TWI755377B

TWI755377B - 穩定的液態促性腺激素調配物

Info

Publication number: TWI755377B
Application number: TW106106132A
Authority: TW
Inventors: 海倫 U. 史喬格倫; 恰洛特后傑彼得森
Original assignee: 荷蘭商菲林公司
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2022-02-21
Also published as: KR20180114178A; SI3419595T1; JOP20170046B1; BR112018015166A2; ES2862193T3; EA201891905A1; RS64929B1; PH12018501688A1; MA52595B1; IL260626B2; EP4257149A2; SI3791860T1; US10792334B2; TN2018000284A1; EP4257149A3; EA036383B1; DK3419595T3; MA43686B1; HRP20231477T1; EP3419595B1

Abstract

本發明大略而言有關促性腺激素調配物，特別是促性腺激素之液態調配物之穩定化的領域。該穩定化可通過特定的賦形劑，較佳地精胺酸以及甲硫胺酸，之組合達到。在一較佳實施例中，該調配物不含緩衝劑。

Description

穩定的液態促性腺激素調配物

發明領域

發明背景

促性腺激素是一種荷爾蒙，其基本上主要參與女性與男性的生育周期。促性腺激素可從尿液衍生而來，可用於研究以及治療二種目的，然而許多促性腺激素如hCG、LH以及FSH亦可重組產生。

特別是，促性腺激素可用於治療不孕症。

四種主要的促性腺激素均屬於相同的糖蛋白家族。此等是促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體激素(LH)以及(人類)絨毛膜促性腺激素(hCG)。此等促性腺激素全部均為異二聚體，且由α以及β次單元構成；α次單元是全部共同的，即，對以上所提及之四種促性腺激素而言均相同的，然而β次單元分別不同。FSH的作用是由不同的FSH受體介導。LH與HCG之β鏈共享82%之蛋白序列同源性，且透過相同的LH受體產生其等之作用。

FSH是由腦下垂體前葉天然分泌的，作用是支持濾泡之發展以及排卵。FSH包含一個92個胺基酸之α次單元，亦共同見於其它糖蛋白激素如LH與hCG，以及一個FSH獨有的111個胺基酸之β次單元，其提供該激素生物專一性(Pierce and Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50: 465-495)。hCG之成熟的β次單元是由145個胺基酸構成。FSH與hCG中之各次單元是轉譯後經由添加複合碳水化合物殘基修飾的。對於FSH，二個次單元均帶有二個供N-連結聚醣附著的位置，α次單元的位在胺基酸52與78處，而β次單元的位在胺基酸殘基7與24處(Rathnam and Saxena, (1975) Primary amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17):6735-6746；Saxena and Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, J Biol Chem. 251(4): 993-1005))。因此FSH有約30質量%是醣化的(Dias and Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6): 510-519；Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89)。hCG之β次單元含有N-與O-糖化二者(N-13、N-30、O-121、O-127、O-132以及O-138)。hCG之β次單元中額外的醣化，使其比FSH更具親水性。β-次單元提供與受體交互反應之專一性。

尿衍生的促性腺激素在臨床上已經使用超過40年了，其等之安全性已經很成熟。相較於第一代，新世代的高純化(HP)尿衍生的促性腺激素已經引進有一段時間。純度的提高是經由添加額外的純化步驟達成，諸如陰離子交換以及疏水交互作用色層分析步驟，用以移除無FSH和/或LH活性之尿蛋白。新世代促性腺激素製品之顯著增加的純度，有助於更全面的表徵研究，提供有關組成的其它資訊。

純化的尿FSH以及人類停經期促性腺激素(hMG)，二者均是從停經後婦女的尿液分離而來，用於不孕症之治療已有許多年了，其可於輔助生殖技術(ART)之前進行控制卵巢刺激(COS)之病人中，誘導(單)排卵或刺激多個濾泡。在90年代中期，開始有二種FSH之重組版本可使用，Gonal-F^® (follitropin alpha, Merck Serono)以及Puregon^®/Follistim^® (follitropin beta, Merck)。二種產品均是由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株表達的(Howles, C.M. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2: 172-191)。

CHO細胞常用於藥學重組蛋白之生產。結構分析已確定唾液酸僅通過α2,3-鍵聯連接。許多人類糖蛋白含有通過α2,3-與α2,6-鍵聯唾液酸殘基二者之混合物。因此，使用CHO系統表達之重組蛋白最後的唾液酸鍵聯類型，將與其等之天然對應體不同。

不孕症

在本文中，"不孕症"定義為懷孕以及生育後代的能力下降或無法懷孕以及生育後代。能夠懷孕但是重複流產的婦女也被認為是不孕症。不孕症亦具體的定義為在無避孕的正常性生活一年下仍無法懷孕之情況。不孕可由許多的原因引起。研究顯示有一半多的不孕症案例是女性病況引起的。剩餘的案例是由精子的毛病以及無法解釋的因素引起的。

目前有許多治療不孕症的可能性。

該等可能性是定時性交；使用輔助生殖技術(ARTs)；醫療管理子宮內膜異位、排卵誘導(OI)、子宮肌瘤以及女性性功能障礙(FSD)；以及手術糾正異常。

輔助生殖技術以及OI是使用藥物刺激排卵。除了主要負責排卵刺激的FSH外，促性腺激素製品可包含LH和/或hCG。

目前在治療不孕症之臨床實務上，使用許多含有從懷孕或停經後婦女之尿液衍生而來之促性腺激素之不同的藥品，諸如含有1：1比率的FSH與LH生物活性之HMG(人類停經期促性腺激素)製品(見如USP版本35，尿促性素專論)以及僅含有FSH生物活性之製品。從1995年起開始可得到重組DNA技術產生之促性腺激素產品。

因此，提供此促性腺激素化合物單獨或混合形式之安定的調配物是很重要的。

因此，本發明之一目的是提供一種穩定的、具有一或多種促性腺激素(特別是包含hCG，可選地結合FSH之組成物)之調配物，特別是液態調配物。本發明之另外的目的是提供一種穩定此調配物之方法。另一目的是提供一種在貯存條件下可穩定12個月，較佳地24個月，甚至更佳地24個月加上1個月“使用中”，即室溫下，之調配物。

發明概要

本發明有關穩定的液態促性腺激素調配物。在一較佳實施例中，此等調配物包含hCG。在亦較佳實施例中，此調配物包含FSH與hCG二者。本發明之調配物中之促性腺激素較佳地為尿衍生的或血漿衍生的，但在選擇性實施例中可為重組產生的。

在下文中，術語“hMG”可與“來自尿液的促性腺激素”交換使用。大部分來自尿液的促性腺激素是來自人的尿液。

人類絨毛膜促性腺激素(hCG)會貢獻LH(黃體激素)之活性，其是形成目前批准的藥物適應症之原因。此是一眾所周知之事實，且描述為hMG製品的產品特性概述(SmPC)之一部分，像是目前授權請求相同的適應症之Menopur®產品。於此等SmPC中，Menopur®包含FSH以及LH活性，但額外確認hCG是形成至少部分的LH活性之原因。因此，本發明之內文中任何有關hCG的說明，均涵蓋包含歸因於hCG之LH活性之調配物。

較佳實施例包括下列：

1.一種液態藥學促性腺激素調配物，其包含一促性腺激素、50至160mM之量的精胺酸、以及0.05至1.5mg/ml之量的甲硫胺酸，其中該調配物不含一額外的緩衝劑，且其中該調配物之pH介於6.0與7.5之間。

