CN116670270A - 控制碱性磷酸酶制造期间的总唾液酸含量(tsac)的方法 - Google Patents

控制碱性磷酸酶制造期间的总唾液酸含量(tsac)的方法 Download PDF

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Abstract

特征在于制造重组碱性磷酸酶，诸如阿斯福酶α的方法，这些方法通过在发酵期间测量总唾液酸含量(TSAC)浓度并相应地调整下游生产步骤来提供对于TSAC浓度的更精确的质量控制。

Description

控制碱性磷酸酶制造期间的总唾液酸含量(TSAC)的方法
相关申请的交叉引用
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本申请含有按ASCII格式以电子方式递交并特此通过援引以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年10月19日，命名为0608WO_SL.txt，并且大小为15,286字节。
背景技术
低磷酸酯酶症(HPP)是一种危及生命的遗传性和超罕见的代谢障碍，其导致无法产生功能性组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)。它导致未矿化骨基质的积累(例如，佝偻病、骨软化症)，其特征在于骨骼和牙齿的低矿化。当生长的骨骼不能适当矿化时，生长障碍会使关节和骨骼的外形损毁。这个结果进而会影响运动性能、呼吸功能，并且甚至可能导致死亡。HPP包括围产期、婴儿期、青少年(或儿童期)和成人HPP。在历史上，定义了六种临床形式，大多数是基于症状发作时的年龄，包括围产期、良性产前、婴儿期、青少年、成人和牙HPP。
阿斯福酶α(亚力兄制药公司(Alexion Pharmaceuticals，Inc.))是一种经过批准的同类首创的靶向酶替代疗法，其被设计来解决有缺陷的内源性TNSALP水平。阿斯福酶α是一种可溶性融合糖蛋白，包含人TNSALP的催化结构域、人免疫球蛋白G1 Fc结构域和用作骨靶向结构域的德卡-天冬氨酸肽(例如，D10)(SEQ ID NO:2)。在体外，与缺乏德卡-天冬氨酸肽的可溶性TNSALP相比，阿斯福酶α以更大的亲和力与羟基磷灰石结合，从而允许阿斯福酶α的TNSALP部分有效地降解过量的局部无机焦磷酸盐(PPi)并恢复骨骼的正常矿化。焦磷酸盐水解促进骨骼矿化，并且其效果在非临床研究中评价的物种中相似。
阿斯福酶α是一种真核蛋白，其含有翻译后修饰，例如糖基化(例如，唾液酸化)。商业规模量的治疗有效碱性磷酸酶(诸如阿斯福酶α)的生产涉及多步骤制造工艺，其条件可能显著影响最终产物。在此工艺中，翻译后修饰的产物可能在制造工艺的一个或多个步骤期间暴露于糖苷酶或其他水解条件，从而对翻译后修饰产生负面影响。例如，添加的唾液酸部分可能丢失。这些变化可能降低大量批次产物的半衰期和酶促活性。因此，需要改进的制造碱性磷酸酶的方法，以改进最终蛋白质产物及其糖基化特征的质量控制。
发明内容
本文披露了可以用于改进碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的生产中糖基化的质量控制的制造工艺。这些方法还可以用于维持、保护、调节和/或改善酶促活性，并且特别地维持、控制和/或提高通过培养的哺乳动物细胞，特别地通过培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的重组蛋白，诸如碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的半衰期。此类碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)适用于在疗法中使用，例如用于治疗受试者，例如人受试者的与降低的碱性磷酸酶蛋白水平(例如，HPP)和/或功能(例如，无机焦磷酸盐(PPi)的裂解不足等)相关联的病症。
在一方面，特征在于一种产生重组碱性磷酸酶的方法。该方法包括以下步骤：用表达重组碱性磷酸酶的细胞(例如，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)接种生物反应器；获得包含该重组碱性磷酸酶的水性培养基；在接种之后约第6天至约第10天，特别地约第6天至约第8天(例如，约第6天、约第7天、约第8天、约第9天、约第10天，例如约第7天)从该水性培养基中获得等分试样；定量该等分试样中每摩尔该重组碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)摩尔浓度；收获该水性培养基；以及进行过滤步骤(例如，超滤、渗滤或其组合)；最终获得原料药(BDS)。该方法可以进一步包括在过滤步骤与获得该BDS之间的额外下游纯化步骤(图1)。
来自该发酵阶段的该培养基的等分试样用于确定保持过滤池期间的时间量。例如，如果该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持小于约9小时。如果该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约10小时至约14小时。如果该等分试样具有约2.8mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约23小时至约27小时。如果该等分试样具有大于约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约38小时至约42小时。
在一个实施例中，如果该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约7+/-2小时或更少时间(例如，在约5-9小时之间)。如果该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约18+/-2小时或更少时间(例如，在约16-20小时之间)。如果该等分试样具有大于约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约32+/-2小时或更少时间(例如，在约30-34小时之间)。
在另一个实施例中，如果该等分试样具有小于或等于约2.3mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约18+/-4小时或更少时间(例如，在约14-22小时之间)。如果该等分试样具有大于约2.3mol/mol至约3.1mol/mol(例如，约2.4mol/mol至约3.1mol/mol)的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约32+/-4小时或更少时间(例如，在约28-36小时之间)。如果该等分试样具有大于约3.1mol/mol(例如，大于或等于约3.2mol/mol)的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约44+/-4小时或更少时间(例如，在约40-48小时之间)。
在另一个实施例中，如果该等分试样具有小于约2.4mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约17+/-3小时或更少时间(例如，在约14-20小时之间)。如果该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约31+/-3小时或更少时间(例如，在约28-34小时之间)。如果该等分试样具有大于约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约45+/-3小时(例如，在约42-48小时之间)。过滤步骤期间的碱性磷酸酶浓度可以是约3.7+/-0.4g/L。
过滤步骤期间的碱性磷酸酶浓度可以是约1.8g/L至约5.0g/L(例如，约1.8至约4.3g/L，例如约2.3g/L、约3.1g/L、约3.7g/L)。该BDS的TSAC浓度可以是约1.2mol/mol至约3.0mol/mol(例如，约1.6mol/mol至约2.4mol/mol)。
过滤步骤可以保持在恒定温度下，其中该恒定温度是定义范围之间的任何温度。例如，该温度可以保持在约15℃至约25℃(例如，约19℃至约25℃，例如约22℃)下。
该等分试样可以从该生物反应器中以无菌方式获得，以防止污染。该等分试样可以是约1mL至约1000mL(例如，约25mL至约500mL，例如约50mL至约300mL，例如约100mL或约200mL)。
获得该等分试样可以进一步包括对该等分试样进行离心，以及任选地从该等分试样中取出上清液。此步骤还可以包括使用色谱柱(例如，蛋白A柱，例如1mL HiTrap ProteinA柱；600μl Protein A Robocolumn；或MabSelect Sure Protein A固相柱)从该上清液中纯化碱性磷酸酶。在一些实施例中，该碱性磷酸酶可以经受缓冲液交换。该碱性磷酸酶还可以例如在确定TSAC分析之前进行浓缩。该TSAC分析，包括定量TSAC浓度，可以包括进行酸水解以释放TSAC。
在纯化该碱性磷酸酶后，该碱性磷酸酶可以冻干和/或置于小瓶中。
该生物反应器可以具有任何合适的尺寸，例如，用于碱性磷酸酶的商业规模生产。例如，该生物反应器可以具有至少2L、至少10L、至少1,000L、至少10,000L或至少20,000L的体积。该体积可以是约10,000L或约20,000L。
可以使用任何合适的培养基，诸如无血清培养基。一些合适的实例包括例如302无血清培养基；CD DG44培养基；BD SELECTTM培养基；SFM4CHO培养基；及其组合。
该碱性磷酸酶可以包含W-sALP-X-Fc-Y-Dn-Z的结构，其中：
W不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
X不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
Y不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
Z不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
Fc是片段可结晶区；
Dn是聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合，其中n＝10或16；并且
sALP是可溶性碱性磷酸酶。
在一些实施例中，该重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO:1中列出的序列具有至少90％(例如，至少95％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。例如，该重组碱性磷酸酶可以包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或由其组成。
定义
如本文所用，术语“约”和“大约”，在应用于一个或多个特定细胞培养条件或数值时，是指为主体值的+/-10％的值范围。
如本文所用，术语“氨基酸”是指通常用于形成多肽的二十种天然存在的氨基酸中的任一种或这些氨基酸的类似物或衍生物。本披露的氨基酸可以在培养基中提供给细胞培养物。培养基中提供的氨基酸可以作为盐或呈水合物形式提供。
如本文所用，术语“分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养工艺开始时提供最终将在培养细胞中使用的所有组分，包括培养基(参见下文“培养基”的定义)以及细胞本身。分批培养典型地在某个时间点停止，并且收获培养基中的细胞和/或组分并任选地进行纯化。在一些实施例中，在此所述的方法用于分批培养。
如本文所用，术语“生物反应器”是指用于细胞培养物(例如，哺乳动物细胞培养物)生长的任何容器。生物反应器可以具有任何尺寸，只要它对于细胞培养有用即可。典型地，生物反应器是至少1升，并且可以是10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000、20,000、22,000、25,000、30,000升或更大，或介于之间的任何体积。在一些实施例中，生物反应器是100升至30,000升、500升至22,000升、1,000升至22,000升、2,000升至22,000升、5,000升至22,000升或10,000升至22,000升。生物反应器的最大工作体积可以变化约1％至5％，例如，可以高达约22,250升或33,000升。生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度，典型地在培养期间进行控制。生物反应器可以由适于在本披露的培养条件下容纳悬浮在培养基中的哺乳动物细胞或其他细胞培养物的任何材料构成，包括玻璃、塑料或金属。如本文所用，术语“生产生物反应器”是指用于生产感兴趣的多肽或蛋白质的最终生物反应器。大规模细胞培养生产生物反应器的体积典型地是至少500升，并且可以是1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000、20,000升或更大，或介于之间的任何体积。本领域的普通技术人员将意识到并将能够选择合适的生物反应器用于实践本披露。
如本文所用，术语“细胞密度”是指存在于给定体积的培养基中的细胞数量。
如本文所用，术语“细胞活力”是指培养物中的细胞在一组给定的培养条件或实验变化下存活的能力。如本文所用，该术语还是指在特定时间存活的细胞部分相对于当时培养物中活细胞和死细胞的总数。
如本文所用，术语“培养物”和“细胞培养物”是指在适合细胞群体存活和/或生长的条件下悬浮在培养基(参见下文“培养基”的定义)中的细胞群体。如本领域的普通技术人员将清楚的那样，如本文所用的这些术语可以是指包含细胞群体和该群体所悬浮于的培养基的组合。
如本文所用，术语“补料分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养工艺开始后的某个时间向培养物提供额外的组分。所提供的组分典型地包括细胞的营养补充剂，这些营养补充剂在培养工艺期间被耗尽。补料分批培养典型地在某个时间点停止，并且收获培养基中的细胞和/或组分并任选地进行纯化。补料分批培养可以在相应的补料分批生物反应器中进行。在一些实施例中，该方法包括补料分批培养。
如本文所用，术语“片段”是指一种多肽，并且被定义为给定多肽的任何离散部分，该离散部分是该多肽所独有或特有的。如本文所用，该术语还是指给定多肽的任何离散部分，该离散部分保留全长多肽的活性的至少一部分。在一些实施例中，所保留的活性的部分是全长多肽的活性的至少10％。在各种实施例中，所保留的活性的部分是全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在其他实施例中，所保留的活性的部分是全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，所保留的活性的部分是全长多肽的活性的100％。如本文所用，该术语还是指给定多肽的任何部分，该部分至少包含全长多肽中存在的已建立的序列元件。在一些实施例中，该序列元件跨越全长多肽的至少4-5个氨基酸。在一些实施例中，该序列元件跨越全长多肽的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。
如本文所用，术语“糖蛋白(glycoprotein)”或“糖蛋白(glycoproteins)”是指具有碳水化合物基团(诸如唾液酸)附接至多肽链的蛋白质或多肽。
