JP2023546682A - アルカリホスファターゼの製造中に総シアル酸含量（ｔｓａｃ）を制御する方法 - Google Patents

Abstract

対象とされるのは、発酵中の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）濃度を測定し、且つそれに応じて下流の作製ステップを調整することにより、最終生成物中のＴＳＡＣ濃度に対するより高精度の品質管理を提供する、組換えアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファを製造する方法である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１０５，０５２号明細書の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、且つ全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１０月１９日に作成され、０６０８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、且つ１５，２８６バイトのサイズである。

低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）は、機能的な組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の産生が不能になる重篤で極希少な遺伝性代謝障害である。それは、骨及び歯の低石灰化によって特徴付けられる非石灰化骨マトリックスの蓄積（例えば、くる病、骨軟化症）をもたらす。成長する骨が適切に石灰化しないとき、成長の障害により、関節及び骨の美観が損なわれる。この結果は、したがって、運動能力、呼吸機能に影響し、さらに死に至ることがある。ＨＰＰとして、出生時、乳児性、若年性（又は小児性）及び成人ＨＰＰが挙げられる。歴史的に、主として症状発現時の年齢に基づき、出生時、良性出生前、小児性、若年性、成人及び歯限局型ＨＰＰを含む６つの臨床形態が定義された。

アスホターゼアルファ（ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標），Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、内因性ＴＮＳＡＬＰレベルの欠陥に対処するように設計されている、承認されたファーストインクラスの標的酵素置換治療薬である。アスホターゼアルファは、ヒトＴＮＳＡＬＰの触媒ドメイン、ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメイン及び骨標的化ドメインとして用いられるデカアスパラギン酸ペプチド（例えば、Ｄ１０）（配列番号２）からなる可溶性の融合糖タンパク質である。インビトロで、アスホターゼアルファは、ハイドロキシアパタイトに対し、デカアスパラギン酸ペプチドを欠如する可溶性のＴＮＳＡＬＰの場合よりも高い親和性で結合し、それにより、アスホターゼアルファのＴＮＳＡＬＰ部分は、余分な局所性の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を効率的に分解し、正常な石灰化を骨に回復させることを可能にする。ピロリン酸加水分解は、骨石灰化を促進し、その効果は、非臨床試験において評価される種の中で類似していた。

アスホターゼアルファは、翻訳後修飾、例えばグリコシル化（例えば、シアリル化）を含有する真核生物タンパク質である。商業規模量の治療有効アルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファの作製は、マルチステップ製造プロセスを含み、その条件は、最終生成物に有意に影響し得る。このプロセス中、翻訳後修飾された生成物は、翻訳後修飾に負の影響を与える製造プロセスの１つ以上のステップ中のグリコシダーゼ又は他の加水分解条件に曝露され得る。例えば、付加されたシアル酸部分が損失し得る。これらの変化は、大量のバッチ生成物の半減期及び酵素活性を低減させ得る。したがって、最終タンパク質生成物及びそのグリコシル化特性の品質管理を改善するために、アルカリホスファターゼを製造する改善された方法が必要とされている。

本明細書で開示されるのは、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の作製におけるグリコシル化の品質管理を改善するために用いることができる製造プロセスである。本方法は、組換えタンパク質、例えば培養された哺乳動物細胞、特に培養されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって作製されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の酵素活性について維持、貯蔵、調節及び／又は改善するため、特に半減期について維持、制御及び／又は改善するためにも用いられ得る。かかるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、治療における使用、例えば対象、例えばヒト対象における低下したアルカリホスファターゼタンパク質レベル（例えば、ＨＰＰ）及び／又は機能（例えば、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）等の不十分な切断）に関連した状態の治療に適している。

一態様では、対象とされるのは、組換えアルカリホスファターゼを作製する方法である。本方法は、組換えアルカリホスファターゼを発現する細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）をバイオリアクターに接種するステップと；組換えアルカリホスファターゼを含む水性培地を得るステップと；接種後約６日目～約１０日目、特に約６日目～約８日目（例えば、約６日目、約７日目、約８日目、約９日目、約１０日目、例えば約７日目）に水性培地から一定分量を得るステップと；一定分量中の組換えアルカリホスファターゼ１モルあたりの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）モル濃度を定量するステップと；水性培地を収集するステップと；濾過ステップ（例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーション又はそれらの組み合わせ）を実施して最終的にバルク原薬（ＢＤＳ）を得るステップとを含む。本方法は、濾過ステップとＢＤＳの取得との間に追加的な下流の精製ステップをさらに含み得る（図１）。

発酵段階からの培地の一定分量は、濾過プールが保持される時間の量を決定するために用いられる。例えば、一定分量が約２．５モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約９時間未満にわたって保持され得る。一定分量が約２．５モル／モル～約２．７モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１０時間～約１４時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．８モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約２３時間～約２７時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．０モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３８時間～約４２時間にわたって保持され得る。

一実施形態では、一定分量が約２．５モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約７＋／－２時間以下（例えば、約５～９時間）にわたって保持され得る。一定分量が約２．５モル／モル～約２．７モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１８＋／－２時間以下（例えば、約１６～２０時間）にわたって保持され得る。一定分量が約２．７モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３２＋／－２時間以下（例えば、約３０～３４時間）にわたって保持され得る。

別の実施形態では、一定分量が約２．３モル／モル以下のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１８＋／－４時間以下（例えば、約１４～２２時間）にわたって保持され得る。一定分量が約２．３モル／モル超～約３．１モル／モル（例えば、約２．４モル／モル～約３．１モル／モル）のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３２＋／－４時間以下（例えば、約２８～３６時間）にわたって保持され得る。一定分量が約３．１モル／モル超（例えば、約３．２モル／モル以上）のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約４４＋／－４時間以下（例えば、約４０～４８時間）にわたって保持され得る。

別の実施形態では、一定分量が約２．４モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１７＋／－３時間以下（例えば、約１４～２０時間）にわたって保持され得る。一定分量が約２．４モル／モル～約３．６モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３１＋／－３時間以下（例えば、約２８～３４時間）にわたって保持され得る。一定分量が約３．６モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約４５＋／－３時間（約４２～４８時間）にわたって保持され得る。濾過ステップ中のアルカリホスファターゼ濃度は、約３．７＋／－０．４ｇ／Ｌであり得る。

濾過ステップ中のアルカリホスファターゼ濃度は、約１．８ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ（例えば、約１．８～約４．３ｇ／Ｌ、例えば約２．３ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ）であり得る。ＢＤＳのＴＳＡＣ濃度は、約１．２モル／モル～約３．０モル／モル（例えば、約１．６モル／モル～約２．４モル／モル）であり得る。

濾過ステップは、一定温度で保持され得、一定温度は、定義された範囲間の任意の温度である。例えば、温度は、約１５℃～約２５℃（例えば、約１９℃～約２５℃、例えば約２２℃）で保持され得る。

一定分量は、汚染を阻止するためにバイオリアクターから無菌的に得ることができる。一定分量は、約１ｍＬ～約１０００ｍＬ（例えば、約２５ｍＬ～約５００ｍＬ、例えば約５０ｍＬ～約３００ｍＬ、例えば約１００ｍＬ又は約２００ｍＬ）であり得る。

一定分量を得ることは、一定分量を遠心分離することと、任意選択的に、一定分量から上清を除去することとをさらに含み得る。このステップは、クロマトグラフィーカラム（例えば、プロテインＡカラム、例えば１ｍＬ ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム；６００μｌプロテインＡ Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ；又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡ固相カラム）を使用して、上清からアルカリホスファターゼを精製することも含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼは、緩衝液交換を施され得る。アルカリホスファターゼは、例えば、ＴＳＡＣ分析を測定する前にも濃縮され得る。ＴＳＡＣ分析は、ＴＳＡＣ濃度を定量することを含み、酸加水分解を実施してＴＳＡＣを放出することを含み得る。

アルカリホスファターゼの精製後、アルカリホスファターゼは、凍結乾燥され、且つ／又はバイアル中に装入され得る。

バイオリアクターは、例えば、アルカリホスファターゼの商業規模作製のための任意の適したサイズであり得る。例えば、バイオリアクターは、少なくとも２Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ又は少なくとも２０，０００Ｌの容積を有し得る。容積は、約１０，０００Ｌ又は約２０，０００Ｌであり得る。

任意の適した細胞培地、例えば無血清培地が使用され得る。適した一部の例としては、例えば、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地；ＣＤ ＤＧ４４培地；ＢＤ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地；ＳＦＭ４ＣＨＯ培地；及びそれらの組み合わせが挙げられる。

アルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、
Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；
Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び
ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含み得る。

いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり得る。

定義
本明細書で用いられるとき、用語「約」及び「およそ」は、１つ以上の特定の細胞培養条件又は数値範囲に適用される場合に対象値の＋／－１０％である値の範囲を指す。

用語「アミノ酸」は、本明細書で用いられるとき、通常、ポリペプチド又はそれらのアミノ酸の類似体若しくは誘導体の形態で用いられる２０の天然に存在するアミノ酸のいずれかを指す。本開示のアミノ酸は、細胞培養物に対する培地中に提供され得る。培地中に提供されるアミノ酸は、塩として又は水和物形態で提供され得る。

用語「バッチ培養」は、本明細書で用いられるとき、培地（下記「培地」の定義を参照されたい）を含む、最終的に細胞を培養するのに用いられる成分のすべて及び細胞自体が培養プロセスの開始時に提供される、細胞を培養する方法を指す。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分は、収集され、任意選択的に精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、バッチ培養において用いられる。

用語「バイオリアクター」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物）の増殖のために用いられる任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞の培養にとって有用である限り、任意のサイズであり得る。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットル、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００、２０，０００、２２，０００、２５，０００、３０，０００リットル若しくはそれを超えるか又はそれらの間の任意の容積となる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１００リットル～３０，０００リットル、５００リットル～２２，０００リットル、１，０００リットル～２２，０００リットル、２，０００リットル～２２，０００リットル、５，０００リットル～２２，０００リットル又は１０，０００リットル～２２，０００リットルである。バイオリアクターの最大作業容積は、約１％～５％だけ変動し得、例えば最大約２２，２５０リットル又は３３，０００リットルになり得る。限定されないが、ｐＨ及び温度を含むバイオリアクターの内部条件は、典型的には、培養期間中に調節される。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック又は金属を含む、本開示の培養条件下の培地に懸濁される哺乳類又は他の細胞培養物を保持することに適した任意の材料から構成され得る。用語「産生バイオリアクター」は、本明細書で用いられるとき、目的のポリペプチド又はタンパク質の作製に用いられる最終バイオリアクターを指す。大規模細胞培養産生バイオリアクターの容積は、典型的には、少なくとも５００リットルであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００、２０，０００リットル若しくはそれを超えるか又はそれらの間の任意の容積であり得る。当業者は、本開示の実行における使用に適したバイオリアクターについて理解し、選択できるであろう。

用語「細胞密度」は、本明細書で用いられるとき、所与の培地の体積中に存在する細胞の数を指す。

用語「細胞生存度」は、本明細書で用いられるとき、培養下の細胞が所与の培養条件又は実験バリエーションのセット下で生存する能力を指す。この用語は、本明細書で用いられるとき、特定の時点で生存している細胞の、その時点の培養下での細胞の総数（生存及び死滅）に対する割合も指す。

用語「培養物」及び「細胞培養物」は、本明細書で用いられるとき、細胞集団の生存及び／又は増殖に適した条件下で培地（下記「培地」の定義を参照されたい）に懸濁される細胞集団を指す。当業者に明白であるように、これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指し得る。

用語「流加培養」は、本明細書で用いられるとき、培養プロセスの開始後のいずれかの時点で追加的成分が培養物に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に枯渇している、細胞のための栄養補助剤を含む。流加培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分は、収集され、任意選択的に精製される。流加培養は、対応する流加バイオリアクター内で実施され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、流加培養を含む。

用語「断片」は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドを指し、所与のポリペプチドの、そのポリペプチドに固有の又は特徴的な任意の分離部分として定義される。この用語は、本明細書で用いられるとき、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の分離部分も指す。いくつかの実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である。他の実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。一実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。この用語は、本明細書で用いられるとき、完全長ポリペプチド中に見出される少なくとも確立された配列要素を含む、所与のポリペプチドの任意の部分も指す。いくつかの実施形態では、配列要素は、完全長ポリペプチドの少なくとも４～５アミノ酸に及ぶ。いくつかの実施形態では、配列要素は、完全長ポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸に及ぶ。

用語「糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」は、本明細書で用いられるとき、炭水化物基（シアル酸など）がポリペプチド鎖に結合したタンパク質又はポリペプチドを指す。