2.如項目1之藥學調配物，其中該促性腺激素包含hCG(人類絨毛膜促性腺激素)以及可選地FSH和/或LH。

3.如項目1或2之藥學調配物，其中該促性腺激素包含hMG(人類停經期促性腺激素)。

4.如項目1至3中任一項之藥學調配物，其中該促性腺激素(諸如FSH、LH和/或hCG)是人源的以及尿衍生的。

5.如項目1至3中任一項之藥學調配物，其中該促性腺激素(諸如FSH、LH和/或hCG)是重組的。

6.如前述項目中任一項之藥學調配物，其額外包含一防腐劑，較佳地苯酚。

7.如前述項目中任一項之藥學調配物，其額外地包含一界面活性劑，較佳地聚山梨醇酯，甚至更佳地聚山梨醇酯20。

8.如項目6或7之藥學調配物，其中該防腐劑，較佳地該苯酚，存在之量為4-6mg/ml，較佳地量為5mg/ml。

9.如項目7或8之藥學調配物，其中該界面活性劑，較地該聚山梨醇酯20，存在之量為0.001-0.05mg/ml，較佳地量為0.005mg/ml。

10.如前述項目中任一項之藥學調配物，其中該精胺酸較佳地為L-精胺酸HCl。

11.如前述項目中任一項之藥學調配物，其中該hMG存在之量為300-900，更佳地500-700，甚至更佳的600-650，極佳地625 IU/ml。

12.如前述項目中任一項之藥學調配物，其由下列構成：- 625I U/ml之hMG，- 0.15mg/ml之甲硫胺酸，- 150mM之精胺酸，- 5mg/ml之苯酚，- 0.005mg/ml之聚山梨醇酯20，- 注射用水(WFI)，以及 - 其中該調配物具有pH為6.8+/-0.3。

13.一種如前述項目中任一項所述之液態藥學調配物於不孕症之治療方法中之用途。

14.如項目13之藥學調配物之用途，其中該治療是排卵誘導(OI)、輔助生殖技術(ART)和/或男性低促性腺激素性性腺功能減退症之治療。

15.一種穩定包含hMG之一液態藥學調配物之方法，其包含下列步驟：- 提供來自人類婦女之尿液之一樣本- 萃取hMG - 以如前述項目中所界定之量，將該萃取物與精胺酸以及甲硫胺酸調製在一起，- 可選地另外添加如前述項目中所界定之量之苯酚以及聚山梨醇酯，- 調整pH，提供具pH介於6.0與7.5之間之調配物，- 其中沒有添加額外的緩衝劑。

如上所述，促性腺激素如FSH與hCG以及LH，適合用於治療不孕症。在這方面，很清楚地此等促性腺激素之液態調配物可能不穩定；即使該等促性腺激素預定為單次使用事實仍如此。若該液態調配物包含如所有多劑量調配物規定之防腐劑時，不穩定甚至更嚴重。

本發明之調配物可分別預定為單次使用或多次使用。

調配於本發明調配物中之FSH可為尿或血漿衍生的或重組的FSH(rFSH)。在一較佳實施例中，該FSH是尿或rFSH；特佳地其為尿FSH。

如上所述，現在已經能夠以重組之方式生產促性腺激素，像是FSH、LH或hCG。因此，在此所指之促性腺激素通常總是包括尿或血漿衍生的以及重組的(r)促性腺激素二者，除非另有指定。因此，如提到“FSH”時亦涵蓋rFSH。FSH、hCG以及LH之生產以及胺基酸序列以及核苷酸序列均為此技藝之人士熟知的。

可在本發明中使用之序列如下：

FSH、LH以及hCG α次單元(序列辨識編號：1)

(亦可見Fiddes, J.C. and Goodman, H.M. The gene encoding the common alpha subunit of the four human glycoprotein hormones J. Mol. Appl. Genet. 1 (1), 3-18(1981))

(下標部分是前導肽)(116)

FSH β次單元(序列辨識編號：2)

(亦可見Saxena,B.B. and Rathnam,P. Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands J. Biol. Chem. 251 (4), 993-1005 (1976))

(下標部分是前導肽)(129)

hCG β次單元(序列辨識編號：3)

(亦可見Fiddes, JC, Goodman HM. The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region Nature. 1980 Aug 14; 286(5774):684-7)

(下標部分是前導肽)(165)

LHβ次單元(序列辨識編號：4)

(亦可見Sairam, M.R. and Li, C.H. Human pituitary lutropin. Isolation, properties, and the complete amino acid sequence of the beta-subunit Biochim. Biophys. Acta 412 (1), 70-81 (1975))

(下標部分是前導肽)(141)

在一選擇性實施例中，所有的實施例中之rFSH或rHCG分別是長效型rFSH或rhCG。此一長效型FSH調配物可由熟悉此技藝之人士一般熟知之方式獲得，如藉由修飾該FSH分子或修飾該調配物。

在此使用之“FSH”涵蓋以上所述之FSH之所有可能的尿衍生或重組形式，以及FSH形式之所有可能的組合。亦涵蓋的是供單次使用之調配物以及一或多種供多次使用之其它的調配物(具相同或不同的促性腺激素)。

一種可能的產品是包括FSH(在一較佳實施例中，亦包括hCG和/或可選地LH、LH活性等等)之調配物，全部於不同的容器中。若存在LH活性時，其可源自LH或hCG。LH可用等劑量的hCG取代，反之亦然；本文中之“等劑量”可用此技藝中熟知之方式計算而得。

特佳的促性腺激素組合是FSH與hCG之組合，較佳地是裝在一容器中之hMG調配物，但可選地亦可如在不同的容器中，像是小玻璃瓶或藥筒。

可提供在不同容器中之可能的組合亦包括：尿(u)FSH與uhCG或uFSH與uLH；再者(rhCG或rLH或rFSH)與(uhCG或uLH或rhCG或rLH)以及其所有可能的排列。在一極佳的實施例中，本發明之調配物包含FSH與hCG。在另一同樣優選的實施例中，本發明之調配物包含hCG。

本發明之促性腺激素調配物是液態調配物。較佳地，該調配物是注射劑。調配物可以一具有可分開或一起投與之一或二或更多種藥學組成物(包含FSH或FSH/hCG，和/或LH)之產品形式提供。若分開投與，則可依序投與。該產品可以任何包裝形式提供。例如，一產品可含有許多預充填的針筒，各包括FSH(FSH組成物)或額外地hCG(hCG組成物)，如其中該針筒可包裝在泡型包裝中或其它可維持無菌之工具中。產品可可選地含有使用該促性腺激素調配物之說明書。

根據另一態樣，本發明之促性腺激素調配物是以多劑量製劑之形式提供。然而本發明明確地亦針對預定為單次使用之調配物。本發明亦有關調配物之穩定化為套組之部分。此一套組包含至少一個容器，其包含該促性腺激素如FSH之一或多個每日劑量；或包含如二個容器(如，小玻璃瓶)，各包含不同的促性腺激素，像是hCG；以及另外包含(如，用於投藥之)說明書；以及另外包含如用於注射之工具。在一較佳實施例中，使用供多次注射之注射筆，因此該促性腺激素溶液是充填在各別的藥筒中。該等活性成份可裝在不同的藥筒中，但當然如熟悉此技藝之人士熟知的，可同時注射或依序注射。且，二或多種活性成份可裝在一個且相同的藥筒內。

在一極佳的實施例中，本發明之調配物是供注射使用，甚至更佳地供皮下注射。

在一較佳實施例中，在該調配物中，典型地在多劑量調配物中，該hMG存在之量為35-850 IU/ml，較佳地50-800 IU/ml，甚至更佳的100-700 IU/ml，最佳的625 IU/ml。

供包含如上之hMG，和/或包含hMG和/或hCG，和/或所有其它如本發明所述的促性腺激素之多劑量調配物用之賦形劑之特佳配方，具有下列組成：50-160mM之精胺酸HCl，較佳地150mM之精胺酸HCl，0.05至1.5mg/ml，較佳地0.15mg/ml之L-甲硫胺酸，0.001-0.05mg/ml，較佳地0.005mg/ml之聚山梨醇酯20，4.0至6.0mg/ml，較佳地5.0mg/ml之苯酚， pH 6.0至7.5，較佳地pH6.8+/-0.3(pH意指整個溶液之pH)，WFI。

在包含重組hCG和/或FSH之調配物中，該活性成份之一般的濃度如下，然而該活性成份之濃度對本發明之效力沒有任何的影響：

rFSH：30-150μg/ml

rhCG：5-200μg/ml

用於此重組調配物之較佳的賦形劑，與以上針對多劑量hMG調配物所述的一樣。典型的單劑量調配物亦涵蓋在本發明中，且與以上所述之賦形劑相同，只是其不含防腐劑，像是苯酚。

