CN107596357A - 艾杜糖‑2‑硫酸酯酶的纯化 - Google Patents

Abstract

本发明除其它事项以外提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的I2S蛋白的改进方法。本发明部分地基于以下令人惊讶的发现，即可使用包括少至4个色谱柱的工艺从未经处理的生物材料例如含I2S的细胞培养基纯化重组I2S蛋白。

Description

艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化

相关申请的交叉引用

本申请是申请号为201380042665.2、申请日为2013年6月28日、发明名称为“艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2013/048561的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2012年6月29日，申请系列号为61/666,733的美国临时专利申请的优先权，其完整内容在此通过引用并入。

序列表

在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为“2006685-0342_SEQ_LIST”的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大小为15KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景

粘多糖贮积症II型(MPS II，亨特综合症)是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖(GAG)硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素切割末端2-O-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大，组织破坏和器官系统功能障碍。

一般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严重的、进行性的和限制寿命的。

酶替代疗法(ERT)是用于治疗亨特综合症(MPS II)的批准的疗法，其包括向亨特综合症患者施用外源替代I2S酶。

发明概述

本发明除其它事项以外提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的I2S蛋白的改进方法。本发明部分地基于以下令人惊讶的发现，即可使用包括少至4个色谱柱的工艺从未经处理的生物材料例如含I2S的细胞培养基纯化重组I2S蛋白。用于酶替代疗法的重组I2S的批准现有的纯化工艺包括6个色谱柱。如在实施例部分中描述的，使用根据本发明的4柱工艺纯化的重组I2S蛋白符合美国和许多其他国家的市场营销纯度要求。此外，根据本发明纯化的重组I2S酶保留高百分比的C_α-甲酰甘氨酸(FGly)(例如，高于70％并高达100％)(这对于I2S酶的活性是重要的)和明显的特性例如唾液酸含量和聚糖图谱(这可促进重组I2S蛋白的生物利用度和/或溶酶体靶向)。因此，本发明提供了有效的、更廉价且更快速的用于纯化重组I2S蛋白的工艺。本发明特别适用于纯化在无血清培养基中产生的重组I2S蛋白。

因此，在一个方面，本发明提供了使用基于阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种的工艺从不纯制剂纯化重组I2S蛋白的方法。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括少于6个(例如，少于5个，少于4个或少于3个)色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括2、3、4或5个色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括4个色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白含有小于100ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)(例如，小于90ng/mg的HCP、小于80ng/mg的HCP、小于70ng/mg的HCP、小于60ng/mg的HCP、小于50ng/mg的HCP、小于40ng/mg的HCP、小于30ng/mg的HCP、小于20ng/mg的HCP、小于10ng/mg的HCP)。

在一些实施方案中，合适的阴离子交换色谱为Q色谱。在一些实施方案中，合适的阳离子交换色谱为SP色谱。在一些实施方案中，适合的混合模式色谱为羟基磷灰石(HA)色谱。在一些实施方案中，合适的疏水相互作用色谱为苯基色谱。

预期阴离子交换色谱(例如，O柱)、阳离子交换色谱(例如，SP柱)、混合模式色谱(例如，HA柱)以及疏水相互作用色谱(例如，苯基柱)可以以任何顺序进行。在一些实施方案中，根据本发明的方法按照该顺序进行阴离子交换色谱(例如，O柱)、阳离子交换色谱(例如，SP柱)、混合模式色谱(例如，HA柱)以及疏水相互作用色谱(例如，苯基柱)。

在一些实施方案中，在上样至阴离子交换色谱柱(例如，Q柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液(flow-through)调整至约5.0-7.0(例如，约5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)的pH以及约10-20mS/cm(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mS/cm)的电导率。在一些实施方案中，使用1M醋酸钠调整pH。在一些实施方案中，使用5M氯化钠调整电导率。在一些实施方案中，上样后，使用pH为约5.0-7.0(例如，约5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)的包含在约140mM至200mM(例如，约140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗涤缓冲液洗涤阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，使用包含线性盐(例如，NaCl)梯度的洗脱缓冲液洗脱阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，适当的线性NaCl梯度含有在约0-500mM范围内的NaCl(例如，约0-400mM、约0-350mM、约0-300mM、约50-500mM、约150-500mM、约150-450mM、约150-400mM)。

在一些实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱(例如，SP柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约1mS/cm与20mS/cm之间(例如，约1mS/cm与15mS/cm之间、约1mS/cm与10mS/cm之间、约1mS/cm与8mS/cm之间、约1mS/cm与6mS/cm之间、约1mS/cm与4mS/cm之间、约2mS/cm与4mS/cm)的范围内的电导率。在一些实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱(例如，SP柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约2mS/cm与4mS/cm之间(例如，2、2.5、3、3.5或4mS/cm)的范围内的电导率。在一些实施方案中，通过用H₂O以约1-2:1(例如，1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)的比率从阴离子交换色谱柱稀释洗脱液来调整电导率。在一些实施方案中，通过渗滤调整电导率。在一些实施方案中，在约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)的pH下运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，利用包含在约0.01M至约0.1M(例如，约0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M或0.1M)的范围内的磷酸盐(例如，NaPO4)浓度的缓冲液运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，合适的pH为约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)。

在一些实施方案中，在上样至混合模式色谱柱(例如，HA柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约0.001M至约0.01M(例如，约0.001M、0.002M、0.003M、0.004M、0.005M、0.006M、0.007M、0.008M、0.009M或0.01M)的范围内的磷酸盐(例如，NaPO4)浓度和约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)的pH。在一些实施方案中，在上样后，用中性pH或接近中性pH的含有磷酸盐(例如，1-10mM的磷酸钠或磷酸钾)的洗涤缓冲液来洗涤混合模式色谱柱(例如，HA柱)。在一些实施方案中，用具有在约10-20mM(例如，约10-18mM、10-16mM、10-15mM、12-20mM、14-18mM、14-16mM)的范围内的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤上样的混合模式色谱柱(例如，HA柱)。在一些实施方案中，用具有是或大于10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤上样的混合模式色谱柱(例如，HA柱)。在一些实施方案中，用梯度磷酸盐缓冲液实现从混合模式色谱柱(例如，HA柱)的洗脱。在一些实施方案中，适当的洗脱缓冲液可具有约1-400mM(例如，1-300mM、1-200mM、1-150mM、1-100mM、10-350mM、10-300mM、10-250mM、10-200mM、10-150mM、10-140mM、10-130mM、10-120mM、10-110mM、10-100mM、10-90mM、10-80mM、10-70mM、10-60mM、10-50mM)的磷酸钠或磷酸钾的磷酸盐梯度。在一些实施方案中，通过逐步增加洗脱缓冲液中的磷酸盐浓度实现从HA柱的洗脱。在一些实施方案中，逐步洗脱缓冲液可具有选自10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM的磷酸盐(例如，磷酸钠)浓度。在一些实施方案中，通过具有在约50mM至150mM的范围内的磷酸盐(例如，磷酸钠)浓度(例如，选自50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM及其组合的磷酸盐(例如，磷酸钠)浓度)的洗脱缓冲液实现从混合模式色谱柱(例如，HA柱)的洗脱。

在一些实施方案中，在上样至疏水相互作用色谱柱(例如，苯基柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至pH为约4.5-6.0(例如，约4.5、5.0、5.5或6.0)的在0.5M至约2.0M(例如，约0.5M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2.0MNaCl)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度。在一些实施方案中，上样后，使用pH为约4.5-6.0(例如，约4.5、5.0、5.5或6.0)的包含在约0.5M至2.0M(例如，约0.5M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2.0M NaCl)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗涤缓冲液洗涤疏水相互作用色谱柱。在一些实施方案中，使用pH为约4.5-6.0(例如，约4.5、5.0、5.5或6.0)的包含在约0.1M至约0.5M(例如，约0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M NaCl)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗脱缓冲液洗脱疏水相互作用色谱柱。

在一些实施方案中，阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱柱中的每一种具有在14-25cm(例如，15-25cm、15-20cm、14-24cm、14-22cm、14-20cm或16-18cm)的范围内的高度。在一些实施方案中，阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱柱中的每一种具有约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25cm的高度。

在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括在将不纯制剂上样至第一色谱柱之前进行病毒灭活的步骤。在一些实施方案中，病毒灭活的步骤包括将去垢剂添加至不纯制剂。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法还包括在最后一个色谱柱之后除去病毒的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法还包括超滤和/或渗滤的步骤。在一些实施方案中，超滤和/或渗滤的步骤包括将纯化的重组I2S蛋白交换至药物配制缓冲液中。

在一些实施方案中，本发明用于纯化具有与SEQ ID NO:1具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的氨基酸序列的重组I2S蛋白。在一些实施方案中，本发明用于纯化具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列的重组I2S蛋白。

在一些实施方案中，本发明用于纯化由在无血清培养基中悬浮培养的哺乳动物细胞产生的重组I2S蛋白。在一些实施方案中，适合于本发明的无血清培养基缺乏动物来源的组分。在一些实施方案中，适合于本发明的无血清培养基是化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，在生物反应器中培养哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为人细胞。

在一些实施方案中，从含有由哺乳动物细胞分泌的重组I2S蛋白的无血清培养基制备用于本发明的方法的不纯制剂。在一些实施方案中，将用于本发明的方法的不纯制剂从冷冻的培养基制剂解冻。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白含有平均每分子16-22个(例如，16-21个、16-20个、16-19个、17-22个、17-21个、17-20个、17-19个)唾液酸。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白含有平均每分子16、17、18、19、20、21或22个唾液酸。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白具有至少约70％(例如，至少约77％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)对应于人I2S(SEQ ID NO:1)的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白具有大体上100％的对应于人I2S(SEQ ID NO:1)的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白具有至少20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg或100U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白特征在于大于70％、75％、80％、85％、90％、95％的细胞摄取，如通过体外摄取测定所测定的。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白特征在于包含7个峰组的聚糖图谱，所述峰组分别指示中性(峰组1)、单唾液酸化(峰组2)、二唾液酸化(峰组3)、单磷酸化(峰组4)、三唾液酸化(峰组5)、四唾液酸化(峰组6)和二磷酸化(峰组7)I2S蛋白。在一些实施方案中，在神经氨酸酶消化后产生聚糖图谱。在其它实施方案中，在碱性磷酸酶消化后产生聚糖图谱。

除其它事项以外，本发明提供了如本文所述的纯化的重组I2S蛋白以及包含所述重组I2S蛋白的药物组合物或制剂。在一些实施方案中，配制用于静脉内、皮下和/或鞘内施用的制剂。本发明还提供了通过向需要治疗的受试者施用纯化的重组I2S、包含重组I2S的药物组合物或制剂来治疗亨特综合症的方法。

如本文中所用，除非另有明确所指，否则术语“I2S蛋白”、“I2S”、“I2S酶”或语法等同物是指重组I2S蛋白分子的制剂。

如本申请中所用，术语“约”和“大致”可作为等同物使用。具有或不具有约/大致的用于本申请的任何数字涵盖由相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。

本发明的其他特征、目的和优势在下面的详细描述中显而易见。然而，应当理解，所述详细描述，虽然表示本发明的实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，而非限制性的。根据所述详细描述，本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图简述

共同地构成附图的以下描述的图仅用于说明目的而不是为了限制。

图1描述了无血清培养基中产生的重组I2S的示例性纯化方案。

图2描述了与参考I2S相比较的纯化的重组I2S AF的示例性肽图谱。

图3描述了纯化的重组I2S AF的示例性SDS-PAGE(银)分析。

图4描述了通过离子交换色谱评估的纯化的重组I2S AF的示例性电荷特征谱分析。

图5描述了纯化的重组I2S AF的示例性聚糖特征图谱。

图6描述了在病毒灭活UPB步骤后重组I2S的澄清收获物的活性(U/mg)的示例性分析。

图7描述了在病毒灭活UPB步骤后重组I2S的澄清收获物的SE C-HPLC示例性分析。

图8描述了纯化的重组I2S蛋白的利用银染处理的示例性SDS-P AGE。

图9显示相较于参考，从在无血清培养条件(顶图)下生长的I2S-AF 2D细胞系产生的纯化的重组I2S酶的示例性肽图谱。

图10描述了相较于参考，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的I2S-AF 2D和4D细胞系产生的纯化的重组I2S酶产生的示例性聚糖特征谱。

图11描述了相较于I2S参考对照，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的I2S-AF 2D细胞系产生的纯化的重组I2S酶产生的示例性电荷征谱。