用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「培地（ｍｅｄｉａ）」「細胞培地」及び「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」は、本明細書で用いられるとき、哺乳動物細胞の増殖に栄養を与える栄養分を含有する溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最低限の増殖及び／又は生存に対して細胞が必要とする必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質及び微量元素を提供する。溶液は、ホルモン及び増殖因子を含む、最小速度を超えて増殖及び／又は生存を増強する成分も含有し得る。溶液は、例えば、細胞生存及び増殖にとって最適なｐＨ及び塩濃度に向けて配合され得る。いくつかの実施形態では、培地は、「限定培地」、即ちタンパク質、加水分解物又は未知組成物の成分を含有しない無血清培地であり得る。限定培地は、動物由来成分を含まず、すべての成分は、既知の化学構造を有する。いくつかの実施形態では、培地は、基礎培地、例えば炭素源、水、塩、アミノ酸及び窒素の供給源（例えば、動物、例えば牛肉又は酵素抽出物）を含有する非限定培地である。様々な培地は、市販されており、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地（Ｓｉｇａｍ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣＤ ＤＧ４４培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）若しくはそれらの混合物又はＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ培地とＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ（商標），Ｌｏｇａｎ ＵＴ）との混合物から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地の組み合わせを９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０（それらの間の任意の中間比を含む）から選択される比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地の組み合わせを７０／３０～９０／１０の比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地の組み合わせを７５／２５の比で含む。ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地は、０．１％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、３．４２ｇ／Ｌグルコース、７．５ｍＭヘペス及び１．６ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有する。ＢＤ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地は、ヒト組換えインスリン、ヒポキサンチン、チミジン及び低エンドトキシン（≦５．０ＥＵ／ｍＬ）をｐＨ７．１＋／－０．２で含有する。ＣＤ ＤＧ４４培地は、ヒポキサンチン及びチミジン並びにＬ－グルタミンを含有し、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ－６８を有さない化学的に規定された無タンパク質無加水分解物培地である。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、培地が余分なボーラス投与で産生バイオリアクターに添加されるプロセスによって作製される。例えば、培地は、１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。特定の一実施形態では、培地は、３回のボーラス投与で添加される。様々な実施形態では、培地のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、培地のかかるボーラス投与は、産生バイオリアクターにおける培地の元の容量の約２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、６０％、６７％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１２５％、１３０％、１３３％、１４０％、１５０％、１６０％、１６７％、１７０％、１７５％、１８０％、１９０％、２００％又はそれを超える量で添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、元の容量の約３３％、６７％、１００％又は１３３％の量で添加され得る。様々な実施形態では、余分なボーラス投与のかかる添加は、細胞増殖又はタンパク質産生の期間中の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラス投与は、プロセスにおける１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目又はそれよりも後に添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、１日おきに（例えば、（１）３日目、５日目及び７日目；（２）４日目、６日目及び８日目、又は（３）５日目、７日目及び９日目に添加され得る。実際、培地のボーラス投与での補助剤の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記の制限に従って自由に組み合わされ、実験練習によって決定され得る。

用語「重量モル浸透圧濃度」及び「容積モル浸透圧濃度」は、本明細書で用いられるとき、水溶液中に溶解した溶質粒子の浸透圧の尺度を指す。溶質粒子は、イオン及び非イオン化分子の両方を含む。重量モル浸透圧濃度は、１ｋｇの溶液に溶解した浸透圧的に活性な粒子の濃度（例えば、オスモル）として表される（３８℃で１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧に等しい）。それに対し、「容積モル浸透圧濃度」は、１リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を指す。本明細書で用いられるとき、略記「ｍＯｓｍ」は、「ミリオスモル／ｋｇ溶液」を意味する。

用語「灌流培養」は、本明細書で用いられるとき、培養プロセスの開始後に追加的成分が培養物に連続的又は半連続的に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に枯渇している、細胞のための栄養補助剤を含む。培地中の細胞及び／又は成分の一部は、典型的には、連続又は半連続ベースで収集され、任意選択的に精製される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、本明細書に記載されるとき、灌流培養下で添加され、例えば、それらは、定められた期間にわたって連続的に提供される。

用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、ペプチド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために用いられるが、当業者は、この用語が長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に連結される２つのアミノ酸を含む最小長さの鎖を指し得ることを理解するであろう。

用語「タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、分離単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが分離機能単位であり、分離機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永久的な物理的会合を必要としない場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、交換可能に用いられる。

用語「組換え発現されるポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている宿主細胞から発現されるポリペプチドを指す。組換え発現されるポリペプチドは、通常、哺乳類宿主細胞において発現されるポリペプチドに一致又は類似し得る。組換え発現されるポリペプチドは、宿主細胞に対して外来性でもあり得、例えば、通常、宿主細胞において発現されるペプチドに対して異種性であり得る。代わりに、組換え発現されるポリペプチドは、ポリペプチドの一部が、通常、哺乳類宿主細胞において発現されるポリペプチドに一致又は類似するアミノ酸配列を有する一方、他の部分が宿主細胞に対して外来性である点でキメラであり得る。

用語「播種」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物をバイオリアクター又は別の容器に提供するプロセスを指す。細胞は、別のバイオリアクター又は容器内で予め増殖され得る。代わりに、細胞は、それらをバイオリアクター又は容器に提供する直前に凍結及び解凍され得る。この用語は、単細胞を含む任意の数の細胞を指す。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、細胞が約１．０×１０５細胞／ｍＬ、１．５×１０５細胞／ｍＬ、２．０×１０５細胞／ｍＬ、２．５×１０５細胞／ｍＬ、３．０×１０５細胞／ｍＬ、３．５×１０５細胞／ｍＬ、４．０×１０５細胞／ｍＬ、４．５×１０５細胞／ｍＬ、５．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ、６．０×１０５細胞／ｍＬ、６．５×１０５細胞／ｍＬ、７．０×１０５細胞／ｍＬ、７．５×１０５細胞／ｍＬ、８．０×１０５細胞／ｍＬ、８．５×１０５細胞／ｍＬ、９．０×１０５細胞／ｍＬ、９．５×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０６細胞／ｍＬ、１．５×１０６細胞／ｍＬ、２．０×１０６細胞／ｍＬの密度又はより高い密度で播種されるプロセスによって作製される。特定の一実施形態では、かかるプロセスにおいて、細胞は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ又は８．０×１０５細胞／ｍＬの密度で播種される。

用語「総シアル酸含量」又は「ＴＳＡＣ」は、本明細書で用いられるとき、特定のタンパク質分子上のシアル酸（炭水化物）の量を指す。それは、タンパク質の１モルあたりのモルでのＴＳＡＣ又は「モル／モル」として表される。ＴＳＡＣ濃度は、精製プロセス中に測定される。例えば、ＴＳＡＣ定量化の一方法は、ＴＳＡＣが酸加水分解を用いてアスホターゼアルファから放出され、その後、放出されたＴＳＡＣが、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー（「ＨＰＡＥ－ＰＡＤ」）を用いた電気化学的検出を介して検出される。

用語「力価」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物によって産生される組換え発現されたポリペプチド又はタンパク質の総量が所与量の培地容量で除されたものを指す。力価は、典型的には、１ｍＬの培地あたりの数ミリグラム単位のポリペプチド又はタンパク質で表される。

本明細書で用いられるアクロニムは、例えば、ＨＣＣＦ：収集清澄化培養液；ＵＦ：限外濾過、ＤＦ：ダイアフィルトレーション；ＶＣＤ：生細胞密度；ＩＶＣＣ：積分生細胞濃度；ＴＳＡＣ：総シアル酸含量；ＨＰＡＥ－ＰＡＤ：アンペロメトリック電気化学検出を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー；ＡＥＸ：アニオン交換クロマトグラフィー；ＬｏＣ：ラボオンチップ；及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化－飛行時間型を含む。

本明細書で用いられるとき、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム」は、固定相又は樹脂に対するタンパク質と疎水性基との間の疎水性相互作用により、目的タンパク質の断片及び凝集物、他のタンパク質若しくはタンパク質断片及び細胞片などの他の汚染物質を含む不純物又は他の精製ステップからの残留不純物からタンパク質が分離される、固定相又は樹脂及び移動相又は液相を含むカラムを指す。固定相又は樹脂は、疎水性リガンドが結合される基材マトリックス又は支持体、例えば架橋アガロース、シリカ又は合成共重合体材料を含む。かかる固定相又は樹脂の例として、フェニル、ブチル、オクチル、ヘキシル及び他のアルキルで置換されたアガロース、シリカ又は他の合成高分子が挙げられる。カラムは、固定相を含む任意のサイズであり得るか、又はオープン及びバッチプロセスで処理され得る。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、ＨＩＣを用いて細胞培養物から単離される。

本明細書で用いられるとき、用語「調製物」は、目的のタンパク質を産生する細胞培養物からの目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼ）及び少なくとも１つの不純物を含む溶液並びに／又は細胞培養物からかかる目的のタンパク質を抽出、濃縮及び／若しくは精製するために用いられる溶液を指す。例えば、目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼ）の調製物は、細胞培養物中で増殖し、かかる目的のタンパク質を産生する細胞をホモジナイズ溶液中でホモジナイズすることによって調製され得る。いくつかの実施形態では、次に、調製物に１つ以上の精製／単離プロセス、例えばクロマトグラフィーステップが施される。

本明細書で用いられるとき、用語「溶液」は、液体形態での２つ以上の物質の均一の分子混合物を指す。詳細には、いくつかの実施形態では、精製されるタンパク質、例えば本開示における組換えアルカリホスファターゼ又はその融合タンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、溶液中の１つの物質を表す。用語「緩衝液」又は「緩衝溶液」は、その共役酸－塩基の範囲の作用により、ｐＨの変化に抗する溶液を指す。ｐＨを約ｐＨ５～約ｐＨ７の範囲で制御する緩衝液の例として、ヘペス、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩及び他のミネラル酸又は有機酸緩衝液並びにこれらの組み合わせが挙げられる。塩のカチオンは、ナトリウム、アンモニウム及びカリウムを含む。本明細書で用いられるとき、用語「負荷緩衝液／溶液」又は「平衡緩衝液／溶液」は、塩又はタンパク質調製物をクロマトグラフィーカラム、例えばＨＩＣカラムに負荷するためにタンパク質調製物と混合される塩を含有する緩衝液／溶液を指す。この緩衝液／溶液は、タンパク質を負荷する前にカラムを平衡化し、且つ負荷後にカラムを洗浄するためにも用いられる。「溶出緩衝液／溶液」は、タンパク質をカラムから溶出するために用いられる緩衝液／溶液を指す。本明細書で用いられるとき、用語「溶液」は、水を含む緩衝液又は非緩衝液のいずれかを指す。

用語「シアル酸」は、一般に、９炭素骨格を有する単糖の、ノイラミン酸のＮ－又はＯ－置換誘導体を指す。シアル酸は、具体的にはＮ－アセチルノイラミン酸化合物も指し得、ときにＮｅｕ５Ａｃ又はＮＡＮＡと略記される。シアル酸の存在は、吸収、血清半減期及び血清からの糖タンパク質の排除並びに糖タンパク質の物理、化学及び免疫原性特性に影響を与えることがある。本開示のいくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファに会合されるシアル酸は、生理的状態下での分子の半減期に影響する。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）の正確且つ予測可能な制御は、組換えアスホターゼアルファにとっての決定的な品質特性として役立つ。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、１．２～３．０モル／モルのアスホターゼアルファ単量体である。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、バイオリアクター内での組換えタンパク質作製プロセスにおいて生成される。いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物細胞培養物を通して、ＴＳＡＣを含有する組換えタンパク質中の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製及びクロマトグラフィーステップは、グリコシダーゼ活性の低下、したがって組換えタンパク質の総シアル酸含量の増加をもたらす。

用語「シアリル化」は、グリコシル化の特定のタイプ、例えば１つ以上のシアル酸分子の生体分子への付加、特に１つ以上のシアル酸分子のタンパク質への付加を指す。本開示のいくつかの実施形態では、シアリル化は、シアリルトランスフェラーゼ酵素により実施される。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を新生オリゴ糖及び／又は糖タンパク質のＮ又はＯ結合型糖鎖に付加する。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞内に天然に存在する。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞を培養するのに用いられる細胞培地及び／又は栄養補充剤中に存在する。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、当技術分野で公知の組換えタンパク質発現方法を用いて組換え的に作製される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼとは別々に作製される組換えシアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物、収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）及び／又は濾過プールに外因性に添加される。