如本文所用，术语“培养基(medium)”、“培养基(media)”、“细胞培养基(cellculture medium)”和“培养基(culture medium)”是指含有滋养生长中的哺乳动物细胞的营养物质的溶液。典型地，这些溶液提供细胞最小生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。该溶液还可以含有在最低速率以上增强生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。该溶液可以例如被配制成对于细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。在一些实施例中，培养基可以是“限定培养基”-不含蛋白质、水解物或未知组成组分的无血清培养基。限定培养基不含动物衍生的组分，并且所有组分都具有已知的化学结构。在一些实施例中，培养基是基础培养基，例如，含有碳源、水、盐、氨基酸和氮源(例如，动物，例如，牛肉或酵母提取物)的非限定培养基。各种培养基是可商购获得的并且是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，培养基选自302无血清培养基(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)、CD DG44培养基(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、BD选择培养基(BD科技公司(BDBiosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)或其混合物或BD选择培养基与SFM4CHO培养基(HYCLONETM，洛根，犹他州)的混合物。在一些实施例中，培养基包括SFM4CHO培养基和BDSELECTTM培养基的组合。在一些实施例中，培养基包括SFM4CHO培养基和BD SELECTTM培养基的组合，其比率选自90/10、80/20、75/25、70/30、60/40或50/50，包括之间的任何中间比率。在一些实施例中，培养基包括SFM4CHO培养基和BD SELECTTM培养基的组合，其比率为70/30至90/10。在一些实施例中，培养基包括SFM4CHO培养基和BD SELECTTM培养基的组合，其比率为75/25。/>302无血清培养基含有0.1％/>F68、3.42g/L葡萄糖、7.5mMHEPES和1.6g/L碳酸氢钠。BD SELECTTM培养基含有人重组胰岛素、次黄嘌呤、胸苷和低内毒素(≤5.0EU/mL)，pH为7.1+/-0.2。CD DG44培养基是一种化学限定的无蛋白、无水解物培养基，其含有次黄嘌呤和胸苷以及L-谷氨酰胺，没有/>F-68。在一些实施例中，碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)是通过向生产生物反应器中添加额外大剂量的培养基的工艺产生的。例如，可以添加一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个大剂量的培养基。在一个特别实施例中，添加三个大剂量的培养基。在各种实施例中，以各种量添加此类额外大剂量的培养基。例如，此类大剂量的培养基可以生产生物反应器中培养基的原始体积的约20％、25％、30％、33％、40％、45％、50％、60％、67％、70％、75％、80％、90％、100％、110％、120％、125％、130％、133％、140％、150％、160％、167％、170％、175％、180％、190％、200％或更多的量添加。在一个特别实施例中，此类大剂量的培养基可以原始体积的约33％、67％、100％或133％的量添加。在各种实施例中，此类额外大剂量的添加可以在细胞生长或蛋白质生产期间的不同时间发生。例如，大剂量可以在工艺的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或更晚时间添加。在一个特别实施例中，此类大剂量的培养基可以每隔一天添加(例如，在(1)第3天、第5天和第7天；(2)第4天、第6天和第8天；或(3)第5天、第7天和第9天)。在实践中，培养基的大剂量补充剂的频率、量、时间点和其他参数可以根据以上限制自由组合，并且通过实验实践确定。
如本文所用，术语“渗透度(Osmolality)”和“渗量(osmolarity)”是指水溶液中溶解溶质颗粒的渗透压的量度。溶质颗粒包括离子和非电离分子。渗透度表示为溶解在1kg溶液中的渗透活性颗粒的浓度(例如，渗克分子量)(38℃下的1mOsm/kg H2O相当于19mm Hg的渗透压)。相比之下，“渗量”是指溶解在1升溶液中的溶质颗粒的数量。当在本文中使用时，缩写“mOsm”意指“毫渗克分子量/kg溶液”。
如本文所用，术语“灌注培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养工艺开始后连续地或半连续地向培养物提供额外的组分。所提供的组分典型地包括细胞的营养补充剂，这些营养补充剂在培养工艺期间被耗尽。培养基中的细胞和/或组分的一部分典型地在连续或半连续基础上收获，并且任选地进行纯化。在一些实施例中，将如本文所述的营养补充剂添加到灌注培养物中，例如，在限定的时间段内连续提供这些营养补充剂。
如本文所用，术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的氨基酸的顺序链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但本领域的普通技术人员将理解，该术语不限于长链，并且可以是指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小长度链。
如本文所用，术语“蛋白质”是指一种或多种多肽，其作为离散单元起作用。如果单个多肽是离散功能单元并且不需要与其他多肽永久物理缔合以形成离散功能单元，则如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。
如本文所用，术语“重组表达的多肽”和“重组多肽”是指一种多肽，该多肽从经基因工程化以表达此多肽的宿主细胞表达。重组表达的多肽可以与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。重组表达的多肽也可以是宿主细胞的异源物，例如，与在宿主细胞中正常表达的肽异源。可替代地，重组表达的多肽可以是嵌合的，因为多肽的一部分含有与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其他部分是宿主细胞的异源物。
如本文所用，术语“接种”是指向生物反应器或另一个容器提供细胞培养物的工艺。这些细胞可能先前已经在另一个生物反应器或容器中繁殖。可替代地，这些细胞可以被冷冻并且在即将将其提供至生物反应器或容器之前进行解冻。该术语是指任何数量的细胞，包括单细胞。在各种实施例中，碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)通过一种工艺产生，在该工艺中细胞以约1.0×105个细胞/mL、1.5×105个细胞/mL、2.0×105个细胞/mL、2.5×105个细胞/mL、3.0×105个细胞/mL、3.5×105个细胞/mL、4.0×105个细胞/mL、4.5×105个细胞/mL、5.0×105个细胞/mL、5.5×105个细胞/mL、6.0×105个细胞/mL、6.5×105个细胞/mL、7.0×105个细胞/mL、7.5×105个细胞/mL、8.0×105个细胞/mL、8.5×105个细胞/mL、9.0×105个细胞/mL、9.5×105个细胞/mL、1.0×106个细胞/mL、1.5×106个细胞/mL、2.0×106个细胞/mL或更高的密度接种。在一个特别实施例中，在这种工艺中，细胞以约4.0×105个细胞/mL、5.5×105个细胞/mL或8.0×105个细胞/mL的密度接种。
如本文所用，术语“总唾液酸含量”或“TSAC”是指特定蛋白质分子上唾液酸(碳水化合物)的量。它表示为TSAC摩尔量/摩尔蛋白质，或“mol/mol”。TSAC浓度在纯化工艺期间测量。例如，一种TSAC定量方法是使用酸水解从阿斯福酶α中释放TSAC，并且随后使用高效阴离子交换色谱法和脉冲安培检测技术(“HPAE-PAD”)经由电化学检测来检测释放的TSAC。
如本文所用，术语“滴度”是指通过细胞培养物产生的重组表达的多肽或蛋白质的总量除以给定量的培养基体积。滴度典型地以毫克多肽或蛋白质/毫升培养基为单位表示。
本文所用的首字母缩略词包括例如HCCF：收获澄清培养液；UF：超滤，DF：渗滤；VCD：活细胞密度；IVCC：活细胞浓度积分；TSAC：总唾液酸含量；HPAE-PAD：高效阴离子交换色谱法和脉冲安培检测；SEC：尺寸排阻色谱法；AEX：阴离子交换色谱法；LoC：芯片实验室；以及MALDI-TOF：基质辅助激光解吸/电离–飞行时间。
如本文所用，术语“疏水相互作用色谱(HIC)柱”是指含有固定相或树脂和流动相或溶液相的柱，其中蛋白质与固定相或树脂上的疏水基团之间的疏水相互作用将蛋白质与杂质(包括主题蛋白的片段和聚集体、其他蛋白质或蛋白质片段以及其他污染物，诸如细胞碎片，或来自其他纯化步骤的残留杂质)分离。固定相或树脂包括基质或支持物，诸如交联琼脂糖、二氧化硅或疏水配体所附接的合成共聚物材料。此类固定相或树脂的实例包括苯基、丁基、辛基、己基和其他烷基取代的琼脂糖、二氧化硅或其他合成聚合物。柱可以具有含有固定相的任何尺寸，或者可以是开放和批量处理的。在一些实施例中，使用HIC从细胞培养物中分离重组碱性磷酸酶。
如本文所用，术语“制剂”是指包含感兴趣的蛋白质(例如，本文所述的重组碱性磷酸酶)和来自产生这种感兴趣的蛋白质的细胞培养物的至少一种杂质的溶液和/或用于从细胞培养物中提取、浓缩和/或纯化这种感兴趣的蛋白质的溶液。例如，感兴趣的蛋白质(例如，本文所述的重组碱性磷酸酶)的制剂可以通过在均化溶液中对细胞进行均化来制备，这些细胞在细胞培养物中生长并产生这种感兴趣的蛋白质。在一些实施例中，然后将制剂经受一个或多个纯化/分离工艺，例如色谱法步骤。
如本文所用，术语“溶液”是指呈液体形式的两种或更多种物质的均质分子混合物。特别地，在一些实施例中，待纯化的蛋白质，诸如本披露中的重组碱性磷酸酶或其融合蛋白(例如，阿斯福酶α)代表溶液中的一种物质。术语“缓冲液”或“缓冲溶液”是指通过其共轭酸碱范围的作用抵抗pH变化的溶液。将pH控制在约pH 5至约pH 7范围内的缓冲液的实例包括HEPES、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和其他无机酸或有机酸缓冲液，以及这些缓冲液的组合。盐阳离子包括钠、铵和钾。如本文所用，术语“加载缓冲液/溶液”或“平衡缓冲液/溶液”是指含有一种或多种盐的缓冲液/溶液，其与蛋白质制剂混合，用于将蛋白质制剂加载到色谱柱(例如，HIC柱)上。此缓冲液/溶液还用于在加载之前对该柱进行平衡，并且在加载蛋白质之后对该柱进行洗涤。“洗脱缓冲液/溶液”是指用于从该柱中洗脱蛋白质的缓冲液/溶液。如本文所用，术语“溶液”是指缓冲或非缓冲溶液，包括水。
术语“唾液酸”通常是指神经氨酸的N或O取代衍生物，神经氨酸是一种具有九碳主链的单糖。唾液酸也可以特指化合物N-乙酰神经氨酸，并且有时缩写为Neu5Ac或NANA。唾液酸的存在可能影响来自血清的糖蛋白的吸收、血清半衰期和清除，以及糖蛋白的物理、化学和免疫原性特性。在本披露的一些实施例中，与碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)相关联的唾液酸在生理条件下影响分子的半衰期。在一些实施例中，精确和可预测地控制阿斯福酶α的总唾液酸含量(TSAC)是重组阿斯福酶α的关键质量属性。在一些实施例中，TSAC是1.2至3.0mol/mol阿斯福酶α单体。在一些实施例中，TSAC是在生物反应器中的重组蛋白生产工艺中生成的。在一些实施例中，本披露提供了一种通过哺乳动物细胞培养控制含有总唾液酸含量(TSAC)的重组蛋白中的TSAC的方法，该方法包括至少一个纯化步骤和至少一个色谱法步骤。在一些实施例中，纯化和色谱法步骤导致糖苷酶活性降低，并且因此增加重组蛋白的总唾液酸含量。
术语“唾液酸化”是指特定类型的糖基化，例如，将一个或多个唾液酸分子添加到生物分子中，特别地将一个或多个唾液酸分子添加到蛋白质中。在本披露的一些实施例中，唾液酸化通过唾液酰基转移酶进行。在一些实施例中，唾液酰基转移酶将唾液酸添加到新生的低聚糖和/或糖蛋白的N或O连接糖链中。在一些实施例中，唾液酰基转移酶天然存在于产生重组碱性磷酸酶的细胞中。在一些实施例中，唾液酰基转移酶存在于用于培养产生重组碱性磷酸酶的细胞的细胞培养基和/或营养补充剂中。在一些实施例中，唾液酰基转移酶是使用本领域已知的重组蛋白表达方法重组产生的。在一些实施例中，将与重组碱性磷酸酶单独产生的重组唾液酰基转移酶外源性地添加到细胞培养物、收获澄清培养液(HCCF)和/或过滤池中。
在本披露的一些实施例中，通过水解从糖蛋白中去除(例如，“去唾液酸化”)唾液酸基团。在一些实施例中，去唾液酸化是通过糖苷酶进行的。如本文所用，“糖苷酶”，也被称为“糖苷水解酶”，是一种催化将糖苷的糖连接到醇或另一种糖单元的键水解的酶。糖苷酶的实例包括淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶和唾液酸酶。在一些实施例中，去唾液酸化是通过唾液酸酶进行的。在一些实施例中，唾液酸酶使糖蛋白、糖脂、低聚糖、聚唾液酸和/或合成底物中末端唾液酸残基的糖苷键水解。在一些实施例中，唾液酸酶存在于产生重组碱性磷酸酶的细胞培养基中。在一些实施例中，唾液酸酶活性依赖于总蛋白浓度和/或与总蛋白浓度相关。在一些实施例中，唾液酸酶基本上是无活性的，直至蛋白质浓度达到极高的水平，此时唾液酸酶被激活。在一些实施例中，唾液酸酶存在于HCCF或产生重组碱性磷酸酶的细胞培养物的过滤池中。在一些实施例中，唾液酸酶从重组碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)上的糖基化位点中去除唾液酸部分，从而有效地降低重组碱性磷酸酶的TSAC。在一些实施例中，选择性地从细胞培养物、HCCF和/或过滤池中去除唾液酸酶。唾液酸酶可以通过例如唾液酸酶特异性抑制剂、抗体、离子交换和/或亲和色谱法、免疫沉淀等的一种或组合选择性地去除。关于生物工艺条件如何影响蛋白质的唾液酸含量的概述，请参见Gramer等人,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]9(4):366-373(1993)，该文献的披露内容特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，本披露提供了一种控制产生重组蛋白的哺乳动物细胞培养物中的糖苷酶活性的方法，该方法包括至少一个纯化步骤和至少一个色谱法步骤。在一些实施例中，纯化和色谱法步骤导致糖苷酶活性降低，并且因此增加重组蛋白的总唾液酸含量。
术语“收获澄清培养液”，缩写为HCCF，是指从细胞培养物(例如，生物反应器中的细胞培养物)中收获的澄清过滤液。HCCF典型地不含细胞培养物中可能存在的细胞和细胞碎片(例如像不溶性生物分子)。在本披露的一些实施例中，HCCF通过离心、深度过滤、无菌过滤和/或色谱法生成。在一些实施例中，首先将来自生物反应器的细胞培养液离心和/或过滤，然后经受至少一个色谱法步骤以生成HCCF。在一些实施例中，将HCCF在至少一个色谱法步骤之前和/或之后浓缩。在一些实施例中，将HCCF在至少一个色谱法步骤之后稀释。在一些实施例中，来自产生重组碱性磷酸酶的细胞培养物的HCCF含有重组碱性磷酸酶和污染物蛋白。在一些实施例中，HCCF中的污染物蛋白包括唾液酸酶。
术语“过滤”和“流动过滤”是指一种压力驱动工艺，该工艺使用膜基于液体溶液或悬浮液中的组分的大小和电荷差异来分离这些组分。流动过滤可以是常规过滤或“切向流过滤”，也被称为TFF或错流过滤。TFF典型地用于澄清、浓缩和纯化蛋白质。在TFF工艺期间，流体沿至少一个膜的表面切向泵送。所施加的压力用于迫使流体的一部分通过膜作为“滤液”流向下游侧。过大而无法穿过膜孔的颗粒和大分子作为“截留物”保留在上游侧。TFF可以呈各种形式使用，包括例如微滤、超滤(包括病毒过滤和高性能TFF)、反渗透、纳滤和渗滤。在本披露的一些实施例中，一种或多种TFF形式组合用于蛋白质加工和/或纯化。在一些实施例中，超滤和渗滤组合用于纯化重组碱性磷酸酶。本文描述了超滤和渗滤。
“超滤”或“UF”是一种纯化过程，用于从缓冲液组分中分离蛋白质以进行缓冲液交换、脱盐或浓缩。根据待保留的蛋白质，使用约1kD至约1000kD范围内的膜分子量限制。在一些实施例中，UF是TFF工艺。
“渗滤”或“DF”是一种纯化工艺，该工艺通过膜洗涤较小的分子并将较大的分子留在截留物中，而不会最终改变浓度。典型地，DF与另一种纯化工艺结合使用，以增强产物产量和/或纯度。在DF期间，将溶液(例如，水或缓冲液)引入样品储器中，同时从单元操作中去除滤液。在所需产物在截留物中的工艺中，渗滤将组分从产物池中洗入滤液中，从而交换缓冲液并降低不希望的物质的浓度。当产物在滤液中时，渗滤将其通过膜洗涤到收集容器中。在一些实施例中，DF是TFF工艺。
术语“过滤池”，有时也被称为“UFDF池”或“UFDF”，是指来自过滤工艺，典型地来自组合超滤/渗滤(UF/DF)工艺的总体积流体。在蛋白质纯化的背景下，UFDF是指超滤/渗滤工艺中的截留物。
附图说明
图1是示出了重组碱性磷酸酶(诸如阿斯福酶α)的生产工艺的流程图。
图2是示出了多个批次在收获时、蛋白A池步骤和最终BDS的阿斯福酶α的TSAC含量的图。
图3是示出了多个批次在接种之后第7天、收获步骤时和最终BDS的阿斯福酶α的TSAC含量的图。
具体实施方式
本披露提供了制造重组糖蛋白，诸如碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的改进方法，这些方法通过在发酵期间测量总唾液酸含量(TSAC)浓度并响应于TSAC浓度测量调整下游生产步骤来提供对于TSAC浓度的改进质量控制。这些方法允许通过使用动态控制策略来响应生物反应器细胞培养物输出中TSAC水平的潜在可变范围，从而调节最终产物的TSAC。最终，此方法为商业生产提供了重组碱性磷酸酶的均匀特性。本文所述的方法提供了一种结果产物，其中最终产物的TSAC被严格控制在输入生物反应器水性培养基TSAC水平的范围内。
制造方法
本文所述的方法包括以下步骤：用表达重组碱性磷酸酶的细胞(例如，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)接种生物反应器；获得包含该重组碱性磷酸酶的水性培养基；在接种之后约第6天至约第10天，特别地约第6天至约第8天(例如，约第6天、约第7天、约第8天、约第9天、约第10天，例如约第7天)从该水性培养基中获得等分试样；定量该等分试样中每摩尔该重组碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)摩尔浓度；收获该水性培养基；以及进行过滤步骤(例如，超滤、渗滤或其组合)以获得原料药溶液(BDS)。
