TWI277425B

TWI277425B - Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility

Info

Publication number: TWI277425B
Application number: TW089106884A
Authority: TW
Inventors: Sudha Nagarajan; John S Patton; David B Bennett; Joanne Greene; Hi-Shi Chiang
Original assignee: Lilly Co Eli; Nektar Therapeutics
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2007-04-01
Also published as: JP2002541213A; AU4082000A; US7112341B1; CA2369262A1; AU779869B2; HK1042234A1; EP1169053A1

Description

1277425

五明說明（1 本案申請U.S.臨時專利案Νο· 60/129，121 (公告於1999 年4月13日）及价· 130,099 (公告於1999年4月2〇日）之益處，二者均以全文列爲本案參考。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 發明.領域本發明是有關經肺投予之穩定的乾粉組成物，其中含有濾泡刺激蛋白質（FSP),可適於遞送至肺深處，以及製備及投予此組成物之方法，及治療不孕症之方法。發明背景經濟部智慧財產局員工消費合作社印製濾泡刺激激素（FSH)是一種異二體之促性腺激素，由腦下垂體所分泌，且是包括FSH，甲狀腺刺激激素（TSH)及促黃體生成激素在内的三種腦下體前葉激素之一。fsh由二個非共價鏈結之亞單位組成，稱爲α及β亞單位。α亞單位在三種激素間是相同的，而β亞單位則在各激素中具獨特性，且提供特異性。於人類，成熟的α亞單位由92 個胺基酸殘基組成，並有二個破水化合物键。相當的Fsh 成熟β亞單位則含有111個胺基酸，且也具有二個碳水化合物鍵。總而言之，二個亞單位當以質譜儀偵測，可得約 31 kD之分子量，而以PAGE或凝膠層析則依糖基化程度在35-45 kD。FSH可直接調控卵巢之顆粒細胞及睪丸足細胞之代謝活性。濾泡刺激激素（FSH)之藥學製劑，在治療人類不孕症上扮演重要角色，而投予FSH，不論是單獨的或組合以其他具生物治性之化合物及蛋白質，自I960年早期即被用來治療不孕症問題。在女性，FSH可促進卵巢濾泡的發展， .4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 _ B7_ 五、1务明說明（2 ) 且FSH藥學製劑主要用於促使排孕，及試管内授孕步驟。[Speroff，L· Glass R.H·，et al·，Clnical Gynecologic Endocrinology and Infertibility, 583-609 (1989); Jones, H.W., et al·，Fertil. Steril，38:14-21 (1982)]。於男性，此組成物可用來啟動及維持生殖腺官能不足時之精子生成[Witcomb，R. W.， et al.，J: Clin Endocrinol Metab，70:3-7 (1990)] 〇在不孕症的早期治療中，含有FSH之調和物係注射方式投予至肌肉深處。此種注射通常在患者父母或看護之助下給予，且需使用尺寸較皮下針大5倍之針頭，且將會十分疼痛。近來，已發展出可將經純化或重組的FSH皮下投予，常是病人自我投藥，的調和物。雖然病人因自我投藥方式較獨立，使皮下投予FSH的提供之優點多於肌内遞送，但因為不方便，不舒服或與以針頭為基礎之遞送法有關之先天上的嫌惡；許多病人仍然不情願或不喜進行不孕症之治療。肺部遞送是有別於皮下注射的另一個吸引入的方法，因為此途徑可省去使用針頭，對皮膚及身體黏膜的刺激有限 (穿皮，離子電泳，及鼻内遞送藥物之一般副作用），且省去經鼻及皮膚滲透加強劑之使用（經鼻及穿皮學之典型組份常會引起皮膚刺激/皮膚炎）。肺部投藥在經濟上十分吸引人，使病人易於自我投藥，且較其他投藥方式更為病人善用。然而，由於其高的分子量及低的親脂性，以肽或蛋白質為基礎之藥物傳統上並不採吸入方式投藥，以沈積及自肺中吸收，雖然也有建議各種的氣霧劑調和物。再者，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） IJ----：-------裝--------訂---------線 0^" (請先閱讀背面之注意事項再壤寫本頁) 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7__ 五、1明說明（3 ) 先前也曾養試以乾粉末型式經氣管内遞送，但造成明顯低的生物利用率-相較於靜脈内投藥只有〇·6% -可推知遞送促性腺激素如FSH，肺路徑是非欲求的[Komada，F.，et al·，J Pharm Sciences，83,（6):863_867 (I994)] 0 另一個在調和蛋白質以投藥的常遇到的問題是其易變得無活性。由於近來有較有效的純化及重組技術，使高純化型式之由尿液衍生的（Arpaia，G.，et· al·，U.S· Patent No. 5,128,453，1992 年 7 月 7 日）及重組體[Loumaye，E·，et al·， Fertil. Steril.，63:77-86 (1995)] FSH 變得可運用，使此問題甚至更突出。雖然這些高純化型式FSH，提供許多優於較不純化型式的潛在益處，包括有所改善的批次間一致法，由於無促黃體激素及其他競爭蛋白質下之高比活性，有所改進之效力，對注射有良好的局部的受性，及低的免疫原性，而含有極純FSH之製劑常是高度不穩定的。這些組成物常在相當短的時間下降解，而部份或甚至完全失去生物活性。再者，雖然已描述賦形劑，其可穩定含FSH之固態調和物[如 Samaritani，et al·，U.S· Patent No· 5,650, 390，1997 年 7月22日]而重組成可注射型式，此固態調和物通常缺乏肺部遞送的必要之特色。因此，即使在已使蛋白質之經肺遞送更臻完善之努力下，此中對於FSH仍無有效的經肺遞送系統及方法，其（i) 提供充份穩定，可呼吸之FSH乾粉型式，（ϋ)減略冷藏之需要，（iii)提供具絕佳氣霧劑特性之散劑，（iv)在分散上勿需推進劑之助，也勿需加強劑化合物加強在下呼吸道之吸 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I.---^-------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再痕寫本頁) 1277425

收’及⑺呈現良好的肺部生物利用率。發明要點入 :月提出#經穩定之fsh乾粉組成物，以經由肺深至全身循環。本發明的乾粉，當氣霧化及經由吸技丁時’可用於τ、孕症之治纽/或處理。滤別體本發明可呼吸之乾粉組成物，包括藥理上有效劑量之敦’白貝⑽）及藥學上可接受之賦形劑。較特本發月〈乾粉包括由哺乳動物尿液 FSP 〇發月的散W當氣霧化及以吸入法投予至肺深處時，可呈現良好的生物利用率。本發明乾粉之特徵在於至少約。〈相對肺生物利用率，而相對肺生物利用率數値通常在由約1%至60%之間。在另纟面，本發明是有關製備經穩定的乾粉FSP組成物之f法。方法中包括混合及賦形劑與溶劑，形成溶液或懸液’再將溶液或懸液乾燥形成具生物活性之散劑，其中包含I乾燥粒子中含有FSp及賦形劑。可用於方法中 (特殊/谷劑包括水及醇類。在方法之較佳具體實施例中， FSP組成物由噴灑乾燥產生。又在另一方面，本發明提出遞送FSp至有所需哺乳動物個中 < 方法，其中的方法包括以吸入投予Fsp乾粉組成物’且其如先前所述般呈氣霧劑型式。以吸入本發明也在另一方面，也包括治療哺乳動物不孕症之方法，其中有效治療劑量之本發明FSP乾粉組成物， 1277425

五'^發明說明（5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製法投予至個體以沈積及吸收自肺部。在特殊具體實例中，個體是不孕的婦女，且FSP乾粉組成物以吸人方式投予至個體肺部，定期地達一個以上的治療循環，歷至少3_2〇天㈣’由是由於該投藥之結果，個體心生長之水平較投藥前有相當程度的增加。又在—個特殊具體實例中，治療有效量之：FSP是由每天約10至1〇〇〇Ιϋ的Fsp。又在另一特殊具體實例中，治療有效劑量之Fsp是每天由約％至約3_KJ。又在另—具體實例中，特別是與絕佳的排卵治療有關（即試管内授孕），治療有效劑量之Fsp是由約 200 至 12,000 IU。本發明的這些及其他目的及特色，t以下詳細説明配& 附圖及實例時，更可充份明白。附圖説明圖1不出三種示範用FSP粉末調和物（L2〇17，L2〇1〇， L2018 )用於一個月穩定研究中（如實例7C中所述），在細碎粒子部份，（FPF ，％少於3·3微米）及氣霧劑粒子大小 (MMAD)間之關係。圖2A及2B，示出對代表性uFSH乾粉調和物，和FSII 標準品（實例8 )比較下，用以決定其生物活性之試管内大鼠生物分析之結果。圖2A證明散劑L2013及L2010之生物利用率。圖2B證明散劑L2006及L2008之生物利用率。圖3示出，uFSH氣管内（IT)及皮下（SC)投予至大鼠（實例9 )之活體内生物利用率。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） -丨^丨j •裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1277425 __B7___ 五、$明說明（6 ) 圖4示出當恒河猴肺及皮下投予人類uFSH後，免疫反應性FSH之平均血清濃度（土SEM)。（實例10 ) 圖5示出當恒河猴肺及皮下投予後，uFSH變型具免疫反應性者之平均血清濃度（±SEM)。（實例17)。圖6示出皮下投予後，免疫反應性hFSH或uFSH之平均血清濃度（土SEM)。（實例Π) 詳細說明定義 ”具生物活性之散劑’’指具有試管内或活體内活性之散劑，且通常指含有一種以上生物活性或藥學作用物，如 FSP之粉末。本發明散劑之”生物活性’’可利用技藝中已知之FSH分析法大體上偵測，如訊號轉導分析，FSH受體結合分析，或Steelman/Pohley活體内大氣卵巢重量分析法版本，FSH半衰期彳貞測及/或FSH生物活性分析[Zlokamik et al·，Science，279，84-88 (1998); Dahl, K. et al.，Journal of Andrology，13:11-22 (1992); Roth and Dias，Biochem. 35:7928 (1996); Valvore, et al.? Endocrinol 135:2657 (1994); Sprengel; et al·，Mol. Endocrinol. 4:525 (1990); Tilly，et al·，Endocrinol. 131:799-806 (1992); Steelman and Pohley, Endocrinol. 53:604 (1953); Bishop et al·，Endocrine. 136:2635 (1995); Mulders，et al·， Biologicals, 25:269 (1997); Fares, PNAS5 89:4304 (1992); LaPolt, et al·，Endocrinol. 131:2514 (1992)]。於試管内生物活性分析之進一步實例包括下列，但不限於此··利用大鼠顆粒細胞芳族酶分析，债測雌激素之產生[Dahl，et al.，Meth. Enzymol· -9- 張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） I ^----_-------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再赛寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 .............. B7 五、^明說明（7 ) ^ s 169.414 (1989)];及 FSH 受體活化分析，如 Kelt(m，et al Molec· Cell· Endocrinol. 89:141 (1992)中所述。， ”相對的肺生物利用率”是沈積在肺中之Fsp乾粉劑量百分率，其吸收及進入哺乳動物血液中之量相較於由肌内或皮下注射位置吸收至血液内之百分率。決定相對肺生物利用率之代表性模式系統包括大鼠，兔子及猴子。本發明 FSP乾粉組成物之特徵在於在血漿或血液中至少約1%之相對肺生物利用率，而相對肺生物利用率通常由純丨至 20〇/〇，且較好是由約1%至約6〇%。相對肺生物利用率可由直接氣管内投藥或吸入FSP-乾粉組成物而由偵測吸收作用中估算出來。 ”分佈狀態"係在參考FSP之半衰期下，指最初之快速期，在此中激素可自血漿中消失。末端減緩或消失期半衰期疋指末端fe速期，於此激素自體内消除。藥學上可接焚之鹽"包括與無機酸製備之鹽類，如氯化物，硫酸鹽，磷酸鹽，二磷酸鹽，氫溴化物，及硝酸鹽，或與有機酸製備之鹽類，如蘋果酸鹽，馬來酸鹽，延胡索酸鹽，酒石酸鹽，丁二酸鹽，乙基丁二酸鹽，檸檬酸鹽，醋酸鹽，乳酸鹽，甲烷磺酸鹽，苯甲酸鹽，抗壞血酸鹽，對位-甲苯磺酸鹽，棕櫚酸鹽，水楊酸鹽，及硬脂酸鹽，以及estolate，gluceptate及乳糖醛酸鹽，但亦不限於此。類似地含有藥學上可接受陽離子之鹽包括鈉，鉀，鈣，鋁’叙及铵（包括經取代的銨）但亦不限於此。梓檬鹽指檸檬酸與陽離子形成的任何藥學上可接之 I,----------装--------灯--------- C請先間讀背面Μ漆意事頊再填寫本貢) -10-

I277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ---—_ _B7__ 五,明說明（8 ) ^ ^ ——— 鹽，如鈉，鉀，銨，包括烷基銨鹽），鈣等。 f’胺基酸”指含有胺基及羧酸基之任何化合物。雖然胺基最常發生在鄰近羧基官能基之位置，胺基則可位於分子内任何所在。胺基酸可含有額外的官能基，如胺基，硫基，竣基，羧醯胺，咪唑等。胺基酸可爲合成的或自然生成的，且可以其外消旋或旋光性（D_，或l_ )型式使用。 "加強劑’’指可加強FSP經由下呼吸道上皮吸收，到全身循環的化合物。於加強劑存在下，吸收至全身循環的卩卯量可較無此加強劑之乾粉還多，且加強的量爲無加強劑下的至少約150%。 π遞送劑量效率”或” DDE ”爲乾粉自適當吸入器裝置口邵，在開動或分散動作後遞送之指示。DDE與”射出量,，或nED”是同義的。較特異地，DDE (ED)可作爲自單位劑量包裝中抽出之粉末百分率，且其係自吸入器裝置之口部射出的。DDE(ED)可定義爲由吸入器裝置遞送至通稱劑里之遞送量比例（即在開動前’置入適當吸入器裝置内之每單位劑量粉末之量）。DDE (ED)是可由實驗決定之變數，且通常利用可模擬病人給藥之裝置來決定。爲決定 DDE値，乾粉之通稱劑量，通常是呈單位劑量型式，置於適合的乾粉吸入器内。（如U.S· Patent No· 5,785,049所述，屬於Inhale Therapeutic Systems )，其再開動，分散出粉末。生成之氣霧劑團，再以吸空方式自裝置内抽出，其中其被捕獲在黏附於裝置口部上之有配衡濾膜上。到達濾膜之粉末量構成遞送劑量。例如，對5毫克乾粉劑型置於吸入裝 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .I---^-------裝--------訂---------線 C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} 1277425 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i 明說明（9 置内而言，粉末若分散時可造成4毫克粉末回收在配衡濾膜上，則該乾粉組成物之DDE是：4亳克（遞送劑量）/5 笔克（通稱劑量）X 100 = 80%。對非均質之粉末而言， DDE值提供藥物自吸入器裝置於開動後之遞送指示而非僅有乾粉，且以藥物之含量而非粉末之總量爲基礎。 ”細碎粉子部份"或"FPF，定義爲氣霧動力直徑少於3 3微米 < 氣霧化粉末粒子質量百分率，其通常是利用Andersen 階式壓緊器來決定。此變數可作爲粒子具最大潛力可到達病人肺深處以使藥物可全身性吸收之百分率。 "氣霧劑性能係數"或"APC”是粉末自單位劑型（如發泡霄包裝）遞送至肺深處之總粉末遞送效率之估計，且可利用在每分鐘28.3升之眞空下操作經道Anders〇n階式壓緊器實驗地決定。APC與”細碎粉子劑量，，或”pPC"同義。Apc 可定義爲粒子大小少於3.3微米之氣霧化粉末之總量（亳克計）’此相較於在單位劑型（如發泡膏或膠囊）中所含之粉末量（按毫克計），且以APC(%)二少於3.3微米之氣霧化粉末總量（毫克）+單位劑型充填質量X 1〇〇，之百分率表示0 π乾粉’’指含有細碎分散之固體粒子之組成物，其可自由流動且可（i)易分散在吸入裝置内，及（ϋ)可爲個體吸入如此邵份粒子可到達肺部，以令穿透至肺泡内。此一粉末可視爲"可呼吸的”或適於肺遞送。乾粉含有約〇 1C/❶至水汽，且通常含有10%以下的水汽，較好少於5%，且又較好少於3%。除非另有所示”可供遞送至肺深處具乾粉組 -12_ 本紙張尺度適用中國國家標準(c!ns)A4規格（21〇 X 297公釐 ^ ^--------- (請先閱讀背面之注意事項再赛寫本頁) A7 1277425 B7____ 五、$明說明（1(3 ) 成物”為可呈乾粉末粒子型式氣霧化及投予者。 ”濾泡刺激蛋白質”或’’FSP’’表示結構及功能類似人類濾泡刺激素（"hFSH”）之蛋白質或其混合物。FSP包括hFSH， hFSH之胺基酸類似物（n hFSH ”類似物），hFSH之糖基型式，hFSH類似物之糖基型式，及選自hFSH，hFSH類似物，hFSH糖基型及hFSH類似物糖基型之混合物。自人類尿液中將FSH純化至各種程度（f’uFSH’’）已被治療上應用數年之久，如上述。UFSH是結構及功能類似hFSH 之蛋白質混合物，且因此在FSP定義之内。UFSH是hFSH 及hFSH類似物之混合物，各自具有糖基化作用之異質性。所謂的重組體FSP (”rFSPn)是結構及功能類似hFSH之蛋白質混合物，其在宿主細胞内生合成，而宿主利用重組體或相關技術修飾可表現hFSH胺基酸序列或hFSH類似物之肢基酸序列[Keene，et al·，J· Biol. Chem·，264:4769-4775 (1989); Chappel，S.，et al·，Proceedings of the 3rd World Congress on Gynocological Endocrinology，179-184 (1992) ; 4Reddy，V· B·，et al·，U.S.PatentNo. 5，156,957，1992 年 10 月 20 日]。 rFSH之異質性肇因於宿主細胞轉錄上之背信及轉譯後處理修飾特色之異質性，或始自培養條件，純化，調和，及貯存等原因。結構上，hFSH是由二個非共價結合亞單位（稱之為α及 β亞單位）所組成之異二元糖蛋白。人類FSH a亞單位含有92胺基酸之鏈，5個亞單位内雙硫键，及2個Ν-鏈結 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨^----_-------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、If明說明（11 ) 之糖基化侧鏈。人類FSH α亞單位之胺基酸序列示於此中，以SEQ ID Ν0:5表示。人類FSH β亞單位含111個胺基酸之鏈，6個亞單位内雙硫鍵，及2個Ν-鏈結的糖基化侧鏈。其胺基酸序列示於此中，SEQ ID:6。雙硫键在及 hFSH α亞單位中係鏈結殘基7及31，10及60，28及 82，32及84及59及87，在hFSH β亞單位中係鏈結殘基 3 及 51，17 及 66，20 及 104，28 及 82，32 及 84，及 87及94 °Ν-糖基化作用位置在α亞單位中之52及78位置（SEQ ID ΝΟ:5)，在β亞單位中在殘基7及24之間（SEQ ID ΝΟ:6)。總而言之，二個亞單位之分子量以質譜儀偵測是約31 kD，以PAGE或凝膠層析則依糖基化狀況為約35-45 kD。適切的序列資料（加上參考）可見於Entrez Protein Database，其為國家生物技術資料中心（NCBI)提供及維持。對於前軀體α-亞單位之供說明蛋白質序列相當於如 Entrez輔助編號No· 69160 ( 116個胺基酸，其中C末端92 個胺基酸構成成熟的oc-亞单位序列）；對前驅體β-亞早位之代表性序列可以下列 Entrez 輔助編號鑑知： N〇:120552，476441，182767，182762 及 511854 ( 129 個胺基酸，其中C-末端111個胺基酸構成成熟的β-亞單位序列）。就功能性而言，FSP之活性如此中的決定的為生物活性粉末。n FSP活性’’，n FSP生物活性π，’’ FSH活性π，’’ FSH 生物活性等功能性概念可由異二聚穩定性來偵測；FSH-相關訊號轉導分析中之活性；FSH 受體結合； -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ^----η I-----I ------ I 訂------I-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7____ 五、1明說明（12 )

Steelman/Pohley活體内大氣卵巢重量分析之版本；活體内藥物動力學偵測，如活體内之半衰期；活體内藥效藥劑學測試，如技藝中已知及此中所述的，如增加之濾、泡生長。

Mm 含於本發明乾粉中之FSH之比活性，可由約100-175 IU/毫克蛋白質（爲uFSH之典型活性範圍，其通常含有LH或其他共純化之蛋白質）至約1000至13500 IU/毫克蛋白質，此對超純化之尿中FSH (Arpaia，et al·，1992)或重組體物質而言，且依激素之來源及純化程度而定。 FSP意指去糖基化的，未糖基化的，經修飾之糖基化，及其他糖基化型式。以糖基化型式爲較佳。糖基化FSP，其糖基化程度通常是異質的，在任何樣品内可具有多樣的糖基化類型。糖基化之異質性，依FSP生合成之細胞型式，及FSP轉譯後，分泌後，純化及貯存中所曝霧之條件可予以P食，士口 Baenziger and Green，Biochem. Biophys· Acta， 947, 287_306 (1998); Bishop，et al.，Mol. Endocrinol·，8, 722-731 (1994); Thotakura and Blithe，Glycobiology，5，3-10 (1995); Dahl， et al·，Science，239，72-74 (1988); Ulloa-Aguirre，et al·，Endocr. Rev·，16，765-787 (1995); Stanton，et al·，Endocrinology，130, 2820-2832 (1992); Beitens and Padmanabhan, Trends Endocrinol. Metab·，2，145-151 (1991); Hard，et al. Eur. J. Biochem·，193, 1064-1069 (1990); Harris，et al·，Mol. Hum. Reprod·，2，807-811 (1996); Hakola，et al·，Mol· Cell. Endocrinol·，127, 59-69 (1997) 。糖基型是糖蛋白的一種型式，其糖基化型式或種類與 uFSH的比較下是多樣性。糖基型式可被視爲是一種碳水 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------i-------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7_ 五、^明說明（13 ) 化合物類（和胺基酸類似物相對）。 FSP包括uFSH之胺基酸類似物（即hFSH類似物）.，如述於 Monahan，M.，et al·，Biochemistry，12:4616-4620 (1973); Nestor，J.J·，et al·，U.S. Patent No· 4,234,571，1980, 11 月 18 日 ;Fujino，M·，et al，J. Med. Chem·，16:1144-1147 (1973); Coy， D.H·，et al.，Biochem. Biophys· Res· Commun·，67:576-582 (1975); Combarnous, Y., Endocrine Reviews, 13(4):670-691 (1992), and Antoni，F·，et al·，U.S. Patent No. 4,552,864, 1985, 11 月 12 曰。 hFSH類似物是在結構及功能上類似hFSH之化合物，但與 hFSH結構上相異處在於一個以上的胺基酸已被置換，刪除，加入，或與hFSH比較上是另外被處理修飾。此中之 hFSH類似物與hFSH在以某偵測法偵測時，需呈現至少 10%生物活性。hFSH類似物之實例，包括SEQ ID NOS:l-4 及7-31 。但亦不限於此。在FSH類似物中爲功能所必要之胺基酸可以技藝中已知之方法鑑知，如位置-指令之突變作用或丙胺酸-掃描突變法[Cunningham and Wells，Science， 244:1〇81-1085 (1989)]。後一步驟中可在分子的每一個殘基上引入單一的丙胺酸突變。所生成之突變分子，再進行生物活性之測試。以結構分析也可測試鑑定出配體-蛋白質結合中具關鑑性之位置，如結晶學，核磁共振光譜，或光親和力標記[Smith, et al·，J. Mol. Biol·，224:899-904 (1992); de Vos，et al，Science，255:306-312 (1992)]。可應用於本發明之特佳的hFSH類似物爲n hFSH變型n。 hFSH變型是結構上異於hFSH之FSP，其中一個以上的胺 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 ,¾ 財產局員工消費

I 五、$明說明（14) 基酸自hFSH四個末端一個以上中刪除（α及β亞單位各自有二個末端，Ν·末端及〇末端）。在hFSH變型中，一個以上的胺基酸添加，置換或刪除也可存在於α亞單位，3 亞單位或二者之内部，即非在末端（與hFSH比較而言）。 hFSH變型α亞單位之胺基酸序列實例包括SEQidn〇s:29. 3 1，但亦不限於此，可視所需含有至少一個進一步的置換，加成或刪除。hFSH變型β亞單位之胺基酸序列實例包括SEQIDN0S:11_28,但亦不限於此，視所需含有至少一個進一步的置換，加成或刪除。某些變型為技藝中熟知的，如 H〇ffmann，j. a.，et al·，Inte〇lati〇nal 恤加匕仙灿 WO 00/04913, Feb. 3, 2000 所述。較佳的hFSH變型為：υ其中一或二個亞單位有末端除者，但其中任何的刪除限於α亞單位ν_末端中1、2 3、4、5或6個胺基酸，α亞單位c_末端中或一5個胺基酸，β亞單位N_末端中i或2個胺基酸，^ ^一 ^末⑸中1、2、3、4、5、6或7個胺基酸；2)JL 中-或二個亞單位中有—或二個刪除者，如上〇中所述除了《亞單位之C-末端無刪除外；3)其中β亞單位者，且其中較好在β亞單位c_末端有至少3個胺: k刪除；4)其在N-末端並無刪除之亞單位，或最多 N-末端有至多—或二個胺基酸之刪除好亞單位之N-末端；5)具全長…、:：好疋在 ::r灿單位者，較好在二二::基7酸胺基奴之删除’且N-末端無胺基酸刪除或N_末端 on 刪 4 亞在 β 個有 I ^ ^--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _17_ U張尺度適財χ 297公爱） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、1明說明（15 ) 一或二個胺基酸刪除；與hFSH比較下所有的均可視所需有一個以上内部胺基酸之刪除，置換或添加（即，非在末端）。最佳之hFSH變型爲所含之α亞單位具SEQ ID N0:5, 29-31任一者胺基酸序列，及所含之β亞單位具SEQ ID NOS:ll-28任一者胺基酸序列者，及所含之α亞單位具 SEQIDNOS:29-31任一胺基酸序列，而β亞單位具SEQID N0S:6胺基酸序列者。至於此中命名之hFSH變型，對SEQ ID NO或所刪除之胺基酸有參考，可利用位置編號後之ndes”或三字碼及所刪除胺基酸之位置（如desAsnl )，或在一或三字碼中單純地示出被移去之胺基酸，及受影響之位置（如1N或Asn1)。 SEQ ID NOS示於下。 FSP SEQID NO: DNA SEQID NO: 亞單位 FSP SEQID NO: DNA SEQID NO: 亞單位 1 - 牛α 17 42 人類β變型 Desl，111 2 - 牛β 18 43 人類β變型 Desl，2, 111 3 - 馬α 19 44 人類β變型 Desl，110, 111 4 - 馬β 20 45 人類β變型 Desl，2, 110, 111 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨·—·-------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 Β7 五、1明說明（I6 ) FSP DNA FSP DNA SEQID SEQID 亞單位 SEQID SEQID 亞單位 NO: NO: NO: NO: 5 32,37 人類α 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 36 人類β 7 - 豬α 8 - 豬β 9 - 羊α 10 - 羊β 11 33, 38 人類β變型 Des 109, 110, 111 12 34 人類β變型 Des 110, 111 13 35 人類β變型 Des 111 14 39 人類β變型 Des 108-111 15 40 人類β變型 Des 107-111 16 41 人類β變型 Des 106-111 21 46 人類β變型 Des 1，109-111 22 47 人類β變型 Des 1，2, 109-111 23 48 人類β變型 Des 1，108-111 24 49 人類β變型 Des 1，2,108-111 25 50 人類β變型 Des 1，107-111 26 51 人類β變型 Des 1，2, 107-111 27 52 人類β變型 Des 1，106-111 28 53 人類β變型 Des 1，2, 106-111 29 54 人類β變型 Des Ala1 30 55 人類α變型 DesAla^ro2 31 56 人類α變型 DesAla^ro^sp3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19 - 1277425