定义

为了使本发明更容易被理解，首先定义某些术语。对下列术语和其他术语的附加定义陈述于整个说明书中。

大致或约：如本文中所用，术语“大致”或“约”，如用于一个或多个目标值，意指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外指出或另外地根据上下文显而易见的(除其中这样的数值超过可能值的100％外)，否则术语“大致”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。

生物活性：如本文中所用，短语“生物活性”是指在生物系统(例如，细胞培养物、生物体等)中具有活性的任何物质的特征。例如，当向生物体施用时对该生物体具有生物作用的物质被认为是有生物活性的。生物活性还可通过体外测定(例如，体外酶促测定如硫酸酯释放测定法)来确定。在具体实施方案中，当蛋白质或多肽具有生物学活性时，共有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物活性”部分。在一些实施方案中，从细胞培养系统产生和/或纯化蛋白质，当向受试者施用时，所述蛋白质显示生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要进一步加工以变得具有生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要翻译后修饰，例如但不限于，糖基化(例如，唾液酸化(sialyation))、法尼基化(farnysylation)、切割、折叠、甲酰甘氨酸转化及其组合，以变得具有生物活性。在一些实施方案中，作为前体(proform)形式(即未成熟的形式)产生的蛋白质可能需要额外的修饰来变得具有生物活性。

不依赖于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)：如本文中所用，术语“不依赖于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”是指结合注定被转运至溶酶体的高尔基体中的酸性水解酶前体上的甘露糖-6-磷酸(M6P)标签的细胞受体。除了甘露糖-6-磷酸以外，CI-MPR还结合其它蛋白质，包括IGF-II。CI-MPR也被称为“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“IGF-II受体”或“IGF2受体”。这些术语及其缩写在本文可互换使用。

色谱：如本文中所用，“色谱”是指用于混合物的分离的技术。通常情况下，将混合物溶解在称为“流动相”的流体中，所述流体携带其通过称为“固定相”的保持另一种材料的结构。柱色谱是其中固定床在管(即柱)内的分离技术。

稀释剂：如本文中所用，术语“稀释剂”是指用于复水制剂的制备的药学上可接受的(例如，对于向人施用是安全和无毒的)稀释物质。示例性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐溶液、林格氏溶液(Ringer’ssolution)或葡萄糖溶液。

洗脱：如本文中所用，术语“洗脱”是指通过用溶剂洗涤来从另一种材料提取一种材料的过程。例如，在离子交换色谱中，洗脱是洗涤上样树脂以除去捕获的离子的过程。

洗脱液：如本文中所用，术语“洗脱液”是指通常作为洗脱结果的流动相“载体”与出自色谱的分析材料的组合。

酶替代疗法(ERT)：如本文中所用，术语“酶替代疗法(ERT)”指的是通过提供缺失的酶校正酶缺乏的任何治疗策略。一旦施用，酶被细胞吸收并转运至溶酶体，在溶酶体中酶用于消除因酶缺乏而在溶酶体中积累的物质。通常情况下，为了使溶酶体酶替代疗法有效，将治疗性酶递送至其中表现贮积缺陷的靶组织中适合的细胞中的溶酶体中。

使平衡或平衡：如本文中所用，关于色谱的术语“使平衡”或“平衡”是指用另一种液体使第一液体(例如，缓冲液)平衡，通常以实现液体(例如，缓冲液)的组分的稳定和均衡分布的过程。例如，在一些实施方案中，色谱柱可通过使一个或或多个柱体积的所需液体(例如，缓冲液)通过柱来进行平衡。

提高、增加或减少：如本文中所用，术语“提高”、“增加”或“减少”或语法等同物，指示相对于基线测量，例如在本文中描述的治疗开始之前相同个体中的测量或在本文中描述的治疗不存在的情况下对照个体(或多个对照个体)中的测量的值。“对照个体”是患有与正在治疗的个体相同的溶酶体贮积病形式的个体，所述个体与正在治疗的个体年龄大致相同(以确保被治疗个体与对照个体的疾病分期是可比较的)。

杂质：如本文中所用，术语“杂质”是指有限量的液体、气体或固体内的与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也称为污染物。

接头：如本文中所用，“接头”是指在融合蛋白中，除在天然蛋白质中的特定位置上出现的氨基酸序列外的氨基酸序列，并且其通常被设计成柔性的或插入在两个蛋白质部分之间的结构，例如α-螺旋。接头也称为间隔子。

上样：如本文中所用，术语“上样”是指在色谱中，将含有样品的液体或固体添加至柱。在一些实施方案中，当上样的样品通过柱时，上样至柱上的样品的特定组分随后被捕获。在一些实施方案中，当上样的样品通过柱时，上样至柱上的样品的特定组分未被柱捕获或“流过”柱。

多肽：如本文中所用，“多肽”，一般来说，是通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串。在一些实施方案中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，其每一个通过至少一个肽键连接于其它氨基酸。本领域普通技术人员将理解，多肽有时任选地包括“非天然”氨基酸或然而能够任选地掺入多肽链的其它实体。

汇集：如本文中所用，与色谱相关的术语“汇集”是指将一个或多个已通过柱的液体级分组合在一起。例如，在一些实施方案中，可将一个或多个已通过色谱分离的包含样品的期望组分的级分(例如，“峰级分”)“汇集”一起，产生单个“汇集”级分。

替代酶：如本文中所用，术语“替代酶”是指可用于至少部分地替代待治疗的疾病中的有缺陷或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语“替代酶”是指可用于至少部分地替代待治疗的溶酶体贮积症中的有缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中积累的材料或者能够挽救或改善一种或多种溶酶体贮积病症状。适合于本发明的替代酶包括野生型溶酶体酶或经修饰的溶酶体酶并且可使用重组的和合成的方法来产生或从自然来源纯化而来。替代酶可以是重组的、合成的、基因活化的或天然的酶。

可溶的：如本文中所用，术语“可溶的”是指治疗剂形成均质的溶液的能力。在一些实施方案中，治疗剂在其中被施用和借助其被转运至靶作用位点的溶液中的溶解度足以允许治疗有效量的治疗剂至靶作用位点的递送。若干因素可影响治疗剂的溶解度。例如，可影响蛋白质溶解度的相关因素包括离子强度、氨基酸序列和其它共增溶剂或盐(例如，钙盐)的存在。在一些实施方案中，根据本发明的治疗剂可溶于其相应的药物组合物。

稳定性：如本文中所用的，术语“稳定的”是指治疗剂(例如，重组酶)在长时期内保持其治疗效能(例如，全部或大部分其预期的生物学活性和/或生理化学完整性)的能力。可在长时期内(例如，至少1，3，6，12，18，24，30、36个月或更长时间)评估治疗剂的稳定性和药物组合物维持这样的治疗剂的稳定性的能力。在制剂的情形中，稳定的制剂是如下的制剂，其中的治疗剂在贮存后和在处理(例如冷冻/解冻、机械混合和冷冻干燥)过程中基本上维持其物理和/或化学完整性和生物活性。对于蛋白质稳定性，其也可通过高分子量(HMW)聚集物的形成、酶活性的丧失、肽片段的产生和电荷特征谱的移位来测量。

病毒处理：如本文中所用，术语“病毒处理”是指其中病毒被简单地从样品除去的“病毒去除”，或其中病毒保留在样品中但以非感染性形式存在的“病毒灭活”。在一些实施方案中，病毒去除可以利用除其它以外，纳米过滤和/或色谱技术。在一些实施方案中，病毒灭活可利用除其它以外，溶剂灭活、去垢剂灭活、巴氏消毒法、酸性pH灭活和/或紫外线灭活。

发明详述

本发明除其它事项以外提供了基于包括少于6个色谱步骤的方法的用于纯化用于酶替代疗法的重组I2S蛋白的改进的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用基于阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种的工艺从不纯制剂种纯化重组I2S蛋白的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过进行Q色谱、羟基磷灰石(HA)色谱、SP色谱、苯基色谱来从不纯制剂纯化重组I2S蛋白的方法。本发明还提供了纯化的重组I2S蛋白及使用方法。

在以下小节中进一步详细地描述了本发明的各个方面。小节的使用并不意味着限制本发明。每一个小节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。

重组I2S蛋白

如本文中所用，I2S蛋白是可取代天然存在的艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的至少部分活性或挽救一个或多个与I2S缺乏相关的表型或症状的任何蛋白质或蛋白质的部分。如本文中所用，术语“I2S酶”和“I2S蛋白”以及语法等同物可互换使用。

通常情况下，人I2S蛋白作为前体形式产生。人I2S的前体形式包含信号肽(全长前体的氨基酸残基1-25)、原肽(全长前体的氨基酸残基26-33)和一条链(全长前体的残基34-550)，所述链可被进一步加工成42kDa的链(全长前体的残基的34-455)和14kDa的链(全长前体的残基446-550)。通常情况下，前体形式也称为全长前体或全长I2S蛋白，其含有550个氨基酸。已除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和典型野生型或天然存在的人I2S蛋白的全长前体的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于表1中。信号肽加以下划线。此外，人I2S蛋白同种型a和b前体的氨基酸序列也分别提供于表1中的SEQ ID NO：3和4。

表1.人艾杜糖-2-硫酸酯酶

因此，在一些实施方案中，重组I2S蛋白为成熟人I2S蛋白(SEQ ID NO:1)。如本文中公开的，SEQ ID NO:1代表人I2S蛋白的典型氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S蛋白可以是因在I2S基因的5’UTR内的可选择起始位点上的转录产生的SEQ ID NO:1的剪接同种型和/或变体。在一些实施方案中，重组I2S蛋白可以是成熟人I2S蛋白的同源物或类似物。例如，成熟人I2S蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的I2S蛋白(例如，SEQ ID NO:1)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰成熟人I2S蛋白。因此，在一些实施方案中，重组I2S蛋白与成熟人I2S蛋白(SEQ IDNO:1)大体上同源。在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白与成熟人I2S蛋白(SEQ ID NO:1)大体上同一。在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白包含成熟人I2S蛋白的片段或部分。

或者，重组I2S蛋白是全长I2S蛋白。在一些实施方案中，重组I2S蛋白可以是全长人I2S蛋白的同源物或类似物。例如，全长人I2S蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的全长I2S蛋白(例如，SEQ ID NO:2)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰全长人I2S蛋白。因此，在一些实施方案中，重组I2S蛋白与全长人I2S蛋白(SEQ ID NO:2)大体上同源。例如，重组I2S蛋白可具有与SEQ IDNO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白与SEQ ID NO:2大体上同一。例如，重组I2S蛋白可具有与SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白包含全长人I2S蛋白的片段或部分。如本文中所用，全长I2S蛋白通常包含信号肽序列。

在一些实施方案中，重组I2S蛋白为人I2S同种型a蛋白。在一些实施方案中，重组I2S蛋白可以是人I2S同种型a蛋白的同源物或类似物。例如，人I2S同种型a蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的人I2S同种型a蛋白(例如，SEQ ID NO:3)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰人I2S同种型a蛋白。因此，在一些实施方案中，重组I2S蛋白与人I2S同种型a蛋白(SEQ ID NO:3)大体上同源。例如，重组I2S蛋白可具有与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白与SEQ ID NO:3大体上同一。例如，重组I2S蛋白可具有与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白包含人I2S同种型a蛋白的片段或部分。如本文中所用，人I2S同种型a蛋白通常包含信号肽序列。

在一些实施方案中，重组I2S蛋白为人I2S同种型b蛋白。在一些实施方案中，重组I2S蛋白可以是人I2S同种型b蛋白的同源物或类似物。例如，人I2S同种型b蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的人I2S同种型b蛋白(例如，SEQ ID NO:4)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰人I2S同种型b蛋白。因此，在一些实施方案中，重组I2S蛋白与人I2S同种型b蛋白(SEQ ID NO:4)大体上同源。例如，重组I2S蛋白可具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白与SEQ ID NO:4大体上同一。例如，重组I2S蛋白可具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白包含人I2S同种型b蛋白的片段或部分。如本文中所用，人I2S同种型b蛋白通常包含信号肽序列。

人I2S蛋白的同源物或类似物可按照对于本领域普通技术人员来说是已知的用于改变多肽序列的方法，例如见于汇编此类方法的参考资料中的方法来制备。在一些实施方案中，氨基酸的保守取代包括在下列组内的氨基酸间的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。在一些实施方案中，“保守氨基酸取代”是指不改变在其中进行氨基酸取代的蛋白质的相关电荷或大小特征的氨基酸取代。

