JP2002541213A - 不妊症の処置のための乾燥粉末処方物の肺投与 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 肺深部へのエアロゾル化された送達のための、安定化濾胞刺激タンパク質（ＦＳＰ）乾燥粉末組成物、このような組成物を調製および投与する方法、ならびに肺深部への肺性送達によって乾燥粉末を投与する工程を包含する不妊症を処置するための方法が提供される。哺乳動物被験体の肺深部へ送達するための本発明の安定化乾燥粉末組成物は、（ｉ）薬理学的有効量の濾胞刺激タンパク質（ＦＳＰ）、および（ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本願は、米国仮特許出願第６０／１２９，１２１号（１９９９年４月１３日出
願）および同第６０／１３０，０９９号（１９９９年４月２０日出願）（これら
のいずれも、その全体が参考として援用される）の優先権の利益を主張する。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、濾胞刺激タンパク質（ＦＳＰ）を含み、そして肺深部への送達に適
した、安定な乾燥粉末組成物の肺投与、このような組成物を調製および投与する
方法、ならびに不妊症を処置する方法に関する。

【０００３】 （発明の背景） 濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、脳下垂体によって分泌されるヘテロダイマー
性腺刺激ホルモンであり、ＦＳＨに加えて、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）およ
び黄体形成ホルモン（ＬＨ）を含む、３つの下垂体前葉糖タンパク質ホルモンの
うちの１つである。ＦＳＨは、アルファ（α）サブユニットおよびベータ（β）
サブユニットといわれる２つの非共有結合サブユニットからなる。αサブユニッ
トは、３つのホルモンの間で同じであるが、βサブユニットは、各ホルモンに対
して固有であり、特異性を与える。ヒトにおいては、成熟αサブユニットは、９
２アミノ酸残基からなり、２つの糖鎖を有する。対応するＦＳＨ成熟βサブユニ
ットは、１１１アミノ酸から構成され、また２つの糖鎖を有する。ともに、２つ
のサブユニットは、質量分析によって測定された約３１ｋＤの分子量、およびグ
リコシル化の状態に依存してＰＡＧＥまたはゲルクロマトグラフィーによって測
定された約３５〜４５ｋＤの分子量を有する。ＦＳＨは、卵巣の顆粒膜細胞およ
び精巣のＳｅｒｔｏｌｉ細胞の代謝活性を直接調節する。

【０００４】 濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の薬学的調製物は、ヒト不妊症の処置において重
要な役割を果たし、そしてＦＳＨの投与（単独または他の生物学的に活性な化合
物およびタンパク質との組み合わせのいずれか）は、１９６０年代初期から不妊
問題を処置するために使用されてきた。女性において、ＦＳＨは、卵巣の濾胞発
育を促進し、そしてＦＳＨの薬学的調製物は、主に排卵誘発手順およびインビト
ロでの受精手順のために使用される。［Ｓｐｅｒｏｆｆ，Ｌ．Ｇｌａｓｓ，Ｒ．
Ｈ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｒｔｉｂｉｌｉｔｙ，５８３〜６０９（１９８９）；Ｊ
ｏｎｅｓ，Ｈ．Ｗ．ら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ，３８：１４〜２１（１９
８２）］。男性においては、このような組成物は、低ゴナドトロピン性性機能低
下症における精子形成を開始および維持するために使用される［Ｗｉｔｃｏｍｂ
，Ｒ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，７０：３〜
７（１９９０）］。

【０００５】 初期の不妊処置方法においては、ＦＳＨ含有処方物は、筋深部への注射を介し
て投与された。このような注射は、代表的には患者のパートナーまたはヘルスケ
ア提供者の助けを与えられ、そして代表的な皮下注射針の５倍までのサイズの針
の使用を必要し、非常に苦痛であった。より最近には、精製または組換えＦＳＨ
が（しばしば患者の自己投与によって）皮下投与される処方物が開発されてきた
。皮下投与されたＦＳＨは、自己投与処置を介して患者のさらなる自立を可能に
することによって、筋内送達された薬物を越える利点を提供するが、針に基づく
送達方法に関連する、不便、不快、または生来の嫌悪にさえ起因して、多くの患
者は、ＦＳＨの皮下投与を必要とする不妊処置を受けることを嫌がるかまたは気
が進まない。

【０００６】 肺送達は、皮下注射の魅力的な代替法として、非常に注目を浴びてきた。なぜ
なら、このアプローチは、針の必要性を排除し、皮膚および身体の粘膜に対する
刺激（経皮的、イオン泳動的、および鼻腔内送達された薬物の共通の副作用）を
制限し、そして鼻および皮膚浸透エンハンサー（しばしば皮膚刺激作用／皮膚炎
を引き起こす、鼻腔内および経皮系の代表的化合物）の必要性を排除するからで
ある。肺投与はまた、経済的に魅力的であり、患者の自己投与を受入可能であり
、そしてしばしば他の代替の投与様式よりも患者によって好まれる。しかし、そ
れらの高い分子量および低い親油性のため、ペプチドまたはタンパク質に基づく
薬物は、伝統的に、肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によって投与さ
れるこれらの薬物の中にはなかったが、種々のエアロゾル処方物が提案されてき
た。さらに、気管内送達を介した乾燥粉末形態のＦＳＨを投与する先の試みは、
明らかに低いバイオアベイラビリティー（静脈内投与に対して０．６％）を生じ
、性腺刺激ホルモン（例えば、ＦＳＨ）を送達するための肺経路の望ましくなさ
を示す［Ｋｏｍａｄａ，Ｆ．ら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８３，（
６）：８６３〜８６７（１９９４）］。

【０００７】 投与のためのタンパク質の処方においてしばしば遭遇する別の問題は、それら
の不活性化への傾向である。より効果的な精製技術および組換え技術の近年の出
現により、尿由来ＦＳＨ［Ａｒｐａｉａ，Ｇ．ら、米国特許第５，１２８，４５
３号（１９９２年７月７日）］および組換えＦＳＨ［Ｌｏｕｍａｙｅ，Ｅ．ら、
Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．，６３：７７〜８６（１９９５）］の両方の非常
に精製された形態が入手可能になり、この問題をさらにより明白にした。これら
の非常に精製された形態のＦＳＨは、より精製されていない形態を越える多くの
潜在的利点（バッチからバッチへの改良された整合性、黄体形成ホルモンおよび
他の競合タンパク質の不存在による非常に特異的な活性、改良された効力、注射
に対する良好な局所耐性、ならびに低い免疫原性を含む）を提供するが、非常に
純粋なＦＳＨを含む調製物は、しばしば非常に不安定である。これらの調製物は
、しばしば比較的短い時間で分解し、生物活性の部分的損失または完全な損失さ
えも伴う。さらに、注射可能形態への再構成のための、ＦＳＨ含有固体処方物を
安定化し得る賦形剤が記載されている［例えば、Ｓａｍａｒｉｔａｎｉら、米国
特許第５，６５０，３９０号（１９９７年７月２２日）］が、このような固体処
方物は、代表的には、肺送達のために必要な特徴を欠く。

【０００８】 従って、タンパク質の肺送達を最適化するためになされてきた多くの研究によ
ってさえも、（ｉ）十分に安定化され、呼吸に適するＦＳＨの乾燥粉末形態を提
供し、（ｉｉ）低温貯蔵の必要性を排除し（ｉｉｉ）優れたエアロゾル特性を有
する粉末を提供し、（ｉｖ）分散を助ける推進剤も、下気道における吸収を促進
するエンハンサー化合物も必要とせず、そして（ｖ）良好な肺性バイオアベイラ
ビリティーを示す、ＦＳＨの肺送達の有効な系および方法は未だ存在しない。

【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、肺深部（ｄｅｅｐ ｌｕｎｇ）を介する体循環への送達のための安
定化ＦＳＨ乾燥粉末組成物を提供する。本発明の乾燥粉末は、吸入を介するエア
ロゾル適用および投与をされる場合、不妊症の治療および処置に有用である。

【００１０】 本発明の呼吸可能な乾燥粉末組成物は、薬理学的に有効な量の濾胞刺激タンパ
ク質（ＦＳＰ）および薬理学的に受容可能な賦形剤を含む。より詳細には、本発
明の粉末乾燥物は、哺乳動物尿誘導ＦＳＰまたは組換えＦＳＰを含む。

【００１１】 本発明の乾燥物は、肺深部に吸入によりエアロゾル適用および投与される場合
に、良好なバイオアベイラビリティを示す。本発明の乾燥物は、代表的には約１
％〜６０％の範囲にある相対的肺性バイオアベイラビリティ値を有する、少なく
とも約１％の相対的肺性バイオアベイラビリティにより特徴付けられる。

【００１２】 別の局面では、本発明は、上記のような、安定化乾燥粉末ＦＳＰ組成物を調製
する方法に関する。この方法は、溶媒を用いてＦＳＰおよび賦形剤を混合して溶
液または懸濁液を形成させる工程、ならびにこの溶液または懸濁液を乾燥して、
ＦＳＰおよび賦形剤物質を含む乾燥粒子を含む生物活性粉末を形成させる工程を
包含する。この方法における使用のための特定の溶媒は、水およびアルコールで
ある。この方法の好ましい実施形態では、ＦＳＰ組成物は、スプレー乾燥により
生成される。

【００１３】 なお別の局面では、本発明は、それ必要とする哺乳動物被験体にＦＳＰを送達
するための方法を提供し、ここで、この方法はエアロゾル適用形態において先に
記載されるように、ＦＳＰ乾燥粉末組成物の吸入による投与を包含する。

【００１４】 本発明はまた、なお別の局面では、哺乳動物被験体における不妊症を処置する
ための方法を包含し、ここで、本発明に従うＦＳＰ乾燥粉末組成物の治療的に有
効な量が、肺における蓄積そして肺からの吸収のための吸入により、被験体に投
与される。特定の実施形態では、被験体検体は、不妊症の雌であり、そしてＦＳ
Ｐ乾燥粉末組成物は、少なくとも３〜２０日の期間にわたる１つ以上の処置のサ
イクルのための被験体の肺への吸入により、定期的に投与され、ここで、この投
与の結果として、被験体は、この投与の前に測定された濾胞成長のレベルに対し
て増加した、濾胞成長のレベルを示す。１つの実施形態では、ＦＳＰの治療的に
有効な量は、１日あたりＦＳＰの約１０〜１０００ＩＵである。別の実施形態で
は、ＦＳＰの治療的に有効な量は、１日あたり約５０〜約３０００ＩＵである。
なお別の実施形態（詳細には、過剰排卵治療（すなわち、体外受精）に関する）
では、ＦＳＰの治療的に有効な量は、１日あたり、ＦＳＰの約２００〜１２，０
００ＩＵである。

【００１５】 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を、添付の図
面および実施例と共に読めばより十分に理解できる。

【００１６】 （発明の詳細な説明） （Ｉ定義） 「生物活性粉末」とは、インビトロ活性またはインビボ活性のいずれかを有す
る粉末をいい、そして代表的には、ＦＳＰのような１つ以上の生物活性物質また
は薬学的物質を含む粉末をいう。本発明の粉末の「生物活性」は、一般に、当該
分野で公知のＦＳＨアッセイ（例えば、シグナル伝達アッセイ、ＦＳＨレセプタ
ー結合アッセイ、あるいは種々のＳｔｅｅｌｍａｎ／Ｐｏｈｌｅｙインビトロラ
ット卵巣重量アッセイ、ＦＳＨ半減期測定および/またはＦＳＨ生物活性アッセ
イ［Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，８４−８８（１９９８）
；Ｄａｈｌ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ，１３：１１
−２２（１９９２）；ＲｏｔｈおよびＤｉａｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：７９２
８（１９９６）；Ｖａｌｖｏｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １３５：２６５７
（１９９４）；Ｓｐｒｅｎｇｅｌら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４：５２
５（１９９０）；Ｔｉｌｌｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３１：７９９−８０
６（１９９２）；ＳｔｅｅｌｍａｎおよびＰｏｈｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
．５３：６０４（１９５３）；Ｂｉｓｈｏｐら、Ｅｎｄｃｒｉｎｅ．１３６：２
６３５（１９９５）；Ｍｕｌｄｅｒｓら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２５：２６
９（１９９７）；Ｆａｒｅｓ，ＰＮＡＳ，８９：４３０４（１９９２）；ＬａＰ
ｏｌｔら、Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ．１３１：２５１４（１９９２）］）を用いて測
定され得る。インビトロでの生物学的活性についてのこのようなアッセイのさら
なる例としては、ラット顆粒膜細胞アロマターゼアッセイを用いる、顆粒膜細胞
によるエストラジオール産生の測定［Ｄａｈｌら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１６９：４１４（１９８９）；およびＦＳＨレセプター活性化アッセイ（例えば
、Ｋｅｌｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８９：１４
１（１９９２）に記載される）］を含むが、これに限定されない。

【００１７】 「相対的肺性バイオアベイラビリティ」は、筋肉内注射部位または皮下注射部
位から血液内に吸収される割合に対する、吸収されそして哺乳動物の血液に入る
肺内に蓄積されるＦＳＰ乾燥粉末用量の割合である。相対的肺性バイオアベイラ
ビリティを決定するための例示的モデル系としては、ラット、ウサギ、およびサ
ルが挙げられる。本発明のＦＳＰ乾燥粉末組成物は、血漿または血液中に少なく
とも約１％の相対的肺性バイオアベイラビリティ（一般に約１〜２０％、そして
好ましくは約１％〜約６０％の範囲の相対的肺性バイオアベイラビリティを有す
る）により、特徴付けられる。相対的肺性バイオアベイラビリティは、ＦＳＰ−
乾燥粉末組成物の直接的な気管内投与からまたは吸入による蓄積を測定すること
により評価され得る。

【００１８】 「分布相」は、ＦＳＰの半減期に関連して、ホルモンが血漿から消失する間の
初期の急速な相をいう。終末の緩徐な相または排出相の半減期は、ホルモンが身
体から排出される間の終末の緩徐な相をいう。

【００１９】 「薬学的に受容可能な塩」としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩
、臭化水素酸塩、および硝酸塩のような無機酸を用いて調製される塩、あるいは
リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、コハク酸エチ
ル塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコ
ルビン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）塩
、サリチル酸塩、およびステアリン酸塩、ならびにエストレート（ｅｓｔｏｌａ
ｔｅ）塩、グルセプテート（ｇｌｕｃｅｐｔａｔｅ）塩、およびラクトビオン酸
（ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ）塩のような有機酸を用いて調製される塩が挙げら
れるが、それらに限定されない。薬学的に受容可能なカチオンを含む類似の塩と
しては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、および
アンモニウム（置換アンモニウムを含む）が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００２０】 「クエン酸塩」は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム（アルキルアンモニ
ウム塩を含む）、カルシウムなどのようなカチオンを有する、クエン酸の任意の
薬学的に受容可能な塩をいう。

【００２１】 「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基の両方を含む任意の化合物をい
う。アミノ酸は、一般に、カルボキシ官能基に隣接した位置で存在するが、アミ
ノ基は、分子内の任意の位置に配置されてもよい。アミノ酸はまた、アミノ、チ
オ、カルボキシル、カルボキサミド、イミダゾールなどのような、さらなる官能
基を含む。アミノ酸は、合成アミノ酸でもよいし、天然に存在するアミノ酸でも
よく、そしてそれらのラセミ体、または光学活性（Ｄ−またはＬ−）体のいずれ
かで用いられ得る。

【００２２】 「エンハンサー」は、下気道の上皮を介し、そして体循環へのＦＳＰの吸収を
増大させる化合物をいう。エンハンサーの存在下では、体循環へと吸収されるＦ
ＳＰの量は、このようなエンハンサーを欠く乾燥粉末についての吸収される量よ
りもより多く、そして好ましくは、エンハンサーの非存在下で吸収される量の少
なくとも約１５０％まで増加される。

【００２３】 「送達用量効率（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」
または「ＤＤＥ」は、発射（ｆｉｒｉｎｇ）事象または分散事象の後での、適切
な吸入器デバイス（ｉｎｈａｌｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）のマウスピースから乾燥粉
末を送達することの表示（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を提供する。ＤＤＥは、用語
「放出用量（ｅｍｉｔｔｅｄ ｄｏｓｅ）」または「ＥＤ」と同義である。より
詳細には、このＤＤＥ（ＥＤ）は、単位用量パッケージから引き出されかつ吸入
器デバイスのマウスピースを出る、粉末のパーセンテージの尺度である。ＤＤＥ
（ＥＤ）は、公称用量（すなわち、発射前に適切な吸入器デバイスに配置された
単位用量当たりの、粉末の質量）に対する吸入器デバイスにより送達される用量
の比として規定される。ＤＤＥ（ＥＤ）は、実験的に決定されるパラメーターで
あり、そして代表的には、患者が服用するのを模倣するデバイスを使用して、決
定される。ＤＤＥ値を決定するために、乾燥粉末の公称用量が（代表的には、単
位用量形態で）、適切な乾燥粉末吸入器（例えば、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓに譲渡された、米国特許第５，７８５，０４９号に
記載されるもの）に配置され、次いで、この乾燥粉末吸入器が作動され、その粉
末が分散される。次いで、生じたエアロゾル雲が、このデバイスからの真空によ
り引き込まれ、このデバイスにおいて、このエアロゾル雲は、このデバイスのマ
ウスピースに取り付けられた風袋を量った（ｔａｒｅｄ）フィルター上にて捕捉
される。このフィルターに達する粉末の量が、その送達用量を構成する。例えば
、吸入器デバイスに配置された投薬形態を含む乾燥粉末５ｍｇについて、その粉
末の分散が上記のような風袋を量ったフィルター上の４ｍｇの粉末の回収をもた
らす場合、その乾燥粉末組成物についてのＤＤＥは、４ｍｇ（送達用量）／５ｍ
ｇ（公称用量）×１００＝８０％である。不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ
）粉末について、ＤＤＥ値は、乾燥粉末以外の発射の後の吸入器デバイスから薬
物を送達することの表示を提供し、そしてこのＤＤＥ値は、総粉末重量ではなく
薬物の量に基づく。

【００２４】 「微細粒子画分（ｆｉｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）」または
「ＦＰＦ」は、３．３μｍ未満の空気力学直径（ａｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉ
ａｍｅｔｅｒ）を有するエアロゾル化した粉末粒子の質量パーセントとして規定
され、代表的には、Ａｎｄｅｒｓｅｎカスケードインパクターでの測定により決
定される。このパラメーターは、薬物の全身取り込みのために患者の肺深部（ｄ
ｅｅｐ ｌｕｎｇ）に到達する最大能力を有する、粒子のパーセントの表示を提
供する。

【００２５】 「エアロゾル能力（ａｅｒｏｓｏｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）係数」または
「ＡＰＣ」は、単位投薬形態（例えば、ブリスターパック）から肺深部への、総
粉末送達効率の推定値（ｅｓｔｉｍａｔｅ）であり、そして２８．３リットル／
分の真空で作動されるショートスタック（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｃｋ）Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎカスケードインパクターを使用して、実験的に決定される。ＡＰＣは、用
語「微細粒子（ｆｉｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）用量」または「ＦＰＤ」と同義で
ある。このＡＰＣは、単位投薬形態（例えば、ブリスターまたはカプセル）にて
含まれる粉末の質量（ミリグラム）に対する、３．３マイクロメートル未満の粒
子サイズを有するエアロゾル化粉末の総質量（ミリグラム）として規定され、そ
して、以下のパーセンテージとして表される：ＡＰＣ（％）＝３．３μｍ未満の
エアロゾル化粉末総質量（ｍｇ）÷単位投薬形態充填（ｆｉｌｌ）質量×１００
。

【００２６】 「乾燥粉末」とは、自由に流動しかつ（ｉ）吸入器デバイスにて容易に分散さ
れ得、かつ（ｉｉ）その粒子の一部が肺に到達して肺胞への貫通が可能であるよ
うに、被検体により吸入され得る、微細に分散した固体粒子を含む組成物をいう
。このような粉末は、「呼吸に適する（ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ）」または肺送達
に適切であると考えられる。乾燥粉末は、約０．１％〜１０％の水分を含み、そ
して代表的には、約１０％未満の水分を含み、好ましくは、５％未満の水分を含
み、そしてより好ましくは、約３％未満の水分を含む。他のように述べない限り
、「肺深部への送達のための乾燥粉末組成物」は、エアロゾル化された場合、乾
燥粉末粒子として投与される、組成物である。

【００２７】 「濾胞刺激タンパク質」または「ＦＳＰ」は、ヒト濾胞刺激ホルモン（「ｈＦ
ＳＨ」と類似する構造および機能を有する、タンパク質またはタンパク質混合物
を意味する。ＦＳＰは、ｈＦＳＨ、ｈＦＳＨのアミノ酸アナログ（「ｈＦＳＨア
ナログ」）、ｈＦＳＨの糖形態、ｈＦＳＨアナログの糖形態を含み、ならびにｈ
ＦＳＨ、ｈＦＳＨアナログ、ｈＦＳＨの糖形態、およびｈＦＳＨアナログの糖形
態から選択されるタンパク質の混合物を含む。

【００２８】 ヒト尿から種々の程度に精製されたＦＳＨ（「ｕＦＳＨ」）は、ｈＦＳＨと類
似の構造および機能を有するタンパク質の混合物であり、従って、ＦＳＰの定義
内にある。ｕＦＳＨは、ｈＦＳＨおよびｈＦＳＨアナログの混合物（各々もまた
、グリコシル化の不均一性を有する）である。

【００２９】 所謂、組換えＦＳＰ（「ｒＦＳＰ」）は、ｈＦＳＨと類似の構造および機能を
有するタンパク質の混合物であり、そしてｈＦＳＨアミノ酸配列またはｈＦＳＨ
アナログのアミノ酸配列を発現するように、組換え技術または関連技術を使用し
て改変された宿主細胞において生合成される［Ｋｅｅｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６４：４７６９〜４７７５（１９８９）；Ｃｈａｐｐｅｌ，Ｓ．ら、
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３^rd Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ
ｏｎ Ｇｙｎｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １７９〜
１８４（１９９２）；またはＲｅｄｄｙ，Ｖ．Ｂ．ら、米国特許第５，１５６，
９５７号（１９９２年１０月２０日）］。ｒＦＳＨの不均一性は、とりわけ、転
写における非忠実性（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）および宿主細胞の特徴である翻訳
後修飾の不均一性により引き起こされるか、または培養条件、精製、処方、およ
び貯蔵から生じる。

