JP2020105209A - 組換えイズロン酸２スルファターゼの精製 - Google Patents

Abstract

【課題】組換えイズロン酸２スルファターゼの精製の提供。【解決手段】本発明は、数ある中で、酵素補充療法のために組換えで製造されたＩ２Ｓタンパク質を精製する改善された方法を提供する。本発明は、部分的に、わずか４つのクロマトグラフィーカラムを使用して、Ｉ２Ｓを含有する細胞培養培地等の加工されていない生体物質から組換えＩ２Ｓタンパク質を精製できるという意外な発見に基づいている。組換えＩ２Ｓの承認された現存する酵素補充療法のための精製プロセスは、６つのクロマトグラフィーカラムを伴う。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年６月２９日に提出した米国仮出願第６１／６６６，７３３号に基づく優先権を主張するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

配列表
本発明の明細書は、２０１３年６月２７日に「２００６６８５-０３４２＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ」と名付けたＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子形式で提出された配列表を参照する。当該テキストファイルは２０１３年６月２５日に生成され、サイズは１５ＫＢである。配列表の全内容は、参照により本明細書に取り込まれる。

ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群）は、酵素イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の欠損から生じるＸ染色体劣性リソソーム貯蔵障害である。Ｉ２Ｓは、末端２-Ｏ-硫酸部分をグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸から切断する。ハンター症候群の患者のＩ２Ｓが失われたか欠陥があることにより、ＧＡＧが、様々な細胞型のリソソームに進行的に蓄積し、細胞の拡張、臓器肥大、組織破壊、および臓器系の機能不全を引き起こす。

一般的に、ハンター症候群の人々の身体的徴侯には、身体的な症状とニューロンの症状の両方がある。例えば、ハンター症候群のいくつかの事例では、中枢神経系の関与が発育遅延および神経系の問題を引き起こす。ハンター症候群の非ニューロン症状は、誕生時には通常ないものの、時が経過するにつれて身体の細胞にＧＡＧが進行的に蓄積することによって、身体の周辺組織に劇的な影響をもたらす可能性がある。周辺組織のＧＡＧの蓄積は、患者の顔特徴に特有の粗悪さをもたらし、突起した額、平坦な鼻梁および肥大した舌を招き、ハンター患者の顕著な特徴である。同様に、ＧＡＧの蓄積は身体の臓器系に有害に影響する可能性がある。初期に、心臓、肺および気道の壁が厚くなり、肝臓、脾臓および腎臓の異常な肥大といった徴侯が見られ、これらの重大な変化は、究極的には、破滅的な臓器不全を拡散させる可能性がある。結果として、ハンター症候群は常に重症であり、進行性であり、寿命を制限する。

酵素補充療法（ＥＲＴ）はハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）を治療するための承認された療法であり、ハンター症候群の患者に、外因性補充Ｉ２Ｓ酵素を投与することを伴う。

本発明は、数ある中で、酵素補充療法のために組換えをして製造したＩ２Ｓタンパク質を精製するための改善した方法を提供する。本発明は、わずか４つのクロマトグラフィーカラムを伴うプロセスを使用して、Ｉ２Ｓを含有する細胞培養培地等の加工されていない生体物質から組換えＩ２Ｓタンパク質を精製できる。組換えＩ２Ｓの承認された現存する酵素補充療法のための精製プロセスは、６つのクロマトグラフィーカラムを伴う。実施例の節で記載するように、本発明に記載の４つのカラムプロセスを用いて精製される組換えＩ２Ｓタンパク質は、米国およびその他多くの国の市販の精製要求に従っている。さらに、本発明に従い精製された組換えＩ２Ｓ酵素は、高い率のＣ_α-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）（例えば、例えば、７０％超、最大１００％）を保持し、Ｉ２Ｓ酵素の活性に重要であり、組換えＩ２Ｓタンパク質の生物学的利用能および／またはリソソーム標的を促進し得るシアル酸量およびグリカンマップ等の特有の特徴である。したがって、本発明は、組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するための効果的、安価で速いプロセスを提供する。本発明は、特に、無血清培地で製造される組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するのに有用である。

したがって、ある態様では、本発明は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの１つ以上に基づくプロセスを用いて、不純調製物から組換えＩ２Ｓタンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、６つ未満（例えば、５つ未満、４つ未満または３つ未満）のクロマトグラフィーのステップを伴う。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、２、３、４または５つのクロマトグラフィーのステップを伴う。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、４つのクロマトグラフィーのステップを伴う。いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、１００ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、９０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、８０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、７０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、５０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、４０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、３０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、２０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ、１０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰ）を含有する。

いくつかの実施形態では、適切なアニオン交換クロマトグラフィーはＱクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、適切なカチオン交換クロマトグラフィーはＳＰクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、適切な混合モードクロマトグラフィーはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、適切な疎水性相互作用クロマトグラフィーはフェニルクロマトグラフィーである。

アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｏカラム）、カチオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＳＰカラム）、混合モードクロマトグラフィー（例えば、ＨＡカラム）、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルカラム）は任意の順番で行うことができることが理解される。いくつかの実施形態では、本発明に記載の方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｏカラム）、カチオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＳＰカラム）、混合モードクロマトグラフィー（例えば、ＨＡカラム）、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルカラム）は、この順番で行われる。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、アニオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｑカラム）に負荷される前に、ｐＨを約５．０〜７．０（例えば、約５．０、５．５、６．０、６．５または７．０）に調整され、約１０〜２０ｍＳ／ｃｍ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍＳ／ｃｍ）の伝導率に調整される。いくつかの実施形態では、１Ｍの酢酸ナトリウムを用いてｐＨを調整する。いくつかの実施形態では、は、５Ｍの塩化ナトリウムを用いて伝導率を調整する。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーカラムは、一度負荷されると、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む洗浄緩衝液を用いて、約１４０ｍＭ〜２００ｍＭ（例えば、約１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１８５ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭ）の濃度、約５．０〜７．０（例えば、約５．０、５．５、６．０、６．５または７．０）のｐＨで洗浄される。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーカラムは、直線的な塩（例えば、ＮａＣｌ）勾配を含む溶離緩衝液を用いて溶離される。いくつかの実施形態では、適切な直線的ＮａＣｌ勾配は、約０〜５００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約０〜４００ｍＭ、約０〜３５０ｍＭ、約０〜３００ｍＭ、約５０〜５００ｍＭ、約１５０〜５００ｍＭ、約１５０〜４５０ｍＭ、約１５０〜４００ｍＭ）の範囲を含む。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、カチオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、ＳＰカラム）に負荷される前に、約１ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍ（例えば、約１ｍＳ／ｃｍ〜１５ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜８ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜６ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍ）の範囲の伝導率に調整される。いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、カチオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、ＳＰカラム）に負荷される前に、約２ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍ（例えば、２、２．５、３、３．５、または４ｍＳ／ｃｍ）の範囲の伝導率で調整される。いくつかの実施形態では、伝導率は、約１〜２：１（例えば、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、または２：１）の比で、Ｈ_２Ｏを含むアニオン交換クロマトグラフィーカラムからの溶離物を希釈することによって調整される。いくつかの実施形態では、伝導率はダイアフィルトレーション（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって調整される。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーカラムは約５．０〜６．５（例えば、５．０、５．５、６．０または６．５）のｐＨで作動する。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーのカラムは、約０．０１Ｍ〜約０．１Ｍ（例えば、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、または０．１Ｍ）の範囲のリン酸塩（例えば、ＮａＰＯ４）濃度を含む緩衝液で作動する。いくつかの実施形態では、適切なｐＨは約５．０〜６．５（例えば、約５．０、５．５、６．０、または６．５）である。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡカラム）に負荷される前に、約０．００１Ｍ〜約０．０１Ｍ（例えば、約０．００１Ｍ、０．００２Ｍ、０．００３Ｍ、０．００４Ｍ、０．００５Ｍ、０．００６Ｍ、０．００７Ｍ、０．００８Ｍ、０．００９Ｍ、または０．０１Ｍ）の範囲のリン酸塩（例えば、ＮａＰＯ４）濃度、約５．０〜６．５（例えば、約５．０、５．５、６．０、または６．５）のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡカラム）は、一度負荷されると、中性またはそれに近いｐＨでリン酸塩（例えば、１〜１０ｍＭのナトリウムまたはリン酸カリウム）を有する洗浄緩衝液で洗浄される。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡカラム）は、約１０〜２０ｍＭ（例えば、約１０〜１８ｍＭ、１０〜１６ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、１２〜２０ｍＭ、１４〜１８ｍＭ、１４〜１６ｍＭ）の範囲のリン酸塩の濃度を有する洗浄緩衝液で洗浄される。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡカラム）は、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ超のリン酸塩の濃度を有する洗浄緩衝液で洗浄される。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡカラム）からの溶離は、勾配リン酸塩緩衝液で達成される。いくつかの実施形態では、適切な溶離緩衝液は、約１〜４００ｍＭ（例えば、１〜３００ｍＭ、１〜２００ｍＭ、１〜１５０ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１０〜３５０ｍＭ、１０〜３００ｍＭ、１０〜２５０ｍＭ、１０〜２００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、１０〜１４０ｍＭ、１０〜１３０ｍＭ、１０〜１２０ｍＭ、１０〜１１０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０〜９０ｍＭ、１０〜８０ｍＭ、１０〜７０ｍＭ、１０〜６０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ）のリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムのリン酸塩の勾配を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＨＡカラムからの溶離は、溶離緩衝液中のリン酸の濃度を段階的に増加させることによって、達成される。いくつかの実施形態では、段階的な溶離緩衝液は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭから選択されるリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）濃度を有してもよい。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡカラム）からの溶離は、約５０ｍＭ〜１５０ｍＭ（例えば、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、およびその組み合わせのリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）から選択される）の範囲のリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）の濃度を有する溶離緩衝液によって達成される。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルカラム）に負荷される前に、約０．５Ｍ〜約２．０Ｍ（例えば、約０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２．０ＭのＮａＣｌ）の範囲の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度、約４．５〜６．０（例えば、約４．５、５．０、５．５、または６．０）のｐＨの範囲に調整される。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、一度負荷されると、約０．５Ｍ〜２．０Ｍ（例えば、約０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２．０ＭのＮａＣｌ）の範囲の濃度、約４．５〜６．０（例えば、約４．５、５．０、５．５、または６．０）のｐＨの塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む洗浄緩衝液を用いて洗浄される。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、０．１Ｍ〜約０．５Ｍ（例えば、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、または０．５ＭのＮａＣｌ）の範囲の濃度、約４．５〜６．０（例えば、約４．５、５．０、５．５、または６．０）のｐＨの塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む洗浄緩衝液を用いて溶離される。

いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーそれぞれのカラムの高さは、１４〜２５ｃｍ（例えば、１５〜２５ｃｍ、１５〜２０ｃｍ、１４〜２４ｃｍ、１４〜２２ｃｍ、１４〜２０ｃｍ、または１６〜１８ｃｍ）の範囲である。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーそれぞれのカラム高さは、約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｃｍである。

いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、不純調製物を最初のクロマトグラフィーカラムに負荷する前に、ウイルスの不活性化のステップを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスの不活性化のステップは、不純調製物に洗剤を加えることを含む。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、最後のクロマトグラフィーカラムの後にウイルスを取り除くステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、限外濾過および／またはダイアフィルトレーションのステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、限外濾過および／またはダイアフィルトレーションのステップは、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質を薬剤処方緩衝液に交換することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１に少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一のアミノ酸配列を有する組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するために使用される。

いくつかの実施形態では、本発明は、無血清培地中の懸濁液で培養された哺乳類細胞によって製造された組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明に適した無血清培地は、動物性由来の成分を欠いている。いくつかの実施形態では、本発明に適した無血清培地は、既知組成培地である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、バイオリアクターで培養される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞はヒト細胞である。

いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用される不純調製物は、哺乳類細胞から分泌される組換えＩ２Ｓタンパク質を含有する無血清培地から調製される。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される不純調製物は、凍結された培地調製物から溶解される。

いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して１分子あたり１６〜２２（例えば、１６〜２１、１６〜２０、１６〜１９、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９）のシアル酸を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して１分子あたり１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個のシアル酸を含有する。

いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓ（配列番号１）のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）転換を有する。いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓ（配列番号１）のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、実質的に１００％の転換を有する。いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって決定されるように、少なくとも約２０Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、または１００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。

いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの取り込みアッセイによって決定されるように、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％超の細胞の取り込みを特徴とする。

いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、それぞれ、中性（ピーク群１）、モノシアリル化（ピーク群２）、ジシアリル化（ピーク群３）、モノホスホリル化（ピーク群４）、トリシアリル化（ピーク群５）、テトラシアリル化（ピーク群６）、またはジホスホリル化（ピーク群７）Ｉ２Ｓタンパク質を指示する７つのピーク群を含むグリカンマップを特徴とする。いくつかの実施形態では、グリカンマップは、ノイラミニダーゼ消化の後に発生する。その他の実施形態では、グリカンマップは、アルカリホスファターゼ消化の後に発生する。

本発明は、数ある中で、本明細書に記載されるように、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質、および医薬組成物または同組成物を含む製剤を提供する。いくつかの実施形態では、製剤は、静脈内、皮下、および／または髄腔内投与のために処方される。本発明は、精製された組換えＩ２Ｓ、それを含む医薬組成物または製剤を、治療を必要とする対象に投与することによって、ハンター症候群を治療する方法も提供する。

本明細書に使用されるように、用語「Ｉ２Ｓタンパク質」、「Ｉ２Ｓ」、「Ｉ２Ｓ酵素」、または文法的に等価な用語は、別に特に示されなければ、組換えＩ２Ｓタンパク質分子を調製することを意味する。

当該出願に使用されるように、用語「約」および「およそ」は等価なものとして使用される。約／およそを付けたまたは付けていない当該出願に使用される数字は、関連技術分野の当業者によって認識される通常の増減を含むことを意味する。

