KR20180114178A

KR20180114178A - 고나도트로핀의 안정한 액체 제형

Info

Publication number: KR20180114178A
Application number: KR1020187027128A
Authority: KR
Inventors: 헬렌 울리카 쇼그렌; 샬롯 호저-페더슨
Original assignee: 훼링 비.브이.
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2018-10-17
Also published as: EP3791860A1; MY193138A; JP6932710B2; JOP20170046B1; CN108883061B; LT3419595T; AU2017222292B2; EP3791860B1; CO2018007810A2; US10792334B2; JP2021191760A; JP2023164573A; ZA201804944B; MD3419595T2; HUE064432T2; IL260626B1; IL260626A; GB201603280D0; EP3419595A1; SI3791860T1

Abstract

본 발명은 일반적으로 고나도트로핀 제형의 안정화 분야, 특히 고나도트로핀의 액체 제형의 안정화 분야에 관한 것이다. 안정화는 부형제의 특수 조합에 의해, 바람직하게는 아르기닌과 메티오닌의 특수 조합에 의해 달성된다. 바람직한 구현예에서, 제형은 완충제를 포함하지 않는다.

Description

고나도트로핀의 안정한 액체 제형

본 발명은 일반적으로 고나도트로핀 제형의 안정화 분야, 특히 고나도트로핀의 액체 제형의 안정화 분야에 관한 것이다. 안정화는 부형제의 조합에 의해, 바람직하게는 아르기닌과 메티오닌의 특정 조합에 의해 달성된다. 바람직한 구현예에서, 제형은 완충제를 포함하지 않는다.

고나도트로핀 (gonadotropin)은 본래 여성 및 남성의 생식 주기에 주로 관여하는 호르몬 계열이다. 고나도트로핀은 연구 목적 및 치료 목적으로 뇨로부터 수득할 수 있지만, 예를 들어 hCG, LH 및 FSH와 같은 몇몇 고나도트로핀은 재조합 방식으로도 생산할 수 있다.

특히, 고나도트로핀은 불임 치료에 사용할 수 있다.

4종의 주요 고나도트로핀 모두 동일한 당단백질 패밀리에 속한다. 4종의 주요 고나도트로핀은 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체화 호르몬 (LH) 및 융모성 고나도트로핀 (hCG)이다. 이들 고나도트로핀 모두 헤테로다이머로서, 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 이루어져 있으며, 알파 서브유닛은 이들 모두에서 공통적이지만, 즉, 전술한 4종의 고나도트로핀은 알파 서브 유닛이 모두 동일하지만, 베타 서브유닛은 각각 다르다. FSH의 작용은 별개의 FSH 수용체에 의해 매개된다. LH 및 HCG의 베타 체인은 82%의 단백질 서열 상동성을 공유하며, 동일한 LH 수용체를 통해 그들 자신의 작용을 발휘한다.

FSH는 뇌하수체 전엽에서 자연적으로 분비되며, 난포 발생과 배란을 지원하는 기능을 수행한다. FSH는, 다른 당단백질 호르몬, 예를 들어, LH 및 hCG에서 공통적인, 92개의 아미노산으로 이루어진 알파 서브유닛과, 호르몬의 생물학적 특이성을 부여하는, FSH에 고유한 111개의 아미노산 베타 서브유닛을 포함한다 (Pierce and Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50: 465-495). hCG의 성숙한 베타 서브유닛은 아미노산 145개로 구성된다. FSH 및 hCG의 각 서브유닛은 복잡한 탄수화물 잔기의 부가에 의해 번역 후 변형된다. FSH의 경우, 이들 서브유닛 둘다 N-연결된 글리칸 결합을 위한 2개의 부위를 가지고 있는데, 알파 서브유닛은 52번 및 78번 아미노산 위치에, 베타 서브유닛은 7번 및 24번 아미노산 위치에 존재한다 (Rathnam and Saxena, (1975) Primary amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17):6735-6746; Saxena and Rathnam (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, J Biol Chem. 251(4); 993-1005). 따라서, FSH는 자신의 중량의 약 30%까지 당화된다 (Dias and Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6): 510-519; Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89). hCG의 베타 서브유닛은 N-당화와 O-당화를 모두 (N-13, N-30, O-121, O-127, O-132 및 O-138) 포함한다. hCG의 베타 서브유닛에서의 추가적인 당화로 인해 hCG는 FSH보다 더 친수성이 된다. β-서브유닛은 수용체와의 상호작용에 특이성을 제공한다.

뇨로부터 유래된 고나도트로핀은 40년간 임상적으로 사용되어 왔으며, 이의 안전성이 잘 확립되어 있다. 시간이 흐르면서 제1 세대와 비교해 고도로 정제된 (HP) 새로운 세대의 뇨 유래 고나도트로핀이 출시되었다. 증가된 순도는, FSH 및/또는 LH 생활성이 없는 뇨 단백질을 제거하기 위해, 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계와 같은 추가적인 정제 단계를 부가함으로써, 수득된다. 새로운 세대의 고나도트로핀 제제의 현저한 순도 증가로 인해 보다 포괄적인 특성화 연구들이 용이하게 이루어질 수 있어서 조성물에 대한 추가적인 정보를 제공하게 된다.

폐경기 여성의 뇨로부터 단리된, 정제된 뇨 FSH 및 인간 폐경기 메노트로핀 (hMG)은, (하나의) 배란을 유도하거나 또는 보조생식술 (ART)에 앞서 과배란 유도 (COS) 시술을 받고 있는 환자에서 여러개의 난포를 자극하기 위해, 불임 치료에 수년간 사용되어 왔다. 2가지 버전의 재조합 FSH, FSH, Gonal-F^® (follitropin alpha, Merck Serono) 및 Puregon^®/Follistim^® (follitropin beta, Merck)이 1990년대 중반에 이용가능하게 되었다. 이 2가지 제품 둘다 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주에서 발현된다 (Howies, CM. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2: 172-191).

CHO 세포는 일반적으로 약제학적 재조합 단백질을 제조하는데 사용된다. 구조 분석을 통해, 시알산이 α2,3-결합으로만 연결되는 것으로 확인되었다. 다수의 인간 당단백질들이 시알산 잔기에 대해 α2,3-결합 및 α2,6-결합을 혼합된 형태로 포함하고 있다. 따라서, CHO 시스템을 이용하여 발현되는 재조합 단백질은 말단 시알산 결합 타입이 이의 천연 산물과 다를 것이다.

불임

본원에서, "불임"은 자손을 임신 및 출산하는 능력의 상실 또는 불능으로 정의될 것이다. 임신할 수 있지만 반복적으로 유산하는 여성도 불임이라고 한다. 또한, 불임은 피임하지 않고 일년간 규칙적인 성 관계를 가짐에도 불구하고 임신에 실패하는 구체적인 표현으로도 정의된다. 불임은 다수 요인들에 의해 유발될 수 있다. 불임 사례의 절반 보다 약간 높은 비율이 여성의 상태로 인한 것이다. 나머지 사례는 정자 장애 및 밝혀지지 않은 요인이 원인이다.

불임을 치료하기 위한 몇가지 방법들이 현재 가능하다.

가능한 방법으로는 계획된 성관계 (timed intercourse), 보조생식술 (ART)의 사용, 자궁내막증, 배란 유도 (OI), 섬유종 및 여성 성 기능 장애 (FSD)에 대한 의학적 조처 및 비정상을 교정하기 위한 수술이 있다.

보조생식술 및 OI의 경우, 배란을 자극하는 약물이 사용된다. 난소 자극을 일차적으로 책임지는 FSH 다음으로, 고나도트로핀 제제가 LH 및/또는 hCG를 포함할 수 있다.

임산부 또는 폐경기 여성의 뇨로부터 유래된 고나도트로핀 호르몬을 포함하는 몇가지 약물 제품, 예를 들어, FSH와 LH 생활성을 1:1 비율로 포함하는 HMG (인간 폐경기 고나도트로핀) 제제 (예, USP 버전 35의 모노트로핀 논문 참조) 및 FSH 생활성만 포함하는 제제들이 현재 불임 치료를 위한 임상 실무에 사용되고 있다. 1995년부터 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 고나도트로핀 제품이 이용가능해지게 되었다.

따라서, 고나도트로핀 화합물을 단독으로 또는 혼합물로 포함하는 안정화된 제형을 제공하는 것이 중요하다.

이에, 본 발명의 목적은, 안정적이며, 선택적으로, FSH와 조합된 형태의, 하나 이상의 고나도트로핀으로 된 제형, 특히 액체 제형, 특히 hCG를 포함하는 조성물의 액체 제형을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기한 제형의 안정화 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 저장 조건에서 12개월, 바람직하게는 24개월, 보다 더 바람직하게는 24개월간, 아울러 "사용시", 즉 실온에서 1달간 안정적인, 상기한 제형을 제공하는 것이다.