【００３０】 構造的に、ｈＦＳＨは、アルファ（α）サブユニットおよびベータ（β）サブ
ユニットと呼ばれる、２つの非共有結合したサブユニットからなる、ヘテロ二量
体糖タンパク質である。ヒトＦＳＨαサブユニットは、９２アミノ酸の鎖、５つ
のサブユニット内ジスルフィド結合、および２つのＮ結合型グリコシル側鎖から
なる。ヒトＦＳＨαサブユニットのアミノ酸配列は、本明細書中にて配列番号５
として示される。ヒトＦＳＨβサブユニットは、１１１アミノ酸の鎖、６つのサ
ブユニット内ジスルフィド結合、および２つのＮ結合型グリコシル側鎖からなる
。そのアミノ酸配列は、本明細書中にて配列番号６として示される。ジスルフィ
ド結合は、ｈＦＳＨαサブユニット中の残基７と３１とを、残基１０と６０とを
、残基２８と８２とを、残基３２と８４とを、そして残基５９と８７とを連結し
、そしてジスルフィド結合は、ｈＦＳＨβサブユニット中の残基３と５１とを、
残基１７と６６とを、残基２０と１０４とを、残基２８と８２とを、残基３２と
８４とを、そして残基８７と９４とを連結する。Ｎグリコシル化の部位は、αサ
ブユニット（配列番号５）中の５２位および７８位、そしてβサブユニット（配
列番号６）中の残基７および残基２４である。まとめると、この２つのサブユニ
ットは、質量分析法により測定される約３１ｋＤの分子量を、そしてグリコシル
化の状態に依存して、ＰＡＧＥまたはゲルクロマトグラフィーにより測定される
約３５〜４５ｋＤの分子量を有する。適切な配列情報（参照とともに）が、Ｅｎ
ｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅにて見出され得る。このＥｎｔｒ
ｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）
により提供されそして維持される。前駆体αサブユニットについての例示的タン
パク質配列は、例えば、Ｅｎｔｒｅｚアクセス番号６９１６０（１１６アミノ酸
）に対応し、これは、そのＣ末端の９２アミノ酸が、成熟αサブユニット配列を
構成する；前駆体βサブユニットについての代表的配列が、以下のＥｎｔｒｅｚ
アクセス番号１２０５５２、同４７６４４１、同１８２７６７、同１８２７６２
および同５１１８５４（１２９アミノ酸）により同定され、そのＣ末端の１１１
アミノ酸が成熟βサブユニット配列を構成する。

【００３１】 機能的には、ＦＳＰの活性は、生物活性粉末について本明細書中に記載される
ように決定される。「ＦＳＰ活性」「ＦＳＰ生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ
）」、「ＦＳＨ活性」、「ＦＳＨ生物活性」などの機能性の概念は、ヘテロ二量
体の安定性、ＦＳＨ関連シグナル伝達アッセイにおける活性；ＦＳＨレセプター
結合；Ｓｔｅｅｌｍａｎ／Ｐｏｈｌｅｙインビボラット卵巣重量アッセイの一バ
ージョン；インビボ薬物動態学的尺度（例えば、インビボ半減期）；当該分野で
公知かつ本明細書中に記載されるような、インビボ薬力学的試験（例えば、卵巣
成長の増大）によって、測定され得る。本発明の乾燥粉末に含まれるＦＳＰの比
活性は、約１００〜１７５ＩＵ／ｍｇタンパク質（一般的にＬＨまたは他の共に
精製されたタンパク質を含む、ｕＦＳＨについての代表的活性範囲）から約１０
００〜１３，５００ＩＵ／ｍｇタンパク質（超高純度の尿ＦＳＨ（Ａｒｐａｉａ
ら、１９９２）または組換え材料について）までの範囲であり得、そしてその供
給源に、およびホルモンの精製の程度に、依存する。

【００３２】 ＦＳＰは、グリコシル化形態、非グリコシル化形態、修飾型グリコシル化形態
、および他の糖形態を含むことが、意味される。グリコシル化形態が、好ましい
。グリコシル化ＦＳＰは、通常、そのグリコシル化がいくらかの程度不均一であ
り、どのサンプル中にも多数のグリコシル化種を有する。グリコシル化の不均一
性は、そのＦＳＰが生合成された細胞の型、ならびにＦＳＰが曝された翻訳後、
分泌後、精製の間および貯蔵の間の状態に、広範に依存し得る。これは、以下に
記載される通りである：ＢａｅｎｚｉｎｇｅｒおよびＧｒｅｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４７、２８７〜３０６（１９９８）；Ｂｉｓ
ｈｏｐら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８、７２２〜７３１（１９９４）；
ＴｈｏｔａｋｕｒａおよびＢｌｉｔｈｅ、Ｇｌｙｃｏｂｙｏｌｏｇｙ ５、３〜
１０（１９９５）；Ｄａｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、７２〜７４（１９８
８）；Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１６、７６５〜
７８７（１９９５）；Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０
、２８２０〜２８３２（１９９２）；ＢｅｉｔｅｎｓおよびＰａｄｍａｎａｂｈ
ａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２、１４５〜１５１
（１９９１）；Ｈａｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９３、１０６４〜
１０６９（１９９０）；Ｈａｒｒｉｓら、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２、
８０７〜８１１（１９９６）；Ｈａｋｏｌａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ．１２７、５９〜６９（１９９７）。糖形態は、ｈＦＳＨのグリコシ
ル化の型または形態と比較して、グリコシル化の型またはパターンにバリエーシ
ョンを有する、糖タンパク質の形態である。糖形態は、炭水化物アナログ（アミ
ノ酸アナログとは異なって）として意図され得る。

【００３３】 ＦＳＰは、ｈＦＳＨのアミノ酸アナログ（すなわち、ｈＦＳＨアナログ）を含
み、これは例えば、以下において記載されるものである：Ｍｏｎａｈａｎ，Ｍ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：４６１６〜４６２０（１９７３）；Ｎｅ
ｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．ら、米国特許第４，２３４，５７１号（１９８０年１１月１
８日）；Ｆｕｊｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１６：１１４４〜１１
４７（１９７３）；Ｃｏｙ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６７：５７６〜５８２（１９７５）；Ｃｏｍｂａｒｎｏｕ
ｓ，Ｙ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３（４）：６７０〜６９１
（１９９２）、およびＡｎｔｏｎｉ，Ｆ．ら、米国特許第４，５５２，８６４号
（１９８５年１１月１２日）。ｈＦＳＨアナログは、ｈＦＳＨに構造的および機
能的に類似する化合物であるが、ｈＦＳＨと比較して、１つ以上のアミノ酸が置
換、欠失、付加、または改変されている点で、ｈＦＳＨと構造的に異なる。本明
細書中のｈＦＳＨアナログは、ｈＦＳＨと比較して、いくつかの尺度により少な
くとも１０％の生物活性を示さなければならない。ｈＦＳＨアナログサブユニッ
トの例は、配列番号１〜４および７〜３１におけるものが挙げられるが、これら
に限定されない。機能に必須であるＦＳＨアナログ中のアミノ酸は、当該分野で
公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャンニング変異誘
発［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｎｅｃｅ ２４４：１０８
１〜１０８５（１９８９）］）によって同定され得る。後者の手順は、その分子
のすべての残基にて単一のアラニン変異を導入する。次いで、生じた変異体分子
は、生物学的活性について試験される。リガンド−タンパク質結合に重要な部位
はまた、構造分析（例えば、結晶学、核磁気共鳴分光法、または光親和性標識［
Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４（１９９２）；
ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１２（１９９２）］によ
り同定され得る。

【００３４】 本発明において使用するための特に好ましいｈＦＳＨアナログは、「ｈＦＳＨ
改変体」である。ｈＦＳＨとは、１つ以上のアミノ酸が、ｈＦＳＨの４つの末端
（αサブユニットおよびβサブユニットの各々が、２つの末端（Ｎ末端およびＣ
末端）を有する）のうちの１つ以上から欠失している点で、ｈＦＳＨと構造的に
異なる、ＦＳＨである。ｈＦＳＨ改変体において、ｈＦＳＨと比較して、１つ以
上のアミノ酸の付加、置換、または欠失がまた、αサブユニット、βサブユニッ
ト、または両方の内部に（すなわち、末端ではない）存在し得る。ｈＦＳＨ改変
体αサブユニットのアミノ酸配列の例としては、必要に応じて少なくとも１つの
さらなる置換、付加、または欠失を含む、配列番号２９〜３１の配列が挙げられ
るが、これらに限定されない。ｈＦＳＨ改変体βサブユニットのアミノ酸配列の
例としては、必要に応じて少なくとも１つのさらなる置換、付加、または欠失を
含む、配列番号１１〜２８の配列が挙げられるが、これらに限定されない。特定
の改変体は、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．ら、国際特許出願公開ＷＯ００／０４
９１３（２０００年２月３日）に記載されるように、当該分野において周知であ
る。

【００３５】 好ましいｈＦＳＨ改変体は、以下である：１）一方または両方のサブユニット
が末端欠失を有するが、ここでいずれの欠質も、αサブユニットのＮ末端からの
、１、２、３、４、５、または６のアミノ酸、αサブユニットのＣ末端からの、
１、２、３、４、または５のアミノ酸、βサブユニットのＮ末端からの、１また
は２のアミノ酸、およびβサブユニットのＣ末端からの、１、２、３、４、５、
６、または７のアミノ酸、に限定されるもの；２）一方または両方のサブユニッ
トが上記１）に記載の１つ以上の欠失を有するが、ただし、αサブユニットのＣ
末端は欠失を有さないもの；３）βサブユニットのＣ末端に欠失を有するもので
あり、そしてこの場合には、より好ましくは、βサブユニットのＣ末端から少な
くとも３のアミノ酸が欠失したもの；４）サブユニットがＮ末端において欠失を
有さないもの、またはＮ末端において多くとも１つまたは２つのアミノ酸が欠失
したものであり、そしてこの場合には、より好ましくは、βサブユニットのＮ末
端において欠失したもの；５）改変βサブユニットと組み合わせられた全長（９
２アミノ酸）のαサブユニットを有するもの、好ましくは、１〜７のアミノ酸が
Ｃ末端から欠失し、そしてＮ末端からアミノ酸が欠失しないか、または１つまた
は２つのアミノ酸がＮ末端から欠失したかのいずれかのもの；全て、ｈＦＳＨと
比較して、必要に応じて、アミノ酸の１つ以上の欠失、置換、または付加を内部
に（すなわち、末端ではない）有する。最も好ましいｈＦＳＨ改変体は、配列番
号５、２９〜３１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するαサブユニット、およ
び配列番号１１〜２８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するβサブユニットか
らなるもの、ならびに配列番号２９〜３１のいずれか１つのアミノ酸配列を有す
るαサブユニット、および配列番号６のアミノ酸配列を有するβサブユニットか
らなるものである。

【００３６】 本明細書中におけるｈＦＳＨ改変体の命名のために、配列番号または欠失され
たアミノ酸が参照され、「デス（ｄｅｓ）」に続いて、位置番号もしくは欠失し
たアミノ酸の３文字のコードおよび位置を使用する（例えば、ｄｅｓＡｌｎ１）
か、または単に、１文字もしくは３文字のコードで除去されたアミノ酸を示し、
そして影響を受けた位置を示す（例えば、１ＮもしくはＡｓｎ¹）かの、いずれ
かである。配列番号は、以下に同定される。

【００３７】

【表１】 「質量中央直径」または「ＭＭＤ」とは、平均粒子サイズの尺度である。なぜ
なら、本発明の粉末は、一般に多分散である（すなわち、ある範囲の粒子サイズ
からなる）からである。本明細書中に報告されるＭＭＤ値は、遠心分離沈降によ
り決定されるが、多数の通常使用される技術（例えば、電子顕微鏡検査、光散乱
、およびレーザー回折）を、平均粒子サイズを測定するために使用し得る。

【００３８】 「質量中央空気力学直径」または「ＭＭＡＤ」とは、分散した粒子の空力学的
サイズの尺度である。空力学的直径を使用して、エアロゾル化粉末を、その沈降
挙動の観点から記載し、そして空力学的直径とは、一般的に空気中で、その粒子
と同じ沈降速度を有する、単位密度球の直径である。空力学的直径は、粒子の形
状、密度、および粒子の物理的大きさを包含する。本明細書中において使用され
る場合、ＭＭＡＤは、カスケードインパクトにより決定されるエアロゾル化粉末
の空力学的粒子サイズ分布の中央点または中央値をいう。

【００３９】 「薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア」とは、被験体（特に、被験体の
肺）に対して有意な不利な毒物学的効果を有さずに、ＦＳＨとともに肺中に取り
込まれ得る賦形剤をいう。

【００４０】 「薬理学的有効量」または「生理学的有効量のＦＳＰ」とは、本明細書中に記
載されるような組成物が、肺中への堆積および肺による吸収のための吸入により
投与される場合に、処置されるべき被験体の血流中に所望のレベルの薬物を提供
して予測される生理学的応答を与えるために必要とされる、本明細書中に記載の
ような乾燥粉末組成物中に存在する、ＦＳＰの量である。正確な量は、多数の要
因（例えば、ＦＳＰの供給源（尿または組換え）、組成物の特異的な活性、使用
される送達デバイス、粉末の物理的特徴、その意図される使用、および患者の考
慮）に依存し、そして本明細書中に提供される情報に基づいて、当業者により容
易に決定され得る。

【００４１】 治療の前に、特定の不妊症の雌性被験体は、一般に、小さな濾胞（すなわち、
代表的に膣プローブを使用する超音波の実施により決定される各卵巣の最大断面
が、直径１０ｍｍ未満である濾胞）を有する。「増加した濾胞成長」とは、雌性
不妊症の処置に関して、本発明のＦＳＰ乾燥粉末組成物の投与の前のベースライ
ンレベルに対して増加した、被験体における濾胞の成長のレベルである。濾胞成
長の増加は、１０ｍｍ以上の平均直径を有する濾胞の数の増加により、測定され
る。好ましくは、増加した濾胞成長は、１０ｍｍ以上の平均直径までの成長を示
す１つ以上の濾胞により、示される。排卵誘導型治療において、増加した濾胞増
殖は、代表的に、１０ｍｍ以上の平均直径までの成長を示す１〜２以上の濾胞に
より、示される。過剰排卵型治療（例えば、インビトロ受精）において、増加し
た濾胞成長は、好ましくは、１０ｍｍ以上の平均直径までの成長を示す２以上の
濾胞、より好ましくは、１０ｍｍ以上の直径までの大きさの増加を有する３〜５
の濾胞、なおより好ましくは、このような大きさの特徴を示す６〜８以上の濾胞
により、示される。処置（特に、過剰排卵処置）の経過にわたって、被験体にお
ける完全な濾胞の発達の１つの指標は、１０ｍｍより大きな直径を有する平均９
以上の濾胞であり、ここで、最大に成長した濾胞は、１６ｍｍ以上の平均直径ま
で成熟した。ＦＳＨ治療の効力はまた、他の方法（例えば、超音波および被験体
のエストラジオールレベル）により、評価され得る。

【００４２】 「安定化乾燥粉末組成物」とは、特に肺深部へのエアロゾル化送達のための乾
燥粉末に関して、以下の粉末である：（ｉ）ＦＳＨおよび賦形剤材料（単数また
は複数）を含む粉末であり、ここで、この賦形剤は、メレチトースではない、（
ｉｉ）少なくとも５０ＩＵ／ｍｇ ＦＳＨの特異的活性、より好ましくは少なく
とも１００ＩＵ／ｍｇ ＦＳＨの特異的活性を有する粉末、および（ｉｉｉ）周
囲条件下、室温で１ヶ月貯蔵した場合に、その最初の生物学的活性の少なくとも
約７０％を維持する粉末。すなわち、本発明による安定化乾燥粉末は、処方の際
、および少なくとも１ヶ月の期間にわたる長期間の貯蔵の際に、インビボおよび
／またはインビトロの活性を実質的に維持する、粉末である。２つ以上のイオン
化可能プロトンを有するカルボン酸の塩（例えば、クエン酸塩、グルタミン酸塩
、酒石酸塩など）を緩衝剤として含む安定化乾燥粉末組成物は、凍結乾燥による
のみでなく、当該分野において公知の方法により、調製される。

【００４３】 「ポリマー性高分子」とは、天然に存在し得る（例えば、タンパク質、炭水化
物、核酸）かまたは合成により生成され得る（例えば、当該分野において公知の
ようなポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、フィコールなど）であ
り得る、高分子量ポリマー性化合物である。

【００４４】 「治療有効量」とは、肺中への堆積のための吸入および肺による吸収により、
本明細書中に記載のような乾燥粉末組成物の形態での送達の際に、所望の生物学
的効果を提供する、ＦＳＰの量である。

【００４５】 「カスケードインパクター効率」または「ＣＩ Ｅｆｆ」とは、カスケードイ
ンパクターに回収されたエアロゾル化粉末の画分である。ＣＩ Ｅｆｆ値は、カ
スケードインパクターののど部または壁への損失に起因して、代表的に、ＤＤＥ
値より小さい。

【００４６】 「残余百分率」とは、最初にブリスターパック（ＢＰ）内にあった粉末の、粉
末用量の分散の後にＢＰ内に残る、粉末の百分率を意味する。

【００４７】 「回収百分率」とは、回収フィルタ上に堆積する、ＢＰから分散された粉末の
百分率を意味する。「回収百分率」は、デバイスおよびチャンバ内への堆積とし
て損失され得る粉末を考慮する。

【００４８】 「嵩密度」とは、コンパクト化の前の粉末の密度（すなわち、圧縮されていな
い粉末の密度）をいい、そして代表的に、周知のＵＳＰ法により、測定される。

【００４９】 （ＩＩ． ＦＳＰ乾燥粉末） 本発明は、ＦＳＰの肺送達のための、安定な、分散可能な乾燥粉末組成物を提
供する。本出願人らにより開発された組成物は、肺深部への送達のために、タン
パク質（特に、性腺刺激ホルモン）を処方する際にこれまでにしばしば遭遇した
問題の多くを、克服する。本明細書中に記載される、ＦＳＰ乾燥粉末組成物は、
容易に分散され（すなわち、良好なエアロゾル性能を示す）、そして（ｉ）粉末
製造の前に、溶液中で、（ｉｉ）粉末製造中および加工中、および（ｉｉｉ）貯
蔵の際に、物理的分解および化学的分解の両方に対して安定であり、そして肺へ
の堆積および肺による吸収のための吸入による送達の際に、良好なバイオアベイ
ラビリティを示す。本発明による乾燥粉末組成物は、一般に、ＦＳＰおよび薬学
的に受容可能な賦形剤を含むが、ニートなＦＳＰからなる乾燥粉末（すなわち、
ＦＳＰからなり、そして本質的に、さらなる賦形剤も添加剤も何も含まない、呼
吸用の粉末）もまた、考慮される。肺深部への送達に適したＦＳＰ乾燥粉末の成
分を、ここに記載する。

【００５０】 （Ａ．濾胞刺激タンパク質） （１．天然に存在するＦＳＰ。）固体調製物に含まれるＦＳＰは、少なくとも
部分的に、天然供給源（例えば、ヒト尿ＦＳＨ（ｕＦＳＨ））から精製され得る
（すなわち、高度に精製され得、そして必要に応じて、ＬＨまたは他の同時に精
製されるタンパク質を含み得る）。尿由来のＦＳＨは、市販の供給源（例えば、
Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から得られ得る
か、またはＡｒｐａｉａ，Ｇ．ら、１９９２に記載されるように、免疫精製によ
り精製され得る。天然に存在する多数のＦＳＰヘテロダイマーが公知であり、そ
して本発明の乾燥粉末において使用するために適切である。このような例示的な
ＦＳＰヘテロダイマー（すなわち、１つのαサブユニットおよび１つのβサブユ
ニットを含む）としては、配列番号１および２（ウシＦＳＨ）；３および４（ウ
マＦＳＨ）；５および６（ｈＦＳＨ）；７および８（ブタＦＳＨ）；９および１
０（ヒツジＦＳＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５１】 （２．合成ＦＳＰまたは組換えＦＳＰ。）あるいは、ＦＳＰは、化学合成によ
り生成され得るか、または分子生物学の従来の技術（すなわち、組換え技術）を
使用して適切に操作された宿主細胞において生合成され得る。組換えＦＳＰ（本
発明の乾燥粉末組成物における使用のための、ＦＳＰの好ましい形態）は、Ｋｅ
ｅｎｅら、１９８９；Ｂｏｉｍｅら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｒｅｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０：４５−５０（１９９２）；Ｃ
ｈａｐｐｅｌら、１９９２；またはＲｅｄｄｙら、１９９２；Ｓｈｏｍｅ，Ｂ．
ら、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．、７：３２５−３３９（１９８８）；Ｓａｘｅｎ
ａ，Ｂ．Ｂ．およびＲａｔｈｎａｍ，Ｐ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５１
、９９３−１００５（１９７６）；Ｗａｔｋｉｎｓら、ＤＮＡ、６：２０５−２
１２（１９８７）；Ｓｈｏｍｅ，Ｂ．およびＰａｒｌｏｗ，Ａ．Ｆ．、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、３９（１）：２０３−２０５（１
９７４）；Ｂｅｃｋら、ＤＮＡ、４：７６（１９８５）；Ｂｏｉｍｅら、米国特
許第５，４０５，９４５号）（１９９５）；およびＲｅｄｄｙ，Ｖ．Ｂ．ら、米
国特許第５，６３９，６４０号（１９９７）Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、
（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８７〜１９９８）、第１０、
１２、１３、１６、１８および２０章（これらの内容は、本明細書中に参考とし
て援用される）に記載される技術のような、従来の技術を使用して、調製され得
る。ＦＳＨ改変体の例示的な調製は、実施例１３、１４、１８および１９に提供
される。

【００５２】 より特定すると、ＦＳＰ産物は、原核生物または真核生物の宿主（例えば、細
菌、酵母、［Ｓｈｅｒｍａ，Ｆ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、（１９９２）］高等植物、昆虫［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ．Ｅｍ
ｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、２７：３５３−３６５（１９８７）］
ならびにＣＨＯ、ＣＯＳおよび腸（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞のような哺乳動物細
胞が挙げられる）における組換え技術により、調製され得る。組換え生成手順に
おいて使用される宿主に依存して、このように生成されるｒＦＳＰ分子は、グリ
コシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、ｒＦＳＰサブユ
ニットはまた、開始メチオニン残基を含み得る。このような方法は、多くの標準
的な実験室手引書に記載されている。

【００５３】 ＦＳＰは、改変された形態（融合タンパク質のような）において発現され得、
そして分泌シグナルのみでなく、さらなる異種機能領域もまた含み得る。例えば
、さらなるアミノ酸（特に、荷電したアミノ酸）の領域は、Ｎ末端に付加されて
、精製の間、または引き続く取り扱いおよび貯蔵の間に、宿主細胞における安定
性および存続に関与し得る。また、ペプチド部分は、ＦＳＰ分子に付加されて、
精製を容易にし得る。このような領域は、ポリペプチドの最終精製の前に、除去
され得る。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、第１７．２９〜１７．
４２章および１８．１〜１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、第１６、１７お
よび１８章のような、多くの標準的な実験室手引書に記載されている。

【００５４】 簡単には、本発明において使用されるＦＳＰをコードする単離された核酸の発
現は、代表的に、例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの、プロモーター（これは、構
造的かまたは誘導的かのいずれかである）への操作的な連結、続いて発現ベクタ
ーへの組込みにより、達成される。これらのベクターは、原核生物または真核生
物のいずれかにおける、複製および取り込みのために、適切であり得る。代表的
な発現ベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列な
らびに本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節のために有用なプロ
モーターを含む。クローン化された遺伝子の高レベルの発現を得るために、転写
を指向するための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、
および転写／翻訳ターミネーターを少なくとも含む、発現ベクターを構築するこ
とが、所望される。

【００５５】 酵母細胞におけるＦＳＰの発現は、周知の方法により実施される［Ｓｈｅｒｍ
ａら、（１９８２）］。真核生物タンパク質の産生のために広範に利用される２
つの酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ およびＰｉ
ｃｈｉａである。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａにおける発現
のためのベクター、株、およびプロトコルは、当該分野において公知であり、そ
して市販の供給業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）から入手可能
である。適切なベクターは、通常、発現制御配列（例えば、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼまたはアルコールオキシダーゼを含むプロモーター、および複製の
起源）、終止配列などを有する。