在发酵期间，该培养基的等分试样用于确定保持过滤步骤期间的时间量。例如，如果该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持小于约9小时。如果该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约10小时至约14小时。如果该等分试样具有约2.8mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约23小时至约27小时。如果该等分试样具有大于约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约38小时至约42小时。
在一个实施例中，如果该等分试样具有小于或等于约2.3mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约18+/-4小时。如果该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.1mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约32+/-4小时。如果该等分试样具有大于或等于约3.2mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约44+/-4小时。
在另一个替代性实施例中，如果该等分试样具有小于约2.4mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约17+/-3小时。如果该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约31+/-3小时。如果该等分试样具有大于约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约45+/-3小时。
这些方法可以产生BDS，其中TSAC浓度被控制至约1.2mol/mol至约3.0mol/mol(例如，约1.6mol/mol至约2.4mol/mol)的范围。此TSAC浓度范围提供了大量具有商业相关规模的重组碱性磷酸酶样品，该样品是稳定的(例如，治疗有效的半衰期)并且具有酶促活性，可用于人类患者。
本文所述的碱性磷酸酶蛋白(例如，阿斯福酶α)可以由哺乳动物细胞或其他细胞，特别地CHO细胞，使用本领域已知的方法产生。此类细胞可以在培养皿、烧瓶杯或生物反应器中生长。用于细胞培养和产生重组蛋白的特定工艺是本领域已知的，诸如在Nelson和Geyer,1991Bioprocess Technol.[生物加工技术]13:112-143和Rea等人,Supplement toBioPharm International[国际生物制药的增刊]2008年3月,20-25中所述。示例性生物反应器包括间歇式、补料分批和连续反应器。在一些实施例中，碱性磷酸酶蛋白在补料分批生物反应器中产生。
细胞培养工艺具有通过例如可变的物理化学环境导致的可变性，包括但不限于pH变化、温度、温度变化、温度变化的时间、细胞培养基组成、细胞培养营养补充剂、原料批次间的变化、介质过滤材料、生物反应器规模差异、通气策略(空气、氧气和二氧化碳)等。如本文所披露的，所制造的碱性磷酸酶蛋白的产量、相对活性谱和糖基化谱可能受到影响，并且可以通过改变这些参数中的一个或多个来控制在特定值内。
对于细胞培养中的重组蛋白产生，首先通过生物技术领域已知的方法将具有必要转录调控元件的重组基因转移到宿主细胞中。任选地，转移向受体细胞赋予选择性优势的第二基因。在基因转移之后几天可以施加的选择剂存在下，只有表达选择基因的那些细胞存活。用于这种选择的两种示例性基因是二氢叶酸还原酶(DHFR，一种参与核苷酸代谢的酶)和谷氨酰胺合成酶(GS)。在这两种情况下，选择在缺乏适当的代谢物(在DHFR的情况下是次黄嘌呤和胸苷，并且在GS的情况下是谷氨酰胺)的情况下发生，从而阻止任何未转化的细胞生长。一般而言，为了有效表达重组蛋白，生物制药编码基因和选择基因是否在同一质粒上并不重要。
在选择后，存活的细胞可以作为单细胞转移到第二培养容器中，并且培养物被扩增以产生克隆群体。最终，评价单个克隆的重组蛋白表达，保留最高的生产者用于进一步培养和分析。从这些候选物中，选择一种具有适当生长和生产力特征的细胞系来产生重组蛋白。然后开发由生产需求和最终产物要求决定的培养工艺。
细胞
可以根据本披露利用任何可以进行培养以产生多肽的哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞类型。可以使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括例如中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报],77:4216)；BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/1，ECACC登录号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell公司，莱顿，荷兰(CruCell,Leiden,The Netherlands)))；通过SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人,1977J.Gen Virol.[普通病毒学杂志],36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学],23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-I 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年鉴]383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。在一个特别实施例中，多肽和蛋白质的培养和表达发生在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中。
另外，根据本披露可以利用任何数量的表达多肽或蛋白质的商购和非商购可获得的杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解，杂交瘤细胞系可能具有不同的营养要求和/或可能需要不同的培养条件以实现最佳生长和多肽或蛋白质表达，并且将能够根据需要修改条件。
接种密度
在本披露中，将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞接种(inoculated)(例如，接种(seeded))到培养基中。可以使用各种接种密度。在一些实施例中，可以使用1.0×102个细胞/mL至1.0×109个细胞/mL(例如，1.0×103个细胞/mL至1.0×108，例如1.0×104个细胞/mL至1.0×107)的接种密度。在一些实施例中，可以使用1.0×105个细胞/mL至1.0×106个细胞/mL的接种密度。在一些实施例中，可以使用4.0×105个细胞/mL至8.0×105个细胞/mL的接种密度。在一些实施例中，增加的接种密度可能影响阿斯福酶α的片段化质量，如通过SEC测量。在一些实施例中，接种时控制接种密度，以降低片段生成的风险。
温度
温度对于若干参数可能具有影响，包括生长速率、聚集、片段化和TSAC。在一些实施例中，当在培养基中培养CHO细胞时，温度保持恒定。在一些实施例中，当在培养基中培养CHO细胞时，温度是约30℃至约40℃、或约35℃至约40℃、或约37℃至约39℃。在一些实施例中，当在培养基中培养CHO细胞时，温度是约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃、约34℃、约34.5℃、约35℃、约35.5℃、约36℃、约36.5℃、约37℃、约37.5℃、约38℃、约38.5℃、约39℃、约39.5℃或约40℃。在一些实施例中，接种之后温度恒定40至200小时。在一些实施例中，接种之后温度恒定50至150小时、或60至140小时、或70至130小时、或80至120小时、或90至110小时。在一些实施例中，接种之后温度恒定80至120小时。在一些实施例中，接种之后温度恒定90小时、92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、108小时或110小时。
温度偏移
细胞培养工艺，特别是非连续工艺(例如，生物反应器中的补料分批工艺)的运行时间通常受到细胞剩余活力的限制，该细胞剩余活力典型地在运行过程中下降。因此，延长细胞活力的时间长度是改善重组蛋白生产所需的。产物质量问题也为最大限度地减少活细胞密度的降低和维持高细胞活力提供了动力，因为细胞死亡可能将唾液酸酶释放到培养上清液中，这可能降低表达的蛋白质的唾液酸含量。蛋白质纯化问题为最大限度地减少活细胞密度的降低和维持高细胞活力提供了又一种动力。培养物中的细胞碎片和死细胞含量可能对培养运行结束时分离和/或纯化蛋白质产物的能力产生负面影响。因此，通过保持培养物中的细胞存活较长时间，可以减少细胞蛋白和酶(例如，细胞蛋白酶和唾液酸酶)对培养基的污染，该污染可能导致细胞产生的所需糖蛋白降解并最终降低所需糖蛋白的质量。
可以应用许多方法来在细胞培养物中实现高细胞活力。一种方法涉及在正常温度下初始培养后降低培养温度。例如，参见Ressler等人,1996,Enzyme and MicrobialTechnology[酶与微生物技术]18:423-427。通常，能够表达感兴趣的蛋白质的哺乳动物细胞或其他类型的细胞首先在正常温度下生长以增加细胞数量。每种细胞类型的此类“正常”温度通常是约37℃(例如，约35℃至约39℃，包括例如35.0℃、35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃和/或39.0℃)。在一个特别实施例中，用于产生阿斯福酶α的温度首先设定在约37℃。当达到合理的高细胞密度时，然后可以使整个细胞培养物的培养温度偏移(例如，降低)以促进蛋白质产生。在大多数情况下，降低温度使细胞向细胞周期的非生长G1部分偏移，与先前的高温环境相比，这可以增加细胞密度和活力。另外，较低的温度还可以通过增加细胞蛋白产生速率、促进蛋白质翻译后修饰(例如，糖基化)、减少新产生的蛋白质的片段化或聚集、促进蛋白质折叠和3D结构形成(从而维持活性)和/或减少新产生的蛋白质的降解来促进重组蛋白质产生。在一些实施例中，温度降低3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。在一些实施例中，温度降低至约27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。在一些实施例中，较低的温度是约30℃至约35℃(例如，30.0℃、30.5℃、31.0℃、31.5℃、32.0℃、32.5℃、33.0℃、33.5℃、34.0℃、34.5℃和/或35.0℃)。在其他实施例中，用于产生阿斯福酶α的温度首先设定为约35.0℃至约39.0℃并且然后偏移至约30.0℃至约35.0℃。在一个实施例中，用于产生阿斯福酶α的温度首先设定在约37.0℃并且然后偏移至约30℃。在另一个实施例中，用于产生阿斯福酶α的温度首先设定在约36.5℃并且然后偏移至约33℃。在又一个实施例中，用于产生阿斯福酶α的温度首先设定在约37.0℃并且然后偏移至约33℃。在又另一个实施例中，用于产生阿斯福酶α的温度首先设定在约36.5℃并且然后偏移至约30℃。在其他实施例中，可以应用多个(例如，超过一个)温度偏移步骤。
可以确定在偏移至不同温度之前将培养物维持在特定温度下的时间，以实现足够的(或所需的)细胞密度，同时维持细胞活力和产生感兴趣的蛋白质的能力。在一些实施例中，细胞培养物在第一温度下生长，直至活细胞密度达到约105个细胞/mL至约107个细胞/mL(例如，1x 105、1.5x 105、2.0x 105、2.5x 105、3.0x 105、3.5x 105、4.0x 105、4.5x 105、5.0x105、5.5x 105、6.0x 105、6.5x 105、7.0x 105、7.5x 105、8.0x 105、8.5x 105、9.0x 105、9.5x105、1.0x 106、1.5x 106、2.0x 106、2.5x 106、3.0x 106、3.5x 106、4.0x 106、4.5x 106、5.0x106、5.5x 106、6.0x 106、6.5x 106、7.0x 106、7.5x 106、8.0x 106、8.5x 106、9.0x 106、9.5x106、1x 107个细胞/mL或更大)，然后偏移至不同温度。在一个实施例中，细胞培养物在第一温度下生长，直至活细胞密度达到约2.5至约3.4×106个细胞/mL，然后偏移至不同温度。在另一个实施例中，细胞培养物在第一温度下生长，直至活细胞密度达到约2.5至约3.2×106个细胞/mL，然后偏移至不同温度。在又一个实施例中，细胞培养物在第一温度下生长，直至活细胞密度达到约2.5至约2.8×106个细胞/mL，然后偏移至不同温度。
在一些实施例中，本披露的方法提供的温度偏移发生在接种之后50至150小时、或60至140小时、或70至130小时、或80至120小时、或90至110小时。在一些实施例中，本披露的方法提供在接种之后约80小时至150小时、接种之后约90小时至100小时、或接种之后约96小时的温度降低。在一些实施例中，温度偏移发生在接种之后80至120小时。在一些实施例中，温度偏移发生在接种之后90小时、92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、108小时或110小时。在一些实施例中，维持温度偏移之后的温度，直至收获CHO细胞。
pH
细胞培养物中生长培养基的pH的改变可能影响细胞蛋白水解活性、分泌和蛋白质产生水平。大多数细胞系在约pH 7-8下生长良好。尽管不同细胞株之间细胞生长的最佳pH差异相对较小，但一些正常的成纤维细胞系在pH 7.0-7.7时表现最佳，并且转化细胞典型地在pH 7.0-7.4下表现最佳(Eagle J Cell Physiol[细胞生理学杂志]82:1-8,1973)。在一些实施例中，用于产生阿斯福酶α的培养基的pH是约pH 6.5-7.7(例如，6.50、6.55、6.60、6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15、7.20、7.25、7.30、7.35、7.39、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65或7.70)。
培养基
在一些实施例中，使用分批培养，其中在接种之后不添加额外的培养基。在一些实施例中，使用补料分批培养，其中在接种之后添加一个或多个大剂量的培养基。在一些实施例中，在接种之后添加两个、三个、四个、五个或六个大剂量的培养基。
在各种实施例中，碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)是通过向生产生物反应器中添加额外大剂量的培养基的工艺产生的。例如，可以添加一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个大剂量的培养基。在一个特别实施例中，添加三个大剂量的培养基。在各种实施例中，以各种量添加此类额外大剂量的培养基。例如，此类大剂量的培养基可以生产生物反应器中培养基的原始体积的约20％、25％、30％、33％、40％、45％、50％、60％、67％、70％、75％、80％、90％、100％、110％、120％、125％、130％、133％、140％、150％、160％、167％、170％、175％、180％、190％、200％或更多的量添加。在一个特别实施例中，此类大剂量的培养基可以原始体积的约33％、67％、100％或133％的量添加。在各种实施例中，此类额外大剂量的添加可以在细胞生长或蛋白质生产期间的不同时间发生。例如，大剂量可以在工艺的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或更晚时间添加。在一个特别实施例中，此类大剂量的培养基可以每隔一天添加(例如，在(1)第3天、第5天和第7天；(2)第4天、第6天和第8天；或(3)第5天、第7天和第9天)。在实践中，培养基的大剂量补充剂的频率、量、时间点和其他参数可以根据以上限制自由组合，并且通过实验实践确定。
各种培养基是可商购获得的。在一些实施例中，培养基选自下组，该组由以下组成：302无血清培养基；CD DG44培养基；BD SELECTTM培养基；SFM4CHO培养基或其组合。在一些实施例中，培养基包括可商购获得的培养基，例如SFM4CHO培养基和BDSELECTTM培养基的组合。在一些实施例中，培养基包括可商购获得的培养基，例如SFM4CHO培养基和BD SELECTTM培养基的组合，其比率选自90/10、80/20、75/25、70/30、60/40或50/50。
营养补充剂
