ES2689468T3

ES2689468T3 - Purificación de iduronato-2-sulfatasa

Info

Publication number: ES2689468T3
Application number: ES13809853.8T
Authority: ES
Inventors: Dave Nichols
Original assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2018-11-14
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: HK1209431A1; HUE040769T2; CO7240396A2; US9492511B2; HK1249026A1; ZA201409397B; MX336715B; CA2877517C; HK1209767A1; EA201492177A1; EP2867245A2; US20190359958A1; AU2018200230B2; KR20190064542A; IL261264B; SG10201703489VA; IL261264A; PH12020500027A1; EA034549B1; DOP2014000294A

Abstract

Una composición que comprende iduronato-2-sulfatasa (I2S) recombinante purificada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:º, en donde la I2S recombinante purificada comprende por lo menos un 70% de conversión del residuo de cisteína correspondiente al Cys59 de la SEQ ID NO:1 a Cα-formilglicina (FGly), y en donde la I2S recombinante purificada contiene menos de 150 ng/mg de Proteína de Célula Huésped (HCP).

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Purificación de iduronato-2-sulfatasa ANTECEDENTES

La mucopolisacaridosis tipo II (MPS II, síndrome de Hunter) es un trastorno de almacenamiento lisosómico recesivo ligado al cromosoma X que es resultado de una deficiencia en la enzima iduronato-2-sulfatasa (I2S). La I2S escinde las fracciones de 2-O-sulfato terminales de los glicosaminoglicanos (GAG) dermatan sulfato y heparan sulfato. Debido a la falta o insuficiencia de la enzima I2S en pacientes con síndrome de Hunter, los GAG se acumulan progresivamente en los lisosomas de una variedad de tipos celulares, lo que lleva a obstrucción celular, organomegalia, destrucción tisular y disfunción del sistema orgánico.

Generalmente, las manifestaciones físicas para personas con síndrome de Hunter incluyen síntomas tanto somáticos como neuronales. Por ejemplo, en algunos casos del síndrome de Hunter, la participación del sistema nervioso central lleva a retrasos en el desarrollo y problemas del sistema nervioso. Aunque generalmente en el momento del nacimiento no hay síntomas no neuronales del síndrome de Hunter, con el tiempo la acumulación progresiva de GAG en las células del cuerpo puede tener un impacto dramático en los tejidos periféricos del cuerpo. La acumulación de GAG en el tejido periférico lleva a una rugosidad distintiva en las características faciales de un paciente y es responsable de la frente prominente, el puente aplanado y la lengua agrandada, las características definitorias de un paciente Hunter. De manera similar, la acumulación de GAG puede afectar adversamente a los sistemas de órganos del cuerpo. Manifestando inicialmente como un engrosamiento de la pared del corazón, los pulmones y las vías respiratorias, y un agrandamiento anormal del hígado, el bazo y los riñones, estos cambios profundos pueden llevar en última instancia a un fallo orgánico catastrófico generalizado. Como resultado, el síndrome de Hunter siempre es grave, progresivo y reduce la esperanza de vida.

La terapia de reemplazo enzimático (ERT) es una terapia aprobada para tratar el síndrome de Hunter (MPS II), que implica administrar la enzima I2S de reemplazo exógeno a pacientes con síndrome de Hunter. Muenzer et al., 2007 divulga una forma recombinante de IDS con modificación post-traduccional en cys59. Dicho documento divulga que la extensión de la modificación post-traduccional de cys59 a formilglicina requerida para la actividad enzimática es de aproximadamente el 50%.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una composición que comprende iduronato-2-sulfatasa (I2S) recombinante purificada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, en donde la I2S recombinante purificada comprende por lo menos un 70% de conversión del residuo de cisteína correspondiente a Cys59 de la SEQ ID NO: 1 a Ca-formilglicina (FGly), y en donde la I2S recombinante purificada contiene menos de 150 ng/mg de Proteína de Célula Huésped (HCP). La invención también proporciona una composición de la invención, para su uso en el tratamiento del síndrome de Hunter.

SUMARIO DE LA DIVULGACION

La presente divulgación proporciona métodos mejorados para purificar la proteína I2S producida recombinantemente para terapia de reemplazo enzimático. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que la proteína I2S recombinante puede purificarse a partir de materiales biológicos no procesados, como, medio de cultivo celular que contiene I2S, usando un proceso que implica tan pocas como cuatro columnas de cromatografía. El proceso de purificación existente aprobado de I2S recombinante para la terapia de reemplazo enzimático implica 6 columnas de cromatografía. Como se describe en la sección de Ejemplos, las proteínas I2S recombinantes purificadas usando un proceso de cuatro columnas de acuerdo con la divulgación se ajustan a los requisitos de pureza de comercialización en los Estados Unidos y en muchos otros países. Adicionalmente la enzima I2S recombinante de acuerdo con la presente invención retiene un alto porcentaje de Ca-formilglicina (FGly) (por ejemplo, más del 70% y hasta el 100%), que es importante para la actividad de la enzima I2S, y características distintas como el contenido de ácido siálico y el mapa de glicanos que pueden facilitar la biodisponibilidad y/o el direccionamiento lisosómico de la proteína I2S recombinante. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un proceso eficaz, más barato, y más rápido para purificar proteína I2S recombinante. La presente divulgación es particularmente útil para purificar la proteína i2s recombinante producida en un medio sin suero.

Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para purificar proteína I2S recombinante a partir de una preparación impura usando un proceso basado en una o más de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de modo mixto y cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas realizaciones, el método de acuerdo con la presente divulgación implica menos de 6 (por ejemplo, menos de 5, menos de 4, o menos de 3) pasos de cromatografía. En algunas realizaciones, un método de acuerdo con la presente divulgación implica menos de 2, 3, 4 ó 5 pasos de cromatografía. En algunas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

realizaciones, un método de acuerdo con la presente divulgación implica 4 pasos de cromatografía. En algunas realizaciones, la proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención contiene menos de 100 ng/mg de Proteína de Célula Huésped (HCP) (por ejemplo, menos de 90 ng/mg de HCP, menos de 80 ng/mg de HCP, menos de 70 ng/mg de HCP, menos de 60 ng/mg de HCP, menos de 50 ng/mg de HCP, menos de 40 ng/mg de HCP, menos de 30 ng/mg de HCP, menos de 20 ng/mg de HCP, menos de 10 ng/mg de HCP).

En algunas realizaciones, una cromatografía de intercambio aniónico adecuada es una cromatografía Q. En algunas realizaciones, una cromatografía de intercambio catiónico adecuada es cromatografía SP. En algunas realizaciones, una cromatografía de modo mixto adecuada es cromatografía con hidroxiapatita (HA). En algunas realizaciones, una cromatografía de interacción hidrófoba adecuada es cromatografía de fenilo.

Se contempla que la cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, columna O), la cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, columna SP), la cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA) y cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, columna de fenilo) pueda llevarse a cabo en cualquier orden. En algunas realizaciones, un método de acuerdo con la presente divulgación lleva a cabo cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, columna O), cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, columna SP), cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA) y cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, columna de fenilo) en ese orden.

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a un pH de aproximadamente 5,0-7,0 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0) y la conductividad de aproximadamente 10-20 mS/cm (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mS/cm) antes de cargarla en la columna de cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, columna Q). En algunas realizaciones, el pH se ajusta usando acetato de sodio 1M. En algunas realizaciones, la conductividad se ajusta usando cloruro de sodio 5M. En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de intercambio aniónico, una vez cargada, se lava usando un tampón de lavado que comprende una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía de aproximadamente 140 mM a 200 mM (por ejemplo, aproximadamente 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM o 200 mM) con un pH de aproximadamente 5,0-7,0 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de intercambio aniónico se eluye usando un tampón de elución que comprende un gradiente de sal lineal (por ejemplo, NaCl). En algunas realizaciones, un gradiente de NaCl lineal adecuado contiene un intervalo de aproximadamente 0500 mM de NaCl (por ejemplo, aproximadamente 0-400 mM, aproximadamente 0-350 mM, aproximadamente 0-300 mM, aproximadamente 50-500 mM, aproximadamente 150-500 mM, aproximadamente 150-450 mM, aproximadamente 150-400 mM).

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una conductividad que varía entre aproximadamente 1 mS/cm y 20 mS/cm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 mS/cm y 15 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 10 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 8 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 6 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 4 mS/cm, entre aproximadamente 2 mS/cm y 4 mS/cm) antes de la carga a la columna de cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, columna SP). En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una conductividad que varía entre n aproximadamente 2 mS/cm y 4 mS/cm (por ejemplo, 2, 2,5, 3, 3,5 ó 4 mS/cm) antes de la carga en la columna de cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, columna SP). En algunas realizaciones, la conductividad se ajusta diluyendo el eluido de la columna de cromatografía de intercambio aniónico con H2O a una proporción de aproximadamente 1-2:1 (por ejemplo, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:, 1,5:1 , de 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 o 2:1). En algunas realizaciones, la conductividad se ajusta por dialfiltración. En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de intercambio catiónico se ejecuta a un pH de aproximadamente 5,0-6,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0 o 6,5). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de intercambio catiónico se ejecuta con un tampón que comprende una concentración de fosfato (por ejemplo, NaPO4) que varía de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,1 M (por ejemplo, aproximadamente 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M o 0,1 M). En algunas realizaciones, un pH adecuado es de aproximadamente 5,0-6,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0 o 6,5).

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una concentración de fosfato (por ejemplo, NaPO4) que varía de aproximadamente 0, 001 M a aproximadamente 0, 01 M (por ejemplo, aproximadamente 0,001 M, 0,002 M, 0,003 M, 0,004 M, 0,005 M, 0,006 M, 0,007 M, 0,008 M, 0,009 M, o 0,01 M) y un pH de aproximadamente 5,0-6,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, o 6,5) antes de cargar la columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna de HA), una vez cargada, se lava con un tampón de lavado que contiene fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio o potasio 1-10 mM) a pH neutro o casi neutro. En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de modo mixto cargada (por ejemplo, columna HA) se lava con un tampón de lavado que tiene una concentración de fosfato que varía de aproximadamente 10-20 mM (por ejemplo, aproximadamente 10-18 mM, 10-16 mM, 10-15 mM, 12-20 mM, 14 -18 mM, 14-16 mM). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de modo mixto cargada (por ejemplo, columna HA) se lava con un tampón de lavado que tiene una concentración de fosfato de o más de 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mM, 19 mM, 20 mM. En algunas realizaciones, la elución desde una columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA) se consigue con un tampón de fosfato en gradiente. En algunas realizaciones, un tampón de elución adecuado puede tener un gradiente de fosfato de aproximadamente 1-400 mM (por ejemplo, 1-300 mM, 1200 mM, 1-150 mM, 1-100 mM, 10-350 mM, 10-300 mM, 10-250 mM, 10-200 mM, 10-150 mM, 10-140 mM, 10-130 mM, 10-120 mM, 10-1 10 mM, 10-100 mM, 10-90 mM, 10-80 mM, 10-70 mM, 10-60 mM, 10-50 mM) de fosfato de sodio o fosfato de potasio. En algunas realizaciones, la elución de una columna HA se consigue incrementando escalonadamente la concentración de fosfato en el tampón de elución. En algunas realizaciones, los tampones de elución escalonada pueden tener una concentración de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) seleccionada de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM.. En algunas realizaciones, la elución de una columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA) se logra mediante un tampón de elución que tiene una concentración de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) que varía de aproximadamente 50 mM a 150 mM (por ejemplo, seleccionada de una concentración de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) de 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, y combinaciones de los mismos).

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2,0 M (por ejemplo, aproximadamente 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M, o 2,0 M de NaCl) a un pH de aproximadamente 4,5-6,0 (por ejemplo, aproximadamente 4,5, 5,0, 5,5, ó 6,0) antes de cargarla en la columna de cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, columna de fenilo). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de interacción hidrófoba, una vez cargada, se lava usando un tampón de lavado que comprende una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía de aproximadamente 0,5 M a 2,0 M (por ejemplo, aproximadamente 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M, o 2,0 M de NaCl) a un pH de aproximadamente 4,5-6,0 (por ejemplo, aproximadamente 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0). En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de interacción hidrófoba se eluye usando un tampón de elución que comprende una concentración de sal (por ejemplo NaCl) que varía de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M (por ejemplo, aproximadamente 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, o 0,5 M de NaCl) a pH de aproximadamente 4,5-6,0 (por ejemplo, aproximadamente 4,5, 5,0, o 6,0).

En algunas realizaciones, cada una de las columnas de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de modo mixto, y cromatografía de interacción hidrófoba tiene una altura que varía de 14-25 cm (por ejemplo, 15-25 cm, 15-20 cm, 14-24 cm, 14-22 cm, 14-20 cm o 16-18 cm). En algunas realizaciones, cada una de las columnas de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de modo mixto y cromatografía de interacción hidrófoba tiene una altura de aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 cm.

En algunas realizaciones, el método de acuerdo con la presente divulgación incluye un paso de inactivación viral antes de cargar la preparación impura en la primera columna de cromatografía. En algunas realizaciones, el paso de inactivación viral incluye añadir un detergente a la preparación impura. En algunas realizaciones, el método inventivo de acuerdo con la presente divulgación incluye además un paso de eliminación viral después de la última columna de cromatografía. En algunas realizaciones, un método de la divulgación incluye además un paso de ultrafiltración y/o dialfiltración. En algunas realizaciones, el paso de ultrafiltración y/o dialfiltración incluye intercambiar la proteína I2S recombinante purificada en un tampón de formulación de fármaco.

En algunas realizaciones, la presente invención se usa para purificar una proteína I2S recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la presente invención se usa para purificar una proteína I2S recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO:1.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se usa para purificar una proteína I2S recombinante producida por células de mamífero cultivadas en suspensión en un medio libre de suero. En algunas realizaciones, un medio libre de suero adecuado para la divulgación carece de componentes derivados de animales. En algunas realizaciones, un medio libre de suero adecuado para la divulgación es un medio definido químicamente. En algunas realizaciones, las células de mamífero se cultivan en un biorreactor. En algunas realizaciones, las células de mamífero coexpresan la proteína I2S recombinante y la enzima generadora de formilglicina (FGE). En algunas realizaciones, las células de mamífero son células humanas.

En algunas realizaciones, una preparación impura usada en un método de la divulgación se prepara a partir del medio libre de suero que contiene proteína I2S recombinante secretada de células de mamífero. En algunas realizaciones, una preparación impura usada en un método de la divulgación se descongela de una preparación de medio congelado.

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención contiene, de media, 16-22 (por ejemplo, 16-21, 16-20, 16-19, 17-22, 17-21, 17- 20, 17-19) ácidos siálicos por molécula. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención contiene, de media, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 ácidos siálicos por molécula.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención tiene por lo menos aproximadamente un 70% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de conversión del residuo de cisteína correspondiente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO: 1) a Ca-formilglicina (FGly). En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención tiene sustancialmente un 100% de conversión del residuo de cisteína correspondiente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO: 1) a Ca-formilglicina (FGly). En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención tiene actividad específica de por lo menos 20 U/mg, 30 U/mg, 40 U/mg, 50 U/mg, 60 U/mg, 70 U/mg, 80 U/mg, 90 U/mg, o 100 U/mg como se determina mediante un ensayo de actividad de liberación de sulfato in vitro usando disacárido de heparina como sustrato.

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente divulgación se caracteriza con una absorción celular de más del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, según se determina mediante un ensayo de absorción in vitro.

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención se caracteriza con un mapa de glicano que comprende siete grupos de picos indicativos de proteína I2S neutra (grupo de picos 1), mono-sialilada (grupo de picos 2), di-sialilada (grupo de picos 3), monofosforilada (grupo de picos 4), tri-sialilada (grupo de picos 5), tetra-sialilada (grupo de picos 6), y difosforilada (grupo de picos 7), respectivamente. En algunas realizaciones, el mapa de glicano se genera siguiendo una digestión con neuraminidasa. En otras realizaciones, el mapa de glicano se genera siguiendo una digestión con fosfatasa alcalina.