注射貯釋劑型可通過在生物可分解的聚合物中形成該促性腺激素(以及若有的話，其它劑)之微囊封基質而製得。該基于聚合物的貯釋劑型/緩釋系統依據其等之化學結構，可為例如微或奈米粒子、水凝膠、微胞、乳液或植入物。依據促性腺激素對聚合物之比率以及所使用之特定聚合物之本質，可控制促性腺激素釋出之速率。生物可分解聚合物之例子包括聚乳酸/聚乙交酯共聚物系統、聚乙烯吡咯烷酮、聚(原酸酯)、聚(酸酣)、聚(乙二醇)、聚胺基酸、多醣，如玻尿酸鈉(NaHA)或其等之鹽類、明膠、幾丁聚醣等等。所有提及的聚合物均可經轉化或修飾，優化蛋白藥物之傳送或其穩定性。注射貯釋型調配物亦可藉由將該促性腺激素截留在脂質系統或聚合物脂質混合物 (如可與身體組織相容之微泡、脂質體或微乳液)中而製得。

注射調配物可藉由通過例如細菌保留過濾器之過濾和/或藉由併入殺菌劑進行殺菌。亦可形成在使用前溶於或分散於無菌水或其它無菌注射介質中之無菌固態組成物。注射調配物可在如上所述之任何適合的容器中提供，如小玻璃瓶、預充填針筒、注射藥筒等等。

調配物中，各種可作為在此所述之藥學組成物之組份的pH以及正確濃度，原則上是依照此領域中之常規實務調整，見如John P. Griffin and John O’Grady編輯的藥學參考書，第五版。在一較佳實施例中，本發明之組成物以注射投藥之組成物方式提供。製備注射調配物之一般方法是業界已知的，且述於REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，同上，第780-820頁中。該注射的組成物可以液態調配物之形式提供，或以在投與前和無菌可注射介質混合之固態形式提供。在一特佳的實施例中，該注射組成物以便於投與以及劑型均一之劑量單元形式提供。

可依據本發明調製之FSH、hCG和/或LH，可通過此技藝中熟知之習用的方式從尿液衍生而來，或可經重組方式產生。有關可能的產生方法，可進一步參考如WO 2009/127826。

本發明之一較佳實施例是目前所述之包含hCG之調配物。

hCG可經由此技藝中已知之任何方式獲得。在此使用之hCG包括尿衍生的hCG以及重組的hCG。包含尿衍生的hCG之調配物是特佳的。亦涵蓋具有至少部分的LH活性是從hCG衍生而來之調配物(換句話說：hCG是產生此LH活性之分子)。人衍生的hCG可從任何適當的來源(如，尿液和/或胎盤)經由業界已知之任何方法純化而得。表達以及純化重組的hCG之方法是本領域熟知的。

LH可由本領域已知之任何方法獲得。在此使用之LH包括人衍生的LH以及重組的LH。人衍生的LH可從任何適當的來源(如，尿液)經由業界已知之任何方法純化而得。表達以及純化重組的LH之方法是本領域熟知的。

在此使用之術語“藥學組成物”可與“藥學調配物”交換使用。

本發明之穩定的藥學組成物可用於治療不孕症。本文中之“治療不孕症”包括利用控制(超)促排卵或包括控制排卵之步驟或階段之方法，例如人工受精(IUI)、體外人工受精(IVF)或精子細胞漿內的注射(ICSI)來治療不孕症。該術語亦包括排卵誘導(OI)或包括排卵誘導之步驟或階段之方法。該術語亦包括治療具有輸卵管或不明原因不孕之個體之不孕症，包括治療具有子宮內膜異位症，例如第I期或第II其子宮內膜異位症(由美國生殖醫學學會(ASRM)子宮內膜異位症各階段分類系統，修訂版美國生殖醫學學會子宮內膜異位症分類：1996, Fertil Steril 1997; 67, 817-821所定義)之個體和/或因男性因素不孕之伴侶之個體之不孕症。該術語較佳地包括使用如輔助生殖技術(ART)、排卵誘導(OI)或人工受精(IUI)。該藥學組成物可用於例如使用FSH製品或FSH與hCG製品之醫療適應症。在一典型的實施例中，本發明之調配物是用於與在歐洲核准Menopur®之適應症相同的醫療適應症，如下列之例示案例：

女性與男性不孕症之治療：

-無排卵婦女：MENOPUR可用於刺激閉經患者體內濾泡的發展。克樂米芬(Clomiphene)(或會影響類固醇回饋機制之相似的排卵誘導劑)是用於下列之優選治療藥：具有各種包括黃體期不足與無卵性週期和正常泌乳激素之月經週期紊亂之婦女，以及證據顯示方內源性雌激素產生但正常的泌乳激素以及正常的促性腺激素位準之無月經病人。無反應者之後可選擇進行尿促性素(menotrophin)的治療。

-正進行醫療輔助受精方案中之超排卵的婦女：MENOPUR可用於誘導正進行諸如體外人工受精(IVF)之輔助受孕技術之病人中多個濾泡之發展。

-男性低促性腺激素性性腺功能減退症：可給與MENOPUR與人類絨毛膜促性腺激素(如，Choragon)之組合來刺激精子生成。

或與在美國核准Menopur®之適應症相同之醫療適應症，如下：

排卵婦女中多個濾泡以及懷孕之發展，為輔助生殖技術(ART)周期之一部分。

選擇性地，Menopur^®之治療項目說明如下：

MENOPUR被指示用於治療下列臨床狀況下之不孕症：

對氯米芬檸檬酸鹽之治療沒有反應之婦女之無排卵，包括多囊性卵巢病(PCOD)。

控制性超促排卵誘導輔助生殖技術(ART)(如，體外人工受精/胚胎植入(IVF/ET)、配子輸卵管內移植(GIFT)以及精子細胞漿內的注射(ICSI))之多個濾泡之發展。

刺激患有低促性腺激素性性腺功能減退症之婦女體內濾泡之發展。

本發明亦提供在此所述(根據本發明之態樣)之穩定的促性腺激素調配物，於製造用於治療不孕症之藥劑上之用途。

在一較佳實施例中，本發明之調配物是用於排卵誘導、輔助生殖技術(ART)和/或男性低促性腺激素性性腺功能減退症。

該藥學組成物可另外被調配成供任何藥物投與途徑之已熟知的組成物，如，經口、直腸、注射、經皮(如，貼片技術)、靜脈內、肌內、皮下、腦池內、陰道內、腹膜內、局部(粉末、軟膏或滴劑)或為口腔或鼻噴霧劑。典型的組成物包含一藥學上可接受之載劑，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences第十五版(Matt Publishing Company, 1975)，第1405至1412頁以及第 1461至87頁；以及USP-NF, The National Formulary XIV第十四版(American Pharmaceutical Association, 1975)中所述之水溶液、無毒性賦形劑，包括鹽類以及防腐劑、緩衝劑等等。在一些實施例中，本發明針對一種具特定條件之調配物，其展現令人驚奇的高穩定性以及其它的優點二者，像是無不可接受之著色、無不可接受的濁度、減少注射時之疼痛或無疼痛以及減少注射時對皮膚的刺激或無刺激。此僅在本發明發現特定組份使在此所述之液態促性腺激素調配物能夠產生有利性能以及高穩定性時才有可能。

