2S total) pode ser determinada com base nas áreas dos picos correspondentes e a razão refletindo a % de FG foi calculada. Exemplos de resultados são apresentados na Tabela 14.

Mapa de Glicano - conteúdo em manose-6-fosfato e ácido siálico

[0178] A composição glicano e ácido siálico de proteína I2S recombinante purificada foi determinada. A quantificação da composição em glicano foi realizada, utilizando cromatografia de troca aniônica para produzir um mapa de glicano. Conforme descrito abaixo, o mapa de glicano de I2S recombinantes purificadas, sob condições aqui descritas é composto por sete grupos de pico, efetuando a eluição de acordo com um aumento da quantidade de cargas negativas, pelo menos em parte, derivada de glicoformas de ácido siálico e manose-6- fosfato resultantes da digestão enzimática. Resumidamente, I2S recombinantes purificadas a partir da cultura de células sem soro (I2S- AF 2D isenta de soro e I2S-AF 4D isenta de soro) e de I2S recombinantes de referência, foram tratadas com (1) enzima neuraminidase purificada (isolada a partir de Arthrobacter Ureafaciens (10 um/μL), Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat. # 269 611 (1U/100μL)) para sua remoção de resíduos de ácido siálico, (2) fosfatase alcalina durante 2 horas a 37 ± 1°C durante a liberação completa de resíduos de manose-6-fosfato, (3) fosfatase alcalina + neuraminidase, ou (4) nenhum tratamento. Cada digestão enzimática foi analisada por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAE-PAD), utilizando uma coluna analítica CarboPac PA1 equipada com uma coluna Dionex CarboPac PA1 Guard. Uma série de padrões de ácido siálico e manose-6-fosfato na faixa de 0,4 a 2,0 nmoles foram corridos para cada ensaio. Um método isocrático utilizando acetato de sódio 48 mM em 100 mM de hidróxido de sódio foi corrido, durante um mínimo de 15 minutos a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min em temperatura ambiente em coluna para eluir cada pico. Os dados gerados por cada corrida individual, para I2S- AF e amostras I2S de referência, cada um foram combinados em um único cromatógrafo para representar o de mapa glicano para cada respectiva proteína recombinante. Como indicado na Figura 10, o mapa de glicano para I2S purificada a partir de meio isento de soro mostrou picos de eluição representativos (na ordem de eluição) que constituem neutros, mono, disialilados, monofosforilados, e híbridos trisialilados (Monosialilados e manose-6-fosfato capeados), e híbridos tetrasialilados (disialilada e manose-6-fosfato capeados) e glicanos difosforilados. Mapas de glicano exemplares são mostrados na Figura 10.

[0179] Teor de ácido siálico (moles de ácido siálico por mole de proteína) em cada amostra de I2S recombinante foi calculado a partir da análise de regressão linear de padrões de ácido siálico. Cada corrida de cromatograma foi visualizada usando o PeakNet 6 Software. Padrões de ácido siálico e o ácido siálico liberados a partir de amostras de controle e ensaio de teste I2S recombinantes aparecem como um pico único. A quantidade de ácido siálico (nmoles) para I2S foi calculada como um valor bruto usando a seguinte equação: (

[0180] Em que C é a concentração de proteína (em mg/ml) de amostra ou controle do ensaio de I2S recombinante.

[0181] O valor corrigido de ácido siálico como moles de ácido siálico por mole de proteína para cada amostra de teste foi calculado usando a seguinte fórmula:

[0182] Exemplos de dados indicativos do teor de ácido siálico nas I2S recombinantes purificadas a partir de linhagens celulares I2S-AF 2D ou 4D são mostrados na Tabela 14. Tabela 14: Características Exemplares de I2S purificada a partir de cultura celular isenta de soro

Atividade específica

[0183] A atividade específica da enzima I2S recombinante purificada utilizando métodos aqui descritos foi analisada por meio de ensaio de liberação in vitro ou um ensaio de sulfato de 4-MUF.

Ensaio de liberação in vitro de sulfato

[0184] Ensaio de liberação de sulfato in vitro foi realizado utilizando heparina dissacarídeo como substrato. Em particular, este ensaio mede a capacidade de I2S para liberar íons sulfato de um substrato dissacarídeo de heparina derivado naturalmente. O sulfato liberado pode ser quantificado por cromatografia iônica equipada com um detector de condutividade. Resumidamente, as amostras foram primeiro trocadas de tampão para 10 mM de acetato de Na, pH de 6 para remover a inibição por meio de íons de fosfato no tampão de formulação. As amostras foram então diluídas a 0,075 mg/ml com tampão de reação (acetato de Na 10 mM, pH 4,4) e incubadas durante 2 horas a 37°C com heparina dissacarídeo em um razão de enzima para substrato de 0,3 I2S/100 μg de substrato em 30 μl de volume de reação. A reação foi então parada por aquecimento das amostras a 100°C durante 3 min. A análise foi realizada com base em uma coluna analítica Dionex lonPac AG 18 com uma coluna de lonPac AG18 guard. Um método isocrático foi usado com hidróxido de potássio a 30 mM a 1,0 ml/min durante 15 minutos. A quantidade de sulfato liberada pela amostra de I2S foi calculada a partir da análise de regressão linear de padrões de sulfato na faixa de 1,7-16,0 nmoles. O valor reportado foi expresso como unidades por mg de proteína, em que 1 unidade é definida como 1 μmol de sulfato liberado por hora e a concentração de proteína é determinada por medições de A280. Exemplos de resultados são apresentados na Tabela 14.