各种营养补充剂，也被称为“饲料介质”，是可商购获得的并且是本领域技术人员已知的。营养补充剂包括在接种发生之后添加到细胞培养物中的介质(不同于培养基)。在一些情况下，营养补充剂可以用于替代培养物中生长细胞所消耗的营养物质。在一些实施例中，添加营养补充剂以优化所需蛋白质的产生，或优化所需蛋白质的活性。已经开发了许多营养补充剂并且是可商购获得的。虽然营养补充剂的明确目的是增加工艺开发的一个方面，但没有通用的营养补充剂适用于所有细胞和/或所有产生的蛋白质。选择可扩展且适当的细胞培养营养补充剂不是常规的，该营养补充剂可以与所需细胞系、所产生的蛋白质和给定的基础培养基结合使用，以实现所需的滴度和生长特征。由于细胞培养工艺中存在无数变量，筛选多种可商购获得的营养补充剂并鉴定与特定细胞系、所产生的特定蛋白质和基础培养基组合最适当的补充剂的典型方法可能无法成功。在一些实施例中，营养补充剂选自下组，该组由以下组成：Efficient Feed C+AGTTM补充剂(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、CELL BOOSTTM2+CELL BOOSTTM4的组合(通用医疗公司(GE Healthcare)，瑞典)、CELL BOOSTTM2+CELL BOOSTTM5的组合(通用医疗公司，瑞典)、CELL BOOSTTM6(通用医疗公司，瑞典)和CELL BOOSTTM7a+CELL BOOSTTM7b(通用医疗公司，瑞典)、CHO进料生物反应器补充剂(西格玛奥德里奇公司；例如，产品目录号C1615)或其组合。
CELL BOOSTTM7a可以被描述为第一无动物衍生组分(ADCF)的营养补充剂，该营养补充剂包含一种或多种氨基酸、维生素、盐、微量元素、泊洛沙姆和葡萄糖，其中该第一ADCF营养补充剂不包含次黄嘌呤、胸苷、胰岛素、L-谷氨酰胺、生长因子、肽、蛋白质、水解物、酚红和2-巯基乙醇。CELL BOOSTTM7a是化学限定的补充剂。短语“无动物衍生组分”或“ADCF”是指没有成分直接衍生自动物来源，例如不是衍生自牛来源的补充剂。在一些实施例中，营养补充剂是CELL BOOSTTM7a。
CELL BOOSTTM7b可以被描述为第二ADCF营养补充剂，该营养补充剂包含一种或多种氨基酸，其中该第二ADCF营养补充剂缺乏次黄嘌呤、胸苷、胰岛素、L-谷氨酰胺、生长因子、肽、蛋白质、水解物、酚红、2-巯基乙醇和泊洛沙姆。CELL BOOSTTM7b是化学限定的补充剂。在一些实施例中，营养补充剂是CELL BOOSTTM7b。
在一些实施例中，使用可商购获得的营养补充剂的组合。术语“营养补充剂”是指单一营养补充剂以及营养补充剂组合两者。例如，在一些实施例中，营养补充剂的组合包括CELL BOOSTTM7a和CELL BOOSTTM7b组合。
在各种实施例中，碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)是通过向生产生物反应器中添加额外营养补充剂的工艺产生的。在一些实施例中，营养补充剂是在一段时间内添加的，例如，在1分钟至2小时的时间段内添加。在一些实施例中，营养补充剂以大剂量添加。例如，可以添加一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个大剂量的营养补充剂。在一些实施例中，营养补充剂在超过2个不同的时间处，例如2至6个不同的时间处添加。在各种实施例中，以各种量添加此类额外大剂量的营养补充剂。例如，此类大剂量的营养补充剂可以生产生物反应器中培养基的原始体积的约1％至20％、1％至10％或1％至5％(w/v)的量添加。在一个特别实施例中，此类大剂量的营养补充剂可以原始体积的1％至20％、1％至10％或1％至5％(w/v)的量添加。
在一些实施例中，使用营养补充剂的组合，并且以培养基的0.5％至4％(w/v)的浓度添加第一营养补充剂，例如CELL BOOSTTM7a。在一些实施例中，使用营养补充剂的组合，并且以培养基的0.05％至0.8％(w/v)的浓度添加第二营养补充剂，例如CELL BOOSTTM7b。在特别实施例中，其中营养补充剂的组合包括CELL BOOSTTM7a和CELL BOOSTTM7b，大剂量的营养补充剂可以原始体积的1％至20％、1％至10％或1％至5％(w/v)的量添加。
在各种实施例中，此类额外大剂量的添加可以在接种之后的不同时间发生。例如，大剂量可以在接种之后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或更晚时间添加。在实践中，营养补充剂的大剂量补充剂的频率、量、时间点和其他参数可以根据以上限制自由组合，并且通过实验实践确定。
在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括在重组多肽的生产期间将锌添加到所述培养基中。在一些实施例中，可以添加锌以在所述培养基中提供约1至约300μM的锌浓度。在一些实施例中，可以添加锌以在培养基中提供约10至约200μM(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μM)的锌浓度。在一些实施例中，添加锌以在培养基中提供约25μM至约150μM、或约60μM至约150μM的锌浓度。在一个实施例中，添加锌以在培养基中提供约30、60或90μM锌的锌浓度。在一些实施例中，将锌以大剂量、连续、半连续或其组合的方式添加到所述培养基中。在一些实施例中，在接种之后一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天和/或十三天添加锌。
收获
先前的研究表明，延迟收获时间与活力和TSAC下降相关联，因此收获时间可能对其他CQA具有潜在影响。在各种实施例中，在约200小时、210小时、220小时、230小时、240小时、250小时、260小时、264小时、270小时、280小时、288小时(例如，12天)或超过12天的时间点处收获碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)。
下游工艺
本文所用的术语“一个或多个下游工艺”通常是指用于回收和纯化从诸如培养细胞或发酵液等的来源产生的碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的全部或部分工艺。
通常，下游加工通过逐步提高纯度和浓度，使产物从其作为组织、细胞或发酵液的组分的自然状态产生出来。例如，去除不溶性物质可以是第一步，其涉及将产物作为溶质捕获在无颗粒液体中(例如，从发酵液中分离细胞、细胞碎片或其他颗粒物质)。实现这一点的示例性操作包括例如过滤、离心、沉积、沉淀、絮凝、电沉淀、重力沉降等。额外的操作可以包括例如研磨、均化或浸出，用于从固体来源(诸如，植物和动物组织)回收产物。第二步可以是“产物-分离”步骤，该步骤去除其特性与所需产物明显不同的组分。对于大部分产物，水是主要杂质，并且分离步骤被设计来去除大部分杂质，从而减少要处理的材料体积并浓缩产物。对于此步骤，溶剂萃取、吸附、超滤和沉淀可以单独使用或组合使用。下一步涉及产物纯化，其分离在物理和化学特性上与产物非常相似的污染物。可能的纯化方法包括例如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、混合模式色谱法、尺寸排阻色谱法、反相色谱法、超滤-渗滤、结晶和分步沉淀。在一些实施例中，下游工艺包括收获澄清、超滤、渗滤、病毒灭活、亲和捕获及其组合中的至少一种。本文描述了下游工艺。
总唾液酸含量的确定
在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括测量来自在例如约第6天至约第10天，特别地约第6天至约第8天(例如，约第6天、约第7天、约第8天、约第9天、约第10天，例如约第7天)从培养基中取出的等分试样的重组碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)。该等分试样可以从该生物反应器中以无菌方式获得，以防止污染。该等分试样可以是约1mL至约1000mL(例如，约25mL至约500mL，例如约50mL至约300mL，例如约100mL或约200mL)。获得该等分试样可以进一步包括对该等分试样进行离心和/或从该等分试样中取出上清液。此步骤还可以包括使用色谱柱(例如，蛋白A柱、1cm蛋白A柱，例如1mL HiTrap Protein A柱或600μL Protein A Robocolumn)从该上清液中纯化碱性磷酸酶。在一些实施例中，该碱性磷酸酶可以经受缓冲液交换。该碱性磷酸酶还可以例如在确定TSAC浓度之前进行浓缩。
碳水化合物定量的商业方法是可用的，例如来自赛默飞世尔公司。通常，使用酸水解从糖蛋白(例如，阿斯福酶α)中释放TSAC，并且使用柱色谱法(诸如高效阴离子交换色谱法和脉冲安培检测技术(HPAE-PAD))经由电化学检测来检测释放的糖/TSAC。针对内部标准定量每摩尔的所得水平，并且表示为总摩尔蛋白的函数。
如本文所述，TSAC在生理条件下影响重组碱性磷酸酶的半衰期，并且因此充当重组产生的碱性磷酸酶(例如像阿斯福酶α)的关键质量属性。严格控制TSAC范围对于可再现性和cGMP是重要的。在一些实施例中，TSAC是约0.8mol/mol至约4.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，TSAC是约0.9mol/mol至约3.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，TSAC是约1.0mol/mol至约2.8mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，TSAC是约1.2mol/mol至约3.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，TSAC是约1.2mol/mol至约2.4mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，TSAC是约0.9mol/mol、约1.0mol/mol、约1.1mol/mol、约1.2mol/mol、约1.3mol/mol、约1.4mol/mol、约1.5mol/mol、约1.6mol/mol、约1.7mol/mol、约1.8mol/mol、约1.9mol/mol、约2.0mol/mol、约2.1mol/mol、约2.2mol/mol、约2.3mol/mol、约2.4mol/mol、约2.5mol/mol、约2.6mol/mol、约2.7mol/mol、约2.8mol/mol、约2.9mol/mol或约3.0mol/mol重组碱性磷酸酶。
在一些实施例中，重组碱性磷酸酶的TSAC在下游加工期间降低。在一些实施例中，重组碱性磷酸酶的TSAC由于含有重组碱性磷酸酶的溶液(例如，细胞培养物、HCCF和/或UFDF过滤池)中存在的唾液酸酶而降低。在一些实施例中，从细胞培养物、HCCF和/或UFDF过滤池中选择性地去除唾液酸酶，以实现约0.9mol/mol至约3.0mol/mol重组碱性磷酸酶的TSAC。唾液酸酶可以通过例如唾液酸酶特异性抑制剂、抗体、离子交换和/或亲和色谱法、免疫沉淀等的一种或组合选择性地去除。
在一些实施例中，通过含有重组碱性磷酸酶的溶液(例如，细胞培养物、HCCF和/或UFDF过滤池)中存在的唾液酰基转移酶将唾液酸部分添加到重组碱性磷酸酶中。在一些实施例中，将重组唾液酰基转移酶外源性地添加到细胞培养物、HCCF和/或UFDF过滤池中，以实现约0.9至约3.0mol/mol重组碱性磷酸酶的TSAC。
重组碱性磷酸酶活性的确定
在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括测量重组碱性磷酸酶活性。在一些实施例中，活性选自一种方法，该方法选自基于pNPP的碱性磷酸酶酶促测定和无机焦磷酸盐(PPi)水解测定中的至少一种。在一些实施例中，重组碱性磷酸酶Kcat和Km值中的至少一种在无机焦磷酸盐(PPi)水解测定中增加。在一些实施例中，该方法包括确定活细胞浓度积分(IVCC)。
最后一步可以用于产品抛光，这些工艺最终以将产品包装成稳定、易于运输且方便的形式而结束。在2℃-8℃下储存、在-20℃至-80℃下冷冻、结晶、干燥、冻干、冷冻干燥和喷雾干燥是此最终步骤中的示例性方法。根据产品及其预期用途，产品抛光还可以对产品进行灭菌，并且去除或灭活可能危及产品安全的微量污染物(例如，病毒、内毒素、代谢废物和热原)。
产品回收方法可以将本文讨论的两个或更多个步骤组合起来。例如，膨胀床吸附(EBA)在单个步骤中实现不溶物去除和产品分离。关于EBA的综述，参见Kennedy,CurrProtoc Protein Sci.[最新蛋白质科学实验指南]2005年6月；第8章：第8.8单元。另外，亲和色谱法经常在单个步骤进行分离和纯化。
关于用于纯化培养细胞中产生的重组蛋白的下游工艺的综述，参见Rea,2008Solutions for Purification of Fc-fusion Proteins.[用于纯化Fc融合蛋白的解决方案]BioPharm Int.Supplements[国际生物制药的增刊]3月2:20-25。本文披露的碱性磷酸酶的下游工艺可以包括本文所述的示例性步骤中的至少一种或任意组合。
收获澄清工艺
在该方法的一些实施例中，重组碱性磷酸酶通过至少一个纯化步骤从细胞培养物中分离出来以形成收获澄清培养液(HCCF)，例如，“收获”步骤或收获澄清步骤。“收获”细胞培养物典型地是指从培养容器(例如，生物反应器)中收集细胞培养物的工艺。在一些实施例中，至少一个纯化步骤包括过滤、离心及其组合中的至少一种。在一些实施例中，收获澄清步骤包括离心和/或过滤收获的细胞培养物，以便去除细胞和细胞碎片(例如，不溶性生物材料)以回收产物，例如重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，细胞和细胞碎片被除去，以便产生适合色谱法的澄清过滤流体。在一些实施例中，该澄清过滤流体被称为收获澄清培养液或HCCF。在一些实施例中，将细胞培养物经受离心和深度过滤的组合以生成HCCF。此步骤中可能使用的溶液可以包括回收缓冲液(例如，50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.50)。合适的回收缓冲液的组成可以由技术人员选择。
在一些实施例中，HCCF具有约1.9mol/mol至约4.3mol/mol的总唾液酸含量(TSAC)。在一些实施例中，HCCF具有约2.2mol/mol至约3.6mol/mol的TSAC。在一些实施例中，HCCF具有约2.2mol/mol至约3.4mol/mol的TSAC。在一些实施例中，HCCF具有约1.9mol/mol至约3.1mol/mol的TSAC。在一些实施例中，HCCF具有约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4或约4.5mol/mol的TSAC。
收获后超滤和/或渗滤
在该方法的一些实施例中，在至少一个纯化步骤之后进行额外的纯化步骤以形成过滤池，也被称为“UFDF池”或“UFDF”。在一些实施例中，至少一个纯化步骤用于浓缩和缓冲液稀释。在一些实施例中，至少一个纯化步骤包括收获澄清、过滤、超滤、渗滤、病毒灭活、亲和捕获及其组合中的至少一种。在一些实施例中，至少一个纯化步骤包括超滤(UF)和/或渗滤(DF)。UF工艺的示例性步骤包括例如滤膜的使用前清洁/储存、清洁后/储存后冲洗、平衡(例如，用含有50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.50的缓冲液)、加载、浓缩、渗滤、稀释/冲洗/回收(例如，用含有50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.50的缓冲液)和滤膜的使用后冲洗/清洁/储存。
在一些实施例中，在UF/DF之后，将UFDF稀释至约1.7g/L至约5.3g/L的蛋白质浓度，然后在约13℃至约27℃下维持约0至约60小时，之后储存和/或进一步纯化。如本文所用，“保持”或“维持”UFDF是指将UFDF保持在相同的温度下(例如，在±约1℃内，或在定义范围内，诸如在19℃与25℃之间)，持续目标时间长度，例如“保持时间”(在±约2小时内)。“保持”或“维持”恒定温度的细节可能取决于制造规模和制造规模的实际考虑。在一些实施例中，保持UFDF以充当重组碱性磷酸酶生产工艺中的控制点。在一些实施例中，保持UFDF以确保均匀的产品质量。在一些实施例中，保持UFDF以有利于下游加工。
在一些实施例中，重组碱性磷酸酶的TSAC在UFDF保持时间期间降低。在一些实施例中，TSAC下降与UFDF保持时间期间的蛋白质浓度、时间长度和/或温度相关。
在一些实施例中，UFDF保持时间的开始是在渗滤完成之后立即开始的。在一些实施例中，UFDF保持时间的开始是在过滤步骤结束之后立即开始的。在一些实施例中，UFDF保持时间的开始是在UF/DF结束之后立即开始的。在一些实施例中，UFDF保持时间的开始是在UF/DF步骤结束时再循环完成之后立即开始的。在一些实施例中，UFDF保持时间的开始是在UF/DF产物过滤和转移完成之后立即开始的。