雖然促性腺激素調配物已經在市場上存在數十年了，但調劑科學家清楚的知道此等蛋白之調配存在許多的困難。此等困難因許多因素而存在顯著的不同，像是- 要調配的是蛋白之事實(在任何情況下，像這樣的蛋白都很難調配)，- 蛋白之糖基化具專一性的事實(糖基化可能受到特別選擇的製造以及賦形劑之影響)，- 調配特定的蛋白(調配化學性質因實際蛋白而有顯著差異：如已顯示出即使關係相近的蛋白像是FSH以及hCG，在相同的調配物中之表現不同，見如WO 2012/013742)，- 是否蛋白是從自然物質，如尿液獲得，或是經重組產生， - 是否需要防腐劑(一些防腐劑達成其等對抗微生物生長之保護目的，但會負面影響最後的調配物之穩定性。所有的間甲酚、苯酚和苯甲醇(有或無氯化烷基二甲基苄基銨)均如此，其等是目前僅授與可用於促性腺激素之防腐劑；此外，視調配物中所含之其它賦形劑以及活性成份而定，防腐劑可能對著色有負面的影響)，- 使用特定的界面活性劑(同樣視各別調配物中所含之其它賦形劑而定，此等在一些情況下可能會導致混濁)，- 使用特定的緩衝劑(如，檸檬酸鹽緩衝劑常會引起注射時疼痛以及皮膚刺激)，- 用於穩定化之特定賦形劑，其會以無法預測之方式穩定不同的組份，- 取決於用於穩定化之賦形劑，其會以無法預測之方式穩定不同的組份。

因此，調劑科學家一方面面臨一系列問題，另一方面面臨著一系列可能的賦形劑，導致提供一方面具有良好穩定性而另一方面無著色或濁度或注射疼痛時之複雜的問題。

因此，非常令人驚訝地，精胺酸與甲硫胺酸之目前的組合，於目前的pH範圍內，在沒有添加緩衝劑之情況下，解決了此等特別的問題。

在此方面，“無(添加/額外的)緩衝劑”以及“不含緩衝劑”在此申請案中是同義的。此表達意指在調配物中沒有添加/存在被視為具有緩衝能力之額外的化合物。假如一個溶液在添加預計會改變一離子之活性之物質時，可對抗該離子之活性之改變，稱作緩衝的。緩衝劑是可提供一溶液此抗性之物質或物質的結合。緩衝溶液是其中離子與能夠移除或釋出該離子之物質平衡之系統。其意指在不會引起離子活性顯著改變之情況下，可加至一溶液中之材料之量。其定義為添加以致改變pH單位之酸或鹼之比(克-當量/L)。通常是藉由調整緩衝物質之濃度，將緩衝溶液之能力調整至使用之條件(USP NF)。緩衝能力通常表示成，使1升之目標溶液的pH改變1個單位(較佳地在一大氣壓與21℃下)之強酸(如，HCl)或鹼(如，NaOH)之當量數(Eq)(Skoog West and Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry，第五版)。1當量的HCl等於1莫耳HCl，而1當量的NaOH等於1莫耳NaOH。在本發明中，該緩衝能力表示成使1升之目標溶液的pH改變1個單位之強酸(如，HCl)或鹼(如，NaOH)之當量數(Eq)。因此，根據本發明，該調配物應不包含在本發明之調配物中所揭示之pH範圍內，貢獻

0.5mEq/(升*pH)(較佳地在1atm、21℃下)之額外的緩衝劑。

測定以及計算緩衝能力之方法

緩衝能力之測定以及計算如下。

用酸如NaOH或鹼如NaOH滴定一定量之待測溶液。

需使用適合濃度的酸與鹼，如0.2N，以便產生夠精準的滴定。

於測試溶液中添加小等分的HCl或NaOH進行滴定。記錄每次添加之添加體積以及對應的pH。

將酸與鹼之累積體積對測得的pH作圖，見如圖1。

對相關的pH區域進行線性最小平方回歸擬合，以及計算R²以確認擬合線之有效性。

利用線性回歸計算緩衝能力，表示為mEq/(升×pH單位)。

在此；

x=緩衝能力[將pH移動1個pH單位之0.2N HCl/NaOH之μL]

Y-b=1 pH單位

a=斜率

以及方程式2 x=((Y-b)×C)/(a×V×10 ⁶ )

在此mEq是濃度如0.2N HCl/NaOH所給之酸或鹼的微當量，其等於0.2當量/L HCl/NaOH，其等於200mEq/L HCl/NaOH。

x=緩衝能力[mEq/升×pH單位]

Y-b=1 pH單位

C=酸或鹼之濃度，如HCl/NaOH[mmol/L=mEq/L]

V=目標溶液之體積

10⁶校正因子從μL至升

使用方程式2以及表9之批次C-01_{pH範圍6.564-6.947}計算之例子：x=(1×200)/(0.001507×0.1×1000000)=1.32mEq/(升×pH單位)

為測定一組份是否貢獻

0.5mEq/(升×pH單位)之緩衝能力，用以上所述之方法測定含該組份之溶液以及不含該組份之相同溶液之緩衝能力。該二種溶液之所測得的緩衝能力之差，得到該指定的組份對緩衝能力之貢獻度。

術語“無(添加/額外的)緩衝劑”以及“不含緩衝劑”亦指本發明之調配物不含任何一種下列緩衝劑(其等為FDA核准可用於注射的緩衝劑，pH範圍6.0-7.5)：

組織胺

磷酸鹽

檸檬酸鹽

三羥甲基胺基甲烷(Tris)

羥乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)

碳酸鹽

此外，該術語亦指沒有包括FDA另外核准之用於注射之緩衝劑，特別是

醋酸鹽

己二酸

硫酸銨

琥珀酸

天門冬醯胺酸

天門冬胺酸

麩胺酸鹽(麩胺酸)

甘胺酸

乳酸鹽

離胺酸

順丁烯二酸鹽(順丁烯二酸)

反丁烯二酸鹽(反丁烯二酸)

蘋果酸鹽

甲葡胺(Meglumine)

丙酸鹽

丙胺酸

苯丙胺酸

半胱胺酸

異白胺酸

白胺酸

脯胺酸

絲胺酸

酒石酸鹽

蘇胺酸

色胺酸

酪胺酸

纈胺酸

在沒有添加緩衝劑之情況下，通常假設最後溶液的pH無法輕易地保持在所欲的範圍內(且在調整期間很難達到特定的目標pH)(在本發明中，pH應介在6.0與7.5之間，更佳地介在6.5與7.4之間，較佳地在6.8或附近)，且波動會很顯著。

維持一個藥學產品之正確的pH是非常重要的。pH會限定像是穩定性、活性以及貨架夀命之參數。因此，藥學調配物通常會用緩衝劑調配。有各式各樣的緩衝劑可以使用，選擇在所欲pH下有效的。在實務上，於所有現有的促性腺激素調配物中經常使用之例示緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑以及檸檬酸鹽緩衝劑。緩衝劑需在該調配物之調配期間，特別是貯存期間可能曝露之環境下，提供該調配物維持pH之能力。找出此一適合的緩衝劑非常具挑戰性，且在一些情況下，有效的緩衝劑會給該調配物不希望有的副作用，像是檸檬酸鹽緩衝劑在注射時會產生疼痛。所有的緩衝劑在作為調配物之額外的成份時，均具固有的缺點，其會使調配過程變得複雜，具有不利地影響其它成份、穩定性、貨架夀命以及最終使用者之接受度之風險。

然而本發明人令人驚奇地提供無緩衝劑存在之調配物，同時該調配物不會遭遇到任何無法接受的pH波動。該調配物包含精胺酸作為穩定化合物。精胺酸在其pKa附近(在2.17、12.5以及9.04下)具有+/-1pH單位之期望的緩衝能力。因此，在本發明之較佳的pH範圍下(如，介在6.0與7.5之間，更佳地介在6.5與7.4之間，較佳地在 6.8下或附近)預計沒有緩衝能力。儘管如此，令人驚訝地發現，精胺酸於在此所述之特定調配物中，對pH具強力的穩定作用。在先前技術中之任何地方，均沒有描述精胺酸之此作用。

有利地，這個不含在此所限定之緩衝劑之調配物，亦提供注射時疼痛之減輕或無疼痛或注射時皮膚刺激之減輕或無刺激之調配物。此與使用如顯示出會引起注射時皮膚刺激以及疼痛之檸檬酸鹽緩衝劑之調配物相反。