本開示のいくつかの実施形態では、シアル酸基は、加水分解により糖タンパク質から除去される（例えば、「脱シアリル化」）。いくつかの実施形態では、脱シアリル化は、グリコシダーゼ酵素により実施される。本明細書で用いられるとき、「配糖体ヒドロラーゼ」とも称される「グリコシダーゼ」は、配糖体の糖をアルコール又は別の糖単位に連結する結合の加水分解を触媒する酵素である。グリコシダーゼの例として、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ及びシアリダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、脱シアリル化は、シアリダーゼ酵素により実施される。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、コロミン酸及び／又は合成基質における末端シアル酸残基のグリコシド結合を加水分解する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞培地中に存在する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼ活性は、総タンパク質濃度に依存し、且つ／又はそれと相関する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、シアリダーゼが活性化される、決定的に高いタンパク質濃度になる時点まで本質的に不活性である。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞培養物のＨＣＣＦ又は濾過プール中に存在する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、組換えアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファにおけるグリコシル化部位からシアル酸部分を除去し、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣを有効に減少させる。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又は濾過プールから選択的に除去される。シアリダーゼは、例えば、シアリダーゼに特異的な阻害剤、抗体、イオン交換及び／又はアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などの１つ又は組み合わせにより選択的に除去され得る。バイオプロセス条件がタンパク質のシアル酸含量にどのように影響するかの概要については、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．９（４）：３６６－３７３（１９９３）（その開示は、その全体がここで参照により援用される）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞培養物中のグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、少なくとも１つの精製及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製及びクロマトグラフィーステップは、グリコシダーゼ活性の低下、したがって組換えタンパク質の総シアル酸含量の増加をもたらす。

ＨＣＣＦとして略記される用語「収集清澄化培養液」は、細胞培養物、例えばバイオリアクター内の細胞培養物から収集された清澄化濾液を指す。ＨＣＣＦは、典型的には、細胞培養物中に存在することがある細胞及び細胞片（例えば、不溶性生体分子など）を含まない。本開示のいくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、遠心分離、深濾過、滅菌濾過及び／又はクロマトグラフィーを通して生成される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターからの細胞培養物は、ＨＣＣＦを生成するため、まず遠心分離及び／又は濾過され、次に少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが施される。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ前及び／又は後に濃縮される。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ後に希釈される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞培養物からのＨＣＣＦは、組換えアルカリホスファターゼ及び汚染物質タンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦ中の汚染物質タンパク質は、シアリダーゼ酵素を含む。

用語「濾過」及び「フロー濾過」は、溶液又は懸濁液中の成分をそれらのサイズ及び電荷差に基づいて分離するために膜を用いる圧力駆動プロセスを指す。フロー濾過は、通常のフロー濾過又は「タンジェンシャルフローフィルトレーション」であり得、ＴＦＦ又はクロスフロー濾過としても知られる。ＴＦＦは、典型的にはタンパク質を清澄化、濃縮及び精製するために用いられる。ＴＦＦプロセス中、流体は、少なくとも１つの膜の表面に沿う接線方向にポンピングされる。適用圧力は、流体の一部を、その膜を通して下流側に「濾液」として押すように機能する。膜孔を貫通するには大き過ぎる微粒子及び高分子は、上流側に「残余分」として保持される。ＴＦＦは、例えば、精密濾過、限外濾過（ウイルス濾過及び高性能ＴＦＦを含む）、逆浸透、ナノ濾過及びダイアフィルトレーションを含む様々な形態で用いられ得る。本開示のいくつかの実施形態では、ＴＦＦ形態の１つ以上は、タンパク質の処理及び／又は精製を意図して併用される。いくつかの実施形態では、限外濾過及びダイアフィルトレーションは、組換えアルカリホスファターゼを精製することを意図して併用される。限外濾過及びダイアフィルトレーションは、本明細書で説明される。

「限外濾過」又は「ＵＦ」は、緩衝液交換、脱塩又は濃縮において緩衝液成分からタンパク質を分離するために用いられる精製プロセスである。保持されるタンパク質に応じて、約１ｋＤ～約１０００ｋＤの範囲内の膜分子量限界が用いられる。いくつかの実施形態では、ＵＦは、ＴＦＦプロセスである。

「ダイアフィルトレーション」又は「ＤＦ」は、膜を通してより小さい分子を洗浄し、より大きい分子を保持液中に残し、最終的に濃度を変更しないような精製プロセスである。典型的には、生成物収量及び／又は純度を増加させるため、ＤＦは、別の精製プロセスと併用される。ＤＦ中、溶液（例えば、水又は緩衝液）は、サンプルリザーバー内に導入される一方、濾液は、単位操作から除去される。所望の生成物が保持液中に存在する場合のプロセスでは、ダイアフィルトレーションにより、成分が生成物プールから濾液中に洗浄され、それにより緩衝液が交換され、望ましくない種の濃度が減少する。生成物が濾液中に存在するとき、ダイアフィルトレーションにより、それが膜を通して収集容器内に洗浄される。いくつかの実施形態では、ＤＦは、ＴＦＦプロセスである。

ときに「ＵＦＤＦプール」又は「ＵＦＤＦ」とも称される用語「濾過プール」は、濾過プロセスから、典型的には限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）組み合わせプロセスからの流体の総体積を指す。タンパク質精製との関連において、ＵＦＤＦは、限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセスからの保持液を指す。

組換えアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファの作製プロセスを示すフローチャートである。 複数のバッチについての収集、プロテインＡプールステップ及び最終ＢＤＳでのアスホターゼアルファのＴＳＡＣ含量を示すグラフである。 複数のバッチについての接種後７日目、収集ステップ及び最終ＢＤＳでのアスホターゼアルファのＴＳＡＣ含量を示すグラフである。

本開示は、発酵中に総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）濃度を測定し、且つＴＳＡＣ濃度測定値に応じて下流の作製ステップを調整することにより、最終生成物中のＴＳＡＣ濃度に対する改善された品質管理を提供する、組換え糖タンパク質、例えばアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）を製造する改善された方法を提供する。本方法は、バイオリアクター細胞培養アウトプットからのＴＳＡＣレベルの潜在的に変動性の範囲に応答する動的制御方法を用いることによって最終生成物のＴＳＡＣの調節を可能とする。最終的に、この方法は、商業的作製のための組換えアルカリホスファターゼの均一な特性を提供する。本明細書に記載の方法は、最終生成物のＴＳＡＣがインプットバイオリアクター水性培地ＴＳＡＣレベルの範囲にわたって厳密に制御される、結果的に得られる生成物を提供する。

製造方法
本明細書に記載の方法は、組換えアルカリホスファターゼを発現する細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）をバイオリアクターに接種するステップと；組換えアルカリホスファターゼを含む水性培地を得るステップと；接種後約６日目～約１０日目、特に約６日目～約８日目（例えば、約６日目、約７日目、約８日目、約９日目、約１０日目、例えば約７日目）に水性培地から一定分量を得るステップと；一定分量中の組換えアルカリホスファターゼ１モルあたりの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）モル濃度を定量するステップと；水性培地を収集するステップと；濾過ステップ（例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーション又はそれらの組み合わせ）を実施してバルク薬液（ＢＤＳ）を得るステップとを含む。

発酵中、培地の一定分量は、濾過ステップが保持される時間の量を決定するために用いられる。例えば、一定分量が約２．５モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約９時間未満にわたって保持され得る。一定分量が約２．５モル／モル～約２．７モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１０時間～約１４時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．８モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約２３時間～約２７時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．０モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３８時間～約４２時間にわたって保持され得る。

一実施形態では、一定分量が約２．３モル／モル以下のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１８＋／－４時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．４モル／モル～約３．１モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３２＋／－４時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．２モル／モル以上のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約４４＋／－４時間にわたって保持され得る。

別の代替的な実施形態では、一定分量が約２．４モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１７＋／－３時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．４モル／モル～約３．６モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３１＋／－３時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．６モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約４５＋／－３時間にわたって保持され得る。

本方法は、ＴＳＡＣ濃度が約１．２モル／モル～約３．０モル／モル（例えば、約１．６モル／モル～約２．４モル／モル）の範囲に制御されたＢＤＳを作製し得る。ＴＳＡＣ濃度のこの範囲は、ヒト患者における使用のための安定的（例えば、治療有効半減期）且つ酵素的に活性である商業関連規模の組換えアルカリホスファターゼのバルクサンプルを提供する。

本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、当技術分野で公知の方法を用いて、哺乳類又は他の細胞、特にＣＨＯ細胞によって産生され得る。かかる細胞は、培養ディッシュ、フラスコガラス又はバイオリアクター内で増殖され得る。細胞培養及び組換えタンパク質作製のための特定のプロセスは、当技術分野で公知であり、例えばＮｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｇｅｙｅｒ，１９９１ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１２－１４３及びＲｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｃｈ ２００８，２０－２５に記載されている。例示的なバイオリアクターは、バッチ、流加及び連続反応器を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、流加バイオリアクター内で作製される。

細胞培養プロセスは、例えば、限定されないが、ｐＨの変化、温度、温度変化、温度変化のタイミング、細胞培地組成、細胞培養栄養補助剤、原料のロット間変動、培地濾過用材料、バイオリアクター規模の差異、ガス処理方法（空気、酸素及び二酸化炭素）などを含む変動する物理化学的環境によって引き起こされる変動性を有する。本明細書で開示される通り、製造されたアルカリホスファターゼタンパク質の収量、相対活性特性及びグリコシル化特性は、損なわれ得、これらのパラメータの１つ以上における変更により特定値の範囲内で制御され得る。

細胞培養物中での組換えタンパク質作製では、必要な転写制御因子を伴う組換え遺伝子は、バイオテクノロジー技術における公知の方法により、まず宿主細胞に移される。任意選択的に、レシピエント細胞に選択的利点を与える第２の遺伝子が導入される。遺伝子導入から数日後、適用され得る選択薬剤の存在下において、選択遺伝子を発現する細胞のみが生存する。そのような選択のための２つの例示的遺伝子は、ヌクレオチド代謝に関与する酵素のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）である。両方の場合において、適切な代謝産物（ＤＨＦＲの場合にはヒポキサンチン及びチミジン並びにＧＳの場合にはグルタミン）の不在下で選択が生じ、いかなる非形質転換細胞の増殖も阻止される。一般に、組換えタンパク質の効率的発現において、生物製剤をコードする遺伝子及び選択遺伝子が同じプラスミド上に存在するか否かは重要でない。

選択後、生存細胞は、単細胞として第２の培養容器に導入され得、培養物は、クローン集団を生成するために拡大される。最終的に、個別クローンは、組換えタンパク質の発現について評価され、最高の生産者は、さらなる培養及び分析のために保持される。これらの候補から、組換えタンパク質の作製のため、適切な増殖及び生産性特性を有する１つの細胞株が選択される。次に、作製需要及び最終生成物の要件によって決定される培養プロセスが開発される。

細胞
任意の哺乳動物細胞型又は非哺乳動物細胞型がポリペプチドを作製するために培養され得るが、本開示に従って利用され得る。用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例として、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ受入番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７ Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－Ｉ ５８７）；ヒト頸部がん細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝腫瘍株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。特定の実施形態では、ポリペプチド及びタンパク質の培養及び発現は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から行われる。

加えて、ポリペプチド又はタンパク質を発現する任意の数の市販及び非市販のハイブリドーマ細胞株が本開示に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養の需要を有し得、且つ／又は最適な増殖及びポリペプチド若しくはタンパク質発現に対して異なる培養条件を必要とし得ることを理解し、且つ必要に応じて条件を変更することができるであろう。

播種密度
本開示では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が培地に接種、即ち播種される。様々な播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０２細胞／ｍＬ～１．０×１０９細胞／ｍＬ（例えば、１．０×１０３細胞／ｍＬ～１．０×１０８、例えば１．０×１０４細胞／ｍＬ～１．０×１０７）の播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０５細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、４．０×１０５細胞／ｍＬ～８．０×１０５細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、播種密度の増加は、ＳＥＣによって測定されるとき、アスホターゼアルファ品質の断片化に影響し得る。いくつかの実施形態では、播種密度は、断片生成のリスクを低減するために接種時に制御される。

温度
温度は、増殖速度、凝集、断片化及びＴＳＡＣを含むいくつかのパラメータに対する影響を有する可能性がある。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、一定のままである。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、約３０℃～約４０℃、又は約３５℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃である。いくつかの実施形態では、培地中でＣＨＯ細胞を培養するとき、温度は、約３０℃、約３０．５℃、約３１℃、約３１．５℃、約３２℃、約３２．５℃、約３３℃、約３３．５℃、約３４℃、約３４．５℃、約３５℃、約３５．５℃、約３６℃、約３６．５℃、約３７℃、約３７．５℃、約３８℃、約３８．５℃、約３９℃、約３９．５℃又は約４０℃である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の４０～２００時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の５０～１５０時間、又は６０～１４０時間、又は７０～１３０時間、又は８０～１２０時間、又は９０～１１０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の８０～１２０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間又は１１０時間にわたって一定である。