본 발명은 고나도트로핀의 안정적인 액체 제형에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 이러한 제형은 hCG를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기한 제형은 FSH 및 hCG를 둘다 포함한다. 본 발명의 제형 내 고나도트로핀은 바람직하게는 뇨-유래 또는 혈장-유래이나, 다른 구현예에서, 재조합에 의해 생산될 수 있다.

이하, 용어 "hMG"는 "뇨 유래 고나도트로핀"과 상호 호환적으로 사용될 것이다. 주로, 뇨 유래 고나도트로핀은 인간 뇨로부터 유래될 것이다.

인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)은, 현재 승인된 약학적 적응증 (pharmaceutical indication)의 원인이 되는 LH (황체형성 호르몬) 활성에 기여한다. 이는 잘 알려진 사실이며, 현재 청구된 동일한 증상들에 대해 허가된, Menopur^®-제품과 같은 hMG 제제의 SmPG의 일부로 기술된다. Menopur^® - 이들 SmPC에서 - 는 FSH 및 LH 활성을 포함하고 있지만, hCG가 LH 활성의 일정 부분 이상을 담당하는 것으로 추가적으로 확인되었다. 따라서, 본원에서 hCG에 대한 모든 언급은 hCG에 기인한 LH 활성을 포함하는 제형을 포괄한다.

바람직한 구현예들은 하기를 포함한다:

1. 고나도트로핀, 50 내지 160 mM 함량의 아르기닌 및 0.05 내지 1.5 mg/ml 함량의 메티오닌을 포함하고, 추가적인 완충제를 포함하지 않으며, 제형의 pH가 6.0 내지 7.5인, 고나도트로핀의 약학적 액체 제형.

2. 고나도트로핀이 hCG (인간 융모성 고나도트로핀)과, 선택적으로 FSH 및/또는 LH를 포함하는, 상기 항목 1에 따른 약학적 액체 제형.

3. 고나도트로핀이 hMG (인간 폐경기 고나도트로핀)을 포함하는, 항목 1 또는 2에 따른 약학적 액체 제형.

4. 고나도트로핀 (예, FSH, LH 및/또는 hCG)이 인간 기원의 뇨-유래인, 항목 1-3 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

5. 고나도트로핀 (예, FSH, LH 및/또는 hCG)이 재조합 산물인, 항목 1-3 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

6. 보존제, 바람직하게는 페놀을 더 포함하는, 항목 1-5 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

7. 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트, 보다 더 바람직하게는 폴리소르베이트 20을 더 포함하는, 항목 1-7 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

8. 보존제, 바람직하게는 페놀이 4 - 6 mg/ml의 함량, 바람직하게는 5 mg/ml의 함량으로 포함되는, 항목 6 또는 7에 따른 약학적 액체 제형.

9. 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 20이 0.001 - 0.05 mg/ml의 함량, 바람직하게는 0.005 mg/ml의 함량으로 포함되는, 항목 7 또는 8에 따른 약학적 액체 제형.

10. 아르기닌이 바람직하게는 L-아르기닌 HCl인, 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

11. hMG가 300 - 900 IU/ml, 바람직하게는 500 - 700 IU/ml, 보다 더 바람직하게는 600 - 650, 가장 바람직하게는 625 IU/ml의 함량으로 포함되는, 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

12. 하기로 구성되며, 상기 제형의 pH가 6.8 +/- 0.3인, 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형:

- 625 IU/ml hMG

- 0.15 mg/ml 메티오닌

- 150 mM 아르기닌

- 5 mg/ml 페놀

- 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 및

- 주사용수 (WFI).

13. 불임의 치료 방법에 사용하기 위한, 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 약학적 액체 제형.

14. 치료가 배란 유도 (OI), 보조생식기술 (ART) 및/또는 남성에서의 저성선자극호르몬성 성선기능 저하증의 치료인, 항목 13에 따른 약학적 액체 제형.

15. 하기 단계를 포함하며, 완충제가 첨가되지 않은 약학적 액체 제형의 안정화 방법:

- 인간 여성으로부터 뇨 샘플을 수득하는 단계,

- hMG를 추출하는 단계,

- 추출물을 아르기닌 및 메티오닌과 전술한 항목들 중 어느 하나에 따라 정해진 양으로 혼합 (compounding)하는 단계,

- 선택적으로, 전술한 항목들 중 어느 하나에 따라 정해진 양으로 페놀 및 폴리소르베이트를 추가로 첨가하는 단계,

- pH가 6.0 내지 7.5인 제형을 제공하도록 pH를 조정하는 단계.

전술한 바와 같이, 고나도트로핀, 예를 들어 FSH 및 hCG 뿐만 아니라 LH는 불임을 치료하는데 적합하다. 이와 관련하여, 이들 고나도트로핀의 액체 제형이 불안정할 수 있음이 명확해졌으며; 이는 심지어 1회 사용으로 계획된 고나도트로핀에도 해당된다. 불안정성은, 액체 제형이, 예를 들어, 다회용 제형에 처방되는 보존제를 포함하는 경우에, 더 악화될 수 있다.

본 발명의 제형은 1회용 또는 다회용으로 각각 설계될 수 있다.

본 발명의 제형 내에 제형화되는 FSH는 뇨-유래 또는 혈장-유래이거나, 또는 재조합 FSH (rFSH)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, FSH는 뇨 FSH 또는 rFSH이며; 특히, 바람직하게는 뇨 FSH이다.

전술한 바와 같이, 현재, FSH, LH 또는 hCG와 같은 고나도트로핀은 재조합 방식으로 생산할 수 있다. 따라서, 본원에서 고나도트로핀에 대한 언급은, 달리 언급되지 않은 한, 일반적으로 늘 뇨- 또는 혈장-유래 뿐만 아니라 재조합 (r) 고나도트로핀을 포함하는 것이다. 즉, 예를 들어, "FSH" 언급은 rFSH에 대한 언급도 포함한다. FSH, hCG 및 LH의 생산 및 아미노산 서열 뿐만 아니라 핵산 서열 모두 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.

본원에서 사용될 수 있는 서열은 다음과 같다:

FSH , LH 및 hCG alpha 서브유닛 (서열번호 1)

(Fiddes , J.C . and Goodman, H.M . The gene encoding the common alpha subunit of the four human glycoprotein hormones J. Mol . Appl . Genet. 1 (1), 3-18 (1981) 참조)

MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS (밑줄 친 부분은 리더 펩타이드임) (116).

FSH beta 서브유닛 (서열번호 2)

(Saxena,B.B . and Rathnam,P . Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands J. Biol . Chem . 251 (4), 993-1005 (1976) 참조)

MKTLQFFFLFCCWKAICCNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE (밑줄 친 부분은 리더 펩타이드임) (129).

hCG beta 서브유닛 (서열번호 3)

( Fiddes , JC , Goodman HM . The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region Nature. 1980 Aug 14; 286(5774):684-7 참조)

MEMFQGLLLLLLLSMGGTWASKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT MTRVLQGVLP ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV SYAVALSCQC ALCRRSTTDC GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ (밑줄 친 부분은 리더 펩타이드임) (165)

LH beta 서브유닛 (서열번호 4)

(Sairam , M.R . and Li , C.H . Human pituitary lutropin . Isolation, properties, and the complete amino acid sequence of the beta-subunit Biochim . Biophys. Acta 412 (1), 70-81 (1975) 참조)

MEMLQGLLLLLLLSMGGAWASREPLRPWCH PINAILAVEKEGCPVCITVN TTICAGYCPTMMRVLQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDC GGPKDHPLTC DHPQLSGLLFL 밑줄 친 부분은 리더 펩타이드임) (141)

다른 구현예에서, 전체 구현예들의 rFSH 또는 rHCG는 각각 장기-작용성 (long-acting) rFSH 또는 rhCG이다. 예를 들어, 이러한 장기-작용성 FSH 제형은 당해 기술 분야의 당업자들에게 일반적으로 공지된 바와 같이, 예를 들어, FSH 분자를 변형시키거나 또는 제형을 변형함으로써, 수득할 수 있다.

따라서, 본원에서 "FSH"는 전술한 FSH의 모든 가능한 뇨 유래 또는 재조합 형태 뿐만 아니라 FSH 형태들의 모든 가능한 조합을 망라한다. 또한, 1회용 제형 및 한가지 이상의 (동일한 또는 다른 고나도트로핀의) 다회용 (multi-dose use) 제형을 망라한다.