在一些实施例中，将UFDF稀释以实现所需的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约1.0g/L至约6.0g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约1.7g/L至约5.3g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约1.8g/L至约5.0g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约2.0g/L至约5.0g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约1.8g/L至约4.3g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约2.3g/L至约4.3g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约3.0g/L至约4.5g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约3.3g/L至约4.1g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约1.0g/L、约1.1g/L、约1.2g/L、约1.3g/L、约1.4g/L、约1.5g/L、约1.6g/L、约1.7g/L、约1.8g/L、约1.9g/L、2.0g/L、约2.1g/L、约2.2g/L、约2.3g/L、约2.4g/L、约2.5g/L、约2.6g/l、约2.7g/L、约2.8g/L、约2.9g/L、约3.0g/L、约3.1g/L、约3.2g/L、约3.3g/L、约3.4g/L、约3.5g/L、约3.6g/L、约3.7g/L、约3.8g/L、约3.9g/L、约4.0g/L、约4.1g/L、约4.2g/L、约4.3g/L、约4.4g/L或约4.5g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约2.3g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约3.1g/L的蛋白质浓度。在一些实施例中，UFDF具有约3.7g/L的蛋白质浓度。
在一些实施例中，将UFDF保持约1小时至约60小时。例如，可以将UFDF保持约1小时(或更短时间)至约10小时(例如，2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时)。在一些实施例中，将UFDF保持约10小时至约50小时。在一些实施例中，将UFDF保持约12小时至约48小时。在一些实施例中，将UFDF保持约14小时至约42小时。在一些实施例中，将UFDF保持约17小时至约34小时。在一些实施例中，将UFDF保持约19小时至约33小时。在一些实施例中，将UFDF保持约25至约38小时。在一些实施例中，将UFDF保持约29至约35小时。在一些实施例中，将UFDF保持约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时或约20小时。在一些实施例中，将UFDF保持约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时或约35小时。在一些实施例中，将UFDF保持约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时或约48小时。在一些实施例中，将UFDF保持约14至20小时。在一些实施例中，将UFDF保持约28至34小时。在一些实施例中，将UFDF保持约42至48小时。
如上所述，在过滤步骤(例如，UFDF)期间的保持时间取决于在细胞生长期间(例如，约第6天至约第10天，例如，约第6天至约第8天，例如，在约第7天)获得的TSAC浓度。例如，如果该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持小于约9小时。如果该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约10小时至约14小时。如果该等分试样具有约2.8mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约23小时至约27小时。如果该等分试样具有大于约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约38小时至约42小时。在一些实施例中，该等分试样的TSAC浓度可以小于约2.5mol/mol，并且过滤步骤保持小于约9小时。可替代地，该等分试样的TSAC浓度可以是约2.5mol/mol至约2.7mol/mol，并且过滤步骤保持约10小时至约14小时。
在一个替代性实施例中，如果该等分试样具有小于或等于约2.3mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约18+/-4小时。如果该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.1mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约32+/-4小时。如果该等分试样具有大于或等于约3.2mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约44+/-4小时。
在另一个替代性实施例中，如果该等分试样具有小于约2.4mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约17+/-3小时。如果该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约31+/-3小时。如果该等分试样具有大于约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约45+/-3小时。
在一些实施例中，将UFDF保持在约10℃至约30℃的温度下。在一些实施例中，将UFDF保持在约13℃至约27℃的温度下。在一些实施例中，将UFDF保持在约14℃至约26℃的温度下。在一些实施例中，将UFDF保持在约15℃至约26℃的温度下。在一些实施例中，将UFDF保持在约15℃至约25℃的温度下。在一些实施例中，将UFDF保持在约19℃至约25℃的温度下。在一些实施例中，将UFDF保持在约22℃的温度下。在一些实施例中，在保持时间结束时储存UFDF，直至进行进一步的下游加工步骤。在一些实施例中，在快速冷冻之后将UFDF储存在-80℃下。
在一些实施例中，至少一个额外的纯化步骤还包括病毒灭活步骤。在一些实施例中，病毒灭活步骤包括溶剂/洗涤剂病毒灭活工艺以对病毒颗粒进行化学灭活。示例性溶剂/洗涤剂可以包含10％聚山梨酯80、3％ TNBP、50mM磷酸钠和100mM NaCl。
色谱法
在该方法的一些实施例中，将UFDF经受至少一个色谱法步骤以获得部分纯化的重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，将UFDF经受至少一个色谱法步骤以获得部分纯化的重组碱性磷酸酶，其中该重组碱性磷酸酶具有约0.9mol/mol至约3.0mol/mol的总唾液酸含量(TSAC)。在一些实施例中，进行至少一个色谱法步骤以进一步纯化产物和/或分离杂质/污染物。在一些实施例中，该至少一个色谱法步骤是蛋白质色谱法。在一些实施例中，该蛋白质色谱法是凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法(RP)、亲和色谱法、膨胀床吸附(EBA)、混合模式色谱法和/或疏水相互作用色谱法(HIC)。在一些实施例中，该蛋白质色谱法是亲和色谱法。在一些实施例中，该蛋白质色谱法是蛋白A色谱法。在一些实施例中，该蛋白A色谱法捕获产物(例如，碱性磷酸酶，诸如阿斯福酶α)。例如，可以使用GE HealthcareMab Select SuRe蛋白A色谱法的工艺。蛋白A色谱法中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如平衡/洗涤缓冲液(例如，50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.50)、洗脱缓冲液(例如，50mMTris，pH 11.0)、再生缓冲液(例如，100mM柠檬酸钠、300mM NaCl、pH 3.2)、冲洗缓冲液、清洁溶液(例如，0.1M NaOH)等。
在一些实施例中，该至少一个色谱法步骤包括额外的色谱法和/或纯化步骤。在一些实施例中，该至少一个额外的色谱法步骤包括柱色谱法。在一些实施例中，该柱色谱法是凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法(RP)、亲和色谱法、膨胀床吸附(EBA)、混合模式色谱法和/或疏水相互作用色谱法(HIC)。在一些实施例中，该柱色谱法包括疏水相互作用色谱法(HIC)。在一些实施例中，该HIC使用丁基琼脂糖或丁基琼脂糖柱。丁基琼脂糖HIC工艺中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如加载稀释缓冲液/预平衡缓冲液(例如，50mM磷酸钠、1.4M硫酸钠、pH 7.50)、平衡缓冲液/洗涤缓冲液/洗脱缓冲液(例如，全部含有磷酸钠和硫酸钠)、再生缓冲液(例如，含有磷酸钠)等。丁基HIC工艺中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如加载稀释缓冲液/预平衡缓冲液(例如，10mM HEPES、2.0M硫酸铵、pH 7.50)、平衡缓冲液/一种或多种洗涤缓冲液/洗脱缓冲液(例如，全部含有磷酸钠或HEPES和硫酸铵)和再生缓冲液(例如，含有磷酸钠)。
在一些实施例中，该至少一个额外的纯化步骤包括额外的渗滤。在一些实施例中，该至少一个额外的色谱法和/或纯化步骤包括疏水相互作用色谱法和/或至少一个额外的渗滤步骤。在一些实施例中，该额外的渗滤步骤是在疏水相互作用色谱法步骤之后进行的。在一些实施例中，进行该额外的渗滤步骤以用于产物浓缩和/或缓冲液交换。此工艺中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如平衡缓冲液(例如，20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 6.75)、渗滤缓冲液(20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 6.75)等。
在一些实施例中，进行该至少一个额外的色谱法和/或纯化步骤以获得具有约0.5mol/mol至约4.0mol/mol的TSAC的重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，进行该至少一个额外的色谱法和/或纯化步骤以获得具有约0.9mol/mol至约3.9mol/mol的TSAC的重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，进行该至少一个额外的色谱法和/或纯化步骤以获得具有约1.1mol/mol至约3.2mol/mol的TSAC的重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，进行该至少一个额外的色谱法和/或纯化步骤以获得具有约1.4mol/mol至约2.6mol/mol的TSAC的重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，进行该至少一个额外的色谱法和/或纯化步骤以获得具有约1.2mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC的重组碱性磷酸酶。在一些实施例中，进行该至少一个额外的色谱法步骤以获得具有约0.8mol/mol、约0.9mol/mol、1.0mol/mol、约1.1mol/mol、约1.2mol/mol、约1.3mol/mol、约1.4mol/mol、约1.5mol/mol、约1.6mol/mol、约1.7mol/mol、约1.8mol/mol、约1.9mol/mol、约2.0mol/mol、约2.1mol/mol、约2.2mol/mol、约2.3mol/mol、约2.4mol/mol、约2.5mol/mol、约2.6mol/mol、约2.7mol/mol、约2.8mol/mol、约2.9mol/mol、约3.0mol/mol、约3.1mol/mol、约3.2mol/mol、约3.3mol/mol、约3.4mol/mol、约3.5mol/mol、约3.6mol/mol、约3.7mol/mol、约3.8mol/mol、约3.9mol/mol或约4.0mol/mol的TSAC的重组碱性磷酸酶。
额外的下游工艺
在一些实施例中，除了至少一个纯化步骤、额外的纯化步骤、至少一个色谱法步骤和/或额外的色谱法步骤之外，还进行额外的下游工艺。在一些实施例中，该额外的下游工艺进一步纯化产物，例如重组碱性磷酸酶。
在一些实施例中，该额外的下游工艺包括病毒减少过滤工艺以进一步去除任何病毒颗粒。在一些实施例中，该病毒减少过滤工艺是纳滤。
在一些实施例中，该额外的下游工艺包括至少一个另外的色谱法步骤。在一些实施例中，该至少一个另外的色谱法步骤是蛋白质色谱法。在一些实施例中，该蛋白质色谱法是凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法(RP)、亲和色谱法、膨胀床吸附(EBA)、混合模式色谱法和/或疏水相互作用色谱法(HIC)。在一些实施例中，第三色谱法步骤是混合模式色谱法，诸如粘附琼脂糖色谱法。可商购获得的混合模式材料包括例如含有烃基胺配体的树脂(例如，来自纽约州华盛顿港颇尔公司(Pall Corporation)的PPAHypercel和HEAHypercel)，其允许在中性或微碱性pH下通过疏水和静电力的组合进行结合，并且在低pH下通过静电荷排斥进行洗脱(参见Brenac等人,2008J Chromatogr A.[色谱杂志A]1177:226-233)；含有4-巯基-乙基-吡啶配体的树脂(MEP Hypercel，颇尔公司)，其通过芳香族残基实现疏水相互作用，并且硫原子通过亲硫相互作用促进靶蛋白的结合(Lees等人,2009Bioprocess Int.[国际生物工艺]7:42-48)；含有具有氢键基团的配体和离子基团附近的芳香族残基的树脂，诸如/>MMC混合模式色谱法和/>粘附琼脂糖色谱法(通用医疗公司，阿默舍姆，英国)，其导致蛋白质在不同电导率下的耐盐吸附(Chen等人,2010JChromatogr A.[色谱杂志A]1217:216-224)；和其他已知的色谱材料，诸如具有染料配体的亲和树脂、羟基磷灰石和一些离子交换树脂(包括但不限于AmberliteCG 50(罗门哈斯公司(Rohm&Haas)，费城，宾夕法尼亚州)或Lewatit CNP 105(朗盛集团，科隆，特拉华州))。对于示例性琼脂糖HIC色谱法步骤，此工艺中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如预平衡缓冲液(例如，0.5M磷酸钠，pH 6.00)、平衡/洗涤缓冲液(例如，20mM磷酸钠、440mM NaCl、pH 6.50)、加载滴定缓冲液(例如，20mM磷酸钠、3.2M NaCl、pH 5.75)、池稀释缓冲液(例如，25mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.40)和再生缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH3.20)。
在一些实施例中，额外的下游工艺包括用于病毒清除的病毒过滤步骤。在一些实施例中，病毒过滤步骤通过尺寸排阻色谱法进行。此工艺中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如使用前和生产后冲洗缓冲液(例如，20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH6.75)。
在一些实施例中，额外的下游工艺包括配制工艺。在一些实施例中，该配制工艺包括至少一个进一步的超滤和/或渗滤，用于进一步浓缩和/或缓冲液交换。此工艺中使用的示例性缓冲液和溶液包括例如过滤器冲洗/平衡/渗滤/回收缓冲液(例如，25mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.40)。
在一些实施例中，额外的下游工艺包括批量填充工艺(bulk fill process)。在一些实施例中，该批量填充工艺包括无菌过滤。用于无菌填充的示例性过滤器是Millipak60或Equivalent sized PVDF过滤器(EMD密理博公司(EMD Millipore)，比尔里卡，马萨诸塞州)。
在一些实施例中，如本文披露的用于从培养细胞产生、纯化和/或分离碱性磷酸酶的步骤进一步包括选自下组的步骤中的至少一个，该组由以下组成：收获澄清工艺(或从细胞培养物中去除完整细胞和细胞碎片的类似工艺)、超滤(UF)工艺(或浓缩所产生的碱性磷酸酶的类似工艺)、渗滤(DF)工艺(或改变或稀释包含从先前工艺产生的碱性磷酸酶的缓冲液的类似工艺)、病毒灭活工艺(或灭活或去除病毒颗粒的类似工艺)、亲和捕获工艺(或捕获所产生的碱性磷酸酶并将其与缓冲液/溶液组分的剩余部分分离的任一种色谱方法)、配制工艺和批量填充工艺。在一个实施例中，如本文披露的用于从培养细胞产生、纯化和/或分离碱性磷酸酶的步骤至少包括收获澄清工艺(或从细胞培养物中去除完整细胞和细胞碎片的类似工艺)、收获后超滤(UF)工艺(或浓缩所产生的碱性磷酸酶的类似工艺)、收获后渗滤(DF)工艺(或改变或稀释包含从先前工艺产生的碱性磷酸酶的缓冲液的类似工艺)、溶剂/洗涤剂病毒灭活工艺(或化学灭活病毒颗粒的类似工艺)、中间体纯化工艺(诸如疏水相互作用色谱法(HIC)或捕获所产生的碱性磷酸酶并将其与缓冲液/溶液组分的剩余部分分离的任一种色谱方法)、HIC后UF/DF工艺(或对所产生的碱性磷酸酶进行浓缩和/或缓冲液交换的类似工艺)、病毒减少过滤工艺(或进一步去除任何病毒颗粒或其他杂质或污染物的类似工艺)；混合模式色谱法(诸如粘附琼脂糖色谱法或进一步纯化和/或浓缩所产生的碱性磷酸酶的类似工艺)、配制工艺和批量填充工艺。在一个实施例中，本文提供的方法的分离步骤进一步包括收获澄清、超滤、渗滤、病毒灭活、亲和捕获、HIC色谱法、混合模式色谱法及其组合中的至少一种。图1是重组碱性磷酸酶阿斯福酶α的生产工艺的实施例的示例性说明。