Entre otras cosas, la presente invención proporciona proteína I2S recombinante purificada como se describe en la presente, y composiciones farmacéuticas o formulaciones que contienen la misma. En algunas realizaciones, una formulación se formula para administración intravenosa, subcutánea y/o intratecal. La presente divulgación también describe métodos para tratar el síndrome de Hunter administrando a un sujeto con necesidad de tratamiento una I2S recombinante purificada, una composición farmacéutica o una formulación que contiene la misma.

Como se usan en la presente, los términos "proteína I2S", "I2S", "enzima I2S", o equivalentes gramaticales, se refieren a una preparación de moléculas de proteína I2S recombinante a menos que se indique específicamente lo contrario.

Como se usan en esta solicitud, los términos "alrededor" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor/aproximadamente pretende cubrir cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

Las Figuras descritas a continuación, que juntas constituyen el Dibujo, son solamente con propósitos de ilustración, no de limitación.

La Figura 1 representa un esquema de purificación ejemplar para I2S recombinante producida en medio libre de suero.

La Figura 2 representa un mapa peptídico ejemplar de I2S FF recombinante purificada en comparación con una I2S de referencia.

La Figura 3 representa un análisis de SDS-PAGE (Plata) ejemplar de I2S AF recombinante purificada.

La Figura 4 representa un análisis de perfil de carga ejemplar de I2S AF recombinante purificada evaluado por cromatografía de intercambio iónico.

La Figura 5 representa perfiles de mapa de glicanos ejemplares de I2S AF recombinante purificada.

La Figura 6 representa un análisis de actividad (U/mg) ejemplar después de un paso de UPB de inactivación viral de una cosecha clarificada de I2S recombinante.

La Figura 7 representa un análisis ejemplar de SEC-HPLC después de un paso de UPB de inactivación viral de una cosecha clarificada de I2S recombinante.

La Figura 8 representa un SDS-PAGE ejemplar tratado con colorante de plata de la proteína I2S recombinante purificada.

La Figura 9 muestra un mapa peptídico ejemplar para una enzima I2S recombinante purificada producida a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

partir de la línea celular I2S-AF 2D cultivada bajo condiciones de cultivo libres de suero (panel superior) en comparación con una referencia.

La Figura 10 representa perfiles de glicano ejemplares generados para enzimas I2S recombinantes purificadas producidas usando las líneas celulares I2S-AF 2D y 4D cultivadas bajo condiciones de cultivo de células libres de suero en comparación con una referencia.

La Figura 11 representa un perfil de carga ejemplar generado para la enzima I2S recombinante purificada producida usando la línea celular I2S-AF 2D crecida en condiciones de cultivo de células sin suero en comparación con un control de referencia I2S.

DEFINICIONES

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen primero ciertos términos. A lo largo de la especificación se describen definiciones adicionales para los términos siguientes y otros términos.

Alrededor o aproximadamente: como se usa en la presente, el término "alrededor" o "aproximadamente", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia expuesto. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor" se refiere a un intervalo de valores que cae dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia expuesto a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo en el contexto (excepto cuando dicho número exceda del 100% de un posible valor).

Biológicamente activo: como se usa en la presente, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tiene actividad en un sistema biológico (por ejemplo, cultivo celular, organismo, etc.). Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera que es biológicamente activa. La actividad biológica también se puede determinar mediante ensayos in vitro (por ejemplo, ensayos enzimáticos in vitro como ensayos de liberación de sulfato). En realizaciones particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte por lo menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido es referida típicamente como una porción "biológicamente activa". En algunas realizaciones, se produce y/o purifica una proteína a partir de un sistema de cultivo celular, que muestra actividad biológica cuando se administra a un sujeto. En algunas realizaciones, una proteína requiere procesamiento adicional para volverse biológicamente activa. En algunas realizaciones, una proteína requiere modificación postraduccional como, pero no limitado a, glicosilación (por ejemplo, sialización), farnesilación, escisión, plegado, conversión en formilglicina y combinaciones de las mismas, para volverse biológicamente activa. En algunas realizaciones, una proteína producida como una proforma (es decir, forma inmadura), puede requerir modificación adicional para volverse biológicamente activa.

Receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR): como se usa la presente, el término "receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR)" se refiere a un receptor celular que se une a etiquetas de manosa-6-fosfatos (M6P) en precursores de hidrolasas de ácidos en el aparato de Golgi que están destinadas al transporte al lisosoma. Además de manosa-6- fosfatos, el CI-MPR también se une a otras proteínas, incluyendo IGF-II. El CI-MPR también se conoce como "receptor de M6P/IGF-II", "receptor de CI-MPR/IGF-II", "receptor de IGF-II" o "receptor de IGF2". Estos términos y abreviaturas de los mismos se usan indistintamente en la presente.

Cromatografía: como se usa en la presente, el término "cromatografía" se refiere a una técnica para la separación de mezclas. Típicamente, la mezcla se disuelve en un fluido denominado la "fase móvil", que lo transporta a través de una estructura que contiene otro material denominado la "fase estacionaria". La cromatografía en columna es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está dentro de un tubo, es decir, una columna.

Diluyente: como se usa en la presente, el término "diluyente" se refiere a una sustancia diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, segura y no tóxica para la administración a un humano) útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución tamponada de pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Elución: como se usa en la presente, el término "elución" se refiere al proceso de extracción de un material de otro lavando con un solvente. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio iónico, la elución es un proceso para lavar resinas cargadas para eliminar los iones capturados.

Eluido: como se usa en la presente, el término "eluido" se refiere a una combinación de "portador" de fase

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

móvil y el material de analito que emerge de la cromatografía, típicamente como resultado de la elución.

Terapia de reemplazo enzimático (ERT): Como se usa en la presente, el término "terapia de reemplazo de enzima (ERT)" se refiere a cualquier estrategia terapéutica que corrige una deficiencia enzimática proporcionando la enzima faltante. Una vez administradas, la enzima se absorbe por las células y la transportan al lisosoma, donde la enzima actúa para eliminar el material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia enzimática. Típicamente, para que la terapia de reemplazo enzimático lisosómico sea eficaz, la enzima terapéutica se administra a los lisosomas en las células apropiadas en los tejidos objetivo donde se manifiesta el defecto de almacenamiento.

Equilibrar o Equilibrio: Como se usa en la presente, los términos "equilibrar" o "equilibrio" en relación con la cromatografía se refiere al proceso de equilibrar un primer líquido (por ejemplo, tampón) con otro, generalmente para lograr una distribución estable y equitativa de los componentes del líquido (por ejemplo, el tampón). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una columna cromatográfica puede equilibrarse haciendo pasar uno o más volúmenes de columna de un líquido deseado (por ejemplo, tampón) a través de la columna.

Mejorar, aumentar o reducir: Como se usan en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir" o equivalentes gramaticales, indican valores que se refieren a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un individuo de control (o individuos de control múltiple), en ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "individuo de control" es un individuo afligido con la misma forma de enfermedad de almacenamiento lisosómico que el individuo que se está tratando, que tiene aproximadamente la misma edad que el individuo que se está tratando (para asegurar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el individuo(s) de control son comparables.

Impurezas: como se usa en la presente, el término "impurezas" se refiere a sustancias dentro de una cantidad confinada de líquido, gas o sólido, que difieren de la composición química del material o compuesto objetivo. Las impurezas también son referidas como contaminantes.

Conector: como se usa en la presente, el término "conector" se refiere a, en una proteína de fusión, una secuencia de aminoácidos distinta de la que aparece en una posición particular en la proteína natural y está diseñada generalmente para ser flexible o para interponer una estructura , como una a-hélice, entre dos fracciones de proteína. Un conector también es referido como un espaciador.

Carga: Como se usa en la presente, el término "carga" se refiere a, en cromatografía, añadir un líquido o sólido que contiene muestra a una columna. En algunas realizaciones, los componentes particulares de la muestra cargados en la columna se capturan luego cuando la muestra cargada pasa a través de la columna. En algunas realizaciones, los componentes particulares de la muestra cargada en la columna no son capturados por, o "fluyen continuamente", a la columna cuando la muestra cargada pasa a través de la columna.

Polipéptido: como se usa en la presente, un "polipéptido", en términos generales, es una cadena de por lo menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir por lo menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido a otros por medio de por lo menos un enlace peptídico. Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos a veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que, no obstante, son capaces de integrarse en una cadena de polipéptidos, opcionalmente.

Grupo: como se usa en la presente, el término "grupo" en relación con la cromatografía se refiere a combinar una o más fracciones de fluido que han pasado a través de una columna juntas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una o más fracciones que contienen un componente deseado de una muestra que se ha separado por cromatografía (por ejemplo, "fracciones de pico") se pueden "agrupar" juntas para generar una única fracción "agrupada".

Enzima de reemplazo: como se usa en la presente, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que puede actuar para reemplazar por lo menos en parte la enzima deficiente o faltante en una enfermedad a ser tratada. En algunas realizaciones, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar por lo menos en parte la enzima lisosómica deficiente o faltante en una enfermedad de almacenamiento lisosómico a ser tratada. En algunas realizaciones, una enzima de reemplazo es capaz de reducir materiales acumulados en lisosomas de mamífero o que puede rescatar o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosómico. Las enzimas de sustitución adecuadas para la invención incluyen tanto enzimas lisosómicas modificadas como de origen natural y pueden producirse usando métodos recombinantes y sintéticos o purificarse a partir de fuentes naturales. Una enzima de reemplazo puede ser una enzima recombinante, sintética, activada por genes o natural.

Soluble: Como se usa en la presente, el término "soluble" se refiere a la capacidad de un agente terapéutico para formar una solución homogénea. En algunas realizaciones, la solubilidad del agente terapéutico en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

la solución en la que se administra y mediante la cual se transporta al sitio de acción objetivo es suficiente para permitir la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico al sitio objetivo de acción. Varios factores pueden afectar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden afectar a la solubilidad de la proteína incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes o sales de co-solubilización (por ejemplo, sales de calcio). En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos de acuerdo con la presente invención son solubles en su composición farmacéutica correspondiente.

Estabilidad: Como se usa en la presente, el término "estable" se refiere a la capacidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima recombinante) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayoría de su actividad biológica y/o integridad fisicoquímica previstas) durante largos períodos de tiempo. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de dicho agente terapéutico, puede evaluarse durante largos períodos de tiempo (por ejemplo, durante por lo menos 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En el contexto de una formulación, una formulación estable es aquella en la que el agente terapéutico en la misma mantiene esencialmente su integridad física y/o química y la actividad biológica durante el almacenamiento y durante los procesos (como congelación/descongelación, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteína, puede medirse mediante la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), pérdida de actividad enzimática, generación de fragmentos de péptidos y cambio de perfiles de carga.

Procesamiento viral: Como se usa en la presente, el término "procesamiento viral" se refiere a "eliminación viral", en la cual los virus simplemente se eliminan de la muestra, o "inactivación viral", en la que los virus permanecen en una muestra pero de una manera no infecciosa. En algunas realizaciones, la eliminación viral puede utilizar nanofiltración y/o técnicas cromatográficas, entre otras. En algunas realizaciones, la inactivación viral puede utilizar inactivación de solventes, inactivación de detergentes, pasteurización, inactivación de pH ácido, y/o inactivación de ultravioleta, entre otros.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, un método mejorado para purificar proteína I2S recombinante para la terapia de reemplazo enzimático en base a un proceso que implica menos de 6 pasos de cromatografía. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe un método para purificar proteína I2S recombinante a partir de una preparación impura usando un proceso basado en una o más cromatografías de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de modo mixto, y cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe un método para purificar proteína I2S recombinante a partir de una preparación impura mediante la realización de cromatografía Q, cromatografía con hidroxiapatita (HA), cromatografía de SP y cromatografía de fenilo. La presente divulgación describe además proteína I2S recombinante purificada y método de uso.

Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones. El uso de subsecciones no pretende limitar la invención. Cada subsección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

Proteína I2S recombinante

Como se usa en la presente, una proteína I2S es cualquier proteína o una porción de una proteína que puede sustituir por lo menos a la actividad parcial de la proteína Iduronato-2-sulfatasa (I2S) de origen natural o rescatar uno o más fenotipos o síntomas asociados con deficiencia de I2S. Como se usa en la presente, los términos "una enzima I2S" y "una proteína I2S", y equivalentes gramaticales, se usan indistintamente.

Típicamente, la proteína I2S humana se produce como una forma precursora. La forma precursora de I2S humana contiene un péptido señal (residuos de aminoácido 1-25 del precursor de longitud completa), un pro-péptido (residuos de aminoácido 26-33 del precursor de longitud completa), y una cadena (residuos 34-550 del precursor de longitud completa) que puede procesarse adicionalmente en la cadena de 42 kDa (residuos 34-455 del precursor de longitud completa) y la cadena de 14 kDa (residuos 446-550 del precursor de longitud completa). Típicamente, la forma precursora también es referida como precursor de longitud completa o proteína I2S de longitud completa, que contiene 550 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de la forma madura (SEQ ID NO: 1) que tienen el péptido señal eliminado y el precursor de longitud completa (SEQ ID NO: 2) de una proteína I2S humana de tipo salvaje o de origen natural típica se muestran en la Tabla 1. El péptido señal está subrayado. Además, las secuencias de aminoácidos del precursor de la isoforma a y b de la proteína I2S humana también se proporcionan en la Tabla 1, SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 1: Iduronato-2-sulfatasa Humana

Forma Madura: SETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAF AQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTM SVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLC PVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKE FQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPV DFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHG EWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQ SMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEE DPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVW VGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ ID NO:1)

Precursor de Longitud Completa (Isoforma a)

MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGC YGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN SYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYH PSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKM KTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYN PWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSAL DDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLP EAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPV PSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNS DKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPL QDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ ID NO:2)

Precursor de Isoforma b: MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGC YGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN SYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYH PSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKM KTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYN PWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQEDQSSTGFRLKTSSTRKYK (SEQ ID NO:3)

Precursor de Isoforma c: MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGC YGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN SYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYH PSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKM KTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYN PWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSAL DDLQLANSTIIAFTSDHGFLMRTNT(SEQ ID No:4)

Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es una proteína I2S humana madura (SEQ ID NO: 1). Como se divulga en la presente, la SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos canónica para la proteína I2S humana. En algunas realizaciones, la proteína i2s puede ser una isoterma de corte y empalme y/o variante de la SEQ ID NO: 1, resultante de la transcripción en un sitio de inicio alternativo dentro del 5' UTR del gen I2S. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante puede ser un homólogo o un análogo de la proteína I2S humana madura. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteína I2S humana madura puede ser una proteína I2S humana madura modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una proteína I2S del tipo salvaje natural o de origen natural (por ejemplo , SEQ ID NO:1), mientras que retiene actividad de proteína I2S sustancial. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente homóloga a la proteína I2S humana madura (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente idéntica a la proteína I2S humana madura (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante contiene un fragmento o una porción de proteína I2S humana madura.

Alternativamente, una proteína I2S recombinante es una proteína I2S de longitud completa. En algunas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

realizaciones, una proteína I2S recombinante puede ser un homólogo o un análogo de la proteína I2S humana de longitud completa. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteína I2S humana de longitud completa puede ser una proteína I2S humana de longitud completa modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una proteína I2S de longitud completa del tipo salvaje o de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO:2), mientras que retiene la actividad sustancial de la proteína I2S. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente homóloga a la proteína I2S humana de longitud completa (SEQ ID NO:2). Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante contiene un fragmento o una porción de la proteína I2S humana de longitud completa. Como se usa en la presente, una proteína I2S de longitud completa contiene típicamente una secuencia de péptido señal.