五、發明說明（π 質量直徑中值"或"MMD"是用於平均粒子大小之備剛’因為本發明之粉末大多县努八 ^ 水文夕疋桌矢散的（即含有大範圍之 2子大小）。此處的報告之MMD值可以離心沈降法來決足雖然任何常用之技術均可用來偵測平均粒子大小（如包子顯微鏡術，光線掃射，及雷射繞射）。質量氣體動力學直徑中值”或” MMAD，，用以測度分散粒子之氣體動力學大小。氣體動力學直徑是用來就其沈降行為所描述之氣霧化粉末，且是具有相同沈降速率之單位密度球之直徑，其通常是在空氣中呈粒子狀。直徑包括粒ς <外形，密度及物理大小。如此中所用的，MMAD指由階式壓緊器所決定的氣霧化粉末之氣體動力學粒子大小分佈之中點或中值。藥學上可接受之賦形劑或載劑”指可與FSH 一起攝入肺中之赋形劑，其對個體並無顯著有害之中毒作用，特別是對個體之肺部而言。 ’’藥學上有效劑量，，或” FSP，，之生理上有效劑量，是存在於此中所述之乾粉組成物中之FSP含量，其是接受治療個體血流中生成欲求藥物水平的必要之量，當此組成物吸入投藥或沈積及為肺所吸收時，可生成預期之生理反應。精確用量依許多因素而定，如FSP來源（尿液或重組體），組成物之比活性，所應用之遞送裝置，粉末之物理特性，其意欲用途，及病人的考量，且可為精藝者依據此中提供之資料所容易地決定。在治療前，某些不孕的女性個體通常有小的濾泡，即在 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ---訂---------線秦經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 -___- _B7 五、〜發明說明（18 ) 各卵巢最大部扮之濾、泡直徑少於10毫米，此通常由p道探針術超音波來決定。”增加之濾泡生長，，在治療女性不孕症之環境下，是指個體中濾泡生長之水平較投予本發明 FSP乾粉組成物之前之基値還增加。較好，增加之減、、包生長是以一個以上的濾泡平均直徑達1〇毫米以卜- 丄不出。在排卵謗導型之治療中，增加之濾泡生長通常以^個濾泡以上，其平均直徑達10毫米以上來表示。在絕佳之排卵型冶療中（4管内授精），增加之遽泡生長較好以2個以上遽泡之平均直徑達10毫米以上，較好3至5個濾泡直徑達10毫米以上，且甚至更好6至8個濾泡呈現出此大小特性來表示。在整個治療過程中（特別是絕佳之排卵治療），個體完全濾泡發展之顯示爲平均有9個濾泡之直2 大於10毫米，且其中最大的濾泡有16毫米以上之平均直徑。FSH療法之效力也可以其他方法來評估，如超音波及個體雌激素水平。穩疋的乾粉組成物”，特別指可氣霧化遞送至肺深部之乾粉，是一種散劑，其⑴含有FSH及賦形劑，其中賦形劑非松三糖，出）具有至少5〇 IU/亳克FSH之比活性，且較好至少l〇〇IU/亳克FSH，及（iii)當在室溫環境條件下貯放個月時，可維持最初生物活性之至少約7〇%。也就是説，依據本發明之穩定化乾粉一旦調和及長期貯放至少一個月，可實質維持活體内及/或試管内FSH活性。含有瘦酸鹽之穩定的乾粉組成物，其含有二個以上可離子化之質子（知檬酸鹽，穀胺酸鹽，酒石酸鹽等等）充作緩衝物 ^ ^--------1--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -21- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 ---------B7_____ 五Ί月說明（19 ) ' u以技藝中已知之方法製備，但非以冷凍乾燥方式。 Π聚合的大分子，，是一種高分子量聚合化合物，其是自然生成的（如蛋白質，碳水化合物，核酸）或合成產生的 ^ u _吁，聚乙烯吡咯啶酮，Ficolls等，技藝中己知的）。 ••治療有效劑量”是依FSP之量，其當以此中所述之乾粉組成物型式以吸入方式投藥，可沈積及自肺中吸收，可提供欲求之生物作用。 11階式壓緊器效率，，或”CI Eff”是在階式壓緊器中回收之軋務化粉末郅份。Cl Eff値由於在咽喉或階式壓緊器壁上有所流失，因此通常少於DDE値。剩下百分率”表示原先在發泡膏包裝（Bp)中之粉末百分率，其於粉末分散係留於BP中。 ’·收集百分率”表示自BP分散之粉末百分率，其係沈積在收集濾膜上。"收集百分率”説明可能因沈積在裝置及小室内而流失之粉末。 ”鬆密度”指粉末在緊壓前之密度（即未壓縮粉末之密度），且通常以熟知之USP方法偵測。 FSP乾粉本發明提出可供FSP肺部遞送之穩定可分散之乾粉組成物。由本申請人發展之組成物可克服在調和蛋白質，特別是促性腺激素，常會遭遇到的許多問題，而可遞送至肺深處。此中所述之FSP乾粉組成物，可容易地分散（即證明有良好的氣霧劑性能），可穩定地拮抗物理及化學降解作 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -1.----------· I------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 丨一—1 ........ 五、發明說明（20 ) 用，（i)於溶浪中，在粉末製造之前，（ii)在粉末製造及處理之中，及（出）於貯存中，且當以吸入方式沈積及吸收自肺時，仍可I現良好之生物利用率。依據本發明之乾粉組成物通常包拉FSP及藥學上可接受之賦形劑，雖然也包括純淨FSP之乾粉（即由FSP組成之可呼吸的散劑，且基本上缺少任何額外的賦形劑或添加物）。目前已描述適於遞送至肺深處！ FSP乾粉組份。

FSP 自然生成$ FSP。含於固體製劑中之FSP可至少部份純化自天然來源（即可以是高度純化的且可視所需包括有LH 或其他共純化之蛋白質），如人類尿液FSH (uFSH)。由尿液衍生之可得自商品化來源（如Vitro Diagnostics， Boulder，CO )或如 ArPaia，G·，et a1·，I992 中所述以免疫純化法純化。許多自然生成的FSP異二體是已知的，且適用於本發明之乾粉。此種示範之FSP異二體，即含有一個α亞單位及一個β亞單位，包括SEQ ID N0S:1及2 (牛FSH); 3 及 4 (馬 FSH) ; 5 及 6 (hFSH) ; 7 及 8 (豬 FSH) ; 9 及 10 (羊 FSH) 0 合成的或重組體FSP。另外，FSP可化學合成地產製，或可在宿主細胞中利用傳統的分子生物學技術遺傳操作地生合成（即重組技術）。重組體FSP，是本發明乾粉組成物中較佳之FSP型式，可利用傳統的技術製備，如述於下歹丨J : Kccnc，et al·，1989; Boime, et al.? Seminars in Reproductive Endocrinology，10:45-50 (1992); Chappel，et al·，1992 ;或 Reddy， -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I-—-1.-------裝-------—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) !277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 i、$明說明（21 )

et al·，1992; Shome，B·，et al·，J. Prot. Chem·，7:325-339 (1988); Saxena，B.B. and Rathnam，P.，J. Biol. Chem·，251:993-1005 (1976); Watkins，et al·，DNA，6:205-212 (1987); Shome，B· and Parlow，A.F·，J· Clin· Endocrinol· Metab·，39(1):203-205 (1974); Beck, et al.? DNA, 4:76 (1985); Boime, et al., U.S. Patent No. 5,405,945 (1995);及 Reddy，V.B·，et al·，U.S. Patent No· 5,639,640 (1997); Sambrook, et al. Molecular Cloning: A

Laboratory manual，2nd Edition，（1989); Ausubel，et al·，Eds·， Current Protocols in Molecular Biology, (1987-1998), Chapters 10? 12, I3, 16, 18及20，其内容已列爲本案參考。FSH變型之示範製劑示於實例13及14。較特異地，FSP產物可在原核或眞核宿主中以重組技術製備，如：細菌，酵母[Sherma，F·，et al·，Methods in Yeast Genetics，（1992)]，較高等植物，昆蟲[Schneider，J. Embryol. Exp. Morphol·，27:353-365 (1987)]及哺乳動物細胞，如 CHO ，COS及Bowes黑色素瘤細胞。依據用於重組產製步驟中之宿主，如此產製之rFSP分子可糖基化或未糖基化。此外，rFSP亞單位也包括一個啓動的甲硫胺酸殘基。此方法述於許多標準的實驗室手册中。 FSP可以經修飾型式表現，如融合蛋白質，且可包括分泌訊號’不僅如此也可有額外的異質功能區域。例如，在 N-末端可加有額外的胺基酸區域，特別是荷電的胺基酸，以改進在宿主細胞中，純化之中，或接下來的處理及貯存中之fe足性及持績性。同時，在FSP分子中也可加有肤部 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I*----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、_發明說明（22 ) 份以助純化。此種區域可在多肽最終製備前移去。此方法描述於許多標準的實驗室手册中，如Sambrook ，上文， Chaptws 17.29-17.42 及 18.1-18.74 ; Ausubel ，上文，

Chapters 16，17 及 18 〇簡言之，編碼用於本發明中之FSP之經分離核酸之表現，通常可由將DNA或cDNA操作鏈結至啓動子（其可爲原構的或可謗導的），再納入表現載體内而完成。載體可適於複製及整合於原核或眞核細胞中。典型的表現載體含有轉錄及轉譯終結子，啓動序列及啓動子，可用於調控編碼本發明蛋白質之DNA之表現。爲得到高水平之經選殖基因之表現，希望可構築表現載體，其中至少含有強的啓動子以指令轉錄作用，核糖體結合位置以供轉譯啓動，及轉錄/轉譯終結子。 FSP在酵母細胞中之表現以熟知方法進行[Sherma，et al·， (1982)]。用於產製眞核蛋白質的二個廣爲利用酵母爲··釀酒酵母及畢赤酵母。用於釀酒酵母及畢赤酵母中表現之載體，菌株及策略爲技藝中熟知的，且可得自商業來源（如 Invitrogen，Inc.)。適合的載體通常有表現控制序列，如啓動子，包括3-磷酸甘油酸酯酶或乙醇氧化酶，及複製源，終結序列等。編碼FSP之聚核甞酸序列也可連接至各種表現載體，以用於轉感哺乳動物細胞。哺乳動物細胞學常呈細胞單層型式，雖然也可使用哺乳動物懸液。可表現FSP的適合的宿主細胞包括HEK293，BHK21，AV12及CHO細胞株。用 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I-—·-------^裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 五、^明說明（23 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於這些細胞的表現載體包括表現控制序列，如複製源，啓動子（如CMV啓動子，EF1 α啓動子或HSV tk啓動子或磷酸甘油酸酯激酶啓動子），加強子及處理資料位置，如核糖體結合位置，RNA剪接位置，聚腺甞化位置（如SV40 大T Ag聚A加成位置），及轉錄終結子序列。其他可用於產製FSP之動物細胞如得自美國標準菌種收集所，（7th edition，1992) 〇在昆蟲細胞中表現FSP之適合的載體通常衍生自SF9样病毒。適合的昆蟲細胞株包括蚊子幼蟲，蠶，行軍蟲，蛾及果繩細胞株，如Schneider細胞株[Schneider ，上文， 1987] 〇載體構體引入宿主細胞可由下列方式完成：磷酸鈣轉感作用，DEAE_右旋糖調介之轉感作用，陽離子-調介之轉感作用，電子脈動，轉導作用，感染或其他方法。此方法述於許多標準實驗室手册中，如Sambrook ，上文， Chapters 1-4 及 16-18 ; Ausubel，上文，Chapters 1，9，13，15, 16已全列爲本案參考。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製另外，編碼FSP之聚核酸可在宿主細胞中表現，經由引入，可經由同質重組至細胞基因體預選定位置，DNA則至少包括調控序列，表現子及剪接供應位置。這些組份以此方式引入染色體（基因體）DNA中，事實上可造成新轉錄單位之產生（其中存在於DNA構體中之調控序列，表現子及剪接供應位置操作鏈結至内源基因）。由於這些組份引入染色體DNA的結果，可改變欲求之内源基因之表 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、1明說明（24 ) 現。此方法是技藝中熟知的，如述於U.S. Patent Nos· 5,580,734, 5,641，670, 5,733,746 及 5,733,761 ，其内容已列爲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參考。重組FSP以熟知之方法回收及純化自重組體細胞培養物，包括硫酸銨或乙醇沈澱，酸萃取，陰離子或陽離子交換層析，麟酸纖維素層析，疏水性交互作用層析’親和力層析，羥磷灰石層析，迸相層析，染料層析及卵磷脂層析。純化過程之追踪可利用西方墨點吸潰技術或放射免疫分析或其他標準的免疫分析技術來完成。 hFSH變型。本發明的乾粉組成物可含有hFSH變型。 hFSH變型可以技藝中已知之許多技術產生，如化學合成，重組體生合成，及活體内或試管内自然生成的或重組體FSH以胺基及/或羧基肽酶處理修飾，以曝露出一個以上的内部胺基酸。編碼FSP之核酸分子經濟部智慧財產局員工消費合作社印製編碼此中所述之FSP之聚核酸分子，可用以説明而非限制可以重組表現方式製備FSP之序列，且其可納入本發明之乾粉組成物中，以於活體内表現FSP ，如下文所詳述的。其他的聚核酸可用來產生FSP，而不影響本發明。聚核酸分子可呈RNA型式，如mRNA，hnRNA，或其他任何型式，或呈DNA型式包括以選殖或合成產製所得之 cDNA及基因體DNA，或其任何組合。DNA可爲三股，二股或單股，或其任何組合。DNA或RNA至少一股的任何部份可爲編碼股，也稱之爲有意義股，或其也可爲非編 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（25 ) 碼股，也稱之爲反-意義股。可用於表現FSP之經分離的聚核酸分子，含有開放讀譯架構（DRF)，示於 SEQIDNOS:32，37，54，55，或 56 中至少一者，或與之互補序列之核酸分子，以表現α亞單位，或含有 ORF 於 SEQ ID ΝΟ··33，34，35，38，39， 40 ，41 ，42 ，43 ，44 ，45 ，46 ，47 ，48 ，49 ， 50，51 ，52或53中至少一者，或與之互補序列之核酸分子，以表現β亞單位。聚核酸序列之製備可利用（a)標準重組體方法，（b)合成的技術，（c)純化技術，或其組合，如技藝中熟知的。聚核酸可合宜地含有此中所示示範序列以外之序列。例如，含有一個以上核酸内切限制酶之多重選殖位置，可納入核酸中，以助聚核甞酸之分離。同時，也可將可轉譯序列納入，以助轉譯之FSH聚核甞酸之分離。額外的序列也可加至此選殖及/或表現序列中，以使其選殖及/或表現功能上更臻完善，以助FSP聚核苷酸之分離，或改善聚核甞酸引入細胞内。編碼FSP之聚核酸可以直接化學合成方法製備，如 Narang，et al·，Meth. Enzymol·，68:90-99 (1979)之轉酸三酉旨酶； Brown et al·，Meth. Enzymol.，68:109-151 (1979)之嶙酸二酯酶方法；Beaucage et al·，Tetra. Letts·，22:1859-1862 (1981)之二乙基磷酸醯亞胺方法；Beaucage 及 Caruthers，Tetra· Letts·， 22(20):1859-1862 (1981)之固相磷酸醯亞胺三酯方法，如利用自動化合成儀，如 Needham-VanDevanter，et al·，Nucleic -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I----.-------裝--------訂--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425

五、明說明（26

Acids Res·，12:6159-6168 (1984);及 U.S· Patent No. 4,458,066 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 之固相載體方法。化學合成通常可產生單股寡核苷酸，其可經由與互補序列雜交而轉化成雙股DNa，或利用單股爲模板以DNA聚合酶行聚合作用。雖然dnA之化學合成限於約100鹼基之序列，但與較短序列連接可得較長序列0 述於此中序列32-56之代表性聚核甞酸序列，可編碼α 或β亞單位。SEQ ID NO:37及％之DNA設計及構築自連接之寡核甞酸。SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:37間之差異，並不改變α亞單位蛋白質所編碼之胺基酸序列。另外， SEQ ID ΝΟ:38及SEQ ID ΝΟ:33間之差異，並不會改變β變型亞單位蛋白質之編碼的胺基酸序列。精藝者應了解，因爲遺傳密碼之簡併性，存在有許多相當於SEq ID Ν0:32-56 所述序列之序列。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明的乾粉含有編碼FSP之聚核甞酸（如編碼FSPa_ 及β-亞單位之基因），其片段（如β_亞單位，其可提供生物特異性），及/或變型如此中所述，其中聚核苷酸或FSp_編碼區操作鏈結至適合的轉錄調控或控制序列（如啓動子，加強子等）以令FSP導入外來基因在個體標的宿主細胞之表現，如來自肺部區域之哺乳動物細胞（如肺上皮細胞，肺泡型細胞），或其他適合的個體宿主細胞。除了此中所提供之序列’編碼FSP，其亞單位，或前軀體蛋白質之代表性基因序列，可見於Entrez Nucleotide Database (如上述）。此示範的編碼序列有以下的輔助號·· j〇〇152 v〇〇487 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮）~' ' - 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五明說明（27 ) (α 亞單位，鹼基 1-397)，M54912 M38644 M21219M18536 (β-亞單位基因，表現 1)，Μ54913 Μ21220 Μ18536. (β-亞單位基因，表現子 2)，Μ54914 Μ38646 Μ21221 Μ18536 (β-亞單位基因，表現子3)。在本發明此方面較佳之具體實例中，調控序列操作鏈結至聚核甞酸編碼序列，可作用並以脈動方式表現FSP。編碼FSP之聚核甞酸可視所需含於病毒或其他傳統基因治療載體中，或可含有脂質-FSP導入外來基因複合物，如 Eljamal， M.， et al.， International Patent Publication WO 96/32116，1996 年 10 月 17 日；McDonald，R.J.，etal.，Pharm· Res.，15(5)671-9 (1998)及 in Eastman，et al·，Hum. Gene Ther.， 8(6)··765-73 (I997)，其内容已完全納入此中爲參考。一般而言，FSP在標的組織中之表現水平，大體上相當於此中所述之FSP量，以直接納入本發明之乾粉中；此表現水平就特性上而言相當於FSP之治療上有效劑量。納入本發明乾粉中，以達到欲求表現水平之核酸構體代表性用量，述於 Eljamal.，M·，et al·，ibid。賦形齊j及其他添力口物在本發明之散劑中，FSP通常混合以一種以上適於經呼吸及肺部投予之藥學賦形劑。此賦形劑當欲減低活性作用物在粉末中之濃度時，其可單純地充作膨脹劑，以可遞送至病人。賦形劑也可用來改進粉末在散劑分散裝置内之分散力，以使活性作用物有更有效率及可再現之遞送，並政善活性作用物之處理特性（如流動力及一致性）以助製造及 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） n f— ϋ n n f— 0m— n ϋ n n an n n 一口> a 1 mmee ϋ (請先閱讀背面之注意事項再壤寫本頁) 考 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（28 ) 散劑充填至單位劑型中。特言之，賦形劑可作用以改進 FSP之物理及化學穩定性，將殘留水汽減至最少，以及可調控粒子大小，集聚程度，粒子表面特性（即縐紋），吸入之難易性，及生成粒子對肺深部之對準程度。另外，FSP可調和成基本上純淨型式，其中組成物中所含之FSP粒子均在要求之粒子範圍内，且實質上無其他具生物活性之組份，藥學賦形劑等。可用於本組成物内之藥用賦形劑及添加物，包括下列但亦不限於此：蛋白質，肽類，胺基酸，脂質及碳水化合物 (如糖類，包括單醣，二，三，四及寡醣；衍生化之糖類如醛醇，醛糖酸，酯化糖類等；及多醣或糖聚合物，如 Ficolls)，其可單獨或組合地存在。較佳之賦形劑爲可溶於水（如糖類，肽，胺基酸及鹽類），醇（如果膠，卵磷月旨，普維酮）或丙酮（如檸檬酸，PLGA)。同時較佳者爲具玻璃轉化溫度（Tg)在35 °C以上者，較好在約45 X：以上，又更好在約55 X：以上。適用於本發明FSP乾粉中之示範賦形劑包括揭示於 Inhale Therapeutic Systems’ International Patent Application No. WO98/16207。供示範之蛋白質賦形劑包括血清白蛋白，如人類血清白蛋白（HSA)，重組體人類白蛋白（rHA)，明膠，酪蛋白，血紅蛋白，等，但亦不限於此。適用於本發明乾粉組成物之多肽及蛋白質提供於 Inhale Therapeutic Systems’ International Patent Publication No. WO96/32096。HSA 是較佳之蛋白質賦形劑，且已示出可增加乾粉之可分散力以供氣霧化遞送至 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -1----^-------裝 -------訂—------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、II明說明（29 ) 肺（WO 96/32096，上文）。可視所需在缓衝能力上有所作用之代表性胺基酸/多肽組份包括丙胺酸，甘胺酸，精胺酸，甜菜驗，組胺酸，穀胺酸，天冬胺酸，半胱胺酸，賴胺酸，白胺酸，異白胺酸，顯胺酸，甲硫胺酸，苯丙胺酸，天冬醯胺，蘇胺酸，赂胺酸，色胺酸等。較佳者爲可作用如分散劑之胺基酸及肽類。屬於此類型之胺基酸包括疏水性胺表酸，如白胺酸 (leu) ’纈胺酸（vai)，異白胺酸（is〇leu)，正白胺酸（…），色胺酸（try) ’丙胺酸（aia)，甲硫胺酸（met)，苯丙胺酸（phe)，酪胺酸（tyr)，組胺酸(his)及脯胺酸（pr〇)。白胺酸爲特佳。白胺酸’當用於此處所述之調和物中包括D_白胺酸，白胺酸，及外消旋型白胺酸。示範之FSp乾粉含有白胺酸表π於實例11 。可用於本發明之加強分散力之肽包括疏水性胺基酸組份之二聚，三聚，四聚及五聚物，如二白胺酸三白胺酸等。通用於本發明之碳水化合物賦形劑排除松三糖，包括有如單醣’ ％果糖，麥芽糖，半乳糖，葡萄糖，d_甘露糖’山梨糖等；二醣類如乳糖，蔗糖，海藻糖，纖維二糖，等；多醣如鼠李糖，麥芽糖糊精，右旋糖，澱糖等；及酸醇類，如甘露醇，木糖醇，乳糖醇，山_(甘醇），肌醇等。可用於本發明之較佳的碳水化合物賦形劑爲甘露 %二母深糖及鼠李糖。依據本發明較佳之散劑組成物爲在下可穩定者，且特別是在無«及讀酸之組合下德疋者。 •32. i---.------_ 裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n n 1 ϋ ^ι^σϋ> 1 n an n 1 考辑張尺度適财“祕+ (CNS)A4規格⑵〇- 297公釐） 1277425 A7 五'1明說明（3〇 ) 乾粉組成物也包括緩衝物質或pH_調整劑。典型而言，緩衝物質是由有機酸或鹼製成之鹽。具代表性之缓衝物質包括檸檬酸，抗壞血酸，葡萄糖酸，碳酸，酒石酸，丁二酸，酷酸或S太酸之鹽，及Tris，胺基丁三醇鹽酸鹽，或磷酸鹽緩衝物質。較佳者爲有機酸如檸檬酸鹽。另外，本發明之FSP乾粉可包括聚合的賦形劑，如聚乙烯吡咯啶酮，Ficolls (聚合糖類），羥乙基澱粉，葡聚糖，多胺基酸（如多白胺酸，多穀胺酸），及/或聚乙二醇，其中此聚合物以添加物而非包膠劑型式存在。乾粉也可含有芳香劑，抗菌劑，甜味劑，抗氧化劑，抗拮劑，固醇類（如膽固醇）及嵌合劑（如EDTA)。其他可用於Fsp組成物之藥用賦形劑及/或添加物列於·· Remingt(m，丁以 Science & practice of Pharmacy，_ ed，（1995)，及