在一些实施方案中，重组I2S蛋白可包含结合于靶细胞表面上的受体以促进细胞摄取和/或溶酶体靶向的部分。例如，这样的受体可以是不依赖于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)，其结合甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。此外，CI-MPR也结合其它蛋白质，包括IGF-Ⅱ。在一些实施方案中，重组I2S蛋白在蛋白质表面上包含M6P残基。具体地，重组I2S蛋白可包含具有更高的针对CI-MPR的结合亲和力的二磷酸化寡糖。在一些实施方案中，适合的酶包含每种酶高达约平均约至少20％的二磷酸化寡糖。在其它实施方案中，适合的酶可包含每种酶约10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％的二磷酸化寡糖。二磷酸化寡糖

在一些实施方案中，可将重组I2S酶融合于能够结合靶细胞表面上的受体的溶酶体靶向部分。适合的溶酶体靶向部分可以是IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段(例如，包括那些具有与野生型成熟人IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列的肽)。可将溶酶体靶向部分在N末端、C末端或内部缀合或融合于I2S蛋白或酶。

重组I2S蛋白的产生

本发明可用于纯化通过各种方法产生的重组I2S蛋白。例如，可通过利用经工程化以表达I2S编码核酸的宿主细胞系统重组产生I2S蛋白。或者，可通过激活内源性I2S基因产生I2S蛋白。

预期本发明可用于纯化使用各种表达系统产生的重组I2S蛋白。适当的表达系统包括例如蛋、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中产生I2S酶。可按照本发明使用的哺乳动物细胞的非限定性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC No:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell,Leiden,The Netherlands)；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(被亚克隆来用于在悬浮培养中生长的HEK293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如，HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK21，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。

在一些实施方案中，根据本发明的发明方法用于纯化从人细胞(例如，HT1080)产生的重组I2S酶。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法用于纯化从CHO细胞产生的重组I2S酶。

通常情况下，经工程化以表达重组I2S的细胞可包含编码本文中描述的重组I2S蛋白的转基因。应当理解，编码重组I2S的核酸可包含调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于表达重组I2S的其它适当的序列。通常情况下，将编码区与这些核酸组件的一个或多个可操作地连接。

“调控序列”通常是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响连接的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。有时，“调控序列”也称为“基因控制序列”。

“启动子”通常是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3'。启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后一元件通常称为增强子。相应地，“增强子”为可刺激启动子活性，并且可以为启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的核苷酸序列。启动子可整体上来源于天然基因或由来源于天然发现的不同启动子的不同元件组成或甚至包含合成核苷酸区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或响应不同的环境条件来指导基因的表达。

“3’非编码序列”通常是指位于编码序列下游的核苷酸序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响聚腺苷酸段至mRNA前体的3'末端的添加。

“翻译前导序列”或“5’非编码序列”通常是指位于基因的启动子序列与编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。

通常情况下，术语“有效连接的”或“可操作地连接的”是指两个或更多个核酸片段在单个核酸片段上的连接，以便一个核酸片段的功能受另一个核酸片段的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制之下)时，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义定向可操作地连接于调控序列。

转基因的编码区可包含一个或多个沉默突变来优化用于特定细胞类型的密码子选择。例如，可优化I2S转基因的密码子以用于在脊椎动物细胞中表达。在一些实施方案中，可优化I2S转基因的密码子以用于在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，可优化I2S转基因的密码子以用于在人细胞中表达。

任选地，构建体可包含另外的组件例如下列组件的一个或多个：剪接位点、增强子序列、在适当的启动子控制下的可选择标记基因、在适当的启动子控制下的可扩增标志基因和基质附着区(MAR)或本领域中已知的其它元件，所述元件增强其所被插入的区域的表达。

一旦转染或转导入宿主细胞后，适合的载体可在染色体外(附加型地)表达或整合进入宿主细胞的基因组。

重组I2S蛋白的激活

通常情况下，通过保守半胱氨酸(对应于成熟人I2S的氨基酸59)至甲酰甘氨酸(也称为2-氨基-3-氧代丙酸或氧代-丙氨酸)的翻译后修饰来激活重组I2S酶。这样的翻译后修饰可通过称为甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的酶来进行。因此，在一些实施方案中，在也表达FGE蛋白的细胞中产生重组I2S酶。在具体实施方案中，在具有增加的或增强的FGE蛋白的表达的细胞中产生重组I2S酶。例如，细胞可经工程化以过表达与重组I2S组合的FGE，以有利于具有高水平的活性酶的I2S制剂的产生。在一些实施方案中，通过使用标准重组技术表达(例如，过表达)外源FGE来实现FGE的过表达。在一些实施方案中，通过例如激活或增强内源FGE基因的启动子激活或增强内源FGE的表达来实现FGE的过表达。在一些情况下，通过具有对应于内部核糖体进入位点的序列的核酸(例如，间隔子序列)来连接编码重组I2S的核酸与编码重组FGE蛋白的核酸。

具有将半胱氨酸转化成甲酰甘氨酸的能力的任何FGE可用于本发明。用于FGE蛋白的示例性核酸和氨基酸序列公开于US2004-0229250，将与这样的序列相关的整个内容和序列本身通过引用整体并入本文中。应当理解，编码重组FGE的核酸可包含调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于表达FGE的其它适当的序列。通常情况下，将编码区与这些核酸组件的一个或多个可操作地连接。

细胞培养基和条件

各种细胞培养基和条件可用于产生重组I2S蛋白。例如，可在含血清或无血清的培养基中产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，在无血清培养基中产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，在无动物的培养基，即缺乏动物来源组分的培养基中产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，在化学成分确定的培养基中产生重组I2S蛋白。如本文中所用，术语“化学成分确定的营养培养基”是指基本上所有的化学成分是已知的培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的培养基不含动物来源的组分如血清、血清来源的蛋白质(例如，白蛋白或胎球蛋白)，以及其他组分。在一些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质(例如，蛋白质生长因子或细胞因子)。在一些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质水解产物。在其他情况下，化学成分确定的营养培养基是不含蛋白质的培养基，即，不包含蛋白质、水解产物或未知组成的组分的无血清培养基。

在一些实施方案中，化学成分确定的培养基可补充一种或多种动物来源组分。这样的动物来源的组分包括但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清、人血清和血清来源的蛋白质例如白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。

各种细胞培养条件可以用于大规模产生重组I2S蛋白，包括但不限于滚瓶培养、生物反应器分批培养和生物反应器补料分批培养。在一些实施方案中，重组I2S蛋白是由悬浮培养的细胞产生的。在一些实施方案中，重组I2S蛋白是通过贴壁细胞产生的。

示例性细胞培养基和培养条件在实施例部分中进行了描述。用于产生重组I2S蛋白的另外的示例性方法和组合物在与其同一日提交的标题为“用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法和组合物(Methods and Compositions for Producing RecombinantIduronate-2-Sulfatase)”的临时申请中进行了描述，所述临时申请的全部公开内容通过引用并入本文。

重组I2S蛋白的纯化

在一些实施方案中，本发明提供了使用基于阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种的工艺从不纯制剂纯化重组I2S蛋白的方法。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括少于6个(例如，少于5个、少于4个或少于3个)色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括2、3、4或5个色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括4个色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法按该顺序包括阴离子交换色谱、混合模式色谱、阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱。

不纯制剂

如本文中所用，不纯制剂可以是任何生物材料，包括含有重组I2S蛋白的未处理的生物材料。例如，不纯制剂可以是含有从产生I2S蛋白的细胞(例如，哺乳动物细胞)分泌的重组I2S蛋白的未处理的细胞培养基或含有I2S蛋白的原始细胞裂解物。在一些实施方案中，不纯制剂可以是部分处理的细胞培养基或细胞裂解物。例如，可浓缩、稀释、通过病毒灭活、病毒处理或病毒去除处理细胞培养基或细胞裂解物。在一些实施方案中，病毒去除可利用除其它以外的纳米过滤和/或色谱技术。在一些实施方案中，病毒灭活可利用除其它以外的溶剂灭活、去垢剂灭活、巴氏消毒法、酸性pH灭活和/或紫外灭活。还可利用蛋白酶、DNA酶和/或RNA酶处理细胞培养基或细胞裂解物以降低宿主细胞蛋白质和/或核酸(例如，DNA或RNA)的水平。在一些实施方案中，可冷冻未处理的或部分处理的生物材料(例如，细胞培养基或细胞裂解物)，并将其于期望的温度(例如，2-8℃、-4℃、-25℃、-75℃)下贮存一段时间，随后解冻用于纯化。如本文中所用，不纯制剂也称为起始材料或填料。

阴离子交换色谱

在一些实施方案中，提供的用于纯化重组I2S的方法包括阴离子交换色谱。简言之，阴离子交换色谱是依赖于带负电荷的化合物与带正电荷的树脂之间的电荷-电荷相互作用的色谱技术。在一些实施方案中，阴离子交换色谱为强阴离子交换色谱。在一些实施方案中，将阴离子交换色谱用作治疗性蛋白(例如，重组I2S)的第一纯化步骤。

示例性阴离子交换树脂包括但不限于季胺树脂或“Q–树脂”(例如，Capto^TM-Q、QAE)；二乙基氨基乙烷(DEAE)树脂(例如，DEAE 苯甲酰化萘酰化DEAE、二乙基氨基乙基)；树脂；树脂；树脂(例如，IRA–67、强碱性、弱碱性)、考来烯胺树脂、树脂(例如，SAX–10、WAX–10、WCX–10)；树脂(例如，TSKgel DEAE–NPR；TSKgel DEAE–5PW)；和树脂。在某些实施方案中，阴离子交换树脂为Q树脂。

用于阴离子交换色谱的典型流动相包括相对极性溶液，例如水、乙腈、有机醇例如甲醇、乙醇和异丙醇或包含2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)的溶液。因此，在某些实施方案中，流动相包含约0％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的极性溶液。在某些实施方案中，流动相在分离过程中的任意给定的时间包含约1％至约100％、约5％至约95％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的极性溶液。

一般地，流动相包含盐。例如，盐(例如，氯化钠)可从阴离子交换柱(例如，抗衡离子为氯离子并且其用于与靶蛋白质交换，随后所述靶蛋白质被释放)洗脱结合的蛋白质。在一些实施方案中，流动相包含约0至约1.0M，例如约0至约0.8M、约0至约0.6M、约0至约0.5M、约0至约0.4M、约0.05M至约0.50M、约0.10M至约0.45M、约0.10M至约0.40M或约0.15M至约0.40M的盐浓度。在一些实施方案中，流动相包含大致0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1.0M的盐浓度。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度是梯度(例如，线性或非线性的梯度)。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度是恒定的。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度可逐步增加或减小。

通常情况下，对流动相进行缓冲。在某些实施方案中，不对流动相进行缓冲。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约14的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约10的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约7的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约6.5的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH。

在一些实施方案中，在上样至阴离子交换色谱柱(例如，Q柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5的pH和约2mS/cm、4mS/cm、6mS/cm、8mS/cm、10mS/cm、12mS/cm、14mS/cm、16mS/cm、18mS/cm或20mS/cm的电导率。可使用醋酸钠(例如，1M)调整pH，以及可使用氯化钠(例如，5M)调整电导率。上样后，可使用pH为约5.0-7.5(例如，约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5)的包含在约140mM至约200mM(例如，约140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗涤缓冲液洗涤阴离子交换色谱柱。可使用包含线性NaCl梯度的洗脱缓冲液洗脱阴离子交换色谱柱。适合的示例性线性NaCl梯度可包含约0-500mMNaCl(例如，约0-400mM、约0-350mM、约0-300mM、约50-500mM、约150-500mM、约150-450mM、约150-400mM)的范围。

阳离子交换色谱

在一些实施方案中，提供的用于纯化重组I2S的方法包括阳离子交换色谱。简言之，阳离子交换色谱是依赖于带正电荷的化合物与带负电荷的树脂之间的电荷-电荷相互作用的色谱技术。在一些实施方案中，阳离子交换色谱是强阳离子交换色谱。