温度変化
細胞培養プロセス、特に非連続プロセス（例えば、バイオリアクターにおける流加プロセス）の実行時間は、通常、典型的には実行期間にわたって減少する細胞の残存生存度によって制限される。したがって、細胞生存度における時間を延長することは、組換えタンパク質の産生を改善するために所望される。生成物品質への関心はまた、細胞死が培養上清にシアリダーゼを放出し得、発現されるタンパク質のシアル酸含量を減少させる可能性があることから、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するという動機付けをもたらす。タンパク質精製への関心は、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するというさらに別の動機付けをもたらす。培養物中の細胞片及び死細胞の内容物は、培養実行の終了時にタンパク質生成物を単離及び／又は精製する能力に対して負の影響を与え得る。したがって、細胞を培養下でより長期間にわたり生存可能に維持することにより、細胞によって産生される所望の糖タンパク質の品質における劣化及び究極的低下を引き起こすことがある、細胞性タンパク質及び酵素（例えば、細胞性プロテアーゼ及びシアリダーゼ）による培地の汚染において低下が認められる。

細胞培養物における高い細胞生存度を達成するため、多くの方法が適用され得る。１つは、正常温度での初期培養後に培養温度を低下させることを含む。例えば、Ｒｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：４２３－４２７）を参照されたい。一般に、目的のタンパク質を発現する能力がある哺乳類又は他の細胞型は、細胞数を増加させるため、最初に正常温度下で増殖される。各細胞型におけるかかる「正常」温度は、一般に約３７℃（例えば、約３５℃～約３９℃、例えば３５．０℃、３５．５℃、３６．０℃、３６．５℃、３７．０℃、３７．５℃、３８．０℃、３８．５℃及び／又は３９．０℃など）である。特定の一実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３７℃に設定される。適度に高い細胞密度が達成されるとき、そこでタンパク質産生を促進するため、全細胞培養物における培養温度が変更され得る（例えば、低減される）。ほとんどの場合、温度の低下により、細胞が細胞周期の非増殖Ｇ１部分の方に変化し、以前のより高い温度環境と比べて細胞密度及び生存度が増加することがある。さらに、より低い温度は、細胞性タンパク質の産生速度を増加させ、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を促進し、新規に産生されるタンパク質の断片化又は凝集を低減し、タンパク質のフォールディング及び三次元構造の形成を促進し（したがって活性を維持する）、且つ／又は新規に産生されるタンパク質の分解を低減することにより、組換えタンパク質の産生を促進する可能性もある。いくつかの実施形態では、温度は、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃低下する。いくつかの実施形態では、温度は、約２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃又は３５℃まで低下する。いくつかの実施形態では、より低い温度は、約３０℃～約３５℃（例えば、３０．０℃、３０．５℃、３１．０℃、３１．５℃、３２．０℃、３２．５℃、３３．０℃、３３．５℃、３４．０℃、３４．５℃及び／又は３５．０℃）である。他の実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３５．０℃～約３９．０℃に設定され、次に約３０．０℃～約３５．０℃に変更される。一実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３７．０℃に設定され、次に約３０℃に変更される。別の実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３６．５℃に設定され、次に約３３℃に変更される。さらに別の実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３７．０℃に設定され、次に約３３℃に変更される。さらなる実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３６．５℃に設定され、次に約３０℃に変更される。他の実施形態では、温度変更の複数（例えば、２つ以上）のステップが適用され得る。

異なる温度に変更する前、特定の温度で培養物を維持するための時間は、細胞生存度及び目的のタンパク質を産生する能力を維持しながら、十分な（又は所望の）細胞密度を達成するように決定され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約１０５細胞／ｍＬ～約１０７細胞／ｍＬ（例えば、１×１０５、１．５×１０５、２．０×１０５、２．５×１０５、３．０×１０５、３．５×１０５、４．０×１０５、４．５×１０５、５．０×１０５、５．５×１０５、６．０×１０５、６．５×１０５、７．０×１０５、７．５×１０５、８．０×１０５、８．５×１０５、９．０×１０５、９．５×１０５、１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、７．０×１０６、７．５×１０６、８．０×１０６、８．５×１０６、９．０×１０６、９．５×１０６、１×１０７細胞／ｍＬ又はそれを超える）に達するまで増殖される。一実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５～約３．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。別の実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５～約３．２×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。さらに別の実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５～約２．８×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、温度変化が接種から５０～１５０時間後、又は６０～１４０時間後、又は７０～１３０時間後、又は８０～１２０時間後、又は９０～１１０時間後に生じることを提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、温度が接種から約８０時間～１５０時間後、接種から約９０時間～１００時間後又は接種から約９６時間後に低下することを提供する。いくつかの実施形態では、温度変化は、接種から８０～１２０時間後に生じる。いくつかの実施形態では、温度変化は、接種から９０時間後、９２時間後、９４時間後、９６時間後、９８時間後、１００時間後、１０２時間後、１０４時間後、１０６時間後、１０８時間後又は１１０時間後に生じる。いくつかの実施形態では、温度変化後の温度は、ＣＨＯ細胞が収集されるまで維持される。

ｐＨ
細胞培養下の増殖培地のｐＨの変更は、細胞タンパク質の分解活性、分泌及びタンパク質産生レベルに影響する可能性がある。細胞株の大部分は、約ｐＨ７～８で十分に増殖する。細胞増殖における最適ｐＨの変動は、様々な細胞株中で比較的小さいが、いくつかの正常な線維芽細胞株の挙動は、ｐＨ７．０～７．７で最高であり、形質転換細胞の挙動は、典型的には７．０～７．４のｐＨで最高である（Ｅａｇｌｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８２：１－８，１９７３）。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための培地のｐＨは、約６．５～７．７のｐＨ（例えば、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．３９、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５又は７．７０）である。

培地
いくつかの実施形態では、バッチ培養が用いられ、ここでは追加的な培地が接種後に添加されない。いくつかの実施形態では、流加培養が用いられ、ここでは１回以上のボーラス投与で培地が接種後に添加される。いくつかの実施形態では、２、３、４、５又は６回のボーラス投与で培地が接種後に添加される。

様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、培地が余分なボーラス投与で産生バイオリアクターに添加されるプロセスによって作製される。例えば、培地が１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。特定の一実施形態では、培地が３回のボーラス投与で添加される。様々な実施形態では、培地のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、培地のかかるボーラス投与は、産生バイオリアクターにおける培地の元の容量の約２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、６０％、６７％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１２５％、１３０％、１３３％、１４０％、１５０％、１６０％、１６７％、１７０％、１７５％、１８０％、１９０％、２００％又はそれを超える量で添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、元の容量の約３３％、６７％、１００％又は１３３％の量で添加され得る。様々な実施形態では、余分なボーラス投与のかかる添加は、細胞増殖又はタンパク質産生の期間中の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラス投与は、プロセスにおける１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目又はそれよりも後に添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、一日おきに（例えば、（１）３日目、５日目及び７日目、（２）４日目、６日目及び８日目、又は（３）５日目、７日目及び９日目に添加され得る。実際、培地のボーラス投与での補助剤の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記の制限に従って自由に組み合わされ、実験練習によって決定され得る。

様々な培地が市販されている。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比で含む。

栄養補助剤
様々な栄養補助剤は、「フィード培地」とも称され、市販され、当業者に公知である。栄養補助剤は、接種が行われてから細胞培養物に添加される（培養培地と異なる）培地を含む。場合により、栄養補助剤は、培養下で増殖する細胞によって消費される栄養分を代替するために用いることができる。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、所望のタンパク質の産生を最適化するか又は所望のタンパク質の活性を最適化するために添加される。極めて多数の栄養補助剤が開発されており、市販されている。栄養補助剤の明示的な目的がプロセス開発の局面を高めることである一方、すべての細胞及び／又は産生されるすべてのタンパク質のために機能する普遍的な栄養補助剤は存在しない。所望の力価及び増殖特性を達成するため、所望の細胞株、産生タンパク質及び所与の基本培地と組み合わせて機能し得る、スケーラブルであり且つ適切な細胞培養栄養補助剤の選択は、ルーチン的でない。特定の細胞株、特定の産生タンパク質及び基本培地の組み合わせを用いて複数の市販の栄養補助剤をスクリーニングし、最適な補助剤を同定する典型的手法は、細胞培養プロセス中に存在する無数の変数に起因し、成功しない可能性がある。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ＋ＡＧＴ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）２＋ＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）４の組み合わせ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）２＋ＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）５の組み合わせ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）６（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）７ａ＋ＣＥＬＬ ＢＯＯＳＴ（商標）７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＨＯフィードバイオリアクター補助剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；例えば、製品カタログ番号Ｃ１６１５）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤として説明することができ、第１のＡＤＣＦ栄養補助剤は、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ－グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２－メルカプトエタノールを含まない。Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、化学的に規定された補助剤である。語句「動物由来成分を含まない」又は「ＡＤＣＦ」は、成分が直接的に動物供給源に由来しない、例えばウシ供給源に由来しない補助剤を指す。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａである。

Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤として説明することができ、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤には、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ－グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２－メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する。Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、化学的に規定された補助剤である。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂである。

いくつかの実施形態では、市販の栄養補助剤の組み合わせが用いられる。用語「栄養補助剤」は、単一の栄養補助剤とともに栄養補助剤の組み合わせの両方を指す。例えば、いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂの組み合わせを含む

様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、栄養補助剤の余分な添加物が産生バイオリアクターに添加されるプロセスによって作製される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、ある期間、例えば１分～２時間の範囲の期間にわたって添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、ボーラス投与で添加される。例えば、栄養補助剤は、１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、３つ以上の異なる時点、例えば２～６つの異なる時点で添加される。様々な実施形態では、栄養補助剤のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、産生バイオリアクター内の培地の元の容量の約１％～２０％、１％～１０％又は１％～５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。特定の一実施形態では、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、元の容量の１％～２０％、１％～１０％又は１％～５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。

いくつかの実施形態では、栄養補充剤の組み合わせが用いられ、第１の栄養補充剤、例えばＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａが培地の０．５％～４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補充剤の組み合わせが用いられ、第２の栄養補充剤、例えばＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂが培地の０．０５％～０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。栄養補充剤の組み合わせがＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂを含むような特定の実施形態では、栄養補充剤のボーラスが元の体積の１％～２０％、１％～１０％又は１％～５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。

様々な実施形態では、追加的ボーラスのかかる添加は、接種後の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラスは、接種の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日後又はそれ以降に添加され得る。実際、栄養補充剤のボーラス添加の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記の制限に応じて自由に組み合わされ、実験実施により決定され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、組換えポリペプチドの作製中に亜鉛を前記培地に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、亜鉛は、前記培地中で約１～約３００μＭの亜鉛濃度をもたらすように添加され得る。一実施形態では、亜鉛は、培地中で約１０～約２００μＭ（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０μＭ）の亜鉛濃度をもたらすように添加され得る。いくつかの実施形態では、亜鉛は、約２５μＭ～約１５０μＭ又は約６０μＭ～約１５０μＭの培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。一実施形態では、亜鉛は、約３０、６０又は９０μＭの亜鉛の培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、前記培地にボーラス投与で連続的に、半連続的に又はそれらを組み合わせで添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、接種から１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後及び／又は１３日後に添加される。

収集
先行試験により、収集タイミングの遅延が生存度及びＴＳＡＣ低下に関連したため、収集タイミングが他のＣＱＡに対する潜在的影響を有し得ることが示唆された。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約２００時間、２１０時間、２２０時間、２３０時間、２４０時間、２５０時間、２６０時間、２６４時間、２７０時間、２８０時間、２８８時間（例えば、１２日）又は１２日以降の時点で収集される。

下流プロセス
用語「下流プロセス」は、本明細書で用いられるとき、一般に、培養細胞又は発酵培養液などの供給源から産生されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の回収及び精製のためのプロセスの全部又は一部を指す。

一般に、下流処理は、純度及び濃度における前進的な改善を通して、生成物をその天然状態から組織、細胞又は発酵培養液の成分としてもたらす。例えば、不溶性材料の除去は、微粒子を含まない液体中の溶質としての生成物の捕捉（例えば、細胞、細胞片又は他の微粒子状物質を発酵培養液から分離すること）を含む第１のステップであり得る。これを達成するための例示的操作は、例えば、濾過、遠心分離、沈降、沈殿、綿状沈殿、電気集塵、重力沈降などを含む。追加的操作は、固体供給源、例えば植物及び動物組織から生成物を回収するために例えば粉砕、均質化又は浸出を含み得る。第２のステップは、その特性が所望の生成物の場合と著しく異なる成分を除去する「生成物単離」ステップであり得る。大部分の生成物において、水が主要な不純物であり、単離ステップは、その大部分を除去し、処理対象の材料の体積を低減し、生成物を濃縮するように設計される。溶媒抽出、吸着、限外濾過及び沈降は、このステップにおいて単独で又は組み合わせて用いられ得る。次のステップは、物理及び化学特性において生成物と酷似する汚染物質を分離する生成物精製を伴う。考えられる精製方法は、例えば、親和性、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、サイズ排除、逆相クロマトグラフィー、限外濾過－ダイアフィルトレーション、結晶化及び分別沈殿を含む。いくつかの実施形態では、下流プロセスは、収集清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。下流プロセスは、本明細書で説明される。