Desk Reference，52-i ed，（1"8)，其揭示已列爲本案參考。和先前所報告的乾粉不同，其當缺少一種以上的加強劑化合物時，會不易吸收至肺血管内及進入全身循環 [BaCkStr〇m，etal.，U.S.PatentNo.5，128,453，1992 年7月 7 日]，本發明的乾粉令人驚訝地可經由肺充份吸收，且勿需添加吸收加強劑。此可由此中提出之生物利用率數據來證知，如於實例10及17。因此，本發明之乾粉較好無典型的加強劑化合物，如界面活性劑（如脂肪酸之鹽類），膽鹽，烷基糖甞，環糊精，及磷脂類，或若此化合物存在，其通常以極低濃度·相對於FSp而言少於約2〇%存在，且較好相較於FSP少於約15%_1〇0/〇 •如此其不致作用至有顯 33 本紙張尺度適用中國國家標準 L----„------裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n ϋ 含σ 嫌· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（31 ) 著加強之吸收作用。較佳的載劑或賦形劑爲碳水化合物（如糖類及醛醇）及緩衝物質（如檸檬酸鹽）或聚合劑，視所需組合以胺基酸或二或三肽。依據本發明，由賦形劑及蛋白質組成之固態基質，可對 FSP傳達穩定環境，且可視所需有助組成物之分散。穩定基質可爲結晶，無晶形玻璃，或二型式之混合。較佳之組成物，不論其晶體百分率如何，爲隨時間變化仍穩定者。最適合的是實質上無晶形（玻璃）或實質上爲結晶形之乾粉調和物（即，在調節含於粉末中之FSP含量後，結晶至最大之可能程度，因爲FSH並不結晶）。通常，較佳之散劑爲實質地晶體，如FSP散劑L2017 (實例6C)，即51-99% 結晶，60%-95%結晶，65%-90%結晶，或其任何範圍或其中數値，或實質地無晶形玻璃，如散劑L2010及L2018 (實例6C )，即固體中至少70%是無晶形玻璃，較好至少約75%是無晶形玻璃，且較好至少約85%是無晶形玻璃。對於實質上無晶形之FSP乾粉調和物而言，較佳者爲玻璃態化溫度（Tg)在約30 °C以上之調和物，較好約40 °C以上，又較好在約60 °C以上。代表性FSP乾粉組成物之玻璃態化溫度示於表6 (實例6B )。如此中所示數値，對於已決定其Tg値之組成物而言，每批中有22個調和物可呈現30 °C以上之Tg値，而每批中有19個調和物Tg値在60 °C以上。Tg値在60 °C以上之調和物包括：L2001 ， L2004 ，L2006 ，L2008 ，L2009 ，L2010 ，L2012 ， -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂---- 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、明說明（32 ) L2013，L2014，L2016，L2020 及 L2018。對實質上無晶形散劑而言之較佳貯存溫度爲至少約10 °c低於其Tg，如 Inhale Therapeutic Systems' International Patent Publication WO 98/16205 所示。含於乾粉調和物中之FSP，其中的含量足以形成藥理學上有效之劑量，此係指以吸入肺部方式投予。本發明的乾粉通常含有約0.1%按重計至約99.9%按重計之FSP，通常由約0.5-80%按重計FSP，且較好是由約1至75%按重計之FSP。較佳之組成物含有由約1.5-70% FSP ，且較好由約12-60%按重計之FSP，依含於調和物中FSP之比活性及治療型式而定（即生殖力治療或排卵謗導對試管内授精或過度排卵治療）。相當的，賦形劑含量範圍由約99.9-0.1% 按重計，且通常由約99.50%-20%按重計，且較好由約99%_ 25%按重計。較佳的組成物含有由約98.5-30%按重計之賦形劑，且較好是由約88-40%按重計賦形劑。在本發明的一個較佳具體實例中，乾粉含有約5%按重計的FSP 。在另一個具體實例中，乾粉含有約15%按重計之FSP。供經肺遞送的代表性FSP乾粉組成物，示於實例2及 11中。可由實例2表1中看出，含有FSP及賦形劑各種組合及相對含量之組成物，可生成有良好粒子大小特色之粉末（所有的粉末具有少於3.5微米之MMDs，而80%的粉末具有少於1.5微米之MMDs)，且其在粉末製造下之FSP高度聚集物形成上可呈現最少的變化（實例3 )。實例3中詳述之發現提供本發明FSP組成物另一驚人特色，即其有穩 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 —訂—------ 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（33 ) 定單體FSP之能力，以拮抗在粉末製造及處理過程中較高度聚集物之形成。此點十分重要，因爲FSP較高度聚集物之形成可危及其生物活性，此乃因破壞受體結合之故，其接著可再減低所生成粉末之效力。製備FSP乾粉乾粉FSP調和物之製備較好是在條件下行噴灑乾燥，如此可生成實質上無晶形玻璃狀或實質上晶狀之如上述的生物活性粉末。含FSP溶液調和物之噴灑乾燥可如：Spray Drying Handbook，5th ed·，(1991)，及 Platz，R'，et al·， International Patent Publication No. WO 97/41833，1997 年 11 月13日所述地進行。爲製備噴灑乾燥之FSP溶液，FSP通常溶於生理上可接受之水性緩衝溶液中，如擰檬酸鹽缓衝溶液或擰檬酸鹽甘胺酸緩衝溶液，通常具有約2至9之pH値。預乾燥溶液. 之pH値範圍通常維持在約4及10之間，以近中性之pH 値爲較佳，因爲此pH値有助維持粉末在溶解於肺後之生物活性或生理相容性。水性調和物可視所需含有額外的水可相容的溶劑，如醇等。具代表性的醇包括甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇等。FSP溶液通常含有FSP ，濃度由0.01% (w/v)至約 10% (w/v)，通常由 0·1%-1% (w/v)。再回至實例1所提供之結果，可看出FSP代表性溶液調和物，在噴灑乾燥前於貯放數天後其生物活性並無可察知之降低，且在冷凍-解凍循環後，顯示此溶液劑調和物之高度穩定性。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂----- 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、ΊΙ明說明（34 ) 含有FSP之溶液再於傳統的喷灑乾燥機中喷灑乾燥，如由廒商所得的，如 Niro A/S (Denmark)，Buchi (Switzerland) 等，可生成穩定性的FSP乾粉。噴灑乾燥FSP溶液之最佳條件，可依調和物組份而定，且可由實驗來決定。用來噴灑乾燥物質之氣體通常是空氣，然而惰性氣體如氮或氬也適合。再者，用來乾燥已噴灑物質之氣體之出入口溫度是如此，以致不會造成已噴灑物質中FSP之失去活性。此溫度通常由實驗來決定，然而大體上來説，入口溫度通常在由約50 °C至約200 °C，而出口溫度由約30 °C至約150 °C。另外，FSP乾粉之製備可先乾燥含有FSP及賦形劑之溶液，可利用冷凍乾燥，眞空乾燥，噴灑冷凍乾燥，超級臨界流體處理修飾，或其他蒸發乾燥型式，且可再進一步處理乾物質，以得具適於投予至肺深處之氣霧劑特性及可接受ED之FSP乾粉，如利用拌合，輾磨或噴射研磨欲求調和物。在某些例子中，可處理FSP乾粉調和物便有改進的處理/修飾特性，如減少之位阻/更佳之流動力，較低結塊現象等，即製備由細碎粒子聚集物組成之組成物，即上述 FSP乾粉粒子之聚集物或附聚物，其中聚集物可容易地瓦解成細碎粉末組份，如 Johnson，et al·，U.S. Patent No. 5,654,007 ， 1997年8月5曰，已納爲本案參考。另外，

FSP粉末之製備也可由聚集粉末組份，過篩物質以得聚集物，成圓球化以生成較具球形之聚集物，並篩選以得均勻大小之產物，如 Ahlneck，C.; et al·，International PCT -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 · n ϋ 言 1277425 A7 五、_麥明說明（35

Publication No· W〇95/096l6，1995 年 4 月 13 日所述，其已列為本案參考。本發明之FSP乾粉，也可由拌合，輾磨或噴射研磨調和物組份或乾粉型式而製成。FSP乾粉在製造，處理及貯存中較好維持在乾燥（即相當低溫度下）條件下。 *、估不論所應用的乾燥過程，此過程較好可生成由Fsp組成I粒子呈半聚集型，或具有較高度聚集物形成程度，其實質上與在預乾燥物質中所見的未改變，如實例3中所説明的。再者，適合製備本發明FSP調和物之過程，爲其中 FSP之生物活性不致有害地受影響，即，所生成粉木之生物活性減低不致超過40_50%，較好不超過约3〇_4〇%，且較好不超過15-30%，與乾燥/篩選前FSp調和物之生物活性比較而言。一旦乾燥其生物活性無顯著喪失之Fsp乾粉實例述於實例8。只例2，且特別是表1，爲本發明組成物之實例。如所見的，FSP乾粉可以高產率獲得，通常在約7〇及 80/〇之間，説明了有能力再現地製備大量適於經肺遞送之 FSP乾粉。再者，FS：p唾液酸化程度示己出不爲喷灑乾燥所影響（實例5 )，説明FSP在傳統噴灑條件下之化學穩定性。此點十分重要，因爲FSP生物活性半衰期之延長乃是其寡醣含量之結果；FSP無唾液酸糖蛋白（即除去唾液酸之蛋白質）可爲肝所快速清除。 gg p 之特色本發明之；FSP粉末可進一步由以下特色鑑定之，最重要 •38- 本紙張尺度適用國家標準（CNS)A4規格（21G x 297公釐） -----^-------裝 (請先閱讀背面之注意事項再壤寫本頁) —-------- 1277425

五’¥明說明（36 的是粉末穿透下呼吸道組織之能力（即肺泡）以可再進入血液中(如見實你]10118)。頃發現，FSP乾粉的某些物理特性’以了更詳細描⑨，可使此粉末經氣霧化遞送至肺深部之效率更臻完善上十分重要。卿乾粉由可有效穿透入肺泡之粉子所组成，即質量中間直徑（MMD)由约01至微米者。典型而言，粒子之MMD少於約10微米（如由約 0.1至10微米），較好少於約7 5微米（如由約〇 5至7微米）且最好少於約5微米，且通常在由〇」微米至5微米直徑。較佳的粉末由MMD由約i至3·5微米之粒子所組成。已製成可呼吸之FSP粉末許多實例，其中含有各種濃度的活性作用物及賦形劑，並由在較佳大小範圍内之粒子所組成（表1，第10欄，實例2)。在某些例子中，Fsp粉末含有不可呼吸之載劑粒子，如乳糖，其中不可呼吸之粒子通常大小大於約4〇微米。本發明的FSP粉末，可由氣霧粒子大小分佈少於約1〇微米質量中間氣霧動力學直徑（MMAD)來鑑定，且較好少於5微米，且較好少於約3 5微米。粉末之質量中間氣霧動力學直徑型是由約0 5—5 〇微米，較好是由約L〇_4 〇微米MMAD，又較好由約1.5-3.5微米MMAD，甚至是約1 5 至3.0微米。爲進一步説明製備氣霧粒子大小分佈在適於經肺投藥範圍内之FSP粉末之能力，在表8 (實例7 )及表 16 (實例11 )中均有説明具少於約5微米MMAD，更好是少於3.5微米MMAD之粒子所組成之FSP乾粉。在另一方面，FSP乾粉可以約1%至60%間之相對肺生 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再泉寫本頁) 裝訂— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五明說明（37 ) 物利用率來鑑定。本發明粉末之相對肺生物利用率通常落在以下範圍内··約 1-60%，1-30%，5-30%，10-30%，15-30%， 15-25%，20-25%， 1-20%，2-20% ^ 3-20% ^ 4- 20%，1-15%，1_10%，2_10%，3_10%，及 4-10%之間。 FSP乾粉之水汽含量通常在約10%按重計以下，通常少於5%，且較好少於約3%按重計。此含低水汽之固體粒子對蛋白質之降解呈現減低之傾向。具代表性之FSP乾粉，其水汽含量示於實例6B，表6。這些粉末之遞送劑量效率（DDE)通常大於3〇%，且較好大於40%。較好，本發明FSP散劑之DDE大於50%，且較常是大於60%。較佳者是DDE値大於70%之粉末，甚至大於75%。在檢視實例7，表7及實例11，表14及I5 中，可看出本申請人已成功地製備大量具代表性的FSP乾粉，其中DDE値大於或等於50%。可呈現且維持特別良好粉末分散力之調和物，由其DDE値示出，包括有·· L2001 ，L2005 ，L2006 ，L2008 ，L2010 ，L2012 ， L2014，L2016，L2017，L2018 及 L2020，其組成示於表 6 ，以及 99348 ，99349 ，99423 ，99425 ，99426 ， 99455 ， 99454 ，及 99457 (表 14 ， 15)。本發明FSP粉末通常具有由約0.10至10克/cc之鬆密度範圍，較好是由約0.15至5克/cc，又較好是由約0.17至 1克/ cc，且最好是由約0.2-0.75克/ cc。

本發明的粉末具有大範圍的比生物活性値，此依含於粉末中FSP型式而定（如含有FSP及其他相對於高純化FSP -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五、11明說明（38 ) 蛋白質之不純的FSP混合物）。本發明之粉末每克粉末通常具有大於100 IU之比生物活性。在大多數例子中，粉末之比生物活性落在下列一個以上之範圍内··每克粉末大於 250 IU，每克粉末大於500 IU，每克粉末大於1000 IU，每克粉末大於2000 IU，每克粉末大於5000 IU，每克粉末大於10,000 IU，每克粉末大於25,000 IU，每克粉末大於 50.000 IU ，每克粉末大於100,000 IU ，每克粉末大於 250.000 IU ，每克粉末大於500,000 IU ，每克粉末大於 1.000. 000 IU，每克粉末大於2,500,000 IU，每克粉末大於 5.000. 000 IU，或每克粉末大於 10,000,000 IU。鑑定於乾粉整體氣霧劑性能的另外的測度法是氣霧劑性能係數（APC)。此中所述的FSP粉末APC値大於0.1 ，通常大於0.15，且較好大於0.25。由表8及14所示之APC 値中可看出，已製備FSP乾粉其特別適於經肺遞送，可由大於0.25之APC値證知。此粉末含有大比例的小氣霧劑粒子大小，因此當以氣霧劑型式遞送時極爲有效，其⑴可到達肺之肺泡區域，繼以（ii)擴散至間質，及（iii)再經由内皮通入血流内。 FSP組成物之經肺投藥此處所述之FSP乾粉調和物，可利用任何適合的乾粉吸入器（DPI)遞送，即利用病人吸入之氣息爲溶媒將乾粉運送至肺部之裝置。較佳的是Inhale Therapeutic Systems’乾粉吸入裝置，如下列所述：？冱1:1:〇11，]\8.，€1丑1.，11.8.?3{61^1^〇· 5,458，135 ，1995 年 10 月 17 日，Smith，A· E·，et al·，U.S· -41- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ί---^-------裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

In mmmMm ammmmmm I 一. 口 T i n ΛβΜΜβ 0M/ HI imm— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、$明說明（39 ) PatentNo. 5,740,794，1998 年 4 月 21 日；及 Smith，A. E.， et. al·，U.S. Patent No. 5,785,049 ，1998 年 7 月 28 日.，在此已列爲本案參考。當利用此型式之裝置投藥時，粉末狀藥物含於有可穿刺外緣或其他輔助表面之容器内，較好是發泡膏包裝或筒匣，其中容器中可含有單一劑型單位或多重劑量單位。將乾粉藥物計量過之劑量充填至大容器内之合宜方法（即單位劑量包裝）述於如Parks，D. J·，et al.， International Patent Publication WO 97/41031，1997 年 11 月 6 曰，已列爲本案參考。適於遞送此中所述之FSP粉末之裝置包括下述型式之乾粉吸入器，如：Cocozza，S.，etal.，U.S.PatentNo· 3,906,950 ， 1974 年 9 月 23 日，及 Cocozza，S·，et al·，U.S. Patent No. 4,013,075 ， 1977年3月22日，已列爲本案參考，其中遞送至個體之FSP乾粉預測知劑量，含於硬明膠膠囊中。經肺遞送FSP乾粉之其他乾粉分散裝置，如下列所述： Newell，R. E·，et al，歐洲專利案 No. EP 129985，1988 年 9 月 7 日；Hodson，P. D·，et al.，歐洲專利案 No. EP 472598 ， 1996 年 7 月 3 日；Cocozza，S.，et al.，歐洲專利案 No· EP 467172，1994 年 4 月 6 日；及 Lloyd，L.J. et al·，U.S. Patent No· 5,522,385，1"6年6月4日；已列爲本案參考。遞送本發明FSP乾粉的其他適合的裝置爲吸入裝置，MAstra-Draco "TURBUHALER，’。此型裝置詳述於 Virtanen，R.，U.S· Patent No. 4,668,218，1987 年 5 月 26 日；Wetterlin，K·，et -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂---- 聲 1277425 A7 B7 五、1明說明（4G ) al.，U.S. Patent No. 4,667,668 ， 1987 年 5 月 26 日；及

Wetterlin，K·，et al·，U.S· Patent No. 4,805,811 ，1989 年 2 月 21日，以上均全部列爲本案參考。其他適合的裝置包括乾粉吸入器，如 Rotahaler® (Glaxo)， Discus②（Glaxo)， Spiros™ 吸入器(Dura Pharmaceuticals)，及 Spinhaler® (Fisons)。同樣適合的裝置包括應用活塞提供空氣者，其或可截留粉末狀藥物，使空氣經由網篩可將藥物自載劑篩中提出，或將空氣與粉末狀藥物混合在混合室中，再經由裝置口氣將粉末引至病人，WMulhauser，P.，etal.，U.S· Patent No· 5,388p72，1997年9月30日所述，已列爲本案參考。 FSP乾粉也可利用加壓，計量之吸入器（MDI)來遞送，如Ventolin®計量吸入器，含有藥物於藥學上惰性液體推進劑之溶液或懸液，如氯氟碳或氟碳，MLaube，etal.，U.S. Patent No. 5,320,094，1994 年 6 月 14 日，及 Rubsamen，R.M.， et al·，U.S. Patent No· 5,672,581 (1994)所述，二者均列爲本案參考。當以計量之吸入器投予時，FSP組成物較好缺少界面活性劑（如脂肪酸，膽鹽，磷脂，或烷基醣類）以加強 FSP之全身吸收，因爲當投予本發明組成物時，此化合物對FSP在血流中達到治療水平是不必要的。另外，此中所述之粉末可溶解或懸浮在溶劑中，如水或食鹽水，並以噴霧方式投藥。遞送氣霧化溶液之噴霧器包括 AERx™ (Aradigm)，Ultravent® (Mallinkrodt)及 Acorn II® (Marquest Medical Products) ° -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11裝--------訂--- 奢· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7

纟使用前，FSP乾粉通常野於環境溫度下，且貯存溫度較好是約25 1或以下，相對濕度（RH)在約3〇_6〇%之間。如少於約鳩之較佳相對濕度條件，可由劑量之二次包裝中納入乾燥劑來達成。本發明之Fsp粉末，在貯存後生物活性並無顯著的喪失；再者’在三個代表性乾粉調和物 (實例7C，表9及圖…斤進行之提升穩定性研究中説明，製備可吸入FSP乾粉之能力，其特性不僅在良好的氣霧劑性能上，也在有良好的穩定性上。再者，在大鼠中鞘内投予FSP溶液（實例9)及在猴子之肺部投予在Fsp粉末 (實例10及18)的二個初步試管内結果也顯示有相當高的生物利用率數値，即相較於皮下投予FSp有由純5%_ | 20%，及由18%-26%，進一步顯示經肺部投予本發明乾粉在治療不孕症上之可行性。治療應用本發明之FSP乾粉，當以吸入方式貯積及吸收自肺部，在治療有效劑量下投予對治療男性及女性不孕症上是有用的。較特別地，本發明方法特別可用於缺乏或無法自水平中獲益之患者之治療性應用，其中所指之FSP水平係較内源產生的還要多之水平。當以乾粉型式吸入肺深部時，在FSP可有效地刺激並無初步即巢官能障礙婦女之卵巢濾泡之生長。在FSp經肺遞送後’血漿中抑制素水平之偵測可用以提供FSP活性之藥 | 物動力學標幟。濾泡生長程度（濾泡直徑大於約1〇毫米之數目（如可以超晋波來決定）及雌激素之分泌（即血清雌激 I - 44 · 二：張尺度適种而家標準（CNS1A4規格⑽X 297公P ----

-----------#裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂--- 1277425

五、_發明說明（42 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製素水平）也可用來評估FSP之作用；在男性，足細胞 (erotoh細胞）產製之水平，也可對治療效力提供額外之指標。較好，此中所述FSP乾粉調和物之經肺遞送，可有、一成上述一種以上標幟水平（濾泡生長，血清雌激素抑制素，足細胞之產製），此係與投予FSP前之基線水平比較而言。本發明心FSP粉末，當投予至肺深部，也可用於輔助生殖技術（ART)。在此例子中，係將FSp投予至排卵方面不孕之婦女，其則正進行多重濾泡發展之刺激，以行試管内授精（IVF)，胚胎轉移（ET)及其他輔助生殖技術。一般而呂，在應用於與女性不孕有關之狀況中，FSp投予至肺深 P進行/人以上歷7至21天時期之治療循環，以刺激濾泡生長。在不孕症女性中，爲了達成濾泡的最終成熟及無 LH (促頁組生成激素）手術下之排卵，則於濾泡發展已充份後，投予人類絨毛膜促性腺激素（hCG)(如上述）。當用於治療男性不孕時，FSP乾粉之投予通常至少約6個月，且典型是至少約一年。典型而言’上述狀況之治療通常由投予治療有效劑量之 FSP乾粉而達成，其平均範園爲至少每天每公斤體重由〇.5_35微克FSP，且較好每天每公斤體重至少約1至2〇微克FSP，依含於組成物中Fsp比活性而定。適合的劑型爲醫務人員已知的，且當然依特殊的疾病狀況，所投予組成物之比活性，及進行治療之特殊病人而定。例如，每單位劑量投予之FSP通常在約5 IU至約12,000 IU，較好是5 -45- 本紙張尺度適財_家標準（CNS)A4規格（210 x 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 * 11111

n H I 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（43 ) IU至約1000 RJ FSP，較好由約37 IU至500 IU，甚至更好是由約50 IU至約300 IU FSP 。較好，平均而言之治療有效劑量範圍由約10至1〇〇〇 IU ISP /每天，50至3000 RJ FSP /每天，75 ITJ至約600 IU FSP /每天，或由約200 IU至 12,000 IUFSP/每天，依個體依循之療程（即24小時以上期間所遞送之氣霧化劑量）及治療型式而定。在某些例子中，爲達到欲求之治療劑量，有必要提供每天重複投藥，即每天重複吸入個別的特殊計量劑量，其中個別投藥重複進行直到達到欲求之每天劑量爲止。以下實例説明本發明範圍，但不欲以任何方式限制。所有的文件，書目，專利及其他刊物參考於此乃以全文列爲本案參考用。實例材料及方法材料 uFSH-以衍生自人類尿液之FSH (uFSH)，爲某些實驗中 FSP之來源。在製備調和物溶液前，經冷凍乾燥之uFSH 粉末（Vitro Diagnostics，Inc·，Boulder，CO)通常重組成 5 毫克 / 毫升。最初之調和物（散劑批號No· R98025-R98054 )直接製備自出售之uFSH。調和物R98067至R98112由以超過濾進一步純化（Centricon 10，10 kD分子量截去値）之uFSH所製備，其中移去存在於商品中之殘留的碳酸氫銨。去鹽化係糖蛋白之完整性以SE-HPLC證實，再以UV來決定所回收之糖蛋白百分率。留下來的溶液在4 °C下一夜以進行溶 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂------ 1277425 A7 B7 五、明說明（44) 液穩定性測試，且經3個冷凍-解凍循環。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 賦形劑-賦形劑如下得自商業來源··甘露醇（Mallinckrodt Specialty Chemical 10·，Paris，Kentucky; U.S.P; FW 180)，擰檬酸鈉· 2 H20 (J.T·，Baker Inc·，Phillipsburg，NJ; U.S.P; FW 294.1)，檸檬酸· H20 (J.T. Baker，Phillipsburg，NJ; U.S.P; FW 210.14)，蔑糖（EM Science，Gibbstown，NJ; FW 342.2)，鼠李糖· 5H；2〇 (Pfanstiehl Lab·，Inc.，Waukegan，IL; FW 594.5)，甘胺酸（J.T· Baker，Inc.，Phillipsburg，NJ; FW 75.07)，海藻糖。 2H20 (Pfanstiehl Lab·，Inc·，Waukegan，IL; FW 350.3)，白胺酸 (Sigma，St. Loius，MO)。

灌注用無菌水（USP)可用於製備調和物溶液及重組uFSH 藥物。方法光譜學_。貯液uFSH溶液，預噴灑乾燥溶液，及重組之粉末，其濃度利用紫外光/可見光（UV/Vis)分光光度測定法來決定。將樣品溶液稀釋至吸光度值介於0.1-1.5單位之間（276毫米下）。以400毫微米下之溶液混濁度作為不溶粒子/聚集物形成之測度。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製粒子大小偵測。粉末之質量中間直徑（MMD)利用 Horiba CAPA-700 粒子大小分析儀貞測（Horiba Instruments inc·，Irvine， CA)。測度之依據是懸浮介質中分散粒子之離心沈降。質量中間直徑，此乃以粒子之Stokes’直徑為準，利用粒子密度及懸浮介質之密度及黏度來估計。粉末之密度全訂在 1.5克/公分3。（此通稱值用於所有欲分析之粉末，且在噴 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1277425 A7 --------— B7_ · 五、飞明說明（45 ) —" 〜麗乾燥粉末典型的範圍内）。粒子大小偵測係以約5·10毫克勃末心浮在 5 笔升 Sedisperse A-ll (Micromeritics，Norcross， ga) ’再以骨波振盥10分鐘分散之。將範圍定在〇心1〇〇微米，超越此値則集合粒子大小資料。噴灑乾燥粉末之熱行爲（2·10亳克於密封之鋁鍋中）以ΤΑ調控之差示掃描熱量計292〇分析。典型而言，樣品在_6〇 Ό下平衡1〇分鐘，再於沁蒸汽下以2。(：/分加熱至200 Ό。調控幅度是±1 t*±〇.3%，且足在60秒，其中在轉位過程中可歷至少四個循環。儀器以In針對溫度及熱容量校正之。在樣品測試前先進行基線抑^描。主式壓縮;^。使用安德森階式壓縮機（一種類似篩子疋裝置，有一系列捕獲粒子之階段，係依大小以慣性壓縮收集）來決定氣霧化粉末調和物在氣流中之MMAD及粒子大小分佈。盤子在測試前及後稱重，並決定盤子在各階段時所沈積之粉末質量。除非另有所示，研究中利用傳統的安德森階式壓縮機進行，其中有8個階段截去値範圍由9.0-0.4微米，且最終的過濾階段當在28·3升/分流速下操作時，可截獲<0.4微米之粒子。裝置測試之组裝類似· DDE試驗，除了階式壓縮機及USP (United States Pharmacop0eia，USP 23, chapter <601>)係黏附附至裝置之口部而非至濾器。多個分散液通常針對各階式壓縮流程進行，以達到比重方面正確數據，如2〇 Fsp-充滿之發泡膏包裝。 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） '_一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂--- #· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 —_— Β7 _ 五、$明說明（46 ) 安錾在ss方法中（用來決定 APCO，各階段安排之次序係由上述之傳㈣德森階式壓縮器改變而來。由上方開始，0階段中之入口角度係用連接至喉嘴。接下去是階段3 ，在階段〇下方，之後是過濾階段（階段F )。含有粉末之氣流僅通過階段〇及3 ;空氣（但非粉末）則流經其他階段，其在階段F下使組合的其餘部份可保持定位。預稱重之濾膜置於階段F，且可捕獲 <3·3微米之粒子。第二組濾膜置於階段3下之倒轉盤，並可捕獲>3.3微米之粒子。關於此中所述之研究，一個Βρ (發泡膏包裝）含有2耄克FS粉末組成物，分散在氣霧劑遞送裝置中’在每個USP測定下將眞空推至28·3升/分。此過程重複二次，每流程之標的質量爲6毫克。再放出濾膜並稱重，以決定所沈積之粉末含量。實例1 uFSH之調和前評估：藥物特性之鐘定進行調和前活性評估以鑑定藥物特性，及評估樣品在分析前貯存下之穩定性。調和前之活性包括評估糖蛋白對冷凍-解凍循環之穩定性，對表面之吸附，溶解度，及⑴經重組之大團uFSH物質，（ii)經調和之uFsh在溶液中（預噴灑乾燥），及（iii)經重組之uFSH粉末溶液，之溶液穩定性。預噴灑乾燥溶液（如表1所示）之pH値範圍維持在5 及8之間。此pH値範圍受檢視，以追踪pH値對於糖蛋白穩定性及固態特性上之影響。選用中性pH値以在粉末溶解在肺内後有助維持生理相容性。初步結果顯示當貯於4 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i丨丨-i丨丨丨丨丨I 裝· -------訂-------丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、^明說明（47 ) °Ct 4至7天，或當貯於環境溫度下i天，或在重複冷凍 -解凍循環後，所有經調和之UFSH溶液均可達穩定.。初步數據顯示，糖蛋白吸附至矽管上之流失可減至最小。前2 毫升之175微克/毫升uFSH調和物溶液，可造成有1〇微克的uFSH可吸附至Buchi噴灑乾燥器所用的試管上（2米 x 4.6毫米内徑）。在接下來之分裝中uFSH並無進一步的流失〇實例2 製備具代表性之uFSH溶液調和物及製備供經肺遞送之粉末製備調和物溶液，其中固體粒子總含量爲0.5% (w/v)。決足各溶液之pH値’在喷灑乾燥前再檢視澄明度。表1 列出所有預噴灑乾燥溶液之組成。甘露醇除非另有所示是糖源。粉末之產生係將uFSH及賦形劑之水溶液，利用裝置有習用噴嘴（如Platz，et al·，1997)及分麈機之Buchi 190微喷灑乾燥器噴灑乾燥而成。典型的調和物係製備自總固體粒子少於300毫克之溶液。可達到高集合效率，通常是介於70-80%之間，生成令人滿意之粉末供應，以可行接續之粉末鑑定。 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -trill· — — ! — I - I - — — — I- (請先閱讀背面之注意事項再赛寫本頁)