【００５６】 ＦＳＰをコードするポリヌクレオチド配列はまた、哺乳動物細胞のトランスフ
ェクトにおいて使用するための種々の発現ベクターに連結され得る。哺乳動物細
胞系は、しばしば、細胞の単層の形態であるが、哺乳動物細胞懸濁液もまた、使
用され得る。ＦＳＰを発現し得る多数の適切な宿主細胞株としては、ＨＥＫ２９
３、ＢＨＫ２１、ＡＶ１２およびＣＨＯ細胞株が挙げられる。これらの細胞のた
めの発現ベクターは、発現制御配列（複製の起源、プロモーター（例えば、ＣＭ
Ｖプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、もしくはＨＳＶｔｋプロモーターまた
はホスホグリセレートキナーゼプロモーター）、エンハンサーのような）、およ
びプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリア
デニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）のような）、
および転写ターミネーター配列を含み得る。ＦＳＰの生成のために有用な他の動
物細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａｓ（第７版、１９９２）から入手可能である。

【００５７】 昆虫細胞においてＦＳＰを発現するための適切なベクターは、通常、ＳＦ９バ
キュロウイルス由来である。適切な昆虫細胞としては、カの幼虫、カイコ、アワ
ヨウトウ、ガおよびショウジョウバエの細胞株（シュナイダー細胞株［Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒ、前出、１９８７］のような）が挙げられる。

【００５８】 宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法に
よってもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的な実験マニュアル（例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、第１〜４章および１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅ
ｌ、前出、第１、９、１３、１５、１６章（これらは、その全体が本明細書中で
参考として援用される）に記載される。

【００５９】 あるいは、ＦＳＰをコードするポリ核酸（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
）は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ
の導入による、細胞ゲノム内の予め選択された部位での相同組換えによって、宿
主細胞中で発現され得る。これらの成分は、新しい転写単位の生成を実際に生じ
るような様式で（ここで、このＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エキソンお
よびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結される）、染色体
（ゲノム）ＤＮＡに導入される。これらの成分の染色体ＤＮＡへの導入の結果と
して、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。このような方法は、例えば、米
国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，
７４６号、および同第５，７３３，７６１号（これらは、その全体が本明細書中
で参考として援用される）に記載されるように、当該分野で周知である。

【００６０】 組換えＦＳＰは、以下を含む当該分野で周知の方法によって、組換え細胞培養
物から回収および精製され得る：硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、
酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィー。精製プロセスのモニタリングは、ウエスタンブロット技術またはラ
ジオイムノアッセイ、あるいは他の標準的な免疫アッセイ技術を使用することに
よって達成され得る。

【００６１】 （３．ｈＦＳＨ改変体）本発明の乾燥粉末組成物は、ｈＦＳＨ改変体を含み得
る。ｈＦＳＨ改変体は、例えば、以下のような当業者に周知の多くの技術によっ
て生成され得る：化学合成、組換え生合成、および天然に存在するＦＳＨまたは
組換えＦＳＨのインビボプロセシングまたはインビトロプロセシング（これは、
アミノペプチダーゼおよび／またはカルボキシペプチダーゼによって１以上の内
部アミノ酸を露出する）。

【００６２】 （Ｂ．ＦＳＰをコードする核酸分子） 本明細書中に記載されるＦＳＰをコードするポリ核酸分子は、限定されないが
、組換え発現によってＦＳＰを調製するために有用な配列の例示であり、そして
これらは、以下により詳細に記載されるように、インビボでのＦＳＰの発現のた
めの、本発明の乾燥粉末組成物に組み込まれ得る。他のポリ核酸は、本発明に影
響を及ぼすことなく、ＦＳＰを生成するために使用され得る。これらのポリ核酸
分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡまたは他の任意の形態）
、あるいはＤＮＡの形態（クローニングによって得られるか、または合成的に生
成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、あるいはそれらの任意の組み合わせを含
むが、これらに限定されない）であり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖または一
本鎖であるか、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分が、コード鎖（センス鎖としてもまた知
られる）であり得るか、またはそれが、非コード鎖（アンチセンス鎖ともまた称
される）であり得る。

【００６３】 ＦＳＰの発現における使用のための単離されたポリ核酸分子は、αサブユニッ
トを発現させるために、配列番号３２、３７、５４、５５または５６の少なくと
も１つに示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはそれに相補
的な配列を有する核酸分子を含むか、またはβサブユニットを発現させるために
、配列番号３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４
５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３の少なくとも１つに
おけるＯＲＦ、またはそれらに相補的な配列を有する核酸分子を含む。

【００６４】 ポリ核酸配列は、当該分野で周知のような、（ａ）標準的な組換え方法、（ｂ
）合成技術、（ｃ）精製技術、またはそれらの組み合わせを使用して作製され得
る。ポリ核酸は、本明細書中に提供される例示的配列に加えて、さらなる配列を
簡便に含み得る。例えば、１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチク
ローニング部位が、ポリヌクレオチドの単離を補助するために核酸に挿入され得
る。また、翻訳可能な配列が、翻訳されるＦＳＨポリヌクレオチドの単離を補助
するために挿入され得る。さらなる配列が、このようなクローニング配列および
／または発現配列に付加され得、クローニングおよび／または発現におけるそれ
らの機能を最適化するか、ＦＳＰポリヌクレオチドの単離を補助するか、または
そのポリヌクレオチドの細胞への導入を改善する。

【００６５】 ＦＳＰをコードするポリ核酸は、以下のような直接的な化学合成方法によって
調製され得る：Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０−９
９（１９７９）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．，６８：１０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃ
ａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１）
のジエチルホスホラミダイト法；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、
Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．，２２（２９）：１８５９−１８６２（１９８１）に
よって記載される固相ホスホラミダイトトリエステル法（例えば、自動合成器（
例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載のような）を使
用する）；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法。化学合成は
、一般的に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これが、相補的配列でのハイ
ブリダイゼーションによってか、またはこの一本鎖をテンプレートとして使用す
るＤＮＡポリメラーゼでの重合化によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。ＤＮ
Ａの化学合成は、約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列が、短い配
列の連結によって得られ得る。

【００６６】 本明細書中の配列３２〜５６に記載される代表的なポリヌクレオチド配列は、
αサブユニットまたはβサブユニットのいずれかをコードする。配列番号３７お
よび３８のＤＮＡは、連結されたオリゴヌクレオチドから設計および構築される
。配列番号３２と配列番号３７との間の差異は、コードされたαサブユニットタ
ンパク質のアミノ酸配列を変化させない。同様に、配列番号３８と配列番号３３
との間の差異は、コードされたβ改変体サブユニットタンパク質のアミノ酸配列
を変化しさせない。当業者は、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号３２〜５
６に記載される配列に等価な多くの配列が存在することを認識する。

【００６７】 本発明の乾燥粉末は、ＦＳＰをコードするポリヌクレオチドフラグメント（例
えば、ＦＳＰのαサブユニットおよびβサブユニットの両方をコードする遺伝子
）、そのフラグメント（例えば、生物学的特異性を付与する、βサブユニット）
、および／または本明細書中に記載されるような改変体を含み得、ここで、この
ポリヌクレオチドまたはＦＳＰコード領域は、適切な転写調節配列または転写制
御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に作動可能に連結され、被
験体の標的宿主細胞（例えば、肺の肺性領域由来の哺乳動物細胞（例えば、肺上
皮細胞、肺胞型細胞））または他の適切な被験体宿主細胞における、ＦＳＰ導入
遺伝子発現を可能にする。本明細書中に提供される配列に加えて、ＦＳＰ、その
サブユニット、または前駆体タンパク質をコードする代表的な遺伝子配列は、例
えば、Ｅｎｔｒｅｚ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（上記のような
）に見い出される。このような例示的コード配列は、以下の登録番号を有する：
Ｊ００１５２ Ｖ００４８７（αサブユニット、塩基１〜３９７）、Ｍ５４９１
２、Ｍ３８６４４、Ｍ２１２１９、Ｍ１８５３６（βサブユニット遺伝子、エキ
ソン１）、Ｍ５４９１３、Ｍ２１２２０、Ｍ１８５３６（βサブユニット遺伝子
、エキソン２）、Ｍ５４９１４、Ｍ３８６４６、Ｍ２１２２１、Ｍ１８５３６（
βサブユニット、エキソン３）。

【００６８】 本発明のこの局面の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドコード配列
に作動可能に連結されている調節配列は、拍動性（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ）様式で
ＦＳＰを発現するように機能する。ＦＳＰをコードするポリヌクレオチドは、必
要に応じて、ウイルス性または他の従来の遺伝子治療ベクター中に含まれ得るか
、またはＥｌｊａｍａｌ，Ｍら、国際特許公開ＷＯ９６／３２１１６（１９９６
年１０月１７日）；ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１
５（５）：６７１−９（１９９８）、およびＥａｓｔｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅ．Ｔｈｅｒ．，８（６）：７６５−７３（１９９７）（これらの内容は、本明
細書中に参考として明確に援用される）に記載されるように、脂質−ＦＳＰ導入
遺伝子複合体を含み得る。一般に、標的組織中でのＦＳＰ発現レベルは、本発明
の乾燥粉末への直接的な組み込みについて本明細書中に記載されるＦＳＰの量に
ほぼ対応し；このような発現レベルは、治療的に有効量のＦＳＰに特徴的に対応
する。所望の発現レベルを達成するための、本発明の乾燥粉末中の組み込みのた
めの核酸構築物の代表的な量は、Ｅｌｊａｍａｌ，Ｍ．ら（同書）に記載される
。

【００６９】 （Ｃ．賦形剤および他の添加剤） 本発明の粉末において、ＦＳＰは、一般に、呼吸器系投与および肺投与に適切
な、１以上の薬学的賦形剤と組み合わせられる。適切な賦形剤は、患者に送達さ
れる粉末中の活性薬剤濃度を減少することが所望される場合の、バルクキング薬
剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として単に作用し得る。賦形剤はまた、より
効率的かつ再現可能な活性薬剤の送達を提供するために粉末分散デバイス内の粉
末の分散性を改善するように作用し得、そして製造および単位投薬形態への粉末
充填を容易にするために活性薬剤の操作特性（例えば、流動性およびコンシステ
ンシー）を改善するように作用し得る。特に、賦形剤材料は、しばしば、残留水
分量を最小化するために、水分吸収を妨げるために、ならびに粒子サイズ、凝集
の程度、粒子表面特性（例えば、しわ状の程度（ｒｕｇｏｓｉｔｙ））、吸入の
容易性および得られた粒子の肺深部（ｄｅｅｐ ｌｕｎｇ）への標的化を調節す
るために、ＦＳＰの物理的安定性および化学的安定性を改善するよう機能する。

【００７０】 あるいは、ＦＳＰは、本質的に純粋（ｎｅａｔ）形態で処方され得、ここで、
組成物は、必要なサイズ範囲内で、かつ他の生物学的に活性な成分、薬学的賦形
剤などを実質的に含まない、ＦＳＰ粒子を含む。

【００７１】 本発明の組成物において有用な薬学的賦形剤および添加剤としては、タンパク
質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭化水素（例えば、糖（単糖類、二糖類
、三糖類、四糖類およびオリゴ糖類を含む）；誘導体化糖（例えば、アルジトー
ル、アルドン酸、エステル化糖など）；およびポリサッカリドまたは糖ポリマー
（例えば、Ｆｉｃｏｌｌｓ））（これらは、単独または組み合わせて存在しても
よい）が挙げられるが、これらに限定されない。水溶性（例えば、糖、ペプチド
、アミノ酸、および塩）、アルコール溶解性（例えば、ペクチン、レシチン、ポ
ビドン）またはアセトン溶解性（例えば、クエン酸、ＰＬＧＡ）の賦形剤が好ま
しい。約３５℃より高い、好ましくは、約４５℃より高い、より好ましくは、約
５５℃より高い、ガラス転移温度（Ｔｇ）を有する賦形剤もまた好ましい。本発
明のＦＳＰ乾燥粉末における使用に適切な例示的賦形剤としては、Ｉｎｈａｌｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍの国際特許出願番号ＷＯ９８／１６２
０７に開示される賦形剤が挙げられる。

【００７２】 例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ））、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン、
ヘモグロビンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の乾燥粉末組
成物における使用に適切なポリペプチドおよびタンパク質は、Ｉｎｈａｌｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍの国際特許公開番号ＷＯ９６／３２０９６
に提供される。ＨＳＡは、好ましいタンパク質様賦形剤であり、そして肺へのエ
アロゾル化送達のための乾燥粉末の分散性を増加することが示されている（ＷＯ
９６／３２０９６（同書））。

【００７３】 代表的なアミノ酸／ポリペプチド成分（必要に応じて、緩衝能において機能す
る）としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グル
タミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム、トレオニン、チロシン
、トリプトファンなどが挙げられる。分散剤として機能するアミノ酸およびペプ
チドが、好ましい。このカテゴリーに属するアミノ酸としては、ロイシン（ｌｅ
ｕ）、バリン（ｖａｌ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕ）、ノルロイシン（ｎｌ
ｅ）、トリプトファン（ｔｒｙ）、アラニン（ａｌａ）、メチオニン（ｍｅｔ）
、フェニルアラニン（ｐｈｅ）、チロシン（ｔｙｒ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）お
よびプロリン（ｐｒｏ）のような疎水性アミノ酸が挙げられる。種々のアミノ酸
賦形剤を含む例示的ＦＳＰ処方物が、実施例２３に提供される。ロイシンは、本
明細書中に記載されるＦＳＰ組成物の、１つの特に好ましい賦形剤である。本明
細書中に記載の処方物において使用される場合、ロイシンとしては、Ｄ−ロイシ
ン、Ｌ−ロイシンおよびラセミ体ロイシンが挙げられる。ロイシンを含む例示的
なＦＳＰ乾燥粉末は、実施例１１、２１、２２および２３に挙げられる。本発明
における使用のため分散性増強ペプチドとしては、上記のような疎水性アミノ酸
成分からなるダイマー、トリマー、テトラマーおよびペンタマー（例えば、ジロ
イシン、トリロイシンなど）が挙げられる。

【００７４】 本発明における使用に適切な炭水化物賦形剤は、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉ
ｔｏｓｅ）を除き、例えば、単糖類（例えば、フルクトース、マルトース、ガラ
クトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）；二糖類（例えば、
ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）；多糖類（例えば
、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）；および
アルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチト
ール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなど）
が挙げられる。本発明における使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール
、トレハロース、およびラフィノースである。本発明に従う好ましい乾燥粉末組
成物は、スクロースの非存在下、特に、スクロースおよびグリシンの組み合わせ
の非存在下で安定である組成物である。

【００７５】 乾燥粉末組成物はまた、緩衝剤またはｐＨ調整剤を含み得る。代表的に、緩衝
剤は、有機酸または有機塩基から調製された塩である。代表的な緩衝剤としては
、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸また
はフタル酸の塩、およびＴｒｉｓ、塩酸トロメタミン、またはリン酸緩衝液が挙
げられる。本発明の組成物における使用に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩のよう
な有機酸塩である。

【００７６】 さらに、本発明のＦＳＰ乾燥粉末は、ポリビニルピロリドン、Ｆｉｃｏｌｌｓ
（ポリマー性糖）、ヒドロキシエチルデンプン、デキストレート、ポリアミノ酸
（例えば、ポリロイシン、ポリグルタミン酸）および／またはポリエチレングリ
コールのようなポリマー性賦形剤を含み得、ここで、このようなポリマーは、カ
プセル化剤としてもむしろ、添加剤として存在する。乾燥粉末はまた、必要に応
じて、矯味矯臭剤、抗微生物剤、甘味剤、抗酸化剤、静電防止剤、ステロイド（
例えば、コレステロール）、およびキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含み得
る。本発明に従うＦＳＰ組成物における使用に適切な他の薬学的賦形剤および／
または添加剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（１９９５）、およびＰｈｙｓｉ
ｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第５２版（１９９８）（これら
の開示は、本明細書中で参考として援用される）に列挙される。

【００７７】 １以上の増強剤化合物を欠く場合に肺血管系および全身循環への吸収が乏しい
、以前に報告された乾燥粉末［Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、米国特許第５，１２８，
４５３号（１９９２年７月７日）］とは対照的に、本発明の乾燥粉末は、肺を通
って驚くほどよく吸収され、そして吸収増強剤の添加を必要としない。これは、
例えば、実施例１０および１７における、本明細書中に提供されたバイオアベイ
ラビリティデータによって証明される。従って、本発明の乾燥粉末は、好ましく
は、代表的な増強剤化合物（例えば、界面活性剤（例えば、脂肪酸塩）、胆汁酸
塩、アルキルグリコシド、シクロデキストリン、リン脂質）を欠くか、またはこ
のような化合物が存在する場合、これらは、非常に低い濃度−−ＦＳＰに対して
約２０重量％未満、そしてより好ましくは、ＦＳＰに対して１５重量％〜１０重
量％未満−−で代表的に存在し、その結果、これらは、吸収を顕著に増強するよ
うに機能しない。

【００７８】 好ましいキャリアまたは賦形剤材料は、炭水化物（例えば、糖類およびアルジ
トール）および緩衝剤（例えば、クエン酸塩）またはポリマー性薬剤であり、こ
れらは、必要に応じて、上記のようなアミノ酸あるいはジペプチドまたはトリペ
プチドと組み合わせられる。

【００７９】 本発明に従って、賦形剤およびタンパク質によって形成される固体状態のマト
リックスは、ＦＳＰに対して安定した環境を与え、そして必要に応じて、この組
成物の分散を補助し得る。この安定なマトリックスは、結晶性であるか、無定形
ガラスであるか、またはその両方の形態の混合物である。それらの結晶化度に関
わらず、この結晶化度に対して長時間安定である組成物が好ましい。実質的に無
定形（ガラス）または実質的に結晶性（すなわち、粉末に含まれるＦＳＰの量を
調整した後（ＦＳＨは、結晶化しないため）で、可能な最大程度に結晶性である
）の乾燥粉末処方物が、最も適切である。より一般には、好ましい粉末は、実質
的に結晶性であり（例えば、ＦＳＰ粉末Ｌ２０１７（実施例６．Ｃ．））（すな
わち、５１％〜９９％の結晶性、６０％〜９５％の結晶性、６５％〜９０％の結
晶性、あるいはそれらのうちの任意の範囲または値）であるか、または実質的に
無定形ガラス（例えば、粉末Ｌ２０１０およびＬ２０１８（実施例６．Ｃ．））
（すなわち、固体の少なくとも約７０％が無定形ガラスであり、好ましくは、少
なくとも約７５％が無定形ガラスであり、そしてより好ましくは、少なくとも約
８５％が無定形ガラスである）である。

【００８０】 実質的に無定形であるＦＳＰ乾燥粉末処方物について、約３０℃より高い、好
ましくは、約４０℃より高い、そしてより好ましくは、約６０℃より高いガラス
転移温度（Ｔ_g）を示す処方物が、好ましい。代表的なＦＳＰ乾燥粉末組成物に
ついてのガラス転移温度を、表６（実施例６．Ｂ．）に示す。そこに提示される
値から見い出されるように、Ｔｇ値を決定したそれらの組成物について、２２の
処方物／ロット番号が、約３０℃より高いＴｇを示し、１９の処方物／ロット番
号が、約６０℃より高いＴｇを示した。６０℃または６０℃より高いＴｇ値を有
する処方物には、以下が含まれた：Ｌ２００１、Ｌ２００４、Ｌ２００６、Ｌ２
００８、Ｌ２００９、Ｌ２０１０、Ｌ２０１２、Ｌ２０１３、Ｌ２０１４、Ｌ２
０１６、Ｌ２０２０およびＬ２０１８。実質的に無定形の粉末についての好まし
い保存温度は、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍの国際特
許公開ＷＯ９８／１６２０５に示されるように、その組成物のＴ_gより少なくと
も約１０℃低い。

【００８１】 乾燥粉末処方物に含まれるＦＳＰは、肺への吸入によって投与される場合に、
薬理学的に有効な量を形成するに十分な量で存在する。本発明の乾燥粉末は、一
般に、約０．１重量％〜９９重量％のＦＳＰ、より代表的には、約０．５重量％
〜８０重量％のＦＳＰ、そして好ましくは、約１重量％〜７５重量％のＦＳＰを
含む。好ましい組成物は、処方物に含まれるＦＳＰの比活性および処置の型（す
なわち、過剰排卵療法（ｓｕｐｅｒ ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に
対する排卵誘導）に依存して、約１．５重量％〜７０重量％のＦＳＰ、そしてよ
り好ましくは、約１２重量％〜６０重量％のＦＳＰを含む。本発明の１つの好ま
しい実施形態において、乾燥粉末は、約５重量％のＦＳＰを含む。代替的実施形
態において、乾燥粉末は、約１５重量％のＦＳＰを含む。対応して、賦形剤材料
の量は、約９９．９重量％〜０．１重量％、より代表的には、約９９．５０重量
％〜２０重量％、そして好ましくは、約９９重量％〜２５重量％の範囲である。
好ましい組成物は、約９８．５重量％〜３０重量％の賦形剤材料、そしてより好
ましくは、約８８重量％〜４０重量％の賦形剤材料を含む。ロイシン含有ＦＳＰ
粉末は、代表的に、約１５〜８５重量％のロイシン、好ましくは、約２０〜８０
重量％のロイシン、そしてより好ましくは、約４０〜６０重量％のロイシンを含
む。

【００８２】 肺送達のための代表的なＦＳＰ乾燥粉末組成物が、少なくとも実施例２および
１１に提供される。実施例２、表１に提供されるデータから見い出され得るよう
に、種々の組み合わせおよび相対量のＦＳＰおよび賦形剤を含む組成物は、良好
な粒子サイズ特性を有する（全ての粉末が、３．５ミクロンより小さいＭＭＤを
有するが、８０パーセントの粉末が、１．５ミクロンよりも小さいＭＭＤを有す
る）粉末を生じ、そしてこの粉末は、粉末製造の際のＦＳＰの高程度の凝集体形
成における、最小の変化を提示した（実施例３）。実施例３に詳述される知見は
、本発明のＦＳＰ組成物の別の驚くべき特性（すなわち、粉末の製造およびプロ
セシングの間の高程度の凝集体形成に対する、モノマー性ＦＳＰを安定化する能
力）の証拠を提供する。ＦＳＰの高程度の凝集体形成は、そのバイオアベイラビ
リティに有害な効果を及ぼし得るので、このことは、損なわれたレセプター結合
（次いで、これは、生じた粉末の能力を減少させる）に起因して重要である。

【００８３】 （ＩＩＩ．ＦＳＰ乾燥粉末の調製） 乾燥粉末ＦＳＰ処方物は、上記のように実質的にアモルファスガラス状かまた
は実質的に結晶性の生物活性粉末を生じる条件下で、スプレー乾燥により、好ま
しくは調製される。例えば、一般的にはＳｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ，第５版（１９９１）およびＰｌａｔｚ、Ｒら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９７／４１８３３、
Ｎｏｖ．１３，１９９７に記載のように、ＦＳＰ−溶液処方物のスプレー乾燥を
実行する。

【００８４】 スプレー乾燥のためのＦＳＰ溶液を調製するため、一般的に、ＦＳＰを、生理
学的に受容可能な水性緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液またはクエン酸グリシン
緩衝液）に溶解する。この緩衝液は、代表的には、約２〜９の範囲のｐＨを有す
る。事前乾燥溶液のｐＨの範囲は、一般に約４と１０との間に維持されるが、中
性に近いｐＨが好ましい。なぜなら、このようなｐＨは、肺内の粉末の溶解後、
粉末の生物活性または生理学的適合性を維持することを補助し得るからである。
水性処方物は、必要に応じて、さらなる水混和性の溶媒（例えば、アルコールな
ど）を含み得る。代表的なアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロ
パノール、イソプロパノールなどが挙げられる。ＦＳＰ溶液は、一般に０．０１
％（重量／容積）〜約１０％（重量／容積）の濃度、通常０．１〜１％（重量／
容積）の濃度で溶解されたＦＳＰを含む。