가능한 한가지 제품은, 여러가지 용기 내에 모든 FSH를 포함하는 제형 (바람직한 구현예에서, hCG, 및/또는 선택적으로 LH, LH 활성 등을 또한 포함함)일 수 있다. LH 활성은, 존재하는 경우, LH 또는 hCG로부터 기원할 수 있다. LH는 등량 (equivalent dose)의 hCG로 대체될 수 있으며, 그 역도 가능하며; 문맥에서 "등량"은 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 계산할 수 있다.

특히 바람직한 고나도트로핀 조합 (gonadotropin combination)은, 예를 들어, 바이얼 또는 카트리지와 같은, 하나의 용기 내에서의, 선택적으로는 또한 예를 들어 서로 다른 용기 내에서의, 바람직하게는 hMG 제형에서와 같이 FSH 및 hCG의 조합이다.

또한, 서로 다른 용기 내에 제공될 수 있는, 가능한 조합은, 하기를 포함한다: 뇨 (u)FSH 및 uhCG 또는 uFSH 및 uLH; 또는 (rhCG 또는 rLH 또는 rFSH) 및 (uhCG 또는 uLH 또는 rhCG 또는 rLH), 및 이들의 모든 가능한 배열 (permutation). 매우 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 FSH 및 hCG를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 hCG를 포함한다.

본 발명의 고나도트로핀 제형은 액체 제형이다. 바람직하게는, 제형은 주사용 제형이다. 제형은, FSH 또는 FSH/hCG, 및/또는 LH를 포함하는, 하나 또는 2 이상의 약학적 조성물(들)을 가진, 별도로 또는 함께 투여하기 위한, 제품으로서 공급될 수 있다. 별도로 투여되는 경우, 투여는 순차적일 수 있다. 제품은 임의의 적절한 패키지 (package)로 공급될 수 있다. 예를 들어, 제품은 각각 FSH (FSH 조성물)를 포함하거나, 또는 부가적으로 hCG (hCG 조성물)를 포함하는, 복수의 사전 충전된 주사기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 주사기는 블리스터 패키지 또는 그외 무균성을 유지하기 위한 수단으로 포장될 수 있다. 제품은 선택적으로 고나도트로핀 제형의 이용법에 대한 설명서를 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명의 고나도트로핀 제형은 다회용 제제 (multi-dose preparation)로서 제공된다. 그러나, 본 발명은, 명백하게는 1회용으로 설계된 제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 키트의 일부로서 제형의 안정화에 관한 것이다. 키트는 고나도트로핀, 예를 들어 FSH를 1일 투여량 (daily dose)으로 하나 이상 포함하는 하나 이상의 용기 또는 예를 들어 각각 hCG와 같은 서로 다른 고나도트로핀을 포함하는 2개의 용기 (예, 바이얼)를, 예를 들어, 추가적으로 설명서 (예, 투여 설명서)와 함께, 추가적으로 예를 들어 주사 수단과 함께 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 고나도트로핀 용액이 해당 카트리지에 충진된 다회 주사를 위한 주사 펜이 사용된다. 활성 성분들은 서로 다른 카트리지에 존재할 수 있으나, 물론 동시에 또는 순차적인 순서로, 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 바와 같이 주사될 수 있다. 또한, 2종 이상의 활성 성분이 하나의 동일한 카트리지 안에 수용될 수 있다.

매우 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 비경구 용도이며, 보다 더 바람직하게는 피하 주사용이다.

바람직한 구현예에서, hMG는 제형에 35 - 850 IU/ml의 함량으로, 바람직하게는 50 -800 IU/ml, 보다 더 바람직하게는 100 - 700 IU/ml, 가장 바람직하게는 625 IU/ml의 함량으로, 전형적으로 다회용 제형 (multidose formulation) 내에 존재한다.

전술한 hMG들, 및/또는 hMG, 및/또는 hCG, 및/또는 본 발명에 언급된 그외 모든 고나도트로핀을 포함하는 다회용 제형에 있어, 특히 바람직한 부형제의 제형은 다음과 같은 조성을 가진다:

50- 160 mM 아르기닌 HCl, 바람직하게는 150 mM, 아르기닌 HCl

0.05 내지 1.5 mg/ml, 바람직하게는 0.15 mg/ml, L-메티오닌

0.001 - 0.05 mg/ml, 바람직하게는 0.005 mg/ml, 폴리소르베이트 20

4.0 to 6.0 mg/ml, 바람직하게는 5.0 mg/ml, 페놀

pH 6.0 - 7.5, 바람직하게는 pH 6.8 +/- 0.3, (pH는 용액 전체의 pH를 의미한다)

WFI.

재조합 hCG 및/또는 FSH를 포함하는 제형에서, 활성 성분의 전형적인 농도는, 활성 성분의 농도가 본 발명의 성능에 어떠한 영향을 미치는 것은 아니지만, 다음과 같다:

rFSH: 30 - 150 ㎍/ml

rhCG: 5 - 200 ㎍/ml

이러한 재조합 제형에 바람직한 부형제는 다회용 hMG 제형에 대해 언급된 바와 동일하다. 또한, 전형적인 1회용 제형도 본 발명에 포함되며, 페놀과 같은 보존제를 포함하지 않는 것을 제외하고는 언급된 바와 동일할 것이다.

주사용 데포 형태 (injectable depot form)는, 생분해성 폴리머 내 고나도트로핀 (및 필요에 따라 기타 물질)의 마이크로 캡슐화된 매트릭스를 형성함으로써 제조할 수 있다. 폴리머 기반의 데포 형태/지속 방출 (sustained release) 시스템은 화학적 특성에 의존할 수 있으며, 예를 들어, 미세입자, 나노입자, 하이드로겔, 마이셀 에멀젼 또는 임플란트일 수 있다. 고나도트로핀 대 폴리머의 비율 및 사용되는 구체적인 폴리머의 특성에 따라, 고나도트로핀의 방출 비율을 조절할 수 있다. 생분해성 폴리머의 예로는, 폴리락티드/폴리글리콜라이드 코폴리머 시스템, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(오르토에스테르), 폴리(무수물), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리 아미노산, 다당류, 예를 들어 소듐 히알루로네이트 (NaHA) 또는 그외 이의 염, 젤라틴, 키토산 등이 있다. 언급된 폴리머들 모두 단백질 약물 전달 또는 안정성을 최적화하기 위해 유도체화 또는 변형될 수 있다. 또한, 데포 주사용 제형은 고나도트로핀을 액체 시스템 또는 신체 조직에 적합한 마이셀, 리포좀 또는 미탁제 (micro-emulsion)로서의 폴리머 액체 혼합물 내에 포집 (entrapping)시킴으로써, 제조된다.

주사용 제형은, 예를 들어, 박테리아-체류 필터 (bacterial-retaining filter)를 통해 여과하거나 및/또는 살균제를 투입함으로써, 살균 처리할 수 있다. 멸균수 또는 그외 무균 주사용 매질에 사용 직전에 용해 또는 분산시킬 수 있는, 무균 고체 조성물을 제조하는 것도 가능하다. 주사용 제형은 전술한 바와 같이 임의의 적절한 용기, 예를 들어, 바이얼, 사전 충전된 주사기, 주사 카트리지 등 내에 공급될 수 있다.

본원에 기술된 약학적 조성물로서 사용하기 위한 제형의 다양한 성분들의 pH 및 실제 농도는, 원칙적으로는, 당해 기술 분야의 일반적인 실무에 따라 조정되며, 예를 들어, The textbook of Pharmaceutical Medicine, fifth edition, edited by John P. Griffin and John O'Grady를 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 조성물로서 공급된다. 비경구 제형을 제조하기 위한 일반적인 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, pages 780-820에 기술되어 있다. 비경구 조성물은 액체 제형 형태로 공급될 수 있거나, 또는 투여 직전에 무균 주사용 매질과 혼합되는 고체로서 공급될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 비경구 조성물은 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위한 투여량 단위 형태 (dosage unit form)로 공급된다.

본 발명에 따라 제형화될 수 있는 FSH, hCG 및/또는 LH는, 당해 기술 분야에 잘 공지된 바와 같이 뇨로부터 통상적인 수단에 의해 유래될 수 있거나, 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 가능한 제조 방법에 대해 예를 들어 WO 2009/127826을 추가로 언급한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예는 hCG를 포함하는 현재 통용되는 제형 (presently described formulation)이다.

hCG는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단에 의해 수득할 수 있다. 본원에서, hCG는 뇨-유래 hCG 및 재조합 hCG를 포함한다. 뇨-유래 hCG를 포함하는 제형이 특히 바람직하다. 적어도 부분적으로 hCG로부터 유래되는 (다시 말해, hCG가 LH 활성의 원인 물질임) LH 활성을 가진 제형 역시 고려된다. 인간-유래 hCG는 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해 임의의 적절한 소스 (예, 뇨 및/또는 태반)로부터 정제될 수 있다. 재조합 hCG를 발현 및 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.