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es una isoforma I2S humana de una proteína. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante puede ser un homólogo o un análogo de una isoforma de I2S humana de una proteína. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la isoforma I2S humana de una proteína puede ser una isoforma I2S humana modificada de una proteína que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una isoforma I2S humana de tipo salvaje o de origen natural de una proteína (por ejemplo, SEQ ID NO: 3), mientras retiene actividad de la proteína I2S sustancial. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente homóloga a la isoforma I2S humana de una proteína (SEQ ID NO: 3). Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo a la SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante contiene un fragmento o una porción de la isoforma I2S humana de una proteína. Como se usa en la presente, una isoforma I2S humana de una proteína contiene típicamente una secuencia de péptido señal.

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es una proteína de isoforma b de I2S humana. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante puede ser un homólogo o un análogo de la proteína de isoforma B de I2S humana. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteína isoforma I2S humana puede ser una proteína isoforma b I2S humana modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una proteína de isoforma b I2S humana de tipo salvaje o de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO:4), mientras que retiene la actividad de proteína I2S sustancial. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente homóloga a la proteína de isoforma b I2S humana (SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:4. Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante contiene un fragmento o una porción de proteína de isoforma b de I2S humana. Como se usa en la presente, una proteína de isoforma b I2S humana contiene típicamente una secuencia de péptido señal.

Pueden prepararse homólogos o análogos de proteínas I2S humanas de acuerdo con métodos para alterar secuencias de polipéptidos conocidas por los expertos en la técnica como las que se encuentran en referencias que recogen tales métodos. En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen sustituciones hechas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D. En algunas realizaciones, una "sustitución de aminoácido conservadora" se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera la carga relativa o las características de tamaño de la proteína en la que se hace la sustitución de aminoácidos.

En algunas realizaciones, las proteínas I2S recombinantes pueden contener una fracción que se une a un receptor en la superficie de células objetivo para facilitar la absorción celular y/o la dirección lisosómica. Por ejemplo, dicho receptor puede ser el receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR) que se une a los residuos de manosa-6-fosfato (M6P). Además, el CI-MPR también se une a otras proteínas incluyendo IGF-II. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante contiene residuos de M6P en la superficie de la proteína. En particular, una proteína I2S recombinante puede contener oligosacáridos bis-fosforilados que tienen una afinidad de unión más alta con el CI-MPR. En algunas realizaciones, una enzima adecuada contiene hasta aproximadamente una media de aproximadamente por lo menos un 20% de oligosacáridos bis-fosforilados por enzima. En otras realizaciones, una enzima adecuada puede contener aproximadamente un 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% oligosacáridos bis-fosforilados por enzima.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En algunas realizaciones, las enzimas I2S recombinantes pueden fusionarse con una fracción de dirección lisosómica que es capaz de unirse a un receptor en la superficie de las células objetivo. Una fracción de dirección lisosómica adecuado puede ser IGF-I, IGF-II, RAP, p97, y variantes, homólogos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, Incluyendo aquellos péptidos que tienen una secuencia por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, o 95% idéntica a una secuencia de péptidos de IGF-I, IGF-II, RAP, p97 humanos maduros de tipo salvaje). La fracción de dirección lisosómica puede conjugarse o fusionarse con una proteína o enzima I2S en el extremo terminal N, el extremo terminal C o internamente.

Producción de Proteínas I2S Recombinantes

Los métodos divulgados en la presente pueden usarse para purificar una proteína I2S recombinante producida por varios medios. Por ejemplo, una proteína I2S puede producirse de manera recombinante utilizando un sistema de célula huésped diseñado para expresar un ácido nucleico que codifica I2S. Alternativamente, una proteína I2S puede producirse activando un gen I2S endógeno.

Se contempla que los métodos divulgados en la presente puedan usar para purificar una proteína I2S recombinante producida usando varios sistemas de expresión. Los sistemas de expresión adecuados incluyen, por ejemplo, células de huevo, baculovirus, plantas, levaduras o mamíferos.

En algunas realizaciones, las enzimas I2S se producen en células de mamífero. Los ejemplos no limitativos de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con los métodos divulgados en la presente incluyen línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, ECACC N° 851 10503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, Países Bajos); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o 293 subclonadas para cultivo en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59,1977); línea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT1080); células de riñón de cría de hámster (BHK21, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino +/- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CcL 70); Células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, AtCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MmT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se usan para purificar enzimas I2S recombinantes producidas a partir de células humanas (por ejemplo, HT1080). En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se usan para purificar enzimas I2S recombinantes producidas a partir de células CHO.

Típicamente, las células que están diseñadas para expresar I2S recombinante pueden comprender un transgén que codifica una proteína 12S recombinante descrita en la presente. Debe apreciarse que los ácidos nucleicos que codifican I2S recombinante pueden contener secuencias reguladoras, secuencias de control de gen, promotores, secuencias no codificantes y/u otras secuencias apropiadas para expresar la I2S recombinante. Típicamente, la región codificante está operativamente ligada con uno o más de estos componentes de ácido nucleico.

Las "secuencias reguladoras" se refieren típicamente a secuencias de nucleótidos localizadas secuencia arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro, o secuencia abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. Algunas veces, las "secuencias reguladoras" también son referidas como "secuencias de control de genes".

"Promotor" se refiere típicamente a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante está localizada 3' en una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste de elementos secuencia arriba proximales y más distales, los últimos elementos referidos a menudo como potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o especificidad tisular de un promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Se entiende por los expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tipos de tejido so células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las "secuencias no codificantes 3' " se refieren típicamente a secuencias de nucleótidos localizadas secuencia abajo de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente por afectar a la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm.

La "secuencia líder de la traducción" o "secuencias 5' no codificantes" se refiere típicamente a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm completamente procesado secuencia arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar al procesamiento del transcrito primario al ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficacia de la traducción.

Típicamente, el término "ligado operativamente" o "ligado operablemente" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de tal manera que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden ligarse operativamente a secuencias reguladoras en orientación con sentido o antisentido.

La región codificante de un transgén puede incluir una o más mutaciones silenciosas para optimizar el uso de codones para un tipo de célula particular. Por ejemplo, los codones de un transgén I2S pueden optimizarse para la expresión en una célula de vertebrado. En algunas realizaciones, los codones de un transgén I2S pueden optimizarse para la expresión en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, los codones de un transgén I2S pueden optimizarse para la expresión en una célula humana.

Opcionalmente, un constructo puede contener componentes adicionales tales como uno o más de los siguientes: un sitio de corte y empalme, una secuencia potenciadora, un gen marcador seleccionable bajo el control de un promotor apropiado, un gen marcador amplificable bajo el control de un promotor apropiado, y una región de unión a la matriz (MAR) u otro elemento conocido en la técnica que mejore la expresión de la región donde se inserta.

Una vez transfectados o transducidos en células huésped, un vector adecuado puede expresarse extracromosómicamente (episómicamente) o integrarse en el genoma de la célula huésped.

Activación de proteínas I2S recombinantes

Típicamente, una enzima I2S recombinante se activa mediante la modificación postraduccional de una cisteína conservada (que corresponde al aminoácido 59 de la I2S humana madura) a formilglicina, también conocida como ácido 2-amino-3-oxopropiónico, u oxo- alanina. Tal modificación post-traduccional puede llevarse a cabo por una enzima conocida como Enzima que Genera Formilglicina (FGE). Por tanto, en algunas realizaciones, las enzimas I2S recombinantes se producen en células que también expresan proteína FGE. En realizaciones particulares, las enzimas I2S recombinantes se producen en células que tienen una expresión aumentada o mejorada de la proteína FGE. Por ejemplo, las células pueden diseñarse para sobreexpresar FGE en combinación con I2S recombinante para facilitar la producción de preparaciones de I2S que tienen altos niveles de enzima activa. En algunas realizaciones, la sobreexpresión de FGE se logra mediante la expresión (por ejemplo, sobreexpresión) de una FGE exógena usando tecnología recombinante estándar. En algunas realizaciones, la sobreexpresión de FGE se logra mediante la expresión activada o mejorada de una FGE endógena mediante, por ejemplo, la activación o mejora del promotor del gen de FGE endógeno. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica la proteína I2S recombinante y el ácido nucleico que codifica una proteína FGE recombinante están ligadas por un ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia espaciadora) que tiene una secuencia correspondiente a un sitio de entrada ribosómico interno.

Puede utilizarse cualquier FGE que tenga capacidad para convertir cisteína en formilglicina en los métodos de la divulgación. Ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos ejemplares para proteínas FGE se divulgan en la US 2004-0229250. Debe apreciarse que los ácidos nucleicos que codifican fGe recombinante pueden comprender secuencias reguladoras, secuencias de control de gen, promotores, secuencias no codificantes y/u otras secuencias apropiadas para expresar la FGE. Típicamente, la región codificante está operativamente ligada con uno o más de estos componentes de ácidos nucleicos.

Medio y Condición de Cultivo Celular

Pueden usarse varios medios y condiciones de cultivo celular para producir una proteína I2S recombinante. Por ejemplo, una proteína I2S recombinante puede producirse en medio que contiene suero o libre de suero. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante se produce en medio libre suero. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante se produce en un medio libre de animales, es decir, un medio que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

carece de componentes derivados de animales. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante se produce en un medio químicamente definido. Como se usa en la presente, el término "medio nutriente químicamente definido" se refiere a un medio del que se conocen sustancialmente todos los componentes químicos. En algunas realizaciones, un medio nutriente químicamente definido está libre de componentes derivados de animales como suero, proteínas derivadas de suero (por ejemplo, albúmina o fetuina), y otros componentes. En algunos casos, un medio químicamente definido comprende una o más proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento de proteínas o citoquinas). En algunos casos, un medio nutriente químicamente definido comprende uno o más hidrolizados de proteínas. En otros casos, un medio nutriente químicamente definido es un medio libre de proteínas, es decir, un medio libre de suero que no contiene proteínas, hidrolizados o componentes de composición desconocida.

En algunas realizaciones, un medio químicamente definido se puede complementar con uno o más componentes derivados de animales. Tales componentes derivados de animales incluyen, pero no están limitados a, suero de ternera fetal, suero de caballo, suero de cabra, suero de burro, suero humano y proteínas derivadas de suero como albúminas (por ejemplo, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano).

Pueden usarse varias condiciones de cultivo celular para producir proteínas I2S recombinantes a gran escala, incluyendo, pero no limitadas a, cultivos de frascos rotatorios, cultivos por lotes de biorreactor y cultivos alimentados por lotes de biorreactor. En algunas realizaciones, la proteína I2S recombinante se produce por células cultivadas en suspenso. En algunas realizaciones, la proteína I2S recombinante se produce por células adherentes.

Los medios celulares y las condiciones de cultivo ejemplares se describen en las secciones de Ejemplos. Métodos y composiciones ejemplares adicionales para producir proteína I2S recombinante se describen en la solicitud provisional titulada " Methods and Compositions for Producing Recombinant Iduronate-2-Sulfatase" presentada junto con la presente en la misma fecha, la divulgación completa de la cual se incorpora en la presente como referencia.

Purificación de Proteína I2S Recombinante

En algunas realizaciones de la presente divulgación puede lograrse un método para purificar proteína I2S recombinante a partir de una preparación impura usando un proceso basado en una o más de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de modo mixto, y cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas realizaciones, el método implica menos de 6 (por ejemplo, menos de 5, menos de 4, o menos de 3) pasos de cromatografía. En algunas realizaciones, el método implica 2, 3, 4 ó 5 pasos de cromatografía. En algunas realizaciones, el método implica 4 pasos de cromatografía. En algunas realizaciones, el método de acuerdo con la presente divulgación realiza cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de modo mixto, cromatografía de intercambio catiónico, y cromatografía de interacción hidrófoba en ese orden.

Preparación impura

Como se usa en la presente, una preparación impura puede ser cualquier material biológico que incluya material biológico no procesado que contiene proteína I2S recombinante. Por ejemplo, una preparación impura puede ser un medio de cultivo celular no procesado que contiene proteína I2S recombinante secretada a partir de las células (por ejemplo, células de mamífero) que producen proteína I2S o lisados celulares brutos que contienen proteína I2S. En algunas realizaciones, una preparación impura puede ser un medio celular o lisados celulares parcialmente procesados. Por ejemplo, el medio celular o los lisados celulares pueden concentrarse, diluirse, tratarse con inactivación viral, procesamiento viral o eliminación viral. En algunas realizaciones, la eliminación viral puede utilizar nanofiltración y/o técnicas cromatográficas, entre otras. En algunas realizaciones, la inactivación viral puede utilizar inactivación de solventes, inactivación de detergentes, pasteurización, inactivación del pH ácida, y/o inactivación ultravioleta, entre otros. El medio celular o los lisados celulares también pueden tratarse con proteasa, ADNasas y/o ARNasas para reducir el nivel de proteína de la célula huésped y/o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN). En algunas realizaciones, los materiales biológicos no procesados o parcialmente procesados (por ejemplo, medio celular o lisado celular) pueden congelarse y almacenarse a una temperatura deseada (por ejemplo, 2-8° C, - 4° C, -25° C, -75° C) durante un período de tiempo y luego descongelarse para la purificación. Como se usa en la presente, una preparación impura también es referida como material de partida o material de carga.

Cromatografía de intercambio aniónico

En algunas realizaciones, los métodos para purificar I2S recombinante incluyen cromatografía de intercambio aniónico. En resumen, la cromatografía de intercambio aniónico es una técnica cromatográfica que se basa en las interacciones carga-carga entre un compuesto cargado negativamente y una resina cargada positivamente. En algunas realizaciones, la cromatografía de intercambio aniónico es una cromatografía de intercambio aniónico fuerte. En algunas realizaciones, la cromatografía de intercambio aniónico se emplea como un primer paso de purificación para una proteína terapéutica (por ejemplo, I2S recombinante).

Las resinas de intercambio aniónico ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, resinas de amina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cuaternaria o "Q-resinas" (por ejemplo, Capto™-Q, Q-Sepharose®, QAE Sephadex®); resinas de dietilaminoetano (DEAE) (por ejemplo, DEAE-Trisacryl®, DEAE Sepharose®, benzoilado naftoilado DEAE, dietilaminoetilo Sephacel®); resinas Amberjet®; resinas Amberlyst®s; resinas Amberlite® (por ejemplo, Amberlite® IRA-67, Amberlite® fuertemente básica, Amberlite® débilmente básica), resina de colestiramina, resinas ProPac® (por ejemplo, ProPac® SAX-10, ProPac® WAX-10, ProPac® WCX-10); resinas TSK-GEL® (por ejemplo, TSKgel DeAe- NPR; TSKgel DEAE-5PW); y resinas Acclaim®. En ciertas realizaciones, la resina de intercambio aniónico es una resina Q.

Las fases móviles típicas para la cromatografía de intercambio aniónico incluyen soluciones relativamente polares, como agua, acetonitrilo, alcoholes orgánicos como metanol, etanol e isopropanol, o soluciones que contienen ácido 2- (N-morfolino)-etanosulfónico (MES). Por tanto, en ciertas realizaciones, la fase móvil incluye aproximadamente un 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o aproximadamente un 100% de solución polar. En ciertas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 100%, aproximadamente el 5% a aproximadamente el 95%, aproximadamente el 10% a aproximadamente el 90%,

aproximadamente el 20% a aproximadamente el 80%, aproximadamente el 30% a aproximadamente el 70% o

aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60% de solución polar en cualquier momento dado durante el

transcurso de la separación.

Generalmente, una fase móvil incluye una sal. Por ejemplo, una sal (por ejemplo, cloruro de sodio) puede eluir una proteína unida de una columna de intercambio aniónico (por ejemplo, el contraión es cloruro y se intercambia por la proteína objetivo, que luego se libera). En algunas realizaciones, la fase móvil incluye una concentración de sal de entre aproximadamente 0 a aproximadamente 1, 0, por ejemplo, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,8 M, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,6 M, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,5 M, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,4 M, entre aproximadamente 0,05 M y aproximadamente 0,50 M, entre aproximadamente 0,10 M y aproximadamente 0,45 M, entre aproximadamente 0,10 M y aproximadamente 0,40 M, o entre aproximadamente 0,15 M y aproximadamente 0,40M. En algunas realizaciones, la fase móvil incluye una concentración de sal de aproximadamente 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4. M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M o 1,0 M. En algunas realizaciones, la concentración de sal en la fase móvil es un gradiente (por ejemplo, gradiente lineal o no lineal). En algunas realizaciones, la concentración de sal en la fase móvil es constante. En algunas realizaciones, la concentración de sal en la fase móvil puede aumentar o disminuir escalonadamente.