総シアル酸含量の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、約６日目～約１０日目、特に約６日目～約８日目（例えば、約６日目、約７日目、約８日目、約９日目、約１０日目、例えば約７日目）に培地から除去された一定分量からの組換えアルカリホスファターゼの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を測定することをさらに含む。一定分量は、汚染を阻止するためにバイオリアクターから無菌的に得ることができる。一定分量は、約１ｍＬ～約１０００ｍＬ（例えば、約２５ｍＬ～約５００ｍＬ、例えば約５０ｍＬ～約３００ｍＬ、例えば約１００ｍＬ又は約２００ｍＬ）であり得る。一定分量を得ることは、一定分量を遠心分離すること及び／又は一定分量から上清を除去することをさらに含み得る。このステップは、クロマトグラフィーカラム（例えば、プロテインＡカラム、１ｃｍプロテインＡカラム、例えば１ｍＬ ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム又は６００μＬプロテインＡ Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ）を使用して、上清からアルカリホスファターゼを精製することも含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼは、緩衝液交換を施され得る。アルカリホスファターゼは、例えば、ＴＳＡＣ濃度を測定する前にも濃縮され得る。

例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの炭水化物定量の商業的方法が利用可能である。一般に、ＴＳＡＣが酸加水分解を用いて糖タンパク質、例えばアスホターゼアルファから放出され、放出された糖／ＴＳＡＣは、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）などのカラムクロマトグラフィーを用いた電気化学的検出を介して検出される。得られるレベルは、内部標準に対して１モルあたりで定量され、総モルのタンパク質の関数として表される。

本明細書に記載の通り、ＴＳＡＣは、生理的状態における組換えアルカリホスファターゼの半減期に影響し、したがって例えばアスホターゼアルファなどの組換え生成されたアルカリホスファターゼにとって決定的な品質特性として機能する。再現性及びｃＧＭＰに対して、ＴＳＡＣ範囲の厳格な管理が重要である。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約０．８モル／モル～約４．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約１．０モル／モル～約２．８モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約１．２モル／モル～約２．４モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約０．９モル／モル、約１．０モル／モル、約１．１モル／モル、約１．２モル／モル、約１．３モル／モル、約１．４モル／モル、約１．５モル／モル、約１．６モル／モル、約１．７モル／モル、約１．８モル／モル、約１．９モル／モル、約２．０モル／モル、約２．１モル／モル、約２．２モル／モル、約２．３モル／モル、約２．４モル／モル、約２．５モル／モル、約２．６モル／モル、約２．７モル／モル、約２．８モル／モル、約２．９モル／モル又は約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。

いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣは、下流処理中に減少する。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣは、組換えアルカリホスファターゼを含有する溶液、例えば細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プール中に存在するシアリダーゼ酵素の結果として減少する。いくつかの実施形態では、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣを得るため、シアリダーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プールから選択的に除去される。シアリダーゼは、例えば、シアリダーゼに特異的な阻害剤、抗体、イオン交換及び／又はアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などの１つ又は組み合わせにより選択的に除去され得る。

いくつかの実施形態では、シアル酸部分は、組換えアルカリホスファターゼを含有する溶液、例えば細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プール中に存在するシアリルトランスフェラーゼ酵素により、組換えアルカリホスファターゼに添加される。いくつかの実施形態では、約０．９～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣを得るため、組換えシアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プールに外因性に添加される。

組換えアルカリホスファターゼ活性の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する。いくつかの実施形態では、本方法は、積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することを含む。

最終ステップは、生成物の研磨、即ち安定であり、容易に輸送可能であり、且つ便宜的な形態での生成物のパッケージングで完了するプロセスとして用いられ得る。２～８℃での貯蔵、－２０℃～－８０℃での凍結、結晶化、乾燥、凍結乾燥、フリーズドライ及び噴霧乾燥は、この最終ステップにおける例示的方法である。生成物の研磨では、生成物及びその使用意図に応じて、さらに生成物を滅菌し、生成物の安全性を損なう可能性がある微量汚染物質（例えば、ウイルス、内毒素、代謝廃棄生成物及び発熱物質）を除去又は非活性化し得る。

生成物回収方法は、本明細書で考察される２つ以上のステップを組み合わせ得る。例えば、吸着流動床（ＥＢＡ）では、不溶物の除去及び生成物単離が単一ステップで実施される。ＥＢＡのレビューとしては、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５ Ｊｕｎ；Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｕｎｉｔ ８．８を参照されたい。さらに、親和性クロマトグラフィーでは、単離及び精製が単一ステップでなされることが多い。

培養細胞において産生される組換えタンパク質を精製するための下流プロセスのレビューとしては、Ｒｅａ，２００８ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ Ｍａｒｃｈ ２：２０－２５を参照されたい。本明細書で開示されるアルカリホスファターゼのための下流プロセスは、下記の例示的ステップの少なくとも１つ又は任意の組み合わせを含み得る。

収集清澄化プロセス
本方法のいくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するための少なくとも１つの精製ステップ、例えば「収集する」ステップ又は収集清澄化ステップにより、細胞培養物から単離される。細胞培養物を「収集すること」は、典型的には細胞培養物を培養容器、例えばバイオリアクターから収集するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濾過、遠心分離及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、収集清澄化ステップは、細胞及び細胞片（例えば、不溶性生体材料）を除去するため、収集された細胞培養物を遠心分離及び／又は濾過し、生成物、例えば組換えアルカリホスファターゼを回収することを含む。いくつかの実施形態では、細胞及び細胞片は、クロマトグラフィーに適した清澄化濾液を得るために除去される。いくつかの実施形態では、清澄化濾液は、収集清澄化培養液又はＨＣＣＦとして知られる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、ＨＣＣＦを生成するため、遠心分離と深濾過との組み合わせが施される。このステップにおいて使用可能な溶液は、回収用緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）を含み得る。好適な回収用緩衝液の組成物は、当業者によって選択され得る。

いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約１．９モル／モル～約３．１モル／モルのＴＳＡＣを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約１．９モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルのＴＳＡＣを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルのＴＳＡＣを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４又は約４．５モル／モルのＴＳＡＣを有する。

収集後の限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション
本方法のいくつかの実施形態では、「ＵＦＤＦプール」又は「ＵＦＤＦ」としても知られる濾過プールを形成するため、少なくとも１つの精製ステップ後、追加的な精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濃縮及び緩衝液希釈が意図される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過（ＵＦ）及び／又はダイアフィルトレーション（ＤＦ）を含む。ＵＦプロセスにおける例示的ステップとして、例えばフィルター膜の使用前の洗浄／貯蔵、洗浄後／貯蔵後のフラッシュ、平衡化（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０を含有する緩衝液を用いる）、負荷、濃縮、ダイアフィルトレーション、希釈／フラッシュ／回収（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０を含有する緩衝液を用いる）及びフィルター膜の使用後のフラッシュ／洗浄／貯蔵が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＵＦ／ＤＦ後、ＵＦＤＦは、約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで希釈され、次に貯蔵及び／又はさらなる精製前に約１３℃～約２７℃で約０～約６０時間にわたって維持される。ＵＦＤＦの「保持」又は「維持」は、本明細書で用いられるとき、同じ温度（例えば、±約１℃以内又は規定範囲、例えば１９～２５℃）で目標時間、例えば「保持時間」（±約２時間以内）、維持されているＵＦＤＦを指す。一定温度の「保持」又は「維持」の詳細は、製造の規模及び製造規模の実施上の検討事項に依存的であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、組換えアルカリホスファターゼ作製プロセスにおける制御ポイントとして役立つように保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、均一な生成物品質を保証するために保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、下流処理を容易にするために保持される。

いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣは、ＵＦＤＦ保持時間中に減少する。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣの減少は、ＵＦＤＦの保持時間中のタンパク質濃度、時間の長さ及び／又は温度と相関する。

いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦ保持時間の開始は、ダイアフィルトレーションの完了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦ保持時間の開始は、濾過ステップの終了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦ保持時間の開始は、ＵＦ／ＤＦの終了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦ保持時間の開始は、ＵＦ／ＤＦステップの終了時の再循環の完了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦ保持時間の開始は、ＵＦ／ＤＦ生成物濾過及び移動が完了した直後である。

いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、所望のタンパク質濃度を達成するために希釈される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．０ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．８ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．８ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．３ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．０ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約１．６ｇ／Ｌ、約１．７ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／ｌ、約２．７ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ又は約４．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．７ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。

いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１時間～約６０時間にわたって保持される。例えば、ＵＦＤＦは、約１時間（以下）～約１０時間（例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間又は１０時間）にわたって保持され得る。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１０時間～約５０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１２時間～約４８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４時間～約４２時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１７時間～約３４時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１９時間～約３３時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２５～約３８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２９～約３５時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間又は約２０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間又は約３５時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間又は約４８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４～２０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２８～３４時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約４２～４８時間にわたって保持される。

上記のように、濾過ステップ（例えば、ＵＦＤＦ）中の保持時間は、細胞増殖中（例えば、約６日目～約１０日目、例えば約６日目～約８日目、例えば約７日目）に得られるＴＳＡＣ濃度に依存的である。例えば、一定分量が約２．５モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約９時間未満にわたって保持され得る。一定分量が約２．５モル／モル～約２．７モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１０時間～約１４時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．８モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約２３時間～約２７時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．０モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３８時間～約４２時間にわたって保持され得る。いくつかの実施形態では、一定分量のＴＳＡＣ濃度は、約２．５モル／モル未満であり得、且つ濾過ステップは、約９時間未満にわたって保持される。代わりに、一定分量のＴＳＡＣ濃度は、約２．５モル／モル～約２．７モル／モルであり得、且つ濾過ステップは、約１０時間～約１４時間にわたって保持される。

代替的な一実施形態では、一定分量が約２．３モル／モル以下のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１８＋／－４時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．４モル／モル～約３．１モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３２＋／－４時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．２モル／モル以上のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約４４＋／－４時間にわたって保持され得る。

別の代替的な実施形態では、一定分量が約２．４モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約１７＋／－３時間にわたって保持され得る。一定分量が約２．４モル／モル～約３．６モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約３１＋／－３時間にわたって保持され得る。一定分量が約３．６モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を有する場合、濾過ステップは、約４５＋／－３時間にわたって保持され得る。

いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１０℃～約３０℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４℃～約２６℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１５℃～約２６℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１５℃～約２５℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１９℃～約２５℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２２℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、保持時間の終了時、さらなる下流処理ステップが実施されるまで貯蔵される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、瞬間冷凍後、－８０℃で貯蔵される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的な精製ステップは、ウイルス不活性化ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、ウイルス粒子を化学的に不活性化するための溶剤／洗剤ウイルス不活性化プロセスを含む。例示的な溶剤／洗剤は、１０％ポリソルベート８０、３％ＴＮＢＰ、５０ｍＭリン酸ナトリウム及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含み得る。

クロマトグラフィー
本方法のいくつかの実施形態では、部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るため、ＵＦＤＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施され、ここで、組換えアルカリホスファターゼは、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する。いくつかの実施形態では、生成物をさらに精製し、且つ／又は不純物／汚染物質を分離するために少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、生成物（例えば、アルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファ）を捕捉する。例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡクロマトグラフィーのプロセスが用いられ得る。プロテインＡクロマトグラフィーで用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、平衡化／洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）、溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１．０）、剥離緩衝液（例えば、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）、フラッシング緩衝液、清浄液（例えば、０．１Ｍ ＮａＯＨ）などを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣでは、ブチルセファロース又はＣＡＰＴＯ（登録商標）ブチルアガロースカラムが用いられる。ＣＡＰＴＯ（登録商標）ブチルアガロースＨＩＣプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば添加希釈液／平衡化前緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．４Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５０）、平衡化緩衝液／洗浄緩衝液／溶出緩衝液（例えば、すべてがリン酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムを含有する）、ストリップ緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムを含有する）などが挙げられる。ブチルＨＩＣプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば添加希釈液／平衡化前緩衝液（例えば、１０ｍＭヘペス、２．０Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５０）、平衡化緩衝液／洗浄緩衝液／溶出緩衝液（例えば、すべてがリン酸ナトリウム又はヘペス及び硫酸アンモニウムを含有する）及びストリップ緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムを含有する）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的な精製ステップは、追加的なダイアフィルトレーションを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は少なくとも１つの追加的なダイアフィルトレーションステップを含む。いくつかの実施形態では、追加的なダイアフィルトレーションステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ後に実施される。いくつかの実施形態では、追加的なダイアフィルトレーションステップは、生成物濃縮及び／又は緩衝液交換を意図して実施される。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、平衡化緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）、ダイアフィルトレーション緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）などを含む。