LH는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단에 의해 수득할 수 있다. LH는, 본원에서, 인간-유래 LH 및 재조합 LH를 포함한다. 인간-유래 LH는 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해 임의의 적절한 소스 (예, 뇨)로부터 정제할 수 있다. 재조합 LH를 발현 및 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.

본원에서 용어 "약학적 조성물"은 "약학적 제형"과 상호 호환적으로 사용된다.

본 발명의 안정한 약학적 조성물은 불임 치료용으로 사용할 수 있다. 본원에서 "불임 치료"는 조절된 난소 (과)자극 (COS) 또는 과배란 유도 단계 또는 시기를 포함하는 방법, 예를 들어, 자궁내 인공 수정 (Intra Uterine Insemination, IUI), 시험관내 수정 (IVF) 또는 세포질내 정자 주입 (ICSI)에 의한 불임의 치료를 포함한다. 또한, 이 용어는 배란 유도 (OI) 또는 배란 유도 단계 또는 시기를 포함하는 방법을 포함한다. 또한, 이 용어는 난관 불임 또는 원인불명 불임인 개체에서의 불임 치료를 포함하며, 예를 들어, 자궁내막증, 예를 들어 I기 또는 II기 자궁내막증 (자궁내막증의 다양한 병기는 미국 생식의학학회 (ASRM) 분류 시스템, 자궁내막증의 미국 생식의학학회의 분류 개정판 1996, Fertil Steril 1997; 67, 817-821에 의해 정의됨)을 앓고 있는 개체, 및/또는 남성 요인의 불임 파트너를 가진 개체에서의 불임 치료를 포함한다. 이 용어는 바람직하게는 예를 들어 보조 생식술 (SRT), 배란 유도 (OI) 또는 자궁내 인공수정 (IUI)을 포함한다. 약학적 조성물은, 예를 들어, 기존 FSH 제제 또는 FSH 및 hCG의 제제가 사용되는 의학적 적응증에 이용될 수 있다. 전형적인 구현예에서, 본 발명의 제형은 예시적인 사례로 하기와 같이 유럽에서 Menopur®에 대해 승인된 적응증과 동일한 의학적 적응증에 사용된다:

여성 및 남성 불임의 치료:

- 무배란성 여성: MENOPUR을 사용헤 무월경 환자에서 난포 발달을 자극할 수 있다. 클로미펜 (또는 스테로이드 피드백 기전에 작용하는 유사한 배란 유도제 )은 무배란성 사이클 및 정상 프로락틴을 동반한 황체기 결함 ( luteal phase insufficiency with anovulatory cycles and with normal prolactin ) 등의 다양한 월경 주기 장애 (menstrual cycle disturbance)를 가진 여성에 대한 바람직한 치료 제이며, 또한 내인성 에스트로겐 생산 증거는 확인되나 정상 프로락틴 및 정상 고나도트로핀 수준을 가진 무월경 환자에 바람직한 치료제이다. 무-반응자는 메노트 로핀 요법의 대상으로 선정될 수 있다.

- 의학적인 보조 수정 프로그램으로 과배란되는 여성: MENOPUR은 시험관내 수정 ( IVF )과 같은 보조 컨셉 기법을 시술받는 환자에서 다발성 난포 발달을 유도하기 위해 사용될 수 있다.

- 남성에서의 저성선자극호르몬성 성선기능 저하증: MENOPUR은 정자 형성을 자극하기 위해 인간 융모성 고나도트로핀 (예, Choragon )과 조합 용법으로 제공될 수 있다.

또는 하기와 같이 미국에서 Menopur^®에 대해 허가된 적응증들:

보조생식술 (ART) 사이클의 일부로서 배란 여성에서 다발성 난포 발달 및 임식

다른 구현예에서, Menopur^®를 이용한 치료 옵션은 다음과 같이 기술될 수 있다:

MENOPUR는 하기 임상 사례들에서 불임 치료용으로 처방된다:

클로미펜 사이트레이트를 이용한 치료에 무반응성인 여성에서, 무배란, 예, 다낭성 난소 질환 (PCOD).

보조 생식술 (ART) (예, 시험관내 수정/배아 이식 (IVF/ET), 배우자 난관내 이식 (GIFT, gamete intra-fallopian transfer) 및 세포질내 정자 주입 (ICSI))에서 다발성 난포 발달을 유도하기 위한 조절된 난소 과자극.

저성선자극호르몬성 성선기능 저하증 여성에서 난포 발달 자극.

또한, 본 발명은 불임 치료용 약제를 제조하기 위한 또는 제조에 있어 (본 발명의 측면들에 따라) 본원에 개시된 안정화된 고나도트로핀 제형의 용도를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 배란 유도, 보조생식기술 (ART) 및/또는 남성에서의 저성선자극호르몬성 성선기능 저하증에 대해 사용된다.

약학적 조성물은 임의의 약물 투여 경로용으로 잘 공지된 조성물, 예를 들어 경구, 직장, 비경구, 경피 (예, 패치 기술), 정맥내, 근육내, 피하, 강내 (intracisternal), 질내, 복막내, 국소 (산제, 연고 또는 점적제), 볼 스프레이 또는 코 스프레이로 제형화할 수 있다. 전형적인 조성물은, Remington's Pharmaceutical Sciences fifteenth edition (Matt Publishing Company, 1975), pages 1405 - 1412 및 1461 - 87, 및 USP-NF, The National Formulary XIV fourteenth edition (American Pharmaceutical Association, 1975)에 기술된 바와 같이, 수용액, 염 및 보존제 등의 무독성 부형제, 완충제 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명은 일부 구현예에서 놀랍게도 높은 안정성을 가지며, 허용되지 않는 발색 및 허용되지 않는 탁도를 가지지 않으며, 주사시 통증이 적거나 없으며, 주사시 피부 자극이 저하되거나 없는 등의 추가적인 이점을 가지는, 조성물의 특정한 측면에 관한 것이다. 이는, 특정 구성 성분들이 본원에 개시된 고나도트로핀 액체 제형의 높은 안정성 및 유익한 성능을 구현할 수 있음을 보여주는 본 발명의 발견 사실만으로 가능하게 되었다.

고나도트로핀 제형이 수십년간 시판되고 있지만, 제형 학자들은 이들 단백질 제형이 여러가지 문제들을 가지고 있음을 잘 인지하고 있다. 이러한 문제들이 존재하며, 하기와 같은 여러 요인에 기반하여 다양한 심각성을 나타낸다.

- 단백질이 제형화된다는 점 (이와 같은 단백질은 임의 경우 제형화하기 어렵다)

- 단백질이 특이적으로 당화된다는 점 (당화는 제조법 및 부형제에 대한 구체적인 선택에 따라 영향을 받을 수 있음)

- 제형화되는 구체적인 단백질(들) (조제 화학은 실제 단백질에 따라 상당히 달라진다: 예를 들어, FSH 및 hCG와 같이 매우 비슷한 단백질들은 동일 제형에서 상이하게 거동하는 것으로 입증되어 있음, 예를 들어 WO 2012/013742를 참조함)

- 단백질을 자연, 예를 들어 뇨에서 수득하거나 또는 재조합에 의해 생산하는지의 여부

- 보존제의 필요성 유무 (일부 보존제는 미생물 증식에 대한 의도한 보호 목적은 충족시키지만, 최종 제형의 안정적에 부정적인 영향을 미침. 현재 고나도트로핀과 함께 사용하는 것이 허가된 유일한 보존제인 m-크레솔, 페놀 및 벤질 알코올 (벤즈알코늄 클로라이드 첨가 또는 비-첨가) 전부 여기에 해당됨; 또한, 보존제는 제형에 포함되는 추가적인 부형제 및 활성 성분에 따라 색상에 좋지 않은 효과를 가질 수 있음)

- 사용되는 특정 계면활성제 (이러한 물질은 일부 경우 해당 제형에 포함되는 추가의 부형제에 따라 혼탁을 유발할 수 있음)

- 사용되는 특정 완충제 (예. 사이트레이트 완충제는 주사시 통증 및 피부 자극을 빈번하게 유발함)

- 예측되지 않은 방식으로 여러가지 조성물을 안정화하는, 안정화를 위해 사용되는 특정 부형제

- 예측되지 않은 방식으로 여러가지 조성물을 안정화하는, 안정화를 위해 사용되는 부형제에 따라.