Típicamente, la fase móvil está tamponada. En ciertas realizaciones, la fase móvil no está tamponada. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 14. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH de aproximadamente 6,5. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH de aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10.

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a un pH de aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 o 7,5 y la conductividad de aproximadamente 2 mS/cm, 4 mS/cm, 6 mS/cm, 8 mS/cm, 10 mS/cm, 12 mS/cm, 14 mS/cm, 16 mS/cm, 18 mS/cm o 20 mS/cm antes de la carga en la columna de cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, columna Q). El pH puede ajustarse usando acetato de sodio (por ejemplo, 1M) y la conductividad puede ajustarse usando cloruro de sodio (por ejemplo, 5M). Una vez cargada, una columna de cromatografía de intercambio aniónico puede lavarse usando un tampón de lavado que comprende una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 200 mM (por ejemplo, aproximadamente 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM o 200 mM) con un pH de aproximadamente 5,0-7,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 o 7,5) . Una columna de cromatografía de intercambio aniónico puede eluirse usando un tampón de elución que comprende un gradiente de NaCl lineal. Un gradiente de NaCl lineal ejemplar adecuado puede contener un intervalo de aproximadamente 0-500 mM de NaCl (por ejemplo, aproximadamente 0-400 mM, aproximadamente 0-350 mM, aproximadamente 0-300 mM, aproximadamente 50-500 mM, aproximadamente 150-500 mM, aproximadamente 150-450 mM, aproximadamente 150-400 mM).

Cromatografía de Intercambio Catiónico

En algunas realizaciones, los métodos para purificar I2S recombinante incluyen cromatografía de intercambio catiónico. Brevemente, la cromatografía de intercambio catiónico es una técnica cromatográfica que se basa en las interacciones carga-carga entre un compuesto cargado positivamente y una resina cargada negativamente. En algunas realizaciones, la cromatografía de intercambio catiónico es una cromatografía de intercambio catiónico fuerte.

La cromatografía de intercambio catiónico se pone en práctica generalmente con una columna de intercambio catiónico fuerte o débil, que contiene un ion de sulfonio, o con un intercambiador de cationes débil, que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tiene habitualmente un grupo funcional de carboximetilo (CM) o carboxilato (CX). Muchas resinas de intercambio de cationes adecuadas son conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente e incluyen, pero no están limitadas a SP-Sepharose®, CM Sepharose®; resinas Amberjet®; resinas Amberlyst®; resinas Amberlite® (por ejemplo, Amberlite® IRA120); resinas PROPAC® (por ejemplo, ProPac® SCX-10, ProPac® WCX-10, ProPac® WCX-10); resinas TSK-GEL® (por ejemplo, TSKgel BioAssist S; TSKgel SP-2SW, TSKgel SP- 5PW; TSKgel SP-NPR; TSKgel SCX; TSKgel SP-STAT; TSKgel CM-5PW; TSKgel OApak-A; TSKgel CM-2SW, TSKgel CM-3SW y TSKgel CM-STAT); y resinas Acclaim®. En ciertas realizaciones, la resina de intercambio aniónico es una resina SP-Sepharose®.

Las fases móviles típicas para la cromatografía de intercambio catiónico incluyen soluciones relativamente polares, como agua, acetonitrilo, alcoholes orgánicos como metanol, etanol e isopropanol, o soluciones que contienen ácido 2- (N-morfolino)-etanosulfónico (MES). Por tanto, en ciertas realizaciones, la fase móvil incluye aproximadamente el 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o aproximadamente el 100% de solución polar. En ciertas realizaciones, la fase móvil incluye entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 100%, aproximadamente el 5% y aproximadamente el 95%, aproximadamente el 10% y aproximadamente el 90%, aproximadamente el 20% y aproximadamente el 80%, aproximadamente el 30% y aproximadamente el 70%, o aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 60% de solución polar en cualquier momento dado durante el transcurso de la separación.

Generalmente, una fase móvil incluye una sal. Por ejemplo, una sal (por ejemplo, cloruro de sodio, fosfato de sodio, etc.) puede eluir una proteína unida de una columna de intercambio catiónico (por ejemplo, el contraión es sodio y se intercambia por la proteína objetivo, que luego se libera). En algunas realizaciones, la fase móvil incluye una concentración de sal de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 1,0, por ejemplo, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,8 M, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,6 M, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,5 M, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,4 M, entre aproximadamente 0,05 M y aproximadamente 0,50 M, entre aproximadamente 0,10 M y aproximadamente 0,45 M, entre aproximadamente 0,10 M y aproximadamente 0,40 M, o entre aproximadamente 0,15 M y aproximadamente 0,40 M. En algunas realizaciones, la fase móvil incluye una concentración de sal de aproximadamente 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M, o 1,0 M. En algunas realizaciones, la concentración de sal en la fase móvil es un gradiente (por ejemplo, gradiente lineal o no lineal). En algunas realizaciones, la concentración de sal en la fase móvil es constante. En algunas realizaciones, la concentración de sal en la fase móvil puede aumentar o disminuir escalonadamente.

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una conductividad que varía entre aproximadamente 1 mS/cm y 20 mS/cm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 mS/cm y 15 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 10 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 8 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 6 mS/cm, entre aproximadamente 1 mS/cm y 4 mS/cm, entre aproximadamente 2 mS/cm y 4 mS/cm) antes de cargarla en la columna de cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, columna SP). En realizaciones particulares, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una conductividad que varía entre n aproximadamente 2 mS/cm y 4 mS/cm (por ejemplo, 2, 2,5, 3, 3,5 o 4 mS/cm) antes de cargarla en la columna de cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, columna SP). La conductividad puede ajustarse diluyendo una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo con H2O a, por ejemplo, una proporción 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 4,0:1, 5,0:1, o 10:1. La conductividad también puede ajustarse mediante dialfiltración en un tampón deseado. En algunas realizaciones, una columna de cromatografía de intercambio catiónico se ejecuta a un pH de aproximadamente 5,0-6,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0 o 6,5). En algunas realizaciones, una columna de cromatografía de intercambio catiónico se ejecuta con un tampón que comprende una concentración de fosfato (por ejemplo, NaPO4) que varía de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,1 M (por ejemplo, aproximadamente 0,01 M, 0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M o 0,1 M). En algunas realizaciones, un pH adecuado es aproximadamente 5,0-6,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0 o 6,5).

Cromatografía de Modo Mixto

La cromatografía de hidroxiapatita (HA) se considera que es una cromatografía de "pseudoafinidad" o un intercambio iónico de "modo mixto" y puede usarse de acuerdo con los métodos divulgados en la presente. La hidroxiapatita es una forma única de fosfato de calcio usada en el fraccionamiento y purificación de moléculas biológicas. En algunos casos, puede usarse hidroxiapatita cristalina, aunque la fragilidad de los cristales puede limitar los caudales y/o la longevidad de la columna. Dos tipos de hidroxiapatita cerámica químicamente pura,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

hidroxiapatita de cerámica CHT Tipos I y II son macroporosas, esféricas y pueden usarse a caudales y presiones altos. El Tipo I generalmente tiene una alta capacidad de unión a proteínas, mientras que el Tipo II generalmente tiene una capacidad de unión a proteínas más baja. En general, la fórmula de la hidroxiapatita es Ca-i0(PO4)6(OH)2 (Kawasaki, et al 1985). Los grupos funcionales incluyen pares positivamente cargados de iones calcio cristalinos (sitios C) y grupos de seis átomos de oxígeno cargados negativamente asociados con tripletes de fosfatos cristalinos (sitios P). Los sitios C, los sitios P y los hidroxilos se distribuyen en un patrón fijo en la superficie del cristal, llevando generalmente a interacciones complejas con proteínas y otras moléculas.

Una muestra puede cargarse en una columna HA en tampón fosfato de baja fuerza iónica (por ejemplo, fosfato de sodio o de potasio 1-10 mM) a pH neutro o casi neutro. En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una concentración de fosfato (por ejemplo, NaPO4) que varía de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 0,01 M (por ejemplo, aproximadamente 0,001 M, 0,002 M, 0,003 M, 0,004 M, 0,005 M, 0,006 M, 0,007 M, 0,008 M, 0,009 M, o 0,01 M) y un pH de aproximadamente 5,0-6,5 (por ejemplo, aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, o 6,5) antes de cargar la columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA). La columna HA cargada se lava típicamente con un tampón de lavado que tiene una concentración de fosfato comparable a la del tampón de carga. En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna HA), una vez cargada, se lava con un tampón de lavado que contiene fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio o potasio 1-10 mM) a pH neutro o casi neutro. Por ejemplo, un tampón de lavado adecuado puede tener una concentración de fosfato de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM o 10 mM. En algunas realizaciones, puede ser deseable aumentar la cantidad de fosfato en el tampón de lavado para crear una condición de lavado más rigurosa. Se contempla que los niveles de M6P, en particular los niveles de di-M6P, en la superficie de las proteínas I2S son importantes para el direccionamiento lisosómico. La concentración de fosfato aumentada en el tampón de lavado puede retener selectivamente proteínas I2S con altos niveles de M6P, en particular, di-M6P en la columna HA. Por tanto, en algunas realizaciones, un tampón de lavado deseado puede tener una concentración de fosfato de o mayor que 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM. En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de modo mixto cargada (por ejemplo, columna HA) se lava con un tampón de lavado que tiene una concentración de fosfato que varía de aproximadamente 10-20 mM (por ejemplo, aproximadamente 10-18 mM, 10-16 mM, 10-15 mM, 12-20 mM, 14-18 mM, 14-16 mM). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de modo mixto cargada (por ejemplo, columna HA) se lava con un tampón de lavado que tiene una

concentración de fosfato de o mayor que 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM,

19 mM, 20 mM.

La elución de una columna HA se logra típicamente con un tampón de fosfato de gradiente. Por ejemplo, un tampón de elución adecuado puede tener un gradiente de fosfato de aproximadamente 1-400 mM (por ejemplo, 1300 mM, 1-200 mM, 1-150 mM, 1-100 mM, 10-350 mM, 10-300 mM, 10-250 mM, 10-200 mM, 10-150 mM, 10-140 mM, 10-130 mM, 10-120 mM, 10-110 mp, 10-100 mM, 10-90 mM, 10-80 mM, 10-70 mM, 10-60 mM, 10 -50 mM) de

fosfato de sodio. En algunas realizaciones, la elución de una columna HA se consigue aumentando

escalonadamente la concentración de fosfato en el tampón de elución. En algunas realizaciones, los tampones de elución escalonados pueden tener una concentración de fosfato seleccionada de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 1 10 mM, 120 mM. , 130 mM, 140 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM. En algunas realizaciones, la elución de una columna de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, columna de HA) se logra mediante un tampón de elución que tiene una concentración de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) que varía de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM (por ejemplo, seleccionada de una concentración de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio) de aproximadamente 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, y combinaciones de los mismos).

Se apreciará que se conocen muchas combinaciones diferentes de condiciones para la cromatografía HA y pueden usarse para ajustar los parámetros para que sean adecuados para una proteína de interés particular (por ejemplo, I2S recombinante).

Cromatografía de Interacción Hidrófoba

La Cromatografía de Interacción Hidrófoba (HIC) es una técnica de separación que usa las propiedades de hidrofobicidad para separar proteínas entre sí. En este tipo de cromatografía, grupos hidrófobos como fenilo, octilo o butilo, se unen a la columna estacionaria. Las proteínas que pasan a través de la columna que tienen cadenas laterales de aminoácidos hidrófobas en sus superficies pueden interactuar y unirse a los grupos hidrófobos en la columna. Se conocen las columnas HIC e incluyen, por ejemplo, fenil sefarosa

Las separaciones HIC se diseñan a menudo usando las condiciones opuestas a las usadas en la cromatografía de intercambio iónico. En general, se aplica inicialmente a la columna un tampón con una fuerza iónica alta, habitualmente sulfato de amonio. La sal en el tampón reduce la solvatación de los solutos de muestra a medida que disminuye la solvatación, las regiones hidrófobas que quedan expuestas son adsorbidas por el medio. La fase estacionaria está diseñada generalmente para formar interacciones hidrófobas con otras moléculas. Estas interacciones son generalmente demasiado débiles en agua, sin embargo, la adición de sales (por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ejemplo, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, NaCI, NH4CI, NaBr, y NaSCN) al tampón da como resultado interacciones hidrófobas. En algunas realizaciones, la fase móvil incluye una concentración de sal entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 3,0 M, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 1,5 M, entre aproximadamente 0,2 M y aproximadamente 0,8 M, o entre aproximadamente 0,3 M y aproximadamente 0,5 M.

En ciertas realizaciones, la fase móvil está tamponada. En ciertas realizaciones, la fase móvil no está tamponada. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 14. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7. En ciertas realizaciones, la fase móvil se tampona a un pH de aproximadamente 5,0.

En algunas realizaciones, una preparación impura o un eluido intermedio o flujo continuo se ajusta a una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2,0 M (por ejemplo, aproximadamente 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M, o 2,0 M) a un pH de aproximadamente 4,5-6,0 (por ejemplo, aproximadamente 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0) antes de cargarla en la columna de cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, columna de fenilo). Una vez cargada, una columna de cromatografía de interacción hidrófoba puede lavarse usando un tampón de lavado que comprende una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 2,0 M (por ejemplo, aproximadamente 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M o 2,0 M) a un pH de aproximadamente 4,5-6,0 (por ejemplo, aproximadamente 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía de interacción hidrófoba se eluye usando un tampón de elución que comprende una concentración de sal (por ejemplo, NaCl) que varía de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M (por ejemplo, aproximadamente 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, o 0,5 M) a un pH de aproximadamente 4,5-6,0 (por ejemplo aproximadamente 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0).

Caracterización de Proteínas I2S Purificadas

La proteína I2S recombinante purificada se puede caracterizar usando varios métodos.

Pureza

La pureza de la proteína I2S recombinante purificada se mide típicamente por el nivel de varias impurezas (por ejemplo, proteína de la célula huésped o ADN de la célula huésped) presente en el producto final. Por ejemplo, el nivel de proteína de la célula huésped (HCP) se puede medir mediante ELISA o SDS-PAGE. En la presente invención la proteína I2S recombinante purificada contiene menos de 150 ng HCP/mg de proteína I2S (por ejemplo, menos de 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 30 , 20, 10 ng HCP/mg de proteína I2S). En algunas realizaciones, la proteína I2S recombinante purificada, cuando se somete a SDS-PAGE con tinción de plata, no tiene nuevas bandas con intensidad mayor que 0,05%, 0,01%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% o 0,5% de control del ensayo. Se pueden usar varios controles de ensayo, en particular, aquellos que son aceptables para agencias reguladoras como la FDA.