【００８５】 ここで、実施例１に示された結果を振り返えれば、スプレー乾燥の前のＦＳＰ
の代表的溶液処方物は、数日間の保管の際、および凍結乾燥サイクルの反復後に
生物活性の目に見えるほどの低下を示さなかった。このことは、このような溶液
処方物の比較的高い安定性を示す。

【００８６】 次いで、ＦＳＰ含有溶液を、Ｎｉｒｏ Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｂｕｃｈ
ｉ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などのような市販の供給業者から入手可能なドラ
イヤーのような従来のスプレードライヤーでスプレー乾燥して、安定なＦＳＰ乾
燥粉末を得る。ＦＳＰ溶液をスプレー乾燥するための至適条件は、処方物の成分
に依存して変化し、そして一般的に実験的に決定される。材料をスプレー乾燥す
るのに用いられるガスは代表的に空気であるが、窒素またはアルゴンのような不
活性ガスがまた適切である。さらに、スプレー化した材料を乾燥するために用い
られるガスの入り口および出口の両方の温度は、スプレー化された材料中のＦＳ
Ｐの非活性化を生じない温度である。このような温度は、代表的には、実験的に
決定されるが、一般的に、入り口温度は、約５０℃〜約２００℃であり、一方、
出口温度は約３０℃〜約１５０℃である。

【００８７】 あるいは、ＦＳＰ乾燥粉末は、凍結乾燥、真空乾燥すること、スプレー凍結乾
燥すること、超臨界液体処理（ｓｕｐｅｒ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ ｐ
ｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、または他の形態のエバポレート乾燥により、ＦＳＰおよ
び賦形剤を含有する溶液を急速乾燥することにより、次いで、肺深部に投与する
のに適切なエアロゾル特性および受容可能なＥＤを有するＦＳＰ乾燥粉末を得る
ために、乾燥材料をさらに、乾燥処方物を混合し、粉砕しまたはジエット製粉（
ｍｉｌｌｉｎｇ）により、処理して、調製され得る。ある場合には、微細な粒子
凝集物から構成される組成物（すなわち、上記のＦＳＰ乾燥粉末粒子の凝集体ま
たは塊）を調製することにより、改善された取り扱い／処理の特徴（例えば、安
定性の低下、良好な流動性、固化の低さなど）を有するＦＳＰ乾燥粉末処方物を
作製することが望ましい。ここで、この凝集物は、例えば、本明細書に参考とし
て援用される、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年８月５日の米国特許第５，６５４
，００７号に記載されるように、肺送達のための微細粉末組成物に容易に崩壊し
戻される。あるいは、ＦＳＰ粉末は、例えば、本明細書に参考として援用される
、Ａｎｌｎｅｃｋ、Ｃら、国際ＰＣＴ刊行物番号ＷＯ９５／０９６１６（１９９
５年４月１３日）に記載のように、粉末組成物を凝塊形成すること、凝集塊を得
るために材料を篩いにかけること、より球状の凝集を提供するため球状化するこ
と、および均一にサイズ化された製品を得るためにサイジングすることにより調
製され得る。本発明のＦＳＰ乾燥粉末は、直接乾燥形態に、処方物組成物を混合
、粉砕またはジェット製粉することにより調製され得る。ＦＳＰ乾燥粉末は、好
ましくは、製造、処理および保管の間、乾燥（すなわち、相対的に低い湿度）条
件下で維持される。

【００８８】 使用される乾燥処理にかかわらず、このプロセスは好ましくは、実施例３に例
示されるように、非凝集形態でＦＳＰから構成される粒子を生じるか、または事
前に乾燥された材料において観察されたのと実質的に変らない、より高い大きさ
の程度を有する粒子を生じる。さらに、本発明のＦＳＰ処方物を調製するのに適
切なプロセスは、ＦＳＰの生物活性が有害に影響されないプロセスである。有害
に影響されないとは、すなわち、得られる粉末の生物活性が、乾燥／サイジング
の前のＦＳＰ処方物の生物活性に比べて、約４０〜５０％しか、好ましくは約３
０〜４０％しか、そしてより好ましくは、約１５％〜３０％しか低下しないとい
うことである。乾燥の際、生物活性において有意な損失を示さない代表的なＦＳ
Ｐ乾燥粉末は、実施例８に記載されている。

【００８９】 本発明に従う例示的ＦＳＰ組成物は、実施例２およびより詳細には表１に提供
される。理解されるように、ＦＳＰ乾燥粉末は、高収率で、代表的には約７０％
と８０％との間で得られ、このことは、肺送達に適切な大量のＦＳＰ乾燥粉末を
再現可能に調製する能力を示す。さらに、ＦＳＰシアリル化の程度は、スプレー
乾燥により影響されないことが示され（実施例５）、このことは従来のスプレー
乾燥条件下でのＦＳＰの化学的安定性を示す。これは、重要である。なぜならＦ
ＳＰの延長した生物活性半減期は、オリゴサッカライド含量の結果であり；ＦＳ
Ｐアシアログリコプロテイン（すなわち、シアル酸を剥離されたタンパク質）は
、肝臓により急速に排除されるからである。

【００９０】 （ＩＶ．ＦＳＰ乾燥粉末の特徴） 本発明のＦＳＰ粉末はいくつかの特徴（最も顕著には、引き続く血流への進入
のために粉末が下部呼吸管（すなわち、肺胞）の組織に浸透する能力）によりさ
らに特徴付けられる（例えば、実施例１０および１８を参照のこと）。以下によ
り詳細に記載されるべき、ＦＳＰ乾燥粉末の特定の物理的特徴は、肺深部へのこ
のような粉末のエアロゾル化送達の効率を最大化するのに重要であることが見出
されている。ＦＳＰ乾燥粉末は、肺の肺胞へ浸透するのに効果的な粒子、すなわ
ち、約０．１〜２０μｍの範囲の質量中央直径（ｍａｓｓ ｍｅｄｉａｎ ｄｉ
ａｍｅｔｅｒ：ＭＭＤ）を有する粒子から構成される。代表的には、粒子のＭＭ
Ｄは、約１０μｍ未満（例えば、約０．１〜１０μｍの範囲にわたる）、好まし
くは７．５μｍ未満（例えば、０．５〜７ミクロンの範囲にわたる）、そして最
も好ましくは、５μｍ未満であり、そして通常、直径０．１μｍ〜５μｍの範囲
である。好ましい粉末は、約１〜３．５μｍのＭＭＤを有する粒子から構成され
る。活性因子および賦形剤の変化する濃度の呼吸に適した、そしてこの好ましい
サイズ範囲内の粒子で形成されたＦＳＰ粉末の多くの例が調製された（例えば、
表１、列１０；実施例２）。ある場合には、ＦＳＰ粉末はまた、ラクトースのよ
うな呼吸に適さないキャリア粒子を含む。ここで呼吸に適さない粒子は、代表的
には約４０ミクロンよりサイズが大きい。

【００９１】 本発明のＦＳＰ粉末は、約１０μｍ未満、そして好ましくは５μｍ未満、そし
てより好ましくは３．５μｍ未満の質量中央空気力学直径（ｍａｓｓ ｍｅｄｉ
ａｎ ａｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ：ＭＭＡＤ）のエアロゾル粒
子サイズ分布によりさらに特徴付けられる。この粉末の質量中央空気力学直径は
、特徴的に、約０．５〜５．０μｍ、好ましくは約１．０〜４．０μｍ ＭＭＤ
Ａ、より好ましくは約１．５〜３．５μｍ ＭＭＡＤ，そしてなおより好ましく
は約１．５〜３．０μｍに範囲する。肺投与に適切な範囲内のエアロゾル粒子サ
イズ分布を有するＦＳＰ粉末を調製する能力をさらに例証するため、約５μｍ
ＭＭＡＤ未満のエアロゾル粒子サイズ分布を有する粒子から構成される、そして
より詳細には３．５μｍ未満のＭＭＡＤ値により特徴付けられる、例示的ＦＳＰ
乾燥粉末は、表８（実施例７）、表１６（実施例１１）、表３０（実施例２１）
および表３１（実施例２２）に例示される。

【００９２】 本発明のＦＳＰ乾燥粉末は、別の観点から言えば、約１％と６０％との間の相
対的肺性バイオアベイラビリティーにより特徴付けられる。本発明の粉末の相対
的肺性バイオアベイラビリティーは、代表的におよそ以下の範囲内におさまる：
１〜６０％、１〜３０％、５〜３０％、１０〜３０％、１５〜３０％、１５〜２
５％、２０〜２５％、１〜２０％、２〜２０％、３〜２０％、４〜２０％、１〜
１５％、１〜１０％、２〜１０％、３〜１０％、および４〜１０％。好ましくは
、ＦＳＰ粉末は、本明細書に提供されるデータにより支持されるように、約１〜
３０％、そしてより好ましくは約１〜２０％の間の相対的肺性バイオアベイラビ
リティーを示す。

【００９３】 ＦＳＰ乾燥粉末は、一般に、約１０重量％未満、そして好ましくは約３重量％
未満の湿度を含む。このような低湿度含有固体は、タンパク質の分解に向かう傾
向の低下をあらわす傾向である。本明細書により記載されるように調整された代
表的ＦＳＰ乾燥粉末の湿度含量は、実施例６Ｂ、表６に提供される。

【００９４】 これらの粉末の送達用量効率（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｅｆｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ：ＤＤＥ）は、３０％より大きく、そして通常４０％より大きい。より
好ましくは、本発明のＦＳＰ粉末のＤＤＥは、５０％より大きく、そしてしばし
ば５５％より大きい。なおより好ましくは、ＦＳＰ粉末のＤＤＥは、６０％より
大きい。非常に好ましいのは、７０％より大きいＤＤＥ値を有する粉末であり、
そしてなおより好ましいのは、約７５％より大きいＤＤＥ値を有する粉末である
。実施例７、表７および実施例１１、表１４および１５に見られるように、本出
願者は、５０％より大きいかまたは等しいＤＤＥ値を有する多量の代表的ＦＳＰ
乾燥粉末を首尾よく調製したことが理解され得る。そのＤＤＥ値により示される
ように、特に良好な粉末分散性を示しかつ維持する処方物としては、Ｌ２００１
、Ｌ２００５、Ｌ２００６、Ｌ２００８、Ｌ２０１０、Ｌ２０１２、Ｌ２０１４
、Ｌ２０１６、Ｌ２０１７、Ｌ２０１８およびＬ２０２０（この組成物は、表６
に提供される）、ならびに９９３４８、９９３４９、９９４２３、９９４２５、
９９４２６、９９４５５、９９４５４、および９９４５７（表１４、１５）が挙
げられる。

【００９５】 本発明のＦＳＰ粉末は、代表的に、約０．１〜１０グラム／立方センチメート
ル、好ましくは約０．１５〜５グラム／立法センチメートル、より好ましくは、
約０．１５〜４．０グラム／立法センチメートル、なおより好ましくは、約０．
１７〜１グラム／立法センチメートル、なおより好ましくは、約０．１７〜０．
７５グラム／立法センチメートル、そして最も好ましくは、約０．２〜０．７５
グラム／立法センチメートルの範囲にわたるバルク密度値を有する 本発明の粉末は、粉末に含まれるＦＳＰ（例えば、高度に精製した形態のＦＳ
Ｐに対してＦＨＰおよび他のタンパク質を含有する不純なＦＳＰ混合物）の型に
依存して、広範な範囲の特定の生物活性値を有する。本発明の粉末は、一般に、
粉末１グラムあたり１００ＩＵより大きい比生物活性を有する。ほとんどの場合
、ＦＳＰ粉末の比生物活性は、以下である：粉末１グラムあたり２５０ＩＵより
大きい、粉末１グラムあたり５００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり１，０
００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり２，０００ＩＵより大きい、粉末１グ
ラムあたり５０００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり１０，０００ＩＵより
大きい、粉末１グラムあたり２５，０００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり
５０，０００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり１００，０００ＩＵより大き
い、粉末１グラムあたり２５０，０００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり５
００，０００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり１，０００，０００ＩＵより
大きい、粉末１グラムあたり２，５００，０００ＩＵより大きい、粉末１グラム
あたり５，０００，０００ＩＵより大きい、粉末１グラムあたり１０，０００，
０００ＩＵより大きい。

【００９６】 乾燥粉末の全体的エアロゾル能力を特徴付けるためのさらなる基準は、エアロ
ゾル能力係数（ＡＰＣ）である。本明細書に記載されるＦＳＰ粉末のＡＰＣ値は
、０．１０より大きく、代表的には、０．１５より大きく、そしてより好ましく
は０．２５より大きい。表８および１４に提供されるＡＰＣ値から理解され得る
ように、０．２５より大きいＡＰＣ値により証明された、肺送達に特に十分に適
切であるＦＳＰ乾燥粉末が調製された。このような粉末は、大きい割合の小さい
エアロゾル粒子サイズを含み、従ってエアロゾル化形態が送達された場合、（ｉ
）肺の肺胞領域への到達において、続く（ｉｉ）間質への分散において、および
（ｉｉｉ）内皮と通じた血流への続く通過において、非常に効果的である。

【００９７】 （Ｖ．ＦＳＰ組成物の肺投与） 本明細書において記載されるＦＳＰ乾燥粉末処方物は、任意の適切な乾燥粉末
吸入器（ＤＰＩ）、すなわち、乾燥粉末薬物を肺に輸送するためのビヒクルとし
て、患者の吸気を利用する吸入デバイスを用いて送達され得る。好ましいのは、
本明細書において参考として援用される、Ｐａｔｔｏｎ、Ｊ．Ｓ．ら、米国特許
第５，４５８，１３５号（１９９５年１０月１７日）；Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．ら
、米国特許第５，７４０，７９４号（１９９８年４月２１日）；およびＳｍｉｔ
ｈ，Ａ．Ｅ．ら、米国特許第５，７８５，０４９号（１９９８年７月２８日）に
記載されるようなＩｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ’乾
燥粉末吸入デバイスである。この型のデバイスを用いて投与した場合、粉末化さ
れた医薬は、穿刺可能なフタまたは他のアクセス表面を有する容器、好ましくは
ブリスターパックまたはカートリッジ中に含まれる。ここでこの容器は、単一投
薬量単位または複数投薬量単位を含み得る。定量用量の乾燥粉末医薬を含む多数
の容器（すなわち、単位用量パッケージ）を充填するための従来の方法は、例え
ば、本明細書において参考として援用される、Ｐａｒｋｓ、Ｄ．Ｊ．ら、Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／
４１０３１（１９９７年１１月６日）に記載されている。

【００９８】 本明細書において記載されるＦＳＰ粉末を送達するためには、例えば、本明細
書において参考として援用される、Ｃｏｃｏｚｚａ、Ｓら、米国特許第３，９０
６，９５０号（１９７４年９月２３日）、およびＣｏｃｏｚｚａ、Ｓら、米国特
許第４，０１３，０７５号（１９７７年３月２２日）に記載される型の乾燥粉末
吸入器がまた適切である。ここでは、被験体への送達のための事前に測定された
用量のＦＳＰ乾燥粉末が、硬カプセル内に含まれる。

【００９９】 ＦＳＰ乾燥粉末の肺投与のための他の乾燥粉末分散デバイスとしては、例えば
、本明細書において参考として援用される、Ｎｅｗｅｌｌ、Ｒ．Ｅ．ら、欧州特
許番号ＥＰ１２９９８５（１９８８年９月７日）；Ｈｏｄｏｓｏｎ、Ｐ．Ｄ．ら
欧州特許番号ＥＰ４７２５９８（１９９６年７月３日）；Ｃｏｃｏｚｚａ，Ｓら
、欧州特許番号ＥＰ４６７１７２（１９９４年４月６日）、およびＬｌｏｙｄ、
Ｌ．Ｊ．ら、米国特許第５，５２２，３８５号（１９９６年６月４日）に記載さ
れるデバイスが挙げられる。本発明のＦＳＰ乾燥粉末を送達するためには、Ａｓ
ｔｒａ−Ｄｒａｃｏ“ＴＵＲＢＵＨＡＬＥＲ”のような吸入デバイスがまた適切
である。この型のデバイスは、詳細には、Ｖｉｒｔａｎｅｎ、Ｒ、米国特許第４
，６６８，２１８号（１９８７年５月２６日）；Ｗｅｔｔｅｒｌｉｎ、Ｋら、米
国特許第４，６６７，６６８号（１９８７年５月２６日）；およびＷｅｔｔｅｒ
ｌｉｎ、Ｋら、米国特許第４，８０５，８１１号（１９８９年２月２１日）（そ
のすべてが、本発明において参考として援用されている）に記載されている。他
の適切なデバイスとしては、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、
Ｄｉｓｃｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｓｐｉｒｏｓ^TM吸入器（Ｄｕｒａ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｆ
ｉｓｏｎｓ）のような乾燥粉末吸入器が挙げられる。粉末化医薬を同調するか、
またはスクリーンを通じて空気を通過することによりキャリアスクリーンから医
薬を持ち上げるか、またはデバイスのマウスピースを通じた患者への粉末の引き
続く導入を伴う混合チャンバ内での空気を粉末医薬と混合すること、のいずれか
のために空気を提供するピストンの使用を用いるデバイス（例えば、本明細書に
おいて参考として援用される、Ｍｕｌｈａｕｓｅｒ、Ｐら、米国特許第５，３８
８，５７２号（１９９７年９月２０日）に記載）もまた適している。

【０１００】 ＦＳＰ乾燥粉末はまた、加圧された、定量用量吸入器（ＭＤＩ）、例えば、Ｖ
ｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量用量吸入器を用いて送達され得る。これは、薬
学的に不活性な液体噴霧剤（例えば、クロロフルオロカーボンまたはフロロカー
ボン）中に薬物の溶液または懸濁液を含む。これは、両方とも本明細書において
参考として援用される、Ｌａｕｂｅら、米国特許第５，３２０，０９４号（１９
９４年６月１４日）およびＲｕｂｓａｍｅｎ，Ｒ．Ｍ．ら、米国特許第５，６７
２，５８１号（１９９４）に記載されている。定量用量吸入器により投与される
場合、ＦＳＰ組成物は、好ましくは、ＦＳＰの全身吸着を増強するための界面活
性物質（例えば、脂肪酸、胆汁酸塩、リン脂質またはアルキルサッカライド）を
欠く。なぜなら、本発明の組成物を投与する場合、このような化合物は、血流中
のＦＳＰの治療レベルを達成するために不必要であるからである。

【０１０１】 あるいは、本明細書において記載される粉末は、溶媒（例えば、水または生理
食塩水）に溶解または懸濁され得、そして噴霧により投与され得る。エアロゾル
化された溶液を送達するためのネブライザーとしては、ＡＥＲｘ^TM（Ａｒａｄｉ
ｇｍ）、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）、および
ＡｃｒｏｎＩＩ（登録商標）（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ）が挙げられる。

【０１０２】 使用前に、ＦＳＰ乾燥粉末は、一般に、環境条件下で保存され、そして好まし
くは、約２５℃かまたはそれ未満の温度で保存され、そして相対湿度（ＲＨ）は
、約３０〜６０℃にわたる。より好ましくは、相対湿度条件（例えば、約３０％
未満）は、投薬形態の二次パッケージング中への乾燥剤の組み込みにより達成さ
れ得る。本発明のＦＳＰ粉末は、保管の際の生物活性の有意な損失を示さない；
さらに、３つの代表的乾燥粉末処方物で行った加速化安定性試験（実施例７．Ｃ
、表９および図１）は、呼吸に適したＦＳＰ乾燥粉末を調製する能力が、良好な
エアロゾル性能により特徴づけられるだけでなく、良好な安定性を有することに
よっても特徴付けられることを示す。さらに、ラット（実施例９）において気管
内投与されたＦＳＰ溶液、およびサル（実施例１０および１７）へのＦＳＰ粉末
の肺投与のための両方の予備的なインビトロ結果は、皮下投与されたＦＳＰに対
して、合理的に高いバイオアベイラビリティー値（すなわち、約５％〜２０％お
よび１８％〜２５％）を示した。このことは、本発明の乾燥粉末の肺投与による
不妊性処置の実施可能性をさらに示す。

【０１０３】 （ＶＩ．治療適用） 本発明のＦＳＰ乾燥粉末は、雄性被験体および雌性被験体の両方における不妊
性を処置するための治療上有効な量での肺への蓄積のためおよび肺からの吸収の
ため、吸入により投与される場合に、有用である。より詳細には、本発明の方法
は、内因性に生成されたレベルを上回って増大されるＦＳＰのレベルを欠く患者
か、またはさもなければ欠くことから利点を得得る患者の処置のための治療適用
において特に有用である。

【０１０４】 乾燥粉末形態で肺深部に吸入される場合、ＦＳＰは、原発性の卵巣不全を蒙っ
ていない女性の卵巣の濾胞成長を刺激するのに効果的である。ＦＳＰの肺送達後
、血漿インヒビンレベルの測定を用いて、ＦＳＰ活性の薬物動態学的マーカーを
提供し得る。濾胞増殖のレベル（直径約１０ｍｍより大きい濾胞の数の増大）（
例えば、超音波により決定される）およびストラジオール分泌（すなわち、血清
エストラジオールレベル）はまた、ＦＳＰの効果を評価するために用いられ得る
；男性において、セロトリ（Ｓｅｒｏｔｏｌｉ）細胞産生レベルはまた、処置の
効率のさらなる指標を提供し得る。好ましくは、本明細書により提供されるよう
なＦＳＰ乾燥粉末処方物の肺送達は、ＦＳＰ処置の前に測定した基準レベルに対
して増加する、上記の１つ以上のマーカー（濾胞増殖、血清エストラジオール、
インヒビン、Ｓｅｒｏｔｏｌｉ細胞産生）のレベルを生じるために効果的である
。

【０１０５】 本発明のＦＳＰ粉末はまた、補助生殖技術（Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ＡＲＴ）のために、肺深部に投与さ
れる場合、有用である。このような場合、ＦＳＰは、体外受精（Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ＩＶＦ）、胚移植（ＥＴ）および他の補助生
殖技術のための複数濾胞発達（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の刺激を受けている排卵性の不妊女性に投与される。一般
に、女性不妊症関連の状態における使用のため、ＦＳＰは、約７〜２１日の期間
の一回以上の処置サイクルのために、または濾胞増殖をさらに刺激するために、
肺深部に投与される。不妊女性の場合、ＬＨ（黄体形成ホルモン）動揺のない、
濾胞の最終成熟および排卵をもたらすため、十分な濾胞発達が生じた後、ヒト絨
毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、投与する（上記のように）。雄性不妊を処置
するために用いる場合、ＦＳＰ乾燥粉末は、代表的に少なくとも約６ヶ月間、そ
して代表的に少なくとも約１年間投与される。