在一些实施例中，本披露提供了一种用于通过哺乳动物细胞培养控制含有总唾液酸含量(TSAC)的重组蛋白中的TSAC的方法，该方法包括至少一个纯化步骤和至少一个色谱法步骤。在一些实施例中，本披露提供了一种用于控制产生重组蛋白的哺乳动物细胞培养物中的糖苷酶活性的方法，该方法包括至少一个纯化步骤和至少一个色谱法步骤。在一些实施例中，该至少一个纯化步骤包括过滤、离心、收获澄清、过滤、超滤、渗滤、病毒灭活、亲和捕获及其组合中的至少一种。在一些实施例中，该至少一个色谱法步骤包括蛋白质色谱法。在一些实施例中，该蛋白质色谱法是凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法(RP)、亲和色谱法、膨胀床吸附(EBA)、混合模式色谱法和/或疏水相互作用色谱法(HIC)。在一些实施例中，该纯化步骤和色谱法步骤是超滤/渗滤和蛋白A色谱法。
在制造和纯化后，该工艺可以产生具有受控唾液酸化范围的原料药(BDS)。这些方法可以产生BDS，其中TSAC浓度被控制至约1.2mol/mol至约3.0mol/mol(例如，约1.6mol/mol至约2.4mol/mol)的范围。例如，BDS可以具有约1.0mol/mol、约1.1mol/mol、约1.2mol/mol、约1.3mol/mol、约1.4mol/mol、约1.5mol/mol、约1.6mol/mol、约1.7mol/mol、约1.8mol/mol、约1.9mol/mol、约2.0mol/mol、约2.1mol/mol、约2.2mol/mol、约2.3mol/mol、约2.4mol/mol、约2.5mol/mol、约2.6mol/mol、约2.7mol/mol、约2.8mol/mol、约2.9mol/mol或约3.0mol/mol的TSAC浓度。
在一些实施例中，BDS被冻干和/或置于小瓶中，例如用于分发。
碱性磷酸酶(ALP)
本披露涉及在重组细胞培养物中制造碱性磷酸酶蛋白(例如，阿斯福酶α)。该碱性磷酸酶蛋白包括任何多肽或分子，其包含具有至少一些碱性磷酸酶活性的多肽。在各种实施例中，本文披露的碱性磷酸酶包括具有碱性磷酸酶功能的任何多肽，这些碱性磷酸酶功能可以包括本领域已知的碱性磷酸酶的任何功能，诸如针对天然底物(包括磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸盐(PPi)和5'-磷酸吡哆醛(PLP))的酶促活性。
在某些实施例中，在通过本文披露的方法产生并且然后纯化之后，这种碱性磷酸酶蛋白可以用于治疗或预防碱性磷酸酶相关的疾病或障碍。例如，这种碱性磷酸酶蛋白可以施用于具有降低和/或功能障碍的内源性碱性磷酸酶，或具有过表达(例如，高于正常水平)的碱性磷酸酶底物的受试者。在一些实施例中，本披露中的碱性磷酸酶蛋白是重组蛋白。在一些实施例中，该碱性磷酸酶蛋白是融合蛋白。在一些实施例中，本披露中的碱性磷酸酶蛋白特异性靶向细胞类型、组织(例如，结缔组织、肌肉、神经或上皮组织)或器官(例如，肝脏、心脏、肾脏、肌肉、骨骼、软骨、韧带、肌腱等)。例如，这种碱性磷酸酶蛋白可以包含全长碱性磷酸酶(ALP)或至少一种碱性磷酸酶(ALP)的片段。在一些实施例中，该碱性磷酸酶蛋白包含与骨靶向部分(例如，如下所述的带负电荷的肽)连接的可溶性ALP(sALP)。在一些实施例中，该碱性磷酸酶蛋白包含与免疫球蛋白部分(全长或片段)连接的可溶性ALP(sALP)。例如，这种免疫球蛋白部分可以包含片段可结晶区(Fc)。在一些实施例中，该碱性磷酸酶蛋白包含与骨靶向部分和免疫球蛋白部分(全长或片段)两者连接的可溶性ALP(sALP)。关于本文披露的碱性磷酸酶蛋白的更详细说明，参见PCT公开号WO 2005/103263和WO 2008/138131，两者的传授内容通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文所述的碱性磷酸酶蛋白包含选自下组的结构中的任一种，该组由以下组成：sALP-X、X-sALP、sALP-Y、Y-sALP、sALP-X-Y、sALP-Y-X、X-sALP-Y、X-Y-sALP、Y-sALP-X和Y-X-sALP，其中X包含如本文所述的骨靶向部分，并且Y包含如本文所述的免疫球蛋白部分。在一些实施例中，该碱性磷酸酶蛋白包含W-sALP-X-Fc-Y-Dn/En-Z的结构，其中W不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；X不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Y不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Z不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Fc是片段可结晶区；Dn/En是聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合，其中n＝8-20；并且sALP是可溶性碱性磷酸酶(ALP)。在一些实施例中，Dn/En是聚天冬氨酸序列。例如，Dn可以是聚天冬氨酸序列，其中n是8与20(包括两者)之间的任何数值(例如，n可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)(SEQ ID NO:3)。在一个实施例中，Dn是D10(SEQ IDNO:2)或D16(SEQ ID NO:4)。在一些实施例中，Dn/En是聚谷氨酸序列。例如，En可以是聚谷氨酸序列，其中n是8与20(包括两者)之间的任何数值(例如，n可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)(SEQ ID NO:5)。在一个实施例中，En是E10(SEQ ID NO:6)或E16(SEQID NO:7)。
例如，此类sALP可以与免疫球蛋白分子的全长或片段(例如，片段可结晶区(Fc))融合。在一些实施例中，该重组多肽包含W-sALP-X-Fc-Y-Dn-Z的结构，其中W不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；X不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Y不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Z不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Fc是片段可结晶区；Dn是聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合，其中n＝10或16；并且所述sALP是可溶性碱性磷酸酶。在一个实施例中，n＝10。在另一个实施例中，所述多肽中不存在W和Z。在一些实施例中，所述Fc包含CH2结构域、CH3结构域和铰链区。在一些实施例中，所述Fc是选自由IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3和IgG-4组成的组的免疫球蛋白的恒定结构域。在一个实施例中，所述Fc是免疫球蛋白IgG-1的恒定结构域。在一个特别实施例中，所述Fc包含如SEQ IDNO:1的D488-K714中列出的序列。
在一些实施例中，本文披露的碱性磷酸酶蛋白包含W-sALP-X-Fc-Y-Dn-Z的结构，其中W不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；X不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Y不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Z不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；Fc是片段可结晶区；Dn是聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合，其中n＝10或16；并且所述sALP是可溶性碱性磷酸酶。这种sALP能够催化磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸盐(PPi)和5'-磷酸吡哆醛(PLP)中的至少一种的裂解。在各种实施例中，本文披露的sALP能够催化无机焦磷酸盐(PPi)的裂解。这种sALP可以包含没有C末端糖脂锚(GPI)的碱性磷酸酶(ALP)的活性锚定形式的所有氨基酸。这种ALP可以是组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP)、胎盘碱性磷酸酶(PALP)、生殖细胞碱性磷酸酶(GCALP)和肠碱性磷酸酶(IAP)或本文披露的它们的嵌合或融合形式或变体中的至少一种。在一个特别实施例中，该ALP包括组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP)。在另一个实施例中，本文披露的sALP由编码多肽的多核苷酸编码，该多肽包含如SEQ ID NO:1的L1-S485中列出的序列。在又一个实施例中，本文披露的sALP包含如SEQ ID NO:1的L1-S485中列出的序列。
在一个实施例中，该碱性磷酸酶蛋白包含TNALP-Fc-D10(SEQ ID NO:1)的结构。天冬酰胺(N)残基(例如N 123、213、254、286、413和564)对应于潜在的糖基化位点。氨基酸残基(L486-K487和D715-I716)分别对应于sALP与Fc以及Fc与D10(SEQ ID NO:2)结构域之间的接头。
在此实施例中，该多肽由五个部分构成。含有氨基酸L1-S485的第一部分(sALP)是人组织非特异性碱性磷酸酶的可溶性部分，其具有催化功能。第二部分含有氨基酸L486-K487作为接头。含有氨基酸D488-K714的第三部分(Fc)是含有铰链、CH2和CH3结构域的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的Fc部分。第四部分含有D715-I716作为接头。第五部分含有氨基酸D717-D726(D10(SEQ ID NO:2))，这是一种骨靶向部分，其允许阿斯福酶α与骨的矿物相结合。另外，每条多肽链含有六个潜在的糖基化位点和十一个半胱氨酸(Cys)残基。Cys102作为游离半胱氨酸存在。每条多肽链在Cys122与Cys184、Cys472与Cys480、Cys528与Cys588以及Cys634与Cys692之间含有四个链内二硫键。两条多肽链通过两条链上的Cys493与两条链上的Cys496之间的两个链间二硫键连接。除了这些共价结构特征之外，哺乳动物碱性磷酸酶被认为在每条多肽链上具有四个金属结合位点，包括两个锌位点、一个镁位点和一个钙位点。
ALP有四种已知的同工酶，即以下进一步描述的组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP)、胎盘碱性磷酸酶(PALP)(例如，如在GenBank登录号NP_112603和NP_001623中所述)、生殖细胞碱性磷酸酶(GCALP)(例如，如在GenBank登录号P10696中所述)和肠碱性磷酸酶(IAP)(例如，如在GenBank登录号NP_001622中所述)。这些酶具有非常相似的三维结构。它们的每个催化位点含有四个金属结合结构域，用于酶促活性所需的金属离子，包括两个Zn和一个Mg。这些酶催化磷酸单酯的水解，并且还在高浓度磷酸受体的存在下催化转磷酸化反应。ALP的三种已知天然底物(例如，TNALP)包括磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸盐(PPi)和5'-磷酸吡哆醛(PLP)(Whyte等人,J Clin Invest[临床研究杂志]95:1440-1445,1995)。这些同工酶之间的比对在WO 2008/138131的图30中示出，该文献的传授内容通过援引以其全文并入本文。
本披露中的碱性磷酸酶蛋白可以包含单独的或组合的任何ALP蛋白的二聚体或多聚体。还可以产生嵌合ALP蛋白或融合蛋白，诸如Kiffer-Moreira等人PLoS One9:e89374,2014中所述的嵌合ALP蛋白，该文献的全部披露内容通过援引以其全文并入本文。
在一个特别实施例中，本文披露的碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸编码，该多肽包含如SEQ ID NO:1中列出的序列。在另一个特别实施例中，本文披露的碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸编码，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，本文披露的碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸编码，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有95％或99％同一性的序列。在另一个实施例中，本文披露的碱性磷酸酶包含如SEQ ID NO:1中列出的序列。
TNALP
如以上所指示，TNALP是一种膜结合蛋白，其通过糖脂锚定至其C末端(对于人TNALP，参见UniProtKB/Swiss-Prot登录号P05186)。此糖脂锚(GPI)是在去除疏水性C末端之后翻译后添加的，其既作为临时膜锚又作为添加GPI的信号。因此，在一个实施例中，可溶性人TNALP包括TNALP，其中疏水性C末端序列的第一氨基酸，即丙氨酸，被终止密码子替代。如此形成的可溶性TNALP(本文被称为sTNALP)含有天然锚定形式的TNALP的所有氨基酸，这些氨基酸是形成催化位点所必需的，但缺乏GPI膜锚。已知的TNALP包括例如人TNALP[GenBank登录号NP-000469、AAI10910、AAH90861、AAH66116、AAH21289和AAI26166]；恒河猴TNALP[GenBank登录号XP-001109717]；大鼠TNALP[GenBank登录号NP_037191]；狗TNALP[GenBank登录号AAF64516]；猪TNALP[GenBank登录号AAN64273]、小鼠TNALP[GenBank登录号NP_031457]、牛TNALP[GenBank登录号NP_789828、NP_776412、AAM 8209和AAC33858]以及猫TNALP[GenBank登录号NP_001036028]。
如本文所用，术语“细胞外结构域”意指天然蛋白质的任何功能性细胞外部分(例如，没有肽信号)。保留原始氨基酸1至501(分泌时为18至501)、氨基酸1至502(分泌时为18至502)、氨基酸1至504(分泌时为18至504)或氨基酸1至505(分泌时为18-505)的重组sTNALP多肽具有酶促活性(参见Oda等人,1999J.Biochem[生物化学杂志]126:694-699)。这指示氨基酸残基可以从天然蛋白质的C末端去除，而不影响其酶促活性。此外，可溶性人TNALP可以包含一种或多种氨基酸取代，其中此类一种或多种取代不降低或至少不完全抑制sTNALP的酶促活性。例如，已知导致低磷酸酯酶症(HPP)的某些突变在PCT公开号WO2008/138131中列出并且应被避免以维持功能性sTNALP。
带负电荷的肽
本披露的碱性磷酸酶蛋白可以包含靶部分，其可以特异性地将碱性磷酸酶蛋白靶向至预先确定的细胞类型、组织或器官。在一些实施例中，这种预先确定的细胞类型、组织或器官是骨组织。这种骨靶向部分可以包括本领域已知的任何已知的多肽、多核苷酸或小分子化合物。例如，带负电荷的肽可以用作骨靶向部分。在一些实施例中，此类带负电荷的肽可以是聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合(例如，包含至少一种天冬氨酸和至少一种谷氨酸的多肽，诸如包含天冬氨酸和谷氨酸残基的组合的带负电荷的肽)。在一些实施例中，此类带负电荷的肽可以是D6(SEQ ID NO:8)、D7(SEQ ID NO:9)、D8(SEQ ID NO:10)、D9(SEQ IDNO:11)、D10(SEQ ID NO:2)、D11(SEQ ID NO:12)、D12(SEQ ID NO:13)、D13(SEQ ID NO:14)、D14(SEQ ID NO:15)、D15(SEQ ID NO:16)、D16(SEQ ID NO:4)、D17(SEQ ID NO:17)、D18(SEQ ID NO:18)、D19(SEQ ID NO:19)、D20(SEQ ID NO:20)或具有超过20个天冬氨酸的聚天冬氨酸。在一些实施例中，此类带负电荷的肽可以是E6(SEQ ID NO:21)、E7(SEQ IDNO:22)、E8(SEQ ID NO:23)、E9(SEQ ID NO:24)、E10(SEQ ID NO:6)、E11(SEQ ID NO:25)、E12(SEQ ID NO:26)、E13(SEQ ID NO:27)、E14(SEQ ID NO:28)、E15(SEQ ID NO:29)、E16(SEQ ID NO:7)、E17(SEQ ID NO:30)、E18(SEQ ID NO:31)、E19(SEQ ID NO:32)、E20(SEQID NO:33)或具有超过20个谷氨酸的聚谷氨酸。在一些实施例中，此类带负电荷的肽可以包含选自由D10(SEQ ID NO:2)至D16(SEQ ID NO:4)或E10(SEQ ID NO:6)至E16(SEQ ID NO:7)组成的组中的至少一种。