ϋ n ί ^ ί 0 1 ϋ ϋ .1_1 ϋ n ·ϋ I 1277425 A7 B7 五、If明說明（48 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表1 :噴灑乾燥溶液及粉末處理結果説明型式 ID. 批號# uFSH1 :糖：擰檬酸鹽 (wt:wt:wt) PH bsd2 pH asd3 產率 (克）產率 (%) MMD4 (微米） - R98023 0:15:85 6.7 6.7 0.15 15 nd - R98024 0:15:85 6.7 6.7 0.17 17 nd L2001 R98025 3.5:15:81 7.7 7.7 0.17 81 0.98 L2002 R980265 3.5:81:15 7.8 7.4 0.03 13 nd L2003 R98027 3.5:48:48 7.9 7.4 0.16 77 1.20 L2004 R98028 3.5:32:64 7.8 7.4 0.16 76 1.00 L2005 R98029 3.5:95:0 7.8 7.3 0.11 50 1.44 L2006 R98030 3.5:15:81 7.0 6.9 0.16 74 1.04 L2006 R98037 3.5:15:81 6.9 6.8 0.17 80 1.38 L2007 R98038 3.5:95:0 (蔗糖） 7.9 7.7 0.18 79 1.10 L2008 R98039 3.5:95:0 (鼠李糖） 7.8 7.6 0.17 74 1.00 L2006 R98040 3.5:15:81 6.8 6.9 0.18 77 1.31 L2010 R98046A 5:15:80 7.0 7.0 0.27 77 1.21 L2010 R98046B 5:15:80 7.0 7.0 0.29 79 0.96 L2011 R98047 5:80:15 7.7 7.4 0.16 45 3.16 L2012 R98048 5:15:80 5.3 5.3 0.27 78 1.20 L2013 R98049 10:14:76 7.4 na 0.27 82 1.08 L2014 R98050 5:31:64 7.1 7.0 0.27 78 0.94 L2015 R98051 5:80:15 6.3 5.8 0.10 29 3.38 -51- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、¥明說明（49 ) L2006 R980521 2 3 4 5 3.5:15:81 6.9 6.9 0.26 75 1.27 L2006 R98053 3.5:15:81 6.9 6.9 0.35 81 1.06 L2016 R98054 5:15:80 7.7 7.4 0.25 81 1.06 L2020 R98067 10:14:76 7.1 7.1 0.19 77 1.10 L2012 R98068 5:15:80 5.1 5.1 0.18 71 1.20 L2016 R98069 5:15:80 7.6 7.5 0.17 69 1.07 L2006 R98070 3.5:15:81 7.0 7.0 0.17 68 1.18 L2010 R98084 5:15:80 7.1 7.1 0.33 77 1.07 L2017 R98085 5:95:0 7.5 7.1 0.25 59 1.59 L2018 R98086 5:95:0 7.4 7.2 0.33 77 0.99 (鼠李糖） L2019 R980875 5:64:31 7.4 7.1 0.07 16 2.66 (鼠李糖） L2010 R98110 5:15:80 6.9 6.9 0.98 81 1.03 L2017 R98111 5:95:0 7.0 6.7 0.80 65 1.44 L2018 R98112 5:95:0 7.2 7.0 0.97 80 0.83 (鼠李糖）卜 — — l·------•-裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1

標的uFSH含量，誤差約土0.2% ; 2噴灑乾燥前溶液之pH 2 値；3重組粉末之pH ; 4以離心沈降法決定（Horiba) ; 5 3 排號排除測試。 _ 4 重組粉末之pH値（噴灑乾燥後，表1 )證明在喷灑乾燥後pH値意外的滑落，尤其在未緩衝之調和物（即無擰檬酸鹽）。此歸因於藥物中碳酸氫銨存在之故。一旦使用經純化之藥物，pH値之滑落可減至最少，且在有緩衝溶液之 -52- 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、1明說明（5G ) 調和物中更不顯著。實例3 喷灑乾燥粉末之化學穩定性評估：經由形成高級聚集體失

去單體uFSH 利用如下述之SE-HPLC (大小排阻之高性能液相層析）評估經調和之uFSH溶液之層析純度及含量。表2 : SE-HPLC變數管柱： TosohaasGW3000XL 或 GW2000XL，5 微米，7.8 X 30 毫米移動相： 0.1M 磷酸鈉/5% IPA，pH 7.5 管柱溫度：環境溫度流速： 0.5毫升/分典型樣品： 3.5-10.0 克偵測： 214毫微米在上示之SE-HPLC條件下，完整的單體單位，其解離的亞單位及較高級之聚集體，分別在18.6分，20.2分及 16.2 分的滯留時間下溶離（GW3000XL 管柱）。在 GW2000XL管柱滯留時間減少。以GW3000XL管柱進行的SE-HPLC方法，其精確性利用 uFSH藥物單一濃度六次重複注射來評估（173克/毫升）。相對之標準偏差在純度及反應因素上分別是〇·〇%及 0.2%。在0.87-17.4克uFSH範圍内評估SE-HPLC方法之線性度。單一濃度之uFSH溶液（173克/毫升）以各種體積注入管柱；各注入體積重複施加。反應顯示出有R2=〇.99999 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -L----^-------裝--------訂--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（51 ) 之線性度。在層析方面，α及β亞單位可共同溶離，且未自· uFSH 單體中充份解析。解析概況維持在1克及1〇克填料之間。因此，將單體及亞單位峰之組合峰面積積分，可決定出uFSH之含量。較高級之聚集體自單體中有較佳之解析，且分別予以積分。總而言之，此方法僅利用來顯示經由較高級聚集體之形成，uFSH單體之流失。 l·--L-------·-裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表3 :大團；〖分末及噴灑乾燥後之SE-HPLC分析高級uFSH聚集體(按區域計） ID Lot % bsd1 % asd2 改變％ L2001 98025 0.34 1.98 1.64 L2002 98026 0.35 0.65 0.30 L2003 98027 0.32 1.07 0.75 L2004 98028 0.30 1.11 0.81 L2005 98029 0.30 1.50 1.20 L2006 98030 0.28 0.83 0.55 L2006 98037 0.35 0.49 0.14 L2007 98038 0.31 0.36 0.05 L2008 98039 0.18 0.23 0.05 L2009 98040 0.20 0.37 0.17 L2010 98046a 0.61 2.20 1.59 L2010 98046b 0.61 6.72 6.11 L2011 98047 0.56 0.98 0.42 L2012 98048 0.64 1.88 1.24 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、！明說明（52 ) L2013 98049 0.69 1.03 0.34 L2014 98050 0.54 1.07 0.53 L2015 98051 0.60 1.77 1.17 L2006 98052 0.48 1.22 0.74 L2006 98053 0.55 1.13 0.58 L2016 98054 0.55 1.88 1.33 L2020 98067 0.70 1.23 0.53 L2012 98068 0.58 1.08 0.50 L2016 98069 0.70 1.25 0.55 L2006 98070 0.68 1.50 0.82 L2010 98084 0.43 1.02 0.59 L2017 98085 0.49 0.51 0.02 L2018 98086 0.37 0.52 0.15 L2019 98087 0.44 0.54 0.10 L2010 98110 0.82 1.68 0.86 L2017 98111 0.78 1.01 0.23 L2018 98112 0.80 0.78 -0.02 噴灑乾燥 ;2asd= :噴灑乾燥後上表3综合高級聚集體百分變化，其係在喷灑乾燥中發生的。高級聚集體以雜質型式存在於大量藥物中（<0.8%純度，SE-HPLC )且於噴灑乾燥後略增加。所有的uFSH調和物在噴灑乾燥後，可觀察到高級聚集物之增加少於2%，除了批號R98046b例外，其有6%以上之高級聚集物（且被視爲局外者）。並未觀察到因pH値，或擰檬酸鹽，或 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —r---„-------_ 裝·--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · ϋ 1 言 1277425 A7 B7 五、¥明說明（53 ) uFSH含量使高級聚集物之形成有明顯傾向。實例4 已包裝之噴灑乾燥粉末之一個月及長期的穩定性決定已包裝粉末之眞實時間及加速下之穩定性，依據之基礎乃是最初及一個月時間點之間高級聚集體之變化％ (表4)。粉末以手動方式充填在發泡膏包裝中使達2毫克之總量（BPs)。發泡膏包裝置於巴氏孤中（20-60 BPs / m ) 〇巴氏皿再以加有乾燥劑之箔包覆之。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表4 :以SE-HPLC分析uFSH包裝粉末之穩定性型式/批號(大小）時間點南級1 良集體總量％ (+/_) 變化％ (+/-) 噴灑前 0.68 0.02 na na L2010/R98084 (0.5 克）最初 1.03 0.01 na na 1 個月（40°C) 1.76 0.01 0.74 0.01 噴灑前 0.60 0.02 na na L2017/R98085 (0.5 克）最初 0.55 na na na 1 個月(40〇C) 1.25 0.05 0.70 0.04 噴灑前 0.58 0.00 na na L2018/R98086 (0.5 克）最初 0.65 0.02 na na 1 個月（40°C) 0.69 0.03 0.05 0.03 喷灑前 0.82 0.01 na na L2010/R98110(1.25 克）最初 1.70 0.01 na na 1 個月(30°C) 1.83 0.02 0.16 0.02 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）訂--- # 1277425 A7 B7 五、發明說明（54 ) 1 個月(40°C) 2.27 0.01 0.59 0.02 噴灑前 0.78 0.01 na na L2017/R98111 (1.25 克）最初 1.02 0.05 na na 1 個月（30°C) 1.18 0.07 0.17 0.07 1 個月（40°C) 1.76 0.12 0.74 0.10 噴灑前 0.80 0.01 na na L2018/R98112(1.25 克）最初 0.78 0.02 na na 1個月（30Ό) 0.71 0.08 -0.08 0.10 1 個月(4(TC) 0.85 0.01 0.06 0.02 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝具代表性之包裝調和物，有許多已證明具良好的貯存穩定性。以鼠李糖調和之尿液FSH，在二組條件下均呈現良好的穩定性。甘露醇/擰檬酸鹽及以甘露醇爲基礎之調和物在30 °C下可穩定達1個月，此由高級聚集體不足道的增加所支持（<〇.2%)。高級聚集體在二種調和物中，當溫度增加至40 °C其也隨之增加，經1個月貯存後總變化 <0.8%，顯示甘露醇/檸檬酸鹽及甘露醇調和物均相當穩、定。對某些甘露醇-擰檬酸鹽發泡膏包裝之uFSH粉末（5% uFSH/15%甘露醇/80%擰檬酸鹽·· L2012/粉末批號98048 ; L2010/粉末批號98110)，其長期的穩定性（48-52週）可以 SE-HPLC類似地偵測，係貯於環境溫度及^5%相對濕度下。粉末，L2012 ，明示出噴灑乾燥後最初之高級聚集體水平爲1.8%，52週後實質上並無改變，總高級聚集體爲 1.5%。類似的，粉末L2010之高級聚集體水平，噴灑乾燥 -57 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） tr---------舞經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五、1明說明（55 ) 後最初値爲1.7%，在密封之發泡膏包裝中貯存48週後僅增加2.6%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例5 噴灑乾燥後uFSH唾液酸化之程度由於在uFSH中存在有潛在不穩定之末端唾液酸殘基，利用比色法來檢視噴灑乾燥後uFSH唾液酸化作用之完整性。在進行此方法中，末端的唾液酸在低pH下解離，繼以由銅催化之與間苯二酚之反應。在560毫微米下偵測產物之吸光度，再依據以N-乙醯基神經胺酸（NANA)產生之校正曲線爲準轉化成毫微莫耳唾液酸。對標準品及糖蛋白樣品均進行三次測度。在呈色反應前，將樣品通過NICK 管柱，以自任何自由態唾液酸中分出完整的唾液酸化糖蛋白。以各溶離出之流份應用於反應中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此方法之線性範園可延伸至80毫微莫耳。偵測之下限是2毫微莫耳唾液酸，相當於在3.5% uFSH粉末中偵測1-2%流失之能力。以胎球蛋白爲對照組測試方法之正確性。生成的唾液酸濃度爲380毫微莫耳/毫克蛋白質，此與在胎球蛋白上之範圍廣泛的實驗空間ABRF研究所報告之370±35毫微莫耳/毫克之平均値可充份比得上。（ACS National Meeting，1997 年 4 月）。以比色方法來評估二種uFSH粉末（R98026，R98029)。以2 mM擰檬酸鹽溶液來重組粉末，並自NICK管柱中溶離出經唾液酸化之糖蛋白。二種批號之溶離概圖顯示，在二調和物中均缺乏自由態唾液酸。進行Bradford分析以證實 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、1明說明（56 ) 流份1-3中有蛋白質之存在。由於唾液酸之解離較善在酸性條件下，因此相同的分析法可用來確定唾液酸之解離是否發生在於較低pH値下所製備之調和物。於此分析中，利用到粉末R98046及 R98048。所得之概況和在較高pH値中所觀察到的相似。四批號（表5 )中完整唾液酸之濃度和尿液FSH最初貯液之唾液酸濃度類似，顯示uFSH唾液化程度未受噴灑乾燥所影響。因此，表5中之結果説明在傳統噴灑乾燥下， uFSH對去唾液酸化作用之化學穩定性。表5 :唾液酸分析之定量結果組成物(％) 唾液酸批號 uFSH 甘露醇擰檬酸鹽 (毫微莫耳/毫克蛋白質） pH R98026 3.5 81 15 266±24 7.7 R98029 3.5 96 0 282±33 7.8 R98046 5 15 80 285+26 7.0 R98048 5 15 80 288土 12 5.3 stock 0.5 - - 297土 15 - 表5之結果證明在近中性或略酸性pH値下，在代表性調和物中之uFSH唾液酸化並不因噴灑乾燥自流失。以此分析法測知之平均唾液酸含量（8.8%按重計）可比得上 uFSH的（8.96%按重計）。 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ill·-----1·1 裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂------ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五^¥明說明（57 ) 實例6 供經肺遞送之uFSH粉末之固態特性進一步鑑定具代表性的uFSH粉末調和物，以探究各種賦形劑及殘留水汽對於生成粉末固態特性上之影響，及其在蛋白質穩定性上之综合作用。調幅的差示掃描量熱法（DSC) 〇以DSC來決定特定噴灑乾燥粉末樣品之熱流動概況，以測度其玻璃態化溫度 (Tg)，及估計出結晶程度。也決定玻璃態化溫度，以提供特殊調和物可能的固態穩定性指示，因爲高的Tg値較低的Tgs更可顯示出對物理穩定性較大之潛力。依上文材料及方法一段中所述的，進行DSC之偵測。表6综合了具代表性uFSH粉末調和物之DSC資料及玻璃態化溫度。注意表6之數據，無晶形之鼠李糖調和物有近100 °C之顯著玻璃態化溫度。此外，在高-擰檬酸鹽含量調和物中 (>80%擰檬酸鹽）可觀察到高的Tgs (70_90 X：) ; Tg後是放熱，用檸檬酸鹽無晶形多晶形物結晶所致。擰檬酸鹽較少（<60%擰檬酸鹽）之甘露醇/擰檬酸鹽調和物呈現較低之 Tgs ( 30-60 °C )，在約90 X：下放熱由於甘露醇結晶之數，且接下來是甘露醇的熔化。高度晶狀之95%甘露醇調和物，並無可觀察之Tg ;僅有在〜160 °C下之放熱是晶狀甘露醇熔化特有的。更詳查其數據，在不純uFSH中之殘留碳酸氫銨，似乎可降低Tg値。雖然據報檸檬酸（低pH)可降低擰檬酸鹽玻璃之 Tg [Lu，Q·，et al·，Pharm· Res. 15(8):1202-1206 (1998)]，此在所檢視之pH値範圍内似乎不明顯。這 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------·-裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 五、^¥明說明（58 ) 些數據證明，有製備不同Tgs及結晶度之穩定uFSH粉末之能力。熱解重量分析法。熱解重量分析（TGA)，是一種用來追踪樣品一旦自室溫至200 °C加熱下重量之流失，可用來決定上述uFSH乾粉殘留之水含量。一旦由25加熱至150 °C 所觀察到之重量流失，可歸於殘留水汽之流失。以ΤΑ 2950熱解重量分析儀分析喷灑乾燥粉末之水汽含量（2-10 毫克在密封之鋁盤再包覆於手套盒中）。已密封盤之上方在加至TGA溶爐前先立即穿孔，以將自室内空氣所吸收之水汽減至最低。結果示於表6。在檢視表6之結果中，以不純uFSH所製備之調和物，在一旦加熱下呈現相當高之重量流失，其後歸因於粉末中有殘留碳酸氫銨之存在 (碳酸氫銨在60 °C下可開始分解）。以純uFSH製備之無檸檬酸鈉粉末，其水汽含量少於2%，而高一檸檬酸鹽含量之粉末，通常含有2-6%間之水。 --------·-裝 (請先閱讀背面之注意事項再赛寫本頁) #. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表6 : uFSH粉末之固態特性型式型式組成物 pH TGA Karl DSC (wt/wt/wt) Fisher ID 批號 uFSH/甘露醇 bsd1 asd2 速率 H20 H20 Tg /檸檬酸鹽 (分） % % C 98023 0:15:85 na na 98024 0:85:15 na na L2001 98025 3.5:15:81 7.7 7.7 6.7 6 69 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1277425 A7 B7 五、II明說明（59 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 L2002 98026 3.5:81:15 7.8 7.4 1.0 na 28 L2003 98027 3.5:48.5:48.5 7.9 7.4 3.8 4.1 51 L2004 98028 3.5:32:64 7.8 7.4 5.0 na 60 L2005 98029 3.5:96 7.8 7.3 6.5 na none L2006 98030 3.5:15:81 7.0 6.9 5.1 na 79 L2006 98037 3.5:15:81 6.9 6.8 4.5 na L2007 98038 3.5:96:0 7.9 7.7 nd na 蔗糖 L2008 98039 3.5:96:0 7.8 7.6 1.8 na 100 鼠李糖 L2009 98040 3.5:15:81 6.8 6.9 4.5 na 83 L2010 98046a 5:15:80 7.0 7.0 4.6 na L2010 98046b 5:15:80 7.0 7.0 3.9 na 84 L2011 98047 5:80:15 7.7 7.4 na 33 L2012 98048 5:15:80 5.3 5.3 0.5 na 73 L2013 98049 10:14:76 7.4 7.3 5.1 na 88 L2014 98050 5:31:64 7.1 7.0 2.6 na 75 L2015 98051 5:80:15 6.3 5.8 1.4 na L2006 98052 3.5:15:81 6.9 6.9 4.1 na L2006 98053 3.5:15:81 6.9 6.9 4.0 na 82 L2016 98054 5.0:15:80 7.7 7.4 7.4 na 83 L2020 98067 10:14:76 7.1 7.1 3.5 na 82 L2012 98068 5:15:80 5.1 5.1 2.4 na 65 L2016 98069 5:15:80 7.6 7.5 3.6 na 84 -------------I 裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -62- 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7 五、1明說明（6G ) L2006 98070 3.5:15:81 7.0 7.0 5.6 na 73 L2010 98084 5:15:80 7.1 7.1 10 3.3 na 90 L2017 98085 5:95:0 7.5 7.1 10 0.6 na nd L2018 98086 5:95:0 7.4 7.2 10 1.4 na 99 鼠李糖 L2019 98087 5:64:31 na na 10 1.2 na na 分塵機鼠李糖 L2019 98087 5:64:31 7.4 7.1 10 0.3 na 43 收集器鼠李糖 L2010 98110 5:15:80 6.9 6.9 10 2.8 na 83 L2017 98111 5:95:0 7.0 6.7 10 0.5 na nd L2018 98112 5:95:0 7.2 7.0 10 0.7 na 98 _鼠李糖_ 噴灑乾燥前調和溶液之pH値，2重組粉末之pH値 X-射線撓射。在Shimadzu XRD6000撓射儀上進行粉末α 射線撓射研究，以鑑定出代表性粉末樣品結晶程度 (L2010 ，L2017 ，L2018)。已決定出uFSH/甘露醇/檸檬酸鹽調和物（L2010)因無鮮明的撓射峰，可知大多爲無晶形。由於撓射型式爲甘露醇α-多晶形特有的，因此uFSH / 甘露醇調和物（L2017)似乎是高度結晶。uFSH/鼠李糖調和物（L2018)完全無晶形，可由無顯著撓射峰決定。這些數據與上述之DSC結果符合。水汽吸著作用。進行水汽吸著分析，提供某些uFSH粉 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂--------- 1277425 A7 B7 五巧明說明（61 ) 末樣品吸濕性之指示。特言之，將樣品保持在固定溫度下，再曝於相對濕度衝擊下，由〇%-80%，再回到0% RH 。各樣品置微量天平上，以追3宗RH函數關係下獲重之平衡。二種代表性uFSH粉末之水汽吸著結果如下。高檸檬酸鹽含量之粉末（L2006，uFSH /甘露醇/擰檬酸鹽）在 30-40% RH間之水汽吸收概況上有鮮明的變化，此可歸因於擰檬酸鹽二水合物形成之故。95%甘露醇調和物在60% RH左右顯示小的轉變，乃少量留下之無晶形甘露醇結晶所致。（少量無晶形甘露醇（<5%)與蛋白質結合，難以利用 DSC或X-射線撓射偵測）。等溫微熱量法（ΤΑΜ)數據也顯示在60% RH時出現甘露醇結晶。在甘露醇/擰檬酸鹽調和物中，以等溫微熱量法也可測及甘露醇之結晶。這些水汽吸著研究之結果顯示處理所生成粉末之較佳模式，即在製造，包裝及貯存中保持粉末乾燥。實例7 uFSH乾粉之氣霧劑性能利用各種可測知之變數，詳估具代表性uFSH粉末之氣霧劑性能，以決定其對經肺遞送之適用性。遞送劑量效率測度（DDE)。充滿2毫克uFSH粉末之單一發泡霄包裝（BP)，填加至乾粉吸入器内，如Smith, A. E·，et al·，U.S. Patent No. 5,740,794，1998 年 4 月 21 日所述。裝置再起動，將粉末分散至裝置室内。形成結果之氣霧劑團之粉子，再自裝置室内利用30升/分之眞空，2.5秒速率抽取，並截獲在接於裝置口部之預先稱重過之濾膜上。含粒 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格mo X 297公釐） * i I I h I I I--I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr---------#. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（62 ) 子之濾膜再次稱重，取得由發泡膏包裝到達濾膜之粉末質量。已分散過之BP也稱重，以決定此動作後仍留於發泡膏包裝内粉末之含量。至於以下所報告之數據，一個測試組由5至10個BP分散液組成。氣體動力粒子大小測度。在uFSH粉末調和物之早期篩選中，利用安德森階式壓縮器進行經修飾之短堆積（SS)方法。以SS方法來提供FPF，APC及Cl Eff值。利用完全尺寸之安德森階式壓縮器，來分析加速穩定批次。如上述進行之氣霧劑性能結果，在下表中針對代表性uFSH粉末組成提出來。表7 :各粉末批號中之射出劑量百分率（平均值，SD及範圍），留於BP中之粉末百分率，留於BP中所收集之粉末百分率射出劑量留下％收集％型式No.批號No. η 平均 SD 最低最高平均 SD 平均 SD L2001 98025 5 68 10 57 82 8 4 73 9 L2003 98027 5 9 5 2.5 16 44 17 15 6 L2004 98028 5 25 17 7 45 18 24 29 15 L2005 98029 5 66 5 58 71 11 4 74 4 L2006 98030 5 71 10 60 83 19 5 88 11 L2006 98037 5 58 3 55 64 16 3 69 4 L2007 98038 5 15 8 7 24 23 14 19 9 L2008 98039 5 50 4 45 54 26 6 68 7 -65 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---L.-------I ^--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 五、1明說明（63 ) L2006 98040 5 64 6 58 74 19 7 79 5 L2010 98046A 5 54 2 53 57 12 3 62 2 L2010 98046B 6 50 3 46 56 22 5 65 5 L2011 98047 5 29 4 24 33 4 4 30 5 L2012 98048 5 69 7 63 79 8 3 75 7 L2013 98049 5 41 5 36 48 19 3 51 4 L2014 98050 5 52 5 44 58 9 2 57 6 L2015 98051 5 46 6 41 55 9 5 51 5 L2006 98053 4 53 6 48 61 18 3 64 5 L2016 98054 5 42 3 39 45 26 7 57 3 L2020 98067 5 71 2 68 74 12 2 81 2 L2012 98068 5 68 2 65 70 9 3 75 1 L2016 98069 5 69 2 67 72 17 4 84 3 L2006 98070 5 63 10 46 70 12 6 71 8 L2010 98084 6 62 3 55 66 28 3 84 5 L2017 98085 6 64 11 47 75 18 5 77 10 L2018 98086 6 60 5 55 69 27 7 83 6 ----------•裝訂---------# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在檢視以上數據之中，呈現極佳氣霧劑性能之調和物爲 L2006 ， L2010及L2020 ，各自由甘露醇··擰檬酸鹽 (1:5，卩117)組成，11?311含量則分別爲3.5，5，及 10%。前四個篩選組中均含有L2006 (3.5% uFSH)，而所製備之5批次，DDE平均62±7% ;個別批次之平均變化由 53-71%。L2010 (5% uFSH)之 DDE 平均 55±5% (n=5)，而個 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（6 ) 別批次之DDE範圍是由47-66%。含10% uFSH之粉末有 71%之平均DDE，而一旦再試驗會意外地下降至55%。其他的粉末調和物則呈現特佳之粉末分散能力，即DDE值在 60% 以上，包括 L2001，L2005，L2006，L2012， L2016，L2006，L2010，L2017 及 L2018。鼠李糖粉末 L2018及L2008之DDE平均50±10% (n=3批次）。雖然鼠李糖調和物之DDE較某些其他uFSH調和物低，這些粉末可由其氣霧劑團之細碎本質予以區別。作為氣霧劑性能的額外指示，示於下表8中之安德森短堆積結果顯示出。平均細碎粒子部份（Fine Particle Fraction FPF 或％<3,3 微米），平均氣霧劑性能係數（Aerosol Performance Coefficient APC)，平均階式壓縮計（CI)效率，且針對此三測度估算出MMAD (每次測度採用三個發泡膏包裝）。 ----K-------_ 裝--------訂--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表8 :短堆積安德森粒子大小偵測安德森短堆積CI 型式編號批號 η⑴ FPF (% <3.3 微米）平均 APC 平均 CI% 效率平均 MMAD (米） L2001 98025 3 81 0.44 54 2.2 L2005 98029 3 58 0.33 57 3.0 L2006 98030 3 83 0.43 52 2.1 L2006 98037 3 81 0.42 52 2.2 L2008 98039 3 91 0.49 53 1.8 L2006 98040 3 79 0.42 53 2.2 -67 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7 五、$明說明（65 ) L2012 98048 3 59 0.34 57 2.9 L2020 98067 3 61 0.37 60 2.9 L2012 98068 3 51 0.33 64 3.2 L2016 98069 3 64 0.39 61 2.8 L2006 98070 4 74 0.37 51 2.4 L2010 98084 2 80 0.38 47 2.2 L2017 98085 2 50 0.30 59 3.3 L2018 98086 2 89 0.44 50 1.9 ⑴每次偵測使用3個發泡膏包裝（η) 安德森短堆積數據顯示所有受試粉末均有良好的粉末性能特性。所有調和物呈現等於或大於50%之FPF値，顯示50% 以上的粒子具有小於3.3微米之大小。此種粉末是遞送至肺深處所欲求的，以可再爲全身所吸收。受試調和物中有一半呈現大於75%，顯示調和物中存在有較高比率之小尺寸粒子。這些調和物包括L2001，L2006，L2008，L2010 及L2018。幾乎所有的粉末也呈現出特佳之APC値，較好是0.36以上。這些調和物包括L2001 ，L2006，L2008 ， L2020，L2016，L2010 及 L2018。L2006 之 APC 實質地超過0.36，且範圍在0.37-0.42，FPF相當値（％ <3.3微米）介於74-83%之間。L2010之APC値極相似，且範圍由0.34-0.38，有 70-80% FPF 〇鼠李糖調和物可得高的APC値，由0.37-0.49 ，FPF相當値爲90%。甘露醇調和物證明略低的APCs (0.26-0.33)。因此，甘露醇調和物似乎可產生最大的氣霧劑粒子，而甘 -68 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1277425 A7 B7 五明說明（66 ) 露醇/擰檬酸鹽調和物爲中等大小，鼠李糖調和物爲最小的氣霧劑粒子。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 加速之穩定性研究。三種粉末調和物，L2010 ， L2017，L2018 在 30 °C 及 40 °C 下準備一個月，2-40 Ό 之壓力循環條件亦然。當針對完全堆積準備對穩定性批次測試粒子大小分佈時，可證實先前產生之短堆積數據。表9 :加速穩定性之數據總和射出劑量(％) 留下％收集％型式/批號條件 η 平均 SD 最小最大平均 SD 平均 SD 2-40 10 52.5 4.8 41 57 29 2 74 6 L2010 30 10 55.7 3.7 49 60 27 3 76 3 98110 40 11 51.4 5.0 43 84 28 10 75 6 t=0 10 50.5 5.1 40 59 28 8 71 7 2-40 11 48.2 3.9 39 52 20 5 60 3 L2017 30 11 50.9 3.2 46 57 14 3 59 4 98111 40 10 49.9 3.3 44 54 14 4 58 4 t=0 11 47.2 2.8 41 52 15 4 56 3 2-40 10 45.1 4.0 37 54 23 9 60 5 L2018 30 11 47.0 6.0 35 54 24 6 62 4 98112 40 9 49.8 5.3 41 59 23 5 64 3 t=0 10 41.1 4.8 34 50 30 5 59 3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五明說明（67 安德森短堆積Cl 型式/批號條件 η FPF (%<3.3 微米）平均 APC 平均 Cl% 效率平均 2-40 3 68 0.32 47 L2010 30 3 72 0.32 45 98110 40 3 75 0.35 47 t=0 3 70 0.34 49 2-40 3 53 0.25 47 L2017 30 3 53 0.24 46 98111 40 3 50 0.25 50 t=0 3 53 0.26 50 2-40 3 87 0.35 41 L2018 30 3 86 0.34 40 98112 40 3 87 0.35 40 t=0 3 89 0.37 41 si ϋ n n 1 n I— n n I n ϋ ϋ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在加速的穩定性研究中，最初之DDE値較先前批次還低。然而，在1個月的測試中，保持在任何穩定性條件下的任何粉末調和物，其DDE並未下降。圖1 ，示出用於此1個月穩定性研究之三種uFSH粉末調和物（L2010 ， L2017，L2018 )其FPF及MMAD間之關係。檢視圖1所示數據實群，及沿著X軸自左至右之處理，數據群分別相當於樣品L2017，L2010及L2018。最初及1個月測度之 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、1明說明（68 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) APC値與各粉末調和物十分一致，且符合先前批次之APC 値。因此，此中所述之示範用粉末調和物，呈現出丧好的氣霧劑性能及穩定性。實例8 uFSH乾粉之生物活性以下述之試管内分析法決定四種代表性乾粉uFSH調和物，L2013 ( 10% uFSH ，14%鼠李糖，76%檸檬酸鹽， L2010 (5%uFSH，15% 鼠李糖，80% 檸檬酸鹽），L2006 (3.5% uFSH ，15%甘露醇，81%擰檬酸鹽），及L2008 (3.5% uFSH，95%鼠李糖）之生物活性。四種uFSH粉末調和物和uFSH標準品比較下，保有顯著的生物活性。以50 微克 / 毫升 uFSH (人類 Urofollitropin; Vitro Diagnostics)於 PBS ，含有1%白蛋白之溶液爲標準品。此溶液取部份在 90 °C下加熱10分鐘，將99%以上的雜二體解離成二個單體（以SEC分析示出），且此溶液爲陰性對照組。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以β-内醯胺酶敏感性告知者細胞分析法來偵測FSP之試管内活性。ΗΕΚ293細胞，含有cAMP敏感性β-内醯胺酶 (BLAM)告知者載體[Zlokarnik et al·，Science，279, 84-88 (1998)] 以人類FSH告知者（FSH-R)表現載體轉感，其編碼潮黴素可選擇性標幟，並與潮黴素共培育3週。存活細胞以10 微克/毫升FSH (Sigma)處理5小時，且顯示出最高藍螢光強度之FSH活化細胞之族群再以FACS鑑定及分離。此多株族群予以擴大，以10克/毫升FSH處理5小時，再以 FACS分成單細胞純系。二種純系細胞株以BLAM微量滴 -71- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、明說明（69 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 定盤分析法分析，顯示藍/綠比例有6至8倍的增加。選擇BLAM表現上有最大倍數增加之FSH-R細胞株爲接下來 FSH分析法中之細胞株。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製細胞以20,000細胞/孔洞種入100微升之生長培養基 (DMEM批號11965-092，10% FBS，500微克/毫升健大霉素），於聚-D-賴胺酸塗佈之96孔洞黑壁組織培養盤，再於37 °C，5% C02下培育一夜。生長培養基以100微升之分析培養基替換（DMEM批號11965-092，0.5% FBS，500 微克/毫升健大霉素），盤再於37 °C下培育一天（5% C02)。移出分析培養基，再於各孔洞中加入1〇〇微升含有未知濃度FSP之分析培養基，且盤在37 °C，5% C02下培育5小時。再於各孔洞中加入20微升之BLAM受質填料，含有6微升之1 mM CCF2-AM於DMSO ，6微升 Pluronic酸（100毫克/毫升於0.1%醋酸DMSO)於1亳升2% PEG-400 及 10% ESS (Aurora Biosciences)。經過在室溫下培育1小時後，藍色（ 395毫微米激光/460毫微米發射）及緣色（ 395毫微米激光/ 530毫微米發射）螢光強度之比例以 Cytofluor 決定（Perseptives Biosystems)。由於 FSP 存在所致之藍/綠比例之倍數增加，由各比例除以對照樣品藍/綠比例中可估算出來。這些結果示於圖2A及2B。實例9 大鼠皮下（SC)及鞘内（IT)投予FSP之生物利用率進行以下研究，以顯示在大鼠内鞘内投予FSP相較於 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、1明說明（70 ) SC-投予FSP之生物利用率。策略1· (FSP-SC)。得自腦下垂體之人類FSH得自.Sigma (St. Louis，MO, USA，批號 #34H0069 產物 # F 4021 )。稀釋劑爲PBS (磷酸鹽緩衝之食鹽水）含有（％白蛋白。公的 Sprague-Dawley重28〇-3〇0克，可用於單一曝霧研究。每個數據收集時間點使用二隻動物，共6個時間點。動物投予 0.9單位/200微升或9.0單位/200微升，在適當時間下殺死並取得總血樣。個別大鼠應用於各時間點。在0，4， 8，24，48及96小時時收集血樣。樣品離心且上清液在 -80 °C下冷康，直到以ICN Pharmaceuticals之RIA套組分析爲止（Costa Mesa，CA USA) 〇策略2 (uFSH-SC及IT)。投予至動物之活性劑爲 •’FERTINORM HP" 75IU (Urofollitropin iFSH) im/sc ，得自 Serono Laboratories (Norwell，MA，USA)。活性作用物（l〇小瓶uFSH，各含有10毫克的乳糖）加1毫升NaCl溶液重組之，此中並加入充份的PBS (磷酸鹽-缓衝之食鹽水）以製備9.0單位/200微升FSH濃度之溶液。重280-300克之公的Sprague-Dawley大鼠作爲單一曝露研究。各組有36雙動物，每天有4隻動物爲對照組。含有9.0單位/200微升 uFSH之藥物溶液在IT及SC研究中均在特定時間點時投予至動物。每次數據收集點時使用二隻動物，其6個時間點。在實驗當日，大鼠予以麻醉以進行IT給藥，再令其恢復。動物在特定時間下犧牲，再取總血樣。個別老鼠用於 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Ι1ΙΙΓΙΙΙ — — — ^^^1 I — I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五、1明說明（71 ) 各時間點。在0 ，1 ’ 2 ，4 ，6 ，9 ，24小時（第1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 天），及48小時（第2天），72小時（第3天）及96小時（第 4天）收集血樣。樣品離心，且上清液在-80 °C冷康直到利用 ICN Biomedicals 之 RIA 套組分析爲止（Costa Mesa，CA)。結果综合於下表10及繪圖於圖3。表10. SC及IT投予FSP至大鼠之生物利用率劑量/來源路徑 Tmax，小時 Cmax mlU/毫升 AUC mlU/毫升·小時 f (%) 0.9 U/* SC 8 6.6 94.05 9.0 U/* SC 4 131 420.37 9.0 U/** SC 9 10.25 251.1 9.0 U/** IT 6 4.14 53.63 21.4 來源：* =人類腦下垂體衍生的；** =人類尿液衍生的 FSP劑量=單位/200微升/大鼠