本発明のその他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な記述で明らかにする。しかしながら、詳細な記述は、本発明の実施形態を示すが、説明のためだけにあり、限定することを意味しないことを理解されたい。本発明の範囲内での様々な変更または修正は、詳細な記述から、当業者に明白であろう。
本発明は、以下の項目も提供する。
（項目１）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む組成物であって、精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％転換し、および、さらに、精製された組換えＩ２Ｓは、１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する、組成物。
（項目２）
精製された組換えＩ２Ｓは、１００ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する項目１に記載の組成物。
（項目３）
精製された組換えＩ２Ｓは、８０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する項目１に記載の組成物。
（項目４）
精製された組換えＩ２Ｓは、６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する項目１に記載の組成物。
（項目５）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む組成物であって、精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％転換し、および、さらに精製された組換えＩ２Ｓは、平均して１分子あたり少なくとも１６個のシアル酸を含有する、組成物。
（項目６）
精製された組換えＩ２Ｓは、平均して１分子あたり少なくとも１８個のシアル酸を含有する、項目５に記載の組成物。
（項目７）
精製された組換えＩ２Ｓは、平均して１分子あたり少なくとも２０個のシアル酸を含有する、項目５に記載の組成物。
（項目８）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む組成物であって、精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％転換し、および、さらに、精製された組換えＩ２Ｓは、１酵素あたり少なくとも１０％のビス-ホスホリルアテドオリゴ糖を含有する、組成物。
（項目９）
精製された組換えＩ２Ｓは、１酵素あたり少なくとも２０％のビス-ホスホリルアテドオリゴ糖を含有する、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む組成物であって、精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％転換し、および、さらに、精製された組換えＩ２Ｓは、中性（ピーク群１）、モノシアリル化（ピーク群２）、ジシアリル化（ピーク群３）、モノホスホリル化（ピーク群４）、トリシアリル化（ピーク群５）、テトラシアリル化（ピーク群６）、またはジホスホリル化（ピーク群７）Ｉ２Ｓタンパク質を指示するピーク群から選択される７つまたはそれより少ないピーク群を含むグリカンマップを特徴とする、組成物。
（項目１１）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７５％転換する、前記項目いずれか１つに記載の組成物。
（項目１２）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約８０％転換する、項目１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
（項目１３）
配列番号１に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む組成物であって、精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、約８５％超の転換を含む、組成物。
（項目１４）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、約９０％超の転換を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、約９５％超の転換を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目１６）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、実質的に１００％の転換を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目１７）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１に少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、前記項目いずれか１つに記載の組成物。
（項目１８）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、前記項目いずれか１つに記載の組成物。
（項目１９）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、前記項目いずれか１つに記載の組成物。
（項目２０）
精製された組換えＩ２Ｓは、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、前記項目いずれか１つに記載の組成物。
（項目２１）
前記項目いずれか１つに記載の組成物および生理学的に許容可能な担体を含む製剤。
（項目２２）
製剤は静脈投与に適している項目２１に記載の製剤。
（項目２３）
製剤は髄腔内投与に適している項目２１に記載の製剤。
（項目２４）
製剤は皮下投与に適している項目２１に記載の製剤。
（項目２５）
製剤はハンター症候群を治療するためにある項目２１に記載の製剤。
（項目２６）
アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの１つ以上を実施することによって、不純調製物から組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質を精製することを含む方法であって、方法は、６つ未満のクロマトグラフィーのステップを伴い、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、１００ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する、方法。
（項目２７）
アニオン交換クロマトグラフィーはＱクロマトグラフィーである項目２６に記載の方法。
（項目２８）
カチオン交換クロマトグラフィーはＳＰクロマトグラフィーである項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
混合モードクロマトグラフィーはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーである項目２６〜２８のいずれか１つに記載の方法。
（項目３０）
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルクロマトグラフィーである項目２６〜２９のいずれか１つに記載の方法。
（項目３１）
方法は５つまたはそれ未満のクロマトグラフィーのステップを伴う項目２６〜３０のいずれか１つに記載の方法。
（項目３２）
方法は４つまたはそれ未満のクロマトグラフィーのステップを伴う項目２６〜３１のいずれか１つに記載の方法。
（項目３３）
方法はアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーをこの順番で実施する、項目２６〜３２のいずれか１つに記載の方法。
（項目３４）
不純調製物または中間溶離物を負荷されると、アニオン交換クロマトグラフィーカラムは、ｐＨ５．５の約１４０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を用いて洗浄される、項目２６〜３３のいずれか１つに記載の方法。
（項目３５）
アニオン交換クロマトグラフィーカラムは、直線的ＮａＣｌ勾配を含む溶離緩衝液を用いて溶離される、項目２６〜３４のいずれか１つに記載の方法。
（項目３６）
直線的ＮａＣｌ勾配は０〜５００ｍＭの範囲のＮａＣｌを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
不純調製物または中間溶離物は、カチオン交換クロマトグラフィーのカラムに負荷される前に、約１ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導率に調整される、項目２６〜３６のいずれか１つに記載の方法。
（項目３８）
カチオン交換クロマトグラフィーカラムは、約５．５のｐＨで作動する項目３７に記載の方法。
（項目３９）
不純調製物または中間溶離物は、混合モードクロマトグラフィーのカラムに負荷される前に、約０．００１〜０．０１ＭおよびｐＨ５．５の範囲のリン酸塩濃度に調整される、項目２６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
（項目４０）
混合モードクロマトグラフィーカラムは、一度負荷されると、約１０〜２０ｍＭ、ｐＨ５．５の範囲のリン酸塩濃度を含む洗浄緩衝液を用いて洗浄される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
混合モードクロマトグラフィーカラムは、約５０〜１５０ｍＭ、ｐＨ５．５の範囲のリン酸塩濃度を含む溶離緩衝液を用いて溶離される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
不純調製物または中間溶離物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムに負荷される前に、約０．５〜２．０Ｍ、約４．５〜６．０のｐＨの範囲の塩濃度に調整される、項目２６〜４１のいずれか１つに記載の方法。
（項目４３）
疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムは、一度負荷されると、約０．５〜２．０Ｍ、約４．５〜６．０のｐＨの範囲の塩濃度を含む洗浄緩衝液を用いて洗浄される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、約０．１〜０．５Ｍ、約４．５〜６．０のｐＨの範囲の塩濃度を含む溶離緩衝液を用いて溶離される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのそれぞれのカラムの高さは１４〜２５ｃｍの範囲である、項目２６〜４４のいずれか１つに記載の方法。
（項目４６）
方法はウイルスの不活性化のステップをさらに含む前記項目いずれか１つに記載の方法。
（項目４７）
ウイルスの不活性化のステップは、最初のクロマトグラフィーのカラムに不純調製物を負荷する前に行われる項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ウイルスの不活性化のステップは、不純調製物に洗剤を加えることを含む項目４６に記載の方法。
（項目４９）
方法は、最後のクロマトグラフィーのカラムの後にウイルスを取り除くステップをさらに含む、項目２６〜４８のいずれか１つに記載の方法。
（項目５０）
方法は、限外濾過および／またはダイアフィルトレーションのステップをさらに含む、項目２６〜４９のいずれか１つに記載の方法。
（項目５１）
限外濾過および／またはダイアフィルトレーションのステップは、組換えＩ２Ｓタンパク質を、薬剤処方緩衝液に交換することを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、項目２６〜５１のいずれか１つに記載の方法。
（項目５３）
組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、項目２６〜５２のいずれか１つに記載の方法。
（項目５４）
組換えＩ２Ｓタンパク質は、無血清培地中の懸濁液に培養される哺乳類細胞によって製造される、項目２６〜５３のいずれか１つに記載の方法。
（項目５５）
哺乳類細胞はバイオリアクターで培養される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
無血清培地は動物性由来成分を欠いている項目５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
無血清培地は、既知組成培地である項目５４〜５６のいずれか１つに記載の方法。
（項目５８）
哺乳類細胞は、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する、項目５４〜５６のいずれか１つに記載の方法。
（項目５９）
哺乳類細胞はヒト細胞である項目５８に記載の方法。
（項目６０）
不純調製物は、哺乳類細胞から分泌される組換えＩ２Ｓタンパク質を含有する無血清培地から調製される、項目５４〜５９のいずれか１つに記載の方法。
（項目６１）
不純調製物は、凍結培地調製物から溶解される項目６０に記載の方法。
（項目６２）
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、８０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、項目２６〜６１のいずれか１つに記載の方法。
（項目６３）
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、項目２６〜６２のいずれか１つに記載の方法。
（項目６４）
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して、１分子あたり１６〜２２個のシアル酸を含有する、項目２６〜６３のいずれか１つに記載の方法。
（項目６５）
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖類を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性によって特定されるように、少なくとも６０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する、項目２６〜６３のいずれか１つに記載の方法。
（項目６６）
項目２６〜６５のいずれか１つに記載の方法に従い精製された組換えＩ２Ｓタンパク質を含む医薬組成物。
（項目６７）
項目６６に記載の医薬組成物を、治療が必要な対象に投与することを含むハンター症候群を治療する方法。

以下に記載の図は、一緒に図を構成し、説明のためだけにあり、限定することを意味しない。
無血清培地に製造された組換えＩ２Ｓについての例示的な精製スキームを記述する。 参照Ｉ２Ｓと比較したときの精製された組換えＩ２Ｓ ＡＦの例示的なペプチドマップを記述する。 精製された組換えＩ２Ｓ ＡＦの例示的なＳＤＳ-ＰＡＧＥ（銀）分析を記述する。 イオン交換クロマトグラフィーによって評価された精製された組換えＩ２Ｓ ＡＦの例示的な電荷特性分析を記述する。 精製された組換えＩ２Ｓ ＡＦの例示的なグリカンマップ特性を記述する。 組換えＩ２Ｓの浄化された回収物のウイルス不活性化ＵＰＢステップの後の例示的な活性の分析（Ｕ／ｍｇ）を記述する。 組換えＩ２Ｓの浄化された回収物のウイルス不活性化ＵＰＢステップの後の例示的なＳＥＣ-ＨＰＬＣの分析を記述する。 精製された組換えＩ２Ｓタンパク質を銀染色で処理された例示的なＳＤＳ-ＰＡＧＥを記述する。 参照と比較したときの、無血清培地条件（上パネル）で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄ細胞株から製造された精製された組換えＩ２Ｓ酵素についての例示的ペプチドマップを示す。 参照と比較したときの、無血清培地条件で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄおよび４Ｄ細胞株を使用して製造された精製された組換えＩ２Ｓ酵素について発生した例示的なグリカンの特性を記述する。 Ｉ２Ｓ参照対照と比較したときの、無血清培地条件で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄおよび４Ｄ細胞株を使用して製造された精製された組換えＩ２Ｓ酵素について発生した例示的な電荷特性を記述する。

定義
本発明をもっとわかり易く理解するために、以下に初めに特定の用語を定義する。以下の用語およびその他の用語についての追加の定義は明細書全体にわたって記載する。

およそまたは約：目的の１つ以上の値に付けられる用語「およそ」または「約」は、本明細書で使用するとき、定められた基準値とほぼ同じ値を意味する。ある実施形態では、用語「およそ」または「約」は、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内にある値の範囲、または別に特に示されなければ、若しくは文脈から別に明白に示されなければ（ただし当該数字が可能な値の１００％を超える場合は除く）、定められた基準値のどちらかの方向でより少ない（超または未満）にある値の範囲を意味する。

生物学的に活性：フレーズ「生物学的に活性な」は、本明細書で使用されるとき、生物系（例えば、細胞培養、有機体等）に活性を有する任意の物質の特徴を意味する。例えば、物質が有機体に投与され、有機体に生物学的影響をもたらすとき、生物学的に活性であると考えられる。生物学的活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって決定することもできる（例えば、硫酸塩放出アッセイ等のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素試験）。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を分かち合うタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的に「生物学的に活性な」部分として意味する。いくつかの実施形態では、タンパク質は細胞培養系から産生および／または精製され、対象に投与されると生物学的活性を表す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生物学的に活性になるために、更なる処理を必要とする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、限定されないが、生物学的に活性になるために、グリコシル化（例えば、シアリル化）、ファルネシル化、切断、折りたたみ、ホルミルグリシン転換およびその組み合わせ等の翻訳後修飾を必要とする。いくつかの実施形態では、プロ形態（すなわち未成熟形態）として産生されるタンパク質は、生物学的に活性になるために、追加の修飾を必要とし得る。

カチオン非依存性マンノース６リン酸レセプター（ＣＩ-ＭＰＲ）：用語「カチオン非依存性マンノース６リン酸レセプター（ＣＩ-ＭＰＲ）」は、本明細書で使用するとき、リソソームを輸送することを運命付けられたゴルジ体中の酸性ヒドロラーゼ前駆体上のマンノース６リン酸レセプター（Ｍ６Ｐ）タグを結合する分子受容体を意味する。マンノース６リン酸の他に、ＣＩ-ＭＰＲはＩＧＦ-ＩＩを含むその他のンパク質とも結合する。ＣＩ-ＭＰＲは「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ-ＩＩ受容体」、「ＣＩ-ＭＰＲ／ＩＧＦ-ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ-ＩＩ受容体」、または「ＩＧＦ２受容体」としても知られる。これらの用語およびその略語は、本明細書では交換可能に使用される。

クロマトグラフィー：用語「クロマトグラフィー」は、本明細書で使用するとき、混合物を分離する手技を意味する。典型的に、混合物は「移動相」と呼ばれる液体に溶解し、「固定相」と呼ばれる別の材料を保持する構造を通過する。カラムクロマトグラフィーは、固定したベッドが管、すなわちカラム内にある分離の手技を意味する。

希釈剤：用語「希釈剤」は、本明細書で使用するとき、再構築された製剤を調製するのに有用な薬剤的に許容可能な（例えば、ヒトへの投与に安全および非毒性である）希釈物質を意味する。例示的な希釈剤として、無菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（リン酸塩緩衝生理食塩水）無菌生理食塩溶液、リンゲル溶液またはブドウ糖溶液が挙げられる。

溶離：用語「溶離」は、本明細書で使用するとき、溶媒を洗浄することによって、１つの物質を別の物質から抽出するプロセスを意味する。例えば、イオン交換クロマトグラフィーでは、溶離は、捉えたイオンを取り除くために負荷された樹脂を洗浄するプロセスである。