通常用强或弱阳离子交换柱实施阳离子交换色谱，所述色谱柱包含锍离子或具有弱阳离子交换剂(通常具有羧甲基(CM)或羧化物(CX)官能团)。许多适合的阳离子交换树脂在本领域是已知的，并且是商购可得的，并且包括但不限于CM 树脂；树脂；树脂(例如，IRA120)；树脂(例如，ScX–10、WCX–10、WCX–10)；树脂(例如，TSKgel Bio Assist S；TSKgel SP-2SW、TSKgel SP–5PW；TSKgel SP-NPR；TSKgel SCX；TSKgel SP-STAT；TSKgel CM-5PW；TSKgel OApak-A；TSKgel CM-2SW、TSKgel CM-3SW和TSKgel CM-STAT)；以及A 树脂。在某些实施方案中，阴离子交换树脂为SP-Sepharose r

用于阳离子交换色谱的典型流动相包含相对极性的溶液，例如水、乙腈、有机醇例如甲醇、乙醇和异丙醇或包含2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)的溶液。因此，在某些实施方案中，流动相包含约0％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的极性溶液。在某些实施方案中，流动相在分离过程中的任意给定的时间包含约1％至约100％、约5％至约95％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的极性溶液。

通常地，流动相包含盐。例如，盐(例如，氯化钠、磷酸钠等)可从阳离子交换柱(例如，抗衡离子为钠离子，并且其与靶蛋白质交换，随后所述蛋白质被释放)洗脱结合的蛋白质。在一些实施方案中，流动相包含约0至约1.0M，例如约0至0.8M、约0至约0.6M、约0至约0.5M、约0至约0.4M、约0.05M至约0.50M、约0.10M至约0.45M、约0.10M至约0.40M或约0.15M至约0.40M的盐浓度。在一些实施方案中，流动相包含大致0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1.0M的盐浓度。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度是梯度(例如，线性或非线性的梯度)。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度是恒定的。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度可逐步增加或减小。

通常情况下，对流动相进行缓冲。在某些实施方案中，不对流动相进行缓冲。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约14的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约10的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约7的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约6.5的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH。

在一些实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱(例如，SP柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约1mS/cm至20mS/cm(例如，约1mS/cm至15mS/cm、约1mS/cm至10mS/cm、约1mS/cm至8mS/cm、约1mS/cm至6mS/cm、约1mS/cm至4mS/cm、约2mS/cm至4mS/cm)的范围内的电导率。在具体实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱(例如，SP柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约2mS/cm至4mS/cm(例如，2、2.5、3、3.5或4mS/cm)的范围内的电导率。可通过用H₂O以例如1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、2.0:1、2.5:1、3.0:1、4.0:1、5.0:1或10:1的比率稀释不纯制剂或中间洗脱液或过柱液来调整电导率。还可通过渗滤至期望的缓冲液来调整电导率。在一些实施方案中，在约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)的pH下运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，利用包含在约0.01M至约0.1M(例如，约0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M或0.1M)的范围内的磷酸盐(例如，NaPO4)浓度的缓冲液运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，合适的pH为约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)。

混合模式色谱

羟基磷灰石色谱(HA)被认为是“假亲和”色谱或“混合模式”离子交换，并且可按照本发明使用。羟基磷灰石是用于生物分子的分级分离和纯化的磷酸钙的独特形式。在一些情况下，可使用结晶羟基磷灰石，尽管晶体的脆性可限制流速和/或柱寿命。两种类型的化学纯陶瓷羟基磷灰石，CHT陶瓷羟基磷灰石I型和II型，是多孔的、球状的，并且可在高流速和压力下使用。I型通常具有高蛋白质结合能力，而II型通常具有较低的对于蛋白质的结合能力。通常地，羟基磷灰石的分子式为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂(Kawasaki,等人1985)。官能团包括带正电荷的晶体钙离子对(C-位点)和6个与三个一组的晶体磷酸盐缔合的带负电荷的氧原子的簇(P-位点)。C-位点、P-位点和羟基以固定模式分布在晶体表面上，通常导致与蛋白质和其它分子的复杂相互作用。

可将样品上样至中性或近中性pH的低离子强度磷酸盐缓冲液(例如，1-10mM磷酸钠或磷酸钾)中的HA柱上。在一些实施方案中，在上样至混合模式色谱柱(例如，HA柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约0.001M至约0.01M(例如，约0.001M、0.002M、0.003M、0.004M、0.005M、0.006M、0.007M、0.008M、0.009M或0.01M)的范围内的磷酸盐(例如，NaPO4)浓度和约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)的pH。通常用具有可与上样缓冲液的浓度相当的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤上样的HA柱。在一些实施方案中，在上样后，用中性或近中性pH的包含磷酸盐(例如，1-10mM磷酸钠或磷酸钾)的洗涤缓冲液洗涤混合模式色谱柱(例如，HA柱)。例如，适合的洗涤缓冲液可具有约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM的磷酸盐浓度。在一些实施方案中，可期望增加洗涤缓冲液中的磷酸盐的量以产生更严格的洗涤条件。预期I2S蛋白表面上的M6P水平，具体为二-M6P水平对于溶酶体靶向是重要的。洗涤缓冲液中增加的磷酸盐浓度可选择性地将具有高水M6P具体为二-M6P的I2S蛋白保留在HA柱上。因此，在一些实施方案中，期望的洗涤缓冲液可具有为或大于10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM的磷酸盐浓度。在一些实施方案中，用具有在约10-20mM(例如，约10-18mM、10-16mM、10-15mM、12-20mM、14-18mM、14-16mM)的范围内的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤上样的混合模式色谱柱(例如，HA柱)。在一些实施方案中，利用具有为或大于10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤上样的混合模式色谱柱(例如，HA柱)。

通常用梯度磷酸盐缓冲液实现从HA柱的洗脱。例如，适合的洗脱缓冲液可具有约1-400mM(例如，1-300mM、1-200mM、1-150mM、1-100mM、10-350mM、10-300mM、10-250mM、10-200mM、10-150mM、10-140mM、10-130mM、10-120mM、10-110mM、10-100mM、10-90mM、10-80mM、10-70mM、10-60mM、10-50mM)的磷酸钠的磷酸盐梯度。在一些实施方案中，通过逐步增加洗脱缓冲液中的磷酸盐浓度来实现从HA柱的洗脱。在一些实施方案中，逐步洗脱缓冲液可具有选自10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM的磷酸盐浓度。在一些实施方案中，通过具有在约50mM至约150mM的范围内的磷酸盐(例如，磷酸钠)浓度(例如，选自约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM及其组合的磷酸盐(例如，磷酸钠)浓度))的洗脱缓冲液实现从混合模式色谱柱(例如，HA柱)的洗脱。

应理解，用于HA色谱的条件的许多不同组合是已知的并且可用于调整参数以适合用于特定目标蛋白质(例如，重组I2S)。

疏水相互作用色谱

疏水相互作用色谱(HIC)是使用疏水性的性质将蛋白质彼此分离的分离技术。在该类型的色谱中，将疏水基团例如苯基、辛基或丁基连接于固定柱。通过在表面上具有疏水氨基酸侧链的柱的蛋白质能够与柱上的疏水基团相互作用或与其结合。HIC柱是已知的，并且包括例如苯基琼脂糖

HIC分离通常使用离子交换色谱中使用的那些条件的相反条件来设计。一般地，最初将具有高离子强度的缓冲液，通常为硫酸铵施加到柱。缓冲液中的盐减弱样品溶质的溶剂化作用，从而随着溶剂化减弱，开始暴露的疏水区域被介质吸附。固定相通常被设计来与其它分子形成疏水性相互作用。然而，这些相互作用在水中通常太弱，以致于向缓冲液中添加盐(例如，Na₂SO₄、K₂SO₄、(NH₄)₂SO₄、NaCl、NH₄Cl、NaBr和NaSCN)导致疏水性相互作用。在一些实施方案中，流动相包含约0.1M至约3.0M，例如，约0.1M至约1.5M，约0.2M至约0.8M或约0.3M至约0.5M的盐浓度。

在某些实施方案中，对流动相进行缓冲。在某些实施方案中，不对流动相进行缓冲。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约14的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约10的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5至约7的pH。在某些实施方案中，将流动相缓冲至约5.0的pH。

在一些实施方案中，在上样至疏水相互作用色谱柱(例如，苯基柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至pH为约4.5-6.0(例如，约4.5、5.0、5.5或6.0)的在约0.5M至约2.0M(例如，约0.5M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2.0M)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度。上样后，可使用pH为约4.5-6.0(例如，约4.5、5.0、5.5或6.0)的包含在约0.5M至约2.0M(例如，约0.5M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2.0M)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗涤缓冲液洗涤疏水相互作用色谱柱。在一些实施方案中，使用pH为约4.5-6.0(例如，约4.5、5.0、5.5或6.0)的包含在约0.1M至约0.5M(例如，约0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗脱缓冲液洗脱疏水相互作用色谱柱。

纯化的I2S蛋白的表征

可使用各种方法表征纯化的重组I2S蛋白。

纯度

纯化的重组I2S蛋白的纯度通常通过存在于终产物中的各种杂质(例如，宿主细胞蛋白或宿主细胞DNA)的水平来测量。例如，宿主细胞蛋白(HCP)的水平可通过ELISA或SDS-PAGE来测量。在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白包含少于150ng HCP/mg的I2S的蛋白(例如，少于140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、30、20、10ng HCP/mg的I2S蛋白)。在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白，当经历利用银染的SDS-PAGE时，不具有拥有大于0.05％、0.01％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％的测定对照的强度的新条带。可使用各种测定对照，特别是可被管理机构例如FDA接受的那些测定对照。

比活性

纯化的重组I2S蛋白还可通过评价功能和/或生物活性来表征。重组I2S组合物的酶活性可使用本领域已知的方法来测定。通常情况下，该方法包括检测硫酸酯从合成底物的去除，这称为硫酸酯释放测定。酶活性测定的一个实例牵涉离子色谱的使用。该方法定量通过重组I2S从底物酶促释放的硫酸根离子的量。底物可以是天然底物或合成底物。在一些情况下，底物为硫酸肝素(例如，肝素二糖)、硫酸皮肤素或其功能等同物。通常情况下，释放的硫酸根离子通过具有电导率检测器的离子色谱进行分析。在本实例中，结果表示为U/mg蛋白质，其中1个单位被定义为每小时从底物释放1微摩尔硫酸根离子所需的酶的量。在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白具有在约0-100U/mg、约10-100U/mg、约10-80U/mg、约20-80U/mg、约20-70U/mg、约20-60U/mg、约20-50U/mg、约30-100U/mg、约30-90U/mg、约30-80U/mg、约30-70U/mg、约30-60U/mg、约40-100U/mg、约40-90U/mg、约40-80U/mg、约40-70U/mg、约40-60U/mg的范围内的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测量的。在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白具有至少约5U/mg、约10U/mg、约15U/mg、约20U/mg、约25U/mg、约30U/mg、约35U/mg、约40U/mg、约45U/mg、约50U/mg、约55U/mg、约60U/mg、约65U/mg、约70U/mg、约75U/mg、约80U/mg、约85U/mg、约90U/mg、约95U/mg或约100U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定法测量的。下文中提供了用于使用肝素二糖作为底物进行体外硫酸酯释放活性测定的示例性条件。通常情况下，该测定测量I2S从天然来源的底物肝素二糖释放硫酸根离子的能力。所释放的硫酸酯可通过离子色谱法来进行定量。在一些情况下，离子色谱法配备有电导率检测器。作为一个非限制性实例，首先将样品缓冲交换至10mM乙酸钠(pH 6)，以解除配制缓冲液中磷酸根离子产生的抑制作用。随后用反应缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.4)将样品稀释至0.075mg/ml，并在37℃于30μL反应体积中以0.3μg I2S/100μg底物的酶与底物比与肝素二糖温育2小时。然后通过在100℃加热3分钟来终止反应。使用具有IonPac AG18保护柱的DionexIonPac AS18分析柱进行分析。以1.0mL/分钟将等度方法与30mM氢氧化钾一起使用，持续15分钟。从在1.7至16.0纳摩尔的范围内的硫酸酯标准的线性回归分析计算由I2S样品释放的硫酸酯的量。该报告值表达为单位每mg蛋白质，其中1个单位定义为每小时释放的1微摩尔的硫酸酯，并且蛋白质浓度通过A280测量来测定。