【０１０６】 代表的に、上記の状態の処置は、組成物中に含まれるＦＳＰの特定の活性に依
存して、平均、患者一日当たり少なくとも約０．５〜３５μｇのＦＳＰ／ｋｇの
範囲、好ましくは患者一日当たり少なくとも約１〜２０μｇのＦＳＰ／ｋｇの範
囲の、治療有効量のＦＳＰ乾燥粉末を投与することによって効果がもたらされる
。適切な投薬量は、臨床開業医に公知であり、もちろん、特定の疾患状態、投与
される組成物の特定の活性、および処置が行われる特定の患者に依存する。例え
ば、単位投薬量形態当たりに投与されるＦＳＰの量は、一般的に、約５ＩＵ〜約
１２，０００ＩＵ ＦＳＰの範囲、好ましくは５ＩＵ〜約１０００ＩＵ ＦＳＰ
、より好ましくは約３７ＩＵ〜５００ＩＵ、さらにより好ましくは約５０ＩＵ〜
３００ＩＵ ＦＳＰの範囲である。好ましくは、治療有効量は、平均して、おお
よそ：１日当たり１０〜１０００ＩＵ ＦＳＰ、１日当たり５０〜３０００ＩＵ
ＦＳＰ、１日当たり７５ＩＵ〜約６００ＩＵのＦＳＰ、または１日当たり約２
００ＩＵ〜１２，０００ＩＵ ＦＳＰの範囲であり、これは、用量レジメン、続
く処置の対象（すなわち、２４時間以上の期間に渡って送達されるエアロゾル化
された用量の数）および処置の型に依存する。いくつかの例において、所望の治
療量を達成するために、日々の反復した投与（すなわち、１日当たり特定のメー
ターに示される用量の反復される個別の吸入（ここで、個別の投与は、所望の日
用量が達成されるまで反復される））を提供することが必要であり得る。

【０１０７】 以下の実施例が示されるが、本発明の範囲を制限することは全く意図されない
。

【０１０８】 本明細書中に参照される全ての論文、書籍、特許および他の刊行物は、その全
体が参考として本明細書によって援用される。

【０１０９】 （実施例） （材料および方法） （材料） （ｕＦＳＨ）ヒト尿由来のＦＳＨ（ｕＦＳＨ）を特定の実験のＦＳＰ供給源と
して使用した。凍結乾燥したｕＦＳＨ粉末（Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）は、代表的に処方溶液の調製前に５ｍｇ
／ｍｌに再構成させた。最初の処方物（粉末ロット番号Ｒ９８０２５〜Ｒ９８０
５４）は、売り手に供給されるｕＦＳＨ材料から直接調製した。処方物Ｒ９８０
６７〜Ｒ９８１１２は、売り手に供給される材料中に存在する残渣の重炭酸アン
モニウムを除去するために、限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０、１０ｋＤの
分子量をカットオフ）によってさらに精製されたｕＦＳＨから調製された。脱塩
後の糖タンパク質の完全性は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって確認し、そしてパーセン
ト糖タンパク質の回復は、ＵＶによって決定した。残存する溶液を、４℃、一晩
での溶液安定性に関して、および３回の凍結融解サイクルに関して試験した。

【０１１０】 （賦形剤）賦形剤は、以下のような市販の供給源から得た：マンニトール（Ｍ
ａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐ
ａｒｉｓ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ；Ｕ．Ｓ．Ｐ；ＦＷ １８０）、クエン酸ナトリウ
ム・２Ｈ₂Ｏ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ
Ｊ；Ｕ．Ｓ．Ｐ；ＦＷ ２９４．１）、クエン酸・Ｈ₂Ｏ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ
，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ；Ｕ．Ｓ．Ｐ；ＦＷ ２１０．１４）、スク
ロース（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ；ＦＷ ３４２．２
）、ラフィノース・５Ｈ₂Ｏ（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．，Ｗ
ａｕｋｅｇａｎ，ＩＬ；ＦＷ ５９４．５）、グリシン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，
Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ；ＦＷ ７５．０７）、トレハロー
ス・２Ｈ₂Ｏ（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．，Ｗａｕｋｅｇａｎ
，ＩＬ；ＦＷ ３５０．３）、ロイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ
）。

【０１１１】 洗浄のための滅菌水（ＵＳＰ）は、処方溶液の調製およびｕＦＳＨ薬剤物質の
再構成のために使用した。

【０１１２】 （方法） （分光学）保存ｕＦＳＨ溶液、予備スプレー乾燥溶液および再構成された粉末
の濃度は、紫外／可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）分光測光法によって測定した。サンプル
溶液は、２７６ｎｍで０．１〜１．５単位の間の吸収値を与えるように希釈した
。４００ｎｍにおける溶液の混濁度を、不溶性粒子／凝集物形成の尺度として使
用した。

【０１１３】 （粒子サイズの測定）粉末の質量中央直径（ＭＭＤ）をＨｏｒｉｂａ ＣＡＰ
Ａ−７００粒子サイズ分析器（Ｈｏｒｉｂａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｉｎｃ
．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて測定した。測定は、懸濁媒体中の分散された
粒子の遠心沈降に基づいた。粒子のストーク直径（Ｓｔｏｋｅｓ’ ｄｉａｍｅ
ｔｅｒ）に基づく質量中央直径は、粒子密度ならびに懸濁媒体の密度および粘度
を用いて計算した。粉末の密度は、全ての粒子に関して１．５ｇ／ｃｍ³として
設定した。（この公称値は、分析される全ての粉末に関して使用され、そしてス
プレー乾燥粉末に対する代表的な範囲内である）。粒子サイズ測定は、５ｍｌの
Ｓｅｄｉｓｐｅｒｓｅ Ａ−１１（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ，Ｎｏｒｃｒｏ
ｓｓ，ＧＡ）に懸濁されかつ１０分間の超音波処理によって分散される、約５〜
１０ｍｇの粉末を用いて実施された。粒子サイズのデータが集められた範囲は、
０．４〜１０．０μｍに設定された。

【０１１４】 （示差走査熱分析（ＤＳＣ））スプレー乾燥粉末（アルミニウムのパンで気密
的に密封された２〜１０ｍｇ）の熱的な挙動は、ＴＡ変調示差走査熱分析２９２
０によって分析した。代表的に、サンプルは、−６０℃で１０分間平衡化し、そ
して、窒素気流下、２℃／分で２００℃まで加熱した。変調振幅は、±１℃また
は±０．３℃であり、そして変調期間は、６０秒であり、ここで、少なくとも４
サイクルが遷移の間に達成された。装置は、温度および熱容量に関して、インジ
ウムによって較正した。基線のスキャンは、サンプルを実行する前に行った。

【０１１５】 （アンダーセンカスケードインパクター）アンダーセンカスケードインパクタ
ー（粒子のサイズに応じた慣性嵌入によってプレート上の粒子を捕獲する連続し
たステージを備える篩様の装置）を使用して、気流中のエアロゾル化された粉末
処方物のＭＭＡＤおよび粒子サイズ分布を測定した。このプレートは、試験の前
および後に秤量し、そして各段階のプレート上に沈着した粉末の質量を測定した
。他に示されない限り、９．０〜０．４μｍの範囲のカットオフサイズを伴う８
つの段階（頂部から低部のステージまで、０〜７）、ならびに流量が２８．３Ｌ
／分で作動された場合に＜０．４μｍの粒子を捕捉する最終濾過ステージを有す
る、従来のアンダーセンカスケードインパクターを用いて行った。デバイス試験
の設定は、カスケードインパクターおよびＵＳＰ（米国薬局方、ＵＳＰ２３、第
６０１章）がフィルターよりもむしろデバイスの口金に装着される以外は、ＤＤ
Ｅ試験と同様であった。複数の分散が、典型的に、重量分析的に正確なデータ（
例えば、２０ＦＳＰ−充填されたブリスターパック（ブリスターパック当たり２
ｍｇを充填））を達成するために各カスケード嵌入の実行に対して行われた。

【０１１６】 （アンダーセンショートスタック（ＳＳ）法（Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｓｈｏｒｔ
Ｓｔａｃｋ Ｍｅｔｈｏｄ））（ＡＰＣを測定するために使用される）ＳＳ法
において、ステージが配置される順序は、上記のように従来のアンダーセンカス
ケードインパクターセットアップから変更される。頂部から、ステージ０を、の
どに接続するために入口円錐体の装着に対して使用した。ステージ３を次にステ
ージ０の下に配置し、続いてフィルターステージ（ステージＦ）を配置した。粉
末を含む気流を、ステージ０および３のみを介して通過させ；空気（粉末ではな
い）を、設置される残りのアセンブリを保持するためにステージＦの下に配置さ
れる他のステージを介して流した。予備秤量したフィルタを、ステージＦ上に配
置し、そして＜３．３μｍの粒子を捕獲した。第２のフィルターは、ステージ３
の逆位のプレート状に配置し、＞３．３μｍの粒子を捕獲した。本明細書中に記
載される研究に関して、２ｍｇのＦＳＰ粉末組成物を含む１つのＢＰ（ブリスタ
ーパック）は、エアロゾル送達デバイス中で分散され、そして減圧は、ＵＳＰ方
法論により２８．３Ｌ／分として吸引した。次いで、このプロセスは、作動当た
り６ｍｇの標的質量に対して２回繰り返した。次いでフィルターを取り除き、そ
して沈着した粉末の量を測定するために秤量した。

【０１１７】 （実施例１） （ｕＦＳＨの予備処方評価：薬剤特性の特徴付け） 予備処方活性は、薬剤特性を評価するため、そして分析の前に保存された溶液
サンプルの安定性を評価するために行った。予備処方活性としては、凍結融解サ
イクルに対する糖タンパク質の安定性、表面への吸着、溶解度、ならびに（ｉ）
再構成された大量ｕＦＳＨ物質、（ｉｉ）溶液中の処方されたｕＦＳＨ（予備ス
プレー乾燥）、および（ｉｉｉ）ｕＦＳＨ粉末の再構成された溶液の溶液安定性
を評価することが挙げられる。予備スプレー乾燥溶液（表１で記載したような）
のｐＨ範囲は、５と８との間に維持した。このｐＨ範囲は、糖タンパク質安定性
および固体状態の特性に対するｐＨの効果をモニターするために調査した。中性
に近いｐＨを選択して、肺内の粉末の分散後における、生理学的適合性の維持を
補助した。予備的な結果により、全ての処方されたｕＦＳＨ溶液が、４℃で４〜
７日間貯蔵される場合、または周囲温度で１日間貯蔵される場合、あるいは凍結
融解サイクルの反復後において、安定であることが示された。予備的なデータに
より、シリコンチューブへの糖タンパク質の吸着損失が最小であることが示され
た。１７５μ／ｍｌ ｕＦＳＨ処方溶液の最初の２ｍＬによって、１０μｇのｕ
ＦＳＨの、Ｂｕｃｈｉスプレードライヤーを用いて使用されたチューブ（２ｍ×
４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）への吸着が生じた。ｕＦＳＨのさらなる損失は、引き続
くアリコート中で観察されなかった。

【０１１８】 （実施例２） （代表的なｕＦＳＨ溶液処方物の調製および肺送達のための粉末の調製） 処方溶液は、０．５％（ｗ／ｖ）の全固体含量で調製した。各溶液のｐＨを測
定し、次いで、溶液をスプレー乾燥の前に清澄さに関して点検した。表１は、全
ての前スプレー乾燥溶液の組成を列挙する。マンニトールが、他に記載しない限
り糖である。粉末は、カスタマイズされたノズルを備えるＢｕｃｈｉ１９０ミニ
スプレードライヤー（Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ，Ｍｅｉｅ
ｒｓｅｇｇｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（Ｐｌａｔｚら、１９９
７に記載されるような）およびサイクロンを用いて、ｕＦＳＨおよび賦形剤の水
溶液をスプレー乾燥させることによって生成された。代表的な処方物は、３００
ｍｇ未満の全固体を含む溶液から調製した。高い収集効率（通常、７０〜８０％
の間）が、達成され、続く粉末特徴付けに対する良好な粉末の供給を生じた。

【０１１９】 表１．スプレー乾燥溶液の説明および粉末プロセシングの結果

【０１２０】

【表２】 ¹標的ｕＦＳＨ含量、エラーは、約±０．２％であった；²スプレー乾燥の前の溶
液ｐＨ；³再構成された粉末のｐＨ；⁴遠心沈降（Ｈｏｒｉｂａ）によって測定さ
れた；⁵試験から除外されたロット。

【０１２１】 初期のロットからの再構成された粉末のｐＨ（スプレー乾燥後、表１）は、ス
プレー乾燥後、ｐＨに予期しない低下を示した（特に、緩衝化されていない（す
なわち、シトレートがない）処方物）。これは、薬剤物質材料中の重炭酸アンモ
ニウムの存在に起因した。ｐＨ低下は、精製された薬剤物質の使用の際に最小化
され、そして、これは緩衝液を含む処方物においてはわずかであった。

【０１２２】 （実施例３） （スプレー乾燥粉末の化学安定性評価：高次凝集体（ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅ
ｒ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の形成を介した単量体ｕＦＳＨの損失） 処方されたｕＦＳＨ溶液のクロマトグラフィの純度および含量は、下記のよう
に、ＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除高性能液体クロマトグラフィ）方法論を用いて
評価した。

【０１２３】 表２．ＳＥ−ＨＰＬＣパラメーター

【０１２４】

【表３】 インタクトな単量体単位、その解離サブユニットおよび高次凝集体は、上記で
特定化されたＳＥ−ＨＰＬＣ条件下において、それぞれ、１８．６分、２０．２
分および１６．２分の保持時間（ＧＷ３０００ＸＬカラム）で溶出された。保持
時間は、ＧＷ２０００ＸＬカラム上で減少した。

【０１２５】 ＧＷ３０００ＸＬカラムを用いたＳＥ−ＨＰＬＣ法の精度は、単一濃度のｕＦ
ＳＨ薬剤物質（１７３μｇ／ｍＬ）の６回複製注入によって評価した。相対的な
標準偏差は、精度および応答因子のそれぞれに関して、０．０％および０．２％
であった。ＳＥ−ＨＰＬＣ法の線形性は、１７．４ｍｇのｕＦＳＨに対して０．
８７の範囲で評価した。ｕＦＳＨ溶液の単一濃度（１７３μｇ／ｍＬ）を、カラ
ム上に種々の体積で収入した；各注入体積は、２連でアプライした。この応答は
、Ｒ²＝０．９９９９９を有する線形性を示した。

【０１２６】 クロマドグラフィによって、αおよびβサブユニットが一緒に溶出され、そし
てｕＦＳＨの単量体形態から十分に分析されなかった。分解プロフィールは、１
μｇと１０μｇの間の充填で保持された。従って、ｕＦＳＨの定量化は、単量体
ピークおよびサブユニットピークの重ね合わせたピーク領域の積分によって決定
された。高次凝集体は、単量体からより良好に分析され、そして別々に積分され
た。要約すると、この方法は、高次凝集体の形成を介した単量体ｕＦＳＨの損失
を示すためにのみ利用される。

【０１２７】 表３．大量粉末およびスプレー乾燥後のＳＥ−ＨＰＬＣ分析

【０１２８】

【表４】 ¹ｂｓｄ＝スプレー乾燥前；²ａｓｄ＝スプレー乾燥後。

【０１２９】 上記の表３は、スプレー乾燥に起因して生じる高次凝集体のパーセンテージに
おける変化を要約する。高次凝集体は、大量薬剤物質中、不純物として存在し（
ＳＥ−ＨＰＬＣによって＜０．８％の純度）、そしてスプレー乾燥後わずかに上
昇した。高次凝集体における２％未満の増加が、スプレー乾燥後、ロットＲ９８
０４６ｂ（これは、＞６％の高次凝集体を示した（そして、アウトライアーであ
ると考えられた））を除く全てのｕＦＳＨ処方物に関して観察された。ｐＨ、ま
たはシトレート、あるいはｕＦＳＨ含量を伴う高次凝集体形成における明確な傾
向は、観察されなかった。

【０１３０】 （実施例４） （包装されたスプレー乾燥粉末の１ヶ月および長期の安定性） 包装された粉末の実時間および促進された安定性は、最初と１ヶ月時点との間
の高次凝集体における％変化に基づいて決定した（表４）。粉末は、ブリスター
パック（ＢＰ）中、２ｍｇの全質量まで手で充填された。このブリスターパック
を、ペトリ皿（２０〜６０ＢＰ／皿）に置いた。次いで、このペトリ皿を、乾燥
剤とともに箔の袋（ｆｏｉｌ ｐｏｕｃｈｅ）に二次的に包装した。

【０１３１】 表４．ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析されたｕＦＳＨ包装粉末の安定性

【０１３２】

【表５】 いくつかの代表的な包装された処方物は、良好な貯蔵安定性を示した。ラフィ
ノースを用いて処方された尿のＦＳＨは、両方の設定状態において良好な安定性
を示した。マンニトール／シトレートおよびマンニトールベースの処方物は、高
次凝集体におけるわずかな増加（＜０．２％）によって支持される場合、１ヶ月
間３０℃で安定であった。高次凝集体は、１ヶ月の貯蔵後＜０．８％の全パーセ
ンテージ変化を伴う両方の処方物に対して温度が４０℃まで上昇した場合、さら
に増加し、これは、マンニトール／シトレートおよびマンニトール処方物の両方
が、比較可能な安定性を有することを示す。

【０１３３】 長期安定性（４８〜５２週間）は、周囲温度および≦５％相対湿度で貯蔵され
た、特定のマンニトール−シトレートブリスターパックｕＦＳＨ粉末（５％ｕＦ
ＳＨ／１５％マンニトール／８０％シトレート：Ｌ２０１２／粉末ロット９８０
４８；Ｌ２０１０／粉末ロット９８１１０）に対するＳＥ−ＨＰＬＣによって同
様に測定した。スプレー乾燥後１．８％の最初の高次凝集体レベルを示す粉末Ｌ
２０１２は、５２週間後、実質的に変化しない（１．５％の全高次凝集体有した
）ままであった。同様に、粉末Ｌ２０１０に関する高次凝集体レベル（スプレー
乾燥後、最初は１．７％）は、密封されたブリスターパック中、４８週間の貯蔵
後に測定された場合、たった２．６％まで増加した。

【０１３４】 （実施例５） （スプレードライの後のｕＦＳＨのシアリル化の程度） ｕＦＳＨの可能性のある不安定な末端シアル酸残基の存在に起因して、比色定
量法を利用して、スプレードライの後のｕＦＳＨシアリル化の完全性を調べた。
この方法を行う際に、末端シアル酸基を低ｐＨにて切断し、その後、レゾルシノ
ールを用いる銅触媒反応を行った。産物の吸光度を、５６０ｎｍにおいて測定し
、そしてその後Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を用いて作成した較正曲
線に基づいて、ナノモルのシアル酸に変換した。標準と糖タンパク質サンプルの
両方について三連の測定を行った。呈色反応の前に、サンプルをＮＩＣＫカラム
を通すことによって、インタクトなシアリル化糖タンパク質を、任意の遊離のシ
アル酸から分離した。溶出した各画分のアリコートを、反応に使用した。

【０１３５】 この方法の線形の範囲は、８０ナノモルにまで及ぶ。検出の下限は、２ナノモ
ルのシアル酸であることが見出された。この下限は、３．５％のｕＦＳＨ粉末に
ついて１〜２％の損失を検出する能力に対応する。この方法の正確さを、フェチ
ュインをコントロールとして用いて試験した。生じたシアル酸の濃度は、３８０
ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質であり、この量は、フェチュインについての包括的な
研究室間のＡＢＲＦ研究において報告された３７０±３５ｎｍｏｌ／ｍｇの平均
値（ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、１９９７年４月）と十分匹敵
した。

【０１３６】 比色定量法を使用して、２つのｕＦＳＨ粉末（Ｒ９８０２６、Ｒ９８０２９）
を評価した。２ｍＭのクエン酸溶液を使用して、粉末を再構成し、そしてシアリ
ル化糖タンパク質をＮＩＣＫカラムから溶出した。２つのロットから生じた溶出
プロフィールは、両方の処方物において、遊離のシアル酸が存在しないことを示
した。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を行って、
画分１〜３中のタンパク質の存在を確認した。

【０１３７】 シアル酸の切断は、酸性条件により適するので、同一のアッセイを用いて、シ
アル酸切断が低ｐＨにおいて調製された処方物において生じるか否かを確認した
。このアッセイのために、粉末Ｒ９８０４６およびＲ９８０４８を利用した。得
られたプロフィールは、高ｐＨにおいて得られたものと同様であった。

【０１３８】 全ての４つのロットについてのインタクトなシアル酸の濃度（表５）は、尿Ｆ
ＳＨの初期のストック溶液についてのシアル酸濃度と類似していた。このことは
、ｕＦＳＨのシアリル化の程度は、スプレードライによって影響を受けなかった
ことを示した。従って、表５の結果は、従来のスプレードライ条件下での脱シア
リル化に対するｕＦＳＨの化学的安定性を説明する。

【０１３９】 （表５：シアル酸アッセイからの定量的結果）

【０１４０】

【表６】 表５の結果は、中性付近または弱酸性のｐＨ値において、スプレードライの結
果として、代表的処方物中のｕＦＳＨのシアリル化の損失がないことを実証する
。このアッセイにおいて測定される平均的なシアル酸含量（８．８重量％）は、
ｕＦＳＨについての含量（８．９６重量％）と匹敵する。

【０１４１】 （実施例６） （肺送達のためのｕＦＳＨ粉末の固体状態での特徴付け） 代表的なｕＦＳＨ粉末処方物をさらに特徴付けして、種々の賦形剤および残存
する湿気の、生じる粉末の固体状態の性質に対する影響、ならびにタンパク質の
安定性に対するその組み合わされた影響を探索した。

【０１４２】 （調節された示差走査熱分析（ＤＳＣ）） ＤＳＣを使用して、所定のスプレードライした粉末サンプルの熱流束プロフィ
ールを測定して、そのガラス転移温度（Ｔｇ）を測定し、そして結晶化度を推定
した。ガラス転移温度もまた決定して、特定の処方物の可能性のある固体状態安
定性の指標を提供した。なぜなら、高いＴｇ値は、低いＴｇよりも、より高度の
物理的安定性の可能性を示し得るからである。ＤＳＣ測定を、上記の材料および
方法の章において記載されるように行った。表６は、ＤＳＣのデータ、および代
表的なｕＦＳＨ粉末処方物について得られたガラス転移温度を要約する。

【０１４３】 表６において示されるデータを見ると、アモルファスのラフィノース処方物が
、１００℃近くの異なるガラス転移温度を示した。さらに、高いＴｇ（７０〜９
０℃）が、高クエン酸含有処方物（＞８０％クエン酸）において観察された；Ｔ
ｇの後には、クエン酸の無水多形の結晶化に起因する発熱（ｅｘｏｔｈｅｒｍ）
が続いた。クエン酸がより少ない（＜６０％クエン酸）マンニトール／クエン酸
処方物は、より低いＴｇ（３０〜６０℃）、マンニトールの結晶化に起因する約
９０℃での発熱、およびその後のマンニトールの溶解を示した。より高度な結晶
９５％マンニトール処方物は、観察可能なＴｇを示さなかった；結晶マンニトー
ルの溶解に特徴的な約１６０℃での吸熱のみを示した。データをより広く見ると
、純粋でないｕＦＳＨに由来する残存する炭酸水素アンモニウムの影響が、Ｔｇ
値を抑制するようである。クエン酸（低ｐＨ）は、クエン酸ガラスのＴｇを抑制
することが報告されている［Ｌｕ，Ｑら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（８）：１
２０２−１２０６（１９９８）］が、このことは、研究したｐＨ範囲において容
易には明らかでなかった。これらのデータは、異なるＴｇおよび異なる結晶化の
程度を有する、安定なｕＦＳＨ粉末を調製する能力を実証する。