Ensaio 4-MUF

[0185] A atividade específica da enzima I2S recombinante purificada pode também ser analisada utilizando o ensaio de fluorescência baseado em 4-MUF. Resumidamente, o ensaio mede a hidrólise por I2S do substrato 4-metilumbeliferil-sulfato (4-MUF-SO4). Com a clivagem do substrato 4-MUF-SO4 por I2S, a molécula é convertida em sulfato e 4-metilumbeliferona naturalmente fluorescente (4-MUF). Como resultado, a atividade da enzima I2S pode ser determinada avaliando a alteração global no sinal de fluorescência ao longo do tempo. Para este experimento, a enzima purificada I2S foi incubada com uma solução de 4-metilumbeliferil-sulfato (4-MUF-SO4), sal de potássio, Sigma Cat. # M-7133). A calibração do ensaio foi realizada usando uma série de amostras de referência de controle, utilizando-se enzima I2S disponível comercialmente diluída a 1:100, 1:200 e 1:20.000 da solução estoque. O ensaio enzimático foi executado a 37°C e ensaiado utilizando um fluorômetro calibrado. Utilizando os valores de fluorescência obtidos para cada padrão de referência, o coeficiente percentual de variação foi determinado utilizando a seguinte equação:

[0186] Os valores de percentual de CV foram então usados para calcular a média corrigida. A fluorescência de cada amostra, a fim de determinar a atividade da enzima reportada, expressa em mU/mL com a seguinte fórmula:

CFU = fluorescência média negativa corrigida DF - Fator de diluição

[0187] Uma atividade de miliunidade é a quantidade de enzima necessária para converter 1 nanomol de 4-metilumbeliferil-sulfato a 4- metilumbeliferona em 1 minuto a 37°C.

Perfil de Carga

[0188] Para este experimento, a distribuição de carga de cada I2S recombinante purificada foi determinada por cromatografia de troca aniônica forte (SAX), com um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O método separa I2S variantes recombinantes dentro da amostra, com base nas diferenças de carga de superfície. Em pH 8,00, espécies carregadas negativamente adsorvem a carga positiva fixa da coluna SAX. Um gradiente de força iônica crescente é utilizado para eluir cada uma das espécies de proteína na proporção da força da sua interação iônica com a coluna. Cem microgramas de I2S purificada, isolada a partir da linhagem celular 2D sob condições de crescimento isentas de soro, ou de enzima I2S de referência recombinante, foi carregada em uma coluna Amersham Biosciences Mini Q PE (4,6 x 50 mm) mantida em temperatura ambiente e equilibrada a 20 mM Tris-HCl, pH 8,00. O gradiente de eluição foi feito com uma vazão de 0,80 mL/min, utilizando uma fase móvel de 20 mM Tris-HCl, cloreto de sódio 1,0 M, pH 8,00. A concentração de proteína foi determinada continuamente durante a corrida, através da medição da absorbância de luz da eluição da amostra no comprimento de onda de 280 nm. Exemplos de resultados, mostrando os perfis de carga observadas para recombinantes I2S purificadas a partir de linhas de células em 2D e 4D são mostrados na Figura 11.

Claims

1. Composição, Caracterizada Pelo Fato De Que Compreende Uma Iduronato-2-sulfatase (I2s) Recombinante Purificada, Em Que A I2s Recombinante Purificada Compreende Pelo Menos 70% De Conversão Do Resíduo De Cisteína Correspondente A Cys59 De Seq Id No: 1 Em Cα-formilglicina (Fgly) E Em Que A I2s Recombinante Purificada Contém Pelo Menos 10% De Oligossacarídeos Bis-fosforilados Por Molécula.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a I2S recombinante purificada contém pelo menos 50% de oligossacarídeos bis-fosforilados por molécula.

3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma iduronato-2-sulfatase (I2S) recombinante purificada, em que a I2S recombinante purificada (i) compreende pelo menos 70% de conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 de SEQ ID NO: 1 em Cα-formilglicina (FGly), e (ii) contém em média pelo menos 16 resíduos de ácido siálico por molécula.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a I2S recombinante purificada contém em média pelo menos 18 ácidos siálicos por molécula.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a I2S recombinante purificada contém em média pelo menos 20 ácidos siálicos por molécula.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma iduronato-2-sulfatase (I2S) recombinante purificada, em que a I2S recombinante purificada compreende pelo menos 70% de conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 de SEQ ID NO: 1 em Cα- formilglicina (FGly), e em que a I2S purificada tem um mapa de glicano compreendendo sete ou menos conjuntos de pico selecionados dos conjuntos de pico indicativos de proteína I2S neutra (grupo de pico 1), mono-sialilada (grupo de pico 2), di-sialilada (grupo de pico 3), monofosforilada (grupo de pico 4), tri-sialilada (grupo de pico 5), tetra- sialilada (grupo de pico 6) ou difosforilada (grupo de pico 7).

7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma I2S recombinante purificada, em que a I2S recombinante purificada compreende pelo menos cerca de 70% de conversão do resíduo de cisteína correspondente a Cys59 em Ca-formilglicina (FGly), em que a I2S recombinante purificada contém menos de 150 ng/mg de proteína de célula hospedeira (HCP).

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína I2S recombinante purificada contém menos de 100 ng/mg de HCP.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína I2S recombinante purificada contém menos de 80 ng/mg de HCP.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína I2S recombinante purificada compreende uma região específica que se liga a um receptor na superfície das células alvo, em que a região específica é fundida com a proteína I2S na região N-terminal, C-terminal ou internamente.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o I2S recombinante purificado tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

12. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento da síndrome de Hunter.