在一些实施方案中，还可使用本领域已知的各种其它方法，例如测量4-甲基伞形酮基-硫酸酯至硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)的水解的4-MUF测定来测定重组I2S蛋白的酶活性。在一些实施方案中，如通过体外4-MUF测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性为至少约0.5U/mg、1.0U/mg、1.5U/mg、2U/mg、2.5U/mg、3U/mg、4U/mg、5U/mg、6U/mg、7U/mg、8U/mg、9U/mg、10U/mg、12U/mg、14U/mg、16U/mg、18U/mg或20U/mg。在一些实施方案中，如通过体外4-MUF测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性在约0-50U/mg(例如，约0-40U/mg、约0-30U/mg、约0-20U/mg、约0-10U/mg、约2-50U/mg、约2-40U/mg、约2-30U/mg、约2-20U/mg、约2-10U/mg、约4-50U/mg、约4-40U/mg、约4-30U/mg、约4-20U/mg、约4-10U/mg、约6-50U/mg、约6-40U/mg、约6-30U/mg、约6-20U/mg、约6-10U/mg)的范围内。下文中提供了用于进行体外4-MUF测定的示例性条件。通常情况下，4-MUF测定测量I2S蛋白将4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)水解成硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)的能力。1毫单位的活性被定义为在37℃于1分钟内将1纳摩尔的4-MUF-SO₄转化成4-MUF所需的酶的量。通常情况下，通过具有已知活性的I2S测试样品产生的平均荧光单位(MFU)可用于产生标准曲线，该曲线可被用来计算目标样品的酶活性。随后可通过将酶活性除以蛋白质浓度来计算比活性。

在任一实例中，重组I2S组合物的蛋白质浓度可通过本领域已知的用于测定蛋白质浓度的任何适合的方法来测定。在一些情况下，蛋白质浓度通过紫外线吸收测定来测定。这样的吸收测定法通常在约280nm的波长(A₂₈₀)下进行。

电荷特征谱

纯化的重组I2S可通过与蛋白质相关的电荷特征谱来表征。通常情况下，蛋白质电荷特征谱反映了通常存在于蛋白质表面上的残基侧链电荷的模式。电荷特征谱可通过对蛋白质进行离子交换(IEX)色谱(例如，HPLC)测定来测定。在一些实施方案中，“电荷特征谱”是指一组代表在向柱添加包含交换离子的流动相后的某个时间点上从离子交换柱洗脱的蛋白质的量。

通常情况下，适合的离子交换柱为阴离子交换柱。例如，电荷特征谱可通过使用高效液相色谱(HPLC)系统的强阴离子交换(SAX)色谱来测定。一般而言，重组I2S吸附至强阴离子交换柱的固定的正电荷上，并以预定流速使用流动相的递增离子强度的梯度与它们与带正电荷的柱的离子相互作用的强度成比例地从柱洗脱重组I2S种类。带较多负电荷的(较酸性的)I2S种类比带较少负电荷的(较不酸性的)I2S种类较晚洗脱出来。洗脱物中蛋白质的浓度通过紫外线吸收(在280nm)来检测。

在一些实施方案中，重组I2S在约pH 8.0下于20mM TRIS-HCl中吸附至Mini Q PE柱的固定正电荷上，并以0.8ml/分钟的流速使用由20mM TRIS-HCL、1M氯化钠，pH 8.0组成的流动相的递增离子强度的梯度与它们与带正电荷的柱的离子相互作用的强度成比例地从柱洗脱重组I2S种类。

在一些实施方案中，可通过从HPLC柱洗脱后吸收单位对时间的色谱图描述电荷特征谱。色谱图可包含一组一个或多个峰，其中组中的每一个峰鉴定组合物的具有相似表面电荷的重组I2S的亚群。

在一些实施方案中，纯化的I2S蛋白组合物在其电荷特征谱中显示至少6个峰。I2S的示例性电荷特征谱描述于实施例部分和图11中。如图11中显示的，按递增的负电荷和递减的对色谱图的总峰面积的贡献标记(A至F)6个峰。在一些实施方案中，取决于蛋白质表面上负电荷或正电荷的量，纯化的重组I2S组合物的电荷特征谱包含不同数目、尺寸、形状或时间间隔的峰。在一些实施方案中，重组I2S组合物具有少于6个(例如，少于5、4、3或2个)峰的电荷特征谱。在一些实施方案中，重组I2S的电荷特征谱可具有5、4、3、2或1个峰。例如，峰A、B、C、D、E和F的任何1、2、3、4或5个峰可以不存在于纯化的重组I2S蛋白组合物中或在所述组合物中减少。通常情况下，如果存在更少的峰，则电荷特征谱被认为更均一。

聚糖图谱

在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白的特征可在于它们的蛋白聚糖组成，通常地称为聚糖图谱。不希望受任何理论束缚，据认为聚糖连接与分支结构的形状和复杂度一起可影响体内清除、溶酶体靶向、生物利用度和/或效力。

通常情况下，聚糖图谱可通过酶促消化和随后色谱分析来测定。各种酶可用于酶促消化，包括但不限于适合的糖基化酶、肽酶(例如，内肽酶、外肽酶)、蛋白酶和磷酸酶。在一些实施方案中，适合的酶为碱性磷酸酶。在一些实施方案中，适合的酶为神经氨酸酶。聚糖(例如，磷聚糖)可通过色谱谱分析来检测。例如，磷聚糖可通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAE-PAD)或尺寸排阻高效液相色谱(HPLC)来检测。由聚糖图谱上的每一个峰代表的聚糖(磷聚糖)的量可按照本领域已知的和本文中公开的方法，使用聚糖(例如，磷聚糖)的标准曲线来计算。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化的I2S显示聚糖图谱，该图谱包含7个分别指示中性(峰组1)、单唾液酸化(峰组2)、二唾液酸化(峰组3组)、单磷酸化(峰组4)、三唾液酸化(峰组5)、四唾液酸化(峰组6)和二磷酸化(峰组7)I2S蛋白的峰组。I2S的示例性聚糖图谱描述于图10中。在一些实施方案中，纯化的重组I2S具有少于7个峰组的聚糖图谱(例如，具有6、5、4、3或2个峰组的聚糖图谱)。在一些实施方案中，纯化的重组I2S具有拥有超过7个峰组(例如，8、9、10、11、12或更多个)的聚糖图谱。

对应于每一个峰组的聚糖的相对量可基于相对于预定参考标准中的相应峰组面积的峰组面积来测定。在一些实施方案中，峰组1(中性)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约40-120％(例如，约40-115％、约40-110％、约40-100％、约45-120％、约45-115％、约45-110％、约45-105％、约45-100％、约50-120％、约50-110％)的范围内的峰组面积。在一些实施方案中，峰组2(单唾液酸化的)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约80-140％(例如，约80-135％、约80-130％、约80-125％、约90-140％、约90-135％、约90-130％、约90-120％、约100-140％)的范围内的峰组面积。在一些实施方案中，峰组3(二唾液酸化)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约80-110％(例如，约80-105％、为约80-100％、约85-105％、约85-100％)的范围内的峰组面积。在一些实施方案中，峰组4(单磷酸化)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约100-550％(例如，约100-525％，约100-500％，约100-450％，约150-550％，约150-500％，约150-450％，约200-550％，约200-500％，约200-450％，约250-550％，约250-500％，约250-450％或约250-400％)的范围内的峰组面积。在一些实施方案中，峰组5(三唾液酸化)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约70-110％(例如，约70-105％，约70-100％，约70-95％，约70-90％，约80-110％，约80-105％，约80-100％或约80-95％)的范围内的峰组面积。在一些实施方案中，峰组6(四唾液酸化的)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约90-130％(例如，约90-125％，约90-120％，约90-115％，约90-110％，约100-130％，约100-125％或约100-120％)的范围内的峰组面积。在一些实施方案中，峰组7(二磷酸化)可具有相对于参考标准中的对应峰组面积在约70-130％(例如，约70-125％，约70-120％，约70-115％，约70-110％，约80-130％，约80-125％，约80-120％，约80-115％，约80-110％，约90-130％，约90-125％，约90-120％、约90-115％，约90-110％)的范围内的峰组面积。聚糖图谱的各种参考标准在本领域是已知的并且可以用于实施本发明。通常情况下，峰组7(二磷酸化)对应于纯化的重组I2S蛋白的表面上的二M6P的水平。

预期纯化的I2S的糖基化模式影响溶酶体靶向。各种体外细胞摄取测定在本领域是已知的并且可以用来实施本发明。例如，为了评估M6P受体对I2S的摄取，使用在其表面上表达M6P受体的人成纤维细胞进行细胞摄取测定。I2S的内化量可通过ELISA法进行测定。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白的特征在于大于70％、75％、80％、85％、90％、95％的细胞摄取，如通过体外摄取测定所测定的。

肽图谱

在一些实施方案中，肽图谱可用于表征氨基酸组成、翻译后修饰和/或细胞处理；例如信号肽的切割、甲酰甘氨酸转化和/或糖基化。通常情况下，重组蛋白可以被分解成离散的肽片段(通过受控或随机断裂)，以产生模式或肽图谱。在一些情况下，可使纯化的I2S蛋白首先经历酶促消化，随后进行解析分析。消化可使用肽酶、糖苷水解酶、磷酸酶、脂肪酶或蛋白酶和/或其组合来进行，随后进行解析分析。肽的结构组成可使用本领域中公知的方法来确定。示例性的方法包括，但不限于，质谱、核磁共振(NMR)或HPLC。

甲酰甘氨酸转化百分比

肽图谱分析可用于测定FGly转化百分比。如上所讨论的，I2S激活需要通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)进行的半胱氨酸(对应于成熟人I2S的位置59)至甲酰甘氨酸的转化，如下所示的：

因此，可使用下列公式计算甲酰甘氨酸转化的百分比(％FG)：

为了计算％FG，可使用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或糜蛋白酶)将重组I2S蛋白消化成短肽。可使用例如尺寸排阻高效液相色谱(HPLC)分离和表征短肽。可表征包含对应于成熟人I2S的位置59的位置的肽以确定位置59上的Cys相较于对照(例如，无FGly转化的I2S蛋白或具有100％FGly转化的I2S蛋白)是否被转化成FGly。包含FGly的蛋白质的量(对应于活性I2S分子的数目)以及具有FGly和Cys的肽的总量(对应于总的I2S分子的数目)可基于相应的峰面积来测定，并且可计算反映％FG的比率。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白具有至少约70％(例如，至少约77％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的对应于人I2S(SEQ ID NO:1)的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白具有大体100％的对应于人I2S(SEQ ID NO:1)的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

唾液酸含量

在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白的特征大于它们的唾液酸组成。不希望受理论的束缚，预期蛋白质上的唾液酸残基可通过存在于肝细胞上的无唾液酸糖蛋白受体阻止、减少或抑制其快速体内清除。因此，认为具有相对高的唾液酸含量的重组蛋白通常具有相对长的体内循环时间。

在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白的唾液酸含量可以使用本领域中公知的方法来确定。例如，重组蛋白的I2S的唾液酸含量可通过酶促消化和随后的色谱分析来确定。酶消化可以使用任何适合的唾液酸酶来完成。在一些情况下，消化是由糖苷水解酶进行的，如神经氨酸酶。唾液酸可通过色谱分析例如具有脉冲安培检测(HPAE-PAD)的高效阴离子交换色谱来检测。重组I2S组合物中的唾液酸的量可按照本领域中已知的和本文中公开的方法，使用唾液酸的标准曲线来计算。

在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白的唾液酸含量可以大于16mol/mol。在唾液酸含量的上下文中，单位“mol/mol”是指每摩尔酶的唾液酸残基的摩尔数。在一些情况下，重组I2S蛋白的唾液酸含量为或大于约16.5mol/mol、约17mol/mol、约18mol/mol、约19mol/mol、约20mol/mol、约21mol/mol、约22mol/mol或更多。在一些实施方案中，纯化的重组I2S蛋白的唾液酸含量可以在约16-20mol/mol、16-21mol/mol之间、约16-22mol/mol、16-23mol/mol、16-24mol/mol、约16-25mol/mol、约17-20mol/mol、17-21mol/mol、约17-22mol/mol、17-23mol/mol、17-24mol/mol或约17-25mol/mol的范围内。

药物组合物和施用

可按照已知的方法向亨特综合症患者施用纯化的重组I2S蛋白。例如，可静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻))递送纯化的重组I2S蛋白。

在一些实施方案中，可通过静脉内施用向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。

在一些实施方案中，通过鞘内施用向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。如本文中所用的，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指至椎管(围绕脊髓的鞘内空间)内的注射。可使用各种技术，包括但不限于，通过钻孔的侧脑室注射或池穿刺或腰椎穿刺等。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰部区或区域的IT施用或递送，即腰IT施用或递送。如本文中所用，术语“腰部区域”或“腰部区”指的是第三和第四腰(下背部)椎骨之间的区，更包含地，脊椎的L2-S1区域。