이에, 제형 학자들은, 양호한 안정성을 가지면서도 색, 혼탁 또는 주사시 통증이 없는 제형을 제공하는데 있어 복잡한 문제들을 유발하는, 한편으로는 여러가지 문제들과, 다른 한편으로는 다수의 가능성있는 부형제들에 직면하고 있다.

따라서, 아르기닌 및 메티오닌의 조합이, 완충제를 첨가하지 않고도 이러한 구체적인 문제들을 현재의 pH 범위에서 해결한다는 것은, 매우 놀라운 일이다.

이와 관련하여, "완충제를 (첨가)하지 않고/(부가적인) 완충제 없이" 및 "완충제를 포함하지 않는다"는 본원에서 동의어로 사용된다. 이 표현은, 완충력을 가진 것으로 간주되는 추가적인 화합물이 제형에 첨가되지 않으며/존재하지 않는다는 것을 의미할 것이다. 이온의 활성을 변화시킬 것으로 예상되는 물질의 첨가시 이온의 활성 변화에 저항한다면, 용액을 완충화되었다고 한다. 완충제는 용액에 이러한 저항성을 부여하는 물질 또는 물질들의 조합이다. 완충화된 용액은, 이온이 이온을 제거 또는 방출할 수 있는 물질과 평형을 이룬 시스템이다. 이는 이온 활성에 유의한 변화를 유발하지 않으면서 용액에 첨가될 수 있는 함량의 물질을 의미한다. 이는, pH 단위 변화에 대해 첨가되는 산 또는 염기의 비 (그람-당량/L)로서 정의된다. 완충화된 용액의 완충력 (capacity)은 일반적으로 완충제 물질 (USP NF)의 농도를 조정함으로써, 사용 조건에 맞게 조정된다. 완충력은, 대상 용액 1 L가 (바람직하게는 1기압 및 21℃에서) pH 한 단위를 변화시키기 위한 강산 (예, HCl) 또는 염기 (예, NaOH)의 당량 (Eq) 수로 일반적으로 표시된다 (Skoog West and Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, fifth edition). 1 당량 HCl은 HCl 1몰이고, 1 당량 NaOH는 NaOH 1몰이다. 본 발명에서, 완충력은 대상 용액 1 L가 pH 한 단위를 변화시키기 위한 강산 (예, HCl) 또는 염기 (예, NaOH)의 당량 (Eq) 수로 표시될 것이다. 따라서, 본 발명에서, 제형은 본 발명의 제형에 대해 언급된 pH 범위에서 ≥0.5　mEq/(L*pH)(바람직하게는, 1 atm, 21℃)로 기여하는, 추가적인 완충제를 포함하지 않을 것이다.

완충력 측정 및 계산 방법

완충력은 하기와 같이 측정 및 계산할 수 있다.

한정된 부피의 검사 용액을 산, 예를 들어 HCl 또는 염기, 예를 들어 NaOH로 적정 (tration)한다.

산 및 염기의 적절한 농도, 예를 들어, 0.2 N를 사용해 매우 정확한 적정이이 이루어지도록 하여야 한다.

적정은 검사 용액에 HCl 또는 NaOH를 소량 첨가하여 수행한다. 각 첨가시, 첨가 부피 및 대응되는 pH를 기록한다.

산 및 염기의 누적 부피를 측정된 pH에 대해 그래프로 작성한다. 예로, 도 1을 참조한다.

해당 pH 면적에 대해 선형 최소 제곱 회귀 피트 (linear least square regression fit)를 수행하고, 피팅된 선의 유효성을 검출하기 위해 R²를 계산한다.

mEq/(L x pH 단위)로 표시되는 완충력은 선형 회귀에 의해 계산된다.

등식 1

식에서,

x = 완충력 [pH 한 단위를 이동시키기 위한 0.2 N HCl/NaOH의 ㎕]

Y-b = 1 pH unit

α = 기울기

및

등식 2

식에서, mEq는 예를 들어, 0.2 N HCl/NaOH 농도로 제공되는 산 또는 염기의 밀리당량으로, 이는 0.2　당량/L HCl/NaOH = 200 mEq/L HCl/NaOH에 해당한다.

x = 완충력 [mEq/L x pH 단위]

Y-b = 1 pH unit

C = 산, 예를 들어 HCl/NaOH의 농도

V = 대상 용액의 부피

10⁶ ㎕를 L로 변환하는 보정 계수

표 9에서 등식 2 및 배치 C-01_pH _{range 6.564-} _6.947를 이용한 계산 예:

구성 요소가 완충력에 ≥0.5 mEq/(L x pH unit)으로 기여하는 지를 확인하기 위해, 완충력은 구성 요소가 첨가된 용액과 비첨가된 동일 용액에서 상기와 같이 측정한다. 2종의 용액에서 결정된 완충력의 차이는 완충력에 대한 해당 구성 요소의 기여를 의미한다.

용어 "완충제를 (첨가)하지 않고/(부가적인) 완충제 없이" 및 "완충제를 포함하지 않는다"는 또한 본 발명의 제형이 하기 하나 이상의 완충제 (pH 6.0 - 7.5 범위에서 비경구 용도로 FDA 승인된 완충제)를 포함하지 않는다는 것을 의미한다:

히스티딘

포스페이트

사이트레이트

트로메타민 (Tris)

하이드록시에틸피페라진 에탄 설폰산 (HEPES)

카보네이트

아울러, 이 용어는 FDA 승인된 추가적인 완충제, 특히 하기 성분이 비경구 용도로 포함되지 않는 것을 의미한다:

아세테이트

아디프산

암모늄 설페이트

숙시네이트

아스파라긴

아스파르트산

글루타메이트 (글루탐산)

글리신

락테이트

라이신

말리에이트 (말레산)

푸마레이트 (푸마르산)

말레이트

메글루민

프로피오네이트

알라닌

페닐알라닌

시스테인

이소루신

루신

프롤린

세린

타르트레이트

트레오닌

트립토판

티로신

발린

완충제를 첨가하지 않은 경우, 일반적으로 최종 용액의 pH를 원하는 범위로 쉽게 유지시킬 수 없으며 (그리고, 조절하여 특정 타겟 pH에 도달하기 어려움) (본 발명에서, pH는 6.0 내지 7.5, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.4, 바람직하게는 약 6.8이어야 함), 변동이 심할 것으로 추정된다.

약학적 제품에서 올바른 pH를 유지시키는 것은 매우 중요한 일이다. pH는 안정성, 활성 및 유효 기간 (shelf life)과 같은 파라미터를 규정한다. 이런 이유로, 약학적 제형은 일반적으로 완충제를 첨가하여 제형화한다. 다양한 완충제들이 이용가능하며, 원하는 pH에 효과적인 것으로 선택된다. 특히 기존 모든 고나도트로핀 제형들에 자주 사용되는 완충제의 예는 포스페이트 완충제와 사이트레이트 완충제이다. 완충제는 제형이 제형화 및 특히 보관시 노출될 수 있는 다양한 범위에서 pH가 유지되는 제형을 제공하기 위해 필요하다. 이러한 적합한 완충제를 찾는 것은 대개 매우 어려운 일이며, 일부 경우 효과적인 완충제가 제형에 부적절한 부작용, 사이트레이트 완충제의 경우 주사시 통증을 부여한다. 모든 완충제들은, 제제화 공정을 복잡하게 만드는 제형 내 추가적인 성분에 기인한 고유한 단점을 가지고 있으며, 다른 성분, 안정성, 유효 기간 및 최종 사용자에의 접근성에 유해하게 작용할 위험성이 있다.

그러나, 본 발명자들은, 놀랍게도, 완충제가 존재하지 않지만, 제형이 임의의 허용되지 않는 pH 변동성이 없는, 제형을 제공하게 되었다. 제형은 안정화 화합물로서 아르기닌을 포함한다. 아르기닌은 대략 이의 pKa, 즉, 2.17, 12.5 및 9.04에서 +/- 1 pH 단위의 예상되는 완충력을 가질 것이다. 따라서, 완충력은 본 발명의 바람직한 pH 범위 (예, 6.0 내지 7.5, 더 바람직하게는 6.5 - 7.4, 바람직하게는 약 6.8)에서 예상되지 못하였다. 그럼에도 불구하고, 아르기닌이 본원에 언급된 특정 제형들에서 pH에 강력한 안정화 효과를 가진다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다. 이러한 아르기닌의 효과는 선행 기술 분야에서는 전혀 언급된 바 없다.

유익하게는, 본원에 개시된 완충제가 첨가되지 않은 이러한 제형의 제공은, 또한 주사시 통증이 저하되거나 또는 통증이 없으며, 주사시 피부 자극이 완화되거나 또는 자극이 없는 제형을 제공해준다. 이는, 예를 들어, 주사시 피부 자극 및 통증을 유발하는 것으로 알려진 사이트레이트 완충제를 이용하는 제형과 대비된다.