溶離物：用語「溶離物」は、移動相「担体」と典型的には溶離の結果として、クロマトグラフィーから現れる分析材料との組み合わせを意味する。

酵素補充療法（ＥＲＴ）：用語「酵素補充療法（ＥＲＴ）」は、本明細書で使用するとき、失われた酵素を提供することによって酵素欠損を直す治療戦略を意味する。一度投与されると、酵素は細胞によって取り込まれ、リソソームに輸送され、そこで酵素は、酵素欠損のためにリソソーム内に蓄積された物質を取り除くように作用する。典型的にはリソソーム酵素補充療法が効果的であり、治療用酵素が、蓄積欠陥が現れる標的細胞の適切な細胞内のリソソームに運ばれる。

平衡化するまたは平衡化：クロマトグラフィーに関係する用語「平衡化する」または「平衡化」は、本明細書で使用するとき、最初の液体（例えば、緩衝液）を別のもので調和をとるプロセスを意味し、通常、液体（例えば、緩衝液）の成分の安定および均等な分布を達成することを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のカラム容量の望ましい液体（例えば、緩衝液）を、カラムを通過させることによって、クロマトカラムを平衡化してもよい。

改善する、増加するまたは減少する：用語「改善する」、「増加する」、若しくは「減少する」、または文法的に等価な用語は、本明細書で使用するとき、本明細書に記載の治療を開始する前の同じ個体の測定、または本明細書に記載の治療のない対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定等の基線測定に関連がある値を示す。「対照個体」は、治療を受けている個体と同じ形態のリソソーム蓄積病に苦しむ個体であり、（治療を受けている個体と対照個体の疾患のステージを確実に比較できるように）治療を受けている個体とほぼ同じ年齢である。

不純物：用語「不純物」は、本明細書で使用するとき、限定された量の液体、気体、または固体内の物質を意味し、標的物質または化合物の化学組成物とは異なる。不純物は汚染物としても意味する。

リンカー：用語「リンカー」は、本明細書で使用するとき、融合タンパク質内の自然のタンパク質内の特定の位置に現れるものではないアミノ酸配列を意味し、通常、２つのタンパク質部分の間のαヘリックス等の構造に柔軟でありまたは挿入するように設計される。リンカーはスペーサーとしても意味する。

負荷する：用語「負荷する」は、本明細書で使用するとき、クロマトグラフィー中にカラムに試料を含む液体または固体を加えることを意味する。いくつかの実施形態では、カラムに負荷された試料の特定の成分は、負荷された試料として捉えられ、カラムを通過する。いくつかの実施形態では、カラムに負荷された試料の特定の成分は、カラムによって捉えられず、または「素通り」し、負荷された試料としてのカラムは、カラムを通過する。

ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、通常言われるように、ペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸のひもである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは少なくとも３〜５個のアミノ酸を含み得、そのそれぞれが、少なくとも１つのペプチド結合によって他と結合する。当業者は、ポリペプチドは、「天然ではない」アミノ酸、またはさもなければ、ポリペプチド鎖に取り込むこともできるその他の実体を含むことがあることを理解するだろう。

プールする：クロマトグラフィーに関係する用語「プールする」は、本明細書で使用するとき、カラムを一緒に通過した液体の１つ以上の画分を組み合わせることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーによって分離された試料の望ましい成分を含有する１つ以上の画分（例えば、「ピーク画分」）は、一緒に「プールする」ことができ、単一の「プールされた」画分を生み出す。

置換酵素：用語「置換酵素」は、本明細書で使用するとき、治療対象の疾患で酵素が欠損または喪失した酵素を少なくとも部分的に置換するように作用することができる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、用語「置換酵素」は、治療対象のリソソーム蓄積疾患で酵素が欠損または喪失した酵素を少なくとも部分的に置換するように作用することができる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、置換酵素は、哺乳類のリソソームに蓄積された物質を減少することができ、または１つ以上のリソソーム蓄積疾患の症状を救うまたは寛解させることができる。本発明に適した置換酵素として野生型または改変型リソソーム酵素の両方が挙げられ、組換えおよび合成方法を使用して製造することができ、または天然資源から精製することができる。置換酵素は、組換えの、合成の、遺伝的に活性のまたは天然の酵素であってよい。

可溶性の：用語「可溶性の」は、本明細書で使用するとき、治療薬が均一な溶液を形成する能力を意味する。いくつかの実施形態では、溶液中の治療薬の可溶性は、投与され、およびそれによって活性の標的部位に輸送される治療薬が、治療有効量の治療薬が活性の標的部位に送達できるのに十分である。いくつかの因子が治療薬の可溶性に影響を与える可能性がある。例えば、タンパク質の可溶性に影響し得る関連因子として、イオン強度、アミノ酸配列およびその他の一緒に可溶する薬剤または塩類（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明に記載の治療薬は、対応する医薬組成物に可溶性である。

安定性：用語「安定の」は、本明細書で使用するとき、拡張した時間にわたって、治療薬（例えば、組換え酵素）が治療効果（例えば、全て、または大部分の意図される生物学的活性および／または生理化学的統一性）を維持する能力を意味する。治療薬の安定性、および当該治療薬の安定性を維持するための医薬組成物の能力は、拡張した時間（例えば、少なくとも、１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月以上の間）にわたって評価してもよい。製剤の文脈で、安定した製剤は、治療薬が保管時、および（凍結／溶解、機械的混合および凍結乾燥等の）加工中に物理的および／または化学的統一性および生物学的活性を本質的に保持している剤である。タンパク質の安定性について、高分子量（ＨＭＷ）凝集物の形成、酵素活性の喪失、ペプチド断片の発生および電荷特性の変化によって測定することができる。

ウイルスプロセッシング：用語「ウイルスプロセッシング」は、本明細書で使用するとき、ウイルスが試料から単純に取り除かれる「ウイルス除去」、またはウイルスが試料中に存在するが、感染しない形態にある「ウイルス不活性化」を意味する。いくつかの実施形態では、ウイルス除去は、数ある中でもナノ濾過法および／またはクロマトグラフィーの手技を用いてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、数ある中でも、溶媒不活性化、洗剤不活性化、低温殺菌法、酸性ｐＨ不活性化および／または紫外線不活性化を用いてもよい。

（発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、６つ未満のクロマトグラフィーステップを含むプロセスに基づいて、酵素補充療法のために、組換えＩ２Ｓタンパク質を精製する改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの１つ以上に基づくプロセスを使用して不純調製物から組換えＩ２Ｓタンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｑクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー、ＳＰクロマトグラフィー、およびフェニルクロマトグラフィーを実施することによって、不純調製物から組換えＩ２Ｓタンパク質を精製する方法を提供する。本発明は精製された組換えＩ２Ｓタンパク質およびその使用をさらに提供する。

以下の小節にて本発明の種々の態様をさらに詳細に説明する。小節の使用は本発明を限定するものではない。各小節は本発明の任意の態様に適用され得る。本出願では「又は」の使用は、言及されない限り、「及び／又は」を意味する。

組換えＩ２Ｓタンパク質
本明細書で使用されるとき、Ｉ２Ｓタンパク質は、天然に存在するイズロン酸-２-スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の少なくとも部分的な活性と置き換わることができる又はＩ２Ｓ欠損に関連した１以上の表現型若しくは症状を救済することができるタンパク質又はタンパク質の一部である。本明細書で使用されるとき、用語「Ｉ２Ｓ酵素」及び「Ｉ２Ｓタンパク質」及び文法的な同等物は交換可能に使用される。

通常、ヒトのＩ２Ｓタンパク質は前駆体形態として産生される。ヒトＩ２Ｓの前駆体形態は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜２５）と、プロペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基２６〜３３）と、さらに４２ｋＤａの鎖（完全長前駆体の残基３４〜４５５）にプロセシングされ得る鎖（完全長前駆体の残基３４〜５５０）と、１４ｋＤａの鎖（完全長前駆体の残基４４６〜５５０）を含有する。通常、前駆体形態は、５５０のアミノ酸を含有する完全長前駆体又は完全長Ｉ２Ｓタンパク質とも呼ばれる。通常野生型の又は天然の存在するヒトのＩ２Ｓタンパク質のシグナルペプチドが除去された成熟形態（配列番号１）及び完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を表１に示す。シグナルペプチドには下線を引く。加えて、ヒトＩ２Ｓタンパク質アイソフォームａ及びｂの前駆体のアミノ酸配列もそれぞれ、表１の配列番号３及び４にて提供する。

従って、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）である。本明細書で開示されるとき、配列番号１はヒトのＩ２Ｓタンパク質の標準的なアミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、Ｉ２Ｓ遺伝子の５’ＵＴＲ内での選択的出発部位での転写の結果生じる配列番号１のスプライスアイソフォーム及び／又は変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、好適な組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するＩ２Ｓタンパク質（たとえば、配列番号１）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の断片又は一部を含有する。

或いは、組換えＩ２Ｓタンパク質は完全長のＩ２Ｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在する完全長のＩ２Ｓタンパク質に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾された完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）に対して実質的に相同である。例えば、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は配列番号２と実質的に同一である。例えば、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトの完全長のＩ２Ｓタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、完全長のＩ２Ｓタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（たとえば、配列番号３）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（配列番号３）に対して実質的に相同である。例えば、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号３と実質的に同一である。例えば、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（たとえば、配列番号４）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（配列番号４）に対して実質的に相同である。例えば、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号４と実質的に同一である。例えば、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。

ヒトのＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、そのような方法を蓄積する参考文献にて見いだされるような当業者に既知のポリペプチド配列を変える方法に従って調製することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄの範囲内でのアミノ酸の間で行われる置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、「保存的なアミノ酸の置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷又はサイズ特性を変えないアミノ酸の置換を指す。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、標的細胞の表面上の受容体に結合して細胞の取り込み及び／又はリソソームの標的化を促進する部分を含有してもよい。たとえば、そのような受容体は、マンノース-６-リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を結合するカチオン依存性のマンノース-６-リン酸受容体（ＣＩ-ＭＰＲ）であり得る。加えて、ＣＩ-ＭＰＲはＩＧＦ-ＩＩを含む他のタンパク質も結合する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、タンパク質の表面にＭ６Ｐ残基を含む。具体的には、組換えＩ２Ｓタンパク質はＣＩ-ＭＰＲにもっと高い結合親和性を有するビスリン酸化オリゴ糖を含有していてもよい。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、１酵素あたり、最大、おおよそ平均の少なくとも約２０％のビスリン酸化オリゴ糖を含有する。他の実施形態では、適切な酵素は、１酵素あたり、約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビスリン酸化オリゴ糖を含有してもよい。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ酵素は、標的細胞の表面で受容体に結合することができるリソソーム標的部分と融合してもよい。好適なリソソーム標的化部分は、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、及びその変異体、同族体又は断片（たとえば、ヒトの野生型成熟ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である配列を有するそれらのペプチドを含む）であり得る。リソソーム標的部分は、Ｎ末端、Ｃ末端または内部で、Ｉ２Ｓタンパク質または酵素と結合または融合してもよい。

組換えＩ２Ｓタンパク質の製造
本発明は、様々な方法で製造される組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するために使用してよい。例えば、Ｉ２Ｓタンパク質は、Ｉ２Ｓをコードする核酸を発現するように操作された宿主細胞系を使用することによって、組換えて製造されてもよい。あるいは、Ｉ２Ｓタンパク質を、内因性Ｉ２Ｓ遺伝子を活性化することによって、製造してもよい。

本発明は、様々な発現系を使用して製造される組換えＩ２Ｓタンパク質を精製するために使用してもよいことが理解される。適切な発現系として、例えば、卵、バキュロウイルス、植物、イースト、または哺乳類細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、哺乳類細胞で製造される。本発明に従い使用してもよい哺乳類細胞の非限定的な例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄種株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０（ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質移入されたサル腎ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養中で増殖のためにサブクローンされたＨＥＫ２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９，１９７７）；ヒト繊維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞 ＋／-ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３-２５１、１９８０）；サル腎培養細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎培養細胞（ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１ ５８７）；ヒト頚部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４-６８、１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、ヒト細胞（例えば、ＨＴ１０８０）から製造された組換えＩ２Ｓ酵素を精製するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、ＣＨＯ細胞から製造された組換えＩ２Ｓ酵素を精製するために使用される。

典型的に、組換えＩ２Ｓを発現するために操作される細胞は、本明細書に記載の組換えＩ２Ｓタンパク質をコードする導入遺伝子を含んでもよい。組換えＩ２Ｓをコードする核酸は、制御配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列および／または組換えＩ２Ｓを発現するためのその他の適切な配列を含んでよい。典型的に、コード領域は、１つ以上のこれらの核酸成分と操作可能に結合される。

「制御配列」は典型的にコード配列の上流（５'非コード配列）、その中、または下流（３'非コード配列）に位置されるヌクレオチド配列を意味し、転写、ＲＮＡプロセッシング若しくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響する。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が挙げられる。「制御配列」は、「遺伝子制御配列」としても意味することがある。

「プロモーター」は典型的にコード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列を意味する。通常、コード配列はプロモーター配列の３位に位置される。プロモーター配列は、近位または遠位の上流要素から成り、後者の要素はエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であり、生得的なプロモーターの要素またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入された異種性要素であってもよい。プロモーターは全体的に、野生型の遺伝子に由来してもよいし、または自然に認められる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよいし、または合成ヌクレオチド断片を含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型で、または発現の異なる段階で、または異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を方向付けてもよいことを当業者は理解する。

「３'非コード配列」は、典型的にコード配列の下流に位置されるヌクレオチド配列を意味し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる制御シグナルをコードするその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルはたいていｍＲＮＡ前駆体の３'末端へのポリアデニル酸のトクラトの添加に影響することを特徴とする。

「翻訳リーダー配列」または「５'非翻訳配列」は典型的に遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置されるヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の完全に加工されたｍＲＮＡ上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に対する一次転写のプロセッシングに影響を与え得る。

典型的に、用語「操作可能に結合される」は、１つの機能が他によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片の結合を意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる（いわゆるコード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、コード配列と操作可能に結合される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向の制御配列に操作可能に結合することができる。

導入遺伝子のコード領域は、特定の細胞型についてのコドンの使用を最適化するために、１つ以上のサイレント変異を含んでいてもよい。例えば、Ｉ２Ｓ導入遺伝子のコドンを、脊椎動物細胞の発現のために最適化してもよい。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ導入遺伝子のコドンを、哺乳類細胞の発現のために最適化してもよい。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ導入遺伝子のコドンを、ヒト細胞の発現のために最適化してもよい。