いくつかの実施形態では、約０．５モル／モル～約４．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約０．９モル／モル～約３．９モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約１．１モル／モル～約３．２モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約１．４モル／モル～約２．６モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約０．８モル／モル、約０．９モル／モル、１．０モル／モル、約１．１モル／モル、約１．２モル／モル、約１．３モル／モル、約１．４モル／モル、約１．５モル／モル、約１．６モル／モル、約１．７モル／モル、約１．８モル／モル、約１．９モル／モル、約２．０モル／モル、約２．１モル／モル、約２．２モル／モル、約２．３モル／モル、約２．４モル／モル、約２．５モル／モル、約２．６モル／モル、約２．７モル／モル、約２．８モル／モル、約２．９モル／モル、約３．０モル／モル、約３．１モル／モル、約３．２モル／モル、約３．３モル／モル、約３．４モル／モル、約３．５モル／モル、約３．６モル／モル、約３．７モル／モル、約３．８モル／モル、約３．９モル／モル又は約４．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップが実施される。

追加的な下流プロセス
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、少なくとも１つの精製ステップ、追加的な精製ステップ、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ及び／又は追加的なクロマトグラフィーステップに加えて実施される。いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、生成物、例えば組換えアルカリホスファターゼをさらに精製する。

いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、任意のウイルス粒子をさらに除去するためのウイルス減少濾過プロセスを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス減少濾過プロセスは、ナノ濾過である。

いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、少なくとも１つのさらなるクロマトグラフィーステップを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなるクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、第３のクロマトグラフィーステップは、混合モードクロマトグラフィー、例えばＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィーである。市販の混合モード材料として、例えば疎水力及び静電力の組み合わせによる中性又は弱塩基性ｐＨでの結合及び低ｐＨでの静電荷反発による溶出を可能にする、ヒドロカルビルアミンリガンドを含有する樹脂（例えば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹからのＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ及びＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ）（Ｂｒｅｎａｃ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１１７７：２２６－２３３を参照されたい）；芳香族残基による疎水性相互作用を得て、硫黄原子がチオフィリック相互作用により標的タンパク質の結合を促進する、４－メルカプト－エチル－ピリジンリガンドを含有する樹脂（ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．７：４２－４８）；異なる伝導率でタンパク質の塩耐性吸着をもたらす、イオン基の近傍に水素結合基及び芳香族残基を有するリガンドを含有する、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー及びＣＡＰＴＯ（登録商標）ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）などの樹脂（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１２１７：２１６－２２４）；及び他の公知のクロマトグラフィー材料、例えば色素リガンドとの親和性樹脂、ハイドロキシアパタイト及びいくつかのイオン交換樹脂（限定されないが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ５０（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）又はＬｅｗａｔｉｔ ＣＮＰ１０５（Ｌａｎｘｅｓｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ、ＤＥ）を含む）が挙げられる。例示的なアガロースＨＩＣクロマトグラフィーステップでは、このプロセスで用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば平衡化前緩衝液（例えば、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．００）、平衡化／洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、４４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５０）、添加滴定緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．７５）、プール希釈緩衝液（例えば、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）及びストリップ緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２０が挙げられる。

いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、ウイルスクリアランスのためのウイルス濾過ステップを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施される。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、使用前及び生成後のフラッシュ緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）を含む。

いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、製剤化プロセスを含む。いくつかの実施形態では、製剤化プロセスは、さらなる濃縮及び／又は緩衝液交換を意図した少なくとも１つのさらなる限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、フィルターフラッシュ／平衡化／ダイアフィルトレーション／回収用緩衝液（例えば、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）を含む。

いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、バルク充填プロセスを含む。いくつかの実施形態では、バルク充填プロセスは、滅菌濾過を含む。滅菌濾過のための例示的なフィルターは、Ｍｉｌｌｉｐａｋ６０又は同等サイズのＰＶＤＦフィルターである（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される通り、培養細胞からアルカリホスファターゼを作製、精製及び／又は分離するために用いられるステップは、収集清澄化プロセス（又は無傷細胞及び細胞片を細胞培養物から除去するための類似プロセス）、限外濾過（ＵＦ）プロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼを濃縮するための類似プロセス）、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は先行プロセスから作製されたアルカリホスファターゼを含む緩衝液を変更又は希釈するための類似プロセス）、ウイルス不活性化プロセス（又はウイルス粒子を不活性化又は除去するための類似プロセス）、親和性捕捉プロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼを捕獲し、それを緩衝液／溶液成分の残りから分離するためのクロマトグラフィー方法のいずれか１つ）、配合プロセス及びバルク充填プロセスからなる群から選択されるステップの少なくとも１つをさらに含む。一実施形態では、培養細胞からアルカリホスファターゼを作製、精製及び／又は分離するためのステップは、本明細書で開示される通り、少なくとも、収集清澄化プロセス（又は無傷細胞及び細胞片を細胞培養物から除去するための類似プロセス）、収集後限外濾過（ＵＦ）プロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼを濃縮するための類似プロセス）、収集後ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は先行プロセスから作製されたアルカリホスファターゼを含む緩衝液を変更又は希釈するための類似プロセス）、溶媒／洗剤ウイルス不活性化プロセス（又はウイルス粒子を化学的に不活性化するための類似プロセス）、中間体精製プロセス（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は作製されたアルカリホスファターゼを捕獲し、それを緩衝液／溶液成分の残りから分離するためのクロマトグラフィー方法のいずれか１つ）、ＨＩＣ後ＵＦ／ＤＦプロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼに対して濃縮及び／又は緩衝液交換するための類似プロセス）、ウイルス減少濾過プロセス（又は任意のウイルス粒子又は他の不純物若しくは汚染物質をさらに除去するための類似プロセス）；混合モードクロマトグラフィー（例えば、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー又は作製されたアルカリホスファターゼをさらに精製及び／若しくは濃縮するための類似プロセス）、配合プロセス及びバルク充填プロセスを含む。一実施形態では、本明細書に提供される方法の分離ステップは、収集清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉、ＨＩＣクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びそれらの組み合わせの少なくとも１つをさらに含む。図１は、組換えアルカリホスファターゼ、アスホターゼアルファの作製プロセスの実施形態の代表的図面である。

いくつかの実施形態では、本開示は、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を含有する組換えタンパク質中のＴＳＡＣを、哺動物細胞培養物を通して制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞培養物中でグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濾過、遠心分離、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、精製ステップ及びクロマトグラフィーステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーション及びプロテインＡクロマトグラフィーである。

製造及び精製後、プロセスは、制御された範囲のシアリル化を有するバルク原薬（ＢＤＳ）を作製し得る。本方法は、ＴＳＡＣ濃度が約１．２モル／モル～約３．０モル／モル（例えば、約１．６モル／モル～約２．４モル／モル）の範囲に制御されたＢＤＳを作製し得る。例えば、ＢＤＳは、約１．０モル／モル、約１．１モル／モル、約１．２モル／モル、約１．３モル／モル、約１．４モル／モル、約１．５モル／モル、約１．６モル／モル、約１．７モル／モル、約１．８モル／モル、約１．９モル／モル、約２．０モル／モル、約２．１モル／モル、約２．２モル／モル、約２．３モル／モル、約２．４モル／モル、約２．５モル／モル、約２．６モル／モル、約２．７モル／モル、約２．８モル／モル、約２．９モル／モル又は約３．０モル／モルのＴＳＡＣ濃度を有し得る。

いくつかの実施形態では、ＢＤＳは、凍結乾燥され、且つ／又は例えば分配のためにバイアル中に装入される。

アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
本開示は、組換え細胞培養におけるアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）の製造に関する。アルカリホスファターゼタンパク質は、少なくともいくらかのアルカリホスファターゼ活性を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドを含む分子を含む。様々な実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、当技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る、アルカリホスファターゼ機能を有する任意のポリペプチドを含む。

特定の実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、本明細書で開示される方法によって作製され、次いで精製された後、アルカリホスファターゼ関連疾患又は障害を治療又は予防するために用いられ得る。例えば、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、内因性アルカリホスファターゼの減少及び／又は機能不全を有するか、又は過剰発現された（例えば、正常レベルを超える）アルカリホスファターゼ基質を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、細胞型、組織（例えば、結合、筋肉、神経又は上皮組織）又は臓器（例えば、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、骨、軟骨、靱帯、腱など）を特異的に標的にする。例えば、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、完全長アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）又は少なくとも１つのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の断片を含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的部分（例えば、下記のような負に荷電したペプチド）に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、免疫グロブリン部分（完全長又は断片）に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。例えば、かかる免疫グロブリン部分は、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）を含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的部分と免疫グロブリン部分（完全長又は断片）との両方に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。本明細書で開示されるアルカリホスファターゼタンパク質のより詳細な説明については、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１０３２６３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレット（それらの両方の教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ－Ｘ、Ｘ－ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ－Ｙ、Ｙ－ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｙ、ｓＡＬＰ－Ｙ－Ｘ、Ｘ－ｓＡＬＰ－Ｙ、Ｘ－Ｙ－ｓＡＬＰ、Ｙ－ｓＡＬＰ－Ｘ及びＹ－Ｘ－ｓＡＬＰ（式中、Ｘは、本明細書に記載のように骨標的部分を含み、且つＹは、本明細書に記載のように免疫グロブリン部分を含む）からなる群から選択される構造のいずれか１つを含む。一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ／Ｅｎ－Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝８～２０であり、及びｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である）の構造を含む。いくつかの実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリアスパラギン酸配列である。例えば、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸配列であり得、ここで、ｎは、８～２０の任意の数（両方が含まれる）である（例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり得る）（配列番号３）。一実施形態では、Ｄｎは、Ｄ１０（配列番号２）又はＤ１６（配列番号４）である。いくつかの実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリグルタミン酸配列である。例えば、Ｅｎは、ポリグルタミン酸配列であり得、ここで、ｎは、８～２０の任意の数（両方が含まれる）である（例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０であり得る）（配列番号５）。一実施形態では、Ｅｎは、Ｅ１０（配列番号６）又はＥ１６（配列番号７）である。

例えば、かかるｓＡＬＰは、免疫グロブリン分子の完全長又は断片（例えば、結晶化可能領域断片（Ｆｃ））に融合され得る。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。一実施形態では、ｎ＝１０である。別の実施形態では、Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－３及びＩｇＧ－４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。一実施形態では、前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ－１の定常ドメインである。特定の一実施形態では、前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８－Ｋ７１４に示される配列を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。かかるｓＡＬＰは、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）の少なくとも１つの切断を触媒する能力がある。様々な実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある。かかるｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型のすべてのアミノ酸を含み得る。かかるＡＬＰは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）、胚細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）又は本明細書で開示されるそれらのキメラ若しくは融合型又は変異体の少なくとも１つであり得る。特定の一実施形態では、ＡＬＰは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１－Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。さらに別の実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１－Ｓ４８５に示される配列を含む。

一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、ＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０（配列番号１）の構造を含む。アスパラギン（Ｎ）残基（例えば、Ｎ１２３、２１３、２５４、２８６、４１３及び５６４）は、予想されるグリコシル化部位に対応する。アミノ酸残基（Ｌ４８６－Ｋ４８７及びＤ７１５－Ｉ７１６）は、それぞれｓＡＬＰとＦｃとの間及びＦｃとＤ１０（配列番号２）ドメインとの間のリンカーに対応する。

この実施形態では、ポリペプチドは、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１－Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６－Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８－Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、アミノ酸Ｄ７１５－Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７－Ｄ７２６（Ｄ１０（配列番号２））を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、Ｃｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に４つの鎖内ジスルフィド結合を有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間の２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳動物アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。

ＡＬＰには、４つの既知のアイソザイム、即ちさらに下に記される組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿１１２６０３及びＮＰ＿００１６２３に記述される通り）、胚細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号Ｐ１０６９６に記述される通り）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１６２２に記述される通り）が存在する。これらの酵素は、酷似する三次元構造を有する。それら触媒部位の各々は、２個のＺｎ及び１個のＭｇを含む、酵素活性にとって必要な金属イオンに対する４つの金属結合ドメインを有する。これらの酵素は、リン酸のモノエステルの加水分解を触媒し、高濃度のリン酸受容体の存在下でトランスリン酸化反応も触媒する。ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）に対する３つの既知の天然基質は、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５：１４４０－１４４５，１９９５）。これらのアイソザイム間の整列化は、国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレット（その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）の図３０に示される。

本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、任意のＡＬＰタンパク質の二量体又は多量体を単独で又は組み合わせて含み得る。キメラＡＬＰタンパク質又は融合タンパク質、例えばＫｉｆｆｅｒ－Ｍｏｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８９３７４，２０１４（その全教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のキメラＡＬＰタンパク質も作製され得る。

特定の一実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に対して８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に対して９５％又は９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む。