Actividad Específica

La proteína I2S recombinante purificada también puede caracterizarse evaluando la actividad funcional y/o biológica. La actividad enzimática de una composición de I2S recombinante puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica. Típicamente, los métodos implican detectar la eliminación de sulfato de un sustrato sintético, que se conoce como ensayo de liberación de sulfato. Un ejemplo de un ensayo de actividad enzimática implica el uso de cromatografía iónica. Este método cuantifica la cantidad de iones de sulfato que se liberan enzimáticamente por la I2S recombinante de un sustrato. El sustrato puede ser un sustrato natural o un sustrato sintético. En algunos casos, el sustrato es sulfato de heparina (por ejemplo, disacárido de heparina), sulfato de dermatán, o un equivalente funcional de los mismos. Típicamente, el ion de sulfato liberado se analiza mediante cromatografía iónica con un detector de conductividad. En este ejemplo, los resultados pueden expresarse como U/mg de proteína donde 1 Unidad se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pl de ion de sulfato por hora del sustrato. En algunas realizaciones, la proteína I2S recombinante purificada tiene una actividad específica, medida mediante el ensayo de actividad de liberación de sulfato in vitro usando disacárido de heparina como sustrato, que varía de aproximadamente 0-100 U/mg, aproximadamente 10-100 U/mg, aproximadamente 1080 U/mg, aproximadamente 20-80 U/mg, aproximadamente 20-70 U/mg, aproximadamente 20-60 U/mg, aproximadamente 20-50 U/mg, aproximadamente 30-100 U/mg, aproximadamente 30-90 U/mg, aproximadamente 30-80 U/mg, aproximadamente 30-70 U/mg, aproximadamente 30-60 U/mg, aproximadamente 40-100 U/mg, aproximadamente 40-90 U/mg, aproximadamente 40-80 U/mg, aproximadamente 40-70 U/mg, aproximadamente 4060 U/mg. En algunas realizaciones, la proteína I2S recombinante purificada tiene una actividad específica, medida mediante el ensayo de actividad de liberación de sulfato in vitro usando disacárido de heparina como sustrato, de por lo menos aproximadamente 5 U/mg, aproximadamente 10 U/mg, aproximadamente 15 U/mg, aproximadamente 20 U/mg, aproximadamente 25 U/mg, aproximadamente 30 U/mg, aproximadamente 35 U/mg, aproximadamente 40 U/mg, aproximadamente 45 U/mg, aproximadamente 50 U/mg, aproximadamente 55 U/mg, aproximadamente 60

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

U/mg, aproximadamente 65 U/mg, aproximadamente 70 U/mg, aproximadamente 75 U/mg, aproximadamente 80 U/mg, aproximadamente 85 U/mg, aproximadamente 90 U/mg, aproximadamente 95 U/mg, o aproximadamente 100 U/mg. Las condiciones ejemplares para realizar el ensayo de actividad de liberación de sulfato in vitro usando disacárido de heparina como sustrato se proporcionan a continuación. Típicamente, este ensayo mide la capacidad de I2S para liberar iones de sulfato de un sustrato de origen natural, disacárido de heparina. El sulfato liberado se puede cuantificar mediante cromatografía iónica. En algunos casos, la cromatografía iónica está equipada con un detector de conductividad. Como un ejemplo no limitativo, las muestras se intercambian primero con tampón a acetato de Na 10 mM, pH 6 para eliminar la inhibición por iones de fosfato en el tampón de formulación. Las muestras se diluyen luego a 0,075 mg/ml con tampón de reacción (acetato de Na 10 mM, pH 4,4) y se incuban durante 2 horas a 37° C con disacárido de heparina a una proporción de enzima a sustrato de 0,3 |jg de I2S/100 |jg de sustrato en un volumen de reacción de 30jl. La reacción se detiene luego calentando las muestras a 100° C durante 3 min. El análisis se lleva a cabo usando una columna analítica Dionex lonPac AS 18 con una columna de protección lonPac AG 18. Se usa un método isocrático con hidróxido de potasio 30 mM a 1,0 ml/min durante 15 minutos. La cantidad de sulfato liberado por la muestra de I2S se calcula a partir del análisis de regresión lineal de los estándares de sulfato en el intervalo de 1,7 a 16,0 nmoles. El valor registrable se expresa como Unidades por mg de proteína, donde 1 unidad se define como 1 jmoles de sulfato liberado por hora y la concentración de proteína se determina por mediciones de A280.

En algunas realizaciones, la actividad enzimática de la proteína I2S recombinante también puede determinarse usando varios otros métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, el ensayo 4-MUF que mide la hidrólisis del 4-metilumbeliferil-sulfato a sulfato y 4-metilumbeliferona fluorescente de manera natural(4-MUF). En algunas realizaciones, una actividad enzimática deseada, medida por el ensayo 4-MUF in vitro, de la proteína I2S recombinante producida es por lo menos aproximadamente 0,5 U/mg, 1,0 U/mg, 1,5 U/mg, 2 U/mg, 2,5 U/mg, 3 U/mg, 4 U/mg, 5 U/mg, 6 U/mg, 7 U/mg, 8 U/mg, 9 U/mg, 10 U/mg, 12 U/mg, 14 U/mg, 16 U/mg, 18 U/mg o 20 U/mg. En algunas realizaciones, una actividad enzimática deseada, medida por el ensayo de 4-MUF in vitro, de la proteína I2S recombinante producida varía de aproximadamente 0-50 U/mg (por ejemplo, aproximadamente 0-40 U/mg, aproximadamente 0-30 U/mg, aproximadamente 0-20 U/mg, aproximadamente 0-10 U/mg, aproximadamente 2-50 U/mg, aproximadamente 2-40 U/mg, aproximadamente 2-30 U/mg, aproximadamente 2-20 U/mg, aproximadamente 2-10 U/mg, aproximadamente 4-50 U/mg, aproximadamente 4 -40 U/mg, aproximadamente 4-30 U/mg, aproximadamente 4-20 U/mg, aproximadamente 4-10 U/mg, aproximadamente 6-50 U/mg, aproximadamente 6-40 U/mg, aproximadamente 6-30 U/mg, aproximadamente 6-20 U/mg, aproximadamente 6-10 U/mg). Las condiciones ejemplares para realizar el ensayo 4-MUF in vitro se proporcionan a continuación. Típicamente, un ensayo 4-MUF mide la capacidad de una proteína I2S para hidrolizar 4-metilumbeliferilo-sulfato (4- MUF-SO4) a sulfato y 4-metilumbeliferona fluorescente de manera natural (4-MUF). Una miliunidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para convertir un nanomol de 4-MUF-SO4 a 4-MUF en un minuto a 37° C. Típicamente, las unidades de fluorescencia medias (MFU) generadas por las muestras de prueba I2S con actividad conocida pueden usarse para generar una curva estándar, que puede usarse para calcular la actividad enzimática de una muestra de interés. La actividad específica puede calcularse luego dividiendo la actividad de la enzima por la concentración de proteína.

En cualquier ejemplo, la concentración de proteína de una composición de I2S recombinante puede determinarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica para determinar concentraciones de proteínas. En algunos casos, la concentración de proteína se determina por un ensayo de absorbancia de luz ultravioleta. Tales ensayos de absorbancia se realizan típicamente a aproximadamente una longitud de onda de 280

nm (A280).

Perfil de Carga

La I2S recombinante purificada puede caracterizarse por el perfil de carga asociado con la proteína. Típicamente, el perfil de carga de la proteína refleja el patrón de cargas de la cadena lateral residual, presentes típicamente en la superficie de la proteína. El perfil de carga se puede determinar realizando un ensayo de cromatografía de intercambio iónico (IEX) (por ejemplo, HPLC) en la proteína. En algunas realizaciones, un "perfil de carga" se refiere a un conjunto de valores que representan la cantidad de proteína que eluye de una columna de intercambio iónico en un punto en el tiempo después de la adición a la columna de una fase móvil que contiene un ion de intercambio.

Típicamente, una columna de intercambio iónico adecuada es una columna de intercambio aniónico. Por ejemplo, un perfil de carga puede determinarse mediante cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX) usando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). En general, la I2S recombinante se adsorbe sobre la carga positiva fija de una columna de intercambio aniónico fuerte y un gradiente de fuerza iónica creciente usando una fase móvil a un caudal predeterminado eluye especies de I2S recombinantes de la columna en proporción a la fuerza de su interacción iónica con la columna con carga positiva. Las especies de I2S con más carga negativa (más ácidas) eluyen más tarde que las especies de I2S con menos carga negativa (menos ácidas). La concentración de proteínas en el eluido se detecta mediante la absorbancia de la luz ultravioleta (a 280 nm).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En algunas realizaciones, la I2S recombinante se adsorbe a aproximadamente pH 8,0 en TRIS-HCl 20 mM sobre la carga positiva fija de una columna Mini Q PE y un gradiente de fuerza iónica creciente usando una fase móvil que consiste de TRIS-HCL 20 mM, cloruro sódico 1 M, pH 8,0 a un caudal de 0,8 ml/min que eluye especies recombinantes de I2S de la columna en proporción a la fuerza de su interacción iónica con la columna con carga positiva.

En algunas realizaciones, se puede representar un perfil de carga mediante un cromatograma de unidades de absorbancia frente al tiempo después de elución de la columna de HPLC. El cromatograma puede comprender un conjunto de uno o más picos, con cada pico en el conjunto identificando una subpoblación de I2S recombinantes de la composición que tienen cargas superficiales similares.

En algunas realizaciones, una composición de proteína I2S purificada muestra por lo menos seis picos en su perfil de carga. Un perfil ejemplar de carga de I2S se representa en la sección de Ejemplos y en la Figura 11. Como se muestra en la Figura 11, seis picos están marcados (A a F) en el orden de carga negativa creciente y contribución decreciente al área de pico total del cromatograma . En algunas realizaciones, el perfil de carga para una composición de I2S recombinante purificada contiene un número, tamaño, forma o intervalo de tiempo diferentes de picos dependiendo de la cantidad de cargas negativas o positivas en la superficie de la proteína. En algunas realizaciones, una composición de I2S recombinante tiene un perfil de carga que tiene menos de 6 (por ejemplo, menos de 5, 4, 3 o 2) picos. En algunas realizaciones, un perfil de carga de I2S recombinante puede tener 5, 4, 3, 2 o 1 pico(s). Por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco picos A, B, C, D, E y F pueden estar ausentes o reducidos en una composición de proteína I2S recombinante purificada. Típicamente, un perfil de carga se considera más homogéneo si hay menos picos.

Mapeo de Glicanos

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada puede caracterizarse por su composición de proteoglicanos, típicamente referida como mapeo de glicanos. Sin querer estar sujeto a ninguna teoría, se cree que el ligamiento del glicano junto con la forma y complejidad de la estructura de la ramificación puede afectar a la depuración in vivo, el direccionamiento lisosómico, la biodisponibilidad y/o la eficacia.

Típicamente, un mapa de glicano puede determinarse por digestión enzimática y análisis cromatográfico posterior. Se pueden usar varias enzimas para la digestión enzimática incluyendo, pero no limitadas a, glicosilasas, peptidasas (por ejemplo, Endopeptidasas, Exopeptidasas), proteasas, y fosfatasas adecuadas. En algunas realizaciones, una enzima adecuada es fosfatasa alcalina. En algunas realizaciones, una enzima adecuada es neuraminidasa. Los glicanos (por ejemplo, fosfoglicanos) pueden detectarse mediante análisis cromatográfico. Por ejemplo, los fosfoglicanos pueden detectarse mediante Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento con Detección Amperométrica Pulsada (HPAE-PAD) o Cromatografía Líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC). La cantidad de glicano (por ejemplo, fosfoglicano) representada por cada pico en un mapa de glicanos puede calcularse usando una curva estándar de glicano (por ejemplo, fosfoglicano), de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y divulgados en la presente.

En algunas realizaciones, una I2S purificada de acuerdo con la presente invención muestra un mapa de glicanos que comprende siete grupos de picos indicativos de proteína I2S neutra (grupo de picos 1), mono-sialilada (grupo de picos 2), di-sialilada (grupo de picos 3), monofosforilada (grupo de picos 4), tri-sialilada (grupo de picos 5), tetra-sialilada (grupo de picos 6) y difosforilada (grupo de picos 7), respectivamente. Los mapas de glicanos ejemplares de I2S se representan en la Figura 10. En algunas realizaciones, una I2S recombinante purificada tiene un mapa de glicanos que tiene menos de 7 grupos de picos (por ejemplo, un mapa de glicanos con 6, 5, 4, 3 o 2 grupos de picos) . En algunas realizaciones, una I2S recombinante purificada tiene un mapa de glicanos que tiene más de 7 grupos de picos (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12 o más).

La cantidad relativa de glicano correspondiente a cada grupo de picos puede determinarse en base al área de grupo de picos relativa al área de grupo de picos correspondiente en un estándar de referencia predeterminado. En algunas realizaciones, el grupo de picos 1 (neutra) puede tener el área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 40-120% (por ejemplo, aproximadamente 40-115%, aproximadamente 40-110%, aproximadamente 40-100%, aproximadamente 45-120%, aproximadamente 45-115%, aproximadamente 45-110%, aproximadamente 45-105%, aproximadamente 45-100%, aproximadamente 50-120%, aproximadamente 50-110%) en relación al área de grupo de picos correspondiente en un estándar de referencia. En algunas realizaciones, el grupo de picos 2 (monosialilada) puede tener el área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 80-140% (por ejemplo, aproximadamente 80-135%, aproximadamente 80-130%, aproximadamente 80-125%, aproximadamente 90-140%, aproximadamente 90-135%, aproximadamente 90-130%, aproximadamente 90-120%, aproximadamente 100-140%) en relación al área del grupo de picos correspondiente en el estándar de referencia. En algunas realizaciones, el grupo de picos 3 (disialilada) puede tener el área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 80-110% (por ejemplo, aproximadamente 80-105%, aproximadamente 80-100%, aproximadamente 85-105%, aproximadamente 85-100%) en relación al área del grupo de picos correspondiente en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

el estándar de referencia. En algunas realizaciones, el grupo de picos 4 (monofosforilada) puede tener el área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 100-550% (por ejemplo, aproximadamente 100-525%, aproximadamente 100-500%, aproximadamente 100-450%, aproximadamente 150-550%, aproximadamente 150- 500%, aproximadamente 150-450%, aproximadamente 200-550%, aproximadamente 200-500%, aproximadamente 200-450%, aproximadamente 250-550%, aproximadamente 250-500%, aproximadamente 250-450%, o aproximadamente 250-400%) en relación al área del grupo de picos correspondiente en el estándar de referencia. En algunas realizaciones, el grupo de picos 5 (triesilailada) puede tener el área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 70-110% (por ejemplo, aproximadamente 70-105%, aproximadamente 70-100%, aproximadamente 70-95%, aproximadamente 70-90%, aproximadamente 80-110%, aproximadamente 80- 105%, aproximadamente 80-100%, o aproximadamente 80-95%) en relación al área de grupo de picos correspondiente en el estándar de referencia. En algunas realizaciones, el grupo de picos 6 (tetra-sialilada) puede tener un área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 90-130% (por ejemplo, aproximadamente 90- 125%, aproximadamente 90-120%, aproximadamente 90-115%, aproximadamente 90-110%, aproximadamente 100- 130%, aproximadamente 100-125%, o aproximadamente 100-120%) en relación al área del grupo de picos correspondiente en el estándar de referencia. En algunas realizaciones, el grupo de picos 7 (difosforilada) puede tener un área de grupo de picos que varía de aproximadamente el 70-130% (por ejemplo, aproximadamente 70- 125%, aproximadamente 70-120%, aproximadamente 70-115%, aproximadamente 70-110%, aproximadamente 80- 130%, aproximadamente 80- 125%, aproximadamente 80-120%, aproximadamente 80-115%, aproximadamente 80- 110%, aproximadamente 90-130%, aproximadamente 90-125%, aproximadamente 90- 120%, aproximadamente 90- 115%, aproximadamente 90-110%) en relación al área del grupo de picos correspondiente en el estándar de referencia. Se conocen en la técnica varios estándares de referencia para el mapeo de glicanos y pueden usarse para poner en práctica la presente invención. Típicamente, el grupo de picos 7 (difosforilada) se corresponde con el nivel de di-M6P en la superficie de la proteína I2S recombinante purificada.

Se contempla que el patrón de glicosilación de una I2S purificada afecte al objetivo lisosómico. En la técnica se conocen varios ensayos de absorción celular in vitro y pueden usarse para poner en práctica la presente invención. Por ejemplo, para evaluar la absorción de I2S por receptores de M6P, los ensayos de absorción celular se realizan usando fibroblastos humanos que expresan receptores de M6P en su superficie. La cantidad internalizada de I2S puede medirse mediante un método ELISA. En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención se caracteriza con una absorción celular de más del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, como se determina mediante un ensayo de absorción in vitro.