構築物は以下の１つ以上の追加の成分を含んでいてもよい。以下、スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーター下の選択可能な標識遺伝子、適切なプロモーター下の増幅可能なマーカー遺伝子、およびマトリックス結合領域（ＭＡＲ）または挿入された領域の発現を高める当業者に周知のその他の要素。

宿主細胞に形質移入または形質導入されると、適切なベクターは染色体外に（エピソームに）発現することができ、または宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

組換えＩ２Ｓタンパク質の活性化
典型的に、組換えＩ２Ｓ酵素は、２-アミノ-３-オキソプロピオン酸またはオキソ-アラニンとしても知られるホルミルグリシンに保存されたシステイン（成熟したヒトＩ２Ｓのアミノ酸５９位に相当する）を翻訳後修飾することによって活性化する。当該翻訳後修飾は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）として知られる酵素によって行うことができる。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ酵素は、ＦＧＥタンパク質も発現する細胞内で製造される。特定の実施形態では、組換えＩ２Ｓ酵素は、ＦＧＥタンパク質の発現を増加させる、または高める細胞で製造する。例えば、細胞を操作して、組換えＩ２Ｓと組み合わせてＦＧＥを過剰発現し、高いレベルの活性酵素を有するＩ２Ｓの調製物を製造することを促進してもよい。いくつかの実施形態では、ＦＧＥの過剰発現は、標準的な組換え技術を用いて外因性ＦＧＥを発現する（例えば、過剰発現）ことによって達成される。いくつかの実施形態では、ＦＧＥの過剰発現は、例えば外因性ＦＧＥ遺伝子のプロモーターを活性化し、または高めることによって、外因性ＦＧＥの発現を活性化し、または高めることによって達成される。いくつかの場合では、例えば、組換えＩ２Ｓをコードする核酸および組換えＦＧＥタンパク質をコードする核酸は、内部のリボソームエントリー領域に対応する配列を有する核酸（例えば、スペーサー配列）によって結合される。

システインをホルミルグリシンに転換する能力を有するＦＧＥを本発明に使用してよい。ＦＧＥタンパク質について例示的な核酸およびアミノ酸配列を米国特許第２００４-０２２９２５０号に開示し、当該配列に関係する内容の全体および配列それ自体は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。組換えＦＧＥをコードする核酸が制御配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列および／またはＦＧＥを発現するためのその他の適切な配列を含んでよい。典型的に、コード領域は、１つ以上のこれらの核酸成分と操作可能に結合される。

細胞培養の培地及び条件
種々の細胞培養の培地及び条件を用いて、組換えＩ２Ｓタンパク質を製造し得る。たとえば、血清含有培地又は無血清培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。いくつかの実施形態では、無血清培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。いくつかの実施形態では、動物成分を含まない培地、すなわち、動物由来の成分を欠く培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。いくつかの実施形態では、既知組成培地にて組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させ得る。本明細書で使用されるとき、用語「既知組成培地」は化学的な成分の実質的にすべてが知られる培地を指す。いくつかの実施形態では、既知組成培地は、たとえば、血清、血清由来のタンパク質（たとえば、アルブミン又はフェチュイン）及び他の成分を含まない。場合によっては、化学的に定義された培地は１以上のタンパク質（たとえば、タンパク質の増殖因子又はサイトカイン）を含む。場合によっては、既知組成培地は１以上のタンパク質の加水分解物を含む。他の場合では、既知組成培地はタンパク質を含まない培地、すなわち、タンパク質、加水分解物又は未知の組成物の成分を含有しない無血清培地である。

いくつかの実施形態では、既知組成培地は１以上の動物に由来する成分によって補完され得る。そのような動物に由来する成分には、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清及びたとえば、アルブミンのような血清に由来するタンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミン）が挙げられるが、これらに限定されない。

ローラーボトル培養、バイオリアクターバッチ培養及びバイオリアクター流加培養を含むが、これらに限定されない種々の細胞培養条件を用いて組換えＩ２Ｓタンパク質を大規模に製造し得る。いくつかの実施形態では、懸濁液で培養される細胞によって組換えＩ２Ｓタンパク質が産生される。いくつかの実施形態では、接着性細胞によって組換えＩ２Ｓタンパク質が産生される。

例となる細胞培地及び培養条件は実施例の項で記載する。組換えＩ２Ｓタンパク質を作出するための追加の例となる方法及び組成物は、同日付で同封して出願された「組換えイズロン酸-２-スルファターゼを作出するための方法及び組成物」と題する仮特許出願にて記載されており、参照によってその開示全体が本明細書に組み入れられる。

組換えＩ２Ｓタンパク質の精製
いくつかの実施形態では、本発明は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの１つ以上に基づくプロセスを用いて、不純調製物から組換えＩ２Ｓタンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、６つ未満（例えば、５つ未満、４つ未満または３つ未満）のクロマトグラフィーのステップを伴う。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、２、３、４または５つのクロマトグラフィーのステップを伴う。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、４つのクロマトグラフィーのステップを伴う。いくつかの実施形態では、本発明に記載の発明の方法は、アニオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーをこの順序で実施する。

不純調製物
不純調製物は、本明細書で使用するとき、組換えＩ２Ｓタンパク質を含有する加工されていない生体物質を含む生体物質であってもよい。例えば、不純調製物は、Ｉ２Ｓタンパク質を製造する細胞（例えば、哺乳類細胞）から分泌される組み換えＩ２Ｓタンパク質を含有する未加工の細胞培養培地であっても、Ｉ２Ｓタンパク質を含有する生の細胞可溶物であってもよい。いくつかの実施形態では、不純調整物は、部分的に、未加工の細胞培養地または細胞可溶物であってもよい。例えば、細胞培地または細胞可溶物は、濃縮され、希釈され、ウイルス不活性化、ウイルスプロセッシング、またはウイルス除去の処理がなされていてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルス除去は、数ある中でもナノ濾過法および／またはクロマトグラフィーの手技を用いてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、数ある中でも溶媒不活性化、洗剤不活性化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活性化、および／または紫外線不活性化を用いてもよい。細胞培地または細胞可溶物は、プロテアーゼ、ＤＮＡ分解酵素、および／またはＲＮＡ分解酵素で処理し、宿主細胞のタンパク質および／または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）のレベルを低下させてもよい。いくつかの実施形態では、加工されていないまたは部分的に加工された生体物質（例えば、細胞培地または細胞可溶物）を、精製のために、望ましい温度（例えば、２〜８℃、-４℃、-２５℃、-７５℃）、望ましい期間に、凍結し保管し、溶解してもよい。本明細書で使用されるように、不純調製物は、出発材料または負荷材料としての意味もある。

アニオン交換クロマトグラフィー
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓを精製するための提供される方法として、アニオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。端的に、アニオン交換クロマトグラフィーは、負に電荷された化合物と正に電荷された樹脂の間の電荷−電荷相互作用に依存するクロマトグラフィーの手技である。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、強アニオン交換クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、治療用タンパク質（例えば、組換えＩ２Ｓ）の最初の精製ステップとして使用される。

例示的なアニオン交換樹脂として、限定されないが、第４級アミン樹脂または「Ｑ樹脂」（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）-Ｑ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））；ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂（例えば、ＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（登録商標）、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチルＳｅｐｈａｃｅｌ（登録商標））；Ａｍｂｅｒｊｅｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−６７、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）強塩基、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）弱塩基）、コレスチラミン樹脂、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＳＡＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＡＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０）；ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ）；およびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）樹脂が挙げられる。ある実施形態では、アニオン交換樹脂はＱ樹脂である。

アニオン性交換クロマトグラフィーの典型的な移動相として、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、およびイソプロパノール等の有機アルコール、または２-（Ｎ-モルホリノ）-エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む溶液等の比較的極性の溶液が挙げられる。したがって、ある実施形態では、移動相は、約０％、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％の極性溶液が挙げられる。ある実施形態では、移動相は、分離の最中に所与の時間で、約１％ 〜約１００％、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、または約４０％〜約６０％の間の極性溶液を含む。

通常、移動相は塩を含む。例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム）は、アニオン交換カラムから結合されたタンパク質を溶離することができる（例えば、対イオンは塩化物であり、標的タンパク質について交換され、その後放出される）。いくつかの実施形態では、移動相は、約０〜約１．０Ｍ、例えば、約０〜約０．８Ｍ、約０〜約０．６Ｍ、約０〜約０．５Ｍ、約０〜約０．４Ｍ、約０．０５Ｍ〜約０．５０Ｍ、約０．１０Ｍ〜約０．４５Ｍ、約０．１０Ｍ〜約０．４０Ｍ、または約０．１５Ｍ〜約０．４０Ｍの塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、または１．０Ｍの塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、移動相の塩濃度は勾配している（例えば、直線的または非直線的勾配）。いくつかの実施形態では、移動相の塩濃度は定常である。いくつかの実施形態では、移動相の塩濃度は、段階的に増加または減少してもよい。

典型的に、移動相は緩衝される。ある実施形態では、移動相は緩衝されない。ある実施形態では、移動相は約５〜約１４のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相は約５〜約１０のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相は約５〜約７のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相は約６．５のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相は約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０のｐＨで緩衝される。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、アニオン交換クロマトグラフィーのカラム（例えば、Ｑカラム）に負荷する前に、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０または７．５のｐＨおよび約２ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、または２０ｍＳ／ｃｍの伝導率に調整される。ｐＨは酢酸ナトリウム（例えば１Ｍ）を使用して調整され、伝導率は塩化ナトリウム（例えば５Ｍ）を使用して調整される。一度負荷されると、アニオン交換クロマトグラフィーのカラムは、約１４０ｍＭ〜約２００ｍＭ（例えば、約１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１８５ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭ）の範囲の塩（例えばＮａＣｌ）濃度、約５．０〜７．５（例えば、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０または７．５）のｐＨを含む洗浄緩衝液を使用して洗浄してもよい。アニオン交換クロマトグラフィーのカラムは、直線的ＮａＣｌ勾配を含む溶離緩衝液を用いて溶離されてもよい。適した例示的な直線的ＮａＣｌ勾配は、約０〜５００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約０〜４００ｍＭ、約０〜３５０ｍＭ、約０〜３００ｍＭ、約５０〜５００ｍＭ、約１５０〜５００ｍＭ、約１５０〜４５０ｍＭ、約１５０〜４００ｍＭ）の範囲を含むことができる。

カチオン交換クロマトグラフィー
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓを精製するために提供される方法として、カチオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。端的に、カチオン交換クロマトグラフィーは、正に電荷された化合物と負に電荷された樹脂の間の電荷-電荷相互作用に依存するクロマトグラフィーの手技である。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーは強カチオン交換クロマトグラフィーである。

カチオン交換クロマトグラフィーは、通常、強カチオンまたは弱カチオン交換カラムのいずれかで実施され、スルホニウムイオンを含有し、またはカルボキシメチル（ＣＭ）若しくはカルボン酸塩（ＣＸ）官能基を通常含む弱カチオン交換器で実施される。多くの適切なカチオン交換樹脂は当該技術分野で周知であり、市販されており、限定されないが、ＳＰ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）；Ａｍ
ｂｅｒｊｅｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ１２０）；ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＳＣＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０）；ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｓ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ-２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ-ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＣＸ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ-ＳＴＡＴ；ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ-５ＰＷ；ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ-Ａ；ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ-２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ-３ＳＷ、およびＴＳＫｇｅｌ ＣＭ-ＳＴＡＴ）；並びにＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）樹脂が挙げられる。ある実施形態では、アニオン交換樹脂はＳＰ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（登録商標）である。

カチオン交換クロマトグラフィーの典型的な移動相として、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、およびイソプロパノール等の有機アルコール、または２-（Ｎ-モルホリノ）-エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む溶液等の比較的極性の溶液が挙げられる。したがって、ある実施形態では、移動相は、約０％、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％の極性溶液を含む。ある実施形態では、移動相は、分離の最中に所与の時間で、約１％〜約１００％、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、または約４０％〜約６０％の極性溶液を含む。

通常、移動相は塩を含む。例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等）はカチオン交換カラムから結合されたタンパク質を溶離することができる（例えば、対イオンはナトリウムであり、標的タンパク質について交換され、その後放出される）。いくつかの実施形態では、移動相は、約０〜約１．０Ｍ、例えば、約０〜約０．８Ｍ、約０〜約０．６Ｍ、約０〜約０．５Ｍ、約０〜約０．４Ｍ、約０．０５Ｍ〜約０．５０Ｍ、約０．１０Ｍ〜約０．４５Ｍ、約０．１０Ｍ〜約０．４０Ｍ、または約０．１５Ｍ〜約０．４０Ｍの範囲の濃度の塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、または１．０Ｍの濃度の塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相の塩濃度は勾配（例えば直線的勾配または非直線的勾配）である。いくつかの実施形態では、移動相の塩濃度は定常である。いくつかの実施形態では、移動相の塩濃度は段階的に増加させても、減少させてもよい。

典型的に移動相は緩衝される。ある実施形態では、移動相は緩衝されない。ある実施形態では、移動相は、約５〜約１４のｐＨに緩衝される。ある実施形態では、移動相は、約５〜約１０のｐＨに緩衝される。ある実施形態では、移動相は、約５〜約７のｐＨに緩衝される。ある実施形態では、移動相は、約６．５のｐＨに緩衝される。ある実施形態では、移動相は、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０のｐＨに緩衝される。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、カチオン交換クロマトグラフィーのカラム（ＳＰカラム）に負荷される前に、約１ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍ（例えば、約１ｍＳ／ｃｍ〜１５ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ 〜１０ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜８ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜６ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍ）の範囲の伝導率に調整される。特定の実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、カチオン交換クロマトグラフィーのカラム（ＳＰカラム）に負荷される前に、約２ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍ（例えば、２、２．５、３、３．５、または４ｍＳ／ｃｍ）の範囲の伝導率に調整される。伝導率はＨ_２Ｏで、例えば、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、２．０：１、２．５：１、３．０：１、４．０：１、５．０：１、または１０：１の比で不純調製物または中間溶離物または通過画分を希釈することによって調整される。伝導率は、また、望ましい緩衝液にダイアフィルトレーションすることによって調整してもよい。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーのカラムは、約５．０〜６．５（例えば、約５．０、５．５、６．０または６．５）のｐＨで作動する。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーのカラムは、約０．０１Ｍ〜約０．１Ｍ（例えば、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、または０．１Ｍ）の範囲の濃度でリン酸塩（例えば、ＮａＰＯ４）を含む緩衝液で作動する。いくつかの実施形態では、適切なｐＨは約５．０〜６．５（例えば、約５．０、５．５、６．０、または６．５）である。