间隔子
在一些实施例中，本披露的碱性磷酸酶蛋白包含在ALP部分与靶向部分之间的间隔序列。在一个实施例中，这种碱性磷酸酶蛋白包含在ALP(例如，TNALP)部分与带负电荷的肽靶向部分之间的间隔序列。这种间隔子可以是任何多肽、多核苷酸或小分子化合物。在一些实施例中，这种间隔子可以包含片段可结晶区(Fc)片段。可用的Fc片段包括包含铰链以及CH2和CH3结构域的IgG的Fc片段。这种IgG可以是lgG-1、lgG-2、lgG-3、lgG-3和lgG-4或其任何组合中的任一种。
不受这种理论的限制，据信骨靶向sALP融合蛋白(例如，阿斯福酶α)中使用的Fc片段充当间隔子，鉴于sTNALP-Fc-D10的表达高于sTNALP-D10的表达，该间隔子允许蛋白质更有效地折叠。一种可能的解释是，Fc片段的引入减轻了由在本文例示的sALP序列的C末端处添加的带高负电荷的D10序列(SEQ ID NO:2)的存在引起的排斥力。在一些实施例中，本文所述的碱性磷酸酶蛋白包含选自下组的结构，该组由以下组成：sALP-Fc-D10、sALP-D10-Fc、D10-sALP-Fc、D10-Fc-sALP、Fc-sALP-D10和Fc-D10-sALP。在其他实施例中，以上结构中的D10(SEQ ID NO:2)被其他带负电荷的多肽(例如，D8(SEQ ID NO:10)、D16(SEQ ID NO:4)、E10(SEQ ID NO:6)、E8(SEQ ID NO:23)、E16(SEQ ID NO:7)等)取代。
用于本披露的可用的间隔子包括例如包含Fc的多肽，以及能够减轻由在sALP序列的C末端处添加的带高负电荷的骨靶向序列(例如，D10(SEQ ID NO:2))的存在引起的排斥力的亲水性和柔性多肽。
二聚体/四聚体
在特别实施例中，本披露的骨靶向sALP融合蛋白进行缔合以形成二聚体或四聚体。
在二聚体构型中，通过链间二硫键形成所施加的空间位阻可能阻止sALP结构域的缔合而缔合成正常细胞中存在的二聚体最小催化活性蛋白。
骨靶向sALP可以进一步任选地包含一个或多个额外的氨基酸：1)在带负电荷的肽(例如，骨标签)的下游；和/或2)在带负电荷的肽(例如，骨标签)与Fc片段之间；和/或3)在间隔子(例如，Fc片段)与sALP片段之间。例如，当用于产生骨靶向缀合物的克隆策略在这些位置中引入外源性氨基酸时，可能会发生这种情况。然而，应选择外源性氨基酸，以免提供额外的GPI锚定信号。所设计的序列被宿主细胞的转酰氨基酶裂解的可能性可以如Ikezawa,2002Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchored proteins.[糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白]Biol Pharm Bull.[生物与医药通报]25:409-17所述进行预测。
本披露还涵盖一种经翻译后修饰的融合蛋白，诸如通过糖基化(包括本文明确提及的那些糖基化)、乙酰化、酰胺化、阻断、甲酰化、γ-羧基谷氨酸羟基化、甲基化、磷酸化、吡咯烷酮羧酸和硫酸化。
阿斯福酶α
阿斯福酶α是一种可溶性Fc融合蛋白，其由两个TNALP-Fc-D10多肽组成，每个具有如SEQ ID NO:1中所示的726个氨基酸。每个多肽或单体由五个部分构成。含有氨基酸L1-S485的第一部分(sALP)是人组织非特异性碱性磷酸酶的可溶性部分，其具有催化功能。第二部分含有氨基酸L486-K487作为接头。含有氨基酸D488-K714的第三部分(Fc)是含有铰链、CH2和CH3结构域的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的Fc部分。第四部分含有D715-I716作为接头。第五部分含有氨基酸D717-D726(D10(SEQ ID NO:2))，这是一种骨靶向部分，其允许阿斯福酶α与骨的矿物相结合。另外，每条多肽链含有六个潜在的糖基化位点和十一个半胱氨酸(Cys)残基。Cys102作为游离半胱氨酸存在。每条多肽链在Cys122与Cys184、Cys472与Cys480、Cys528与Cys588以及Cys634与Cys692之间含有四个链内二硫键。两条多肽链通过两条链上的Cys493与两条链上的Cys496之间的两个链间二硫键连接。除了这些共价结构特征之外，哺乳动物碱性磷酸酶被认为在每条多肽链上具有四个金属结合位点，包括两个锌位点、一个镁位点和一个钙位点。
阿斯福酶α还可以如下表征。阿斯福酶α从N末端至C末端包含：(1)人组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P05186)的可溶性催化结构域，(2)人免疫球蛋白G1 Fc结构域(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01857)以及(3)德卡-天冬氨酸肽(D10(SEQ ID NO:2))，其用作骨靶向结构域(Nishioka等人2006Mol Genet Metab[分子遗传与代谢]88:244-255)。该蛋白由两个主要蛋白质序列缔合成同源二聚体。此融合蛋白含有6个已确认的复杂N-糖基化位点。这些N-糖基化位点中的五个位于sALP结构域上，并且一个位于Fc结构域上。阿斯福酶α上存在的另一个重要的翻译后修饰是存在使酶和Fc结构域结构稳定的二硫键。每个单体存在总计4个分子内二硫键，并且二聚体中存在2个分子间二硫键。碱性磷酸酶结构域的一个半胱氨酸是游离的。
阿斯福酶α已被用作治疗磷酸酯酶症(HPP)的酶替代疗法。在患有HPP的患者中，编码TNSALP的基因中的一个或多个功能丧失突变导致TNSALP酶促活性不足，从而导致底物(诸如无机焦磷酸盐(PPi)和5’-磷酸吡哆醛(PLP))的循环水平升高。向患有HPP的患者施用阿斯福酶α使PPi裂解，释放无机磷酸盐与钙组合，从而促进羟基磷灰石晶体形成和骨骼矿化，并且恢复正常的骨骼表型。关于阿斯福酶α及其治疗用途的更多细节，参见PCT公开号WO2005/103263和WO 2008/138131
在一些实施例中，该方法提供了一种碱性磷酸酶(阿斯福酶α)，通过最小化对活性具有潜在负面影响的金属离子的浓度或增加对活性具有潜在积极影响的金属离子的浓度或如本文所述的两者，该碱性磷酸酶相对于通过常规手段产生的碱性磷酸酶具有所产生的碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的改善酶促活性。活性可以通过任何已知的方法测量。此类方法包括例如体外和体内测定，测量所产生的碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)对碱性磷酸酶的底物(诸如磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸盐(PPi)和5'-磷酸吡哆醛(PLP))的酶促活性。
在一些实施例中，本文披露的碱性磷酸酶由在高严格条件下与第二多核苷酸杂交的第一多核苷酸编码，该第二多核苷酸包含与第三多核苷酸完全互补的序列，该第三多核苷酸编码包含如SEQ ID NO:1中列出的序列的多肽。此类高严格条件可以包括：在68℃下在6x SSC、5x Denhardt试剂、0.5％ SDS和100mg/ml变性片段化鲑鱼精DNA中进行预杂交和杂交；以及在室温下在2x SSC和0.5％ SDS中洗涤10分钟；在室温下在2x SSC和0.1％ SDS中洗涤10分钟；以及在65℃下在0.1x SSC和0.5％SDS中洗涤5分钟。
实例
实例1：阿斯福酶α制造工艺
示例性阿斯福酶α原料药(BDS)制造工艺在图1中示出。
以下详细描述了一种阿斯福酶α制造工艺，其中在生产生物反应器中在细胞培养发酵的第7天测量TSAC含量，并且用于确定下游收获后超滤/渗滤(UF/DF1)步骤的保持时间。这一增加的步骤提供了增加的质量控制，其中最终TSAC含量被维持在先前被批准用于人类的可接受范围内。制造工艺和目标TSAC范围提供了具有适当酶促活性、治疗有效半衰期和批次间可重复性的最终药物产品。
工艺内TSAC控制的历史
唾液酸是一种已知的糖基化形式，与在生理条件下影响分子的半衰期的阿斯福酶α相关联。需要将TSAC水平控制在1.2–3.0mol唾液酸/mol阿斯福酶α单体(mol/mol)的可接受范围内，以提供具有适当功效、治疗有效半衰期和批次间可重复性的最终药物产品。在生产生物反应器(细胞培养液，CCF，图1中的步骤2)中生成TSAC，并且收获的细胞培养液(HCCF，图1中的步骤3)中的TSAC在蛋白AMabSelectTM SuReTM(ProA)色谱法步骤(图1中的步骤5b)之前的收获后超滤/渗滤(UF/DF1)(图1中的步骤4)池保持期间降低。
UF/DF1池保持是BDS TSAC的重要工艺内控制步骤。先前的小规模表征研究表明，收获后UF/DF1保持时间、蛋白质浓度和温度显著影响UF/DF1池保持期间TSAC降低的程度。
制造TSAC数据综述
在制造期间在两个步骤(ProA池和BDS释放)处测量TSAC。对于批次的子集，还在生产生物反应器步骤(第7天和第10天，被称为CCF)、收获步骤(HCCF)和HIC步骤处测量了TSAC。表1中列出了20,000L批次的TSAC数据。制造数据的综述确认了TSAC从HCCF步骤(图1中的步骤3)至ProA步骤(图1的步骤5b)降低，如表1列出和图2所示。
观察到BDS的TSAC结果具有接近规范下限的趋势，包括三个超出规范(OOS)的结果(#8、#9和#11)。上游工艺(特别是生产生物反应器)的可变性被鉴定为BDS OOS TSAC的可能原因。另外，生产生物反应器下游的TSAC控制(UF/DF1保持)的设计对于应对这种上游可变性并不是最佳的。
/>
增强TSAC控制策略
开发了一种增强TSAC控制策略。该增强策略包括监测生产生物反应器中的TSAC水平并相应地调节UF/DF1工艺参数，以改进BDS的TSAC的工艺控制和能力。特别地，在第7天从生产生物反应器样品测量的TSAC(称为“第7天TSAC”)可以在UF/DF1单元操作之前提供TSAC的估计值。第7天TSAC已作为工艺的工艺内控制(IPC)被引入，并且第7天TSAC的相关作用限值鉴定了每个批次的目标UF/DF1保持时间。由于样品制备(小规模蛋白A纯化)和TSAC测定持续时间目前排除了在UF/DF1操作和保持开始之前对TSAC进行实际在线测量，因此第7天TSAC被用作细胞培养结束或收获后TSAC结果的替代物。为了响应于生物反应器中特定批次的TSAC生产来优化UF/DF1保持策略，调整了蛋白质浓度目标和范围。UF/DF1保持温度未改变。
表2中总结了UF/DF1操作中为进一步增强TSAC控制而引入的变化。第7天TSAC作用限值在表3中列出。使用从小规模UF/DF1表征研究生成的预测模型以及从制造规模批次收集的额外TSAC数据，优化了参数和属性范围以及IPC作用限值。
表2：增强TSAC控制的总结
表3：增强TSAC控制的第7天TSAC和UF/DF1保持时间目标
TSAC控制策略的更新在生产生物反应器中的细胞培养工艺期间生成的更宽TSAC范围内改进了BDS的TSAC的工艺控制和能力。使用开发批次来微调UF/DF1保持时间，证明了第7天TSAC工艺内控制的制造操作可行性，并证明了改进的控制策略的有效性。
成功地将四个初始开发批次执行到BDS(批次16、17、18和19；参见表1以及图2和图3)。使用小规模蛋白A色谱法纯化来自生产生物反应器的第7天样品，并且然后测试TSAC。对于四个开发批次中的三个，使用第7天TSAC结果来基于类似于表3中指定的那些的预定义作用限值来调节UF/DF1保持时间。以固定保持时间目标执行一个批次(17)，以证明低于先前定义范围的最短保持时间的操作可行性。通过增强TSAC控制策略制造额外三个批次至BDS(批次20至22)。表1中总结了具有增强TSAC控制的所有批次的TSAC和UF/DF1工艺数据。对于所有批次，UF/DF1温度、蛋白质浓度和保持时间均在针对增强控制策略定义的可接受范围内(表2)。实际UF/DF1保持时间在针对第7天作用限值定义的目标范围内(表3)，第一个开发批次16除外，它以不同的第7天作用限值执行。
与先前批次相比，来自生产生物反应器(CCF)和收获后(HCCF)(图2中所示的HCCF)的TSAC在增强TSAC控制批次中的趋势相似，并且第7天TSAC近似于UF/DF1单元操作之前的TSAC(HCCF TSAC)(表1，图2)。没有第7天TSAC控制的批次1至15(n＝15)的平均BDS TSAC是1.3mol/mol，与之相比利用第7天TSAC控制的批次(批次17至22，n＝6)的平均BDS TSAC是2.1mol/mol(范围1.9至2.4mol/mol)。与先前批次相比，批次17至22的BDS TSAC偏移更接近规范范围的中点，与使用增强TSAC控制针对这些批次执行的UF/DF1保持条件一致并说明了其功效(表1以及图2和图3)。虽然这些批次中来自生产生物反应器(第7天)的TSAC缩短了目标UF/DF1保持时间，但增强TSAC控制策略可以动态地对来自生产生物反应器的一系列TSAC输出做出响应。如果在第7天测量到更高的TSAC输出，则增强策略会鉴定并定义适当的目标UF/DF1保持时间，以便将BDS的TSAC偏移至更接近规范范围的中点并避免OOS结果。
除了证明增强TSAC控制策略的可行性和功效之外，来自批次17至22的BDS符合放行规范的所有标准，从而确认对工艺性能或其他产品质量属性没有不利影响。
其他实施例
本文中引用的所有参考文献均通过援引以其全文并入。虽然已经出于清晰理解的目的通过说明和实例详细描述了前述披露内容，但是对于本领域技术人员明显的是，将进行某些微小改变和修改。因此，描述和实例不应解释为限制本披露的范围。
仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本披露不限于所示和所述的精确细节，对于本领域技术人员而言明显的变化将包括在由权利要求书所限定的披露内容内。
除非另外指示，在所有情况下，表示在说明书和权利要求书中使用的组分的量、分子量等的所有数字都要理解为由术语“约”修饰。因此，除非另外指示相反含义，在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，可以根据本披露所寻求获得的所需特性而变化。至少，并不是试图将等同原则限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
虽然阐述本披露的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在特别实例中阐述的数值是尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地含有一个范围，该范围必然是其各自的测试测量中存在的标准偏差所产生的。
本文引用的所有专利、专利申请(包括临时专利申请)、出版物(包括专利出版物和非专利出版物)和电子可得材料(包括，例如提交到例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列，以及提交到例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)的完整披露通过援引并入。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本披露不限于所示和所述的精确细节，对于本领域技术人员而言显而易见的变化将包含在由权利要求书所限定的实施例内。
序列表
<110> 阿雷克森制药公司（ALEXION PHARMACEUTICALS, INC.）
<120> 控制碱性磷酸酶制造期间的总唾液酸含量（TSAC）的方法
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<141>
<150> 63/105,052
<151> 2020-10-23
<160> 33
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 726
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala
1 5 10 15
Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr Asn
20 25 30
Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser
35 40 45
Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro
50 55 60
Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu
65 70 75 80
Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly
100 105 110
Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn
115 120 125
Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val
130 135 140
Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro
165 170 175
Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met
180 185 190
His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr
195 200 205
Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp Lys
225 230 235 240
Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg Thr
245 250 255
Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu
260 265 270
Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr
275 280 285
Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp
305 310 315 320
His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val
325 330 335
Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser Glu
340 345 350
Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe
355 360 365
Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met
370 375 380
Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn
385 390 395 400
Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met
405 410 415
Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu
420 425 430
Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys Gly
435 440 445
Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val Pro
450 455 460
His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His Cys
465 470 475 480
Ala Pro Ala Ser Ser Leu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
485 490 495
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
500 505 510
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
515 520 525
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
530 535 540
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
545 550 555 560
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
565 570 575
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
580 585 590
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
595 600 605
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
610 615 620
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
625 630 635 640
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
645 650 655
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
660 665 670
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
675 680 685
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
690 695 700
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Asp Asp Asp Asp
705 710 715 720
Asp Asp Asp Asp Asp Asp
725
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(20)
<223> 此序列可以涵盖8-20个残基
<400> 3
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
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Asp Asp Asp Asp
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
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Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(20)
<223> 此序列可涵盖8-20个残基
<400> 5
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
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Glu Glu Glu Glu
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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Asp
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<400> 23
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 24
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 25
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 26
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 27
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 28
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 29
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 31
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 32
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 33
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu
20

Claims (39)

1.一种产生重组碱性磷酸酶的方法，该方法包括：
(a)用表达重组碱性磷酸酶的细胞接种生物反应器；
(b)获得包含该重组碱性磷酸酶的水性培养基；
(c)在接种之后约第6天至约第10天从该水性培养基中获得等分试样；
(d)定量该等分试样中每摩尔该重组碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)摩尔浓度；
(e)收获该水性培养基；以及
(f)进行至少一个纯化步骤以获得原料药溶液(BDS)；
其中：
(i)
(1)该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持小于约9小时；
(2)该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约10小时至约14小时；
(3)该等分试样具有约2.8mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约23小时至约27小时；或者
(4)该等分试样具有大于约3.0mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约38小时至约42小时；或者
(ii)
(1)该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约5小时至约9小时；
(2)该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约16小时至约20小时；或者
(3)该等分试样具有大于约2.7mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约30小时至约34小时；或者
(iii)
(1)该等分试样具有小于或等于约2.3mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约14小时至约22小时；
(2)该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.1mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约28小时至约36小时；或者
(3)该等分试样具有大于或等于约3.2mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约40小时至约48小时。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括在接种之后约第7天从该水性培养基中获得该等分试样。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该过滤步骤包括超滤、渗滤或其组合。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中该哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该等分试样的TSAC浓度小于约2.5mol/mol，并且该过滤步骤保持小于约9小时。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该等分试样的TSAC浓度是约2.5mol/mol至约2.7mol/mol，并且该过滤步骤保持约10小时至约14小时。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该过滤步骤期间的该碱性磷酸酶浓度是约1.8g/L至约5.0g/L。
9.如权利要求8所述的方法，其中该过滤步骤期间的该碱性磷酸酶浓度是约1.8至约4.3g/L。
10.如权利要求9所述的方法，其中该过滤步骤期间的该碱性磷酸酶浓度是约2.3g/L、约3.1g/L或约3.7g/L。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该BDS的TSAC浓度是约1.2mol/mol至约3.0mol/mol。
12.如权利要求11所述的方法，其中该BDS的TSAC浓度是约1.6mol/mol至约2.4mol/mol。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该过滤步骤保持在恒定温度下。
14.如权利要求13所述的方法，其中该恒定温度是约15℃至约25℃。
15.如权利要求14所述的方法，其中该恒定温度是约19℃至约25℃。
16.如权利要求15所述的方法，其中该温度是约22℃。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该等分试样无菌地获得。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该等分试样是约1mL至约500mL。
19.如权利要求18所述的方法，其中该等分试样是约50mL至约300mL。
20.如权利要求19所述的方法，其中该等分试样是约100mL或约200mL。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括对该等分试样进行离心。
22.如权利要求21所述的方法，其中步骤(c)进一步包括从该等分试样中取出上清液。
23.如权利要求22所述的方法，其中步骤(c)进一步包括使用色谱柱从该上清液中纯化该碱性磷酸酶。
24.如权利要求23所述的方法，其中该色谱柱包括蛋白A柱，1mL HiTrap Protein A柱；600μl Protein A Robocolumn；或MabSelect Sure Protein A固相柱。
25.如权利要求24所述的方法，其中该蛋白A柱是MabSelect Sure Protein A柱。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括进行缓冲液交换。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括对该碱性磷酸酶进行浓缩。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括进行酸水解以释放该TSAC。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，该方法进一步包括对该碱性磷酸酶进行冻干。
30.如权利要求29所述的方法，该方法进一步包括将该碱性磷酸酶置于小瓶中。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中该生物反应器具有至少2L的体积。
32.如权利要求31所述的方法，其中该体积是至少10L。
33.如权利要求32所述的方法，其中该体积是至少1,000L。
34.如权利要求33所述的方法，其中该体积是至少10,000L。
35.如权利要求34所述的方法，其中该体积是约20,000L。
36.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中该培养基选自下组，该组由以下组成：302无血清培养基；CD DG44培养基；BD SelectTM培养基；SFM4CHO培养基；及其组合。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中该重组碱性磷酸酶包含W-sALP-X-Fc-Y-Dn-Z的结构，其中：
W不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
X不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
Y不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
Z不存在或者是至少一个氨基酸的氨基酸序列；
Fc是片段可结晶区；
Dn是聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合，其中n＝10或16；并且
sALP是可溶性碱性磷酸酶。
38.如权利要求37所述的方法，其中该重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO:1中列出的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
39.如权利要求37所述的方法，其中该重组碱性磷酸酶包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列或由其组成。
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