Mapeo de Péptidos

En algunas realizaciones, puede usarse el mapeo de péptidos para caracterizar la composición de aminoácidos, las modificaciones postraduccionales y/o el procesamiento celular; como la escisión de un péptido señal, conversión de formilglicina y/o glicosilación. Típicamente, una proteína recombinante puede romperse en fragmentos peptídicos discretos, ya sea mediante ruptura controlada o aleatoria, para producir un patrón o mapa de péptidos. En algunos casos, una proteína I2S purificada puede someterse primero a digestión enzimática antes del análisis analítico. La digestión puede realizarse usando una peptidasa, glicósido hidrolasa, fosfatasa, lipasa o proteasa y/o combinaciones de los mismos, antes del análisis analítico. La composición estructural de los péptidos puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, Espectrometría de Masas, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) o HPLC.

Porcentaje de Conversión de Formilglicina

El mapeo de péptidos puede usarse para determinar la conversión de FGly porcentual. Como se ha tratado anteriormente, la activación de I2S requiere Cisteína (correspondiente a la posición 59 de la I2S humana madura) a la conversión de formilglicina por la enzima generadora de formilglicina (FGE) como se muestra a continuación:

(HO)

HS

1

XxxXx.xCysXxxProXxxArgXxx.Xxx {Ser} (Ala)

Formilglicina Enzima generadora

°yh

XxxX xxFG iyX x:x ProX xx A rgX xxX x x (Ala)

Por lo tanto, el porcentaje de conversión de formilglicina (%FG) puede calcularse usando la siguiente

fórmula:

imagen1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Para calcular el %FG, una proteína I2S recombinante puede digerirse en péptidos cortos usando una proteasa (por ejemplo, tripsina o quimotripsina). Los péptidos cortos pueden separarse y caracterizarse usando, por ejemplo, Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) de exclusión por tamaño. El péptido que contiene la posición correspondiente a la posición 59 de la I2S humana madura puede caracterizarse para determinar si el Cys en la posición 59 se convirtió en un FGly en comparación con un control (por ejemplo, una proteína I2S sin conversión de FGly o una proteína I2S con 100 % de conversión de FGly). La cantidad de péptidos que contienen FGly (que corresponde al número de moléculas de I2S activas) y la cantidad total de péptidos con tanto FGly como Cys (correspondiente al número de moléculas de I2S totales) se puede determinar en base a las áreas de los picos correspondientes y se puede calcular la proporción que refleja el %FG.

Una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención tiene por lo menos aproximadamente un 70% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de conversión del residuo de cisteína correspondiente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO: 1) en Ca- formilglicina (FGly). En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada de acuerdo con la presente invención tiene sustancialmente un 100% de conversión del residuo de cisteína correspondiente a Cys59 de I2S humana (SEQ ID NO: 1) a Ca-formilglicina (FGly).

Contenido de Ácido Siálico

En algunas realizaciones, una proteína I2S recombinante purificada puede caracterizarse por su composición de ácido siálico. Sin pretender estar sujeto por ninguna teoría, se contempla que los residuos de ácido siálico en las proteínas pueden prevenir, reducir o inhibir su depuración in vivo rápida a través de los receptores de asialoglicoproteínas que están presentes en los hepatocitos. Por tanto, se piensa que las proteínas recombinantes que tienen un contenido de ácido siálico relativamente alto tienen típicamente un tiempo de circulación relativamente largo in vivo.

En algunas realizaciones, el contenido de ácido siálico de una proteína I2S recombinante purificada puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el contenido de ácido siálico de una proteína I2S recombinante puede determinarse mediante digestión enzimática y análisis cromatográfico posterior. La digestión enzimática puede realizarse usando cualquier sialidasa adecuada. En algunos casos, la digestión se realiza mediante una enzima glicósido hidrolasa, como la neuraminidasa. El ácido siálico puede detectarse mediante análisis cromatográfico como, por ejemplo, Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento con Detección Amperométrica Pulsada (HPAE-PAD). La cantidad de ácido siálico en una composición de I2S recombinante puede calcularse usando una curva estándar de ácido siálico, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y divulgados en la presente.

En algunas realizaciones, el contenido de ácido siálico de una proteína I2S recombinante purificada puede ser mayor que 16 mol/mol. Las unidades "mol/mol" en el contexto de contenido de ácido siálico se refieren a moles de residuo de ácido siálico por mol de enzima. En algunos casos, el contenido de ácido siálico de una proteína I2S recombinante es o es mayor a aproximadamente 16,5 mol/mol, aproximadamente 17 mol/mol, aproximadamente 18 mol/mol, aproximadamente 19 mol/mol, aproximadamente 20 mol/mol, aproximadamente 21 mol/mol, aproximadamente 22 mol/mol o más. En algunas realizaciones, el contenido de ácido siálico de una proteína I2S recombinante purificada puede estar en un intervalo entre aproximadamente 16-20 mol/mol, 16-21 mol/mol, aproximadamente 16-22 mol/mol, 16-23 mol/mol, 16-24 mol/mol, aproximadamente 16-25 mol/mol, aproximadamente 17-20 mol/mol, 17-21 mol/mol, aproximadamente 17-22 mol/mol, 17-23 mol/mol, 17-24 mol/mol, o aproximadamente 17-25 mol/mol.

Composición Farmacéutica y Administración

La proteína I2S recombinante purificada puede administrarse a un paciente con Síndrome de Hunter de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, la proteína I2S recombinante purificada puede administrarse por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, transdérmica o transmucosal (por ejemplo, por vía oral o nasal).

En algunas realizaciones, una I2S recombinante o una composición farmacéutica que la contiene se administra a un sujeto por administración intravenosa.

En algunas realizaciones, una I2S recombinante o una composición farmacéutica que la contiene se administra a un sujeto por administración intratecal. Como se usa en la presente, el término "administración intratecal" o "inyección intratecal" se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Se pueden usar varias técnicas incluyendo, sin limitación, inyección cerebroventricular lateral a través de una trepanación o punción cisternal o lumbar o similares. En algunas realizaciones, "administración intratecal" o" suministro intratecal" de acuerdo con la presente invención se refiere a la administración o suministro IT a través del área o región lumbar, es decir, administración o suministro IT lumbar. Como se usa en la presente, el término "región lumbar " o "área lumbar" se refiere a el área entre la tercera y la cuarta vértebra lumbar (espalda inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En algunas realizaciones, una I2S recombinante o una composición farmacéutica que la contiene se administra al sujeto por administración subcutánea (es decir, por debajo de la piel). Para tales propósitos, la formulación puede inyectarse usando una jeringuilla. Sin embargo, están disponibles otros dispositivos para la administración de la formulación como dispositivos de inyección (por ejemplo, los dispositivos Inject-ease™ y Genject™); plumas inyectoras (como la GenPen™); dispositivos sin aguja (por ejemplo, MediJector™ y BioJector ); y sistemas de administración de parches subcutáneos.

En algunas realizaciones, la administración intratecal puede usarse en conjunción con otras vías de administración (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, transdérmica o transmucosal (por ejemplo, oral o nasal)).

La presente invención contempla administraciones individuales así como múltiples de una cantidad terapéuticamente eficaz de una I2S recombinante o una composición farmacéutica que contiene la misma descrita en la presente. Puede administrarse una I2S recombinante o una composición farmacéutica que la contiene a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, gravedad y extensión de la afección del sujeto (por ejemplo, una enfermedad de almacenamiento lisosómico). En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de una I2S recombinante o una composición farmacéutica que la contiene puede administrarse periódicamente a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bimensualmente (una vez cada dos meses), mensualmente (una vez al mes), bisemanalmente (una vez cada dos semanas), semanalmente, diariamente, o continuamente.

Una I2S recombinante o una composición farmacéutica que la contiene puede formularse con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable para preparar una composición farmacéutica. El portador y el agente terapéutico pueden ser estériles. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no están limitados a agua, soluciones de sales (por ejemplo, NaCl), solución salina, solución salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos como lactosa, amilosa o almidón, azúcares como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Si se desea, las preparaciones farmacéuticas pueden mezclarse con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir sobre la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares) que no reaccionan de manera perjudicial con los compuestos activos o interfieren con su actividad. En algunas realizaciones, se usa un portador soluble en agua adecuado para administración intravenosa.

La composición o medicamento, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La composición también puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

La composición o medicamento puede formularse de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración a seres humanos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición para administración intravenosa típicamente es una solución en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua estéril de grado farmacéutico, solución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Como se usa en la presente, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se determina en gran medida en base a la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para lograr un beneficio significativo para el sujeto (por ejemplo, tratar, modular, curar, prevenir y/o mejorar la enfermedad o afección subyacente). Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, como una cantidad suficiente para modular los receptores de enzimas lisosómicos o su actividad para tratar de este modo la enfermedad de almacenamiento lisosómico o los síntomas de la misma (por ejemplo una reducción o eliminación de la presencia o incidencia de "cuerpos cebra" o vacuolización celular después de la administración de las composiciones de la presente invención a un sujeto). Generalmente, la cantidad de un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

agente terapéutico (por ejemplo, una enzima lisosómica recombinante) administrada a un sujeto con necesidad de ello dependerá de las características del sujeto. Tales características incluyen la condición, la gravedad de la enfermedad, la salud general, la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto. Un experto en la técnica será capaz de determinar fácilmente las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos tanto objetivos como subjetivos para identificar intervalos de dosificación óptimos.

Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad (y/o dosis unitaria) terapéuticamente eficaz específica para cualquier paciente en particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración, y/o tasa de excreción o metabolismo de la proteína de fusión específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares, como es bien conocido en las técnicas médicas.

Composiciones farmacéuticas ejemplares y métodos de administración adicionales se describen en la Publicación de PCT WO2011/163649 titulada " Methods and Compositions for CNS Delivery of Iduronate-2- Sulfatase"; y la solicitud provisional N° de serie 61/618.638 titulada " Subcutaneous administration of iduronate 2 sulfatase" presentada el 30 de marzo de 2012.

Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de la terapia de reemplazo enzimático y los intervalos de dosificación establecidos en la presente son ejemplares solamente y no pretenden limitar el alcance o puesta en práctica de la invención reivindicada.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Proceso de Captura y Purificación de I2S AF Recombinante

Este ejemplo demuestra que se puede usar un proceso de purificación secuencia abajo simplificado que puede usarse para capturar y purificar I2S recombinante producida en medio libre de suero. Un esquema de purificación ejemplar se representa en la Figura 1.

Se desarrolló una línea celular que expresaba establemente una enzima iduronato-2-sulfatasa (I2S) y una enzima generadora de formilglicina (FGE). La generación y caracterización de las líneas celulares ejemplares se describen en la Solicitud Provisional de Estados Unidos titulada "Cells for Producing Recombinant Iduronate-2- Sulfatase". Brevemente, se diseñó una línea celular humana para coexpresar la proteína I2S humana con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 y la enzima generadora de formilglicina humana (FGE) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 5.

SEQ ID NO: 2

> Iduronato-2-sulfatasa precursora de longitud completa

MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDK

LVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAG

NFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCR

GPDGEFHANFFCPVDVFDVPEGTFPDKQSTEQAIQFFEKMKTSASPFFFAVGYHKPH

IPFRYPKEFQKFYPFENITFAPDPEVPDGFPPVAYNPWMDIRQREDVQAFNISVPYGPI

PVDFQRKIRQSYFASVSYFDTQVGRFFSAFDDFQFANSTIIAFTSDHGWAFGEHGEW

AKYSNFDVATHVPFIFYVPGRTASFPEAGEKFFPYFDPFDSASQFMEPGRQSMDFVE

FVSFFPTFAGFAGFQVPPRCPVPSFHVEFCREGKNFFKHFRFRDFEEDPYFPGNPREF

IAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSFKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFFANFSDIHA

GEFYFVDSDPFQDHNMYNDSQGGDFFQFFMP

SEQ ID NO: 5

Precursor de FGE humana de longitud completa:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQ

RPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSBCMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDG

EAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTN

IQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHV S WNDAVAY CTWAGK

RLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGT

APVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGS

YMCHRS Y C YRYRC AARS QNTPD S S ASNLGFRC AADRLPTMD

Después de la síntesis de la enzima I2S de longitud completa, se elimina el péptido señal de 25 aminoácidos y se secreta una enzima I2S madura soluble desde la célula.

Se usó un medio definido químicamente (libre de suero/componente animal, AF) en el proceso de biorreactor.

Se redujo el volumen de material cosechado individual y se intercambió el tampón a través de un proceso de ultrafiltración/dialfiltración. El material, denominado volumen sin purificar (UPB), se congeló a -50° C por cosecha individual. El proceso de purificación secuencia abajo comenzó con la descongelación y el agrupamiento del volumen sin purificar e incluyó sucesivos pasos de cromatografía de inactivación viral, intercambio aniónico (Capto Q), modo mixto (hidroxiapatita cerámica), intercambio catiónico (SP Sepharose) e interacción hidrófoba (Fenil Sefarosa) seguidos por filtración viral, y el paso de concentración final y diafiltración. En particular, este proceso de purificación utilizó Q, hidroxiapatita, SP y modalidades cromatográficas de Fenilo. Se eliminaron la cromatografía de Proteína G y la Cromatografía de Exclusión por Tamaño usadas tradicionalmente en el proceso de purificación de I2S. Los pasos ejemplares se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Pasos Ejemplares del Proceso de Purificación Cosecha

UF/DF

Almacenamiento Congelado

Descongelar, Agrupar y Filtración en Profundidad

I

Inactivación Viral de Solvente/Detergente

I

Cromatografía de intercambio aniónico

I

Cromatografía de modo mixto

I

Dilución (1-1,2 veces)

I

Cromatografía de intercambio catiónico

I

Cromatografía de interacción hidrófoba

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

I

. . I. . .

Filtración de Eliminación Viral

I

UF/DF

I

Sustancia de Fármaco

La pureza de la proteína I2S purificada se evaluó para pureza mediante mapeo de péptidos, SDS-PAGE (Plata), HPLC de exclusión por tamaño. La actividad específica de la enzima, el contenido de formilglicina, el contenido de ácido siálico, el mapa de glicanos, los perfiles de carga se determinaron usando métodos estándar. Los resultados ejemplares se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Análisis de Proteína I2S Recombinante Purificada

Ensayo: I2S Purificada (Escala de 10 l) Min-Max (n)

: L1 100-105% (n=3)

: L10 98-100% (n=3)

: L12 102-102% (n=3)

Mapeo de Péptidos: L13 96-97% (n=3)

: L14 102-103% (n=3)

: L17 101-101% (n=3)

: L20 102-103% (n=3)

Proteína de Célula Huésped: <62.5 (n=5)

SDS-PAGE (Plata): Conforma

: % de Pico A 69-69% (n=2)

HPLC de Intercambio Iónico: % de Pico B 20-21% (n=2)

: % de Pico E+F 10-11% (n=2)

HPLC de Exclusión por tamaño______________________________________99.9-99.9% (n=5)

Absorción Celular (Bioensayo_____________________________________85, 95% y 97% (n=3)

% de Formilglicina: 87-95% (n=5)

Actividad Específica: 62-78 (n=5)

Mapa de Glicanos: Grupo de Picos 3 88-93% (n=5)

: Grupo de Picos 5 72-110% (n=5)

: Grupo de Picos 6 124-133% (n=5)

: Grupo de Picos 7 78-87% (n=5)

: Área Total 94-116% (n=5)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ensayo: I2S Purificada (Escala de 10 l) Min-Max (n)

Ácido Siálico: 16-22 (n=4)

Endotoxina: <0.04-<0.05 (n=2)

Carga biológica: 0.00-0.00 (n=2)

Un de mapa de péptidos ejemplar en comparación con la referencia I2S comercialmente disponible se muestra en la Figura 2. Los resultados del análisis SDS-PAGE (Plata) ejemplares se muestran en la Figura 3. Típicamente, usando un proceso descrito en la presente, la concentración de HCP de sustancia de fármaco (DS) era <100 ppm, cumpliendo con la especificación de <100 ppm requerida en muchos mercados, incluyendo los Estados Unidos. La SEC de DS fue >99,5%, también cumpliendo con el requisito de especificación de comercialización de >99,3% actual en muchos mercados. El perfil de carga ejemplar se muestra en la Figura 4. El mapa de glicanos ejemplar se muestra en la Figura 5. En particular, el mapa de glicanos de I2S purificada incluye siete grupos de picos, eluyendo de acuerdo con una cantidad creciente de cargas negativas derivadas de residuos de ácido siálico y manosa-6-fosfato, que representan en orden de elución, neutros, mono-, disializados, monofosforilados, trisialilados e híbridos (monosialilados y M6P protegidos), tetrasialilados e híbridas (dislailados y M6P protegidos) y glicanos difosforilados.