本發明之精胺酸可為精胺酸，或可為精胺酸HCl或甚至更佳地為L-精胺酸(HCl)。精胺酸存在之量較佳地在50與160mM之間，更佳的80-160mM之間之範圍內，甚至更佳地為約150mM。

從下列範例可看到，精胺酸在FSH以及hCG之氧化上具有明顯的作用。然而本發明人的確秀出特別高的穩定作用。相當驚訝地，假如促性腺激素結合高穩定量的精胺酸(如，150mM)，則其等能夠提供穩定且顯示僅極少的氧化作用(在可接受之程度內，見以下範例部分)之液態促性腺激素調配物。

特別驚訝的是此作用之獲得是在離精胺酸之pKa值很遠之pH範圍內，即在pH 6.0至7.5之pH範圍內。此是本發明之較佳的pH範圍。在一特佳的實施例中，該pH是在6.5至7.4之範圍內。甚至更佳的是介在6.5與7.2之間之pH範圍。最佳的是pH為6.8+/-0.3。

令人驚訝地，低抗氧化量之甲硫胺酸，較佳地L-甲硫胺酸，能夠防止不欲的氧化事件。此低量可能低如0.05mg/ml，但可能高至2.5mg/ml。在一較佳實施例中，甲硫胺酸之量介於0.1與1.5mg/ml之間。在一甚至更佳的實施例中，該甲硫胺酸之量介於0.1與1mg/ml之間。在一甚至更佳的實施例中，該甲硫胺酸之量介於0.1與0.5mg/ml之間。在最佳的實施例中，該甲硫胺酸在0.15mg/ml下。根本無法預測精氨酸的高氧化能力可以被如此低量的甲硫胺酸所抵消和克服。

甚至更令人驚訝的是發現精胺酸具有遠比其它已知的穩定劑，如蔗糖(其是很常添加且非常成熟的穩定劑)都還顯著的穩定作用。

該調配物可包括適合的水性與非水性藥學載劑、稀釋劑、溶劑和/或載體。適合的水性與非水性藥學載劑、稀釋劑、溶劑或載體包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、乙二醇等等)、羧基甲基纖維素以及其等之適合的混合物、植物油(諸如橄欖油)以及可注射的有機酯類，諸如油酸乙酯。

另外較佳的，特別是在本發明之多劑量調配物中添加防腐劑。極佳的，此防腐劑是苯酚。在一又更佳的實施例中，添加濃度在4.0至6.0mg/ml下，較佳地5.0mg/ml之苯酚。令人驚訝地，如範例部分所示，相較於其它熟知的防腐劑，在本發明之特定調配物之情況下，該苯酚亦為有利的，即僅管存在此防腐劑甚至持續一段長時間，其不會引起著色且非常穩定。

又更佳的是在本發明中添加一界面活性劑。極佳地，此界面活性劑是聚山梨醇酯，甚至更佳的聚山梨醇酯20。在一更佳實施例中，該聚山梨醇酯20添加之濃度為0.001-0.05mg/ml，較佳地0.005mg/ml之聚山梨醇酯20。有利地，如範例部分所示，僅管存在此防腐劑，甚至持續一段長時間，與聚山梨醇酯20調製之本發明調配物不會導致混濁且非常穩定。

除了該等以上已知列出的外，該組成物亦可含其它添加劑，諸如，但不限於(另外的)防腐劑、濕潤劑、乳化劑以及分散劑。可包括抗菌以及抗真菌劑以便防止微生物之生長，包括，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚類、山梨酸等等。此外，最好能包括等張劑。然而本發明之調配物不含額外的緩衝劑。

在一些情況下，為延長作用，需從皮下或肌肉注射慢慢的吸收諸如FSH(以及若有的話，其它活性劑)之促性腺激素。此可藉由使用具差水溶性之結晶或非晶形材料之液態懸浮液達成。吸收率則取決於溶解率，其亦可取決於晶體尺寸以及晶體形式。選擇性地，延緩吸收注射投與的FSH結合劑型，可藉由將該FSH結合劑型溶解或懸浮於油載體中而達成。

根據本發明，本發明人致力於探討某些化合物在液態促性腺激素調配物之穩定性上的作用；在此，已探討了許多化合物的穩定以及破壞穩定的作用。此外，本發明人力求改善所產生的調配物之澄清度、著色度以及注射時之疼痛。

術語“穩定性”可意指涉及胺基酸序列中共價修飾之化學穩定性，但在蛋白之穩定性方面，其亦涉及蛋白的摺疊狀態(即，天然狀態)之改變，不包括共價鍵斷裂的物理穩定性。

在本發明中，術語"穩定性"意指促性腺激素，特別是FSH與hCG之調配物之生物穩定性。蛋白調配物之物理不穩定性，可因蛋白分子凝集形成較高階凝集體、因異二聚體解離成單體或因任何其它構型的改變，降低本發明中所包括之如FSH蛋白之至少一種生物活性而引起。

"穩定的"溶液或調配物是一種其中蛋白之凝集、解離、構型修飾、生物活性喪失等等之程度是可接受控制的，且不會隨著時間而增加不可接受性。穩定性可用此技藝中熟知之方法評估，包括樣本之光散射、目測檢查澄澈度和/或著色度、吸光度或光學密度、分子尺寸測定(如，利用粒徑排阻層析法或場流分級法)、活體外或活體內生物活性和/或利用微差掃描熱量法(DSC)之測量。

本調配物在貯存條件下可穩定12個月，較佳地16個月，甚至更佳的24個月，甚至更佳地在貯存條件下24個月加上“使用中”，即在室溫下，1個月。在“貯存條件下”之穩定性，意指調配物貯存在冷卻環境下如5℃±3℃。本文中之“室溫”意指在30℃下或低於30℃，較佳地15-25℃，較佳地18-25℃，最佳的25±2℃。

為測定本調配物之穩定性，可使用針對FSH與hCG之熟知的(免疫)分析法，其等為熟悉此技藝之人士熟悉的，因此在此僅大略的說明如下：

針對氧化作用之RP-HPLC

蛋白之氧化的測定，是利用RP-HPLC，在C4管柱上梯度洗堤以及在210nm下UV檢測。

酵素結合螢光分析法(ELFA)

FSH與hCG之免疫活性的測定，是使用自動分析VIDAS^®儀器(BioMérieux, France)以及分別相應於FSH與hCG之VIDAS^®套組進行之三明治免疫分析法。

粒徑排阻層析法(SEC)

rFSH之純度的測定，是使用粒徑排阻層析法(SEC)，在蛋白範圍3-70kDa之SEC管柱上以及在210nm下UV檢測。

疏水交互作用層析法(HIC)

rhCG之純度的測定，是使用疏水交互作用層析法(HIC)，在管柱上用烷基醯胺基團梯度洗提以及在220nm下V檢測。

FSH以及LH之生物分析

FSH以及LH之效價的測定，是分別使用Steelman-Pohley (FSH)以及精囊增重分析法(LH)之生物活體內分析法。

其它用於評估穩定性之方法是業界熟悉的，且亦可根據本發明使用。

使用世界衛生組織生物製品標準化專家委員會(WHO ECBS)於2000年十一月訂定之第四屆尿FSH與尿LH之國際標準，標準化所分析的FSH以及LH之活性，此為熟悉此技藝之人士熟悉的。

已知許多防腐劑對促性腺激素調配物具有明顯的破壞穩定性之作用，而令人驚訝地發現，在此所述特別是包含精胺酸以及甲硫胺酸但不含緩衝劑之發明調配物特別地穩定，甚至在持續一段長時間以及甚至在苯酚之存在下亦如此。

目前所請求之精胺酸與甲硫胺酸之組合，對液態hMG調配物具有穩定作用，此之有利以及令人驚訝的方式甚至比已知的穩定劑等等，如蔗糖之穩定作用更顯著。相較於已知的穩定劑如蔗糖，該經改善的穩定作用是特別地令人驚訝的。此外，相當意外地，即使沒有緩衝劑，本發明之組合的穩定作用仍很顯著。