【０１４４】 （熱重量分析） 熱重量分析（ＴＧＡ）（室温から２００℃までの加熱の際に、サンプルから損
失される重量をモニターする技術）を利用して、上記のｕＦＳＨ乾燥粉末の残存
水分含量を測定した。２５℃から１５０℃までの加熱の際に観察された重量損失
は、残存する湿気の損失に起因した。スプレードライした粉末の湿気含量（グロ
ーブボックス内に梱包した密閉したアルミ鍋中に２〜１０ｍｇ）を、ＴＡ２９５
０熱重量分析装置を用いて分析した。密封した鍋の頂上に、ＴＧＡ炉中に加える
直前に穴を開けて、室内の空気からの水分の取り込みを最小限とした。結果を表
６に提供する。表６の結果を見ると、純粋でないｕＦＳＨを用いて調製した処方
物は、加熱の際にかなり大量の重量の損失を示し、このことは、後に、粉末中に
残存する炭酸水素アンモニウムの存在の原因であった（炭酸水素アンモニウムは
、６０℃で分解し始める）。湿気含量は、精製されたｕＦＳＨを用いて調製され
た、クエン酸ナトリウムを含有しない粉末について２％未満であったが、高クエ
ン酸含量の粉末は、一般に２〜６％の間の水分を含んだ。

【０１４５】 （表６：ｕＦＳＨ粉末の固体状態での特徴付け）

【０１４６】

【表７】 ¹スプレードライ前の処方物溶液のｐＨ、²再構成粉末のｐＨ。

【０１４７】 （Ｘ線回折） 粉末のＸ線回折研究を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＸＲＤ６０００回折計で行い、代
表的な粉末サンプル（Ｌ２０１０、Ｌ２０１７、Ｌ２０１８）の結晶化度の程度
の特徴付けをした。ｕＦＳＨ／マンニトール／クエン酸処方物（Ｌ２０１０）を
、異なる回折ピークが存在しないことによって示されるように、大きなアモルフ
ァスであると決定した。ｕＦＳＨ／マンニトール処方物（Ｌ２０１７）は、マン
ニトールのα−多形に特徴的な回折パターンを考慮すると、高度に結晶化してい
るようである。ｕＦＳＨ／ラフィノース処方物（Ｌ２０１８）は、別の回折ピー
クの不存在から決定すると、完全にアモルファス化であった。これらのデータは
、上記のＤＳＣの結果と一致する。

【０１４８】 （湿気収着） 湿気収着分析を行い、特定のｕＦＳＨ粉末サンプルの吸湿性の指標を提供した
。具体的には、サンプルを一定の温度下に保ち、そして相対湿度を０％から８０
％まで変化させ、次に０％の相対湿度にまで戻した。各サンプルを、微量てんび
ん上に置き、相対湿度の関数としての平衡での増加重量をモニターした。例とし
ての２つのｕＦＳＨ粉末の湿気収着の結果は、以下のとおりである。高クエン酸
含量粉末（Ｌ２００６、ｕＦＳＨ／マンニトール／クエン酸）は、３０％相対湿
度と４０％相対湿度との間で、湿気取り込みのプロフィールの鋭い変化を示し、
このことは、クエン酸二水化物の形成に起因した。９５％マンニトール処方物は
、６０％付近の相対湿度において小さな転移を示し、このことは、少量の残存す
るアモルファスマンニトールの結晶化に起因した。（タンパク質と会合する少量
のアモルファスマンニトール（＜５％）は、ＤＳＣを使用しても、Ｘ線回折を使
用しても、検出するのが困難である。）等温ミクロ熱量測定（ＴＡＭ）のデータ
はまた、６０％相対湿度でのマンニトール結晶化の存在を示した。マンニトール
の結晶化もまた、等温ミクロ熱量測定によって、マンニトール／クエン酸処方物
中で検出された。これらの湿気収着研究の結果は、生じる粉末の操作の好ましい
様式（すなわち、操作、梱包、および貯蔵の間に、粉末を乾燥したまま保つこと
）を明らかにする。

【０１４９】 （実施例７：ｕＦＳＨ乾燥粉末のエアロゾル性能） 種々の測定可能なパラメーターを使用して、代表的なｕＦＳＨ粉末のエアロゾ
ル性能を評価して、肺への送達についてのｕＦＳＨ乾燥粉末の安定性を測定した
。

【０１５０】 （送達された用量の効率測定（ＤＤＥ）） ２ｍｇのｕＦＳＨ粉末を充填した一つのブリスターパック（ＢＰ）を、Ｓｍｉ
ｔｈ，Ａ．Ｅ．ら（米国特許第５，７４０，７９４号、１９９８年４月２１日）
に記載されるように、乾燥粉末吸入器に入れた。次にこの装置を始動して、粉末
を装置のチャンバー内に分配した。次に、生じるエアロゾル雲を形成する粒子を
、３０Ｌ／分の速度で２．５秒間、減圧によって装置チャンバーから吸い込み、
装置の吹出し口に付けた、予め重量測定したフィルター上に捕獲した。粒子を含
有するフィルターの重量を再度測定して、フィルターに到達したブリスターパッ
クからの粉末の重量を提供した。始動したＢＰもまた、分散後に重量測定して、
事象の後にブリスターパック内に残存する粉末の量を決定した。以下に報告され
るデータについて、１組の試験は、５〜１０のＰＢ分散からなった。

【０１５１】 （空気力学粒径測定） アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）カスケードインパクターを用いる改変され
たショートスタック（ＳＳ）法を、ｕＦＳＨ粉末処方物の初期のスクリーニング
相の間に利用した。ＳＳ法を利用して、ＦＰＦ値、ＡＰＣ値、およびＣＩ Ｅｆ
ｆ値を提供した。原寸のアンダーソンカスケードインパクターを、増進された安
定性のバッチの分析のために利用した。上記のように行われたエアロゾル性能の
結果を、以下の表中の代表的なｕＦＳＨ含有粉末組成について提供する。

【０１５２】 （表７：各粉末のロットについての、放射された用量のパーセント（平均、標
準偏差（ＳＤ）、範囲）、ＢＰ中に残った粉末のパーセント、およびＢＰから離
れて、収集された粉末のパーセント）

【０１５３】

【表８】 上記のデータを見ると、優れたエアロゾル性能を示す処方物は、Ｌ２００６、
Ｌ２０１０、およびＬ２０２０であり、この各々は、それぞれ３．５％、５％お
よび１０％のｕＦＳＨを含有するマンニトール：クエン酸（１：５、ｐＨ７）か
ら構成された。第１の４組のスクリーニングの全ては、Ｌ２００６（３．５％の
ｕＦＳＨ）を含み、そしてそのＤＤＥ平均は、調製した５つのロットについて６
２±７％であった；個々のロットの平均は、５３％から７１％まで変化した。Ｌ
２０１０（５％のｕＦＳＨ）ロットのＤＤＥの平均は、５５±５％（ｎ＝５）で
あり、そして個々のロットのＤＤＥは、４７％から６６％の範囲であった。１０
％のｕＦＳＨを含有する粉末は、７１％の平均ＤＤＥを有したが、再試験の際に
、５５％までの説明できない下降を示した。特に良好な粉末の分散能を示す（す
なわち、６０％以上のＤＤＥ値を有する）他の粉末処方物としては、Ｌ２００１
、Ｌ２００５、Ｌ２００６、Ｌ２０１２、Ｌ２０１６、Ｌ２００６、Ｌ２０１０
、Ｌ２０１７、およびＬ２０１８が挙げられた。ラフィノース粉末Ｌ２０１８お
よびＬ２００８のＤＤＥの平均は、５０±１０％（ｎ＝３ ロット）であった。
ラフィノース処方物のＤＤＥは、他のｕＦＳＨ処方物のいくつかよりも低かった
が、これらの粉末は、そのエアロゾル雲の微細な性質によって区別された。エア
ロゾル性能のさらなる指標として、アンダーソンショートスタック試験の結果を
、３つの測定（１測定あたり３つのブリスターパック）についての、平均微細粒
子画分（Ｆｉｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＦＰＦまたは％＜
３．３μｍ）、平均エアロゾル性能係数（ＡＰＣ）、平均カスケードインパクタ
ー（ＣＩ）効率および推定されたＭＭＡＤを示す以下の表８において、提供する
。

【０１５４】 （表８：ショートスタックアンダーソン粒子サイズ測定）

【０１５５】

【表９】 ⁽¹⁾３つのブリスターパックを、１測定あたり使用した（ｎ）。

【０１５６】 アンダーソンショートスタックのデータは、試験した粉末に特徴的な、良好な
粉末性能を示した。全ての処方物は、５０％以上のＦＰＦ値を示し、このことは
、粒子の５０％以上が３．３ミクロン未満のサイズを有することを示す。そのよ
うな粉末は、その後の全身性の取り込みのための、肺の深部への送達のために望
ましい。試験した処方物の半分は、７５％以上のＦＰＦ値を示した。このことは
、処方物中に存在する小さなサイズの粒子の高いパーセントを示す。これらの処
方物としては、Ｌ２００１、Ｌ２００６、Ｌ２００８、Ｌ２０１０、およびＬ２
０１８が挙げられた。ほとんど全ての粉末はまた、特に良好なＡＰＣ値（好まし
くは、０．３６以上）を示した。これらの処方物としては、Ｌ２００１、Ｌ２０
０６、Ｌ２００８、Ｌ２０２０、Ｌ２０１６、Ｌ２０１０、およびＬ２０１８が
挙げられた。Ｌ２００６のＡＰＣは、一貫して、０．３６を超え、そして０．３
７から０．４２の範囲であり、７４％〜８３％の間の対応するＦＰＦ値（％＜３
．３μｍ）を有した。Ｌ２０１０のＡＰＣ値は、非常に類似し、そして０．３４
〜０．３８の範囲であり、７０％〜８０％のＦＰＦを有した。

【０１５７】 ラフィノース処方物は、ＡＰＣの値が非常に高く、０．３７〜０．４９であり
、９０％の対応するＦＰＦ値を有した。マンニトール処方物は、わずかに低いＡ
ＰＣを示した（０．２６〜０．３３）。従って、マンニトール処方物は、最も大
きなエアロゾル粒子サイズを生成するようであったが、マンニトール／クエン酸
処方物は、中程度の大きさであり、そしてラフィノース処方物は、最も小さいエ
アロゾル粒子サイズであった。

【０１５８】 （加速安定性の研究） ３つの粉末処方物（Ｌ２０１０、Ｌ２０１７、Ｌ２０１８）を、１ヶ月間、３
０℃および４０℃ならびに２〜４０℃のストレス循環条件でセットアップした。
以前に生じた短いスタックデータを、安定性バッチが、完全なスタックセットア
ップを用いた粒子の大きさの分布について試験された場合に確認した。表９は、
加速安定性研究からのデータを含む。

【０１５９】

【表１０】 加速安定性研究において、初期ＤＤＥ値は、以前のバッチの値よりも低かった
。しかし、１ヶ月の試験の直後、安定性条件のいずれかで保持された粉末処方物
のいずれかについてのＤＤＥの減少は存在しなかった。図１は、この１ヶ月の安
定性研究に利用された、３つのｕＦＳＨ粉末処方物（Ｌ２０１０、Ｌ２０１７、
Ｌ２０１８）についての、ＦＰＦとＭＭＡＤとの間の関係を示す。図１に示され
るデータポイントのクラスターを見て、そしてｘ軸に沿って、左から右へ進むと
、データクラスターは、それぞれ、サンプルＬ２０１７、Ｌ２０１０およびＬ２
０１８に対応する。初期測定および１ヶ月の測定の両方についてのＡＰＣ値は、
各々の粉末処方物にほぼ一致しており、そしてより早いバッチのＡＰＣ値に一致
した。従って、本明細書中に記載される例示的な粉末処方物は、良好なエアロゾ
ル性能および安定性を示す。

【０１６０】 （実施例８） （ｕＦＳＨ乾燥粉末の生物活性） ４つの代表的な乾燥粉末ｕＦＳＨ処方物（Ｌ２０１３（１０％ ｕＦＳＨ、１
４％ラフィノース、７６％シトラート）、Ｌ２０１０（５％ ｕＦＳＨ、１５％
ラフィノース、８０％シトラート）、Ｌ２００６（３．５％ ｕＦＳＨ、１５％
マンニトール、８１％シトラート）、およびＬ２００８（３．５％ ｕＦＳＨ、
９５％ラフィノース）の生物活性を、βラクタマーゼ感受性レポーター細胞アッ
セイによって決定した。４つのｕＦＳＨ粉末処方物は、ｕＦＳＨ標準に匹敵する
有意な生物活性を保持した。他の適切なインビトロアッセイが、本明細書中で言
及される。

【０１６１】 これらの結果は、図２Ａおよび２Ｂに図表を用いて示される。

【０１６２】 （実施例９） （ラットにおいて皮下（ＳＣ）投与されたＦＳＰおよび気管内（ＩＴ）投与さ
れたＦＳＰのバイオアベイラビリイティー） 以下の研究が着手され、ＳＣ投与されたＦＳＰに関連して、ラットにおいて気
管内投与されたＦＳＰのバイオアベイラビリティーの指標を提供した。

【０１６３】 （プロトコル１（ＦＳＰ−ＳＣ）） 下垂体由来のヒトＦＳＨを、Ｓｉｇｍａから得た（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，
ＵＳＡ，ロット番号３４Ｈ００６９ 製品番号Ｆ４０２１）。希釈液は、１％ア
ルブミンを含むＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）であった。２８０〜３００グ
ラムの間の体重の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、単一の照射研究
のために使用した。２匹の動物を、計６時点について、データ収集時点あたり使
用した。動物に、０．９単位／２００μＬまたは９．０単位／２００μＬのいず
れかで投与し、その動物を適切な時間で殺傷し、そして合計の血液サンプルを得
た。個々のラットを、各々の時点について使用した。血液サンプルを、０、４、
８、２４、４８および９６時間で収集した。サンプルを遠心分離し、そして上清
を、ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ
ＵＳＡ）からのＲＩＡキットを使用して分析するまで、−８０℃で凍結した。

【０１６４】 （プロトコル２（ｕＦＳＨ−ＳＣおよびＩＴ）） 動物に投与された活性因子は、Ｓｅｒｏｎｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎ
ｏｒｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た「ＦＥＲＴＩＮＯＲＭ ＨＰ」７５ＩＵ
（Ｕｒｏｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ ｉＦＳＨ）ｉｍ／ｓｃであった。活性因子（
各々１０ｍｇのラクトースを含むｕＦＳＨの１０バイアル）を、売り主によって
供給された１ｍｌのＮａＣｌ溶液の添加によって再構築し、これに、十分なＰＢ
Ｓ（リン酸緩衝化生理食塩水）を添加し、９．０単位／２００μＬ ＦＳＨの濃
度を有する溶液を調製した。２８０〜３００グラムの体重の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ
−Ｄａｗｌｅｙラットを、単一の照射研究のために使用した。各々の群を、毎日
４匹の動物のコントロール群を含む３６匹の動物から構成した。９．０単位／２
００μＬ ｕＦＳＨを含む薬物溶液を、ＩＴおよびＳＣ研究の両方について、所
定の時点で動物に投与した。２匹の動物を、計６時点について、データ収集時点
あたり使用した。

【０１６５】 実験の日に、ラットをＩＴ投薬のために麻酔し、次いで回復させた。次いで、
動物を所定の時間で屠殺し、そして合計の血液サンプルを得た。個々のラットを
、各々の時点について使用した。血液サンプルを、０、１、２、４、６、９、２
４時間（１日目）、および４８時間（２日目）、７２時間（３日目）ならびに９
６時間（４日目）で収集した。サンプルを遠心分離し、そして上清を、ＩＣＮ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）からのＲＩＡキットを
使用して分析するまで、−８０℃で凍結した。結果を、以下の表１０に要約し、
そして図３に図表を用いて要約する。

【０１６６】

【表１１】 上記の結果は、気管内送達されたＦＳＰのバイオアベイラビリティーの指標を
提供し、そしてＳＣ送達されたＦＳＰと比較して、約２０パーセントの相対的Ｉ
Ｔバイオアベイラビリティーを明らかにする。この予備研究の結果は、ラット気
管に液体形態でしみこませる場合、ＦＳＰが、穏当なバイオアベイラビリティー
を有することを示す。このデータは、さらに、ＦＳＰが、肺に投与され得、そし
てより低い気道を介して吸収され得、そして体循環に吸収され得ることを示唆す
る。

【０１６７】 （実施例１０） （カニクイザルにおける肺投与および皮下投与後のｕＦＳＨの薬物動態学） 以下のインビボ薬物動態学的（ＰＫ）研究を、皮下注射または筋肉内注射の代
替として肺経路によって投与される場合に、カニクイザルにおける濾胞刺激タン
パク質（ｕＦＳＨ）のバイオアベイラビリティーを試験するために行った。

【０１６８】 ５匹の雌性カニクイザルの各々に、皮下注射によってｕＦＳＨを投与し、その
後、エアロゾル化されたｕＦＳＨ粉末組成物２０１０の３つの別々の肺用量を投
与した（２ｍｇ用量；５％ ＦＳＨ／１５％マンニトール／８０％シトラート）
。粉末の肺投与について、サルは、ヘルメット型照射装置の内部に置かれ、そし
てＦＳＨ乾燥粉末を、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．ら、米国特許第５，７４０，７９４
号、１９９８年４月２１日に記載される型の乾燥粉末吸入デバイスを使用して、
ヘルメットに直接分散した。ＦＳＨの漸増濃度の吸入用量を、５または１５分の
照射時間にわたって投与した。吸入用量の実際の平均は、３．８±１．７μｇ／
ｋｇ、１８．４±１．３μｇ／ｋｇおよび３７．２±３．９μｇ／ｋｇであり、
これは、各々の吸入の間の各々のサルについての、エアロゾル濃度、平均分量（
ｍｅａｎ ｍｉｎｕｔｅ ｖｏｌｕｍｅ）および照射持続期間に基づいた処置後
を算出した。用量投与を、少なくとも１週間によって分離した。

【０１６９】 血液サンプル全体を、０時間（用量前）、０．０８、０．２５、０．５、１、
３、６、９、１２、２４、４８および７２時間の用量後に収集した。免疫反応性
ｕＦＳＨの血清濃度を、市販のＦＳＨキット（Ｃｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ（登録
商標）ＦＳＨ ＩＲＭＡ，ＤＰＣ（登録商標）Ｌｔｄ．，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅ
ｓ，ＣＡ）を利用した、確認されて、改変されたイムノラジオメトリックアッセ
イ（（ＩＲＭＡ）、９０６ＤＭ−０５２−０１）によって決定した。パーセント
相対的バイオアベイラビリティーを、以下の関係を使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆ
ｔ Ｅｘｃｅｌによって算出した［Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉ
ｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｓｔ，１８８−１８９（１９９３）］：

【０１７０】

【数１】 。

【０１７１】

【数２】 を、この計算に使用した。サル血清における免疫反応性ｕＦＳＨの個々の濃度を
、表１１に報告する。薬物動態学的分析の結果を、表１２に報告する。平均血清
濃度（±ＳＥＭ）を、図４に図表を用いて示す。

【０１７２】

【表１２】

【０１７３】

【表１３】 血清薬物動態学的結果は、肺送達後の血清濃度の時間プロフィールが、皮下投
与に類似したことを示した。肺送達後の末端半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈａｌ
ｆ−ｌｉｆｅ）は、皮下投与を用いて得られた末端半減期（約２４時間）に類似
した。肺用量群（中用量および高用量）内で、血清の

【０１７４】

【数３】 およびＣ_maxは、肺に投与された漸増用量に関連して増加した。最終的に、皮下
投与と比較して肺経路によって送達されたエアロゾル処方されたｕＦＳＨの平均
パーセントバイオアベイラビリティーは、吸入用量に基づいて、平均して約６．
５％であった。対応する肺内バイオアベイラビリティーまたは相対的肺性バイオ
アベイラビリティーは、ガンマシントグラフィ（ｓｃｉｎｔｏｇｒａｐｈｙ）を
使用して、サルにおける２μｍのＭＭＡＤ粒子の肺堆積の測定に基づいて、２６
％であることが見積もられる。低用量の肺ＰＫは、これらの計算において使用さ
れなかった。なぜなら、ＦＳＨ血液レベルが測定可能である場合に採取されるサ
ンプルが少なすぎるからである。これらの知見は、ＦＳＰの乾燥粉末が、肺経路
によって、カニクイザル、他の動物および特に他の霊長類（例えば、ヒト）に首
尾良く投与され得、広範に行われた皮下経路によって得られた血清濃度およびプ
ロフィールに類似の濃度およびプロフィールに帰着したことを示す。

【０１７５】 （実施例１１） （ロイシンを含有する呼吸可能なＦＳＨ乾燥粉末） 粉末ロット９９３４８および９９３４９を、Ｌ２０１０粉末についての実施例
２に記載されるような条件下でスプレー乾燥した。これらの処方物は、各々ロイ
シンを４０％（ｗ／ｗ）で組み込まれた；この処方物マトリックスの残りは、Ｌ
２０１０に存在する場合と類似の相対比でのマンニトールおよびクエン酸ナトリ
ウムであった。粉末中のｕＦＳＨ含量は、それぞれロット９９３４８および９９
３４９について、５％および２％であった。２％ ＦＳＨを含む組成物について
、ブリスターパック（ｂｌｉｓｔｅｒ ｐａｃｋ）中の充填質量（ｆｉｌｌ ｍ
ａｓｓ）は、５ｍｇであったが、５％ ＦＳＨ乾燥粉末組成物については、ブリ
スターパック中の充填質量は、２ｍｇであった。２つのスプレー乾燥されたロイ
シン処方物の各々は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定されたような非ロイシン含
有処方物の安定性と比較して、良好なｕＦＳＨ安定性を有した（非ロイシン含有
処方物についてのデータは、表３に見出され得る）。

【０１７６】

【表１４】 ２つのロイシン処方物は、試験されたすべての他の処方物と比較して、優れた
エアロゾル性能を示した。ＤＤＥにおける１４〜３０％の絶対的な増加が観察さ
れ、そしてブリスターパック中の「％残り」における減少を伴った。エアロゾル
性能係数（ＡＰＣ）は、０．６０を超えてまで有意に増加した。

【０１７７】

【表１５】 さらに、ＳＥＭによって調べられたように、粒子の形態は、アミノ酸の添加に
よって変更された。粒子は、より「崩壊して」観察され、従って、表面の折り畳
みが、より公言された。これらの顕微鏡写真を用いて入手された限定された視野
において、粒子の大きさの分布は、より均一に見え、いくつかの非常に微細な粒
子が明らかであった。さらなるＦＳＰ−ロイシン処方物が上記のように調製され
て、このエアロゾルおよび安定性性質をさらに試験した。

【０１７８】

【表１６】 ６つのロイシン含有処方物の各々が、ロイシンを含まない３つの処方物よりも
、デバイスの吸い口からより高いＤＤＥを示した。ＤＤＥにおける有意な変化が
、４０℃での保存の４ヶ月後に観察されず、これは、これらのロイシン含有処方
物が、加速安定性試験条件下でさえも、より高い分散可能な性質を保持すること
を示した。さらに同様に調製されたＦＳＰロイシン含有乾燥粉末の性質を、以下
の表に提供する。