混合モードクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）は、「偽親和性（ｐｓｅｕｄｏ-ａｆｆｉｎｉｔｙ）」クロマトグラフィーまたは「混合モード」イオン交換であると考えられ、本発明に従い使用してよい。ヒドロキシアパタイトは、生体分子の分画および精製に使用される固有の形態のリン酸カルシウムである。いくつかの場合では、結晶の脆弱性によって流速および／またはカラムの寿命に限界があるが、結晶性ヒドロキシアパタイトを使用してもよい。２つのタイプの化学的に純粋なセラミックスヒドロキシアパタイト、ＣＨＴセラミックスヒドロキシアパタイトＩ型およびＩＩ型はマクロ多孔性で、球状であり、高速の流速および高い圧力で使用することができる。Ｉ型は、通常、高いタンパク質結合能力があり、ＩＩ型は、通常タンパク質についての結合能力が低い。通常、ヒドロキシアパタイトの公式はＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９８５）である。官能基は、正に電荷された対の結晶性のカルシウムイオン（Ｃ-部位）および三つ組の結晶性リン酸塩（Ｐ-部位）と結合した６つの負に電荷された酸素原子のクラスターを含む。Ｃ-部位、Ｐ-部位およびヒドロキシルは、結晶表面に固定されたパターンで分布し、通常、タンパク質およびその他の分子と複雑な相互作用をもたらす。

中性または中性に近いｐＨで、イオン強度の低いリン酸塩緩衝液（例えば、１〜１０ｍＭのリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム）中のＨＡカラムに、試料を負荷してもよい。いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分を、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えばＨＡカラム）に負荷する前に、約０．００１Ｍ〜約０．０１Ｍ（例えば、約０．００１Ｍ、０．００２Ｍ、０．００３Ｍ、０．００４Ｍ、０．００５Ｍ、０．００６Ｍ、０．００７Ｍ、０．００８Ｍ、０．００９Ｍ、または０．０１Ｍ）の範囲のリン酸塩（例えば、ＮａＰＯ４）濃度および約５．０〜６．５（例えば、約５．０、５．５、６．０、または６．５）のｐＨに調整する。負荷されたＨＡカラムを、典型的に、付加している緩衝液のリン酸塩の濃度と比較することのできるリン酸塩濃度を有する洗浄緩衝液で洗浄する。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えばＨＡカラム）は、一度負荷されると、中性または中性に近いｐＨで、リン酸塩（例えば、１〜１０ｍＭのリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム）を含む洗浄緩衝液で洗浄される。例えば、適切な洗浄緩衝液は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭのリン酸塩濃度を有してもよい。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液中のリン酸塩の量を増やし、よりストリンジェントな洗浄条件を作製することが望ましい。Ｉ２Ｓタンパク質の表面上のＭ６Ｐレベル、特にジ-Ｍ６Ｐレベルは、リソソーム標的に重要である。洗浄緩衝液中の増加したリン酸塩濃度は、選択的に、Ｉ２Ｓタンパク質を、高いレベルのＭ６Ｐ、特にＨＡカラム上のジ-Ｍ６Ｐで保持する。したがって、いくつかの実施形態では、望ましい洗浄緩衝液は、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ超のリン酸塩濃度を有してよい。いくつかの実施形態では、負荷された混合モードクロマトグラフィーカラム（例えばＨＡカラム）は、約１０〜２０ｍＭ（例えば、約１０〜１８ｍＭ、１０〜１６ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、１２〜２０ｍＭ、１４〜１８ｍＭ、１４〜１６ｍＭ）の範囲のリン酸塩濃度を有する洗浄緩衝液で洗浄される。いくつかの実施形態では、負荷された負荷された混合モードクロマトグラフィーカラム（例えばＨＡカラム）は、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ超のリン酸塩濃度を有する洗浄緩衝液で洗浄される。

ＨＡカラムからの溶離は、典型的に勾配リン酸塩緩衝液で達成される。例えば、適切な溶離緩衝液は、約１〜４００ｍＭ（例えば、１〜３００ｍＭ、１〜２００ｍＭ、１〜１５０ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１０〜３５０ｍＭ、１０〜３００ｍＭ、１０〜２５０ｍＭ、１０〜２００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、１０〜１４０ｍＭ、１０〜１３０ｍＭ、１０〜１２０ｍＭ、１０〜１１０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０〜９０ｍＭ、１０〜８０ｍＭ、１０〜７０ｍＭ、１０〜６０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ）のリン酸ナトリウムのリン酸塩の勾配を有してよい。いくつかの実施形態では、ＨＡカラムからの溶離は、溶離緩衝液中のリン酸塩濃度を段階的に増加させることによって達成される。いくつかの実施形態では、段階的な溶離緩衝液は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭから選択されるリン酸塩濃度を有してよい。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラム（例えばＨＡカラム）からの溶離は、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（例えば、約５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、およびその組み合わせのリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）濃度から選択される）の範囲のリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）濃度を有する溶離緩衝液によって達成される。

ＨＡクロマトグラフィーについての多くの異なる条件の組み合わせは周知であり、対象の特定のタンパク質（例えば、組み換えＩ２Ｓ）に適するように数値を調整して使用してよい。

疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、タンパク質を他から分離する疎水性の特性を使用する分離の手技である。このタイプのクロマトグラフィーでは、フェニル、オクチル、またはブチル等の疎水基が、固定カラムに結合する。表面に疎水性アミノ酸側鎖を有するカラムを通過するタンパク質は、カラム上で疎水基と相互作用し、結合する。ＨＩＣカラムは周知であり、例えば、フェニルセファロースが挙げられる。

ＨＩＣ分離は、イオン交換クロマトグラフィーに使用される条件と反対の条件を用いて設計されることが多い。通常、強いイオン強度を持つ緩衝液、たいてい硫酸アンモニウムは、最初にカラムに適用される。緩衝液中の塩が、試料溶離物の溶媒和を減少させ、したがって、溶媒和が減少すると、曝露されるようになる疎水性領域が、培地によって吸収される。固相は通常、他の分子と疎水性の相互作用を形成するように設計される。相互作用は、通常、水中では弱すぎるが、塩（例えば、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌ、ＮａＢｒ、およびＮａＳＣＮ）を緩衝液に追加することによって、疎水性の相互作用になる。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．１Ｍ〜約３．０Ｍ、例えば、約０．１Ｍ〜約１．５Ｍ，約０．２Ｍ〜約０．８Ｍ、または約０．３Ｍ〜約０．５Ｍの塩濃度を含む。

ある実施形態では、移動相は緩衝される。ある実施形態では、移動相は緩衝されない。ある実施形態では、移動相は約５〜約１４のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相は約５〜約１０のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相は約５〜約７のｐＨで緩衝される。ある実施形態では、移動相約５．０のｐＨで緩衝される。

いくつかの実施形態では、不純調製物または中間溶離物または通過画分は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルカラム）に負荷される前に、約０．５Ｍ〜約２．０Ｍ（例えば、約０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２．０Ｍ）の範囲の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度に、約４．５〜６．０のｐＨで調整される。一度負荷されると、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムを、約０．５Ｍ〜約２．０Ｍ（例えば、約０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２．０Ｍ）の範囲の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を含む洗浄緩衝液を用いて、約４．５〜６．０（例えば、約４．５、５．０、５．５、または６．０）のｐＨで、洗浄してもよい。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムを、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ（例えば、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、または０．５Ｍ）の範囲の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を含む約４．５〜６．０（例えば、約４．５、５．０、５．５、または６．０）の溶離緩衝液を用いて、約４．５〜６．０（例えば、約４．５、５．０、５．５、または６．０）のｐＨで、溶離してもよい。

精製されたＩ２Ｓのタンパク質の特徴付け
精製されたＩ２Ｓのタンパク質の特徴付けを様々な方法を用いて行ってよい。

純度
精製された組換えＩ２Ｓのタンパク質の純度は、典型的に、最終産生物に存在する様々な不純物（例えば、宿主細胞タンパク質または宿主細胞ＤＮＡ）のレベルによって測定される。例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルはＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ-ＰＡＧＥによって測定してよい。いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓのタンパク質は、１５０ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ未満のＩ２Ｓタンパク質（例えば、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、３０、２０、１０ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ未満のＩ２Ｓタンパク質）を含有する。いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓのタンパク質は、銀染色のＳＤＳ-ＰＡＧＥに供すると、０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％超のアッセイ対照の強度で新しい結合を有しない。様々なアッセイ対照、特にＦＤＡ等の制御剤に許容可能な対照を使用してよい。

特異的活性
精製された組換えＩ２Ｓのタンパク質は、機能的および／生物学的活性を評価することによって、特徴付けることができる。組換えＩ２Ｓ組成物の酵素活性は、当該技術分野に周知の方法を用いて決定してもよい。典型的に、方法は、合成基質から硫酸塩の除去を検出することを伴い、硫酸塩放出アッセイとして周知である。酵素活性アッセイの一例は、イオンクロマトグラフィーを伴う。この方法は、基質から組換えＩ２Ｓによって酵素的に放出される硫酸イオンの量を定量化する。基質は、天然の基質であっても、合成の基質であってもよい。いくつかの場合では、基質はヘパリン硫酸塩（例えば、ヘパリン二糖類）、デルマタン硫酸塩、またはその等価物である。典型的に、放出される硫酸塩を、電気伝導度検出器を伴うイオンクロマトグラフィーによって分析する。当該実施例では、結果をタンパク質のＵ／ｍｇとして表し、１Ｕｎｉｔは、時間あたり基質から１マイクロモルの硫酸イオンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。いくつかの実施形態では、基質としてヘパリン二糖類を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出アッセイによって測定されるように、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は特異的活性を有し、その範囲は、約０〜１００Ｕ／ｍｇ、約１０〜１００Ｕ／ｍｇ、約１０〜８０Ｕ／ｍｇ、約２０〜８０Ｕ／ｍｇ、約２０〜７０Ｕ／ｍｇ、約２０〜６０Ｕ／ｍｇ、約２０〜５０Ｕ／ｍｇ、約３０〜１００Ｕ／ｍｇ、約３０〜９０Ｕ／ｍｇ、約３０〜８０Ｕ／ｍｇ、約３０〜７０Ｕ／ｍｇ、約３０〜６０Ｕ／ｍｇ、約４０〜１００Ｕ／ｍｇ、約４０〜９０Ｕ／ｍｇ、約４０〜８０Ｕ／ｍｇ、約４０〜７０Ｕ／ｍｇ、約４０〜６０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、基質としてヘパリン二糖類を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出アッセイによって測定されるように、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は特異的活性を有し、少なくとも約５Ｕ／ｍｇ、約１０Ｕ／ｍｇ、約１５Ｕ／ｍｇ、約２０Ｕ／ｍｇ、約２５Ｕ／ｍｇ、約３０Ｕ／ｍｇ、約３５Ｕ／ｍｇ、約４０Ｕ／ｍｇ、約４５Ｕ／ｍｇ、約５０Ｕ／ｍｇ、約５５Ｕ／ｍｇ、約６０Ｕ／ｍｇ、約６５Ｕ／ｍｇ、約７０Ｕ／ｍｇ、約７５Ｕ／ｍｇ、約８０Ｕ／ｍｇ、約８５Ｕ／ｍｇ、約９０Ｕ／ｍｇ、約９５Ｕ／ｍｇ、または約１００Ｕ／ｍｇである。ヘパリン二糖を基質として用いた試験管内の硫酸塩放出活性アッセイを行うための例となる条件を以下に提供する。通常、このアッセイは天然に由来する基質であるヘパリン二糖から硫酸イオンを放出するＩ２Ｓの能力を測定する。放出された硫酸塩をイオンクロマトグラフィによって定量してもよい。場合によっては、イオンクロマトグラフィには伝導率検出器が装備されている。非限定の例として、試料を先ず１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６に緩衝液交換し、製剤化緩衝液におけるリン酸イオンによる阻害を取り除く。次いで試料を反応緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．４）で０．０７５ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０μｌの反応容量にて０．３μｇのＩ２Ｓ／１００μｇの基質の酵素と基質の比でヘパリン二糖と共に３７℃で２時間インキュベートする。次いで試料を１００℃で３分間加熱することによって反応を止める。ＩｏｎＰａｃ ＡＧ１８ガードカラムと共にＤｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１８分析用カラムを用いて分析を行う。１．０ｍｌ／分で１５分間の３０ｍＭの水酸化カリウムによる定組成法を使用する。Ｉ２Ｓ試料によって放出される硫酸塩の量は１．７〜１６．０ナノモルの範囲での硫酸塩基準の線形回帰分析から算出する。報告可能な値をタンパク質のｍｇ当たりの単位として表し、１単位は、時間あたり放出される硫酸塩の１マイクロモルとして定義され、タンパク質濃度はＡ２８０の測定によって決定する。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質の酵素活性は、当該技術で周知の種々の他の方法、たとえば、４-メチルウンベリフェリル-硫酸塩の硫酸塩と自然に蛍光を発する４-メチルウンベリフェロン（４-ＭＵＦ）への加水分解を測定する４-ＭＵＦアッセイを用いても決定され得る。いくつかの実施形態では、試験管内での４-ＭＵＦアッセイによって測定するとき、産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の所望の酵素活性は、少なくとも０．５Ｕ／ｍｇ、１．０Ｕ／ｍｇ、１．５Ｕ／ｍｇ、２Ｕ／ｍｇ、２．５Ｕ／ｍｇ、３Ｕ／ｍｇ、４Ｕ／ｍｇ、５Ｕ／ｍｇ、６Ｕ／ｍｇ、７Ｕ／ｍｇ、８Ｕ／ｍｇ、９Ｕ／ｍｇ、１０Ｕ／ｍｇ、１２Ｕ／ｍｇ、１４Ｕ／ｍｇ、１６Ｕ／ｍｇ、１８Ｕ／ｍｇ、又は２０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、試験管内での４-ＭＵＦアッセイによって測定するとき、産生される組換えＩ２Ｓタンパク質の所望の酵素活性は、約０〜５０Ｕ／ｍｇ（たとえば、約０〜４０Ｕ／ｍｇ、約０〜３０Ｕ／ｍｇ、約０〜２０Ｕ／ｍｇ、約０〜１０Ｕ／ｍｇ、約２〜５０Ｕ／ｍｇ、約２〜４０Ｕ／ｍｇ、約２〜３０Ｕ／ｍｇ、約２〜２０Ｕ／ｍｇ、約２〜１０Ｕ／ｍｇ、約４〜５０Ｕ／ｍｇ、約４〜４０Ｕ／ｍｇ、約４〜３０Ｕ／ｍｇ、約４〜２０Ｕ／ｍｇ、約４〜１０Ｕ／ｍｇ、約６〜５０Ｕ／ｍｇ、約６〜４０Ｕ／ｍｇ、約６〜３０Ｕ／ｍｇ、約６〜２０Ｕ／ｍｇ、約６〜１０Ｕ／ｍｇ）の範囲に及ぶ。試験管内での４-ＭＵＦアッセイを行うための例となる条件を以下に提供する。通常、４-ＭＵＦアッセイは、４-メチルウンベリフェリル-硫酸塩（４-ＭＵＦ-ＳＯ_４）を硫酸塩と自然に蛍光を発する４-メチルウンベリフェロン（４-ＭＵＦ）に加水分解するＩ２Ｓタンパク質の能力を測定する。活性の１ミリ単位は、３７℃にて１分間で１ナノモルの４-ＭＵＦ-ＳＯ_４を４-ＭＵＦに変換するのに必要とされる酵素の量として定義される。通常、活性が既知のＩ２Ｓ試験試料によって生成される平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線を生成することができ、それを用いて当該試料の酵素活性を算出することができる。タンパク質濃度による酵素活性を分けることによって、特異的活性を計算してよい。