在一些实施方案中，通过皮下(即皮肤下方)向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。为此目的，可使用注射器注射制剂。然而，用于该制剂的施用的其它装置是可获得的，例如注射装置(例如，Inject-ease^TM和Genject^TM装置)；注射器笔(例如GenPen^TM)；无针装置(例如，MediJector^TM和BioJector^TM)；和皮下贴片递送系统。

在一些实施方案中，可将鞘内施用与其他施用途径(例如，静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻))一起使用。

本发明设想了治疗有效量的本文中描述的重组I2S或包含所述重组I2S的药物组合物的单次以及多次施用。可定期施用重组I2S或包含其的药物组合物，这取决于受试者的病况(例如，溶酶体贮积病)的性质、严重性和程度。在一些实施方案中，可定期(例如，每年一次，每六个月一次，每五个月一次，每三个月一次，每两月一次(每两个月一次)，每月一次(每个月一次)，每两周一次(每隔两周一次)，每周一次，每日一次或连续地)周期性施用治疗有效的量的重组I2S或包含其的药物组合物。

可用生理上可接受的载体或赋形剂配制重组I2S或包含其的药物组合物以制备药物组合物。载体和治疗剂可以是无菌的。所述制剂应该适合施用模式。

适合的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖例如甘露醇、蔗糖或其他糖、葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等及其组合。必要时，可将药物制剂与助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，所述助剂其不与活性化合物产生不利反应或干扰它们的活性。在一些实施方案中，使用适合于静脉内施用的水溶性载体。

必要时，组合物或药剂还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂。还可利用常规粘合剂和载体如甘油三酯将组合物配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可按照常规程序将组合物或药剂配制为适于向人类施用的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，单独地提供成分或以单位剂型将成分混合在一起，例如，作为标明活性剂的量的密闭容器例如安瓿或小袋中的干燥的冻干粉剂或无水浓缩物。当将通过输注施用组合物时，可用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶分配所述组合物。当通过注射施用组合物时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水以便可在施用前混合成分。

如本文中所用，主要基于本发明的药物组合物中包含的治疗剂的总量确定术语“治疗有效量”。通常，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在的疾病或病症)。例如，治疗有效量可以是足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如足以调节溶酶体酶受体或它们的活性，从而治疗这样的溶酶体贮积病或其症状(例如，在向受试者施用本发明的组合物后减少或消除“斑状体”或细胞空泡形成的存在或发生率)的量。通常地，向需要其的受试者施用的治疗剂(例如，重组溶酶体酶)的量将取决于受试者的特征。这样的特征包括受试者的状态、疾病的严重度、一般健康状况、年龄、性别和体重。取决于这些和其他相关因素，本领域普通技术人员将能够容易地确定适当的剂量。此外，可任选地将客观和主观测定用于鉴定最佳剂量范围。

通常在可包括多个单位剂量的给药方案中施用治疗有效量。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以例如取决于施用途径、取决于与其它药剂的组合而变化。同样地，对于任何特定患者的具体的治疗有效量(和/或单位剂量)还可取决于多种因素，包括被治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体药剂的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或使用的特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及在医学领域中公知的类似因素。

另外的示例性药物组合物和施用方法描述于标题为“用于艾杜糖-2-硫酸酯酶的CNS递送的方法和组合物(Methods and Compositions for CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase)”的PCT公布WO2011/163649；和2012年3月30日提交的标题为“艾杜糖醛酸2硫酸酯酶的皮下施用(Subcutaneous administration of iduronate 2sulfatase)”的临时申请序列号61/618,638，将这两者的全部公开内容通过引用并入本文。

应当进一步理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和施用或监督酶替代疗法的施用的人的专业判断来随时间调整具体剂量方案，并且本文中所陈述的剂量范围仅是示例性的并且无意限定本发明的范围或实践。

本文还包括以下实施方式：

实施方式1.一种包含纯化的重组艾杜-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列，

其中所述纯化的重组I2S包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化和

另外地其中所述纯化的重组I2S含有小于150ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)。

实施方式2.根据实施方式1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有小于100ng/mg的HCP。

实施方式3.根据实施方式1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有小于80ng/mg的HCP。

实施方式4.根据实施方式1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有小于60ng/mg的HCP。

实施方式5.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列

其中所述纯化的重组I2S包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化和

另外地其中所述纯化的重组I2S含有平均每分子至少16个唾液酸。

实施方式6.根据实施方式5所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有平均每分子至少18个唾液酸。

实施方式7.根据实施方式5所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有平均每分子至少20个唾液酸。

实施方式8.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列

其中所述纯化的重组I2S包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化和

另外地其中所述纯化的重组I2S含有每种酶至少10％的二磷酸化寡糖。

实施方式9.根据实施方式8所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有每种酶至少20％的二磷酸化寡糖。

实施方式10.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列

其中所述纯化的重组I2S包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化和

另外地其中所述纯化的I2S的特征在于包含7个或更少的峰组的聚糖图谱，所述峰组选自指示中性(峰组1)、单唾液酸化(峰组2)、二唾液酸化(峰组3)、单磷酸化(峰组4)、三唾液酸化(峰组5)、四唾液酸化(峰组6)或二磷酸化(峰组7)I2S蛋白的峰组。

实施方式11.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含至少约75％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

实施方式12.根据实施方式1-10中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含至少约80％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

实施方式13.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列，其中所述纯化的重组I2S包含大于约85％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

实施方式14.根据实施方式13所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含大于约90％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

实施方式15.根据实施方式13所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含大于约95％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

实施方式16.根据实施方式13所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含大体上100％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

实施方式17.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO:1具有至少80％的同一性的氨基酸序列。

实施方式18.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性的氨基酸序列。

实施方式19.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

实施方式20.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

实施方式21.一种制剂，其包含根据前述实施方式中任一项所述的组合物和生理上可接受的载体。

实施方式22.根据实施方式21所述的制剂，其中所述制剂适合用于静脉内施用。

实施方式23.根据实施方式21所述的制剂，其中所述制剂适合用于鞘内施用。

实施方式24.根据实施方式21所述的制剂，其中所述制剂适合用于皮下施用。

实施方式25.根据实施方式21所述的制剂，其中所述制剂用于治疗亨特综合症。

实施方式26.一种方法，其包括

通过进行阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种从不纯制剂纯化重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白，和

其中所述方法包括少于6个色谱步骤并且其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于100ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)。

实施方式27.根据实施方式26所述的方法，其中所述阴离子交换色谱为Q色谱。

实施方式28.根据实施方式26或27所述的方法，其中所述阳离子交换色谱为SP色谱。

实施方式29.根据实施方式26-28中任一项所述的方法，其中所述混合模式色谱为羟基磷灰石(HA)色谱。

实施方式30.根据实施方式26-29中任一项所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱为苯基色谱。

实施方式31.根据实施方式26-30中任一项所述的方法，其中所述方法包括5个色谱步骤或更少色谱步骤。

实施方式32.根据实施方式26-31中任一项所述的方法，其中所述方法包括4个色谱步骤或更少色谱步骤。

实施方式33.根据实施方式26-32中任一项所述的方法，其中所述方法按照该顺序进行阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱。

实施方式34.根据实施方式26-33中任一项所述的方法，其中在上样不纯制剂或中间洗脱液后，使用pH 5.5的包含浓度在约140mM和200mM之间的范围内的NaCl的洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换色谱柱。

实施方式35.根据实施方式26-34中任一项所述的方法，其中使用包含线性NaCl梯度的洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换色谱柱。

实施方式36.根据实施方式33所述的方法，其中所述线性NaCl梯度包含在0-500mM范围内的NaCl。

实施方式37.根据实施方式26-36中任一项所述的方法，其中在上样至所述阳离子交换色谱柱之前，将所述不纯制剂或中间洗脱液调整至在约1mS/cm和20mS/cm之间的范围内的电导率。

实施方式38.根据实施方式37所述的方法，其中在约5.5的pH下运行所述阳离子交换色谱柱。

实施方式39.根据实施方式26-38中任一项所述的方法，其中在上样至所述混合模式色谱柱之前，将所述不纯制剂或中间洗脱液调整至在约0.001-0.01M的范围内的磷酸盐浓度和pH 5.5。

实施方式40.根据实施方式39所述的方法，其中在上样后，使用pH 5.5的包含在约10-20mM的范围内的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤所述混合模式色谱柱。

实施方式41.根据实施方式40所述的方法，其中使用pH 5.5的包含在约50-150mM的范围内的磷酸盐浓度的洗脱缓冲液洗脱所述混合模式色谱柱。

实施方式42.根据实施方式26-41中任一项所述的方法，其中在上样至疏水相互作用色谱柱上之前，将所述不纯制剂或中间洗脱液调整至的在约0.5-2.0M的范围内的盐浓度，pH为约4.5-6.0。

实施方式43.根据实施方式42所述的方法，其中在上样后，使用pH为约4.5-6.0的包含在约0.5-2.0M的范围内的盐浓度的洗涤缓冲液洗涤所述疏水相互作用色谱柱。

实施方式44.根据实施方式43所述的方法，其中使用pH为约4.5-6.0的包含在约0.1-0.5M的范围内的盐浓度的洗脱缓冲液洗脱所述疏水相互作用色谱柱。

实施方式45.根据实施方式26-44中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱柱中的每一种具有在14-25cm的范围内的高度。

实施方式46.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法还包括病毒灭活的步骤。

实施方式47.根据实施方式46所述的方法，其中所述病毒灭活的步骤在将所述不纯制剂上样至所述第一色谱柱上之前进行。

实施方式48.根据实施方式46所述的方法，其中所述病毒灭活的步骤包括将去垢剂添加至所述不纯制剂。

实施方式49.根据实施方式26-48中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述最后一个色谱柱之后除去病毒的步骤。

实施方式50.根据实施方式26-49中任一项所述的方法，其中所述方法还包括超滤和/或渗滤的步骤。

实施方式51.根据实施方式50所述的方法，其中所述超滤和/或渗滤的步骤包括将所述纯化的重组I2S蛋白交换至药物配制缓冲液中。

实施方式52.根据实施方式26-51中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列。

实施方式53.根据实施方式26-52中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

实施方式54.根据实施方式26-53中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白由在无血清培养基中悬浮培养的哺乳动物细胞产生。

实施方式55.根据实施方式54所述的方法，其中在生物反应器中培养所述哺乳动物细胞。

实施方式56.根据实施方式54或55所述的方法，其中所述无血清培养基缺乏动物来源的组分。

实施方式57.根据实施方式54-56中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基是化学成分确定的培养基。

实施方式58.根据实施方式54-56中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞共表达所述重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。

实施方式59.根据实施方式58所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。

实施方式60.根据实施方式54-59中任一项所述的方法，其中从含有由所述哺乳动物细胞分泌的重组I2S蛋白的所述无血清培养基制备所述不纯制剂。

实施方式61.根据实施方式60所述的方法，其中将所述不纯制剂从冷冻的培养基制剂解冻。

实施方式62.根据实施方式26-61中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于80ng/mg的HCP。

实施方式63.根据实施方式26-62中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于60ng/mg的HCP。

实施方式64.根据实施方式26-63中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有平均每分子16-22个唾液酸。

实施方式65.根据实施方式26-63中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少60U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

实施方式66.一种药物组合物，其包含根据如实施方式26-65中任一项所述的方法纯化的重组I2S蛋白。

实施方式67.一种治疗亨特综合症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用根据实施方式66所述的药物组合物。

实施例

实施例1：重组I2S AF捕获和纯化工艺

本实施例说明简化的下游纯化工艺可以用于捕获和纯化在无血清培养基中产生的重组I2S。示例性纯化方案描述图1中。

开发稳定地表达艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的细胞系。示例性细胞系的产生和表征描述于与其同日提交的标题为“用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞(Cells for Producing Recombinant Iduronate-2-Sulfatase)”的美国临时申请中，其完整内容通过引用并入本文。简言之，将人细胞系工程化以共表达具有SEQ IDNO：2中显示的氨基酸序列的人I2S蛋白和具有SEQ ID NO：5中显示的氨基酸序列的人甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。