본 발명의 아르기닌은 아르기닌, 또는 아르기닌 HCl, 또는 보다 더 바람직하게는, L-아르기닌 (HCl)일 수 있다. 아르기닌의 함량은 바람직하게는 50 내지 160 mM 범위이며, 더 바람직하게는 80 - 160 mM, 보다 더 바람직하게는 약 150 mM이다.

하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 아르기닌은 FSH 및 hSG의 산화에 상당한 효과를 가진다. 그러나, 본 발명자들은 특히 높은 안정화 효과를 입증하였다. 매우 놀랍게도, 본 발명자들은, 고나도트로핀을 아르기닌과 높은 안정화 함량 (high stabilizing amount) (예, 150 mM)으로 조합하였을 경우, 안정적이며 최소한의 산화 (허용가능한 수준, 하기 실시예 참조)만을 나타내는, 고나도트로핀 액체 제형을 제공할 수 있었다.

이는, 아르기닌의 pKa 값에서 먼 pH 범위, 즉 pH 6.0 - 7.5 범위에서 효과가 달성되었다는 점에서, 특히 놀라운 일이다. 상기한 범위는 본 발명에서 바람직한 pH 범위이다. 특히 바람직한 구현예에서, pH는 6.5 - 7.4 범위이다. 보다 더 바람직하게는, pH 범위는 6.5 - 7.2이고, 가장 바람직하게는 pH 6.8 +/- 0.3이다.

놀랍게도, 메티오닌, 바람직하게는 L-메티오닌이 적은 항산화제 함량 (low anti-oxidant amount)으로 부적절한 산화 현상을 방지할 수 있었다. 이러한 소량은 적게는 0.05 mg/ml일 수 있으며, 최대 2.5 mg/ml일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 메티오닌의 함량은 0.1 - 1.5 mg/ml이다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 메티오닌의 함량은 0.1 - 1 mg/ml이다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 메티오닌의 함량은 0.1 - 0.5 mg/ml이다. 가장 바람직하게는 구현예에서, 메티오닌의 함량은 0.15 mg/ml이다. 아르기닌의 높은 산화력이 소량의 메티오닌에 의해 상쇄 및 해소될 수 있다는 것 역시 전혀 예측할 수 없었던 사항이다.

보다 더 놀라운 점은, 아르기닌이 공지된 다른 안정화 물질, 예를 들어, 매우 자주 첨가되며 잘 확립되어 있는 안정화제인 슈크로스 보다 훨씬 더 강력한 안정화 효과를 가짐을 확인한 것이다.

제형은 적절한 수성 및 비-수성 약학적 담체, 희석제, 용매 및/또는 비히클을 포함할 수 있다. 적절한 수성 및 비-수성 약학적 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등), 카르복시-메틸셀룰로스 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일 (예, 올리브 오일), 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 등이 있다.

본 발명에서, 다회용 제형에는 보존제를 첨가하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 보존제는 특히 바람직하게는 페놀이다. 특히 바람직한 구현예에서, 페놀은 4.0 - 6.0 mg/ml의 농도로 첨가되며, 바람직하게는 5.0 mg/ml 페놀이다. 놀랍게도, 페놀은, 실시예에서 나타낸 바와 같이, 보존제가 존재함에도 불구하고, 심지어 장기간 동안 매우 안정적이며, 착색 (coloring)을 유도하지 않는다는 점에서, 잘 공지된 다른 보존제와 비교해 특정한 본 제형에 유익하다.

본 발명에서 계면활성제를 첨가하는 것이 또한 바람직하다. 특히 바람직하게는, 계면활성제는 폴리소르베이트, 보다 더 바람직하게는 폴리소르베이트 20이다. 바람직한 다른 구현예에서, 폴리소르베이트 20은 0.001 - 0.05 mg/ml의 농도로 첨가되며, 바람직하게는 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20이다. 유익하게는, 폴리소르베이트 20이 혼합된 본 발명의 제형은, 실시예에서 나타낸 바와 같이, 보존제의 존재에도 불구하고, 심지어 장기간 동안 혼탁을 유발하지 않으며, 매우 안정적이다.

또한, 본 조성물은, 전술한 성분 외에도 다른 첨가제, 비-제한적인 예로, (추가의) 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산화제를 포함할 수 있다. 미생물 증식을 방지하기 위해 항세균제 및 항진균제가 포함될 수 있으며, 그 예로는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등이 있다. 또한, 등장성 물질 (등장화제)을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 본 발명의 제형은 추가적인 완충제를 포함하지 않는다.

일부 경우에, 장기간의 작용을 위해, FSH와 같은 고나도트로핀(들) (및 존재하는 경우, 그외 활성 성분)의 피하 또는 근육내 주사로부터 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 수용해성이 좋지 않은 결정질 또는 비결정질 물질의 액체 현탁물을 사용함으로써 달성될 수 있다. 흡수 속도는 용해 속도에 의존하며, 용해 속도는 결정 크기 및 결정질 형태에 의존할 수 있다. 다른 예로, 비경구 투여된 FSH 조합 형태의 흡수 지연은 오일 비히클 내 FSH 조합물의 용해 또는 현탁에 의해 달성된다.

본 발명에서, 본 발명자들은 고나도트로핀 액체 제형의 안정성에 대한 특정 화합물의 효과를 조사하기 위한 시도를 수행하였으며; 몇가지 화합물들의 안정화 효과 및 탈안정화 효과를 조사하였다. 또한, 본 발명자들은 투명성, 색도 (degree of coloration) 및 주사시 통증에 대해 제조되는 제형을 개선하고자 하였다.

용어 "안정성"은 아미노산 서열에서의 공유 결합 변형을 수반하는 화학적 안정성을 지칭할 수 있으며, 단백질 안정성 측면에서는, 또한, 공유 결합 절단을 포함하지 않는 (즉, 천연 상태) 단백질의 폴딩 상태의 변화를 포함하는, 물리적 안정성도 의미할 수 있다.

본원에서, 용어 "안정성"은 고나도트로핀, 특히 FSH 및 hCG의 제형의 생물학적 안정성을 지칭한다. 단백질 제형의 물리적 불안정성은, 단백질 분자의 응집에 의한 고차 구조의 (higher order) 응집체 형성에 의해, 이형이량체의 단량체로의 해리에 의해 또는 예를 들어, 본 발명에 포함되는 FSH (및 존재하는 경우 다른 활성 성분)의 한가지 이상의 생물 활성을 낮추는 임의의 다른 구조적 변화에 의해 유발될 수 있다.

"안정한" 용액 또는 제형은, 그 안에 존재하는 단백질의 응집도, 해리도, 구조적 변형 수준, 생물학적 활성 소실 정도 등이, 허용가능한 수준으로 제어되며, 시간 경과에 따라 허용불가한 수준으로 증가되지 않는 것이다. 안정성은 샘플의 광 산란 측정, 가시적인 투명성 조사 및/또는 색, 흡광 또는 광 밀도, 분자 크기 결정 (예, 크기 배제 크로마토그래피 또는 장 흐름 분획법 (field flow fractionation)), 시험관내 또는 생체내 생물 활성 및/또는 시차 주사 열량법 (DSC) 등의, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법으로 평가할 수 있다.

본 제형은 보관 조건에서 12개월간, 바람직하게는 보관 조건에서 16개월간, 보다 더 바람직하게는 24개월간, 보다 더 바람직하게는 보관 조건에서 24개월간 + "사용시" 즉, 실온에서 1개월간 안정적이다. "보관 조건"에서의 안정성은 저온 환경, 예컨대 5℃ ± 3℃에서의 제형의 보관을 의미한다. 문맥에서 "실온"은 30℃ 이하, 바람직하게는 15 - 25℃, 바람직하게는 18 - 25℃, 가장 바람직하게는 25 ± 2℃를 의미한다.

본 제형에서 안정성을 평가하기 위해 FSH 및 hCG에 대해 잘 공지된 (면역)분석이 사용되었으며, 이는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 결과적으로 다음과 같이 일반적인 용어들로 설명된다:

산화에 대한 RP- HPLC

단백질의 산화는, RP-HPLC에 의해, C4 컬럼에서의 농도 구배 용출 및 210 nm에서의 UV 검출에 의해 측정하였다.

효소-연결된 형광 분석 ( ELFA )

FSH 및 hCG의 면역활성은 FSH 및 hCG에 각각 대응되는 VIDAS^® 키트와 자동 분석기 VIDAS ^® 장치 (BioMerieux, France)를 사용해 수행되는 샌드위치 면역분석으로 측정하였다.