Tmax :達到最大藥物濃度（血漿）之時間

Cmax :所達到之最大藥物濃度（在Tmax時）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 AUC :減少藥物時，藥物水平一時間曲線下之總面積 f :在％ =AUCIT/AUCsc之生物利用率上述結果提供對鞘内遞送FSP之生物利用率，且與SC-衍生之FSP比較下顯示約20%之相對IT生物利用率。此初步研究結果顯示，FSP當以液體型式注入大鼠氣管時可有合理的生物利用率。此數據進一步建議，FSP可經肺投 0 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、1明說明（72) 實例10 uFSH經肺及皮下投予至恒猿之藥物動力學進行以下活體内藥物動力學（PK)研究，以檢查濾泡刺激蛋質（uFSH)在猴子之生物利用率，其中其以有別於皮下或肌内注射之經肺路徑投予。五隻雌的猴子皮下注入uFSH，再給予氣霧化uFSH粉末組成物2010三個分別的經肺劑量（2毫克劑量；5% FSH/15%甘露醇/80%檸檬酸鹽）。粉末經肺投予，猴子置於盔帽型曝露裝置内，FSH乾粉再直接分散至盔帽内，利用 Smith，A· E·，et al.，U.S· PatentNo· 5,740,794，1998 年 4 月 21日所述之粉末吸入器裝置。在5或15分鐘曝露期間，投予漸增濃度FSH之吸入劑量。吸入劑量之確實平均爲 3.8土1.7微克/公斤，18·4±1·3微克/公斤及37·2±3·9微克/公斤，此係在氣霧劑濃度爲基礎下於治療後估算而得，並配合各次吸入中各猴子之平均分鐘量及曝露期間。劑量分別投予至少一週。在0小時（給藥前）及給藥後〇·〇8 ，0·25 ，0·5 ，1 ， 3，6，9，12，24，48及72小時後收集全血血樣。以可信賴且經修飾之免疫計量分析法（（IRMA)， 906DM- 052-01 )決定具免疫反應性之uFSH之血清濃度，此中並應用商品化之 FSH 套組（Coat-A-Count® FSH IRMA，DPC® Ltd·， Los Angeles，CA)。以Microsoft Excel估計相對生物利用率百分率，並使用以下的關係[Wagner，J·，Pharmacokinetics for the Pharmaceutical Scientist，188-189 (1993)]: -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） * ϋ 1 n n n n n n n I I n 11 I an It ammmB 一口V n nfl ϋ an iam n I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、1明說明（73 ) (AUC 肺 x DOSEsc) --x 100 AUCsc x DOSE 肺在此估算中使用AUCo-οο。在猴子血清中免疫反應性 uFSH之個別濃度示於表11 。藥物動力學分析結果示於表 12。平均血清濃度（ISEM)圖示於圖4。鬌-裝--------訂---------聲. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表11.猴子經肺及皮下投予uFSH後，免疫反應性FSH之血清濃度及藥物動力學統計 __ SC=2微克/毫升動物數目/濃度(毫IU/毫升）時間(小時) 82841 82861 83871 83921 84761 Mean SEM 0 BQL(1) BQL BQL BQL BQL 0 1 5.3 4.6 BQL 5.3 BQL 3.0 1.3 3 20.9 63.7 28.2 65.5 36.3 42.9 9.2 6 25.4 75.7 28.9 97.1 68.5 59.1 13.9 9 20.2 58.3 31.5 71.3 76.0 51.5 11.0 12 18.7(2) 46·8(2) 33.4(2) 55.0(2) 54.3(2) 41.6 6.9 24 20.7(2) 36.8(2) 29.1(2) 38.0(2) 40.5(2) 33.0 3.6 48 15.7(2) 20.8(2) 17.4(2) 17.4(2) 14.5(2) 17.2 1.1 72 9·2(2) 9·8(2) 8.4(2) 8·6(2) 5·8(2) 8.4 0.7 AUC〇_t (毫IU*小時/毫升) 1197.1 2198.4 1544.4 2294.2 2078.1 1862.4 210.9 AUCo^»(毫IU*小時/毫升) 2013.4 2594.5 1932.5 2566.8 2231.3 2267.7 136.9 半哀期(小時) 55.5 26.6 29.8 22.3 18.1 26.4 4.3 Cmbx (毫IU/毫升) 25.4 75.7 33.4 97.1 76.0 61.5 13.7 TMax (小時) 6.0 6.0 12.0 6.0 9.0 7.8 1.2 劑量(微克/公斤) 2 2 2 2 2 2 -76- 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 74 五1明說明（經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PUL-18.4±1.3 微克/臺外動物數目/濃度(毫IU/毫升） 82841 82861 83871 83921 84761 Mean SEM 0 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.08 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.25 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.5 BQL BQL BQL BQL BQL 0 1 BQL BQL BQL BQL 4.4 0.9 0.9 3 6.9 13.1 6.4 5.5 16.6 9.7 2.2 6 20.0 21.0 16.6 18.8 33.0 21.9 2.9 9 29.1 24.3 19.4 17.2 40.1 26.0 4.1 12 26.6(2) 25.2(2) 24.4(2) 20.4(2) 40.0(2) 27.3 3.3 24 19.6(2) 20.4(2) 13.7(2) 16.3(2) 31.3(2) 20.3 3.0 48 7·4(2) 9.3(2) 6.9(2) 90(2) 10.7(2) 8.7 0.7 72 3 9(¾ 4.5(2) 3.0(2) 5.3(2) 4.2(2) 4.2 0.4 AUC〇4(毫IU*小時/毫升) 941.3 1001.8 755.2 847.8 1436.9 996.6 117.8 AUC〇〇〇(毫IU*小時/毫升) 1053.5 1157.9 843.4 1079.3 1546.8 1136.0 115.1 半衣期(小時) 20.9 23.5 20.5 30.4 17.83 21.9 1.8 CMaX (毫！U/亳升) 29.1 25.2 24.4 20.4 40.1 27.8 3.4 TMax (小時) 9.0 12.0 12.0 12.0 9.0 10.8 0.7 劑量(微克/公斤) 19 19 22 14 18 18.4 1.3 百分生物利用率 5.5 4.7 4.0 6.0 7.7 5.6 0.6 -77- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（75 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ΡϋΙ-37.2±3.9 微克 / 毫升動物數目/濃度(毫IU/毫升）時間(小時) 82841 82861 83871 83921 84761 Mean SEM 0 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.33 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.5 BQL BQL 4.3 BQL BQL 0.86 0.86 0.75 3.8 BQL 6.6 BQL BQL 2.1 1.4 1.25 57.6 BQL 31.0 4.7 BQL 18.7 11.3 3.25 32.7 10.4 50.1 12.2 13.4 23.8 7.7 6.25 69.3 22.7 85.2 23.7 29.0 46.0 13.1 9.25 82.4 30.6 132.8 33.8 36.8 63.3 19.8 12.25 72·5(2) 36.0(2) 155.0(2) 36.7(2) 39.8(2) 68.0 22.8 24.25 55.4(2) 32.7(2) 94.6(2) 30.4(2) 36.6(2) 49.9 12.0 48.25 29.3(2) 17.5(2) 47.8(2) 15.5(2) 14·2(2) 24.9 6.4 72.25 14.1(2) 9.2(¾ 19.4(2) 8.6(2) 6·0(2) 11.5 2.4 AUC〇—t (笔IU*小時/毫升) 3023.6 1574.9 5069.1 1506.5 1601 2555.0 689.6 AUC〇^〇(毫IU*小時/毫升) 3554.7 1981.5 5659.1 1845.2 1790.4 2968.0 747.9 半衰期(小時) 25.3 29.4 20.52 27.9 20.9 24.3 1.8 C^ax (亳IU/毫升) 82.4 36.0 155.0 36.7 39.8 70.0 23.0 T^ax (小時) 9.3 12.3 12.3 12.3 12.3 11.7 0.6 劑量(微克/公斤) 38 47 43 33 25 37.2 3.9 百分生物利用率 9.3 3.2 13.6 4.4 6.4 7 A 1.9 -78- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（76 )

PUL-3.8±1.7微克/毫升動物數目/濃度(毫IU/毫升）時間(小時) 82841 82861 83871 83921 84761 Mean SEM 0 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.08 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.25 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0.5 BQL BQL BQL BQL BQL 0 1 BQL BQL BQL BQL BQL 0 3 BQL BQL BQL BQL BQL 0 6 BQL 3.1 4.5 3.7 3.7 3.8 0.3 9 BQL 4.5 6.1 4.9 4.3 5.0 0.4 12 BQL 4.6 8.1 5.2 4.7 5.7 0.8 24 BQL 4.2 8.5 5.6 3.9 5.6 1.1 48 BQL BQL 4.9 3.0 BQL 4.0 nc(3) 72 BQL BQL BQL BQL BQL 0 AUC0_t (毫IU*小時/毫升) 0 132.9 363.2 237.6 129.5 172.6 60.7 AUCooc(毫IU*小時/亳升) NC NC NC NC NC NC NC 半衣期(小時) NC NC NC NC NC NC CMax (毫愛升) 0 4.6 8.5 5.6 4.7 4.7 1.4 TMax (小時) 0 12 24 24 12 14.4 4.5 劑量(微克/公斤) 6 2 3 5 3 3.8 1.7 百分生物利用率 NC NC NC NC NC NC ----^--------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 h=小時·，mIU=亳國際單位；ml=毫升；SEM=平均之標準誤差；pg=微克；kg=公斤；Cmax=最大濃度；AUC〇_t=由0 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1277425 A7 B7 五、發明說明（77 ) 時間至t時曲線外插下之區域；AUC〇_〇〇=由0時至無限大外插曲線下之區域；Tmax=至最大血漿濃度之時間。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (1) BQL表示在定量限度之下，其定義爲3.0毫微克/毫升，且於估計時，BQL値定爲0値。 (2) 用來估計半衰期之時間點。 (3) NC表示未估計。表12.猴子肺内及皮下投予1^311之藥物動力學變數

SC 肺肺肺中劑量高劑量低劑量平均SEM平均SEM 平均SEM 平均SEM

AUC〇_t (毫IU*小時/毫升） 1862 211 997 118 2555 690 173 61 AlJCw(毫IU*小時/毫升） 2268 137 1136 115 2968 748 NC NC 半衰期(小時） 26.4 4.3 21.9 1.8 24.3 1.8 NC CMax (毫IU/毫升） 61.5 13.7 27.8 3.4 70.0 23.0 4.7 1.4 Tmbx (小時) 7.8 1.2 10.8 0.7 11.7 0.6 14.4 4.5 劑量(微克/公斤） 2 幽 18.4 1.3 37.2 3.9 3.8 1.7 生物利用率(％) 100 5.6 0.6 7.4 1.9 NC 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製血清藥物動力學結果證明，在肺遞送後之血清濃度時間概況和皮下投藥是類似的。肺投藥後之末端半衰期和以皮下投藥所得的類似（約24小時）。在肺劑量群内（中及高劑量）隨著投予至肺之劑量增加，血清AUCo^及Cmax隨之增加。最後，經肺遞送之氣霧劑調和的uFSH ，其平均生物 -80 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五明說明（78 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用率與皮下投予比較下，依吸入劑量平均約6.5%。相當的肺中生物利用率，或相對的肺生物利用率，利用丫液體閃爍圖可知在猴子中依2微米MMAD粒子肺部沈積偵測爲準，估計是26%。低劑量之肺PK並未應用於這些估算中，因爲當FSH血中水平可測度時可採取之血樣太少。這些發現顯示，FSP之乾粉可以經肺路徑成功地投予至猴子，至其他哺乳動物，且特別是其他靈長類，如人類，生成和廣泛實行之皮下路徑類似之血清濃度及概況。實例11 含白胺酸之可吸入FSH乾粉粉末批號99348及99349在如實例2中所‘述的條件下噴灑乾燥。調和物中各納入40% (w/w)白胺酸；調和物基質中的其他部份爲甘露醇及擰檬酸鈉，其比例類似L2010 。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在粉末中之uFSH含量，於批號99348及99349中分別是 5%及2%。至於含有2% FSH之組成物，在發泡膏包裝中之充填質量爲5毫克，而在5% FSH乾粉組成物中，在發泡膏包裝中之充填質量爲2毫克。二個噴灑一乾燥之白胺酸調和物，各自有良好的uFSH穩定性，此係比得上無白胺酸之調和物，並由SEC-HPLC所決定（關於不含白胺酸之調和物數據，可見於表I3)。 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（79 ) 表13.噴灑乾燥對於有L-白胺酸之uFSH粉末調和物中高級聚集體（HOA)含量之影響 ____ 總 HO A % uFSH:檸檬酸鹽：甘露醇：白胺酸噴灑乾喷灑乾 (wt:wt:wt:wt) 批號# Form.# 燥之前燥之後 5:48:7:40 99348 L2029 0.6 1.8 2:50:8:40 99349 L2030 0.6 1.8 2:83:15:0 99347 L2028 0.4 2.3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 · 二種白胺酸調和物，與所有其他調和物比較下，顯示出絕佳之氣霧劑性能。可觀察到DDE在14-30%絕對之增加，且在發泡膏中伴有”留下％ ”之減少。氣霧劑性能係數 (APC)顯著增加，至0.60以上。表14.含L-白胺酸粉末之氣霧劑性能批號 BP充填質量説明 DDE(%) SD %留下 SD APC 99348 2毫克 5% uFSH 71.1 5.7 15.2 3.7 0.64 w/白胺酸 99349 5毫克 2% uFSH 74.2 5.0 13.3 4.2 0.60 w/白胺酸 99295 2毫克 5% uFSH 56.9 10.7 24.2 10.8 0.37 99347 5毫克 2% uFSH 44.5 2.7 17.1 3.3 0.32 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製另外，粒子之外形由SEM觀察，可因胺基酸之加入而 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 五、1明說明（80 ) 改變。粒子似乎較"扁塌"，因此表面的折疊更明顯。在這些顯微圖可運用的有限視野中，粒子大小的分佈似乎較均質，只有少許細碎粒子可見。如上製備另外的含Fsp調和；物，以進一步檢查其氣霧劑及穩定特性。表15.比較白胺酸及非白胺酩格古；乂古比較 ED (%)1 批號# FSP 擰檬酸鹽甘露醇鼠李糖白胺酸卞岣1 最初 4個月 99420 5 80 15 0 0 60.8 n.d. 99421 5 42.5 10 42.5 0 62.9 n.d. 99422 5 20 0 75 0 53.2 n.d. 99423 5 0 0 55 40 70.9 65.3 99425 5 0 0 35 60 74.4 75.8 99426 5 55 0 0 40 65.3 67.1 99455 5 47.7 7.3 0 40 71.6 66.3 994542 5 47.7 7.3 0 40 72.7 n.d 99457 5 25 0 10 60 70.4 71.5 1所有粉末以2毫克充填重量接受評估。 — 1 — — — — — — I · ·丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2批號99454以uFSH製成。 n.d·表示在4個月時未進行ed試驗。六種含白胺酸之調和物各自證明有較不含白胺酸的三種調和物更高之DDE。在40 °C下4個月貯存後，DDE未見明顯的變化，顯示這些含有白胺酸之調和物保有其高度分尺張紙