どの実施例でも、組換えＩ２Ｓ組成物のタンパク質濃度を、タンパク質濃度を決定するために、当該技術分野に周知の適切な方法によって決定してよい。いくつかの場合では、タンパク質濃度を、紫外線光吸収度分析によって決定する。当該吸収度分析は典型的に、約２８０ｎｍの波長（Ａ_２８０）で実施する。

電荷特性
精製された組換えＩ２Ｓを、タンパク質に関連する電荷特性によって特徴付けてよい。典型的に、タンパク質電荷特性は、典型的にタンパク質の表面に存在する残基側鎖電荷のパターンを反映する。電荷特性を、タンパク質のイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）アッセイを実施することによって決定してよい。いくつかの実施形態では、「電荷特性」は、交換イオンを含有する移動相のカラムに加えた後に、ある時点で、イオン交換カラムから溶離するタンパク質量を表す一組の値を意味する。

典型的に、適切なイオン交換カラムはアニオン交換カラムである。例えば、電荷特性は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系を使用して、強アニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーによって決定してよい。通常、組換えＩ２Ｓは、強アニオン交換カラムの固定された正電荷上で吸収し、事前に定められた流速で、移動相を使用した増加したイオン強度の勾配が、正電荷されたカラムとのイオン相互作用の強度に比例して、カラムから組換えＩ２Ｓ種を溶離する。より負に電化した（より酸性）Ｉ２Ｓ種は、負電荷が弱い（弱い酸性）Ｉ２Ｓ種より遅く溶離する。溶離物のタンパク質濃度は、紫外線光吸収によって（２８０ｎｍで）検出される。

いくつかの実施形態では、Ｍｉｎｉ Ｑ ＰＥカラムの固定された正電荷上で、２０ｍＭのＴＲＩＳ-ＨＣｌ中、約８．０のｐＨで、組換えＩ２Ｓは吸収し、０．８ｍｌ／分の流速、ｐＨ８．０で、２０ｍＭのＴＲＩＳ-ＨＣＬ、１Ｍの塩化ナトリウムから成る移動相を使用して増加したイオン強度の勾配が、正電荷されたカラムとのイオン相互作用の強度に比例して、カラムから組換えＩ２Ｓ種を溶離する。

いくつかの実施形態では、電荷特性をＨＰＬＣカラムからの溶離後に、時間に対する吸光ユニットのクロマトグラムによって記述してよい。クロマトグラムは一組の１つ以上のピークを含んでよく、その組の各ピークが、同様の表面電荷を有する組成物の組換えＩ２Ｓの部分母集団を識別する。

いくつかの実施形態では、精製されたＩ２Ｓタンパク質組成物は、電荷特性に少なくとも６つのピークを表す。Ｉ２Ｓの例示的な電荷特性を実施例の節および図１１に記述する。図１１に示すように、増加した負電荷およびクロマトグラムの総ピーク領域に対する減少した分布の順番で、６つのピークに標識を付ける（Ａ〜Ｆ）。いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓ組成物についての電荷特性は、タンパク質の表面の負または正電荷の量に依存して、異なる数、大きさ、形、またはピークの時間間隔を含む。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓは、６つ未満（例えば、５、４、３、または２未満）のピークの電荷特性を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓの電荷特性は、５、４、３、２、または１つのピークを有してよい。例えば、１、２、３、４、または５つのピークＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質組成物になくても、減少していてもよい。典型的に、電荷特性は、ピークが少ないと、より均質になると考えられる。

グリカンマッピング
いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、プロテオグリカン組成物によって特徴付けされてもよく、典型的に、グリカンマッピングとして意味する。いかなる理論に縛られることを望むものではないが、分岐構造の形状または複雑さに沿ってグリカン結合は、ｉｎ ｖｉｖｏのクリアランス、リソソーム標的、生物学的利用能、および／または効果に影響を与え得ると考えられる。

典型的に、グリカンマップは、酵素消化および次のクロマトグラフィー分析によって決定してよい。限定されないが、適切なグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プロテアーゼ、およびホスファターゼを含む酵素消化に様々な酵素を使用してよい。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、アルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、適切な酵素はノイラミニダーゼである。グリカン（例えば、ホスホグリカン）は、クロマトグラフィー分析によって検出され得る。例えば、ホスホグリカンは、パルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥ-ＰＡＤ）を伴う高速アニオン交換クロマトグラフィー、または粒径排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出してよい。グリカンマップの各ピークによって表されるグリカン（例えば、ホスホグリカン）の量は、当該技術分野に周知の方法および本明細書に開示の方法に従い、グリカン（例えば、ホスホグリカン）の標準曲線を用いて計算してよい。

いくつかの実施形態では、本発明の精製されたＩ２Ｓは、それぞれ、中性（ピーク群１）、モノシアリル化（ピーク群２）、ジシアリル化（ピーク群３）、モノホスホリル化（ピーク群４）、トリシアリル化（ピーク群５）、テトラシアリル化（ピーク群６）、またはジホスホリル化（ピーク群７）Ｉ２Ｓタンパク質を指示する７つのピーク群を含むグリカンマップを表す。例示的なＩ２Ｓのグリカンマップを図１０に記述する。いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓは、７つ未満の群のグリカンマップを有する（例えば、６、５、４、３、または２つのピーク群）。いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓは７つ以上のピーク群を有するグリカンマップを有する（例えば、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上）。

各ピーク群に対応するグリカンの相対的な量を、事前に定められた標準試料の対応するピーク群領域に相対するピーク群に基づいて決定してよい。いくつかの実施形態では、ピーク群１（中性）は、標準試料の対応するピーク群領域に対して、約４０〜１２０％（例えば、約４０〜１１５％、約４０〜１１０％、約４０〜１００％、約４５〜１２０％、約４５〜１１５％、約４５〜１１０％、約４５〜１０５％、約４５〜１００％、約５０〜１２０％、約５０〜１１０％）の範囲のピーク領域を有する。いくつかの実施形態では、ピーク群２（モノシアリル化）は、標準試料の対応するピーク群領域に対して、約８０〜１４０％（例えば、約８０〜１３５％、約８０〜１３０％、約８０〜１２５％、約９０〜１４０％、約９０〜１３５％、約９０〜１３０％、約９０〜１２０％、約１００〜１４０％）の範囲のピーク領域を有する。いくつかの実施形態では、ピーク群３（ジシアリル化）は、標準試料の対応するピーク群領域に対して、約８０〜１１０％（例えば、約８０〜１０５％、約８０〜１００％、約８５〜１０５％、約８５-１００％）の範囲のピーク領域有する。いくつかの実施形態では、ピーク群４（モノホスホリル化）は、標準試料の対応するピーク群領域に対して、約１００-５５０％（例えば、約１００〜５２５％、約１００〜５００％、約１００〜４５０％、約１５０〜５５０％、約１５〜５００％、約１５０〜４５０％、約２００〜５５０％、約２００〜５００％、約２００〜４５０％、約２５０〜５５０％、約２５０〜５００％、約２５０〜４５０％、または約２５０〜４００％）の範囲のピーク領域を有する。いくつかの実施形態では、ピーク群５（トリシアリル化）は、標準試料の対応するピーク群領域に対して、約７０〜１１０％（例えば、約７０〜１０５％、約７０〜１００％、約７０〜９５％、約７０〜９０％、約８０〜１１０％、約８０〜１０５％、約８０〜１００％、または約８０〜９５％）の範囲のピーク領域を有する。いくつかの実施形態では、ピーク群６（テトラシアリル化）は、標準試料の対応するピーク群領域に対して、約９０〜１３０％（例えば、約９０〜１２５％、約９０〜１２０％、約９０〜１１５％、約９０〜１１０％、約１００〜１３０％、約１００〜１２５％、または約１００〜１２０％）の範囲のピーク領域を有する。いくつかの実施形態では、ピーク群７（ジホスホリル化）は標準試料の対応するピーク群領域に対して、約７０〜１３０％（例えば、約７０〜１２５％、約７０〜１２０％、約７０〜１１５％、約７０〜１１０％、約８０〜１３０％、約８０〜１２５％、約８０〜１２０％、約８０〜１１５％、約８０〜１１０％、約９０〜１３０％、約９０〜１２５％、約９０〜１２０％、約９０〜１１５％、約９０〜１１０％）の範囲のピーク領域を有する。グリカンマッピングの様々な標準試料が当該技術分野に周知であり、本発明を実施するために使用することができる。典型的に、ピーク群７（ジホスホリル化）は、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質の表面で、ジ-Ｍ６Ｐのレベルに対応する。

精製されたＩ２Ｓのグリコシル化パターンはリソソーム標的に影響を与える。様々なｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞取り込みアッセイが当該技術分野に周知であり、本発明を実施するために使用することができる。例えば、Ｍ６Ｐ受容体によるＩ２Ｓの取り込みを評価するために、表面にＭ６Ｐ受容体を発現するヒト繊維芽細胞を使用して、細胞取り込みアッセイを実施する。内部に取り入れられたＩ２Ｓの量は、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞取り込みアッセイによって決定されるように、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％超の細胞取り込みを特徴とする。

ペプチドマッピング
いくつかの実施形態では、ペプチドマッピングを使用して、アミノ酸組成物、翻訳後修飾、および／またはシグナルペプチドの切断、ホルミルグリシン転換および／またはグリコシル化等の細胞プロセッシングを特徴付けてよい。典型的に、組換えタンパク質を、制御されたまたはランダムな切断のいずれかによって、別個のペプチド断片に切断し、パターンまたはペプチドマップを作製してよい。いくつかの場合では、精製されたＩ２Ｓタンパク質を、分析する前に、最初に酵素消化に供してよい。分析する前に、ペプチダーゼ、配糖体、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、リパーゼまたはプロテアーゼおよび／またはその組み合わせを使用して消化を行ってよい。ペプチドの構造的組成物を、当該技術分野に周知の方法を用いて決定してよい。例示的な方法として、限定されないが、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）またはＨＰＬＣが挙げられる。

ホルミルグリシンの転換率
ペプチドマッピングを使用して、ＦＧｌｙ転換率を決定した。Ｉ２Ｓ活性は、以下に示されるように、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によってホルミルグリシン転換するために、システイン（成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）を必要とする。

したがって、ホルミルグリシン転換率（％ＦＧ）を以下の公式を使用して計算することができる。

％ＦＧを計算するために、組換えＩ２Ｓタンパク質を、タンパク分解酵素（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を使用して、短いペプチドに消化させてよい。短いペプチドを分離し、粒径排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して特徴付けした。成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチドが、対照（例えば、ＦＧｌｙ転換のないＩ２Ｓタンパク質または１００％ＦＧｌｙ転換したＩ２Ｓタンパク質）と比較して、５９位のＣｙｓがＦＧｌｙに転換されるかどうかを特徴付けした。ＦＧｌｙを含むペプチドの量（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）、およびＦＧｌｙとＣｙｓの両方を有するペプチドの全量を、対応するピーク領域に基づいて特定してもよく、％ＦＧを反映する比を計算することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓ（配列番号１）のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）転換する。いくつかの実施形態では、本発明の精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓ（配列番号１）のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、実質的に１００％転換する。

シアル酸量
いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、シアル酸組成物によって特徴付けられる。理論に縛られることを望むものではないが、タンパク質上のシアル酸残基は、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体による急速なｉｎ ｖｉｖｏのクリアランスを防ぎ、減少させ、または抑制し得ることは理解されている。したがって、比較的高いシアル酸量を有する組換えタンパク質は、典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏの比較的長い循環時間を有すると考えられる。

いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質のシアル酸量を、当該技術分野に周知の方法を用いて決定してよい。例えば、精製されたＩ２Ｓタンパク質のシアル酸量を、酵素消化および次のクロマトグラフィー分析によって決定してよい。任意の適切なシアリダーゼを用いて、酵素消化達成してよい。いくつかの場合では、ノイラミニダーゼ等のグリコシドヒドロラーゼ酵素によって消化をおこなう。シアル酸を、例えば、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ-ＰＡＤ）等のクロマトグラフィー分析によって決定してよい。組換えＩ２Ｓ組成物中のシアル酸の量を、当該技術分野に周知の方法および本明細書に記載の方法に従い、シアル酸の標準曲線を用いて計算してよい。

いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質のシアル酸量は、１６ｍｏｌ／ｍｏｌ超である。シアル酸量の文脈で「ｍｏｌ／ｍｏｌ」は、酵素の１モルあたりのシアル酸残基のモル数を意味する。いくつかの場合では、組換えＩ２Ｓタンパク質のシアル酸量は、約１６．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１８ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１９ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２１ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２２ｍｏｌ／ｍｏｌまたはそれ以上であるか、それ以上である。いくつかの実施形態では、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質のシアル酸量は、約１６〜２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１６〜２１ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１６〜２２ｍｏｌ／ｍｏｌ、１６〜２３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１６〜２４ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１６〜２５ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７〜２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７〜２１ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７〜２２ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７〜２３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７〜２４ｍｏｌ／ｍｏｌ、または約１７〜２５ｍｏｌ／ｍｏｌの範囲にあり得る。

医薬組成物および投与
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質を既知の方法に従ってハンター症候群患者に投与し得る。たとえば、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、非経口で、経皮で又は経粘膜で（たとえば、経口若しくは経鼻）送達され得る。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は静脈内投与によって対象に投与される。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物はクモ膜下投与によって対象に投与される。本明細書で使用されるとき、用語「クモ膜下投与」又は「クモ膜下注入」は、脊柱管（脊髄を取り囲むクモ膜下空間）への注入を指す。穿頭孔又は大槽穿刺又は腰椎穿刺等を介した側脳室内注入含むが、限定されない種々の技法を使用し得る。いくつかの実施形態では、本発明に係る「クモ膜下投与」又は「クモ膜下送達」は、腰椎の域又は領域を介したＩＴ投与又は送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与又は送達を指す。本明細書で使用されるとき、用語「腰椎領域」又は「腰椎域」は第３と第４の腰椎（腰背部）、さらに包括的には脊椎のＬ２〜Ｓ１の領域を指す。

いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は皮下（すなわち、皮膚の下）投与によって対象に投与される。そのような目的では、製剤は注射器を用いて注入され得る。しかしながら、たとえば、注入用具（Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（商標）Ｇｅｎｊｅｃｔ（商標）用具）；注入ペン（たとえば、ＧｅｎＰｅｎ（商標））；針なし装置（たとえば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（商標）及びＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（商標））；及び皮下添付送達方式のような製剤の投与用の他の用具が利用可能である。

いくつかの実施形態では、投与の他の経路（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、又は経粘膜（たとえば、経口若しくは経鼻））との併用でクモ膜下投与が使用され得る。

本発明は、治療上有効な量の、本明細書で記載される組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物の単回投与と同様に複数回投与を熟考する。組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は、定期的な間隔で、対象の状態（たとえば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度及び程度に応じて投与することができる。いくつかの実施形態では、治療上有効な量の組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物が、定期的な間隔で（たとえば、毎年１回、６ヵ月ごとに１回、５ヵ月ごとに１回、３ヵ月ごとに１回、２ヵ月に１回（２ヵ月ごとに１回）、１ヵ月に１回（１ヵ月ごとに１回）、２週間に１回（２週間ごとに１回）、毎週、毎日又は連続的に）定期的に投与され得る。

組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は、生理的に許容可能なキャリア又は賦形剤と共に製剤化されて医薬組成物を調製することができる。キャリア及び治療剤は無菌であることができる。製剤は投与の方式に適合すべきである。

好適な薬学上許容可能なキャリアには、水、塩溶液（たとえば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール類、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、たとえば、ラクトース、アミロース又はデンプンのような炭水化物、たとえば、マンニトール、スクロース等のような糖類、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、と同様にそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は所望であれば、活性化合物と有害に反応しない、又はその活性を妨害しない補助剤（たとえば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝液、着色剤、風味剤及び／又は芳香物質等）と混合することができる。いくつかの実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性キャリアが使用される。

組成物又は薬物は所望であれば、軽微な量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有することもできる。組成物は、液状溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉剤であることができる。組成物はまたトリグリセリドのような従来の結合剤又はキャリアと共に座薬として製剤化することもできる。経口製剤は、たとえば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準のキャリアを含むことができる。

組成物又は薬物はヒトに投与するのに適合した医薬組成物として日常の手順に従って製剤化することができる。たとえば、いくつかの実施形態では、静脈内投与用の組成物は通常、等張の水性緩衝液における溶液である。必要に応じて組成物は可溶化剤及び局所麻酔剤を含んで注射の部位で痛みを軽くし得る。一般に、成分は別々に供給される、又は、たとえば、活性剤の量を示すアンプル若しくはサシェのような密封した容器にて凍結乾燥粉末若しくは水を含まない濃縮物として、単位剤形にて一緒に混合される。組成物が点滴で投与されるべきである場合、無菌の医薬等級の水、生理食塩水又はデキストロース／水を含有する点滴ビンでそれを調剤することができる。組成物が注射で投与される場合、投与に先立って成分が混合され得るように無菌の注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。

本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な量」は、本発明の医薬組成物に含有される治療剤の総量に基づいて主に決定される。一般に、治療上有効な量は、対象にとって意味のある利益（たとえば、根底にある疾患又は状態を治療すること、調節すること、治癒すること、予防すること及び／又は改善すること）を達成するのに十分である。たとえば、治療上有効な量は、所望の治療効果及び／又は予防効果を達成するのに十分な量、たとえば、リソソーム酵素受容体又はその活性を調節し、それによってリソソーム蓄積症又はその症状を治療する（たとえば、本発明の組成物の対象への投与に続く、「ゼブラ小体」又は細胞の空胞変性の存在又は発生の軽減又は排除）のに十分な量であり得る。一般に、それを必要とする対象に投与される治療剤（たとえば、組換えリソソーム酵素）の量は対象の特徴に左右されるであろう。そのような特徴には、対象の状態、疾患の重症度、全身状態、年齢、性別及び体重が挙げられる。当業者は、それら及び関連する因子に応じて適当な投与量を容易に決定することができるであろう。加えて、客観的なアッセイ及び主観的なアッセイの双方を任意で採用して最適な投与量範囲を特定し得る。

治療上有効な量は一般に複数の単位用量を含む投与計画にて投与される。特定の治療用のタンパク質については、治療上有効な量（及び／又は有効な投与計画の範囲内での適当な単位用量）は、たとえば、投与経路、他の医薬剤との併用に応じて変化し得る。また、特定の患者のための具体的な治療上有効な量（及び／又は単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度、採用される具体的な医薬剤の活性、採用される具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食事、投与の時間、投与の経路及び／又は採用される具体的な融合タンパク質の排泄若しくは代謝の速度、治療の持続時間、及び医療技術で周知のような類似の因子を含む種々の因子に左右され得る。

追加の例となる医薬組成物及び投与方法は、双方の開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年３月３０日に出願された「イズロン酸−２−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法及び組成物」と題されるＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１６３６４９及び「イズロン酸−２−スルファターゼの皮下投与」と題される仮特許出願番号６１／６１８，６３８にて記載されている。

特定の対象については、具体的な投与計画は、個々の必要性及び酵素補充療法を投与する又はその投与を監督する人の専門的な判断に従って時間をかけて調整されるべきであり、本明細書で述べられる投与量範囲は単に例となるだけであって、請求される本発明の実践の範囲を限定するようには意図されないことがさらに理解されるべきである。

実施例１：組換えＩ２Ｓ ＡＦの捕獲および精製プロセス
当該実施例は、無血清培地に製造される組換えＩ２Ｓを捕獲し精製するために単純化した下流精製プロセスを使用してよいことを説明する。例示的な精製スキームを図１に記述する。

イズロン酸２スルファターゼ酵素（Ｉ２Ｓ）およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を安定的に発現する細胞株を開発した。例示的な細胞株の発生および特徴付けについては、米国特許仮出願「ヒトイズロン酸２スルファターゼを製造するための細胞」（提出日は当該明細書に記載）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。端的に、配列番号２に示されるアミノ酸配列および配列番号５に示されるヒトホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）で、ヒトＩ２Ｓタンパク質を共発現するように、ヒト細胞株を操作した。
配列番号２
完全長前駆体イズロン酸２スルファターゼ：
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP

配列番号５
完全長ヒトＦＧＥ前駆体：
MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD

完全長Ｉ２Ｓ酵素を合成した後、２５アミノ酸シグナルペプチドを取り除き、可溶性の成熟したＩ２Ｓ酵素が細胞から分泌された。

既知組成培地（無血清／動物性成分なし；ＡＦ）をバイオリアクタープロセスに使用した。

個別の回収物質の容量を減少させ、限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセスによって緩衝液を交換した。未精製バルク（ＵＰＢ）と呼ばれる物質を個々の回収物あたり、-５０℃に凍結した。下流の精製プロセスを、未精製バルクの溶解およびプールから開始し、連続するウイルス不活性化、アニオン交換（Ｃａｐｔｏ Ｑ）、混合モード（セラミックスヒドロキシアパタイト）、カチオン交換（ＳＰセファロース）および疎水性相互作用（フェニルセファロース）クロマトグラフィーのステップを行い、次にウイルス濾過、並びに、最終濃度およびダイアフィルトレーションのステップを行った。特に、当該精製プロセスは、Ｑ、ヒドロキシアパタイト、ＳＰおよびフェニルクロマトグラフィー様式を使用した。Ｉ２Ｓ精製プロセスに伝統的に使用されるタンパク質Ｇクロマトグラフィーおよび粒径排除クロマトグラフィーは、削除した。例示的なステップを表３に示す。

精製されたＩ２Ｓタンパク質の純度について、ペプチドマッピング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（銀）、粒径排除ＨＰＬＣによって評価した。酵素特異的活性、ホルミルグリシン量、シアル酸量、グリカンマップ、電荷特性を標準的な方法を用いて決定した。例示的な結果を表４に示す。

市販のＩ２Ｓ参照と比較したときの例示的なペプチドマップを図２に示す。例示的なＳＤＳ-ＰＡＧＥ（銀）分析の結果を図３に示す。典型的に、本明細書に記載のプロセスを使用して、薬物物質のＨＣＰ濃度（ＤＳ）は＜１００ｐｐｍであり、米国を含む多くの市場で要求されている＜ｌ００ｐｐｍ規格を満たしている。ＤＳのＳＥＣは≧９９．５％であり、これも多くの市場で要求されている現状の＞９９．３％を満たしている。例示的な電荷特性を図４に示す。例示的なグリカンマップを図５に示す。特に、精製されたＩ２Ｓのグリカンマップは７つのピーク群を含み、シアル酸およびマンノース６リン酸残基から生じる負電荷の増加量に従い溶離し、順に、溶離、中性、モノ、ジシアリル化、モノホスホリル化、トリシアリル化、およびハイブリッド（モノシアリル化およびキャップされたＭ６Ｐ）、テトラシアリル化、およびハイブリッド（ジシアリル化およびキャップされたＭ６Ｐ）並びにジホスホリル化グリカンを表した。

まとめると、当該実施例は、単純化された４つのカラム精製プロセスを使用して、大規模に、無動物性培地に精製されたＩ２Ｓの精製を成功させることができることを説明する。

実施例２：組換えＩ２Ｓ ＡＦの回収およびウイルス不活性化の安定化試験
当該実施権の目的は、浄化した回収物の組換えＩ２Ｓの安定性に与える温度保持時間および凍結-溶解周期の影響を評価する。

浄化した回収試料を雰囲気および２〜８℃で、最大７日間保管し、ウイルス不活性化ＵＰＢ試料を雰囲気で、最大２４時間保管した。浄化した回収物の凍結-溶解試料を-２０℃、-５０℃、および-８０℃に凍結し、最大３周期の凍結-溶解を行った。ウエスタンブロット、ＳＥＣ ＨＰＬＣおよび活性アッセイを用いて、安定性を測定した。

遠心分離保持装置を備えたＢ．Ｂｒａｕｎ２０Ｌのバイオリアクターを使用して、望ましい流出速度で、ＣＣＰＤによる２Ｄ細胞株から、Ｉ２Ｓ-ＡＦ回収物質を製造した。温度保持試験について、それぞれ浄化した回収物を雰囲気および２〜８℃で保管し、選択した保持時間で回収した。サンプリングの量および保持時間を表５に挙げる。凍結-溶解試料を-２０℃、-５０℃、および-８０℃で保管し、水浴を用いて、２５℃で溶解した。

最初のカラムに負荷する前に、ウイルスの不活性化のステップを未精製バルクのステップで起こした。濃縮し、浄化した回収物の緩衝液の交換によって、ＵＰＢを製造した。Ｐａｌｌ １ ｓｑ．ｆｔを使用してＵＦ／ＤＦを実施した。Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ系および緩衝液を１０ｍＭのＭＥＳ、１５５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝６．５に交換した。ウイルスの不活性化のステップは、１％のＴｗｅｅｎ ８０および０．３％のＴｎＢＰを加え、各時点でＤｕｒａｐｏｒシリンジフィルターを使用して濾過した。表６に挙げる各時点で試料を取り出し、-８０℃で凍結した。ウエスタンブロットおよび活性（４-ＭＵＦアッセイ）によって、浄化した回収物の保持ポイントからの試料および凍結-溶解試験をおこなった。ウイルスの不活性化からのＵＰＢ試料の純度についてＳＥＣ ＨＰＬＣによって試験した。表５の回収物１２および１８から保持ポイントの活性の結果は、両方の回収物について、雰囲気および２〜８℃での最大７日間の保管に著しい変化を示さなかった。-２０℃、-５０℃、および-８０℃で保管された最大３回の凍結-溶解周期の間に、回収物１２の活性に著しい変化は示されなかった。

ウイルス不活性化ＵＰＢステップの安定性についての活性およびＳＥＣ-ＨＰＬＣを図６および７に記載する。活性および最大２４時間の純度に基づくウイルス不活性化の安定性に、問題がなかったことを示す。

まとめると、本明細書に記載の安定性分析に基づき、浄化された回収物は、２〜８℃で（例えば、最大７日間）、回収物の品質に著しい変化を示すことなく、保管することができる。浄化された回収物に、複数回の凍結−溶解周期を行うことができ、安定性に著しい変化を示すことなく、-２０℃、-５０℃、および-８０℃で保管することができる。ＳＥＣ ＨＰＬＣ純度の結果に基づき、活性および純度に何の変化もなく、雰囲気温度（例えば、最大２４時間）でＵＰＢステップでのウイルス不活性化を行うことができる。