크기 배제 크로마토그래피 (SEC)

rFSH의 순도는 단백질 범위 3-70 kDa의 SEC 컬럼에서의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 210 nm에서 UV 검출을 사용해 측정하였다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)

rhCG의 순도는 알킬 아미드 기를 가진 컬럼에서의 농도 구배 용출에 의한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 210 nm에서 UV 검출을 사용해 측정하였다.

FSH 및 LH 생물분석

FSH 및 LH 효능 (potency)은 생물학적 생체내 분석; Steelman-Pohley (FSH) 및 정낭 무게 획득 분석 (seminal vesicle weight gain assay) (LH) 각각으로 측정하였다.

안정성을 평가하는 다른 방법들이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명에 따라 사용할 수도 있다.

FSH 및 LH 활성 분석은 Expert Committee on Biological Standardization of the World Health Organization (WHO ECBS)의 Fourth International Standard for Urinary FSH and Urinary LH, November 2000을 적용해 표준화되며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.

몇가지 보존제들이 고나도트로핀 제형에 충분한 불안정한 효과를 나타낸다는 사실은 공지되어 있으며, 본 발명의 제형, 특히 완충제가 아닌 아르기닌 및 메티오닌을 포함하는 제형이 심지어 장기간, 심지어 페놀의 존재 하에서도 특히 안정적이라는 것을 놀랍게도 확인하였다. 본원에서 청구하는 아르기닌과 메티오닌의 조합은, hMG 액체 제형에 대해, 예컨대 슈크로스와 같이 알려져 있는 안정화제의 안정화 효과 보다 유익하고 놀라운 방식으로 훨씬 더 강력한, 안정화 효과를 발휘한다. 슈크로스와 같은 기존의 안정화제 보다 개선된 안정화 효과는 특히 놀라운 일이다. 나아가, 거의 예상치 못하게도, 완충제의 부재에도 불구하고 본 발명의 조합물의 안정화 효과는 강력하였다.

FSH 약학 제형에서 FSH가 분해된다는 것이 종래에 공지되어 있으며, 이는 WO 2012/013742의 실시예에 의해 검증된 바 있다. FSH는 시간 함수로서, 그리고 온도 함수로서 분해될 것이다.

가열시 발생하는 FSH의 3차 및 2차 구조의 구조적 언폴딩 (conformational unfolding)은 2-상 전이 (two-state transition) (단백질 응집이 제한되는 경우)인 것으로 보인다. 이러한 언폴딩은 서브유닛 해리 (4차 구조의 변화)와는 관계없을 수 있다.

나아가, 보존제가 FSH 액체 제형에, 예를 들어, 항미생물제로서 필수일 경우, 벤질 알코올 또는 페놀과 같은 보존제를 함유한 FSH는, 다회용 FSH 제형의 안정성에 명백하게 부정적으로 작용함은 선행 기술 분야에서 명확해져 있다. 본원에서, 보존제를 포함하지 않는 FSH 제형과 비교해, FSH의 장기 안정성이 저하되고, FSH의 변성 온도가 낮아지고, 이미 변성된 형태가 보다 낮은 수준의 2차 구조를 취한다.

또한, 본 발명은, 완충제를 포함하지 않는 제형에 아르기닌 및 메티오닌을 첨가하는 단계를 포함하는, 고나도트로핀 액체 제형을 안정화하는 방법에 관한 것이다.

도 1: 적정 곡선. 적정 곡선의 기울기는 완충력을 나타내며, 예를 들어 기울기가 급격할수록 완충력이 낮다는 것을 의미한다.
도 2: 25℃ 결과에 기초한 반응 최적화. 수직선은 L-아르기닌과 L-메티오닌의 수준을 나타내며, FSH 및 hCG 면역분석 반응은 Y (IU/ml)로 표시된다. R² _HCG: 92.15% 및 R² _FSH: 67.31%.

전체 실험은 부가적으로 수행된 실시간 데이터에 의해 검증되었다.

실시예

실시예 1

1 배경 및 서론

폐경기 또는 임산부의 뇨에서 유래된 고나도트로핀 호르몬을 포함하는 수종의 약물 제품, 예를 들어, hMG (인간 폐경기 고나도트로핀) 제제가 불임 치료에 사용된다. hMG는 난포 자극 호르몬 (FSH) 및 항체형성 호르몬 (LH) 활성을 1:1 비율로 가진다.

FSH, LH 및 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)은 복잡합 당단백질 호르몬들로 구성된 고나도트로핀 패밀리에 속한다. 이들은 α-서브유닛과 β-서브유닛으로 구성된 이형이량체이다. 아미노산 92개로 구성된 α-서브유닛은 이들 3종의 고나도트로핀에 공통적이지만, β-서브유닛은 고유하여, 이들에 서로 다른 생물학적 특징을 부여한다 (Wolfenson C. et al. 2005, Batch-to-batch consistency of human-derived gonadotropin preparations compared with recombinant preparations. Reproductive BioMedicine. Vol 10 No. 4:442-454; Shen, S. T., Cheng, Y. S., Shen, T. Y., and Yu, J. Y. 2006, Molecular cloning of follicle-stimulating hormone (FSH)-beta subunit cDNA from duck pituitary. Gen. Comp Endocrinol . 148:388-394; Fox, K. M., Dias, J. A., and Van, R. P. 2001, Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol . Endocrinol . 15:378-389; Burova, T., Lecompte, F., Galet, C., Monsallier, F., Delpech, S., Haertle, T., 및 Combarnous, Y. 2001, Conformational stability and in vitro bioactivity of porcine luteinizing hormone. Mol . Cell Endocrinol . 176:129-134). 당단백질 호르몬들 모두 비-공유 결합된 서브유닛들이 해리되었을 때 생활성을 상실한다 (Alevizaki, M. and Huhtaniemi, I. 2002, Structure-function relationships of glycoprotein hormones; lessons from mutations and polymorphisms of the thyrotrophin and gonadotropin subunit genes. Hormones. (Athens.) 1:224-232).

LH 및 hCG는 동일한 수용체에 결합하므로, 둘다 LH 활성을 가진다. hMG에서, LH 활성은 대부분 hCG로부터 기원한다.

본 발명의 목적은 피하 주사하기 위한 액체 제형으로서 고나도트로핀 제형을 개발하는 것이다. 다회용 주사제의 경우, 전형적으로 보존제가 첨가되어야 한다 (Meyer, B. K., Ni, A., Hu, B., and Shi, L. 2007, Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. J. Pharm . Sci . 96:3155-3167; Chang, B. S. and Hershenson, S. Practical Approaches to Protein 제형 Development. In Rational Design of Stable Protein 제형s. J. F. Carpenter and M. C. Manning, editors. 2002, Plenum Publ., New York. 1-25; Pharmaceutical 제형 Development of Peptides and Proteins. 2000, CRC Press, Boca Raton).

일반적으로, 단백질의 천연 (생활성) 구조는 예를 들어 제형의 조성, 용기/밀봉 시스템, pH 및 온도와 같은 주변 환경에 매우 민감하여, 고나도트로핀에 적합한 액체 제형을 식별하기 매우 어려워, 다양한 부형제들을 스크리닝하였다. 본 실험에서, 다양한 hMG 제형들의 완충력 및 실시간 안정성을 후술한 바와 같이 FSH 면역분석, hCG 면역분석, 생분석, 산화된 단백질을 측정하기 위한 RP-HPLC, 조정 및 pH를 이용해 조사하였다.

2 실험 제품

2.1 재료

2.1.1 약물 물질 ( DS )

hMG-HP 약물 물질 (DS)은 Instituto Massone S.A. Argentina에서 제조되었다. hMG-HP DS는 덴마크 코펜하겐에 위치한 Ferring Pharmaceuticals A/S 사로부터 분말로서 제공된다.

약물 물질에서 FSH 및 LH 생물 활성 측정은 영국 약전 (BP)의 현행판에 따라 수행하였다. 또한, 필요한 경우, USP 35 버전에 따라 상기한 측정을 수행할 수도 있다. hMG의 FSH:LH 생활성은 1:1이므로, 측정된 평균 생활성의 FSH 및 LH가 약물 제품에 혼합 (compounding)하는데 사용된다. 그래서, hMG의 농도가 예를 들어 625 IU/ml로 제공된다면, 이는 625 IU/ml FSH 및 625 IU/ml LH 생활성과 등가이다.

2.1.2 부형제

본 실험에 사용된 부형제 목록을 표 1에 나타낸다.