SEQ ID NO：2

＞全长前体艾杜糖-2-硫酸酯酶

MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP

SEQ ID NO：5

全长人FGE前体：

MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD

在全长I2S酶合成后，25个氨基酸的信号肽被除去，并且可溶性成熟I2S酶从细胞分泌。

将化学成分确定的培养基(无血清/无动物成分；AF)用于生物反应器工艺。

减小个体收获材料的体积，并通过超滤/渗滤法交换缓冲液。将每个体收获物的材料(称为未纯化的批量(UPB))在-50℃冷冻。下游纯化工艺始于未纯化批量的解冻和汇集，并且包括连续病毒灭活、阴离子交换(Capto Q)、混合模式(陶瓷羟基磷灰石)、阳离子交换(SP琼脂糖)和疏水性相互作用(苯基琼脂糖)色谱步骤，随后进行病毒过滤以及最终浓缩和渗滤步骤。具体地，该纯化过程使用Q、羟基磷灰石、SP和苯基色谱方式。去除常规用于I2S纯化工艺中的蛋白G色谱和尺寸排阻色谱。示例性步骤示于表3中。

表3:纯化工艺的示例性步骤

通过肽图谱、SDS-PAGE(银)、尺寸排阻HPLC评估纯化的I2S蛋白的纯度。使用标准方法测定酶特异性活性、甲酰甘氨酸含量、唾液酸含量、聚糖图谱、电荷特征谱。示例性结果示于表4中。

表4:纯化的重组I2S蛋白的分析

示例性肽图谱相较于商购可得I2S参考示于图2中。示例性SDS-PAGE(银)分析结果示于图3中。通常情况下，通过使用本文中描述的工艺，原料药的HCP浓度(DS)<100ppm，满足在许多市场(包括美国)中所需的<100ppm的规范。DS的SEC≥99.5％，也满足许多市场的当前>99.3％的营销规范要求。示例性电荷特征谱示于图4中。示例性聚糖图谱示于图5中。具体地，纯化的I2S的聚糖图谱包括七个的峰组，根据递增量的来源于唾液酸和甘露糖-6-磷酸残基的负电荷洗脱，按照洗脱的顺序代表中性、单、二唾液酸化、单磷酸化、三唾液酸化和混合(单唾液酸化和封端M6P)、四唾液酸化和混合(二唾液酸化和封端M6P)以及二磷酸化聚糖。

综上所述，本实施例证明，简化的四柱纯化工艺可用于成功地纯化在无动物成分培养基中大规模产生的重组I2S。

实施例2:重组I2S AF的收获和病毒灭活稳定性研究

本研究的目的是评价温度保持时间和冷冻-解冻循环对重组I2S澄清收获物的稳定性的影响。

将澄清的收获样品在环境温度和2-8℃贮存达7天，并将灭活病毒的UPB样品在环境温度下保持达24小时。将澄清收获物的冻融样品在-20℃、-50℃、-80℃下冷冻，并经历冷冻-解冻达3个循环。使用Western印迹、SEC HPLC和活性测定精确计量稳定性。

使用具有离心保留装置的B.Braun 20L生物反应器和期望的泌水率，通过CCPD从2D细胞系产生I2S-AF收获材料。对于温度保持研究，将每一个澄清的收获物在环境温度和2-8℃下贮存，并在选择的保持时间上取样。采样量和保持时间列表5中。将冷冻-解冻样品于-20℃、-50℃和-80℃下贮存，并使用25℃水浴解冻。

表5.澄清的收获物保持点稳定性

病毒灭活步骤在上样第一柱之前的未纯化的批量步骤中发生。通过澄清的收获物的浓缩和缓冲交液换产生UPB。使用Pall 1sq.ft.Centramate系统进行UF/DF，并且将缓冲液交换成10mM MES，155mM NaCl，pH＝6.5。病毒灭活步骤添加1％Tween 80和0.3％TnBP，对于每一个时间点使用Durapore注射器过滤器进行过滤。在表6中所列的每一个时间点取样，将其在-80℃下冷冻。通过Western印迹和活性(4-MU测定)测试来自澄清的收获保持点和冷冻-解冻研究的样品。通过SEC HPLC测试来自病毒灭活的UPB样品的纯度。来自表5中的收获物12和18的保持点活性结果显示，对于两种收获物，在环境温度和2-8℃下在达7天的贮存中没有显著的变化。对于在-20℃、-50℃和-80℃贮存的，经历达3个冷冻-解冻循环的收获物12活性没有显著变化。

表6.未纯化的批量的病毒灭活

	样品	保持温度	保持时间(天)
				病毒灭活	9x 0.5mL	环境温度，控制	T＝0,6小时,24小时
	9x 0.5mL	环境温度，病毒灭活	T＝0,6小时,24小时

关于病毒灭活UPB步骤的稳定性的活性和SEC-HPLC描述于图6和7中。这显示，基于长达24小时的活性和纯度，病毒灭活的稳定性没有问题。

总之，基于本文中描述的稳定性分析，可在2-8℃下贮存澄清的收获物(例如，长达7天)而无收获物质量的显著变化。澄清的收获物可经历多个冷冻-解冻循环并于-20℃、-50℃、-80℃的温度下贮存，而无稳定性的显著变化。基于SEC HPLC纯度结果，在UPB步骤中进行的病毒灭活可在环境温度下进行(例如，长达24小时)而无活性和纯度的变化。

实施例3：无动物成分IL CD培养基确认运行的纯化和分析

本研究的目的是从I2S-AF的汇集收获物进行纯化和表征原料药，所述I2S-AF是使用化学成分确定的培养基在无动物成分灌注中产生的。

本研究评估I2S-AF纯化工艺性能和从化学成分确定的培养基生物反应器产生的原料药(DS)。

细胞培养

I2S-AF材料从如实施例1中描述的表达I2S和甲酰甘氨酸生成酶(FGE))的细胞系2D产生。使用化学成分明确的无血清培养基，在1L Das Gip旋转过滤器生物反应器中于CCPD中产生材料。将来自每一个澄清的收获物(HI-21)的单个袋子在-20℃下冷冻，在2-8℃解冻过夜。将等体积的每一个澄清的收获物汇集以代表整个收获汇集物，随后进行0.2μm过滤，并用30kD的Pall Omega Centramate盒(具有1ft²的总膜面积)进行浓缩。将未纯化批量(UPB)进行0.2um过滤，并在使用前进行冷冻。

纯化

示例性柱规格和上样描述于表7中。通过滴定以3g/L的靶上样至Q琼脂糖。将先前的柱洗脱液100％地上样至随后的柱，并且无材料被去除。

表7.柱和上样规范

利用来自汇集收获物1至21(来自生物反应器)的UPB进行一个纯化运行。将UPB在2-8℃解冻过夜，并从每一个收获物等体积汇集UPB。

单个柱工艺步骤和缓冲制剂可见于表8-11中。使用0.2um瓶过滤器系统过滤汇集的UPB，使用1M醋酸钠将其调整至pH6.5，并在上样至Q琼脂糖FF柱之前，用5M氯化钠将电导率调整至16mS/cm。在上样至HA柱之前，使用0.25M NaP0₄(pH 5.5)将Q琼脂糖洗脱液调整至0.001M NaP0₄，并用0.22um PES瓶顶过滤器进行过滤。用5M NaCl将HA洗脱液的电导率调整至1.55M NaCl，并且用1M醋酸钠将pH调整至pH 5.5。调整时间为约1小时。在上样至苯基琼脂糖柱上之前，使用0.22um的PES瓶顶过滤器过滤经调整的汇集液。将苯基洗脱液浓缩4倍，和渗滤6倍至0.02M NaP0₄，0.137M NaCl，pH 6.0中。将渗滤产物调整至2.0g/L，并用0.2％聚山梨酯20配制，以产生模拟原料药。产生DS的H1-20的模拟汇集物以用于额外表征。

表8.Q琼脂糖FF色谱的示例性工艺细节

工艺步骤	流速(cm/小时)	CV	缓冲液
				清洁处理	150	3	0.5N NaOH
平衡	150	4	0.01M MES,0.155M NaCl,ph 6.5
				洗涤1	150	2	0.01M MES,0.155M NaCl,ph 6.5
洗涤2	150	3	0.01M MES,0.155M NaCl,ph 5.5
				洗脱	150	3	0.01M MES,0.50M NaCl,ph 5.5
清洁/剥离	150	4	1.0M NaOH,2M NaCl
				贮存	150	4	0.0N NaOH

表9.HA色谱的示例性工艺细节

表10.苯基琼脂糖色谱的示例性工艺细节

工艺步骤	流速(cm/小时)	CV	缓冲液
				清洁处理	150	3	0.5N NaOH
平衡	150	4-6	0.02M MES,1.5M NaCl,pH 5.5
				洗涤	150	2	0.02M MES,1.5M NaCl,pH 5.5
洗脱	150	3	0.02M MES,0.2M NaCl,pH 5.5
				水洗涤	150	3	RO/去离子水
乙醇洗涤	150	3	20％乙醇
				清洁	150	3	0.5N NaOH
贮存	150	3	0.01N NaOH

表11.苯基洗脱汇集物的示例性渗滤

通过ELISA测定的HCP的过程中纯度

表12描述每一个步骤的过程中HOP去除。对于HA步骤中的大部分去除，过程中HCP结果很高。

表12.过程中HCP去除

原料药表征

示例性原料药大量释放的结果列于表13中。如可看到的，原料药在纯材料中具有高比活性和％FG。示例性原料药属性表征示于表13中。在终UF/DF步骤中HCP从1,870ng/mg减少至372ng/mg。

表13.示例性原料药的大量释放

实施例4.纯化的重组I2S酶的生理化学和生物学表征

本实施例的目的是进行使用上述方法纯化的重组I2S蛋白的详细表征。

SDS-PAGE

关于实验，在两个单独的无血清细胞培养反应中，使用2D和4D人细胞系产生重组I2S蛋白。收集样品，并使用上述方法进行纯化。通过SDS-PAGE分析纯化的I2S酶，并用银染进行处理以使其可见。示例性结果示于图8中。如可从图8中看到的，使用本文中描述的方法的纯化的重组I2S蛋白显示可与使用标准方法纯化的I2S参考样品可比较的带型模式。

肽图谱

使用如上所述方法纯化由I2S-AF 2D细胞系产生的重组I2S蛋白。使纯化的重组I2S和参考人I2S的样品各自经历蛋白水解消化，并通过HPLC分析进行检查。相较于参考I2S的肽图谱的示例性肽图谱示于图9中。

甲酰甘氨酸转化百分比

肽图谱可用于确定FGly转化百分比。I2S活化需要通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)进行的半胱氨酸(对应于成熟人I2S的位置59)至甲酰甘氨酸的转化，如下文中显示的：

因此，甲酰甘氨酸转化的百分比(％FG)可以使用下列公式计算：

例如，50％FG意指一半纯化的重组I2S无酶活性而没有任何治疗效果。

肽图谱用于计算％FG。简言之，使用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或糜蛋白酶)将纯化的重组I2S蛋白消化成短肽。使用HPLC分离和表征短肽。表征包含对应于成熟人I2S的位置59的位置的肽以确定相较于对照(例如，无FGly转化的I2S蛋白或具有100％FGly转化的I2S蛋白)位置59上的Cys是否被转化成FGly。可基于对应的峰面积测定包含FGly的肽的量(对应于活性I2S分子的数目)和具有FGly和Cys的肽的总量(对应于总的I2S分子的数目)，并计算反映％FG的比率。示例性结果示于表14中。