ＴＮＡＬＰ
上に示される通り、ＴＮＡＬＰは、糖脂質を通してそのＣ末端に固定される膜結合タンパク質である（ヒトＴＮＡＬＰについては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６を参照されたい）。この糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、翻訳後、一時的な膜アンカーとＧＰＩの付加に対するシグナルとの両方として役立つ疎水性Ｃ末端の除去後に付加される。したがって、一実施形態では、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、疎水性Ｃ末端配列の１番目のアミノ酸、即ちアラニンが停止コドンで置換されるＴＮＡＬＰを含む。そのように形成された可溶性ＴＮＡＬＰ（本明細書中でｓＴＮＡＬＰと称される）は、ＧＰＩ膜アンカーを欠如する触媒部位の形成に必要である、ＴＮＡＬＰの天然アンカー型のすべてのアミノ酸を含有する。公知のＴＮＡＬＰとして、例えばヒトＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ－０００４６９、ＡＡＩ１０９１０、ＡＡＨ９０８６１、ＡＡＨ６６１１６、ＡＡＨ２１２８９及びＡＡＩ２６１６６］；アカゲザルＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＸＰ－００１１０９７１７］；ラットＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３７１９１］；イヌＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＦ６４５１６］；ブタＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＮ６４２７３］、マウスＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３１４５７］、ウシＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿７８９８２８、ＮＰ＿７７６４１２、ＡＡＭ８２０９及びＡＡＣ３３８５８］並びにネコＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１０３６０２８］が挙げられる。

本明細書で用いられるとき、用語「細胞外ドメイン」は、（例えば、ペプチドシグナルを伴わない）天然タンパク質の任意の機能的細胞外部分を指すことを意味する。元のアミノ酸１～５０１（分泌時、１８～５０１）、アミノ酸１～５０２（分泌時、１８～５０２）、アミノ酸１～５０４（分泌時、１８～５０４）又はアミノ酸１～５０５（分泌時、１８～５０５）を保持する組換えｓＴＮＡＬＰポリペプチドは、酵素活性がある（Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １２６：６９４－６９９を参照されたい）。これは、アミノ酸残基が天然タンパク質のＣ末端からその酵素活性に影響することなく除去され得ることを示す。さらに、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、１つ以上のアミノ酸置換を含み得、かかる置換は、ｓＴＮＡＬＰの酵素活性を低下させないか又は少なくとも完全に阻害することはない。例えば、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の原因となることが知られる特定の突然変異は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレットに列挙されており、機能的ｓＴＮＡＬＰを維持するために回避される必要がある。

負に荷電したペプチド
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、所定の細胞型、組織又は臓器に対してアルカリホスファターゼタンパク質を特異的に標的にすることがある標的部分を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる所定の細胞型、組織又は臓器は、骨組織である。かかる骨標的部分は、任意の公知のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は当技術分野で公知の小分子化合物を含み得る。例えば、負に荷電したペプチドは、骨標的部分として用いられ得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせ（例えば、少なくとも１つのアスパラギン酸と少なくとも１つのグルタミン酸とを含むポリペプチド、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の組み合わせを含む負に荷電したペプチド）であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ６（配列番号８）、Ｄ７（配列番号９）、Ｄ８（配列番号１０）、Ｄ９（配列番号１１）、Ｄ１０（配列番号２）、Ｄ１１（配列番号１２）、Ｄ１２（配列番号１３）、Ｄ１３（配列番号１４）、Ｄ１４（配列番号１５）、Ｄ１５（配列番号１６）、Ｄ１６（配列番号４）、Ｄ１７（配列番号１７）、Ｄ１８（配列番号１８）、Ｄ１９（配列番号１９）、Ｄ２０（配列番号２０）又は２０を超えるアスパラギン酸を有するポリアスパラギン酸であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｅ６（配列番号２１）、Ｅ７（配列番号２２）、Ｅ８（配列番号２３）、Ｅ９（配列番号２４）、Ｅ１０（配列番号６）、Ｅ１１（配列番号２５）、Ｅ１２（配列番号２６）、Ｅ１３（配列番号２７）、Ｅ１４（配列番号２８）、Ｅ１５（配列番号２９）、Ｅ１６（配列番号７）、Ｅ１７（配列番号３０）、Ｅ１８（配列番号３１）、Ｅ１９（配列番号３２）、Ｅ２０（配列番号３３）又は２０を超えるグルタミン酸を有するポリグルタミン酸であり得る。一実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ１０（配列番号２）～Ｄ１６（配列番号４）又はＥ１０（配列番号６）～Ｅ１６（配列番号７）からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。

スペーサー
いくつかの実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ部分と標的部分との間にスペーサー配列を含む。一実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）部分と負に荷電したペプチド標的部分との間にスペーサー配列を含む。かかるスペーサーは、任意のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、かかるスペーサーは、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）の断片を含み得る。有用なＦｃ断片は、ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧのＦｃ断片を含む。かかるＩｇＧは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－３及びＩｇＧ－４又はそれらの任意の組み合わせのいずれかであり得る。

この理論に制限されることなく、骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）で用いられるＦｃ断片がスペーサーとして作用し、ｓＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０の発現がｓＴＮＡＬＰ－Ｄ１０の発現よりも高いと仮定すると、タンパク質がより効率的に折り畳まれることを可能にすると考えられる。１つの考えられる説明は、Ｆｃ断片の導入が、本明細書に例示されるｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加される高度に負に荷電したＤ１０配列（配列番号２）の存在によって引き起こされる斥力を軽減することである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０、ｓＡＬＰ－Ｄ１０－Ｆｃ、Ｄ１０－ｓＡＬＰ－Ｆｃ、Ｄ１０－Ｆｃ－ｓＡＬＰ、Ｆｃ－ｓＡＬＰ－Ｄ１０及びＦｃ－Ｄ１０－ｓＡＬＰからなる群から選択される構造を含む。他の実施形態では、上記の構造中のＤ１０（配列番号２）は、他の負に荷電したポリペプチド（例えば、Ｄ８（配列番号１０）、Ｄ１６（配列番号４）、Ｅ１０（配列番号６）、Ｅ８（配列番号２３）、Ｅ１６（配列番号７）など）で置換される。

本開示にとって有用なスペーサーは、例えば、Ｆｃを含むポリペプチド並びにｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加される高度に負に荷電した骨標的配列（例えば、Ｄ１０（配列番号２））の存在によって引き起こされる斥力を軽減することができる親水性及び柔軟性ポリペプチドを含む。

二量体／四量体
具体的な実施形態では、本開示の骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質は、二量体又は四量体を形成するように会合される。

二量体立体配置では、鎖間ジスルフィド結合の形成によって課せられる立体障害は、おそらく、正常細胞内に存在する最小の触媒活性タンパク質二量体に会合するためのｓＡＬＰドメインの会合性を阻止する。

骨標的化ｓＡＬＰは、任意選択的に、１）負に荷電したペプチド（例えば、骨標識剤）から下流、及び／又は２）負に荷電したペプチド（例えば、骨標識剤）とＦｃ断片との間、及び／又は３）スペーサー（例えば、Ｆｃ断片）とｓＡＬＰ断片との間に１つ以上の追加的なアミノ酸をさらに含み得る。例えば、骨標的コンジュゲートを作製するために用いられるクローニング方法により、これらの位置に外因性アミノ酸が導入される場合にこれが生じ得る。しかし、外因性アミノ酸は、さらなるＧＰＩアンカーシグナルをもたらさないように選択される必要がある。設計された配列が宿主細胞のトランスアミダーゼによって切断される可能性は、Ｉｋｅｚａｗａ，２００２ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．２５：４０９－１７に記載のように予測可能である。

本開示は、例えば、本明細書中で明記されるものを含むグリコシル化、アセチル化、アミド化、封鎖、ホルミル化、γ－カルボキシグルタミン酸水酸化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸及び硫酸化によって翻訳後修飾される融合タンパク質も包含する。

アスホターゼアルファ
アスホターゼアルファは、２つのＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０ポリペプチド（それぞれ配列番号１に示されるような７２６アミノ酸を有する）からなる可溶性Ｆｃ融合タンパク質である。各々のポリペプチド又は単量体は、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１－Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６－Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８－Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、リンカーとしてＤ７１５－Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７－Ｄ７２６（Ｄ１０（配列番号２））を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、４つの鎖内ジスルフィド結合をＣｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間での２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳動物アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。

アスホターゼアルファは、次のようにも特徴付けることができる。Ｎ末端からＣ末端へ、アスホターゼアルファは、（１）ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の可溶性触媒ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６）、（２）ヒト免疫グロブリンＧ１ Ｆｃドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８５７）、及び（３）骨標的化ドメインとして用いられるデカアスパラギン酸ペプチド（Ｄ１０（配列番号２））を含む（Ｎｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ８８：２４４－２５５）。タンパク質は、２つの一次タンパク質配列からホモ二量体に会合する。この融合タンパク質は、６つの確認された複雑なＮ－グリコシル化部位を有する。これらのＮ－グリコシル化部位の５つは、ｓＡＬＰドメイン上に位置し、１つは、Ｆｃドメイン上に位置する。アスホターゼアルファ上に存在する別の重要な翻訳後修飾は、酵素とＦｃ－ドメイン構造とを安定化するジスルフィド架橋の存在である。全部で４つの分子内ジスルフィド架橋が１単量体あたりに存在し、２つの分子内ジスルフィド架橋が二量体中に存在する。アルカリホスファターゼドメインの１つのシステインが遊離している。

アスホターゼアルファは、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の治療のための酵素置換治療薬として用いられている。ＨＰＰを有する患者では、ＴＮＳＡＬＰをコードする遺伝子における機能欠失変異は、ＴＮＳＡＬＰ酵素活性の欠損を引き起こし、基質、例えば無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）の循環レベルの上昇をもたらす。アスホターゼアルファのＨＰＰを有する患者への投与により、ＰＰｉが切断され、カルシウムとの組み合わせのために無機リン酸塩が放出され、それによりハイドロキシアパタイト結晶形成及び骨石灰化が促進され、正常な骨格表現型が回復される。アスホターゼアルファ及び治療におけるその使用に関するさらなる詳細については、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１０３２６３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレットを参照されたい。

いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の通り、通常の手段により、活性に対して潜在的な負の影響を有する金属イオンの濃度を最小化するか、若しくは活性に対して潜在的な正の影響を有する金属イオンの濃度を増加させるか、又はその両方によって作製されるアルカリホスファターゼと比べて、作製されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の改善された酵素活性を有するアルカリホスファターゼ（アスホターゼアルファ）を提供する。活性は、任意の公知の方法によって測定され得る。かかる方法は、例えば、作製されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の、アルカリホスファターゼの基質、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）に対する酵素活性を測定するインビトロ及びインビボアッセイを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされる。かかる高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含み得る。

実施例１：アスホターゼアルファ製造プロセス
例示的なアスホターゼアルファバルク原薬（ＢＤＳ）製造プロセスを図１に示す。

産生バイオリアクターにおける細胞培養発酵の７日目にＴＳＡＣ含量を測定し、それを使用して下流収集後限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ１）ステップの保持時間を決定したアスホターゼアルファ製造プロセスを以下に詳細に記載する。この追加されたステップは、品質管理の向上を提供し、ヒトにおける使用のために既に承認された許容可能な範囲で最終ＴＳＡＣ含量が維持された。製造プロセス及び目標ＴＳＡＣ範囲は、適正な酵素活性、治療有効半減期及びバッチ間の再現性を有する最終薬物生成物を提供する。

インプロセスＴＳＡＣ制御の過程
シアル酸は、生理学的条件下で分子の半減期に影響するアスホターゼアルファに関連するグリコシル化の公知の形態である。１．２～３．０モルのシアル酸／アスホターゼアルファ単量体１モル（モル／モル）の許容可能な範囲内のＴＳＡＣレベルの制御は、適正な効力、治療有効半減期及びバッチ間の再現性を有する最終薬物生成物を提供するために必要である。ＴＳＡＣは、産生バイオリアクター（細胞培養液、ＣＣＦ、図１のステップ２）中で生成され、収集された細胞培養液（ＨＣＣＦ、図１のステップ３）中のＴＳＡＣは、プロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）（ＰｒｏＡ）、クロマトグラフィーステップ（図１のステップ５ｂ）前の収集後限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ１）（図１のステップ４）プール保持中に減少する。

ＵＦ／ＤＦ１プール保持は、ＢＤＳ ＴＳＡＣのための重要なインプロセス制御ステップである。事前の小規模特徴付け試験は、収集後ＵＦ／ＤＦ１保持時間、タンパク質濃度及び温度がＵＦ／ＤＦ１プール保持中にＴＳＡＣが減少する幅に有意に影響することを確立した。