Tomado en conjunto, este ejemplo demuestra que se puede usar un proceso de purificación de cuatro columnas simplificado para purificar con éxito I2S recombinante producida en medio libre de animales a gran escala.

Ejemplo 2: Estudios de Estabilidad Cosecha e Inactivación Viral de I2S AF Recombinante

El objetivo de este estudio era evaluar los efectos del tiempo de mantenimiento de la temperatura y los ciclos de congelación-descongelación en la estabilidad de la cosecha clarificada de I2S recombinante.

Las muestras de recolección clarificadas se almacenaron a temperatura ambiente y 2-8° C durante hasta siete días y las muestras de UPB inactivadas virales se mantuvieron a temperatura ambiente durante hasta 24 horas. Las muestras de congelación-descongelación en cosechas clarificadas se congelaron a -20° C, -50° C y -80° C y experimentaron congelación-descongelación durante hasta tres ciclos. La estabilidad se midió usando transferencia Western, SEC HPLC y ensayo de actividad.

El material de cosecha de I2S-AF se produjo a partir de la línea celular 2D por CCPD usando un biorreactor de 20 l B. Braun con un dispositivo de retención centrífuga y una tasa de fuga deseada. Para el estudio de mantenimiento de temperatura, cada cosecha clarificada se almacenó a temperatura ambiente y 2-8° C y se tomaron muestras en los tiempos de espera seleccionados. Las cantidades de muestra y los tiempos de mantenimiento se enumeran en la Tabla 5. Las muestras de congelación-descongelación se almacenaron a -20° C, -50° C y -80° C y se descongelaron usando un baño de agua a 25° C.

Tabla 5. Estabilidad del punto de mantenimiento de la cosecha clarificada

: Muestras Temperatura de Mantenimiento Tiempo de Mantenimiento (Días)

Cosecha Clarificada 12: 15x0.5ml K) ¿O 0 O T=0, 24h, 76h, 120h, 168h

15x0.5ml: Ambiente T=0, 24h, 76h, 120h, 168h

9 x 0.5 ml: -20 °C, -50 °C, y-80 °C Congelación/Descongela ción 1 2 y 3

Cosecha Clarificada 18: 15x0.5ml K) ¿O 0 O T=0, 24h, 76h, 120h, 168h

15x0.5ml: Ambiente T=0, 24h, 76h, 120h, 168h

9 x 0.5 ml: -20°C, -50°C, y-80 °C Congelación/Descongela ción 1, 2, y 3

El paso de inactivación viral tuvo lugar en el paso de volumen no purificado antes de cargar la primera columna. El UPB se produjo mediante concentración y el intercambio de tampón de la cosecha clarificada. El UF/DF se realizó usando un sistema Centramate de 1 pie cuadrado Pall y el tampón se intercambió en MES 10 mM, NaCl 155 mM, pH = 6,5. El paso de inactivación viral añadió 1% de Tween 80 y 0,3% de TnBP, se filtró usando filtros de jeringuilla Durapore para cada punto temporal. Se tomaron muestras en cada punto temporal enumeradas en la Tabla 6 y se congelaron a -80° C. Las muestras del punto de mantenimiento de la cosecha clarificada y los estudios

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de congelación-descongelación se analizaron por transferencia Western y actividad (ensayo 4-MU). Las muestras de UPB de la inactivación viral se probaron para pureza mediante SEC HPLC. Los resultados de actividad del punto de mantenimiento de las Cosechas 12 y 18 en la Tabla 5 no mostraron cambios significativos hasta 7 días de almacenamiento a temperatura ambiente y 2-8° C para ambas cosechas. No se observaron cambios significativos en la actividad de la Cosecha 12 durante hasta 3 ciclos de congelación-descongelación almacenados a -20° C, -50° C y -80° C.

Tabla 6. Inactivación Viral de Volumen sin Purificar

: Muestras Temperatura de Mantenimiento Tiempo de Mantenimiento (Días)

Inactivación Viral: 9 x 0.5 ml Ambiente, Control T=0, 6h, 24h

: 9 x 0.5 ml Ambiente, Inactivación Viral T=0, 6h, 24h

La actividad y SEC-HPLC para la estabilidad del paso de UPB de inactivación viral se describen en las Figuras 6 y 7. Esto muestra que no hubo problemas en la estabilidad de la inactivación viral en base a la actividad y la pureza durante hasta 24 horas.

En resumen, en base al análisis de estabilidad descrito en la presente, la cosecha clarificada puede almacenarse a 2-8° C (por ejemplo, durante hasta 7 días) sin cambios significativos en la calidad de la cosecha. Las cosechas clarificadas pueden experimentar múltiples ciclos de congelación-descongelación y almacenarse a temperaturas de - 20° C, -50° C y -80° C sin cambios significativos en la estabilidad. En base a los resultados de pureza de SEC HPLC, la inactivación viral en el paso de UPB puede tener lugar a temperatura ambiente (por ejemplo, durante hasta 24 horas) sin cambios en la actividad y la pureza.

Ejemplo 3: Purificación y Análisis de Ejecución de Confirmación de Medios IL CD Libres de Animales

El objetivo de este estudio era realizar la purificación a partir de la cosecha agrupada de I2S-AF producida en una perfusión libre de animales usando medios químicamente definidos y para caracterizar la sustancia del fármaco.

Este estudio evaluó el rendimiento del proceso de purificación de I2S-AF y la sustancia de fármaco (DS) producida a partir de un biorreactor de medio definido químicamente.

Cultivo Celular

El material de I2S-AF se produjo a partir de la línea celular 2D que expresa I2S y la enzima generadora de formilglicina (FGE) como se describe en el Ejemplo 1. El material se produjo en CCPD en un biorreactor de filtro giratorio Das Gip de 1l usando un medio libre de suero químicamente definido. Se recibieron bolsas individuales de cada cosecha clarificada (HI-21) congeladas a -20° C y se descongelaron a 2-8° C durante la noche. Volúmenes iguales de cada cosecha clarificada se agruparon para representar una agrupación completa de cosecha, luego se filtraron 0,2 pm y se concentraron usando un casete Pall Omega Centramate de 30 kD con un área de membrana total de 1 pies cuadrados . El volumen no purificado (UPB) se filtró 0,2 pm y se congeló antes de su uso.

Purificación

Las especificaciones de columna ejemplares y la carga se describen en la Tabla 7. La Sefarosa Q se cargó a un objetivo de 3 g/l por título. Las columnas posteriores se cargaron al 100% de la elución de la columna anterior y no se eliminó material.

Tabla 7. Especificaciones de columna y carga

Columna: Dimensiones de la Columna (cm x cm) Volumen de la Columna (ml) Carga de la Columna (g/l resina por I2S) Carga de la Columna (mg)

Sefarosa Q: 2.6x25 133 3 399

HATipoM, 80 pm: 1.6x 30 60 5.5 330

Fenil Sefarosa: 1.6x23 46 5.6 258

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se realizó una ejecución de purificación usando UPB de las cosechas de agolpamiento 1 a 21 del biorreactor. El UPB se descongeló a 2-8° C durante la noche y se agrupó en el mismo volumen de cada cosecha.

Se pueden encontrar pasos de proceso de columnas individuales y formulaciones de tampones en las Tablas 8-11. El UPB agrupado se filtró usando un sistema de filtro de botella de 0,2 |jm, se ajustó a pH 6,5 usando acetato de sodio 1 M y se ajustó la conductividad a 16 mS/cm con cloruro de sodio 5 M antes de cargarlo en la columna FF de Sefarosa Q. La elución con Sefarosa Q se ajustó a NaPO4 0,001 M usando NaPO4 0,25M, pH 5,5 y se filtró con un filtro superior de botella PES de 0,22 um antes de cargarla en la columna de HA. La conductividad de la elución de HA se ajustó a NaCl 1,55 M con NaCl 5 M y el pH se ajustó a pH 5,5 con acetato de sodio 1M. El tiempo de ajuste fue de aproximadamente 1 hora. El agrupamiento ajustado se filtró usando un filtro superior de botella PES de 0,22 um antes de cargarlo en la columna de Fenil Sefarosa. La elución del Fenilo se concentró 4X y se diafiltró 6X en NaPO4 0,02 M, NaCl 0,137 M, pH 6,0. El producto diafiltrado se ajustó a 2,0 g/l y se formuló con 0,2% de Polisorbato 20 para generar una sustancia de fármaco simulada. Se creó una agrupación simulada de H1- 20 del DS para caracterización adicional.

Tabla 8. Detalles del Proceso Ejemplares para Cromatografía FF Sefarosa Q

Paso del Proceso: Caudal (cm/hr) CV Tampones

Sanitización: 150 3 0.5 N NaOH

Equilibrio: 150 4 0.01 M MES, 0.155 M NaCl, ph 6.5

Lavado 1: 150 2 0.01 M MES, 0.155 M NaCl, ph 6.5

Lavado 2: 150 3 0.01 M MES, 0.155 M NaCl, ph 5.5

Elución: 150 3 0.01 M MES, 0.50 M NaCl, ph 5.5

Limpieza/Retirada: 150 4 1.0 M NaOH, 2 M NaCl

Almacenamiento: 150 4 0.0 N NaOH

Tabla 9. Detalles del Proceso Ejemplares para Cromatografía HA

Paso del Proceso: Caudal (cm/hr) CV Tampones

Sanitización: 200 3 0.5 N NaOH

Carga: 200 3 0.250 M NaPO4, pH 5.5

Equilibrio: 200 3-6 0.01M MES, 0.001 M NaPO4, 0.5M NaCl, pH 5.5

Lavado 1: 200 1 0.01M MES, 0.001 M NaPO4, 0.5M NaCl, pH 5.5

Lavado 2: 200 6 0.01M MES, 0.01 M NaPO4, 0.5M NaCl, pH 5.5

Elución: 200 3 0.01M MES, 0.08M NaPO4, pH 5.5

Retirada: 200 4 0.4M NaPO4 pH 12

Limpieza: 200 4 0.5 N NaOH

Almacenamiento: 200 4 0.1 N NaOH

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 10. Detalles del Proceso ejemplar para Cromatografía de Fenil Sefarosa

Paso del Proceso: Caudal (cm/hr) CV Tampones

Sanitización: 150 3 0.5 N NaOH

Equilibrio: 150 4-6 0.02 M MES, 1.5 M NaCl, pH 5.5

Lavado: 150 2 0.02 M MES, 1.5 M NaCl, pH 5.5

Elución: 150 3 0.02 M MES, 0.2 M NaCl, pH 5.5

Lavado con Agua: 150 3 RO/DI Agua

Lavado con Etanol: 150 3 20% de Etanol

Limpieza: 150 3 0.5 N NaOH

Almacenamiento: 150 3 0.01 N NaOH

Tabla 11. Diafiltración Ejemplar de la Agrupación de Elución de Fenilo

Unidad de Filtración: Centricon Plus 70

Tampón de Diafiltración: 0.02 M NaPO4, 0.137 M NaCl, pH 6.0

Volúmenes de Diafiltración: 6X-8X

Pureza en el Proceso por HCP por ELISA

La Tabla 12 describe la eliminación de HOP en proceso para cada paso. Los resultados de HCP en proceso fueron altos con la mayoría de la eliminación en el paso de HA.

Tabla 12. Eliminación de HCP En Proceso

Paso: HCP (ng/mg) LRV Veces de HCP

Q: 46,392 0.3 2

51,957

HA: 51,957 1.3 18

5,876

Fenilo: 5,876 0.7 5

1,870

Caracterización de la Sustancia de Fármaco

Los resultados de liberación de lote de sustancia de fármaco ejemplares se enumeran en la Tabla 13. Como puede observarse, la sustancia de fármaco tenía una actividad específica alta y %FG en el material purificado. La caracterización de los atributos de fármacos ejemplares se muestra en la Tabla 13. La HCP se redujo de 1.870 ng/mg a 372 ng/mg en el paso final de UF/DF.

Tabla 13. Liberación de Lote de Sustancia de Fármaco Ejemplar

Liberación de Lote DS
Liberación de Lote DS

%FG: 94%

Mapa de Glicanos

Grupo 3: 99%

Grupo 5: 89%

Grupo 6: 104%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Liberación de Lote DS
Liberación de Lote DS

Grupo 7 (2-M6P): 95%

Área Total: 107%

Ácido Siálico: 17

Internalización: 83%

SEC-HPLC: 99.9%

Actividad Específica (U/mg): 82

IEXHPLC

A (%): 64%

B (%): 23%

A+B: 87%

E+F: 0%

Proteína de Célula Huésped: 372

Absorción Celular: 98

Ejemplo 4. Caracterización Fisicoquímica y Biológica de Enzima I2S Recombinante Purificada

El propósito del ejemplo era realizar una caracterización detallada de la proteína I2S recombinante purificada usando los métodos descritos anteriormente.

Para el experimento, la proteína recombinante I2S se generó usando líneas celulares humanas 2D y 4D, en dos reacciones de cultivo celular libre de suero separadas. Las muestras se recogieron y purificaron usando métodos descritos anteriormente. La enzima I2S purificada se analizó mediante SDS-PAGE y se trató con tinción de plata para su visualización. Los resultados ejemplares se muestran en la Figura 8. Como puede observarse en la Figura 8, la proteína I2S recombinante purificada usando los métodos descritos en la presente presenta patrones de bandas comparables a la muestra de referencia de I2S purificada usando el método estándar.

Mapa de Péptidos

La proteína I2S recombinante producida por la línea celular I2S-AF 2D se purificó usando métodos como se ha descrito con anterioridad. La I2S recombinante purificada y una muestra de I2S humana de referencia se sometieron cada una a digestión proteolítica y se examinaron mediante análisis HPLC. En la Figura 9 se muestra un mapa de péptidos ejemplar en comparación con el de una I2S de referencia.

Porcentaje de Conversión de Formilglicina

El mapeo de péptidos puede usarse para determinar el porcentaje de conversión de FGly. La activación de I2S requiere Cisteína (que corresponde a la posición 59 de la I2S humana madura) para la conversión de formilglicina por la enzima generadora de formilglicina (FGE) como se muestra a continuación:

(HO)

HS

XxxXxxCysXxxProXxxArgXxxXxx (Ser) (Ala)

Formilglicina Enzima Generadora

cy

X x x X xx FGI yXx xP r oXx x A rg X x x X x x

(Ala)

Por lo tanto, el porcentaje de conversión de formilglicina (%FG) puede calcularse usando la fórmula siguiente:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

imagen2

Por ejemplo, 50% de FG significa que la mitad de la I2S recombinante purificada es enzimáticamente inactiva sin ningún efecto terapéutico.

El mapeo de péptidos se usó para calcular %FG. Brevemente, una proteína I2S recombinante purificada se digirió en péptidos cortos usando una proteasa (por ejemplo, tripsina o quimotripsina). Los péptidos cortos se separaron y se caracterizaron usando HPLC. El péptido que contenía la posición correspondiente a la posición 59 de la I2S humana madura se caracterizó para determinar si el Cys en la posición 59 se convirtió en un FGly en comparación con un control (por ejemplo, una proteína I2S sin conversión de FGly o una proteína I2S con un 100% de conversión de FGly). La cantidad de péptidos que contienen FGly (que corresponde al número de moléculas de I2S activas) y la cantidad total de péptidos con tanto FGly como Cys (correspondiente al número total de moléculas de I2S) se puede determinar en base a las áreas de los picos correspondientes y se calculó la proporción que refleja el %FG. Los resultados ejemplares se muestran en la Tabla 14.