聚糖图谱-甘露糖-6磷酸和唾液酸含量

测定纯化的重组I2S蛋白的聚糖和唾液酸的组成。使用阴离子交换色谱法产生聚糖图谱来进行聚糖组合物的定量。如下所述，在本文中描述的条件下纯化的重组I2S的聚糖图谱由七个峰组组成，根据递增量的负电荷(至少部分地因酶消化而从唾液酸和甘露糖-6-磷酸糖产生)洗脱。简言之，使用如下方式处理来自无血清细胞培养物(I2S-AF2D无血清和I2S-AF 4D无血清)的纯化的重组I2S和参考重组I2S：(1)使用纯化的神经氨酸酶(分离自产脲节杆菌(Arthrobacter Ureafaciens)(10mU/μL)，Roche Biochemical(Indianapolis,IN)，目录号269 611(1U/100μL))以除去唾液酸残留物，(2)在37±1℃用碱性磷酸酶处理2小时以完全释放甘露糖-6-磷酸残留物，(3)碱性磷酸酶+神经氨酸酶或(4)无处理。使用配备有Dionex CarboPac PA1保护柱的CarboPac PA1分析柱，通过利用脉冲安培检测(HPAE-PAD)的高效阴离子交换色谱法分析每一种酶消化。对于每一种测定，运行一系列在0.4至2.0纳摩尔的范围内的唾液酸和甘露糖-6-磷酸标准。在环境柱温度下将使用在100mM氢氧化钠中的48mM乙酸钠的等度方法以1.0毫升/分钟的流速运行至少15分钟，以洗脱每个峰。将从每个单独的运行产生的I2S-AF和参考I2S样品的数据分别组合成单个色谱来表示每个相应的重组蛋白的聚糖图谱。如图10中显示的，由无血清培养基纯化的I2S的聚糖图谱显示构成中性、单、二唾液酸化、单磷酸化、三唾液酸化和混合(单唾液酸化和封端的甘露糖-6-磷酸)、四唾液酸化和混合(双唾液酸化和封端的甘露糖-6-磷酸)以及二磷酸化聚糖的代表性洗脱峰(按洗脱顺序)。示例性聚糖图谱示于图10中。

根据唾液酸标准的线性回归分析计算每一个重组I2S样品中的平均唾液酸含量(每摩尔蛋白质的唾液酸摩尔数)。使用PeakNet 6软件使每一个色谱图运行可视化。唾液酸标准和从重组I2S测定对照和测试样品释放的唾液酸显现为单个峰。使用下列公式将I2S的唾液酸(纳摩尔)的量计算为原始值：

其中C为样品或重组I2S测定对照的蛋白质浓度(以mg/ml表示)。

使用下列公式计算每一个测试样品的表示为每摩尔蛋白质的唾液酸的摩尔数的唾液酸的校正值：

表示由I2S-AF 2D或4D细胞系纯化的重组I2S上的唾液酸含量的示例性数据示于表14中。

表14:从无血清细胞培养基物纯化的I2S的示例性特征

比活性

使用体外硫酸酯释放测定或4-MUF测定使用本文所述的方法纯化的重组I2S酶的比活性。

体外硫酸酯释放测定

体外硫酸酯释放活性测定使用肝素二糖作为底物来进行。具体地，该测定测量I2S从天然来源的底物肝素二糖释放硫酸根离子的能力。释放的硫酸酯可通过配备有电导率检测器的离子色谱来定量。简言之，首先将样品缓冲交换至10mM醋酸钠(pH6)以消除由配制缓冲液中的磷酸根离子产生的抑制。随后用反应缓冲液(10mM醋酸钠，pH值4.4)将样品稀释至0.075mg/ml，并在37℃于30μL反应体积中以0.3μg I2S/100μg底物的酶与底物的比率与肝素二糖一起温育2小时。随后通过在100℃加热样品3分钟来终止反应。使用具有IonPacAG18保护柱的Dionex IonPac AS18分析柱进行分析。以1.0毫升/分钟利用30mM氢氧化钾来使用等度方法，进行15分钟。根据在1.7至16.0纳摩尔的范围内的硫酸酯标准的线性回归分析计算通过I2S样品释放的硫酸酯的量。可报告值表示为每mg蛋白质的单位，其中1个单位被定义为1微尔的每小时释放的硫酸酯，并且通过A280测量来测定蛋白质浓度。示例性结果示于表14中。

4-MUF测定

还可使用基于荧光的4-MUF测定来分析纯化的重组I2S酶的比活性。简言之，该测定测量了I2S底物4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)的水解。在4-MUF-SO₄底物被I2S切割后，该分子被转化成硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)。作为结果，I2S酶活性可以通过评价随时间的荧光信号的整体变化来测定。对于本实验，使纯化的I2S酶与4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄钾盐(Sigma目录号M-7133)温育。使用以1:100、1:200和1:20,000的原液稀释的商购可得的I2S酶，利用一系列对照参照样品进行测定的校准。在37℃运行酶测定，并使用校准的荧光计进行测定。使用对于每个参考标准获得的荧光值，使用下列公式确定变异系数百分比：

随后使用下列公式将百分比CV值用于计算每一个样品的修正平均荧光，以确定以mU/mL表示的报告酶的活性：

CFU＝负修正平均荧光

DF–稀释因子

1毫单位的活性是在37℃于1分钟内将1纳摩尔的4-甲基伞形酮基硫酸酯转化为4-甲基伞形酮所需的酶的量。

电荷特征谱

利用高效液相色谱(HPLC)系统，通过强阴离子交换(SAX)色谱测定每一种纯化的重组I2S的电荷分布。该方法基于表面电荷差异分离样品内的重组I2S变体。在pH 8.00时，带负电荷的物质吸附至SAX柱的固定正电荷上。将递增离子强度的梯度用于以与它们与柱的离子相互作用的强度成比例的方式洗脱每一个蛋白质物质。将100微克的纯化的I2S(从在无血清生长条件下的2D细胞系分离的)或参考重组I2S酶上样至在环境温度下保持的并且被平衡至20mM Tris-HC1，pH 8.00的Amersham Biosciences Mini Q PE(4.6x 50mm)柱上。使用20mM Tris-HC1，1.0M氯化钠，pH 8.00的流动相，以0.80毫升/分钟的流速进行梯度洗脱。通过测量样品洗脱液在280nm波长处的吸光度来在运行过程中连续测定蛋白质浓度。显示针对从2D和4D细胞系纯化的重组I2S观察到的电荷特征谱的示例性结果示于图11中。

序列表

<110> 夏尔人类遗传性治疗公司

<120> 艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化

<130> 2006685-0342

<150> 61/666,733

<151> 2012-06-29

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 1

Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu

1 5 10 15

Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys

20 25 30

Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu

35 40 45

Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val

50 55 60

Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe

65 70 75 80

Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln

85 90 95

Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe

100 105 110

His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp

115 120 125

Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys

130 135 140

Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro

145 150 155 160

Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser

165 170 175

Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser

180 185 190

Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg

195 200 205

Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu

210 215 220

Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn

225 230 235 240

Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile

245 250 255

Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg

260 265 270

Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg

275 280 285

Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile

290 295 300

Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp

305 310 315 320

Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe

325 330 335

Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu

340 345 350

Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro

355 360 365

Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr

370 375 380

Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro

385 390 395 400

Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His

405 410 415

Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro

420 425 430

Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro

435 440 445

Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly

450 455 460

Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe

465 470 475 480

Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu

485 490 495

Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn

500 505 510

Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro

515 520 525

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 2

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile

50 55 60

Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln

65 70 75 80

Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg

85 90 95

Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His

100 105 110

Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn

130 135 140

His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro

145 150 155 160

Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly

165 170 175

Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly

210 215 220

Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro

245 250 255

Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile

275 280 285

Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val

290 295 300

Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly

325 330 335

Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp

340 345 350

Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala

355 360 365

Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe

370 375 380

Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu

385 390 395 400

Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu

405 410 415

Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys

420 425 430

Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu

435 440 445

Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser

450 455 460

Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro

465 470 475 480

Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp

485 490 495

Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala

500 505 510

Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp

515 520 525

Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu

530 535 540

Phe Gln Leu Leu Met Pro

545 550

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 3

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile

50 55 60

Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln

65 70 75 80

Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg

85 90 95

Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His

100 105 110

Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn

130 135 140

His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro

145 150 155 160

Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly

165 170 175

Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly

210 215 220

Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro

245 250 255

Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile

275 280 285

Pro Val Asp Phe Gln Glu Asp Gln Ser Ser Thr Gly Phe Arg Leu Lys

290 295 300

Thr Ser Ser Thr Arg Lys Tyr Lys

305 310

<210> 4

<211> 343

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 4

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile

50 55 60

Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln

65 70 75 80

Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg

85 90 95

Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His

100 105 110

Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn

130 135 140

His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro

145 150 155 160

Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly

165 170 175

Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly

210 215 220

Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro

245 250 255

Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile

275 280 285

Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val

290 295 300

Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly

325 330 335

Phe Leu Met Arg Thr Asn Thr

340

<210> 5

<211> 374

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 5

Met Ala Ala Pro Ala Leu Gly Leu Val Cys Gly Arg Cys Pro Glu Leu

1 5 10 15

Gly Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Cys Gly Ala Ala

20 25 30

Gly Ser Gln Glu Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Leu Ala Gly

35 40 45

Ser Cys Gly Cys Gly Thr Pro Gln Arg Pro Gly Ala His Gly Ser Ser

50 55 60

Ala Ala Ala His Arg Tyr Ser Arg Glu Ala Asn Ala Pro Gly Pro Val

65 70 75 80

Pro Gly Glu Arg Gln Leu Ala His Ser Lys Met Val Pro Ile Pro Ala

85 90 95

Gly Val Phe Thr Met Gly Thr Asp Asp Pro Gln Ile Lys Gln Asp Gly

100 105 110

Glu Ala Pro Ala Arg Arg Val Thr Ile Asp Ala Phe Tyr Met Asp Ala

115 120 125

Tyr Glu Val Ser Asn Thr Glu Phe Glu Lys Phe Val Asn Ser Thr Gly

130 135 140

Tyr Leu Thr Glu Ala Glu Lys Phe Gly Asp Ser Phe Val Phe Glu Gly

145 150 155 160

Met Leu Ser Glu Gln Val Lys Thr Asn Ile Gln Gln Ala Val Ala Ala

165 170 175

Ala Pro Trp Trp Leu Pro Val Lys Gly Ala Asn Trp Arg His Pro Glu

180 185 190

Gly Pro Asp Ser Thr Ile Leu His Arg Pro Asp His Pro Val Leu His

195 200 205

Val Ser Trp Asn Asp Ala Val Ala Tyr Cys Thr Trp Ala Gly Lys Arg

210 215 220

Leu Pro Thr Glu Ala Glu Trp Glu Tyr Ser Cys Arg Gly Gly Leu His

225 230 235 240

Asn Arg Leu Phe Pro Trp Gly Asn Lys Leu Gln Pro Lys Gly Gln His

245 250 255

Tyr Ala Asn Ile Trp Gln Gly Glu Phe Pro Val Thr Asn Thr Gly Glu

260 265 270

Asp Gly Phe Gln Gly Thr Ala Pro Val Asp Ala Phe Pro Pro Asn Gly

275 280 285

Tyr Gly Leu Tyr Asn Ile Val Gly Asn Ala Trp Glu Trp Thr Ser Asp

290 295 300

Trp Trp Thr Val His His Ser Val Glu Glu Thr Leu Asn Pro Lys Gly

305 310 315 320

Pro Pro Ser Gly Lys Asp Arg Val Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Met Cys

325 330 335

His Arg Ser Tyr Cys Tyr Arg Tyr Arg Cys Ala Ala Arg Ser Gln Asn

340 345 350

Thr Pro Asp Ser Ser Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala Asp

355 360 365

Arg Leu Pro Thr Met Asp

370

Claims (17)

1.一种包含纯化的重组艾杜-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，

其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，

其中所述纯化的重组I2S含有小于150ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有至少75％的对应于SEQID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有至少85％的对应于SEQID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

4.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，

其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，和

其中所述纯化的重组I2S含有每分子酶至少10％的二磷酸化寡糖。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有每分子酶至少50％的二磷酸化寡糖。

6.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，

其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，和

其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少40U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少50U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少60U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

9.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，

其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，和

其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少20U/mg的比活性，如通过使用体外4-MUF-SO₄至4-MUF的转化测定所测定的。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少30U/mg的比活性，如通过使用体外4-MUF-SO₄至4-MUF的转化测定所测定的。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少40U/mg的比活性，如通过使用体外4-MUF-SO₄至4-MUF的转化测定所测定的。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少50U/mg的比活性，如通过使用体外4-MUF-SO₄至4-MUF的转化测定所测定的。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少60U/mg的比活性，如通过使用体外4-MUF-SO₄至4-MUF的转化测定所测定的。

14.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，其中所述纯化的重组I2S

(i)包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，和

(ii)含有平均每分子至少16个唾液酸。

15.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，

其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化和

其中所述纯化的重组I2S的特征在于包含7个或更少的峰组的聚糖图谱，所述峰组选自指示中性(峰组1)、单唾液酸化(峰组2)、二唾液酸化(峰组3)、单磷酸化(峰组4)、三唾液酸化(峰组5)、四唾液酸化(峰组6)或二磷酸化(峰组7)I2S蛋白的峰组。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于100ng/mg的HCP。

17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于80ng/mg的HCP。