ＴＳＡＣ製造データレビュー
ＴＳＡＣは、製造中の２つのステップ（ＰｒｏＡプール及びＢＤＳ放出）で測定される。バッチのサブセットについて、ＴＳＡＣを産生バイオリアクターステップ（７日目及び１０日目、ＣＣＦと称される）、収集ステップ（ＨＣＣＦ））及びＨＩＣステップでも測定した。２０，０００ＬバッチについてのＴＳＡＣデータを表１にまとめる。製造データのレビューは、表１にまとめられ、且つ図２に示される通り、ＴＳＡＣがＨＣＣＦステップ（図１のステップ３）からＰｒｏＡステップ（図１のステップ５ｂ）まで減少することを裏付けた。

ＢＤＳでのＴＳＡＣ結果は、規格外（ＯＯＳ）であった３つの結果（（＃８、＃９及び＃１１）を含め、下側規格限界付近に傾くことが観察された。上流プロセス、特に産生バイオリアクターの変動性が、ＢＤＳ ＯＯＳ ＴＳＡＣの証明可能な原因として同定された。さらに、産生バイオリアクターの下流のＴＳＡＣ制御（ＵＦ／ＤＦ１保持）は、この上流変動性に応答するように最適に設計されなかった。

向上されたＴＳＡＣ制御方法
向上されたＴＳＡＣ制御方法が開発された。向上された方法は、産生バイオリアクター中のＴＳＡＣレベルを監視し、それに応じてＵＦ／ＤＦ１プロセスパラメータを調節してプロセス制御及びＢＤＳでのＴＳＡＣの性能を改善することを含む。具体的には、産生バイオリアクターサンプルから７日目に測定されるＴＳＡＣ（「７日目ＴＳＡＣ」と称される）は、ＵＦ／ＤＦ１単位操作前のＴＳＡＣについての推定値を提供し得る。７日目ＴＳＡＣをプロセスのためのインプロセス制御（ＩＰＣ）として導入し、７日目ＴＳＡＣについての関連処理限界は各バッチについての目標ＵＦ／ＤＦ１保持時間を同定する。サンプル調製（小規模プロテインＡ精製）及びＴＳＡＣアッセイ持続時間は、目下、ＵＦ／ＤＦ１操作の開始及び保持前の実際のＴＳＡＣのアットライン測定を除外することから、７日目ＴＳＡＣは、細胞培養の終了又は収集後からのＴＳＡＣ結果に代わるものとして用いられる。バイオリアクター中のバッチ毎に特定されるＴＳＡＣ作製に応じたＵＦ／ＤＦ１保持方法を最適化するため、タンパク質濃度目標及び範囲を調整した。ＵＦ／ＤＦ１保持温度は不変とした。

ＴＳＡＣ制御をさらに向上させるためにＵＦ／ＤＦ１操作において導入される変化を表２にまとめる。７日目ＴＳＡＣ処理限界を表３にまとめる。小規模ＵＦ／ＤＦ１特徴付け試験及び製造規模バッチからの追加的なＴＳＡＣデータ収集から生成された予測モデルを用いてパラメータ及び特性範囲並びにＩＰＣ処理限界を最適化した。

ＴＳＡＣ制御方法のアップデートは、産生バイオリアクター中の細胞培養プロセス中に生成されるより広範囲のＴＳＡＣと比べてプロセス制御及びＢＤＳでのＴＳＡＣの性能を改善した。開発バッチは、ＵＦ／ＤＦ１保持時間を微調整するために用いられ、７日目ＴＳＡＣインプロセス制御の製造操作実行可能性を実証し、改変された制御方法の有効性を実証する。

４つの初期開発バッチは、ＢＤＳまで良好に実施された（バッチ１６、１７、１８及び１９；表１並びに図２及び３を参照されたい）。小規模プロテインＡクロマトグラフィーを用いて産生バイオリアクターからの７日目サンプルを精製し、次いでＴＳＡＣについて試験した。４つの開発バッチの３つについて、７日目ＴＳＡＣ結果を用いて表３に規定されたものと同様の事前に規定された処理限界に基づきＵＦ／ＤＦ１保持時間を調節した。１つのバッチ（１７）は、固定保持時間目標で実施されて事前に規定された範囲未満の最短保持時間の操作実行可能性が実証された。向上されたＴＳＡＣ制御方法を用いてＢＤＳまで３つの追加的バッチが製造された（バッチ２０～２２）。向上されたＴＳＡＣ制御を用いたすべてのバッチについてのＴＳＡＣ及びＵＦ／ＤＦ１プロセスデータを表１にまとめる。すべてのバッチについて、ＵＦ／ＤＦ１温度、タンパク質濃度及び保持時間は、向上された制御方法について規定された許容可能な範囲内であった（表２）。実際のＵＦ／ＤＦ１保持時間は、７日目処理限界について規定された目標範囲内であり（表３）、但し、異なる７日目処理限界を用いて実施された第１の開発バッチ１６を除く。

産生バイオリアクター（ＣＣＦ）からの及び収集後（ＨＣＣＦ）（図２に示されるＨＣＣＦ）のＴＳＡＣは、予備バッチと比較して向上されたＴＳＡＣ制御バッチにおいて同様の傾向であり、７日目ＴＳＡＣは、ＵＦ／ＤＦ１単位操作前のＴＳＡＣ（ＨＣＣＦ ＴＳＡＣ）に近似する（表１、図２）。７日目ＴＳＡＣ制御なしのバッチ１～１５（ｎ＝１５）についての平均ＢＤＳ ＴＳＡＣは、７日目ＴＳＡＣ制御を利用したバッチ（バッチ１７～２２、ｎ＝６）についての２．１モル／モル（１．９～２．４モル／モルの範囲）の平均ＢＤＳ ＴＳＡＣと比較して１．３モル／モルであった。バッチ１７～２２についてのＢＤＳ ＴＳＡＣの変化は、前のバッチと比較して規格範囲の中間点に近く、向上されたＴＳＡＣ制御を用いてそれらのバッチについて実行されたＵＦ／ＤＦ１保持条件と一致し、その効力を実証する（表１並びに図２及び図３）。これらのバッチにおける産生バイオリアクター（７日目）からのＴＳＡＣがより短い目標ＵＦ／ＤＦ１保持時間をもたらした一方、向上されたＴＳＡＣ制御方法は、産生バイオリアクターからのＴＳＡＣアウトプットの範囲に動的に応答する。より高いＴＳＡＣアウトプットが７日目に測定される場合、向上された方法は適切な目標ＵＦ／ＤＦ１保持時間を同定及び規定してＢＤＳでのＴＳＡＣを規格範囲の中間点により近く変化させ、ＯＯＳ結果を回避する。

向上されたＴＳＡＣ制御方法の実行可能性及び効力の実証に加え、バッチ１７から２２までのＢＤＳは放出規格ごとのすべての基準に合致し、プロセス性能に対しても他の生成物品質特性に対しても悪影響がないことを裏付ける。

他の実施形態
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により援用される。前述の本開示は、理解を明確にすることを意図して図面及び実施例を通してある程度詳細に記載されているが、特定の小さい変更及び修正が実施されることは、当業者に自明である。したがって、説明及び実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

上記の詳細な説明及び実施例は、理解の明確性のために挙げたに過ぎない。不要な限定がそれから理解されるべきではない。本開示は、示され且つ記載される正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変更形態は、特許請求の範囲によって定義される本開示内に含まれる。

特に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲において用いられる構成成分の量、分子量などを表現するすべての数字は、すべての例において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。したがって、そうでないことが特に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本開示によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも且つ特許請求の範囲の均等物の教義を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告される有効数字に照らして且つ通常の丸めの技術を適用することによって解釈すべきである。

本開示の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値にもかかわらず、具体的な実施例に示される数値範囲は、可能な限り正確に報告される。しかし、すべての数値範囲は、それらの各々の試験測定値に見出される標準偏差から必ず得られる範囲を固有に含む。

本明細書に引用されるすべての特許、仮特許出願を含む特許出願、特許公開及び非特許公開を含む刊行物並びに電子的に利用可能な資料（例えば、ジェンバンク及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列登録物並びに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列登録物並びにジェンバンク及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参照によって援用される。上記の詳細な説明及び実施例は、理解の明確性のために挙げたに過ぎない。不要な限定がそれから理解すべきではない。本開示は、示され且つ記載される正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変更形態は、特許請求の範囲によって定義される実施形態内に含まれる。

Claims (39)

1. 組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
   （ａ）組換えアルカリホスファターゼを発現する細胞をバイオリアクターに接種することと；
   （ｂ）前記組換えアルカリホスファターゼを含む水性培地を得ることと；
   （ｃ）接種後約６日目～約１０日目に前記水性培地から一定分量を得ることと；
   （ｄ）前記一定分量中の前記組換えアルカリホスファターゼ１モルあたりの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）モル濃度を定量することと；
   （ｅ）前記水性培地を収集することと；
   （ｆ）少なくとも１回の精製ステップを実施してバルク薬液（ＢＤＳ）を得ることと
   を含み、
   （ｉ）
   （１）前記一定分量は、約２．５モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約９時間未満にわたって保持されるか；
   （２）前記一定分量は、約２．５モル／モル～約２．７モル／モルのＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約１０時間～約１４時間にわたって保持されるか；
   （３）前記一定分量は、約２．８モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約２３時間～約２７時間にわたって保持されるか；若しくは
   （４）前記一定分量は、約３．０モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約３８時間～約４２時間にわたって保持されるか；又は
   （ｉｉ）
   （１）前記一定分量は、約２．５モル／モル未満のＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約５時間～約９時間にわたって保持されるか；
   （２）前記一定分量は、約２．５モル／モル～約２．７モル／モルのＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約１６時間～約２０時間にわたって保持されるか；若しくは
   （３）前記一定分量は、約２．７モル／モル超のＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約３０時間～約３４時間にわたって保持されるか；又は
   （ｉｉｉ）
   （１）前記一定分量は、約２．３モル／モル以下のＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約１４時間～約２２時間にわたって保持されるか；
   （２）前記一定分量は、約２．４モル／モル～約３．１モル／モルのＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約２８時間～約３６時間にわたって保持されるか；若しくは
   （３）前記一定分量は、約３．２モル／モル以上のＴＳＡＣ濃度を含み、及び前記濾過ステップは、約４０時間～約４８時間にわたって保持される、方法。
2. ステップ（ｃ）は、接種後約７日目に前記水性培地から前記一定分量を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記濾過ステップは、限外濾過、ダイアフィルトレーション又はそれらの組み合わせを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４に記載の方法。
6. 前記一定分量の前記ＴＳＡＣ濃度は、約２．５モル／モル未満であり、及び前記濾過ステップは、約９時間未満にわたって保持される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記一定分量の前記ＴＳＡＣ濃度は、約２．５モル／モル～約２．７モル／モルであり、及び前記濾過ステップは、約１０時間～約１４時間にわたって保持される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記濾過ステップ中のアルカリホスファターゼ濃度は、約１．８ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記濾過ステップ中の前記アルカリホスファターゼ濃度は、約１．８～約４．３ｇ／Ｌである、請求項８に記載の方法。
10. 前記濾過ステップ中の前記アルカリホスファターゼ濃度は、約２．３ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ又は約３．７ｇ／Ｌである、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＢＤＳの前記ＴＳＡＣ濃度は、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ＢＤＳの前記ＴＳＡＣ濃度は、約１．６モル／モル～約２．４モル／モルである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記濾過ステップは、一定温度で保持される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記一定温度は、約１５℃～約２５℃である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記一定温度は、約１９℃～約２５℃である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記温度は、約２２℃である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記一定分量は、無菌的に得られる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記一定分量は、約１ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記一定分量は、約５０ｍＬ～約３００ｍＬである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記一定分量は、約１００ｍＬ又は約２００ｍＬである、請求項１９に記載の方法。
21. ステップ（ｃ）は、前記一定分量を遠心分離することをさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ステップ（ｃ）は、前記一定分量から上清を除去することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. ステップ（ｃ）は、クロマトグラフィーカラムを使用して、前記上清から前記アルカリホスファターゼを精製することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡカラム、１ｍＬ ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム；６００μｌプロテインＡ Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ；又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡ固相カラムを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記プロテインＡカラムは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡカラムである、請求項２４に記載の方法。
26. ステップ（ｃ）は、緩衝液交換を実施することをさらに含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ステップ（ｃ）は、前記アルカリホスファターゼを濃縮することをさらに含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ステップ（ｄ）は、酸加水分解を実施してＴＳＡＣを放出させることを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記アルカリホスファターゼを凍結乾燥させることをさらに含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記アルカリホスファターゼをバイアル中に装入することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記バイオリアクターは、少なくとも２Ｌの容積を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記容積は、少なくとも１０Ｌである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記容積は、少なくとも１，０００Ｌである、請求項３２に記載の方法。
34. 前記容積は、少なくとも１０，０００Ｌである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記容積は、約２０，０００Ｌである、請求項３４に記載の方法。
36. 前記培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地；ＣＤ ＤＧ４４培地；ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地；ＳＦＭ４ＣＨＯ培地；及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、
    Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
    Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
    Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
    Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
    Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；
    Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び
    ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
    の構造を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項３７に記載の方法。

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