1277425 A7 B7 五、發明說明（81 ) 散之本質，即使在加速穩定試驗條件下。另外類似地製備之含白胺酸FSP乾粉，其特性示於下表中。表16.四個含有15% FSH之示範FSP乾粉調和物，並置於加速穩定性下（40 °C / 75% RH於箔包中），最初及1個月之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表17.含白胺酸之乾粉之物理特性 ID 批號 FSP 白胺酸檸檬酸鹽產率 (%) MMD (微米） H20 (%) Tg (°C) L.C. (%) L2041 99598 2 40 58 79 1.2, 1.6 2.7 106 35 L2042 99599 2 80 18 72 1.3 1.3 100 62 L2043 99600 2 95 3 71 1.1 0.5 η·ο· 80 L2044 99601 8 60 32 78 1.2 1.7 112 45 L2032 99602 15 40 45 83 1.4 2.4 t.b.d. 322 L2045 99603 15 80 5 79 1.4 1.0 η.ο. 541 -84- 氣霧劑性能 _ 組成物 (wt %) ED (%) 最初，1個月1 MMAD (微米）批號# FSH 檸檬酸鹽甘露醇鼠李糖白胺酸 99513 15 42.5 0 42.5 0 55.7, 56.3 2.8, 3.0 99514 15 45 0 0 40 63.9, 65.1 2.2, 2.3 99515 15 2 0 43 40 68.7, 66.1 2.3,2.3 99516 15 72 13 0 0 58.6, 59.9 2.8, 2.9 所有粉末以3毫克充填重量評估。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（82 ) LC=白胺酸結晶度經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表18. BP充填重量及含白胺酸之FSP乾粉調和物，其函數關係之ED及細碎粒子百分率批號調和物 BP充填重量 %ED 平均(RSD) %細碎粒子 FSP:檸檬酸鹽:白胺酸 (毫克） (n=16) (n=3) 99598 2:58:40 2 76⑹ 53 3 74(4) 4 76(5) 53 5 76(5) 99599 2:18:80 2 80(7) 51 3 81(4) 4 81(4) 41 5 81(3) 99600 2:3:95 2 83(7) 50 99601 8:32:60 2 75⑹ 55 4 78(4) 52 99602 15:45:40 2 77(8) 53 3 73(8) 4 74(5) 51 99603 (15:5:80 2 78(5) 57 4 80(4) 54 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -85 - 1277425 Α7 Β7 五、發明說明（83 ) 實例12 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) FSH變型在AV12細胞中之表現以表現ϋ載體pGTH應用於FSH α亞單位在AV12中之表現。簡言之，pGTH依序含有許多要件：SV40早期啓動子/ ori ，大腸桿菌潮霉素抗性，SV40小ntn抗原剪接位置/poly-A位置，pBR322選殖殘餘部份，BK病毒（P2株）選殖殘餘部份，Poly-CA2〇/GT2。要件（合成的寡核甞酸）， BK病毒（P2株）加強子，AD2主要晚期啓動子/剪接的三個一組領導子，Bell供FSHcx亞單位編碼序列之嵌入位置 (包括停止密碼子），SV4〇小"t"抗原剪接位置/poly-A位置，pBR322氨苄青黴素抗性/ori。產生質體構體pGTH-a ，以表現所編碼之人類a亞單位序列（SEQ ID N0:5)，係將 362-bp Bell FSH 變型 eDNA 片段選殖至載體的獨特的Bell位置。FSH變型a eDNA片段DNA. 以PCR擴大作用產生，其中並以往返質體pLGD637爲模版，pLGD637含有一個合成的/寡核甞酸-組合之FSH變形 a eDNA序列（SEQ ID NO: 37)。Bell嵌入子之完整性以定序證實，繼以與GenPept資料庫比較（Accession No· 31869)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以表現匣載體pGTD來表現人類β亞單位FSH變型序歹ij，其編碼 SEQ ID N0:11 (即核甘酸 SEQ ID NO:38)， pGTD爲在AV12細胞中表現，含有許多的要件：依序如下，BK病毒（P2株）選殖殘餘部份，Poly_CA2〇/GT2。要件 (合成的寡核苷酸），BK病毒（P2株）加強子，AD2主要晚期啓動子/剪接二個一組領導子，Bell用於FSH變型β亞 -86 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（84 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 單位編碼序列（包括停止密碼子）之嵌入位置，SV40小"t" 抗原剪接位置/ poly-Α位置；SV40早期啓動子ori ，鼠類二氫葉酸還原酶cDNA，SV40小"tn抗原剪接位置/ poly-A 位置，及pBR322氨苄青黴素抗性/ori。質體構體pGTD-bCD3之產生係將393 bp Bell FSH變型 p-bCD3 eDNA片段選殖至pGTD載體獨特的Bell位置内（見 SEQ ID NO:38)。FSH 變型 P-CD3 eDNA 片段 DNA 以 PCR 擴大作用來產生，利用往返質體PLGD638爲模板，pLGD638 含有一個合成的/寡核苷酸組合之FSH變型β eDNA序列）。構體之完整性以定序證實，並於GenPept資料庫之人類β亞單位序列比較。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製簡言之，pGTH-α及pGTD-bCD3質體線化，再純化，並共轉感至黏附的AV23-RGT18細胞。在以含有0.25 μΜ胺甲碟呤及100微克/毫升潮霉素-Β ，加上200微克/毫升 G418以維持AV12-RGT18細胞較胺醯胺運送子基因型之培養基篩選後，可手動地或經流體-輔助之細胞分類儀之助，分離出個別穩定的純系。鑑定出有最高產製力之純系，係以商品化之FSH ELISA套組分析調適培養基以偵測 FSH變型之產製。會許多純系接受無血清懸液，以進一步擴大並得到FSH變型異二體可分離之量。實例13 N_末端截斷之FSH變型以N-末端定序分析蛋白質序列。在實驗室醱酵槽中產製多批號之重組體hFSH變型，再利用各種分析法鑑定。 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五發明說明（85 ----'-------~ 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 設計宿主（CHO細胞）可表現α亞單位（爲seqidn〇:37所、爲碼）及β S單位（爲SEQ ID ΝΟ··38所編碼）。利用溶液或已吸潰樣品進行所有末端定序。只有完整的及Μ α 及β亞單位之相對比例可得自Ν_末端序列資料。例如， Cys之存在無法以Ν_末端定序鑑知，且呈現之回收率較平均値爲低，因此以此方法較難正確估計出完整的及n_ 2 β亞單位之相對比例（β亞單位分別在2及3位置上有 Ser及Cys)。利用第二循環之回收可估算出胺基末端相對量，如Ser及Glu。某些代表性結果示於下表19。蛋白質 α-亞單元a (%N-2) β -亞單位(％N-2)b WUJ_38 7.9 58 WUQ-90 11 60 WUQ-115 10 59 WWG-15 9.5 59 WWG-30 9.2 59 WWG-50 8.7 57 FSH 8.6 66 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 38及WUQ-115檢視胰蛋白酶肽，顯示完整的Ν-2 α亞單1 分別爲94及92.7%。 b概算。以LC/MS針對WUJ-38及WUQ-115檢視胰蛋】酶肽，顯示完整及Ν·2變型β亞單位分有ι :1比例。尺張紙本 -88- 1277425 A7 B7 五、發明說明（86 ) 實例14 以胰蛋白酶輿圖及LC/MS鑑定C-末端經截斷之FSH變型六批次之中國倉鼠卵鈿胞予以修飾以可生合成hFSH變型，其中有由SEQ ID NO:37 DNA編碼之α亞單位，及由 SEQIDNO:38DNA編碼之β亞單位（指導合成108個胺基酸）以實驗室規模生長。純化所表現之FSH變型蛋白質，有分析β亞單位C-末端之異質性。在FSH變型製劑上進行的三次獨立的LC/MS ，其中C-末端序列資料示於下表 20中0 表20. FSH變型β亞單位C-末端之截斷批號 108個胺基酸 107個胺基酸 106個胺基酸 WUJ-38a’b 84.2 1.5 14.2 • WUQ-90 96 2.2 1.7 WUQ-1150 3.8 7.8 88.4 WWG-15 62 15 22 WWG-30 94 2 4 WWG-50 63.3 12.1 24.6 a在WUJ-38分別流程中，三種型式分別得73.5 ， 7及 20% 〇 b在WUJ-38分別流程中，於108及106個胺基酸中分別可得 83% 及 17%。 c於WUQ-115分別流程中，於CD3及CD5分別可得25及 75% 〇 -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -—裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五、發明說明（87) 實例15 FSH變型之生物活性在FSH變型不同批次上所得之活體内活性顯示，激素在大鼠印巢獲重分析上之效力類似，且示於表21 。以 Steelman/Pohley 大鼠卵巢獲重分析法（Steelman and Pohley， 1953，Endocrinology，53，604-616)债測 FSH 變型與尿液 FSH (uFSH)比較下之活體内活性。垂體切除後之不成熟雌性大鼠（23-25天）在光線控制下監禁。大鼠以hFSH變型或溶媒 (PBS加0.1% BSA，〜0.25毫升）每天皮下治療處理。每天使用0.1，0.3，1.0或3.0微克，以24小時爲間隔共重複治療4天。大鼠稱重，於4小時劑量後予以犧牲，再除去卵巢及子宮之油脂並稱重。針對各種劑量各使用六隻大鼠。如下製備FSH變型樣品：樣品在PBS緩衝溶液中，利用 Pierce 10,000 MWCO 透析匣（GIBCOBRL)透析 3 小時。樣品濃度以AVIV UV分光光度計決定，係在1公分徑長小池中以1毫克/毫升溶液進行，278毫微米下有1.06之消長係數。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 ------B7___ 五、1明說明（88 ) 表21· FSH (FSH變型）之活體内活性，係偵測大鼠卵巢之獲重（Ov wt)及子宮獲重（Ut wt)以爲FSH劑量之函數關係 ------——— uFSH WUJ-38 WUQ-090 WUQ-115 劑量 Ov wt Ut wt Ov wt Ut wt Ov wt Ut wt Ov wt Ut wt (克/天) (毫克） (毫克） (毫克） (毫克） (毫克） (毫克） (毫克） (毫克） 0 11.2 15.0 11.2 15.0 11.7 13.2 11.7 13.2 0.1 31.5 33.0 26.8 33.7 22.0 26.7 22.4 17.0 0.3 35.0 62.0 40.2 66.2 33.0 49.3 44.5 63.3 1 49.2 78.8 38.2 77.2 36.5 72.5 39.7 70.2 3 41.2 82.7 42.8 77.5 40.7 87.0 42.0 75.7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實例16 雌的Fisher大鼠中，uFSH與FSH變型藥物動力學比較以下的研究可偵測Fisher大鼠在靜脈内（IV)及皮下（SC) 投藥後，hFSH變型與uFSH藥物動力學（PK)。雌的Fisher 大鼠SC及IV路徑投予UFSH或hFSH變型（15微克/公斤）。hFSH變型在細胞中重組產製，此細胞可表現具SEQ IDNO:5之胺基酸序列之α亞單位，及具SEQIDNO:ll之胺基酸序列之β亞單位。在給藥後0.08 ，0.25 ，0.5 ， 1，3，6，9，12及24小時後收集全血血樣。以免疫放射計量分析決定免疫反應性UuFSH或hFSH變型之血清濃度，其中應用經修飾之商品化FSH套組，FSH IRMA， DPC® Ltd. (Los Angeles，CA)。RIASYS，是一種軟體程式其中應用稱重之4-變數邏輯模式程式，以此來分析IRMA結 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " 1277425 A7 B7 五；發明說明（89 ) 合資料。由標準曲線中估計免疫反應性uFSH或hFSH變型之血清濃度。大鼠血清中之標準品範圍介於3.5及3500毫 IU/毫升之間。定量之下限爲5 mlU/毫升。上限是750 mlU/毫升。利用統計包裝進行血清濃度之藥物動力學分析。SC及IV投藥後，大鼠血清中免疫反應性uFSH及 hFSH之個別濃度分別示於表23及24中。藥物動力學（PK) 値示於表25。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝入-α. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表23.皮下或靜脈内投予15.0微克/公斤uFSH後，雌的 Fisher大鼠中免疫反應性uFSH之血清濃度（mlU /毫升）時間(小時） uFSH IV 0.08 0.25 0.5 1 3 6 9 12 24 Rat 1 1894 645 109 2 2435 856 78 3 2447 920 85 4 2992 477 84 5 103 308 145 6 1223 351 131 7 1604 224 38 8 2031 198 24 9 1888 200 23 Mean 2258 1439 1841 807 379 207 91 120 28 SEM 182 841 125 83 51 8.4 9.5 18.5 4.7 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、'發明說明（9〇 ) uFSH SC 0.08 0.25 0.5 1 3 6 9 12 24 Rat 10 5.5 37.9 143 11 BQL 23.8 165 12 BQL 34.8 117 13 BQL 95 126 14 15.8 139 144 15 9.3 170 153 16 15.4 138 75.4 17 37.2 168.1 70.1 18 15.2 150.4 74.5 Mean 1.8 8.4 22.6 32.2 135 152 142 141 73.3 SEM 1.8 4.6 7.3 4.3 21.7 8.7 13.9 7.9 1.6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表24.皮下或靜脈内投予15.0微克/公斤FSH變型後，雌的 Fisher大鼠中免疫反應性FSH之血清濃度（mlU/毫升）時間(小時） FSH variant IV 0.08 0.25 0.5 1 3 6 9 12 24 Rat 1 3689 1150 79 2 3994 1348 90 3 3816 1248 85 4 2671 407 54 5 2743 432 56 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、¥明說明（91 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 2399 316 36 7 2047 150 19 8 1937 145 20 9 1947 166 17 Mean 3833 2604 1977 1249 385 154 84 49 18.7 SEM 88 105 35 57 35 6.1 3.0 6.3 1.0 FSH variant SC 0.08 0.25 0.5 1 3 6 9 12 24 Rat 10 BQL 36.5 152 11 BQL 36.7 172 12 BQL 28.1 139 13 10.2 112 111 14 12.2 215 123 15 5.8 116 100 16 17.9 162 53.8 17 23.0 175 62.4 18 28.1 183 62.9 Mean 0 9.4 23.0 33.8 148 173 154 111 59.7 SEM 0 1.9 2.9 2.8 34 6.1 9.5 6.8 3.0 -94- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 _ B7 五、'明說明（92 ) 表25.靜脈内及皮下投予uFSH或FSH變型後，雌的Fisher 大鼠中之藥物動力學變數治療劑量 Cmax AUC〇.t AUC〇^ Tmax Τΐ/2 (微克/公斤） (rnlU/毫升）（mlU •小時/毫升）（mlU •小時/毫升） (小時） (小時） UFSH IV 15 2258 5093 5373 0.1 6.8 UFSH SC 15 152 2767 4566 6.0 16.4 FSH variant IV 15 3833 5318 5472 0.1 6.3 FSH variant SC 15 173 2598 3575 6.0 11.5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 . 縮寫：ng，毫微克；h，小時；ml，毫升；pg，微克； kg，公斤；Cmax最大濃度；AUC〇-t，0至24小時時間下外插曲線下之面積，AUCo-οο，由0至無限大下外插曲線下之面積；Tmax，到達最大血清濃度下之時間；T1/2，最終消去半衰期。血清濃度概況證明，SC及IV投予FSH變型及uFSH有類似之概圖。AUC，末端半衰期，及Tmax也類似。實例17 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在猿猴中，皮下遞送（SC) uFSH與肺（P)及皮下（SC)遞送 FSH變型之藥物動力學比較以下研究可用來偵測猿猴中與皮下投予uFSH比較下，皮下及經肺投予hFSH變型之生物利用率及藥物動力學。策略1 (皮下uFSH)。猴子以SC路徑投予uFSH (2微克/公斤）。溶液中含有uFSH，PBS及0.1%人類血清白蛋白。在給藥後 0.08，0.25，0.5，1，3，6，9，12， -95- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（93) 24，48及72小時收集全血血樣。血樣收集自股靜脈或動脈，再置於無抗凝血劑之試管中。全血血樣中之血清由離心獲得，以經修飾之免疫放射計量分析決定免疫反應性 uFSH之血清濃度，使用經修飾之商品化FSH套組，FSH IRMA DPC® Ltd (Los Angeles，CA)。利用可信賴之數據還原軟體分析IRMA結合數據，其中應用4或5變數之邏輯演算法（StatLIA® Brendan Scientific Corporation)。自標準曲線上估算免疫反應性uFSH之血清濃度，曲線由uFSH投予至猴子上所得。標準品製備於猴子血清中，濃度範圍由0.5毫微克/毫升-75毫微克/毫升。定量下限是0.5毫微克/毫升。下限是75毫微克/毫升。利用傳統技術進行血清濃度數據之藥物動力學分析。平均値及SEM有時利用Microsoft· Excel估算0 策略2 (皮下及肺部投予rFSH變型）〇經SC及肺部路徑投予猴子重組體產製之hFSH變型（2微克/公斤）。設定重組宿主可表現出SEQ ID NO:5之α亞單位，及SEQ ID NO: 11之β亞單位，並自醱酵肉汁中純化出活性變型。粉末調和物中含有FSP，自胺酸，及擰檬酸鈉，重量比例爲 12.5:80:7.5 。利用吸入乾粉之吸入裝置（如實例10所述）進行肺部遞送，以自發泡膏中分散粉末至猴子之頭圓頂處歷 2 小時曝露，（如 Allen，D· L.，et al·，J· Appl. Toxicol·， π (1995)) 所述。於 2 分鐘曝露後可偵測 rFSH 變型之血清水平。治療後估算出各猴子所收到之吸入劑量，以2分鐘吸入期間各猴子之氣霧劑濃度及平均分鐘體積爲準。估算 -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再赛寫本頁) 裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五、發明說明（94) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 出之肺劑量在猴子間各有變化（見表26 )。也皮下投予 rFSH變型，以在估算藥物動力學變數後獲得相對妁肺生物利用率。皮下投予之調和物含有FSP ，PBS及0.1%人類血清白蛋白。於給藥後 0.08，0.25，0.5，1，3，6，9，12， 24，48及72小時收集全血血樣。自股靜脈或動脈中收集血樣，並置於無抗凝血劑之試管中。全血中之血清以離心獲得。以經修飾之免疫放射計量分析法決定免疫反應性 rFSH變型之血清濃度，此中應用經修飾之商品化FSH套組，FSH IRMA DPC® Ltd (Los Angeles，CA)。利用可信賴之數據還原軟體分析IRMA結合數據，其中應用4或5變數邏輯演算法（StatLIA® Brendan Scientific Corporation)。自標準曲線上估算免疫反應性rFSH變型之血清濃度，此曲線係對猴子投予rFSH變型而得。標準品製備於猴子血清中，濃度範圍由0.5毫微克/毫升-75毫微克/毫升。定量下限是0.5毫微克/毫升。下限是75毫微克/毫升。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此研究之目的是偵測hFSH變型示範之乾粉調和物（白胺酸/檸檬酸鹽），在肺部投予至猴子後之生物利用率百分比，係與皮下投予FSH比較。在此研究中，各猴子接受一次經肺投予rFSH變型，及二次分別的皮下注射[2微克/公斤的hFSH變型及uFSH ]。uFSH之皮下注射與rFSH變型比較。在經肺遞藥後0，0.08，0.25，0.5 ，1 ，3 ， 6，9，12，24，48及72小時取得血樣。而皮下投藥後之血樣取自0，1，3，6，9，12，24，48及72 -97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五：發明說明（95 ) 小時。使用經修飾之商品化IRMA套組，決定免疫反應性 hFSH變型或uFSH之血清濃度。這些濃度見於表26-29。 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 在示範之肺用調和物（白胺酸/檸檬酸鹽）中，hFSH變型平均生物利用率，較吸入劑量爲基礎之皮下投藥而言，爲約4.6%。以hFSH變型研究的比例中，相當的肺中生物利用率，或相對肺生物利用率據估計是約18.4%，偵測的依據在於利用γ閃爍計數偵測猴子肺中所沈積之2微米 MMAD粒子。在uFSH之猴子研究中（利用甘露醇/檸檬酸鹽調和物）以吸入劑量爲準之平均相對生物利用率爲6.5% (26%相對肺生物利用率）。rFSH變型之肺中投藥，可在 10.8小時下產生免疫反應性rFSH變型之高峰濃度，而皮下投藥比較下是5.4小時。uFSH於甘露醇/擰檬酸鹽調和物中經肺遞送，也可在約10小時時到達血清高峰濃度。 hFSH變型之藥物動力學變數，在肺及皮下投藥後是相似的（表26 ，27)。針對二種分子（uFSH及hFSH變型），在皮下投藥後之藥物動力學變數是相似的（表29 )。這些變數也可與2微克/公斤uFSH皮下投予之實例10所見的相比。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -98 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五：發明說明（96 ) 表26.猴子肺部投與rFSH變型後，免疫反應性rFSH變型之血清濃度（毫微克/毫升） _；_ 肺部投予rFSH 動物數目（性別）時間 (小時） 8717 (M) 8720 (M) 8791 (F) 8794 (F) 8795 (F) 平均値 SEM N 0 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0 5 0.08 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0 5 0.25 BQL BQL BQL BQL 0.89 0.18 1.18 5 0.5 BQL BQL BQL 0.55 1.29 0.37 0.25 5 1 0.80 1.04 0.96 1.28 2.20 1.26 0.25 5 3 4.94 4.58 3.07 4.14 5.68 4.48 0.43 5 6 7.78 7.09 5.73 6.30 6.30 6.64 0.36 5 9 10.08 6.77 6.34 4.37 7.92 7.10 0.94 5 12 10.88(1) 7.74(1) 7.25(1) 5.73(1) 14.44 ⑴ 9.21 1.55 5 24 5.90(1) 4.00(1) 5.41(1) 3.80(1) 5.81(1) 4.98 0.45 5 48 1.92(1) 2.01(1) 1.94(1) 2.32(1) 1.28(1) 1.89 0.17 5 72 0.72(1) 0.86(1) 0.86(1) 1.11(1) 2.28 ⑴ 1.17 0.29 5 -99- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 ___B7___ 五明說明（97) 表27.猴子皮下投予rFSH變型後，免疫反應性rFSH變型之血清濃度（毫微克/毫升)_ ·_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 皮下投予rFSH變型（2微克/公斤）動物數目（性另4) 時間 (小時) 8717 (M) 8720 (M) 8791 (F) 8794 (F) 8795 (F) 平均値 SEM N 0 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0 5 1 0.53 BQL BQL BQL NR 0.13 0.13 4 3 2.76 1.32 2.66 2.66 7.03 3.29 0.97 5 6 5.53 3.65 3.80 4.32 6.14 4.69 0.49 5 9 4.39 2.74 3.46 3.29 4.42 3.66 0.33 5 12 2.74 ⑴ 2.04(1) 2.64(1) 2.68(1) 3.81 ⑴ 2.78 0.29 5 24 2.59(1) 1.86(1) 1.57(1) 2· 57 ⑴ 2·64(1) 2.25 0.22 5 48 0.80 ⑴ 1.29 ⑴ 1·19(1) 1.06 ⑴ 1·26(1) 1.12 0.09 5 72 BQL 0.57 0.61 BQL BQL 0.24 0.14 5 縮寫： M=男· f生；F= :女性； BQL= 定量限度以下 ;NR= :由於樣品不良無結果；hr=小時；ng=毫微克；ml=毫升；gg= 微克；kg=公斤。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1)用來估算半衰期之時間點。 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 五、發明說明（98 ) 表28.猴子皮下投予uFSH後，免疫反應性fsh之血清濃度 1微克/毫升）皮下投予uFSH (2微克/公斤、動物數目（性別） _間丨、時） 8717 (M) 8720 (M) 8791 (F) 8794 (F) 8795 (F) 平均値 SEM N 0 BQL BQL BQL BQL BQL 0 0 5 1 0.77 0.67 0.73 2.93 1.23 1.27 0.43 5 3 5.05 4.38 3.57 6.71 3.55 4.65 0.59 5 6 6.31 4.52 4.76 6.53 3.60 5.14 0.56 5 9 6.30 4.28 4.14 4.85 3.55 4.62 0.47 5 12 4.46 ⑴ 4.04(1) 4.11(1) 3.39(1) 2.81 ⑴ 3.76 0.29 5 24 2.61(1) .2.87(1) 2.83(1) 3.06(1) 2.85(1) 2,84 0.07 5 48 1.15(1) 1.10(1) 1.65 ⑴ 1.04(1) 1.65 ⑴ 1,32 0.14 5 72 BQL BQL 0.86 ⑴ 0.61 0.70 0.43 0.18 5 縮寫：M=男性；F=女性；BQL=定量限度下；hr=小時 ng=毫微克；ml=毫升；μδ=微克；kg=公斤。 (1)用來估算半衰期之時間點。 ---*-------裝--------訂. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 101 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7