【０１７９】

【表１７】

【０１８０】

【表１８】

【０１８１】

【表１９】 （実施例１２） （ＡＶ１２細胞におけるＦＳＨ改変体の発現） 発現カセットベクターｐＧＴＨを、ＡＶ１２におけるＦＳＨαサブユニットの
発現のために使用した。手短に言えば、ｐＧＴＨは、配列中にいくつかのエレメ
ントを含む：ＳＶ４０初期プロモーター／ｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉハイグロマイシ
ン耐性、ＳＶ４０小「ｔ」抗原スプライス部位／ポリＡ部位、ｐＢＲ３２２クロ
ーニングレムナント、ＢＫウイルス（株Ｐ２）クローニングレムナント、ポリ−
ＣＡ₂₀／ＧＴ₂₀エレメント（合成オリゴヌクレオチド）、ＢＫウイルス（株Ｐ２
）エンハンサー、ＡＤ２主要後期プロモーター／スプライシングされた３部から
なるリーダー、ＦＳＨαサブユニットコード配列（停止コドンを含む）のための
Ｂｃｌ１挿入部位、ＳＶ４０小「ｔ」抗原スプライス部位／ポリＡ部位；および
ｐＢＲ３２２アンピシリン耐性／ｏｒｉ。

【０１８２】 プラスミド構築物ｐＧＴＨ−αを生成し、ベクターの独特のＢｃｌＩ部位へ３
６２ｂｐ ＢｃｌＩ ＦＳＨ改変体ｃＤＮＡフラグメントをクローニングするこ
とによって、コードされたヒトαサブユニット配列（配列番号５）を発現した。
ＦＳＨ改変体αｃＤＮＡフラグメントＤＮＡを、鋳型としてシャトルプラスミド
ｐＬＧＤ６３７を使用して、ｐＣＲ増幅によって生成した（ｐＬＧＤ６３７は、
合成／オリゴヌクレオチド集合化ＦＳＨ改変体αｃＤＮＡ配列（配列番号３７）
を含む）。ＢｃｌＩ挿入物の統合性を、配列決定によって確認し、その後Ｇｅｎ
Ｐｅｐｔデータベース（登録番号３１８６９）と比較した。

【０１８３】 発現カセットベクターｐＧＴＤを使用して、配列番号１１をコードするヒトβ
サブユニットＦＳＨ改変体配列（すなわち、ヌクレオチド配列番号３８）を発現
した。ｐＧＴＤは、ＡＶ１２細胞において、いくつかの発現エレメントを含む：
連続して、ＢＫウイルス（株Ｐ２）クローニングレムナント、ポリ−ＣＡ₂₀／Ｇ
Ｔ₂₀エレメント（合成オリゴヌクレオチド）、ＢＫウイルス（株Ｐ２）エンハン
サー、ＡＤ２主要後期プロモーター／スプライシングされた３部からなるリーダ
ー、ＦＳＨ改変体βサブユニットコード配列（停止コドンを含む）のためのＢｃ
ｌ１挿入部位、ＳＶ４０小「ｔ」抗原スプライス部位／ポリＡ部位；ＳＶ４０初
期プロモーターｏｒｉ、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡ、ＳＶ４０小
「ｔ」抗原スプライス部位／ポリＡ部位およびｐＢＲ３２２アンピシリン耐性／
ｏｒｉ。

【０１８４】 プラスミド構築物ｐＧＴＤ−ｂＣＤ３を、ｐＧＴＤベクターの独特のＢｃｌＩ
部位へ、３９３ｂｐ ＢｃｌＩ ＦＳＨ改変体β−ｂＣＤ３ ｃＤＮＡフラグメ
ントをクローニングすることによって生成した（配列番号３８を参照のこと）。
ＦＳＨ改変体β−ＣＤ３ ｃＤＮＡフラグメントＤＮＡを、鋳型としてシャトル
プラスミドｐＬＧＤ６３８を使用して、ＰＣＲ増幅によって生成した（ｐＬＧＤ
６３８は、合成／オリゴヌクレオチド集合化ＦＳＨ改変体βｃＤＮＡ配列を含む
）。構築物の統合性を、配列決定によって確認し、そしてＧｅｎＰｅｐｔデータ
ベース（登録番号４７６４４１）に保管されたヒトβサブユニット配列と比較し
た。

【０１８５】 手短に言えば、ｐＧＴＨ−αプラスミドおよびｐＧＴＤ−ｂＣＤ３プラスミド
を直線化し、再精製し、次いで付着性ＡＶ２３−ＲＧＴ１８細胞に同時トランス
フェクトした。ＡＶ１２−ＲＧＴ１８細胞のグルタミン酸トランスポーター遺伝
子型を維持するための２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８と共に、０．２５μＭメトト
レキサートおよび１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培地を用いた選択
後、個々の安定なクローンを、手動またはフロー補助細胞ソーティング（ｆｌｏ
ｗ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を介してのいずれかで単離
した。最も高い産生クローンを、市販のＦＳＨ ＥＬＩＳＡキットを用いて馴化
培地の分析によって同定し、ＦＳＨ改変体産生を測定した。いくつかのクローン
を、無血清懸濁液に適応させ、そしてさらに増幅し、ＦＳＨ改変体ヘテロダイマ
ーの単離可能な量を得た。

【０１８６】 （実施例１３） （Ｎ末端を切断されたＦＳＨ改変体形態） （Ｎ末端配列決定によるタンパク質配列の分析） 複数のロットの組換えｈＦＳＨ改変体を、実験室における発酵において生成し
、そして種々のアッセイを使用して計量した。宿主（ＣＨＯ細胞）を、配列番号
３７によってコードされるαサブユニット、および配列番号３８によってコード
されるβサブユニットを発現するように設計した。すべてのＮ末端配列決定を、
溶液またはブロッティングされたサンプルのいずれかを使用して行った。インタ
クトなαサブユニットおよびβサブユニットならびにＮ−２αサブユニットおよ
びβサブユニットの相対比のみが、Ｎ末端配列データから得られ得る。例えば、
Ｃｙｓの存在は、Ｎ末端配列決定によって計量不可能であり、そしてＳｅｒは、
平均回収よりも低い回収を示す。これは、この方法によって、インタクトなβサ
ブユニットおよびＮ−２βサブユニットの相対比を正確に評価することをより困
難にする（βサブユニットは、それぞれ２位および３位にＳｅｒおよびＣｙｓを
有する）。アミノ末端の相対量は、第二のサイクル回収（例えば、Ｓｅｒおよび
Ｇｌｕ）を使用して評価される。いくつかの代表的な結果を、以下の表１９に要
約する。

【０１８７】

【表２０】 （実施例１４） （トリプシンマッピングおよびＬＣ／ＭＳによって定量化された、Ｃ末端を切
断されたＦＳＨ改変体形態） 配列番号３７のＤＮＡによってコードされるαサブユニットを有し、そして配
列番号３８のＤＮＡによってコードされるβサブユニットを有するｈＦＳＨ改変
体を生合成するように改変された（１０８アミノ酸をコードする）６つのロット
のチャイニーズハムスター卵巣細胞を、実験室スケールで増殖した。発現された
ＦＳＨ改変体タンパク質を精製し、そしてβサブユニットＣ末端の不均一性につ
いて分析した。ＦＳＨ改変体調製物に対する３つの独立したＬＣ／ＭＳランから
のＣ末端配列データを、以下の表２０に示す。

【０１８８】

【表２１】 （実施例１５） （ＦＳＨ改変体の生物学的活性） ＦＳＨ改変体の異なるロットに対して得られたインビボ活性データは、ラット
卵巣重量増加アッセイにおいて、ホルモンの類似の効力を示し、そして表２１に
示す。尿ＦＨＳ（ｕＦＳＨ）と比較して、ＦＳＨ改変体のインビボ活性を、Ｓｔ
ｅｅｌｍａｎ／Ｐｏｈｌｅｙラット卵巣重量増加アッセイによって測定した（Ｓ
ｔｅｅｌｍａｎおよびＰｏｈｌｅｙ，１９５３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，
５３，６０４−６１６）。下垂体を切除された未成熟の雌性ラット（２３〜２５
日）を、制御された採光で収容した。ラットを、ｈＦＳＨ改変体またはビヒクル
（０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ、〜０．２５ｍＬ）で、毎日皮下処置した。０
．１μｇ／日、０．３μｇ／日、１．０μｇ／日または３．０μｇ／日の用量を
使用した。処置を、２４時間の間隔で、４日間繰り返した。このラットを、秤量
し、そして４回目の投薬の２４時間後に屠殺した。卵巣および尿を、脂肪から切
り出し、そして秤量した。６匹のラットを、各々の用量について使用した。ＦＳ
Ｈ改変体サンプルを、以下のように調製した：サンプルを、ＰＢＳ緩衝液（ＧＩ
ＢＣＯＢＲＬ）中で、３時間、Ｐｉｅｒｃｅの１０，０００ＭＷＣＯ透析カセッ
トを用いて透析した。サンプルの濃度を、１ｃｍの路程セル中で、１ｍｇ／ｍＬ
の溶液について、２７８ｎｍで１．０６の吸光率を使用して、ＡＶＩＶ ＵＶ分
光計を用いて測定した。

【０１８９】

【表２２】 （実施例１６） （雌性ＦｉｓｈｅｒラットにおいてＦＳＨ改変体と比較したｕＦＳＨの薬物動
態学） 以下の研究は、静脈内（ＩＶ）投与後および皮下（ＳＣ）投与後に、Ｆｉｓｈ
ｅｒラットにおいてｕＦＳＨと比較したｈＦＳＨ改変体の薬物動態学（ＰＫ）を
測定する。雌性Ｆｉｓｈｅｒラットに、ｕＦＳＨまたはｈＦＳＨ改変体（１５μ
ｇ／ｋｇ）をＳＣ経路およびＩＶ経路によって投与した。ｈＦＳＨ改変体を、配
列番号５のアミノ酸配列を有するαサブユニットおよび配列番号１１のアミノ酸
配列を有するβサブユニットを発現する細胞において組換え産生した。全血サン
プルを、投薬の０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、６
時間、９時間、１２時間、および２４時間後に収集した。免疫反応性のｕＦＳＨ
またはｈＦＳＨ改変体の血清濃度を、改変された市販のＦＳＨキットであるＦＳ
Ｈ ＩＲＭＡ、ＤＰＣ（登録商標）Ｌｔｄ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）
を用いたイムノラジオメトリックアッセイによって決定した。重み付け４パラメ
ーターロジスティックモデルアルゴリズムを用いるソフトウェアプログラムであ
るＲＩＡＳＹＳを用いて、ＩＲＭＡ結合データを分析した。免疫反応性のｕＦＳ
ＨまたはｈＦＳＨ改変体の血清濃度を、標準曲線から見積もった。ラット血清中
の標準は、３．５ｍＩＵ／ｍＬと３５００ｍＩＵ／ｍＬとの間の範囲であった。
定量の下限は５ｍＩＵ／ｍＬであった。定量の上限は７５０ｍＩＵ／ｍＬであっ
た。血清濃度データの薬物動態学分析を、統計学的ソフトウェア（ｓｔａｔｉｓ
ｔｉｃａｌ ｐａｃｋａｇｅ）を用いて行った。ＳＣ投与後およびＩＶ投与後の
ラット血清中の免疫反応性のｕＦＳＨおよびｈＦＳＨ改変体の個々の濃度を、そ
れぞれ、表２３および表２４に報告する。薬物動態学的（ＰＫ）値を表２５に報
告する。

【０１９０】

【表２３】

【０１９１】

【表２４】

【０１９２】

【表２５】 血清濃度時間プロフィールは、ＦＳＨ改変体およびｕＦＳＨのＳＣ投与および
ＩＶ投与について類似のプロフィールを実証する。ＡＵＣ、最終半減期（ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ ｈａｌｆ ｌｉｆｅ）およびＴ_maxもまた類似であった。

【０１９３】 （実施例１７） （カニクイザルにおける肺（Ｐ）および皮下（ＳＣ）のＦＳＨ改変体と比較し
たｕＦＳＨの皮下（ＳＣ）送達の薬物動態学） 以下の研究を行って、カニクイザルにおけるｕＦＳＨの皮下投与と比較したｈ
ＦＳＨ改変体の皮下投与および肺投与のバイオアベイラビリティーおよび薬物動
態学を測定した。（プロトコル１（皮下ｕＦＳＨ））。カニクイザルに、ＳＣ経
路によってｕＦＳＨ（２μｇ／ｋｇ）を投与した。この溶液は、ｕＦＳＨ、ＰＢ
Ｓおよび０．１％ヒト血清アルブミンを含んでいた。全血サンプルを、投薬の０
．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、６時間、９時間、１
２時間、２４時間、４８時間、および７２時間後に収集した。サンプルを大腿静
脈または大腿動脈から収集し、そして抗凝固剤を含まない収集チューブ中に入れ
た。全血サンプルからの血清を、遠心分離によって得た。免疫反応性のｕＦＳＨ
の血清濃度を、改変された市販のＦＳＨキットであるＦＳＨ ＩＲＭＡ、ＤＰＣ
（登録商標）Ｌｔｄ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いた改変されたイ
ムノラジオメトリックアッセイによって決定した。ＩＲＭＡ結合データを、４パ
ラメーターロジスティックアルゴリズムまたは５パラメーターロジスティックア
ルゴリズムを用いる認証済みデータ縮約ソフトウェア（ＳｔａｔＬＩＡ（登録商
標）、Ｂｒｅｎｄａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用
いることによって分析した。免疫反応性ｕＦＳＨの血清濃度を、ｕＦＳＨを投与
したサルについてのｕＦＳＨについての標準曲線から見積もった。標準を、０．
５ｎｇ／ｍＬ〜７５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でカニクイザル血清において調製し
た。定量の下限は、０．５ｎｇ／ｍＬであった。定量の上限は、７５ｎｇ／ｍＬ
であった。血清濃度データの薬物動態学分析を、従来技術を用いて行った。平均
およびＳＥＭを時々、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）を用いて算
出した。

【０１９４】 （プロトコル２（皮下および肺のｒＦＳＨ改変体））。カニクイザルに、組換
え産生されたｈＦＳＨ改変体（２μｇ／ｋｇ）をＳＣ経路および肺経路によって
投与した。組換え宿主を、配列番号５のαサブユニットおよび配列番号１１のβ
サブユニットを発現するように設計し、そして活性な改変体を、発酵ブロスから
精製した。粉末処方物は、ＦＳＰ、ロイシンおよびクエン酸ナトリウムを、１２
．５：８０：７．５の重量比で含んでいた。肺送達を、吸入乾燥粉末吸入デバイ
ス（上記の実施例１０に記載される通り）を用いて行って、発疱剤パックからの
粉末をサル頭部ドーム（ｈｅａｄ ｄｏｍｅ）中へと２分間の曝露にわたって、
Ａｌｌｅｎ、Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１５（１）：１３
−１７（１９９５）によって記載されるように分散させた。次いで、ｒＦＳＨ改
変体の血清レベルを、２分間の曝露後に測定した。各サルが受けた吸入された用
量を、エアロゾル濃度および２分間の吸入の間の各サルの平均分時拍出量に基づ
いて処置後に算出した。これらの算出された肺用量は、サル毎に変化する（表２
６を参照のこと）。ｒＦＳＨ改変体の皮下投与もまた投与して、薬物動態学パラ
メーターの算出後に相対肺バイオアベイラビリティーを得た。皮下投与のための
処方物は、ＦＳＰ、ＰＢＳおよび０．１％ヒト血清アルブミンを含んでいた。

【０１９５】 全血サンプルを、投薬の０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、
３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間後に
収集した。サンプルを大腿静脈または大腿動脈から収集し、そして抗凝固剤を含
まない収集チューブ中に入れた。全血サンプルからの血清を、遠心分離によって
得た。免疫反応性ｒＦＳＨ改変体の血清濃度を、改変された市販のＦＳＨキット
であるＦＳＨ ＩＲＭＡ、ＤＰＣ（登録商標）Ｌｔｄ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅ
ｓ、ＣＡ）を用いた改変されたイムノラジオメトリックアッセイによって決定し
た。４パラメーターロジスティックアルゴリズムまたは５パラメーターロジステ
ィックアルゴリズムを用いる妥当なデータ縮約ソフトウェア（ＳｔａｔＬＩＡ（
登録商標）、Ｂｒｅｎｄａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）を用いて、ＩＲＭＡ結合データを分析した。免疫反応性のｒＦＳＨ改変体の血
清濃度を、ｒＦＳＨ改変体を投与したサルについてのｒＦＳＨ改変体についての
標準曲線から見積もった。標準を、０．５ｎｇ／ｍＬ〜７５ｎｇ／ｍＬの範囲の
濃度でカニクイザル血清において調製した。定量の下限は、０．５ｎｇ／ｍＬで
あった。定量の上限は、７５ｎｇ／ｍＬであった。

【０１９６】 この研究の目的は、ＦＳＨの皮下投与と比較した、肺投与後のカニクイザルに
おけるｈＦＳＨ改変体の例示的な乾燥粉末処方物（ロイシン／シトレート）のパ
ーセントバイオアベイラビリティーを測定することであった。この研究では、各
サルに、ｒＦＳＨ改変体の１回の肺投与を与え、そして２回の別個の皮下注射［
２μｇ／ｋｇのｈＦＳＨ改変体およびｕＦＳＨ］を与えた。ｕＦＳＨの皮下注射
を投与して、ｒＦＳＨ改変体に対して比較した。血液サンプルを、肺投与の０時
間、０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、６時間、９時
間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間後に得た。皮下投与について
の血液サンプルを、０時間、１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４
時間、４８時間および７２時間で採取した。改変された市販のＩＲＭＡキットを
用いて、免疫反応性のｈＦＳＨ改変体またはｕＦＳＨの血清濃度を決定した。こ
れらの濃度は、表２６〜表２９に見出される。

【０１９７】 例示的な肺処方物（ロイシン／シトレート）におけるｈＦＳＨ改変体の平均パ
ーセントバイオアベイラビリティーは、吸入された用量に基づいて、皮下投与と
比較して約４．６％であった。ｈＦＳＨ改変体を用いたこの研究における対応す
る肺内バイオアベイラビリティー、または相対肺バイオアベイラビリティーは、
ガンマシントグラフィを用いたサルにおける２μｍ ＭＭＡＤ粒子の肺沈着の測
定に基づいて約１８．４％であると見積もられる。マンニトール／シトレート処
方物におけるｕＦＳＨを用いたサル研究では、平均相対バイオアベイラビリティ
ーは、吸入された用量に基づいて６．５％であった（２６％の相対肺バイオアベ
イラビリティー）。ｒＦＳＨ改変体の肺投与は、皮下投与後は５．４時間である
のと比較して平均１０．８時間で免疫反応性のｒＦＳＨ改変体のピーク濃度を生
じた。マンニトール／シトレート処方物におけるｕＦＳＨの肺送達もまた、約１
０時間でピーク血清濃度に達した。

【０１９８】 肺投与後および皮下投与後のｈＦＳＨ改変体の薬物動態学パラメーターは同様
であった（表２６、表２７）。皮下投与後の２つの分子（ｕＦＳＨおよびｈＦＳ
Ｈ改変体）についての薬物動態学パラメーターは同様であった（表２９）。これ
らのパラメーターもまた、２μｇ／ｋｇのｕＦＳＨの皮下投与後に本明細書中の
実施例１０に見出されるパラメーターと匹敵した。

【０１９９】

【表２６】

【０２００】

【表２７】

【０２０１】

【表２８】

【０２０２】

【表２９】 （実施例１８） （ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｈＦＳＨ改変体の発現） 当業者は、適切な発現ベクターおよび宿主細胞株を用いてＦＳＰを発現するた
めの多くの方法を知っている。１つの方法は、チャイニーズハムスター卵巣細胞
株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＬＯＮＺＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を用い
ることである。これらの細胞は、配列番号５の配列を有するαサブユニットおよ
び配列番号１１の配列を有するβサブユニットから構成されるｈＦＳＨ改変体を
発現するように設計され得る。

【０２０３】 発現ベクターは、標準的な技術によって構築される。トランスフェクションを
支持するベクターＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ
１０Ｂ細胞（カタログ番号１８２９０−０１５）において、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉ
ａＦｉｌｔｅｒ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（カタログ番号１２２６３）を用い
て調製され得、そしてこのベクターは、適切な診断消化（例えば、Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ／Ｘｈｏ Ｉ）によって確認され得る。両方の遺伝子の配列分析は、配列番
号５のαサブユニットおよび配列番号１１の改変体βサブユニットを発現するよ
うに設計されたＤＮＡ配列が、それぞれ、本明細書中の配列番号３７および配列
番号３８に示すＤＮＡ配列であることを確認する。各サブユニットの発現は、異
なるプロモーターによって、または同じプロモーターによって制御され得る。こ
の配列はまた、ポリＡテールを用い得る。このベクターは、選択マーカーを含み
得る。このベクターを用い、公知の技術を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフ
ェクトする。

【０２０４】 この細胞株を、適切な培地（例えば、ＧｉｂｃｏＢＲＬのＣＤ ＣＨＯ培地）
中で選択圧下で増殖させる。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ｈＦＳＨ改変体を発
現するマスターウェルを同定し得、標準的な手順を用いてこれらをクローニング
および増幅する。これらの手順は、適切な発現レベルを有するクローンをもたら
す。例えば、振盪フラスコ（２０〜６０ｍＬ）中では、７日後〜８日後に３０ｍ
ｇ／Ｌにて活性なｈＦＳＨ改変体が産生される。

【０２０５】 （実施例１９） （ＦＳＰの精製） 組換えＦＳＰ（例えば、配列番号５のαサブユニットおよび配列番号１１のβ
サブユニットから構成されるｈＦＳＨ改変体など）の精製は、当該分野で記載さ
れそして当該分野で公知の多数の方法によって、形質転換された宿主細胞（例え
ば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株もしくはＡＶ１２細胞株または適切に利用可能な他の産
生株）の単層または懸濁培養物から達成され得る。培養培地からＦＳＰを単離す
るための１つの方法は、培養培地を陽イオン交換クロマトグラフィーもしくは陰
イオン交換クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、逆相
クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、またはこれらの方法の何ら
かの組み合わせに供することを含む。界面活性剤を含み得る懸濁培養物の場合、
さらなる精製工程（例えば、イオン交換工程）が必要であり得る。クロマトグラ
フィー工程は、ｐＨ、伝導率、緩衝液組成および流す条件（カラムの寸法、流速
など）について最適化され得る。純度および収率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ク
ーマシー染色およびウェスタンブロッティングの両方）、ＥＬＩＳＡアッセイ、
排除クロマトグラフィーおよび２７７ｎｍでのＵＶ吸光度によるタンパク質濃度
または他の公知の技術によって分析され得る。標準的な精製工程を用いて、クー
マシーおよび銀染色ゲルによって９５％を超える純度を有するＦＳＰが入手され
得る。

【０２０６】 （実施例２０） （肺投与のための賦形剤としてのロイシンの亜慢性（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ）
吸入研究） ＦＳＰの肺送達のための粉末におけるロイシンの薬学的受容可能性を、国内で
飼育されたカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において
試験した。ロイシン：クエン酸ナトリウム（９０：１０）の吸入された標的用量
は、１．６６ｍｇ／ｋｇ／日であった。この動物を、１日あたり１５分間、１５
日間にわたって曝露した。これらのサルを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＢＲ
Ｆ，Ｉｎｃ−Ｍａｕｒｉｔｉｕｓから入手した。サルが到着したら収容し、そし
て研究に割り当てる前に少なくとも６週間隔離した。４頭のサル（各性別２頭ず
つ）を任意に処置群に割り当て、そして個々のケージに割り当てた。サルを、７
２±８°Ｆの温度を維持するようにサーモスタットを設定した部屋に収容した。
環境制御システムを、最少相対湿度２０％および最大相対湿度８０％を維持する
ように設計した。光周期は、１２時間明および１２時間暗であり、０６００時お
よび１８００時に変更した。サルを個々に、吊り床を備えるアルミニウムのケー
ジに収容した。糞便および尿を、毎日手作業で洗浄除去した。Ｃｅｒｔｉｆｉｅ
ｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｈｏｗ ５０４８（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）の約１０枚〜約２０枚のビスケットを、この
週の間毎日２回サルに与え、そして週末には１日１回、二倍量で食料を与えた。
各サルに、新鮮な果物を各週少なくとも３回与えた。水道水は、曝露の間以外は
、自動灌水システムから自由に利用可能であった。各サルを、曝露を開始する前
に少なくとも９回、拘束（ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）椅子に座るように条件付けした
。条件付けを、正の強化（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ）と
して食物のご褒美（ｆｏｏｄ ｔｒｅａｔ）を使用して達成した。