從先前技藝已知，在藥學FSH調配物中會有FSH之降解的發生，此已經過WO 2012/013742所提供之範例證實。FSH會隨著時間以及溫度二者降解。

在加熱時發生之三級以及二級FSH結構之構形展開，似乎是一種二階段的轉變(當蛋白凝集受限時)。此展開可與次單元解離(四級結構的改變)獨立發生。

此外在先前技術中，液態FSH調配物中含有像苯甲醇或苯酚之必要防腐劑(例如抗微生物劑)，對FSH多劑量調配物之穩定性很清楚地具有負面的影響。在此， FSH之長期穩定性會降低，FSH之變性溫度會降低以及已經變性的形式具有二級結構之位準會低於不含防腐劑之FSH調配物。

本發明亦有關一種穩定液態促性腺激素調配物之方法，其中該方法包含於該調配物中添加精胺酸以及甲硫胺酸之步驟，該調配物不含緩衝劑。

圖1：滴定曲線。該曲線之斜率顯示緩衝能力，如陡峭的斜率意指低緩衝能力。

圖2：根據25℃結果之反應優化。垂直線顯示L-精胺酸以及L-甲硫胺酸之位準，而FSH與hCG免疫分析之反應為Y(單位IU/ml)。R² _HCG：92.15%以及R² _FSH：67.31%。

所有的研究均經額外進行的實時數據確認。

範例 範例1

1.背景介紹

許多含衍生自停經後或懷孕婦女之尿液之促性腺激素之不同的藥品可用於治療不孕症，諸如hMG(人類停經期促性腺激素)製劑。hMG具有促濾泡激素(FSH)以及黃體激素(LH)之活性，比率為1：1。

FSH、LH以及人類絨毛膜促性腺激素(hCG)屬於具複雜糖蛋白荷爾蒙之促性腺激素家族。其等為由α以及β次單元構成之異二聚體。92個胺基酸之α次單元是此等三種促性腺激素共同的，β次單元是獨有的，給予其等不同的生物特徵(Wolfenson C. et al. 2005, Batch-to-batch consistency of human-derived gonadotropin preparations compared with recombinant preparations. Reproductive BioMedicine. Vol 10 No. 4:442-454；Shen, S. T., Cheng, Y. S., Shen, T. Y., and Yu, J. Y. 2006, Molecular cloning of follicle-stimulating hormone(FSH)-beta subunit cDNA from duck pituitary. Gen. Comp Endocrinol. 148:388-394；Fox, K. M., Dias, J. A., and Van, R. P. 2001, Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol. Endocrinol. 15:378-389；Burova, T., Lecompte, F., Galet, C., Monsallier, F., Delpech, S., Haertle, T., and Combarnous, Y. 2001, Conformational stability and in vitro bioactivity of porcine luteinizing hormone. Mol. Cell Endocrinol. 176:129-134)。全部的糖蛋白荷爾蒙在非共價連接的次單元解離時，會失去其等之生物活性(Alevizaki, M. and Huhtaniemi, I. 2002, Structure-function relationships of glycoprotein hormones; lessons from mutations and polymorphisms of the thyrotrophin and gonadotropin subunit genes. Hormones. (Athens.) 1:224-232)。

LH與hCG結合至相同的受體，因此二者均擁有LH活性。在hMG中，LH之活性大部分源自hCG。

本發明之目的是建立一種呈供皮下注射之液態調配物形式之促性腺激素調配物。在多劑量注射方面，防腐劑之添加通常是必要的(Meyer, B. K., Ni, A., Hu, B., and Shi, L. 2007, Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. J. Pharm. Sci. 96:3155-3167；Chang, B. S. and Hershenson, S. Practical Approaches to Protein Formulation Development. In Rational Design of Stable Protein Formulations. J. F. Carpenter and M. C. Manning, editors. 2002, Plenum Publ., New York. 1-25; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. 2000, CRC Press, Boca Raton)。

通常，蛋白之天然(生物活性)結構對其環境非常敏感，如調配物之組成、容器/封閉系統、pH以及溫度，辨識一適合促性腺激素之液態調配物是一項壯舉，需篩選不同的賦形劑。在目前的工作中，使用FSH免疫分析法、hCG免疫分析法、生物分析法、用於測定氧化蛋白之RP-HPLC、滴定以及pH，探討各種hMG調配物之緩衝能力以及實時穩定性，將於下文中詳細描述。

2.待研究之產品

2.1 材料

2.1.1藥物原料(DS)

hMG-HP藥物原料(DS)是Instituto Massone S.A製造的。收到的阿根廷hMG-HP DS，是來自Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Denmark之粉末。

藥物原料中FSH與LH之生物活性的測定，是依照英國藥典(BP)目前的版本進行。若需要，亦可能依照USP 35版本進行此測定。hMG中FSH：LH之生物活性為1：1，因此使用FSH以及LH之平均測定的生物活性來調製藥品。因此，當提供之hMG的濃度為如625IU/ml時，其等於625IU/ml之FSH以及625IU/ml之LH的生物活性。

2.1.2賦形劑

在此工作中使用之賦形劑之列表描述於表1中。

2.1.3 容器封閉系統

在穩定性之研究方面，主要的包裝材料為帶有橡皮塞以及鋁/塑膠蓋之玻璃小瓶，或帶有橡皮柱塞以及捲邊帽之玻璃藥筒。

3.製造程序

3.1 調製

所有的調配物均以實驗室規格製造。

在藥品溶液(DP)之調製方面，將各賦形劑與藥物原料(DS)之儲備原液依序混合。在添加hMG以及最後稀釋至定容刻度之前，需要時調整各調配物之pH。所有賦形劑以及hMG之儲備原液均製備於Milli-Q水中。

3.2 無菌過濾以及無菌充填

用Millipore PVDF 0.22μm濾器，無菌過濾供穩定性測定之調配物。無菌過濾在LAF工作台中，使用高壓滅菌的材料進行。

充填在過濾後進行。將樣本溶液充填於容器中。所有的小玻璃瓶以及藥筒均在LAF工作台中之無菌條件下充填，且立即用橡皮塞或捲邊帽封住。在LAF工作台外，用鋁翻轉(flip-off)蓋密封該充填的小玻璃瓶。

4.貯存條件

4.1 貯存條件

含藥品調配物之容器貯存在30±2℃/65±5%RH之加速條件下達3個月，和/或在25±2℃/60±5%RH之加速條件下達最少6個月。在各貯存溫度下，容器是以直立方式貯存。藥筒是水平方式貯存。所有的容器均避光。

5.分析方法

於此研究中使用之分析方法述於下。

5.1 滴定程序

根據前述之USP-NF，假如一溶液在添加預計會改變一離子之活性之物質時，可對抗該離子之活性的改變，則其稱作緩衝的。緩衝劑是可提供一溶液此抗性之物質或物質的結合。緩衝溶液是其中離子與能夠移除或釋出該離子之物質平衡之系統。緩衝能力意指在不會引起離子活性顯著改變之情況下，可加至一溶液中之添加物質之量。其定義為添加以致改變pH單位之酸或鹼(單位克當量/L)的比。通常是藉由調整緩衝物質之濃度，將緩衝溶液之能力調整至使用之條件。

緩衝能力通常表示成，使1升之目標溶液的pH改變1個單位之酸或鹼之當量數(Eq)，單位mEq/(升×pH)，其用於測定本發明之緩衝能力。

此意指該緩衝能力定義為使1升緩衝溶液之pH改變1個單位所需之H⁺/OH^-之莫耳(當量)數。

緩衝能力是使用調整至作為起點之標示pH之空白調配物(空白指的是無活性成份之調配物)進行。使用0.2N之NaOH/HCl滴定，使pH提高或下降。在各個0.2N NaOH/HCl之添加後測量pH，以及記錄0.2N NaOH/HCl之體積。將0.2N NaOH/HCl之量繪製成X值，而pH為Y值。在pH 6.8附近進行hMG空白劑(標示pH)之擬合線性回歸，以及在pH 6.5附近進行參考空白劑(標示pH)之擬合線性回歸。如以上定義中所述的，緩衝能力計算為移動pH值 0.01個pH單位之0.2N HCl/NaOH的μL/L DP，以及微當量(mEq)酸或鹼/(升×pH單位)。