B 五、發明說明（"）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表29.猴子肺部及皮下投予rFSH變型及皮下投予UFSH後之藥物動力學變數 rFSH變型皮下劑量統計學/個體 8717 8720 8791 8794 8795 平均値 SEM N AUC〇_72 小時 123.8 109.1 112.4 121.3 159.1 125.1 8.92 5 (毫微克*小時/毫升） AUCo., 130.9 144.5 132.1 139.3 174.3 144.2 7.92 5 (毫微克*小時/亳升）半哀期(小時） 19.09 52.95 33.61 25.34 22.54 27.05 4.26 5 cmax(毫微克/毫升) 5.53 3.65 3.80 4.32 7.03 4.87 0.63 5 Tmax (小時) 6 6 6 6 3 5.40 0.60 5 劑量(微克/公斤） 2 2 2 2 2 2 rFSH變型肺部劑量统計學/個體ID 8717 8720 8791 8794 8795 平均値 SEM N AUC〇_72 小時 309.5 242.9 253.7 224.5 331.2 272.4 20.42 5 (毫微克*小時/毫升) AUCq^ 324.3 268.5 282.6 297.5 337.9 302.1 12.84 5 (毫微克*小時/毫升）半衰期(小時）15.33 19.70 18.92 26.22 21.32 19.69 1.71 5 Cmax (晕微克/毫升）10.88 7.74 7.25 6.30 14.44 9.32 1.49 5 Tmax (小時) 12 12 12 6 12 10.8 1.20 5 平均分鐘體積(升) 2.45 2.07 3.57 3.08 2.36 劑量(微克/公斤） 69 85 124 114 87 95.8 10.1 5 生物利用率 7.18 *4.37 3.45 3.75 4.50 4.64 0.66 5 -102- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格⑽χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 五、發明說明（100 ) rFSH皮下劑量統計學/個體Π) 8717 8720 8791 8794 8795 平均値 SEM N AUC〇-72 小時 159.6 146.7 168.4 168.1 152.6 159.1 4.27 5 (毫微克*小時/毫升） AUC“ 169.3 161.6 204.3 178.4 215.1 185.7 10.3 5 (毫微克*小時/毫升）半衰期(小時）18.66 18.90 27.79 20.06 43.51 23.22 3.21 5 Cmax(毫微克/毫升）6.31 4.52 4.76 6.71 3.60 5.18 0.58 5 Tmax (小時）6 6 6 3 6 5.40 0.60 5 劑量(微克/公斤）2 2 2 2 2 2 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝縮寫：hr=小時；ml=毫升；DEM=平均値之標準偏差； ng=毫微克；pg=微克；kg=公斤；N=觀察數目；Cmax=最大濃度；AUC〇_t=由0至t (72小時）外插曲線下之面積， AUCo-οο =由0至無限大時間外插曲線下之面積；Tmax =血清濃度達到最大時之時間。實例18 hFSH變型在CHO-K1細胞中之表現學精藝者應明白如何利用適合的表現載體及宿主細胞株來表現FSP許多方式。一種方式是使用中國倉鼠卵細胞株，如CHO-K1細胞株（LONZA Biologies)。這些細胞經設計可表現hFSH變型，其含有SEQ ID NO:5序列之α亞單位，及 SEQIDNO.ll序列之β亞單位。表現載體以標準技術構築。支持轉感所需之載體 DNA，可在 Gibco/BRL ElectroMax DH10B 細胞中製備（Cat. # -103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）訂· · »1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 Α7 Β7 五：發明說明（1Q1) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 18290-015)，利用 Qiagen QiaFilter Maxi Prep 套組（Cat· # 12%3)，且以適合的診斷用水解（如Hind ΙΙΙ/Xho I)證實載體。二基因之序列分析均可證實，可用來表現SEQ ID ΝΟ:5 α亞單位及SEQ ID ΝΟ:11變型β亞單位之DNA序列，分別爲SEQ ID NO:37及38所示者。各亞單位之表現可由不同的啓動子或相同的啓動子來控制。序列也可使用 polyA尾。載體中可含有一個可篩選之標幟。載體可利用已知技術來轉感CHO-K1細胞。細胞在適合的培養基中生長，如GibcoBRL’s CD CHO培養基，並在篩選之壓力下。可使用ELISA分析法來鑑定可表現hFSH變型之主要孔洞，其利用標準步騍選殖及擴大。這些步驟可生成可適當表現水平之純學。例如，在震盪燒瓶中（20-60毫升），經7至8天後可產生30毫克/升之活性hFSH變型。 _ 實例19 FSP之純化經濟部智慧財產局員工消費合作社印製重組體FSP之純化，如hFSH變型，其含有SEQ ID NO:5 之α亞單位及SEQ ID NO: 11之β亞單位，可以此中所述及技藝中已知方法來完成，純化自經轉形宿主細胞之單層或懸液培養物’如CHO-K1或AV12細胞株或其他可適用之產製株。自培養基中分離FSP的一個方法包括將培養基接受陽離子或陰離子交換層析，染料親和力層析，逆相層析，凝膠過濾層析，或這些方法的某些組合。在懸液培養物例子中，其中可含有去污劑，也可能需要額外的純化步 -104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（102) 驟，如離子交換步驟。層析步驟可針對pH値，導中性，缓衝溶液組成及流程條件（管柱尺寸，流速等）使更臻完善。純度及產率可以SDS-P AGE凝膠（考馬斯藍染色及西方墨點法），ELISA分析，排阻層析及以277毫微米下之UV 吸光度或其他已知技術求得蛋白質濃度而分析之。利用標準的純化步驟，可獲得以考馬斯藍及銀染凝膠知純度在 95%以上之FSP。實例20 白胺酸充作經肺投藥賦形劑之亞慢性吸入在家庭餵養之猴子（Macaca fascicularis)中研究在FSP經肺遞送中，白胺酸於粉末中之藥學接受性。白胺酸：擰檬酸鈉（90:10)之標的吸入劑量是1.66毫克/公斤/天。動物每天曝露15分鐘，共15天。猴子得自Charles River BRF，Inc -Mauritius 。動物一到達即監禁，並在進行研究前至少分離 6週。四隻猴子（二種性別各二隻）任意至治療組並指定至個別檻攔内。猴子監禁房間維持在72士8 °F之恒溫下。環境控制系統也維持在20%最低相對及80%最高相對濕度下。光照時間爲12小時白天12小時黑夜，由0600變化至 1800小時。猴子個別監禁在有懸浮地板之鋁欄内。糞便及尿液每天手動清除。在一週内每天二次供應約10至20個 Certified Primate 口糧 5048 餅干（PMI Nutrition International， Inc)，且在週末每天一次提供雙重比例。各猴子每週接受至少三次的新鮮水果。自來自以自動給水系自由取用，但曝露時例外。各猴子調控至使坐在受限之椅子上至少9 -105- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ftm n n· I— I i H ϋ n I i I I ϋ atmam I ϋ 一 0, I I ta— n ϋ in ϋ n I - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 五、發明說明（103) 次，再開始進行曝露。以食物治療爲正面加強以完成調適。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在曝露前猴子先置受限椅子上。取二片乳膠（〇·3〇厚度）置動物頸部以形成密封。於動物頭部置約7.7升之頭圓頂。在圓頂中維持約12升/分鐘之空氣流動，係經由出口之計量轉運器。利用Wright Dust Feed產生器產生白胺酸-檸檬酸鹽粉末（90%白胺酸/ 10%擰檬酸鈉）。由產生器每分鐘可流經8至10 ,升。氣霧劑通過集塵器，再進入頭圓頂以供猴子汗吸。以曝露中取自頭圓頂之重量分析樣品來決定白胺酸濃度。這些樣品係以25毫米Gelman Type A/E玻璃纖維濾膜經過1 LPM空氣之抽取而收集。可完成1個粒子大小之決定。粒子大小決定時之樣品係利用裝配有Gelman Type A/E 玻璃纖維濾膜之Sierra Model 218K階式壓縮器所收集的。流過階式壓縮器之氣流爲3 LPM，歷5分鐘。吸入之劑量可如下計算：（平均分鐘體積X曝露時間）x(平均重量分析濃度體重。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製利用”0”尺寸之呼吸氣速度描記器，接至頭圓頂通口，來追踪由氣流中所衍生之變數（潮流體積，分鐘體積，及呼吸頻率）。利用個人電腦及Buxco Electronics，Inc·之XA 軟體可收集訊號。曝露前收集之資料可至少有15分鐘，此後整個期間也收集資料。平均每5分鐘收集肺功能資料。這些資料再下載至Microsoft Excel ，並績圖檢視其呼吸型式。 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 -------- -- 五、^¥明說明（104 ) 在猴子曝露前，之中及之後進行觀察。任何不尋常處均可察覺。記錄體重（最初體重-雄性，2.9-4.1公斤雌性； 2.7-2.8公斤）。將數據平均，再求出白胺酸遞送至肺部之量。在給藥開始及第15天時取得血樣，取自餵食之前之血樣。此外，給藥開始及第15天時，進行支氣管及肺泡之灌洗（BAL)。動物給予0.015毫克/公斤，iM之胃長寧 (glycopyrrolate)，數分鐘後再給予10亳克/，im之鹽酸氯胺酮（ketamine HC1)。之後將兒科用枝氣管鏡插至右或左下肺葉’再擠進呼吸道。各1〇毫升二份之生理食鹽水送入肺中’再以20毫升注射器小心地手動抽取出來。回收之流體置冰中，再送病理實驗室分析。血液分析包括：紅血球數目，血紅素，血球溶積，平均細胞體積，平均細胞血紅素，平均細胞血紅素濃度，網織細胞數’血球細胞外形’白血球總數，白血球分類計數，血小板（凝血細胞）計數，凝血酶原時間，活化的部份促凝血S琴原激酶時間’葡萄糖，血尿氮，肌酸酐，總膽紅素，鹼性磷酸酶，鹼性轉胺酶，天冬醯胺轉胺酶，丫穀胺醯基轉移酶，肌酸磷酸激酶，鈣，無機磷，鈉，鉀，氯化物，膽固醇，三甘油酯，總蛋白質，白蛋白，球蛋白，微蛋白質。再分析尿之比重及蛋白質。在14天曝露期中之平均重量分析濃度爲425 83±232 9〇微克/升（平均値土SD)。質量中値當量氣霧動力直徑爲 L_微米，t 2.46之幾何標準偏差。和體重有關下之平均吸入劑量爲2.13±0.56亳克/公斤/天。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝 -107 -

1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（1〇5 任何動物在此研究期間未見任何不尋常的行爲。在呼吸頻率’潮泥體積或分鐘體積上，並無與治療有關之增加。在曝露第一天可見呼吸頻率明顯增加，此大多可歸因於猴子對於圓頂中出現塵粉之非特異反應。在次日偵測時，動物適應圓頂中之粉塵，使呼吸頻率之差異消失。在血液學變數，臨床化學變數，尿液分析變數，或支氣管肺泡灌洗液（BAL)變數上，均無與化合物有關之影響。有一隻猴子在研究上及在病史數據上與其他猴子比較下，在蛋白質水平，白血球總量，嗜中性球，淋巴細胞及巨噬細胞計數，及BAL流體中之紅血球數方面有極少之上昇情形。這些發現應與化合物無關，且由處理前bal中較南之蛋白質水平可證知，在此猴子身上有緩和的，未被決定出的，預先存在之肺部狀況。實例21 利用Niro噴灑乾燥器製作FSP粉末利用裝配有二個流體噴嘴的Niro可動式少量噴灑乾燥器製備粉末，其中含有白胺酸，擰檬酸鈉及生合成及純化之重組體FSP (基本上如此中所述）。如所述偵測粉末特性。自由悲、亞單位組成物基本上依實例2所述偵測。組成示於下表30。批次大小爲前六批是10克，最後三批號5 克，見表30。粉末之產率範圍由62%-78%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 · 108- 1277425 A7 B7 五明說明（1Q6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表30. Niro FSP粉末特性批號# 粉末組成 MMD (微米） MMAD (微米） Sub. h2o (%) ED (%) FSP L C 2011 1.9 6 38 2.3 3.5 8.2 1.4 0 2012 1.9 6 38 2.2 3.6 6.6 0.8 0 2013 1.9 6 38 2.1 3.5 7.9 1.3 0 2014 1.9 6 38 2.6 3.8 7.7 1.2 0 2015 1.9 6 38 2.0 3.4 6.1 1.2 0 2016 1.9 6 38 1.7 3.0 4.5 1.7 0 2017 1.9 4 58 1.7 2.3 3.2 82 0 2018 1.9 6 38 1.4 2.2 3.8 77 0 2021 11 6 29 1.8 2.2 2.8 78 0 2022 11 4 49 1.6 2.3 2.9 82 0 2095 1.9 6 38 1.5 2.4 5.5 0 2096 1.9 4 58 1.5 2.1 4.0 0 FSP=濾泡刺激蛋白質；L=白胺酸；C=檸檬酸鈉；Sub=亞單位含量。 -109- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再餐寫本頁) 裝訂： # 1277425 A7 B7 五、發明說明（107 ) 實例22 規模及調和物組份對於FSP粉末特性之影響利用裝配有經修飾的二個流體噴嘴之Buchi噴灑乾燥器 (190機型）產製批號00023-00030。手動充填發泡膏後進行偵測。於所有批號中使用hFSH變型（細胞經設計可表現具 SEQIDNO:5序列之α亞單位，及具SEQIDNO:ll之β亞單位）。批號1952-1954利用裝配有經修飾的二個流體噴嘴之Niro可動式少量噴灑乾燥器產製。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -110- 表31. 批號# GP L C 批號尺寸 (克） [FSP] MMD 微克/毫升（微米） MMAD (微米） APC (%) 1952 1.75 40 58 5 170 1.9 2.2 56 1953 1.75 40 58 5 340 2.2 2.8 46 1954 8 80 12 3 800 1.8 3.6 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（1〇8 ) 表32. 粉末組成物 ED(%) 批號# FSP L C 平均亞單位 HOA (%) (%) (%) (SD) (%) (%) 00023 1.0 40 59.0 76.2 (8.5) 6.5 0.16 00024 1.5 60 38.5 83.1 (4.0) 5.6 0.18 00025 1.5 50 48.5 4.8 0.24 00026 4.0 80 16.0 85.7(2.5) 5.4 0.12 00027 4.0 40 56.0 82.3 (5.0) 3.6 0.07 00028 12.0 60 28.0 3.3 0.03 00030 1.5 60 38.5 81.5 (3.2) 5.6 0.08 1952 1.7 40 58.3 78.1 (6.6) 4 1953 1.7 40 58.3 75.6 (6.5) 5、 1954 8.0 80 12.0 76.9 (3.5) 9 L=白胺酸；C=摔樣酸鋼。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例23 各種胺基酸賦形劑對FSP粉末特性之影響經濟部智慧財產局員工消費合作社印製含有各種胺基酸賦形劑之FSP粉末，視所需混合以檸檬酸鹽，基本上依此中所述的製備，產率範圍在由約54%至 78%。所生成粉末之特色示於下表33下。 -111- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五、發明說明（109 ) 表 33·___ 批號粉末組成物 H20亞單位HOA MMD(%) (%)(%)(%)(%)(微米) 78 1.3 36.4 0.18 1.32 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 00047 FSP :丙胺酸：擰檬酸鹽 2:80:18 00048 FSP :白胺酸：檸檬酸鹽 ••曱硫胺酸 2:80··13··5 00049 FSP :白胺酸：檸檬酸鹽 2:80:18 00050 FSP :白胺酸：擰檬酸鹽甘露醇2:80:13:5 00051 FSP :三白胺酸··擰檬酸鹽 2:40:58 00052 FSP :白胺酸：擰檬酸鹽 ••異白胺酸2:80:13:5 00053 FSP ··白胺酸：擰檬酸鹽 :精胺酸 2:80:13:5 00029 FSP ··纈胺酸：檸檬酸鹽 1.5:60:38:5 74 0.6 33.1 0.05 1.89 65 0.6 15.1 0.12 1.72 70 0.3 15.4 0.08 1.76 54 2.3 4.5 0.03 1.43 72 0.5 11.1 0.05 1.78 70 0.7 6.9 0.05 1.40 13.6 0.30 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五明說明（Μ ) 序列表 <110> ELI LILLY AND COMPANY AND INHALE THERAPEUTIC SYSTEMS, INC. <120>用於治療不孕症之經肺投藥乾粉狀調和物 <130> 032055-019 <140> - <141> · <150〉 60/130,099 <151> 1999-04-20 <160> 56 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 96 <2\2> PRT <213〉哺乳動物 ^400> 1

Fhe Pro Αερ Gly Glu Phe Thr Met Gin Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu 1 5 10 15

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro lie Tyr Gin Cys 20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arc/ Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys 35 40 ' 45

Lys Thr Mec I.eu Val Pro I,ys Asn lie Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys 50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val 65 70 75 20

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys SQr 85 90 95

<210> 2 <Z11> 111 <9.12^ PRT <213> 哺乳動物（mammalian) <400> 2

Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie Thr Va], Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15

Cys Gly Phe Cys ΙΙθ Ser. lie Asn Thr Thr Trp Cys Alex Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Ijeu Val Tyr Arg Asp Pro Ala Arg Pro Αε；η lie Gin 35 40 45 -113- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1 — — — — — — — — —.^v— I — — — — — — II 1111111 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1277425 A7 B7 五1明說明（111)

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Lou Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp ser Leu Tyr Tnr Tyr Pro Val Ala- Thr 65 70 75 30

Clu Cys His Cys Ser Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Pho Arg Glu He Lys Glu 100 105 110

<210> 3 <211> SC <212> PRT <213> 哺乳動物（mammalian) <400> 3

Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr Gin Asp Cys Pro Glu Cys x.ys Lou 1 5 10 15

Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phc Lys Leu Gly Val Pro He Tyr Gin Cys 20 25 30

Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Arg 35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn 工le Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys 50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe lie Arg Val Thr Val Met Gly Asn lie Lys Leu 65 *70 75 80

Glu Asn His Thr Gin Cys Tyr Cys Ser Thr Cys Tyr His Ilic Lys lie 85 90 95 -------------裳 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂------ 錚經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

<210> 4 <2ll> 111 <212> PRT <213〉哺乳動物（mammalian) <400> 4

Asn Ser Cys Glu I.eu Thr Acn Ilo Thr lie Ala Val Glu Lye Glu Gly 1 5 10 15

Cys Gly Phe Cys 工le Thr lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro A.^n lie Gin 35 >a〇 45 hys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Aap Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）. 1277425 A7 B7 五1明說明（112) 65 70 75 80 Ala Cya His Cys Gly Lys Cys Asn Ser Asp Ser I’hr Asp Cys Thr Val S5 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Asp Met Lys Glu 100 105 110 <210> 5 * <2U> 92 · <212> PRT <213〉人類（Homo sapims) <400> 5 Ala Pro Asp Val Gin Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro Ilo Leu Gin Cys Met G丄y Cys Cys 20 25 30 Phe Scr Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Mel: Lqu 35 40 45 Val Gin Lys Asn Val Thr Ser Glu Sor Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Mec Gly Gly Phe l，ys val Glu Asn Hi£J.Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His hys Ser 85 , 90 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <Λ00> S Asn Sbx Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cyc Arg Phe Cys lie Scr lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Aap Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110 -115 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 玉1明說明（113) <210> 7 <211> 96 <212> PRT<213> 哺乳動物（mammalian) <Λ00> 7 Phe pro Asp Gly Glu Phc Thr Met Gin Gly Cys Pro Glu Cys Iiys Leu 1 5 10 15 Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Ala Pro Ilo Tyr Gin Cys 20 25 30 Met Gly Cya Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys 35 40 45 I,,yf3 Thr Met Leu Val Pro Lys Asn lie Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys 50 55 60 Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Het Gly Aon Ala Arg Val 各 5 70 75 80 Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr HiG Lys Ser 85 90 95 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 8 <211》1U <212> PRT <213> 哺乳動物（mammalian) , <400> 8 Asn Ser Cys Glu Lgu Thr Asn II© Thr lie Thr Val Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Asn Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Λί?ρ Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn He Gin 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala Hi曰 I.Iis Ala Asp Ser r」eu Tyr Thr I'yr Pro Val Ala Thr 65 ’ 70 75 80 Glu Cys Kis Cys Gl.y Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val B5 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu 100 105 110 <210> 9 <2ll> 9G <212> PRT<213> 哺乳動物（mammalian)-116- 又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ta· 1277425 A7 B7 五7¥明說明（114) <400> 9

PhG Pro Asp Qly Glu Phe Thr Met Gin Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu 1 5 10 is

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe SQr Lys Pro Asp Ala Pro lie Tyr Gin Cys (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lyc 35 40 45

Lys Thr Mot Leu Val Pro Lys Asn He Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys 50 55 60

Val Ala Lyss Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val 65 70 75 80

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 95

c210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> 哺乳動物（mammalian) <400> 10

Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn X3.e Thr lie Thr Val Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 t

Cys Scr Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg 八sp Leu Val Tyr Lys _ Pro Ala Arg Pro Asn lie Gin 35 .40 45

Lys Ala Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His Hia Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 〇〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Glu Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Arg A3p Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ssr Phe Ser Asp lie Arg Glu 100 105 11.0

<210> 11 <211> 108 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 11

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 __-117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） A7 B7 1277425 玉1明說明（115)

Cys Arg Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala G].y Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu val Tyr Lys Asp fro Ala Arg Pro Lys He Gin 35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Scr Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 · 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu 100 105

<210> 12 <211> 109 <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 12

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn He Thr lie Ala 工le Glu L»ys Glu Glu 1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys 工le Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lya Asp Pro Ala Arg Pro Lys He Gin 35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe hys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lya Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Scr Phe Gly Glu Met 100 105

<210> 13 <211> 110 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 13

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys lie Ser*.工1g Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin 35 40 45 -118- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --裝 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五^¥明說明（116)

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Lgu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 5〇 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala· Thr 70 75 80 -----·-------·裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Tlir Asp Cys Thr val 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 100 105 no <210> 14 ·

<211〉 107 <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 14

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ilo Thr He Ala lie Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 2S 30

Tyr Thr Arg Asp hew Val Tyr Lys Acp Pro Ala Arq Pro Lys I],e Gin 35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Ara Val Pro 50 55 60 ^

Gly Cys Ala His liis Ala Asp» Ser Leu Tyi· Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Anp Sor Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val G5 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Pho Gly 100 l〇5

<210> 15 <211> 106 <212> PRT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <213> 人類（Homo sapiens) <400> 15

Asn Ssr Cys Glu Leu Thr Asn Ilc^ Thr lie Ala He Glu Lys Glu Glu 1 5 l〇 15

Cya Arg Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro T.；vs lie Gin 35 40 45

Lys Thr Cys rhr Pho Lyg Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Krg Val Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His A.la Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr -119- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1277425 A7 B7 五β明說明（117) 65 70 75 80 Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 35 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Ph.〇 100 105 <210> 16 .· <211> 105 · <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <aoo> 16 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr· lie Ala lie Glu Ly只 Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phc Cy3 lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cya Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Tlir Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro L»ys lie Gin 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 GO Gly Cys Ala His His Ala Asp Scr Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 is 80 Gin Cys His Cys Gly nys Cys Asp Ser Asp Scr Thr Asp Cys Thr Val 85 t 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser 100 105 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •-裝訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 17 <211> 109 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 17 Ser Cys Glu Leu Thr Asii lie Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu Cys 15 10 15 Arg Phe Cys Ils Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr 20 25 30 Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg pro Lys IIq Gin Lys 35 <10 45 . Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly 50 55 60 Cys Ala His His Ala Asp Ser Lqu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin 65 70 75 8〇 Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg 85 90 95 -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） #! 1277425 A7 B7 五1明說明（118) Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Sqt Phe Glv Glu Met Lyc 100 i〇5 <210> 18 <211> l〇8 <212> PR1* <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 18 ·. Cys Glu Leu Thr A〇n lie Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu Cys Arg 15 10 15 Ph© Cys Ho Sor lie Αεη Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Tlir 2〇 25 30 Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys He Gin Lys Thr 35 40 45 Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val. Pro Gly Cys 55 60 Ala Hib His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin Cys 65 70 75 80 His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly B5 90 95 Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Mei: Lys 100 ， i〇5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 19 ^ <211^ los <212> prt <213> 人類（Homo sapiens) <400> 19 Ser Cys Glu l,eu Thr Aen He Thr He Ala lie Glu Lya Glu Glu Cys 1 5 10 15 Arg ?he Cys lie 5er lie Asn Thr Thr Trp Cys Alci Gly Tyr Cys Tyr 20 25 30 Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin Lys 35 40 45 Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly 50 55 60 Cys Ala His Kis Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin 65 70 75 80 Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Scr Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg 85 90 95 Gly I.eu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met 100 105 <210> 20 -121- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） f 1277425 A7 B7 玉7赛明說明（119)

<211、，107 <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <40Q> 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Cys Glu Leu Thr Asri 工1。Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu Cys Arg 1 5 10 15

Pho Cys 工le Sgjc lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr 20 2S ·. 3〇

Arg Asp Leu Val fXYr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys He Gin Lys Thr 35 40 /15

Cya Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys 50 55 60

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin Cys 65 70 75 80

His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Aisp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg· Gly 85 90 95

Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met 100 105

c210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 21 '

Ser Cys Glu Lgu Thr Asn lie Thr lie Ala lie Glu Lys Glu Glu Cys 15 10 15

Arg Phe Cys Ilo Ser 工le Αση Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr 20 25 30

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 工le Gin Lys 35 40 45

Thr Cys Thr Phe Lys Clu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly 50 55 (50 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Cya Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin 65 70 75 80

Cya His Cyc Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser T.hr Asp cys Thr Val Arg 35 90 95

Gly Leu Gly Pro Sor Tyr Cys Ser Phe Gly Glu 100 105

c210> 22 <211> 106 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <ά00> 22 -122- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 玉1明說明（12())

Cys Glu Leu Thr Asn l].e Thr lie Ala lie G：Lu ’Lys Glu Glu Cys 7\rg 15 10 15

Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly，ryr Cys Tyr Thr 20 25 30

Arg Asp Lou Val Tyr Lyc Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin Lys Thr 35 40 d5

Cys Thr Phe Lys Glu Leu val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys 50 55 · 60

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin Cys 65 70 75 〇0

Hie Cya Gly Lys Cyc Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys.Thr Val Arg Gly 85 90 95

Leu Gly Pro Ser Tyr Cys ser Phe Gly Glu 100 105

<210> 23 <211> 106 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 23

Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie* Ala lie Glu Lys Glu Glu Cys 1 5 10 15

Arg Phs Cys lie Sor lie Asn rXhr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr 20 25 30

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin Lys 35 40 45

Thr Cye Thr Phc Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly 50 55 60

Cys Ala His Hip· Ala Asp S<ar Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin 65 70 Ί5 80

Cys His Cya Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg 95 90 95

Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly 100 105

<210> 24 <211> 105 <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 24

Cys Glu Leu Thr Asn He Thr lie Ala He Glu Lys Glu Glu Cys Arg 15 l〇 15

Phe Cys He Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr 20 25 30 -123- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i裝訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 玉1明說明（121 )

Arg Asp Leu Val Tyr Lye Asp Pro Ala Arg Pro Lys He Gin Lys Thr 35 40 45

Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys 5〇 55 6〇

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin Cys 70 Q〇

His Cys Gly Lys Cys Asp Ser A印 Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly 85 90 95

Leu Gly Pro 5er Tyr Cyp. Ser Phe Gly 100 105

<210> 25 <211> 105 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 25 .