【０２０７】 これらのサルを、各曝露の前に拘束椅子に配置した。２枚のシートのラテック
ス（０．３０インチの厚さ）をこれらの動物の首の周りに置いてシールを形成し
た。約７．７リットルの頭部ドームを動物の頭の上に配置した。約１２Ｌ／分の
空気流を、排出口上の較正されたトランスベクター（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｏｒ）
を介して頭部ドームを通して維持した。ロイシン−シトレート粉末（９０％ロイ
シン／１０％クエン酸ナトリウム）を、Ｗｒｉｇｈｔ Ｄｕｓｔ Ｆｅｅｄ発生
器を用いて生成した。８〜１０リットル／分の空気を、この発生器を通して流し
た。エアロゾルを、サイクロンを通過させ、次いで頭部ドームに侵入させてサル
に吸わせた。

【０２０８】 ロイシンの濃度を、曝露の間に頭部ドームから採取した重量サンプルを用いて
決定した。これらのサンプルを、頭部ドームに接続された２５ｍｍ Ｇｅｌｍａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ａ／Ｅガラス繊維フィルターを通して１ＬＰＭの空気を引き抜く
ことによって収集した。１粒子の大きさの決定を完了した。この粒子の大きさを
、Ｇｅｌｍａｎ Ｔｙｐｅ Ａ／Ｅガラス繊維フィルターを取り付けたＳｉｅｒ
ｒａ Ｍｏｄｅｌ ２１８Ｋ Ｃａｓｃａｄｅ Ｉｍｐａｃｔｏｒを用いて収集
したサンプルから決定した。Ｃａｓｃａｄｅ Ｉｍｐａｃｔｏｒを通しての空気
流は、５分間の持続時間にわたって３ＬＰＭであった。吸入された用量を以下の
通りに算出した：（平均分時拍出量×曝露時間）×（平均重量濃度）÷体重。

【０２０９】 流量に由来するパラメーター（一回呼吸量、分時拍出量および呼吸頻度）を、
頭部ドームの口に接続した大きさ「０」の呼吸流量計を用いてモニタリングした
。シグナルを、Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＸＡソフ
トウェアを用いてパーソナルコンピューターで収集した。少なくとも１５分間の
曝露前データを、曝露を開始する前に収集し、続いて曝露時間の間を通してデー
タを収集した。全ての肺機能のデータを、５分間の平均として収集した。これら
のデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）のスプレッドシート
にダウンロードし、および呼吸パターンの傾向についてみるためにグラフにした
。

【０２１０】 各サルを、曝露の前、曝露の間および曝露後に観察した。あらゆる異常な挙動
を書き留めた。体重を記録した（最初の体重−雄性：２．９〜４．１ｋｇ；雌性
：２．７〜２．８ｋｇ）。これらのデータを平均し、そしてこれを用いてサルの
肺に送達したロイシンの用量を算出した。血液サンプルを、投薬の開始前および
１５日目に各サルから得た。これらの血液サンプルを、給餌前に得た。さらに、
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、投薬の開始前および１５日目に行った。これらの
動物に、グリコピロレート０．０１５ｍｇ／ｋｇをＩＭで投薬し、続いて数分後
にケタミンＨＣｌ １０ｍｇ／ｋｇをＩＭで投薬した。次いで、小児気管支鏡を
、右または左の下葉に挿入し、そして気道中に無理やり押し込んだ。通常生理食
塩水の２つの１０ｍＬアリコートを肺に入れ、次いで２０ｍＬシリンジを用いて
穏やかに手動で吸引した。回収された液体を氷上に置き、そして臨床病理学研究
所に分析のために送付した。

【０２１１】 血液分析は以下を含んでいた：赤血球計数、ヘモグロビン、ヘマトクリット（
充填赤血球量）、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモ
グロビン濃度、網状赤血球数、血球の形態、総白血球数、白血球特異形態（ｌｅ
ｕｋｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）、血小板（栓球）数、総白血球数
、白血球特異形態、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、
グルコース、血液尿素窒素、クレアチニン、総ビリルビン、アルカリホスファタ
ーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、γグ
ルタミルトランスフェラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、カルシウム、無機リ
ン、ナトリウム、カリウム、塩素、コレステロール、トリグリセリド、総タンパ
ク質、アルブミン、グロブリン、ミクロプロテイン（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ
）。尿を、比重およびタンパク質について分析した。

【０２１２】 １４日間の曝露にまたがる平均重量濃度は、４２５．８３±２３２．９０μｇ
／Ｌ（平均±ＳＤ）であった。質量中央等価空気力学直径（ｍａｓｓ ｍｅｄｉ
ａｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）は
１．００μｍであり、幾何標準偏差は、２．４６であった。体重に対する、吸入
された平均用量は、２．１３±０．５６ｍｇ／ｋｇ／日であった。

【０２１３】 研究の間にどの動物においても異常な挙動は、書き留められなかった。呼吸頻
度、一回呼吸量、分時拍出量のいずれにおいても処置に関連した増加は存在しな
かった。曝露の１日目での呼吸頻度の明らかな増加は、ドーム内での雲状の粉塵
の出現に対するサルの非特異的応答に起因する可能性が最も高い。次の測定日ま
でには、この動物は、このドーム内のこの粉塵に順応し、そして呼吸頻度の相違
は消失した。

【０２１４】 血液学パラメーター、臨床化学パラメーター、尿分析パラメーター、気管支肺
胞洗浄（ＢＡＬ）パラメーターのいずれに対しても化合物に関連した影響は存在
しなかった。１頭のサルは、この研究における他のサルと比較して、そして歴史
上の参考文献の値と比較してＢＡＬ液中のタンパク質レベル、総白血球数、好中
球数、リンパ球数およびマクロファージ数、および赤血球数において最少の上昇
を有した。これらの知見は、化合物に関連しないとみなされた。そしてこれらの
知見は、処置前ＢＡＬにおける上昇したＢＡＬ液タンパク質レベルによって証明
されるように、このサルにおける軽度の決定されていない既存の肺状態を反映す
るようである。

【０２１５】 （実施例２１） （Ｎｉｒｏ噴霧乾燥機を用いて製造したＦＳＰ粉末） ロイシン、クエン酸ナトリウム、および生合成されそして本質的に本明細書中
に記載されるように精製された組換えＦＳＰを含む粉末を、２つの流動ノズル（
ｔｗｏ−ｆｌｕｉｄ ｎｏｚｚｌｅ）を取り付けたＮｉｒｏ移動式小型噴霧乾燥
機（Ｎｉｒｏ ｍｏｂｉｌｅ ｍｉｎｏｒ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ）を用いて
調製した。粉末の特徴を、本明細書中の他の箇所に記載される通りに測定した。
遊離のサブユニット組成を、本質的に実施例２に記載される通りに測定した。各
ＦＳＰ粉末の組成を、以下の表３０に提供する。バッチの大きさは、表３０中の
最初の６つのロットについては１０グラムであり、そして最後の３つのロットに
ついては５グラムであった。これらの粉末についての収率は、６２％〜７８％の
範囲であった。

【０２１６】

【表３０】 （実施例２２） （ＦＳＰ粉末の特徴に対する規模および処方物成分の影響） ロット０００２３〜０００３０を、改変された２つの流動ノズルを取り付けた
Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥機（モデル１９０）を用いて製造した。分析測定を、手動に
よって発疱剤パックを充填した後に行った。ｈＦＳＨ改変体（配列番号５の配列
を有するαサブユニットおよび配列番号１１の配列を有するβサブユニットを発
現するように設計された細胞）を、全てのロットについて用いた。ロット１９５
２〜１９５４を、改変された２つの流動ノズルを取り付けたＮｉｒｏ移動式小型
噴霧乾燥機を用いて製造した。

【０２１７】

【表３１】

【０２１８】

【表３２】 （実施例２３） （ＦＳＰ粉末の特徴に対する種々のアミノ酸賦形剤の影響） （必要に応じてシトレートと組み合わせて）種々のアミノ酸賦形剤を含むＦＳ
Ｐ粉末を、本質的に本明細書中に記載されるように調製した。その収率は、約５
４％〜約７８％の範囲であった。得られた粉末の選択された特徴を、以下の表３
３に提供する。

【０２１９】

【表３３】

【０２２０】

【表３４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、実施例７Ｃに詳細に記載されるような、１ヶ月の安定性試験に利用し
た、３つの例示的ＦＳＰ粉末処方物（Ｌ２０１７、Ｌ２０１０、Ｌ２０１８）に
ついての、微粒子フラクション（ＦＰＦ、３．３ミクロン未満の％）とエアロゾ
ル粒子サイズ（ＭＭＡＤ）との間の相関関係を示すグラフである。

【図２Ａ】 図２Ａは、ＦＳＨ標準と比較した代表的なｕＦＳＨ乾燥粉末処方物の生理活性
を決定するためのインビトロバイオアッセイの結果を示すグラフである（実施例
８）。図２Ａは、粉末Ｌ２０１３およびＬ２０１０の生理活性を示す。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、ＦＳＨ標準と比較した代表的なｕＦＳＨ乾燥粉末処方物の生理活性
を決定するためのインビトロバイオアッセイの結果を示すグラフである（実施例
８）。図２Ｂは、粉末Ｌ２００６およびＬ２０１３の生理活性を示す。

【図３】 図３は、気管内（ＩＴ）投与および皮下（ＳＣ）投与されたｕＦＳＨのラット
におけるインビトロバイオアベイラビリティのグラフでの比較を提供する（実施
例９）。

【図４】 図４は、ヒトｕＦＳＨの肺投与および皮下投与後の、カニクイザルにおける免
疫反応性ＦＳＨの平均血清濃度（±ＳＥＭ）のグラフ表示を提供する（実施例１
０）。

【図５】 図５は、肺投与および皮下投与後の、カニクイザルにおける免疫反応性ｈＦＳ
Ｈ改変体の平均血清濃度（±ＳＥＭ）のグラフ表示を提供する（実施例１７）。

【図６】 図６は、皮下投与後の、免疫反応性ｈＦＳＨ改変体またはｕＦＳＨの平均血清
濃度（±ＳＥＭ）のグラフでの比較を提供する（実施例１７）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｐ 15/18 Ａ６１Ｐ 15/18 Ｃ０７Ｋ 14/59 // Ｃ０７Ｋ 14/59 Ａ６１Ｋ 37/38 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ナガラジャン， スダ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303， パロ アルト， ケニス ドライブ 3363 (72)発明者 パットン， ジョン エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94028， ポートラ バリー， アラストラデロ ８ (72)発明者 ベネット， デイビッド ビー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95129， サン ノゼ， クイーン アン ドライ ブ 1098 (72)発明者 グリーン， ジョアンヌ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061， レッドウッド シティ， ベルモント アベニュー 326 (72)発明者 チャン， ヒ−シ アメリカ合衆国 カリフォルニア 95120， サン ノゼ， パム レーン 1524 (72)発明者 スタルツ， シェリル エル． エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403， サン マテオ， ウエスト 25ティーエ イチ アベニュー 322 (72)発明者 ベンソイエ， ジェラルディン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， ティンバーヘッ ド レーン 340 (72)発明者 アレン， ダレル ラ バーン アメリカ合衆国 インディアナ 46236， インディアナポリス， ゲイスト コー ブ ドライブ 12240 (72)発明者 ヒューズ， ベンジャミン リー アメリカ合衆国 インディアナ 46208， インディアナポリス， ブルー リッジ ロード 402 (72)発明者 スティフ−トービック， メアリー アメリカ合衆国 インディアナ 46140， グリーンフィールド， ウォータービュ ー ブールバード 716 (72)発明者 ウォルフ， ロナルド ケイス アメリカ合衆国 インディアナ 46033， カーメル， ブルックシェア パークウ ェイ 12329 (72)発明者 ローダー， ウィリアム デイビッド アメリカ合衆国 インディアナ 46077， ジオンスビル， コンティネンタル ド ライブ 1800 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 4C076 AA29 AA93 BB27 CC30 DD43 DD51 DD67 GG05 4C084 AA01 AA02 AA03 AA06 BA01 BA08 BA20 BA21 CA18 DB26 MA05 MA43 MA56 NA11 NA13 ZA862 ZC112 4H045 AA20 AA30 BA10 CA40 DA30 EA20 FA10 FA71 FA72 FA74

Claims (65)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物被験体の肺深部へ送達するための安定化乾燥粉末組
   成物であって、以下： （ｉ）薬理学的有効量の濾胞刺激タンパク質（ＦＳＰ）、および （ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤 を含有する、組成物。
2. 【請求項２】 １％と６０％との間の相対的肺性バイオアベイラビリティー
   を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 １％と３０％との間の相対的肺性バイオアベイラビリティー
   を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】 １％と２０％との間の相対的肺性バイオアベイラビリティー
   を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
5. 【請求項５】 約１０重量％未満の残留水分含量を有する、請求項１に記載
   の組成物。
6. 【請求項６】 ＦＳＰの比生物活性が、粉末１グラム当たり１００ＩＵより
   も大きい、請求項１に記載の組成物。
7. 【請求項７】 ＦＳＰの比生物活性が、粉末１グラム当たり１，０００ＩＵ
   よりも大きい、請求項１に記載の組成物。
8. 【請求項８】 ＦＳＰの比生物活性が、粉末１グラム当たり５，０００ＩＵ
   よりも大きい、請求項１に記載の組成物。
9. 【請求項９】 ＦＳＰの比生物活性が、粉末１グラム当たり２５，０００Ｉ
   Ｕよりも大きい、請求項１に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 肺または肺深部へと吸入を介して投与される場合に、１時
    間と５０時間との間の分布相半減期を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 前記ＦＳＰが組換え産生される、請求項１に記載の組成物
    。
12. 【請求項１２】 前記ＦＳＰがヒト尿由来ＦＳＨである、請求項１に記載の
    組成物。
13. 【請求項１３】 前記組換え産生されたＦＳＰがｈＦＳＨ改変体である、請
    求項１１に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 前記ｈＦＳＨ改変体が、配列番号８のβサブユニットが混
    入していない改変体ポリペプチドを含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 【請求項１５】 前記ｈＦＳＨ改変体が、そのアミノ酸配列が、配列番号１
    １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
    ３、２４、２５、２６、２７、および２８からなる群より選択される改変体ポリ
    ペプチドを含む、請求項１３に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 前記ｈＦＳＨ改変体が、αサブユニットおよび改変体βサ
    ブユニットを含むヘテロダイマーを含む、請求項１３に記載の組成物。
17. 【請求項１７】 前記改変体ヘテロダイマーが、配列番号８のβサブユニッ
    トが混入していない、請求項１６に記載の組成物。
18. 【請求項１８】 前記ｈＦＳＨ改変体ヘテロダイマーが、配列番号１１、１
    ２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
    ４、２５、２６、２７、および２８からなる群より選択される改変体βサブユニ
    ットを含む、請求項１６に記載の組成物。
19. 【請求項１９】 前記ｈＦＳＨ改変体ヘテロダイマーが、配列番号５、２９
    、３０、および３１からなる群より選択されるαサブユニットを含む、請求項１
    ６に記載の組成物。
20. 【請求項２０】 ２以上の異なるｈＦＳＨ改変体ポリペプチドまたはｈＦＳ
    Ｈ改変体ヘテロダイマーを含む、請求項１３に記載の組成物。
21. 【請求項２１】 前記組成物が、約０．１〜２０ミクロンの質量中央直径（
    ＭＭＤ）を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
22. 【請求項２２】 前記組成物が、約０．１〜１０ミクロンの質量中央直径（
    ＭＭＤ）を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
23. 【請求項２３】 前記組成物が、約０．５〜７ミクロンの質量中央直径（Ｍ
    ＭＤ）を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
24. 【請求項２４】 前記組成物が、約１０ミクロン未満の質量中央空気力学直
    径（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
25. 【請求項２５】 前記組成物が、約１．５〜約３．５ミクロンの質量中央空
    気力学直径（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含む、請求項２４に記載の組成物。
26. 【請求項２６】 １平方センチメートル当たり０．１〜１０グラムのかさ密
    度を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
27. 【請求項２７】 １平方センチメートル当たり０．１５〜４．０グラムのか
    さ密度を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
28. 【請求項２８】 １平方センチメートル当たり０．１７〜０．７５グラムの
    かさ密度を有する粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
29. 【請求項２９】 前記組成物が、約０．１〜９９．９重量％のＦＳＰを含む
    、請求項１に記載の組成物。
30. 【請求項３０】 ３０％よりも大きい放出用量を有する、請求項１に記載の
    組成物。
31. 【請求項３１】 ５０％よりも大きい放出用量を有する、請求項３０に記載
    の組成物。
32. 【請求項３２】 ５５％よりも大きい放出用量を有する、請求項１に記載の
    組成物。
33. 【請求項３３】 ６０％よりも大きい放出用量を有する、請求項１に記載の
    組成物。
34. 【請求項３４】 請求項１に記載の噴霧乾燥組成物。
35. 【請求項３５】 緩衝塩をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
36. 【請求項３６】 水への溶解の際に、約４と１０との間のｐＨを示す、請求
    項３５に記載の組成物。
37. 【請求項３７】 前記賦形剤が炭水化物である、請求項１に記載の組成物。
38. 【請求項３８】 前記炭水化物賦形剤が、マンニトール、トレハロース、お
    よびラフィノースからなる群より選択される、請求項３７に記載の組成物。
39. 【請求項３９】 前記賦形剤が、アミノ酸、ポリアミノ酸、ポリペプチド、
    およびタンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
40. 【請求項４０】 前記賦形剤が、ロイシン、イソロイシン、およびノルロイ
    シンからなる群より選択されるアミノ酸である、請求項３９に記載の組成物。
41. 【請求項４１】 前記賦形剤がロイシンである、請求項４０に記載の組成物
    。
42. 【請求項４２】 ２０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のロイシンを含む、
    請求項４１に記載の組成物。
43. 【請求項４３】 ４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のロイシンを含む、
    請求項４２に記載の組成物。
44. 【請求項４４】 ＦＳＰ、マンニトールおよびシトレートを含む、請求項１
    に記載の組成物。
45. 【請求項４５】 ＦＳＰ、ロイシンおよびシトレートを含む、請求項１に記
    載の組成物。
46. 【請求項４６】 請求項１に記載の安定化乾燥粉末ＦＳＰ組成物を調製する
    方法であって、以下の工程： （ｉ）前記ＦＳＰおよび前記賦形剤を溶媒と混合して、溶液または懸濁液を形
    成する工程、および （ｉｉ）請求項１に記載の、呼吸可能な生物活性ＦＳＰ乾燥粉末を形成するた
    めに適した条件下で、工程（ｉ）で形成された該溶液または懸濁液を乾燥する工
    程、 を包含する、方法。
47. 【請求項４７】 前記乾燥工程が噴霧乾燥を含む、請求項４６に記載の方法
    。
48. 【請求項４８】 前記ＦＳＰが、前記賦形剤物質を含む溶媒中で混合されて
    、約４〜１０のｐＨを有する溶液を形成する、請求項４６に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記溶媒中のＦＳＰの量が、前記溶液または懸濁液の全固
    体含有量の約０．０１〜１０％を構成する、請求項４６に記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記溶媒が水またはアルコールである、請求項４６に記載
    の方法。
51. 【請求項５１】 前記乾燥粉末中のＦＳＰのシアリル化度が、前記乾燥工程
    の前のＦＳＰのシアリル化度の少なくとも約３０％である、請求項４６に記載の
    方法。
52. 【請求項５２】 哺乳動物患者の肺へのＦＳＰの送達のための方法であって
    、該方法は、エアロゾル化形態の請求項１に記載の乾燥粉末組成物を吸入によっ
    て投与する工程を包含する、方法。
53. 【請求項５３】 哺乳動物患者の肺へのＦＳＰの送達のための方法であって
    、該方法は、エアロゾル化形態の請求項１９に記載の乾燥粉末組成物を吸入によ
    って投与する工程を包含する、方法。
54. 【請求項５４】 哺乳動物被験体にＦＳＰを送達するための方法であって、
    以下の工程： （ｉ）請求項１に記載のＦＳＰ乾燥粉末組成物をエアロゾル化する工程、およ
    び （ｉｉ）該被験体の肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によって、該
    エアロゾル化ＦＳＰ乾燥粉末組成物を投与する工程、 を包含する、方法。
55. 【請求項５５】 哺乳動物被験体にＦＳＰを送達するための方法であって、
    以下の工程： （ｉ）請求項１９に記載のＦＳＰ乾燥粉末組成物をエアロゾル化する工程、お
    よび （ｉｉ）該被験体の肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によって、該
    エアロゾル化ＦＳＰ乾燥粉末組成物を投与する工程、 を包含する、方法。
56. 【請求項５６】 哺乳動物被験体における不妊症を処置するための方法であ
    って、該被験体の肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によって、治療有
    効量の請求項１に記載の乾燥粉末組成物を投与する工程を包含する、方法。
57. 【請求項５７】 哺乳動物被験体における不妊症を処置するための方法であ
    って、該被験体の肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によって、治療有
    効量の請求項１９に記載の乾燥粉末組成物を投与する工程を包含する、方法。
58. 【請求項５８】 請求項５６または請求項５７に記載の方法であって、ここ
    で前記被験体が不妊の雌であり、そして少なくとも３〜２０日間のタイムコース
    にわたる前記組成物投与の結果として、該被験体が、該投与の前に測定された濾
    胞の成長のレベルと比較して増加した濾胞の成長のレベルを示す、方法。
59. 【請求項５９】 前記治療有効量が、１日当たり約１０〜１，０００ＩＵの
    ＦＳＰを含む、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
60. 【請求項６０】 前記治療有効量が、１日当たり約５０〜３，０００ＩＵの
    ＦＳＰを含む、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
61. 【請求項６１】 前記治療有効量が、１日当たり約２００〜１２，０００Ｉ
    ＵのＦＳＰを含む、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
62. 【請求項６２】 インビトロでの受精のための配偶子を産生するための方法
    であって、該方法は、被験体の肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によ
    って、治療有効量の請求項１に記載の乾燥粉末組成物を投与する工程を包含する
    、方法。
63. 【請求項６３】 インビトロでの受精のための配偶子を産生するための方法
    であって、該方法は、被験体の肺への沈着および肺からの吸収のための吸入によ
    って、治療有効量の請求項１９に記載の乾燥粉末組成物を投与する工程を包含す
    る、方法。
64. 【請求項６４】 前記治療有効量が、１日当たり約５０〜３，０００ＩＵの
    ＦＳＰを含む、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
65. 【請求項６５】 前記治療有効量が、１日当たり約２００〜１２，０００Ｉ
    ＵのＦＳＰを含む、請求項６２または請求項６３に記載の方法。