5.2 FSH以及hCG之免疫分析

FSH以及hCG之免疫分析是用三明治ELFA測定。

5.3 氧化蛋白

蛋白之氧化用RP-HPLC測定。

5.4 pH

pH依照Ph. Eur.測量。

6.結果

穩定性研究之結果、緩衝劑之緩衝能力的評估以及之實驗設計(DoE)研究之穩定性結果示於下。

6.1 液態hMG調配物之穩定性/3個月

於溶液中添加如鹽類、碳水化合物類或胺基酸類可穩定蛋白分子，但在不同的調配物之間添加不同的鹽類、碳水化合物類或胺基酸類時，穩定程度差異很大。在此，一開始的穩定性研究是用於篩選在hMG之液態調配物中各種穩定劑與防腐劑和緩衝劑之結合。令人驚訝地，結果顯示L-精胺酸之優越的穩定作用，如hCG之免疫分析的結果表3與6，以及FSH之免疫分析的結果表4與7所示。相較於所有其它調配物，調配物E-09展現優越的穩定性。調配物E-09是唯一含有L-精胺酸的調配物(見表2)。相較於所有其它的調配物，調配物K-01、K-03與K-04以及K-09展現優越的穩定性(見表6)。此等調配物再次含有L-精胺酸(見表5)。在表4中，相較於所有其它的調配物，調配物E-09是最穩定的，FSH之免疫分析法亦同，而表7證實相較於所有其它的調配物，調配物K-09顯示最高的FSH之免疫分析結果。

6.2 液態hMG調配物之穩定性-3個月

從起始篩選中，篩選額外具有精胺酸之調配物。

表5，液態hMG 600 IU/ml之組成穩定性的研究-調配

非常清楚地，包含L-精胺酸之調配物遠比該等包含不同穩定劑者來的穩定。比較如3個月後之調配物K-02以及K-03。

FSH亦證實hCG之結果-比較如3個月後之調配物K-02以及K-03。

6.3 緩衝能力之研究

緩衝劑如磷酸鈉與檸檬酸鈉是生理耐受緩衝劑，很常添加用於維持pH在所欲之範圍內。檸檬酸三鈉二水合物以及磷酸二氫鈉十二水合物經緩衝能力評估為緩衝劑。緩衝能力計算為將pH移動至一預定階段所需之酸或鹼之量，即如上所述，移動pH達1 pH單位/L DP所需要0.2N HCl/NaOH的μl量，算成mEq酸或鹼/(升×pH單位)。

為測定緩衝能力所進行之滴定的結果示於圖1中。曲線之斜率顯示緩衝能力，如，陡峭的斜率表示低緩衝能力。從圖1中可觀察到批次C-04(參考調配物)具有最低的緩衝能力。在hMG相關的pH區域6.8±0.3中，所有的hMG調配物C-01(無緩衝劑)、C-02(5mM之檸檬酸三鈉二水合物)以及C-03(10mM之檸檬酸三鈉二水合物)具有相似的緩衝能力，且具有比含1mM之磷酸二氫鈉十二水合物之參考調配物高的緩衝能力。參考調配物之標示pH為6.5。調配物C-01、C-02以及-03是與已知具有穩定的pH之參考物比較。對參考調配物C-04進行的許多穩定性之研究，沒有觀察到pH任何的漂移。

以下表9顯示緩衝能力之研究的結果：

表9，緩衝能力之研究。在hMG調配物相關的pH區域6.8之中，所有的hMG調配物均具有比參考空白劑調配物高的緩衝能力。

令人驚訝地，不含緩衝劑之hMG調配物之緩衝能力(C-01)高於參考調配物C-04。該hMG調配物中主要的賦形劑是濃度120mM之L-精胺酸。L-精胺酸之pKa值為pKa₁=2.17；pKa₂=9.04以及pKa₃=12.5(Handbook of Pharmaceutical Excipients. 2015, Pharmaceutical Press, London)。非常意外地，精胺酸在遠離其pKa值時展現足夠的緩衝行為。

6.4 氧化作用之研究

在於30±2℃/65±5% RH下3個月的貯存後，含L-精胺酸之調配物E-09(見表5)之氧化蛋白的位準增加為起始值的241%(見以下表10)。此是非常高的量，存在如此高量的氧化不是期望的情況。

因此，進行進一步的研究探討是否能克服此一問題。

在蛋白調配物中有許多的抗氧化劑可供選擇使用。因為甲硫胺酸可與蛋白中的甲硫胺酸殘基競爭氧化作用之機制，所以添加甲硫胺酸可防止氧化作用。於一含有精胺酸之調配物中添加甲硫胺酸之結果示於表10中。調配物K-01、K-03、K-04以及K-09含有精胺酸以及甲硫胺酸，氧化蛋白的位準很清楚地降低。調配物K-01(具甲硫胺酸)與調配物E-09(無甲硫胺酸)是相同的調配物。比較此二個批次，可看到氧化蛋白之位準因甲硫胺酸而大幅地減少。

結論，此二個研究證明，於促性腺激素之調配物中精胺酸之驚人的穩定作用以及少量甲硫胺酸之抗氧化作用。

6.5 DoE穩定性之研究

結合以上研究以及緩衝能力研究之結果，進行DoE研究以探討精胺酸與甲硫胺酸之間之交互作用以及決定此等二種賦形劑最適合的濃度。

6.5.1 FSH之免疫分析

在25±2℃/60±5% RH下3個月的貯存期間之FSH之免疫分析的穩定性結果，列於表12中。

進行FSH活性[IU/ml]之統計計算，評估精胺酸與甲硫胺酸之影響以及交互反應。統計評估之結果證實，L-精胺酸在FSH之免疫分析的穩定性結果上，具有統計上顯著的影響。甲硫胺酸在FSH之免疫分析的穩定性結果上，不具有統計上顯著的影響。針對此反應參數，精胺酸與甲硫胺酸之間沒有統計上顯著的交互作用。

6.5.2 hCG之免疫分析

在25±2℃/60±5% RH下3個月的貯存期間之hCG之免疫分的穩定性結果，列在表13中。.

進行hCG活性[IU/ml]之統計計算，以評估精胺酸與甲硫胺酸之影響以及交互反應。統計評估之結果證實，精胺酸在hCG之免疫分析的穩定性結果上，具有統計上顯著的影響。甲硫胺酸在25℃下hCG之免疫分析的穩定性結果上，具有些微的影響。很清楚地，甲硫胺酸高於一低的濃度(0.1mg/ml)時，即使增加濃度至1.5mg/ml，亦沒有檢測到穩定性進一步的增加。針對此反應參數，精胺酸與甲硫胺酸之間沒有統計上顯著的交互作用。

6.5.3 氧化蛋白

在以上的穩定性之研究中，令人驚訝地觀察到，精胺酸之存在具有驚人的穩定作用。然而，添加精胺酸導致氧化蛋白之位準增加。添加甲硫胺酸可防止此氧化作用，因此此研究探討作為穩定劑之精胺酸與作為抗氧化劑之間之濃度平衡。

具精胺酸以及甲硫胺酸(濃度範圍0.1-1.5mg/ml)之調配物，在25±2℃/60±5% RH下6個月的貯存期間以及在30±2℃/65±5% RH下3個月的貯存期間之氧化蛋白的量[從起始增加之%]之穩定性結果列在下面。表14中亦包括含精胺酸但不含甲硫胺酸之調配物E-09作為比較用表。

從表14中驚訝地發現，即使小量的甲硫胺酸，在精胺酸之整個濃度範圍內均足以防止氧化作用。

6.5.4 DoE之綜述

為總結以及綜述DoE之結果，施用Minitab中之反應最佳化功能，見圖2。該Minitab反應最佳化工具顯示，在因子設計方面，不同的實驗因子設定如精胺酸以及甲硫胺酸濃度，如何影響如FSH之免疫分析[IU/ml]以及hCG之免疫分析[IU/ml]之預期的反應。優化圖顯示各因子(欄)對反應(列)之影響。圖中垂直粗線代表目前的因子設定。展現在欄頂部之數字顯示目前的因子位準設定(方括號中)。水平虛線以及對應的數字代表該目前因子位準之反應。該反應優化工具是依據在25℃下之結果。施用該反應優化工具之結果示於圖2中。在高濃度的精胺酸以及低濃度的甲硫胺酸下，獲得最佳的穩定性(複合需求)。