Ser Cyc Glu Leu Thr Acn He Thr He Ale- He Glu Lys Glu Glu Cys .1 5 10 15

Arg Fhe Cys IlQ Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr 20 25 30 '

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Iiys A.sp Pro Ala Arg Pro Lye lie Gin Lys 35 40 45

Thr Cys Thr. PhG Lya Glu Leu Val TVr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly 50 55 60

Cys Ala Hie His Ala Acp Scr Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin 65 70 75 80

Cys His Cys Gly Lys Cys Asp ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg S5 90 95

Gly Lou Gly Pro Scr Tyr Cys Ser Phc 100 105

<210> 26 <211> 10/1 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens)

</!00> 2S

Cys Gl\i ijeu Thr Asn lie Thr 工le Ala lie Glu Lyg Glu Glu Cys Arg 1 5 10 1!5

Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr T?hr 20 25 30

Arg Asp Leu Val Tyr Lye Asp Pro Ala Arg Pro Lys 工lc Gin Lys Thr 35 40 45

Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly cys -124- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 五明說明 (122 ) 50 55 G0 ?\la His His Ala Acp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin Cys (35 70 75 80

His Cya Gly I.ys Cys Asp Ssr Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly 05 90 95

Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe ioo *

<210> 27 <211> 104 <2X2> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 27

Ser Cys Glu j,,eu Thr Asn I1g Thr lie Ala 工le Glu Lys Glu Glu Cys 15 10 15

Arg Phe Cys He Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr 20 25 30

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin Lys 35 40 45

Thr Cys Thr Phs Lye Glu Leu Val Tyr Olu Thr Val Arg Val Pro Gly 50 55 60

Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr ri.*yr Pro Val Ala Thr Gin 65 70 t 75 80

Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg 85 90 95

Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser 100

<210> 28 <211> 103 <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 28

Cys Glu Ijeu Thr Asn lie Thr 工le Ma lie Glu Lys Glu Glu Cys Arg 1 5 10 15

Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr 20 25 30

Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gin Lys Thr 35 40 45

Cys Thr Phe hys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys 50 55 60

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gin CyB 65 70 75 80 -125- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) •裝 f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1277425 A7 B7 明說明（ 123

His Cys Gly 乙ys Cys Asp Ser Λκρ Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly 85 90 95

Lgu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser 100 c210> 29 <211> 91 <212> PRT .. <213〉人類（Homo sapiens) <400> 23 Pro Aap Val Gin Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro Phe 15 10 15 Phs Ser Gin Pro Gly Ala Pro'll© Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys Pho 20 25 30 Ser Arc/ Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val 35 40 as Gin Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cye Val Ala Lye Ser Tyr 50 55 60 Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala 65 70 75 80 Cys Ilis Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 (請先閱讀背面之注意事項再褒寫本頁) Ϊ裝 .. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 30 1 <211> 90 <212> PRT <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 30 Asp Val Gin Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro Phe Phe 1 5 10 15 Ser Gin Pro Gly Ala Pro lie Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser 20 25 30 Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gin 35 40 45 Lys Λεη val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Lys Ser Tyr Asn 50 55 60 Arg val Thr val Mec Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys 65 7 0 7 5 8 0 Hie Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 <210> 31 <m> 89 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 B7 五1明說明（124 ) <A00> 31

Val Gin Asp Cys Pro Glu Cys Thr Lgu Gin Glu Azn Pro Phe Phe Ser 1 5 10 is (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

Gin Pro Gly Ala Pro lie Leu Gin Cys Met Qly Cys Cyc Phe Ser Arg 20 25 30

Ala IVr Pro Thr Pro Leu Arg Scr Lys Lys Thr Met Lea Val Gin Lys 35 40 .. 45

Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg 50 55 60

Val Thr Val Mec Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His 65 70 75 80

Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Scr 85 32

<211> c212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 32

gcccccgatig tgcagganng cccagaatgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag (SO ccgggtgcca caabacttca gtgcatgggc tgctacttct ccagagcata tcccacccca 120 ccaaggccca agaagacgac gccggcacaci aagaacgtca cctcagagtc cexcttgctgt 100 gtagctaaat catataacag gc/tcaca.gta aLggggggcc tcaaagtgga gaaccacacg 240 gcgcgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276

<210> 33 <211^ 324 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 33 aanagccgtg agccgacaaa catcaccacc gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60 ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc cacugctaca ccagggaccc ggcgcacaag 120 gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt: ataLgaaaca 1Θ0 gtgagagtac ccgcjctgtgc ccaccacgca gattccttgt acacacaccc agtggccacc 240 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cagcgtcact gtggcaagtg tgacagcgac egcactgatt gtactgtgcg aggcccggcjg 300 cccagctact. gcccci:匕匕gg tgaa 324

<210> 34 <211> 327 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) </!00> 34 aatagccgcg agccgaccaa catcaccacc gcaatzagaga aagaagaacg ccgtctctgc 60 ataagcafcca acaccacttg gtgfcgctggc tactgc匕aca ccagggatct: ggtgnauaag 120

Oacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca cgcaccttca aggaactggt: atatgaaaca 180 gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 2<10 cagtgtcact gtggcaagcg Cgacagcgac agcaccgatt gtactgtgcg aggcccgggg 300 ccccigctact gctcctttgg tgaaatg 327 __ - 127- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐) 1277425 A7 B7 玉1明說明（125 )

<210：> 35 <211> 330 <212^ DNA <213〉人類（Homo sapiens) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <Λ〇〇> 35 aatagctgbg agctgaccaa catcaccat匕 gcaatagaga aagaagaatg tcgtucccgc 60 anaagcatca acaccacccg gtgtgctggc tactgctaca ccagggaLct ggtgtataag 120 gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgcaccccba aggaactggu atatgaaaca 180 gcgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gabtccttg匕 atacataccc agt^gccacc 240 cagtgtcact gtggcaaata ugacagcgac agcaccgau: gtactgrgcg aggcctgggg 300 cccagctact gctcctttgg tgaaatgaaa 330

<U0> 36 <211> 333 ,<212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 36 aacagccgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60 ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc cacugctaca ccagggatot ggtgtataag 120 gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca fcgtaccbtca aggaactggt atatgaaaca 180

Htgagagtgc ccggccgtgc ucaccatgca gaccccctgc atacataccc agtggccacc 240 cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggc; 300 ccca〇ctact gctcccccgg cgaaatgaaa gaa 333

<210> 37 <211^ 27S <212> DNA ' <213〉人類（Homo sapiens) <400> 37 gcccccgacg tgcaggattg cccagaacgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag 60 ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc tgctgcttct caagagcaca tcccactcca 120 ctaaggtcca agaagacgat gttggcccaa aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt 100 gtagctaaat catataacag ggtcacagLa acggggggtt ccaaagcgga gaaccacacg 240 gcgcgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276

<210> 38 <211> 324 <212> DNA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <213 > 人類（Homo sapiens) , <400> 38 aacagctgtg agctcaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60 atahcgatca acaccacttg gcgcgctggc tactqccaca ccagggatct ggtgtataag 120 gacccggccc gtcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180 qccicgcgtgc ccggccgcgc ccaccatgca gattccccgc atacauaccc agtggccacc 240 cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300 cccagctiact gctcccccgg cgaa 324

<210> 39 <211> 321 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) -128- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1277425 A7 B7 五β明說明（126 ) <400〉 39 aatage匕gtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaacg tcgtttctgc 60 acaageatea acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct: ggtgtataag 120 gacccagcca ggccx*aaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca ISO gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt Qtacataccc agtggccacc 240 cagtgtcact Qtcjgcaagzg tgacagcgac agcactgacc gcactgtgcg aggcctgggg 300 ccccigctact gctcctttgg t 321 <210> 40 · <211^- 318 * <212> DMA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 40 satagctgtg cigcbgaccaa cdtcaccat匕 gcaatagaga ataagcacca acaccactzcg gcgcgccggc tactgccaca gacccagcca cjgcccaaaat ccagaaaaca tataccttca gtgagagcgc ccggccgtgc tcaccacgca gattccttgt cagtgtcact gtggcaagtg fcgacagcgac agcaccgatt cccagcccict gctcctcc aagiiagaatg ccagggatct aggaaciiggt atacataccc gtaccgtgcg tcgcccccgc 60 ggtgtataag 120 acatgas«ca 180 ^srtggccacc 240 aggcctgggg 300 <210> 41 <211> 315 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 41 aatagctgcg agatgaccaa caccaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60 ataageated acaccacttg gtgtgctggc tacLyctaca ccagggaccL ggtgtataag 120 gacccagcca ggcccaanat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 1BQ gbgagagtgc. ccgQctgtgc tcaccatgca g!atcccttgt acacacaccc agcggccacc 240 cagtgccact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgdtt gtactgtr/cg aggcctgggg 300 cccagctact gcccc 315 <210> 42 <211〉 327 <212> OUh <213〉人類（Homo sapiens) in*-------裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------等· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 42 QgcLgtgagc agcaccaaca ccagccaggc agagtgcccg cgtcacugtg agctac匕get tgaccaacac ccacttggtg ccaaaatcca gctgtgctca gcaagtgega cctttggtga caccacugca tgctggctac gaaaacacgc ccatgcagafc cagcgacagc aatgeiaa atagagaaag tgctscacca accttcaagg teettgtata actigattgta aagaaegteg gggatctggt aactggtata caLacccagt ctgtgcgagg tttctgcata 60 gtataaggac 12 0 tgaaacagtg 190 ggccacccag 240 cctggggccc 300 <210> A3 <211> 324 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 43 cgtgagctga ccaacatcac cattgcaata atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc gtgcccggcc gugctcacca tgcagactcc gagaaagaag aaugucgttt tacaccaggg atctggtgta ttcaaggaac tggcatatga Ctgtatacat acccaotggc ctgcataagc 60 taaggaccca 120 aacagtgaga 130 cacccagtgt 2Ί0 -129- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1277425 A7 B7 127 明說明（ cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg cgcgaggcct ggggccccigc 300 caccgctccc ccggcgaaac gaaa. 324 <210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> 人類〇H〇mo sapiens) <400> 44 agctgtgagc agcatcaaca ccagccaggc cigagtgcccg tgtcaccgtg age匕actgct cgaccaacat ccacttggtg ccaaaatcca acLgtgctca gcaagtgtga ccctcggcga caccattgca tgccggctac gaaaacatgt ccatigcagat cagcgacagc aatig atagagaaag tigctacacca accbtcaagg cccttgtata actgattgta aagaatgtcg gggacctggt a¾c匕ggta匕a cacacccagt c匕gtgcg&gg tttctgcata 60 gtataaggac 120 tgaaacagtg 160 ggccacccag 240 ccuygggccc 300 324 <210> 4S <211> 321 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 45 tgtgagctna. atcaacacca gccaggccca gtgcccggct cactgtggca tactgctcct ccaacatcac cttggtgtgc aaaccca〇aa gtgctcacca agcgcgacaa ttggtgaaat caccgcaata tggctactgc aacatgcacc tgcagattcc cgacagcacc g gagaaagaag tacaccaggg r-ccaaggaac ttgtatacat gatcgcactg aacgccgttt atctggtgta tggtatatga iicccagtggc tgcgaggcct ctgcataagc 60 caagyaccca 120 aacagtgaga 180 cacccagcgL 240 ggggcccagc 300 321 <210> AS 1 321 <212> Dm <213> 人類（Homo sapiens)

<400> 4G agctgtgagc agcaccaaca ccagccaggc agagcgcccg tgtcactgcg agccactgct tgaccaacat ccactcggcg ccaaaatcca gctgtgctca gcaagfcgtga cctttgg匕ga caccattgca cgctggcteic gaaaacatgi: ccatgcagat cagcgacagc atagagaaag tgctacacca accttcaagg teettgtata acigattgta aagaatgtcg gggatctggt sacuggtata catacccagt ccgcgcgagg tttctgcata 60 gtataaggac 120 tgaaacagtg 180 ggccacccag 240 cccggggccc 300 321 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 47 <21i> 318 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 47 cgrgagctga atcaacacca gccaggccca gtgcccggci: cactgtggca Lactgctcct ccaacaccac cttggugcgc aaatccagaa gtgctcacca ^9tgtgacag teggeejaa cattgcaata cggcuactgc aacaLtgtacc tgcagacccc cgacagcact gagaaagaag tacaccaggg 匕匕 caexggaac Ctgtatacat gattgtactg aatgtcgttt acccggtgta tggtatatga acccagcggc tgcgaggcct ctgcataagc 60 taaggaccca 120 aacagtgaga 180 cacccagtgt 240 ggggcccaQC 300 318 <210> 48 -130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1277425 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製明說明（128 ) 〇-U) 318 <212> DN^ <213> 人類（Homo sapiens) <400 48 agctgtgagc cgaccaacac caccatiigca agcatcaaca ccacttggtg tgctggctac ccagccaggc ccaaaacccci gaaaacatgt agagtgcccg gctgtgctca ccatgcagat tgtcactgtg gcaagtgtga cagcgacagc agctiactgct cctttggt; aliagagaaag aagaacgccg cccccgcaca GO tgctacacca gggatctggt gnettiaaiggac 120 acctccaagg aactggtata tgaaacagtg 180 tccccgcaua caizacccagt ggccaccc〇g 240 actgattgta ctgfcgcgagg cctggggccc 300 • 318 <210> 49 <211> 315 <212> DNA <213 > 人類（H〇mo saPiens) <d00> 49 tgtgagctga ccaacatcac caa：tqTcaiata atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc gccaggccca aaacccagaa aacatguacc gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc cactgtggca agcgcgacag cgacagcacc tactgctcct ttggt <21Q> 50 <211> 315 <712> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 50 agctgtgagc tgaccaacat caccattgca agcaccaaca ccacttggtg tgctggctac ccagccaggc ccaaaatcca gaaauc^tgt agagtgcccg gctgtgctca ccatgcagat tgtcactgtg gcaagtgtga cagcgacagc agctactgcc ccccc <210> 51 <211^ 312 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 51 tgcgagctga ccaacatcac cattgcaata atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc gccaggccca ciaatccagaa aacatgtacc r/tgcccar/cc gtgctcacca tgcagattcc cactgtggca agtgtgacag cgacagcact tactgccccc tc <210> 52 <?·11> 312 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 52 gagaaagaag aacgccgctc ccgcacaagc 60 tacaccaggg atctggtgta taaggaccca 120 ttcaaggaac cggtacacga aacagcgaga ISO btgta匕aca匕 acccagtggc cacccagtgl: 240 gactgtactg tgcgaggccc ggggcccagc 300 315 atagagaaag aagaatgtcg tttctgcata 60 tgccacacca gggatctggt gtataaggac 120 accttcaagg aactggtata tgaaacagcg 180 tccttgtata catacccagt ggccacccag 240 eictgattgta ctgtgcgagg cctggggccc 300 315 gagaaagaag aacgtcgttc ctgcaeaagc 60 tacaccaggg atctggtgca tzaaggaccca 120 ttcaaggaac tggtatatga aacagtgaga ISO tcgtacacac acccagcggc cacccagtgc 740 gatfcgtactg tgcgaggcct ggggcccagc 300 312 131- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --裝訂--- 錚 1277425 A7 B7 五1明說明（ agctgtgagc agcatcaaca ccagccaygc ^gcigtgcccg Ugtcactgcg agctactgct 129 ^ tgaccaacac ccacttggtg ccaaaaccca gctgtgctca gcaagcgtga cc caccatLgca tgctggctac gaaaacatgt ccatgcagat cagcgacagc atagagaaag tgctacacca acccccaagg tccctgLata actgattgta aagastgtcg gggatctggt aactggtata catacccagc ctgtgcgagg ntcctgc^ta GO gtataaygac .120 tgaaacagtg 180 ggccacccag 240 cctggggccc 300 312 <210> 53 <2U> 309 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <d00> 53 tgtgagctga atcaacacca gccaggccca gtgcccggct cactgcggca tactgctcc ccaacatcac cttggtgtgc aaatccagaa gtgctcacca agtgtgacag cattgcaata tggctactgc aacacacacc tgcagattac cgacagcacc gagaaagaag tacaccaggg ttcaaggaac ttgtatacat gattgtaccg aacgccgttt atctgg匕gta tgg'Catatga acccagbggc tgcgaggcct ctgcacaagc 60 taaggaccca 120 aacagcgaga 180 cacccagtg仁 240 ggggcccagc 300 309 <；.10> 54 <211> 273 <?.12> DNA. <213> 人類 0®〇mo saP—s) <400> 54 cccgatgtgc aggattgccc agaatgcacg cbacaggaaa acccattctt ctcccagccc/ ggtgccccaa tacttcagtg cacgggcngc tgcttctcta gagcatatcc cactccacta aggtccaaga· agacgatgt匕 ggtccaaaag aacgtcacct cagagucccic ttgctgtgca getaaatcaT： ataacagggt cacagcaacg gggggtttca aagtggagaa ccacacggcg tgccactgca gtacttgcta ttatcacaaa tct 60 120 180 240 273 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--- <210> 55 <211> 270 <212> DNA <213 > 人類（Homo sapiens) <400> 55 gatgtgcagg attgcccaga atgcacgcta caggaaaacc cattcttctc ccagccgggt: gccccaatdc ttcagcgcac gggctgctgc ttccccagag catatcccac tccactaagg tccaagaaga cgatgttggt ccaaaagaac gtcacctcag acjuccacttg ctgtgtagc匚 aaancatata acagggtcac agcaatgggg ggtttcaaag tggagaacca cacggcgtgc cactgcagta c匕匕gttatta tcacaaatct 等經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 60 120 180 240 270 <2]，0> 56 <211> 267 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 56 gtgcaggatt gcccagaatg cacgctacag gaaaacccat ccctctccca gccgggtgcc ccaatactcc agtgcatggg ctgccgcccc tctagagcat atcccac匕cc actaaggtcc aagaagacga tgttggtcca aaagaacgtc acctcagagt ccacttgccg tgcagccaaa tcatataaca gggccacagt aatggggggt ctcaaagtgg agaaccacac ggcgtgccac tgcagtactt gttafctatca caaatct • 132· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） SO 120 180 240 267

Claims

Ai5 B8 C8 19 06884號專利申請案丄厶/ 請專利範園替換本(95年10月) 申請專利範園 (：: 年 1. -種遞送至哺乳動物肺深部之經穩定之乾粉組成物，其含有： (1)藥學上有效劑量之濾泡刺激蛋白質（FSP)， (ii)藥學上可接受之賦形劑，及 (出)視需要的吸收加強劑，其中當該吸收加強劑存在於組成物中時，其劑量相對於F S P係小於1 0重量％，其中該藥學上有效量之FSP為按該組合物之重量計之約 1.0% 至約 15.0%，其中該組成物含有具鬆密度由〇·!至10克/立方公分之粒子，其中該組成物具有至少50 IU/毫克FSH之比活性，其中該組成物當在室溫環境條件下貯放一個月時，可維持最初生物活性之至少約7 0 %，且其中該賦形劑係選自由蛋白質、多肽、胺基酸、聚胺基酸、脂質、碳水化合物、緩衝物質及聚合劑所組成之群。 2·根據申請專利範圍第丨項之組成物，其特徵在於相對肺生物利用率在1〇/〇及60%之間。 3·根據申請專利範圍第丨項之組成物，其特徵在於相對肺生物利用率在1%及30%之間。 4·根據申請專利範圍第丨項之組成物，其特徵在於相對肺生物利用率在1〇/〇及20%之間。 5·根據申請專利範圍第1項之組成物，其殘留的水汽含量少於約10%按重計。 63749A-951030.DOC . ι . 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1277425 B8 C8 D8 、申請專利範圍 6·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中FSP之特異生物活性是每克粉末大於1〇〇 IU按重計。 7·根據申請專利範圍第1項之組成物’其中FSP之特異生物活性是每克粉末大於1000 IU。 8·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中FSP之特異生物活性是每克粉末大於5,000 IU。 9·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中FSP之特異生物活性是每克粉末大於25,000 IU。 10·根據申請專利範圍第1項之組成物，其特徵在於當以吸入方式投予至肺或肺深部時，分佈相半衰期介於1 及50小時之間。 U.根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該FSP係以重組方式產製。 12·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該FSP是由人類尿液衍生之FSH。 13·根據申請專利範圍第11項之組成物，其中該以重組體方式產製之FSP是hFSH變型。 14·根據申請專利範圍第13項之組成物，其中該hFSH變型包括無SEQ ID ΝΟ:8 β亞單位摻雜之變型多肽。 15·根據申請專利範圍第13項之組成物，其中該hFSH變型包括其胺基酸序列選自包括SEQ ID NOS:ll，12， 13，Η，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27及28之變型多肽。根據申請專利範圍第13項之組成物，其中該hFSH變 -2- 63749A-951030.DOC t @ B ^if(CNS) A4»(210X297/^) B8 C8 D8 1277425 六、申請專利範圍型包括含有一個以亞單位及一個可變的β亞單位之異二體。 17·根據申請專利範圍第16項之組成物，其中該變型異二體無SEQIDN0:8 β亞單位之掺雜。 18.根據申請專利範圍第a項之組成物，其中該hFSH變型異一體包括選自 SEQ ID N0S:11，12，13，14，15， 16 ’ 17 ’ 18 ’ 19，20，21，22，23，24，25，26，27 及28之變型β亞單位。 !9·根據申請專利範圍第μ項之組成物，其中該hFSH變型異二體包括選自SEQ ID NOS:29，30及31 亞單位。 20·根據申請專利範圍第13項之組成物，其含有二個以上不同的hFSH變型多肽或異二體。 21·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物含有具質量中值直徑（MMD)由約0_1至20微米之粒子。 22.根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物含有具質量中值直徑（MMD)由約0.1至10微米之粒子。 23·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物含有具質量中值直徑（MMD)由約0.5至7微米之粒子。 24·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物含有具質量中值氣霧動力直徑（MMAD)少於約1〇微米之粒子。 25·根據申請專利範圍第24項之組成物，其中該組成物含有具質量中值氣霧動力直徑（MMAD)由約1.5至約3.5 63749A-951030.DOC 本紙張尺度適财S S家鮮(CNS) A4規格(210X297公釐). ' B8 C8 D8 1277425 申請專利範圍微米之粒子。 26·才良、睛專利範圍第1項之組成物，其含有具鬆密度由0.15 $ 4·古/上、 97 , 至4克/互万公分之粒子。 ^7·根據φ枝 %專利範圍第1項之組成物，其含有具鬆密度由0 17 至0·75克/立方公分之粒子。 &根據Φ i 、叫專利範圍第1項之組成物，其具有大於30% 之射出劑量。根據电、、清專利範圍第2 8項之組成物，其具有大於50% 之射出劑量。、據申請專利範圍第1項之組成物，其具有大於55% 之射出劑量。根據申請專利範圍第1項之組成物，其具有大於60% 之射出劑量。根據申請專利範圍第1項之組成物，其係呈噴灑乾燥形態。根據申琦專利範圍第丨項之組成物，其進一步含有緩衝用鹽類。根據申請專利範圍第3 3項之組成物，其一旦在水中溶解呈現約4及10間之pH值。 35·根據申請專利範圍第丨項之組成物，其中該賦形劑是蚊水化合物。充.根據申請專利範圍第35項之組成物，其中該碳水化合物職形劑選自下列包括甘露醇，海藻糖及鼠李糖。苁根據申請專利範圍第i項之組成物，其中該賦形劑選 63749A-951030.DOC -4. 本紙張尺度適用中S S家標準(CNS) A4規格(21G><297錢)

訂線

Αό 1277425 I 六、申請專利範園自下列包括胺基酸，聚胺基酸，多肽及蛋白質。 38.根據中請專利範圍第3 7項之組成物，其中該賦形劑是胺基酸選自下列包括白胺酸，異白胺酸，及正白胺酸。 39·根據申請專利範圍第3 8項之組成物，其中該賦形劑是白胺酸。 40.根據申請專利範圍第3 9項之組成物，其含有2〇%-80% (w/w)白胺酸。 41·根據申請專利範圍第4 0項之組成物，其含有4〇%_6〇0/〇 (w/w)白胺酸。 42根據申印專利範圍第1項之組成物，其含有Fsp，甘露醇及禪樣酸鹽。 43·根據申請專利範圍第！項之組成物，其含有Fsp，白胺酸及檸檬酸鹽。 44 一種製備申請專利範圍第丨項之經穩定乾粉Fsp組成物之方法，此方法包括： ⑴混合FSP及賦形劑與溶劑，以形成溶液或懸液，及 (ii)在適於形成根據申請專利範圍第〗項之可吸入且具生物活性之FSP之條件下，將該溶液或懸液乾燥。 45‘根據中請專利範圍第44項之方法，其中該乾燥步驟包括噴灑乾燥。牴根據申印專利範圍第4 4項之方法，其中該混合於含有孩贼形劑之溶劑中，以形成pH值由約4至10 之溶液。

A8 1277425 .¾ —_ 」_ D8 六、申請專利範圍 47.根據申請專利範圍第4 4項之方法，其中FSH在該溶劑中之量包括溶液或懸液總固體粒子含量的由約〇〇1 至 10%。 48·根據申請專利範圍第44項之方法，其中該溶劑是水或醇。 49.根據申請專利範圍第4 4項之方法，其中FSP在乾燥粉末中唾液酸化之程度至少是乾燥前FSP唾液化程度的至少約30%。 5〇· —種將FSP遞送至哺乳動物病患肺部之方法，該方法包括以吸入方式投予呈氣霧化型式之根據申請專利範圍第1項之乾粉組成物。 51. —種將FSP遞送至哺乳動物病患肺部之方法，該方法包括以吸入方式投予呈氣霧型式之根據申請專利範圍第19項之乾粉組成物。 52·根據申請專利範圍第1項之乾粉組合物，其係以治療有效之劑量經由吸入方式投予，以沈積及吸收自哺乳動物個體之肺部而治療該哺乳動物個體之不孕症。 53·根據申請專利範圍第1 9項之乾粉組合物，其係以治療有效之劑量經由吸入方式投予，以沈積及吸收自哺乳動物個體之肺部而治療該哺乳動物個體之不孕症。 54·根據申請專利範圍第52或53項之乾粉組合物，其中该個體是不孕的雌性，且由於投予該組成物歷至少3_ 20天過程，該個體可呈現增加的濾泡生長水平，此係與投藥前偵測之水平相較而言。 63749A-951030.DOC _6_ ΐ紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐). ----- 1277425、甲m寻利範圍

55·根據申請專利範圍第52或53項之乾粉組合物 ▲ 療有效劑量包括每天由約10至1，0〇〇 IU。免根據申請專利範圍第52或53項之乾粉組合物 ▲ 療有效劑量包括每天由約50至3,〇〇〇 ιυ。 57·根據申請專利範圍第5 2或5 3項之乾粉組合物々冶療有效劑量包括每天由約200至12,000 IU。 58·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該吸收加強劑不存在於組成物中。 59·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物具有最多13, 500 IU/毫克FSH之比活性。 ④·根據申請專利範圍第5 9項之組成物，其特徵在於相對肺生物利用率在1 %至6 0 %之間。 61·根據申請專利範圍第5 9項之組成物量少於約1 〇重量〇/〇。 62·根據申請專利範圍第5 9項之組成物比生物活性是每克粉末大於1 0 0 I U 63·根據申請專利範圍第5 9項之組成物吸入方式投予至肺或肺深部時，分佈相半衰期介於及5 0小時之間。 64·根據申請專利範圍第5 9項之組成物，其中該組成物含有具質量中值直徑（MMD)由約0.1至20微米之粒子。 65·根據申請專利範圍第59項之組成物，其中該組成物含有具質量中值氣霧動力直徑（MMAD)少於約1〇微米之粒子。其中其中其中其殘留的水汽含其中該FSH之其特徵在於當以 63749A-951030.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） I2J7425 -—一申請專利範園的·根據申兮杳轰 %專利範圍第5 9項之組成物，其具有大於 3 0 /〇之射出劑量。 67.根據中枝番明專利範圍第5 9項之組成物，其係呈噴灑乾燥形態。货·根據Φ马· & %專利範圍第5 9項之組成物，其進一步含有緩衝用鹽類。 ④·根據φ ^太— %寻利範圍第5 9項之組成物，其中該賦形劑是碳水化合物。根據申晴專利範圍第5 9項之組成物，其中該賦形劑選自由下列各物組成之群：胺基酸，聚胺基酸，多肽及蛋白質。 71·根據申凊專利範圍第5 9項之組成物，其含有F S Ρ，甘露醇及檸檬酸鹽。根據申叫專利範圍第5 9項之組成物，其含有F S Ρ，白胺酸及檸檬酸鹽。 U —種製備申請專利範圍第5 9項之經穩定之乾粉ρ s Ρ 組成物的方法，此方法包括·· (I) 混合FSP及賦形劑與溶劑，以形成溶液或懸液，及 (II) 在適於形成根據申請專利範圍第5 9項之可吸入且具生物活性之FSP之條件下，將該溶液或懸液乾燥。 74. —種將F S Ρ遞送至哺乳動物病患肺部之方法，該方法包括以吸入方式投予呈氣霧化型式之根據申請專利範圍第5 9項之乾粉組成物。 63749A-951030.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公复)