Mapa de Glicanos - Contenido de Manosa-6-Fosfato y Ácido Siálico

Se determinó la composición de glicanos y ácido siálico de la proteína I2S recombinante purificada. Se realizó la cuantificación de la composición de glicano, usando cromatografía de intercambio aniónico para producir un mapa de glicanos. Como se describe a continuación, el mapa de glicanos de I2S recombinante purificada bajo las condiciones descritas en la presente consiste en siete grupos de picos, eluyendo de acuerdo con una cantidad creciente de cargas negativas, por lo menos parcialmente derivadas de ácido siálico y glicoformas de manosa-6- fosfato resultantes de digestión enzimática. Brevemente, la I2S recombinante purificada del cultivo de células libres de suero (libre de suero 2D I2S-AF y libre de suero I2S-AF 4D) y I2S recombinante de referencia, se trataron con (1) enzima neuraminidasa purificada (aislada de Arthrobacter Ureafaciens (10 mU/^l), Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat. N° 269 611 (1U/100 ^l)) para la eliminación de residuos de ácido siálico, (2) fosfatasa alcalina durante 2 horas a 37 ± 1° C para la liberación completa de los residuos de manosa-6-fosfato, (3) fosfatasa alcalina + neuraminidasa, o (4) sin tratamiento. Cada digestión enzimática se analizó mediante Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento con Detección Amperométrica Pulsada (HPAE-PAD) usando una Columna Analítica CarboPac PA1 equipada con una Columna de Protección Dionex CarboPac PA1. Se ejecutaron una serie de estándares de ácido siálico y manosa-6-fosfato en el intervalo de 0,4 a 2,0 nmoles para cada ensayo. Se ejecutó un método isocrático que usa acetato de sodio 48 mM en hidróxido de sodio 100 mM durante un mínimo de 15 minutos a un caudal de 1,0 ml/min a temperatura de la columna ambiente para eluir cada pico. Los datos generados de cada ejecución individual, tanto para las muestras de I2S-AF como de I2S de referencia, se combinaron cada uno en un solo cromatógrafo para representar el mapa de glicanos para cada proteína recombinante respectiva. Como se indica en la Figura 10, el mapa de glicanos para I2S purificada del medio libre de suero mostró picos de elución representativos (en el orden de elución) que constituyen glicanos neutros, mono-, disializados, monofosforilados, trisialilados e híbridos (monosializado y manosa-6-fosfato protegido), tetrasiailados e híbridos (disililado y manosa-6- fosfato protegido) y difosforilados. Los mapas de glicanos ejemplares se muestran en la Figura 10.

Se calculó el contenido de ácido siálico medio (moles de ácido siálico por mol de proteína) en cada muestra de I2S recombinante a partir del análisis de regresión lineal de estándares de ácido siálico. Cada ejecución del cromatograma se visualizó usando el software PeakNet 6. Los estándares de ácido siálico y el ácido siálico liberado del ensayo de I2S recombinante y las muestras de prueba aparecen como un único pico. La cantidad de ácido siálico (nmoles) para I2S se calculó como un valor bruto usando la siguiente ecuación:

S.A.(mo¡por mol de I2S ) =

(nmoles ácido siálico^

(0.3272XC)

Donde C es la concentración de proteína (en mg/ml) de muestra o control de ensayo I2S recombinante.

El valor corregido del ácido siálico como moles de ácido siálico por mol de proteína para cada muestra de prueba se calculó usando la fórmula siguiente:

S.A. corregido =

(Valor de Acido Siálico Bruto de Ict Muestra)x(Valor de Control de Ensayo de Idursulfasa Establecido) (Valor de Acido Sia 'Jico Bruto de Control de Ensayo de Idursulfasa)

Los datos ejemplares del contenido de ácido siálico en la I2S recombinante purificada a partir de líneas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

celulares I2S-AF 2D o 4D se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14: Características Ejemplares de I2S purificada a partir de cultivo celular libre de

suero

Ensayo: I2S-AF2D (Libre de Suero)

Mapeo de Péptidos

L1: 101

L10: 100

L12: 102

L13: 97

L14: 101

L17: 100

L20: 102

Proteína de Célula Huésped: < 62.5 ng/mg

% de Área de HPLC de Intercambio Iónico

Pico A: 62

Pico A+B: 82

Pico E+F: 0

% de Formilglicina: 87

Actividad Específica (U/mg) (ensayo de liberación de sulfato): 64

% de HPLC de Exclusión por Tamaño: > 99.8 (n=13)

Mapeo de Glicanos

Monosialilado: 105

Disialilado: 93

Monofosforilado: 139

Trisialilado: 89

Tetrasialilado: 125

Difosforilado: 95

Ácido Siálico (mol/mol): 20

Actividad Específica

La actividad específica de la enzima I2S recombinante purificada usando los procedimientos descritos en la presente se analizó usando un ensayo de liberación de sulfato in vitro o un ensayo de 4-MUF.

Ensayo de liberación de sulfato in vitro

El ensayo de actividad de liberación de sulfato in vitro se realizó usando disacárido de heparina como sustrato. En particular, este ensayo mide la capacidad de I2S para liberar iones de sulfato de un sustrato de origen natural, el diasacárido de heparina. El sulfato liberado se puede cuantificar mediante cromatografía iónica equipada con un detector de conductividad. Brevemente, las muestras se intercambiaron primero con tampón a acetato de Na 10 mM, pH 6 para eliminar la inhibición por iones de fosfato en el tampón de formulación. Las muestras se diluyeron luego a 0,075 mg/ml con tampón de reacción (acetato de Na 10 mM, pH 4,4) y se incubaron durante 2 horas a 37° C con disacárido de heparina a una proporción de enzima a sustrato de 0,3 |jg de I2S/100 |jg de sustrato en un volumen de reacción de 30 jl. La reacción se detuvo calentando las muestras a 100° C durante 3 min. El análisis se llevó a cabo usando una columna analítica Dionex lonPac AS18 con una columna de protección lonPac AG18. Se usó un método isocrático con hidróxido de potasio 30 mM a 1,0 ml/min durante 15 minutos. La cantidad de sulfato

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

liberado por la muestra de I2S se calculó a partir del análisis de regresión lineal de los estándares de sulfato en el rango de 1,7 a 16,0 nmoles. El valor registrable se expresó como Unidades por mg de proteína, donde 1 unidad se define como 1 pmoles de sulfato liberado por hora y la concentración de proteína se determina mediante mediciones A280. Los resultados ejemplares se muestran en la Tabla 14.

Ensayo 4-MUF

La actividad específica de la enzima I2S recombinante purificada también puede analizarse usando el ensayo 4-MUF basado en fluorescencia. Brevemente, el ensayo mide la hidrólisis del substrato de I2S 4- metilumbeliferil-sulfato (4-MUF-SO4). Tras la escisión del sustrato 4-MUF-SO4 por I2S, la molécula se convierte en sulfato y 4-metilumbeliferona (4-MUF) fluorescente de forma natural. Como resultado, la actividad de la enzima I2S puede determinarse evaluando el cambio total en la señal fluorescente a lo largo del tiempo. Para este experimento, se incubó enzima I2S purificada con una solución de 4-metilumbeliferil-sulfato (4-MUF-SO4), Sal de potasio, Sigma Cat. N° M-7133). La calibración del ensayo se realizó usando una serie de muestras de referencia de control, usando enzima I2S comercialmente disponible diluida a 1:100, 1:200 y 1:20.000 de la solución madre. El ensayo enzimático se ejecutó a 37° C y se ensayó usando un fluorómetro calibrado. Usando los valores de fluorescencia obtenidos para cada estándar de referencia, se determinó el coeficiente porcentual de variación usando la siguiente ecuación:

Desviación Estancia de Valores de Fluorescencia Brutos (N=3)

% CV =-------------------------------------------------------------------------X100%

Valor de Fluorescencia Medio

Los valores de CV porcentuales se usaron luego para calcular la Fluorescencia Media Corregida para cada muestra, para determinar la actividad enzimática registrable, expresada en mU/ml usando la fórmula siguiente:

imagen3

imagen4

CFU = Fluorescencia media corregida negativa DF - Factor de dilución

Una miliunidad de actividad es la cantidad de enzima requerida para convertir 1 nanomol de 4- metilumbeliferil-sulfato en 4-metilumbeliferona en 1 minuto a 37° C.

Perfil de Carga

Para este experimento, la distribución de carga de cada I2S recombinante purificada se determinó mediante Cromatografía de Intercambio Aniónico Fuerte (SAX), con un sistema de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC). El método separa las variantes de I2S recombinantes dentro de la muestra, en base a las diferencias de carga superficial. A pH 8,00, las especies cargadas negativamente se adsorben sobre la carga positiva fija de la columna SAX. Se usa un gradiente de fuerza iónica creciente para eluir cada especie de proteína en proporción a la fuerza de su interacción iónica con la columna. Se cargaron cien microgramos de I2S purificada, aislada de la línea celular 2D bajo condiciones de crecimiento libre de suero o enzima I2S recombinante de referencia, en una columna Amersham Biosciences Mini Q PE (4,6 x 50 mm) mantenida a temperatura ambiente y equilibrada a Tris-HCl 20 mM, pH 8,00. La elución en gradiente se realizó a un caudal de 0,80 ml/min, usando una fase móvil de Tris-HCl 20 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 8,00. La concentración de proteína se determinó continuamente durante la ejecución, midiendo la absorbancia de la luz de la elución de la muestra a la longitud de onda de 280 nm. Los resultados ejemplares que muestran los perfiles de carga observados para I2S recombinante purificada a partir de las líneas celulares 2D y 4D se muestran en la Figura 11.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Shire Human Genetic Therapies

<120> PURIFICACION DE IDURONATO-2-SULFATASA

<130> 2006685-0342

<150> 61/666,733 <151> 2012-06-29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<160>5

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 15 10 15

lie lie Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30

Leu Val Arg Ser Pro Asn lie Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45

Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60

Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80

Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr lie Pro Gln 85 90 95

Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110

His Pro Gly lie Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125

Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140

Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160

Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende iduronato-2-sulfatasa (I2S) recombinante purificada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:°, en donde la I2S recombinante purificada comprende por lo menos un 70% de conversión del residuo de cisteína correspondiente al Cys59 de la SEQ ID NO:1 a Ca-formilglicina (FGly), y en donde la I2S recombinante purificada contiene menos de 150 ng/mg de Proteína de Célula Huésped (HCP).
2. La composición de la reivindicación 1, en la que la proteína I2S recombinante purificada:

i. contiene por lo menos un 10% de oligosacáridos bis-fosforilados por molécula;

ii. contiene de media por lo menos 16 ácidos siálicos por molécula;

iii. se caracteriza con un mapa de glicanos que comprende siete o menos grupos de picos seleccionados de los grupos de picos indicativos de proteína I2S neutra (grupo de picos 1), mono-sialilada (grupo de picos 2), disialilada (grupo de picos 3), monofosforilada (grupo de picos 4), tri-sialilada (grupo de picos 5), tetra- sialilada (grupo de picos 6) o difosforilada (grupo de picos 7);

iv. tiene una actividad específica de por lo menos 40 U/mg determinada por un ensayo de actividad de liberación de sulfato in vitro que usa disacárido de heparina como sustrato; o

v. tiene una actividad específica de por lo menos 20 U/mg determinada por un ensayo de conversión 4-MUF- SO4 a 4-MUF in vitro.
3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proteína I2S recombinante purificada contiene menos de 100 ng/mg de HCP.
4. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proteína I2S recombinante purificada contiene menos de 80 ng/mg de HCP.
5. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la I2S recombinante purificada contiene por lo menos un 50% de oligosacáridos bis-fosforilados por molécula.
6. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína I2S recombinante purificada tiene actividad específica de por lo menos 50 U/mg como se determina por un ensayo de liberación de sulfato in vitro usando disacárido de heparina como sustrato.
7. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína I2S recombinante purificada tiene actividad específica de por lo menos 60 U/mg como se determina por un ensayo de liberación de sulfato in vitro usando disacárido de heparina como sustrato.
8. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína I2S recombinante purificada tiene una actividad específica de por lo menos 30 U/mg como se determina por un ensayo de conversión de 4-MUF-SO4 a 4- MUF in vitro.
9. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína I2S recombinante purificada tiene una actividad específica de por lo menos 40 U/mg como se determina por un ensayo de conversión de 4-MUF-SO4 a 4- MUF in vitro.
10. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína I2S recombinante purificada tiene una actividad específica de por lo menos 50 U/mg como se determina por un ensayo de conversión de 4-MUF-SO4 a 4- MUF in vitro.
11. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína I2S recombinante purificada tiene una actividad específica de por lo menos 60 U/mg como se determina por un ensayo de conversión de 4-MUF-SO4 a 4- MUF in vitro.
12. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la I2S recombinante purificada comprende por lo menos un 75% de conversión del residuo de cisteína correspondiente al Cys59 de la SEQ ID NO:1 a Ca-formilglicina (FGly).
13. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la I2S recombinante purificada comprende por lo menos un 85% de conversión del residuo de cisteína correspondiente al Cys59 de la SEQ ID NO:1 a Ca-formilglicina (FGly).
14. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en el tratamiento del Síndrome de Hunter.

imagen1

T]

P

ro
81.02-60-82

£58608813

AU

imagen2

imagen3

FILA

MUESTRA DE CARGA PÁD ID VOL. DE CARGA ¡J\ TOTAL ng

1

PRECISION MAS PROTEINA STDS (SIN TEÑIR) 3 |i¡

2

CONTROL DE ENSAYO N° 1 ¡f¡¡¡¡¡ 20 8 jxg CADA, OV ÉND REF

3

CONTROL DE ENSAYO N° 2 ■i 20 18 jig CADA, OV END REF

4

ESTANDAR DE REFERENCIA 20 8

5

RDSF 11-101 DS SIMULADO 11AD0545-1 20 8

6

RDSF 11-105 DS SIMULADO 11AD0545-2 20 8

FIG. 3

imagen4

REFERENCIA DE I2S 1-GLICANOS 3X-GLICAN0S

NEUTROS 2-GLICANOS TRISIALILADOS DISIALILADOS o

3a

4-GLICANOS

MONOFOSFORILADOS

7X-GLICANOS

DISFOSFORILADOS

5-GLICANOS

6X-GLICANOS

TRISIALILADOS

TETRASIALILADOS

E HIBRIDOS

E HIBRIDOS

7a

6a

6 (

i k .

?

I2S AF

CD

imagen5

I2S AF

6a

imagen6

7a

7

\ í

i

...............—

V ,

i i i l i i i 11 i i i i l i i i i l i i i i l i i
30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5

ii | i i i i | i i i i | i i i i | i i i i | n
45.0 47.5 50.0 52.5 55.0 MINUTOS

i i | i i i i | i i i i | i i i i | i i i i | i i i i
57.5 60.0 62.5 65.0 67.5 70.0

FIG. 5

imagen7

imagen8

(kDa)

250

150

100

75

50

37

25

20

15

10

FILA

MUESTRA DE CARGA VOLUMEN DE CARGA TOTAL |tg

1

STDS DE PROTEINA 3 jll

2

CONTROL DE ENSAYO N° 18 20 |il

3

CONTROL DE ENSAYO N° 2 20 |il 16 jug

4

ESTANDAR DE REFERENCIA DE I2S 20 |il 8|ig

5

CULTIVO LIBRE DE SUERO DE I2S-AF2D 20 |il 8)ig

6

CULTIVO LIBRE DE SUERO DE I2S-AF4D 20 |il 8)ig

O LO

h- T—

imagen9

FIG. 9

en

oo

imagen10

MINUTOS

FIG. 10
0.050

en

imagen11
14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00

MINUTOS

FIG. 11