6.6 pH之研究

在緩衝能力之研究中，其顯示出該hMG調配物中僅使用精胺酸將pH穩定在所欲的pH範圍內，不需要緩衝劑。

為證明在貯存期間維持pH，在25±2℃/60±5% RH下6個月的貯存期間以及在30±2℃/65±5% RH下3個月的貯存期間進行測量。結果列在表15中。

所有調配物之標示pH為pH 6.8，以及所有的調配物之起始時間點之pH為6.8。pH相當穩定，但在2個月後稍微增加至6.9，然後維持在pH 6.9附近至貯存6個月。貯存至6個月之結果證實，在精胺酸之測試濃度範圍內pH很穩定。

7.結論

非常令人驚訝地，不含緩衝劑之hMG調配物之緩衝能力高於具1mM磷酸二氫鈉十二水合物之參考物。該hMG調配物中主要的賦形劑組份是精胺酸。精胺酸之pKa值為pKa₁=2.17；pKa₂=9.04以及pKa₃=12.5。非預期地，精胺酸在遠離其pKa值時展現足夠的緩衝行為。然而該結果清楚地表明，在當前pH範圍內，該hMG調配物中不需要其它緩衝劑。精胺酸獨自即足夠維持pH在所欲的pH範圍內。在測試一濃度範圍的精胺酸在25±2℃/60±5% RH下6個月的貯存期間以及在30±2℃/65±5% RH下3個月的貯存期間之DoE研究中，證實pH之穩定性，其證實在緩衝能力之研究中之觀察。

於本發明之液態hMG調配物中添加精胺酸，顯示出對液態hMG調配物具有驚人的穩定作用。然而，亦發現精胺酸會導致高位準的氧化蛋白。相較於無甲硫胺酸，添加甲硫胺酸顯示出可防止氧化作用。

在25±2℃/60±5% RH下6個月的貯存期間以及在30±2℃/65±5% RH下3個月的貯存期間，顯示出即使低濃度的甲硫胺酸亦能防止氧化。

從此等研究結果得出之結論可清楚地看到，添加精胺酸足以維持pH在所欲的pH位準。添加精胺酸可驚人地穩定呈液態調配物形式之測試促性腺激素調配物。沒有其它測試胺基酸、糖或鹽顯示出相似的穩定作用。添加精胺酸時氧化蛋白之位準會顯著地增加，但添加即使少量的甲硫胺酸可防止蛋白氧化。令人驚訝地，不管精胺酸之濃度，即使是少量的甲硫胺酸仍足以防止氧化作用。

範例2

本發明人另外證實本發明之有利的發明調配物，亦適合於穩定各自的重組促性腺激素調配物。

為了說明此功效，依照已熟知之方法製備重組FSH以及重組hCG(分別用以上所述之序列)。

對二個分別包含rhCG或rFSH之調配物進行加速穩定性之研究，如下所述。

在重組蛋白中亦證實所觀察到之精胺酸驚人的穩定作用。rFSH以及rhCG二者已調配於5mg/ml之苯酚、0.15mg/ml之L-甲硫胺酸、150mM之精胺酸HCl、0.005mg/ml之聚山梨醇酯20，pH 6.8中。為簡化蛋白穩定性之分析，將rFSH以及rhCG調配於不同的容器中。

此完全地證實，本發明之具有精胺酸但無額外的緩衝劑以及具有少量的甲硫胺酸之調配物，亦適合於穩定的重組促性腺激素。

範例3

進行進一步的研究，評估下列組成物：

標的調配物之穩定性

結合所有之前的結果，證實了以上調配物具良好的穩定性，如下：

表18，FSH之免疫分析在25±2℃/60±5%相對濕度(RH)下3個月以及在5±3℃下12個月的貯存期間之FSH之免疫分析的穩定性結果：

pH

在25±2℃/60±5% RH下3個月以及在5±3℃下12個月的貯存期間之pH的穩定性結果，顯示穩定的pH。

範例4

除以上之外，本發明人亦進行生物分析之研究(在25℃下貯存6個月，DoE批次)。

FSH之生物分析(Steelman-Pohley)

在25±2℃/60±5%RH下6個月的貯存期間之FSH之生物分析的穩定性結果，列在表22中。

LH之生物分析法(精液重量增加)

在25±2℃/60±5% RH下6個月的貯存期間之LH之生物分析的穩定性結果列在表23中。

此外，亦測試範例3之組成物之FSH以及LH之生物分析，得到下列結果：

在25±2℃/60±5%RH下3個月的貯存期間以及在5±3℃下12個月的貯存期間之FSH之生物分析的結果列在表24中：

在25±2℃/60±5%RH下3個月以及在5±3℃下12個月的貯存期間之LH之生物分析的穩定性結果列在表25中。

表25，在25±2℃/60±5% RH下的貯存期間以及在5±3℃下12個月的貯存期間之LH之生物分析的結果。

8縮寫以及定義

（無）

Claims

一種液態藥學促性腺激素調配物，其包含一促性腺激素、50至160mM之量的精胺酸、0.05至1.5mg/ml之量的甲硫胺酸、一防腐劑以及一界面活性劑，其中該調配物不含一額外的緩衝劑，其中該調配物之pH介於6.0與7.5之間，且其中該防腐劑包括苯酚以及該界面活性劑包括聚山梨醇酯。
如請求項1之藥學調配物，其中該促性腺激素包含hCG(人類絨毛膜促性腺激素)。
如請求項2之藥學調配物，其中該促性腺激素進一步包含FSH和/或LH。
如請求項1之藥學調配物，其中該促性腺激素包含hMG(人類停經期促性腺激素)。
如請求項1之藥學調配物，其中該促性腺激素包含人源的、尿衍生的FSH、LH和/或hCG。
如請求項1之藥學調配物，其中該促性腺激素包含重組FSH、LH和/或hCG。
如請求項1之藥學調配物，其中該聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯20。
如請求項1之藥學調配物，其中該防腐劑的含量為4-6mg/ml。
如請求項8之藥學調配物，其中該防腐劑的含量為5mg/ml。
如請求項1之藥學調配物，其中該界面活性劑的含量為0.001-0.05mg/ml，。
如請求項10之藥學調配物，其中該界面活性劑的含量為0.005mg/ml。
如請求項1之藥學調配物，其中該精胺酸為L-精胺酸HCl。
如請求項1之藥學調配物，其中該hMG的含量為300-900IU/ml。
如請求項13之藥學調配物，其中該hMG的含量為500-700 IU/ml。
如請求項1之藥學調配物，其由下列構成：- 625 IU/ml之hMG，- 0.15mg/ml之甲硫胺酸，- 150mM之精胺酸，- 5mg/ml之苯酚，- 0.005mg/ml之聚山梨醇酯20，- 注射用水(WFI)，以及- 其中該調配物具有6.8+/-0.3之pH。
一種如請求項1至15中任一項之液態藥學調配物於製備藥物的用途，該藥物係用於不孕症之治療方法中。
如請求項16之用途，其中該治療是排卵誘導(OI)、輔助生殖技術(ART)和/或男性低促性腺激素性性腺功能減退症之治療。
一種穩定包含hMG之一液態藥學調配物之方法，其包含下列步驟：提供來自人類婦女之尿液之一樣本，從該樣本萃取hMG，以如請求項1或15中所界定之量，將該萃取物與精胺酸以及甲硫胺酸調製在一起，添加如請求項8至11及15中任一項所界定之量之苯酚以及聚山梨醇酯，將該調配物之pH調整至介於6.0與7.5之間，其中沒有添加額外的緩衝劑。