実施例３：無動物性ＩＬ ＣＤ培地の確認作動の精製および分析

当該試験の目的は、既知組成培地を使用して無動物灌流で製造されたＩ２Ｓ-ＡＦのプールされた回収物から精製すること、および薬物物質を特徴付けることである。

当該試験は、Ｉ２Ｓ-ＡＦ精製プロセスの性能および既知組成培地のバイオリアクターから製造された薬物物質（ＤＳ）を評価した。

細胞培地
実施例１に記載のＩ２Ｓおよびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現する細胞株２ＤからＩ２Ｓ-ＡＦ物質を製造した。既知の無血清培地を使用して１ＬのＤａｓ ＧｉｐスピンフィルターバイオリアクターでＣＣＰＤに、物質を製造した。浄化された回収物（ＨＩ-２１）のそれぞれからの個別のバッグを受け取り、-２０℃で凍結し、２〜８℃で一晩溶解した。浄化された回収物のそれぞれの等量をプールし、全体の回収プールを表し、その後、０．２μｍフィルターにかけ、全膜領域が１ｆｔ^２の３０ ｋＤ Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを使用して濃縮した。使用前に、未精製バルク（ＵＰＢ）を０．２μｍフィルターにかけ、凍結した。

精製
例示的なカラムの規格および負荷を表７に記述する。Ｑセファロースを３ｇ／Ｌの標的で、力価によって負荷した。次のカラムを前のカラム溶離物から１００％で負荷し、物質を取り除かなかった。

バイオリアクターから、プールしている回収物１〜２１からのＵＰＢを使用して、１回の精製を行った。ＵＰＢを２〜８℃で一晩溶解し、各回収物から等量でプールした。

個々のカラムのプロセスステップおよび緩衝液の配合について表８〜１１に認めることができる。ＱセファロースＦＦカラムに負荷する前に、プールされたＵＰＢを、０．２ｕｍのボトルフィルター系を使用して濾過し、１Ｍの酢酸ナトリウムを使用してｐＨを６．５に調整し、５Ｍの塩化ナトリウムで伝導率を１６ｍＳ／ｃｍに調整した。ＨＡカラムに負荷する前に、Ｑセファロース溶離を、０．２５ＭのＮａＰ０_４を使用して０．００１ＭのＮａＰ０_４に調整し、ｐＨ５．５、および０．２２ｕｍのＰＥＳボトルトップフィルターでフィルターをかけた。ＨＡ溶離伝導率を５ＭのＮａＣｌで１．５５ＭのＮａＣｌに調整し、１Ｍの酢酸ナトリウムでｐＨを５．５に調整した。調整時間は約１時間であった。フェニルセファロースカラムに負荷する前に、調整されたプールを、０．２２ｕｍのＰＥＳボトルトップフィルターを使用してフィルターをかけた。フェニル溶離物を４倍に濃縮し、０．０２ＭのＮａＰ０_４、０．１３７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に６回ダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした産生物を２．０ｇ／Ｌに調整し、０．２％のポリソルベート２０で処方し、模擬の薬物物質が発生した。ＤＳのＨ１-２０の模擬プールを追加で特徴付けるために作製した。

ＥＬＩＳＡによるＨＣＬＰによるインプロセス精製
表１２は各ステップについてインプロセスＨＯＰ除去を記述する。インプロセスＨＣＬＰの結果は、ＨＡステップで大部分の除去が高かった。

薬物物質の特徴付け
例示的な薬物物質のロットの放出の結果を表１３に挙げる。見るとわかるように、薬物物質は精製された物質の中で高い特異的活性および％ＦＧを有した。例示的な薬物物質の属性の特徴付けを表１３に示す。ＨＣＰは最終のＵＦ／ＤＦステップで１，８７０ｎｇ／ｍｇから３７２ｎｇ／ｍｇに減少した。

実施例４：精製された組換えＩ２Ｓ酵素の生理化学的および生物学的特徴付け
実施例の目的は、上述の方法を使用して精製された組換えＩ２Ｓタンパク質の詳細な特徴付けをすることである。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実験のために、２つの別個の無血清培養培地反応液に、２Ｄおよび４Ｄヒト細胞株を用いて組換えＩ２Ｓタンパク質を発生させた。試料を回収し、上述の方法を用いて精製した。精製されたＩ２Ｓ酵素を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析し、視覚化のために銀染色した。例示的な結果を図８に示す。図８に示されるように、本明細書に記載の方法を使用して精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、標準的な方法を使用して精製されたＩ２Ｓ標準試料と比較して、比較可能な横縞模様を示した。

ペプチドマップ
Ｉ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄ細胞株から製造された組換えＩ２Ｓタンパク質を上述の方法で精製した。精製された組換えＩ２Ｓおよび参照のヒトＩ２Ｓの試料を、それぞれ、タンパク質分解消化に供し、ＨＰＬＣ分析によって検査した。参照Ｉ２Ｓのペプチドマップと比較したときの例示的なペプチドマップを図９に示す。

ホルミルグリシンの転換率
ペプチドマッピングを使用して、ＦＧｌｙ転換率を決定した。Ｉ２Ｓ活性は、以下に示されるように、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によってホルミルグリシン転換するために、システイン（成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）を必要とする。

したがって、ホルミルグリシン転換率（％ＦＧ）を以下の公式を使用して計算することができる。

例えば、５０％のＦＧは、精製された組換えＩ２Ｓの半分は、任意の治療効果のない酵素的に不活性であることを意味する。

ペプチドマッピングを使用して％ＦＧを計算した。端的には、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、タンパク分解酵素（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を使用して、短いペプチドに消化された。短いペプチドを分離し、ＨＰＬＣを使用して特徴付けした。成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチドが、対照（例えば、ＦＧｌｙ転換のないＩ２Ｓタンパク質または１００％ＦＧｌｙ転換したＩ２Ｓタンパク質）と比較して、５９位のＣｙｓがＦＧｌｙに転換されるかどうかを特徴付けした。ＦＧｌｙを含むペプチドの量（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）、およびＦＧｌｙとＣｙｓの両方を有するペプチドの全量を、対応するピーク領域に基づいて特定してもよく、％ＦＧを反映する比を計算した。例示的な結果を表１４に示す。

グリカンマップ−マンノース６リン酸およびシアル酸量
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質のグリカンおよびシアル酸組成物を決定した。アニオン交換クロマトグラフィーを使用してグリカン組成物の定量化を行い、グリカンマップを作製した。以下に記載するように、本明細書に記載の条件で精製される組換えＩ２Ｓのグリカンマップは、７つのピーク群から構成され、負電荷の増加量に従って溶離し、少なくとも部分的に、酵素消化物から生じるシアル酸およびマンノース-６-リン酸グリコフォームに由来する。端的には、無血清細胞培養（Ｉ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄ無血清およびＩ２Ｓ-ＡＦ ４Ｄ無血清）から精製された組換えＩ２Ｓおよび参照の組換えＩ２Ｓを、（１）シアル酸残基を取り除くための精製されたノイラミニダーゼ酵素（アルスロバクター・ウレアファシエンス（１０ｍＵ／μＬ）、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（インディアナポリス、インディアナ州）、カタログ番号２６９ ６１１（１Ｕ／１００μＬ））、（２）マンノース-６-リン酸残基を完全に放出するためのアルカリホスファターゼを、３７±１℃で２時間、（３）アルカリホスファターゼ＋ノイラミニダーゼ、または（４）処理なし、のいずれかで処理した。各酵素消化物を、Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎを備えたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎを使用して、Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＨＰＡＥ-ＰＡＤ）によって分析した。０．４〜２．０ナノモルの範囲のシアル酸およびマンノース-６-リン酸標準を、各アッセイについて実施した。１００ｍＭの水酸化ナトリウム中の４８ｍＭの酢酸ナトリウムを使用して、定組成法を、雰囲気カラム温度、流速１．０ｍＬ／分で最小１５分間実施し、各ピークを溶離した。Ｉ２Ｓ-ＡＦとＩ２Ｓ標準試料の両方について、個別の実施から生成されたデータを、単一のクロマトグラフにそれぞれまとめ、各個別の組換えタンパク質についてグリカンマップを表した。図１０に示されるように、無血清培地から精製されるＩ２Ｓのグリカンマップは、代表的な溶離ピーク（溶離の順序で）を表し、中性、モノ、ジシアリル化、モノホスホリル化、トリシアリル化、およびハイブリッド（モノシアリル化およびキャップされたマンノース-６-リン酸）、テトラシアリル化、およびハイブリッド（ジシアリル化およびキャップされたマンノース-６-リン酸）並びにジホスホリル化グリカンを構成した。例示的なグリカンマップを図１０に示す。

各組換えＩ２Ｓ試料の平均的なシアル酸量（モルタンパク質あたりのモルシアル酸）を、シアル酸標準の線形回帰分析から計算した。ＰｅａｋＮｅｔ６ソフトウェアを使用して、各クロマトグラムの実施を視覚化した。組換えＩ２Ｓアッセイ対照および試験試料から放出されたシアル酸標準およびシアル酸は、単一のピークとして現れる。Ｉ２Ｓについてシアル酸の量（ナノモル）を、以下の公式を使用して生値として計算した。

ここで、Ｃは試料または組換えＩ２Ｓアッセイ対照のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）である。
各試験試料について、タンパク質のモルあたりシアル酸のモルとしてシアル酸の補正値を以下の公式を使用して計算した。

Ｉ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄまたは４Ｄ細胞株から精製される組換えＩ２Ｓ上のシアル酸量を指示する例示的なデータを表１４に示す。

特異的活性
本明細書に記載の方法を使用して精製された組換えＩ２Ｓ酵素の特異的活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出アッセイまたは４-ＭＵＦアッセイを使用して分析した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩アッセイ
ヘパリン二糖類を基質として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸塩アッセイを実施した。特に、このアッセイでは、天然由来の基質であるヘパリン二糖類から硫酸イオンを放出するＩ２Ｓの能力を測定する。電気伝導度検出器を備えたイオンクロマトグラフィーによって、放出される硫酸塩を定量化してもよい。端的には、最初に試料をｐＨ６、１０ｍＭのＮａ酢酸塩に緩衝液交換し、緩衝液処方物中のリン酸塩イオンによる阻害を取り除いた。その後、試料を反応緩衝液（１０ｍＭのＮａ酢酸塩、ｐＨ４．４）で、０．０７５ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０μＬの反応容量中、基質比が０．３μgのＩ２Ｓ／１００μgの酵素の基質ヘパリン二糖類で、３７℃で２時間インキュベートした。試料を１００℃で３分間加熱することによって、反応を停止した。ＩｏｎＰａｃ ＡＧ１８ガードカラムを備えたＤｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１８分析カラムを使用して分析を行った。１．０ｍＬ／分で１５分間、３０ｎＭの水酸化カリウムで定組成法を使用した。Ｉ２Ｓ試料によって放出される硫酸塩の量を、１．７〜１６．０ナノモルの範囲の硫酸塩標準の線形回帰分析から計算した。報告できる値をｍｇあたりの単位のタンパク質として表し、１単位は一時間あたりに放出される硫酸塩の１マイクロモルとして定め、タンパク質濃度をＡ２８０測定法によって決定した。例示的な結果を表１４に表す。

４−ＭＵＦアッセイ
精製された組換えＩ２Ｓ酵素の特異的活性についても、蛍光に基づく４−ＭＵＦアッセイを使用して分析してもよい。端的には、アッセイはＩ２Ｓ基質の４−メチルウンベリフェリル-硫酸塩（４−ＭＵＦ−ＳＯ_４）の加水分解を測定する。Ｉ２Ｓによって４−ＭＵＦ−ＳＯ_４基質を切断したとき、分子が硫酸塩および自然に蛍光を発する４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＦ）に転換される。結果として、経時的な蛍光シグナルの全体的な変化を評価することによってＩ２Ｓ酵素活性を決定することができる。当該実験について、Ｉ２Ｓ-ＡＦ ２Ｄおよび４Ｄヒト細胞株から製造された精製されたＩ２Ｓ酵素を、４−メチルウンベリフェリル-硫酸（４−ＭＵＦ−ＳＯ_４）、カリウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ-７１３３）の溶液でインキュベートした。一連の対照の標準試料を使用し、保存液の１：１００、１：２００および１：２０，０００で希釈された市販のＩ２Ｓ酵素を使用して、アッセイの較正を行った。３７℃で酵素アッセイを実施し、較正した蛍光光度計を使用して分析した。各標準試料について、得られる蛍光値を使用して、以下の等式を使用して、変動係数率を決定した。

その後、報告可能な酵素活性を決定するために、率ＣＶ値を使用して、各試料の補正した平均蛍光を計算し、以下の公式を使用してｍＵ／ｍＬで表した。

ＣＦＵ＝負に補正された平均蛍光
ＤＦ＝希釈係数

活性の１ミリ単位は、３７℃、１分で、４−メチルウンベリフェリル-硫酸の１ナノモルを４−メチルウンベリフェロンに転換するのに必要とされる酵素の量である。

電荷特性
この実験では、それぞれ精製された組換えＩ２Ｓの電荷分布を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を有する強アニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーによって決定した。この方法は、表面電荷差に基づいて、試料内の組換えＩ２Ｓ変異体を分離する。ｐＨが８．００では、負電荷した種が、ＳＡＸカラムの固定された正電荷上で吸収される。増加しているイオン強度の勾配を使用してカラムとのイオン相互作用の強度に比例して、各タンパク質の種を溶離する。無血清成長条件下の２Ｄ細胞株または参照の組換えＩ２Ｓ酵素から単離された１００マイクログラムの精製されたＩ２Ｓを、雰囲気温度で保持されたＡｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＭｉｎｉ Ｑ ＰＥ（４．６ｘ５０ｍｍ）カラムに負荷し、２０ｍＭのトリス-ＨＣ１、ｐＨ８．００に平衡した。２０ｍＭのトリス-ＨＣ１、１．０Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．００の移動相を使用して、流速０．８０ｍＬ／分で勾配溶離を行った。２８０ｎｍの波長で試料の溶離の吸光度を測定することによって、実施中にタンパク質濃度を連続して決定した。２Ｄおよび４Ｄ細胞株から精製される組み換えＩ２Ｓに観察される電荷特製の例示的な結果を図１１に示す。

Claims (1)

1. 組成物、製剤、または方法。