표 1 부형제 목록

명칭	품질	제조사
소듐 하이드록사이드 펠렛	Ph Eur, BP, JP, NF	Merck
염산, 흄 (fuming) 37%	Ph Eur, BP,JP,NF	Merck
시트르산 일수화물	Ph Eur, BP, JPE,USP	Merck
오르토-인산 85%	Ph Eur, BP, JPE, NF	Merck
트리-소듐 사이트레이트 이수화물	Ph Eur, BP, JPE,USP	Merck
다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물	Ph Eur, BP, JPE, USP	Merck
L-히스티딘	EMPROVE® exp Ph Eur, USP	Merck
L-메티오닌	USP, multicompendial	J.T. Baker
L-아르기닌	Ph Eur, USP	Merck
L-아르기닌 모노하이드로클로라이드	Pharma Grade, EP, JP, USP	Sigma-Aldrich
슈크로스	EMPROVE® exp Ph. Eur, BP, JPE, NF	Merck
D-(+)-트레할로스 탈수화물	≥99%, cGMP	Sigma-Aldrich
만니톨	EMPROVE® Ph Eur, BP, USP, JPE	Merck
락토스 일수화물	Ph Eur, BP, NF, JP	Merck
글리신	EMPROVE® Ph.Eur., BP, JPE, USP	Merck
소듐 클로라이드	EMPROVE, Ph.Eur., BP, USP	Merck
폴리소르베이트 20	Ph.Eur, NF, JPE	J.T. Baker
Poloxamer 188	bio. Pharm. Production, Ph.Eur., NF	Merck
페놀	Ph.Eur, JP,USP	Merck
Meta-크레솔	Ph. Eur. / USP 비경구 등급	Hedinger
Milli-Q 워터	-	Millipore

2.1.3 용기 밀봉 시스템

안정성 실험을 위해, 1차 패킹 물질은 고무 마개 및 alu/플라스틱 뚜껑이 장착된 유리 바이얼 또는 고무 플런저 및 크림프 캡 (crimp cap)이 장착된 유리 카트리지였다.

3 제조 공정

3.1 혼합

모든 제형은 실험 스케일로 제조한다.

약물 제품 용액 (DP)을 제조하기 위해, 각 부형제와 약물 물질 (DS)의 원액을 순차적으로 혼합한다. hMG 첨가 및 최종 부피 희석하기 전에 각 제형의 pH를 필요에 따라 조정한다. 부형제 및 hMG의 모든 원액은 Milli-Q 워터 중에 제조한다.

3.2 멸균 여과 및 무균 충진

제형은 안정성을 위해 Millipore PVDF 0.22　㎛ 필터로 멸균 여과한다. 멸균 여과는 자동살균 물질을 사용해 LAF 벤치에서 수행한다.

여과 후 충진을 수행한다. 용기에 샘플 용액을 넣는다. 바이얼 및 카트리지 모두 LAF 벤치 내 환경과 같이 무균 하에 충진하고, 즉시 고무 마개 또는 크림프 캡으로 밀봉한다. LAF 벤치 밖에서, 충진한 바이얼을 알루미늄 플립-오프 캡으로 밀봉한다.

4 보관 조건

4.1 보관 조건

약물 제형이 수용된 용기를 최대 3개월간 30　±　2℃/65　±　5%　RH 및/또는 최대 6개월간 25　±　2℃/60　±　5%　RH의 가속 조건에서 보관한다. 각 보관 조건에서, 용기는 수직으로 세워 둔다. 카트리지는 수평으로 눕혀 둔다. 용기들 모두 광 차단된다.

5 분석 방법

본 실험에서 사용한 분석 방법을 이하 설명한다.

5.1 적정 공정

기존에 개시된 바와 같이 USP-NF에 따르면, 이온의 활성을 변화시킬 것으로 예상되는 물질의 첨가시 이온의 활성 변화에 저항한다면, 용액을 완충화되었다고 한다. 완충제는 용액에 이러한 저항성을 부여하는 물질 또는 물질들의 조합이다. 완충화된 용액은, 이온이 이온을 제거 또는 방출할 수 있는 물질과 평형을 이룬 시스템이다. 완충력은 이온 활성에 유의한 변화를 야기하지 않으면서 용액에 첨가될 수 있는 물질의 양을 의미한다. 이는, pH 단위 변화에 대한 첨가된 산 또는 염기의 비 (그람-당량/L)으로서 정의된다. 환충화된 용액의 완충력은 일반적으로 완충제 물질의 농도를 조정함으로써, 사용 조건에 맞게 조정한다.

완충력은, 대상 용액 1 L가 pH 한 단위를 변화시키기 위한 강산 또는 염기의 당량 (Eq) 수로 일반적으로 표시되며, 이는 본 발명에서 완충력 측정에 사용된 mEq/(L x pH)단위로 제시된다.

이는, 완충화된 용액 1 L의 pH를 1 단위 바꾸는데 필요한 H⁺/OH^-의 몰수 (당량)으로서 완충력을 정의하는 것을 의미한다.

완충력은 출발 포인트로서 타겟 pH로 조정된 위약 (위약은 본원에서 활성 성분이 비-첨가된 제형을 의미함) 제형을 이용하여 측정하였다. 0.2 N NaOH/HCl을 pH를 높이거나 낮게 조정하는데 사용하였다. 0.2 N NaOH/HCl 첨가시마다 pH를 측정하고, 0.2 N NaOH/HCl 첨가량을 기록하였다. 0.2 N NaOH/HCl의 양은 X-값으로, pH는 Y-값으로 하여 그래프를 작성한다. hMG 위약의 경우 약 pH 6.8 (타겟 pH)에서, 그리고 기준 위약의 경우 약 pH 6.5 (타겟 pH)에서 선형 회귀 피팅을 수행하였다. 완충력은 pH를 0.01 이동시키기 위한 0.2 N HCl/NaOH ㎕로서, 전술한 정의에서와 같이 unit/L DP = 밀리당량 (mEq) 산 또는 염기/(L x pH 단위)로서 계산될 수 있다.

5.2 FSH 및 hCG 면역분석

FSH 및 hCG 면역분석은 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다.

5.3 산화된 단백질

단백질의 산화는 RP-HPLC에 의해 측정하였다.

5.4 pH

pH는 Ph. Eur.에 따라 측정하였다.

6 결과

안정성 실험의 결과, 완충력 실험에서 완충제 평가 뿐 아니라 실험 설계 (DoE) 실험을 통한 안정성 결과를 아래에 나타낸다.

표 2 hMG ( 600 IU /ml) 액체 제형의 조성

배치 번호	완충제	계면활성제	보존제	안정제/ 등장화제
E-01	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	41.3 mg/ml 만니톨
E-02	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	85.9 mg/ml 트레할로스
E-03	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	74.3 mg/ml 슈크로스
E-04	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	18.8 mg/ml 글리신
E-05	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	67.7 mg/ml 슈크로스
E-06	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	6.8 mg/ml NaCl
E-07	10 mM 포스페이트¹ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	37.6 mg/ml 만니톨
E-08	10 mM 사이트레이트² pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	71.1 mg/ml 슈크로스
E-09	10 mM 사이트레이트² pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	29.3 mg/ml L-아르기닌 HCl
E-10	10 mM 사이트레이트² pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	39.5 mg/ml 만니톨
E-11	10 mM 사이트레이트² pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	74.7 mg/ml 트레할로스
E-12	10 mM 사이트레이트² pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	64.5 mg/ml 슈크로스
E-13	10 mM 사이트레이트² pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	6.5 mg/ml NaCl
E-14	10 mM 히스티딘 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	77.5 mg/ml 슈크로스
E-15	10 mM 히스티딘 pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	19.6 mg/ml 글리신
¹ 10 mM 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물, 인간으로 pH 조정 ² 10 mM 트리-소듐 사이트레이트 이수화물, 시트르산으로 pH 조정

6.1 hMG 액체 제형의 안정성/3개월

단백질 분자는, 용액에 부형제, 예를 들어, 염, 탄수화물 또는 아미노산을 첨가함으로써 안정시킬 수 있지만, 여러가지 탄수화물, 염 및 아미노산 첨가에 따른 안정화 정도는 여러 제형들 간에 상당한 차이를 나타낸다. 본원에서, 일차 안정성 실험은 hMG의 액체 제형에서 보존제 및 완충제와 조합하여 다양한 안정화제를 스크리닝하기 위해 수행하였다. 놀랍게도, 그 결과 hCG 면역분석에 대한 표 3 및 6, 그리고 FSH 면역분석에 대한 표 4 및 7에 나타낸 바와 같이, L-아르기닌의 강력한 안정화 효과가 확인된다. 제형 E-09는 그외 다른 제형들과 비교해 탁월한 안정성을 나타낸다. 제형 E-09는 L-아르기닌을 포함하는 유일한 제형이다 (표 2 참조). 제형 K-01, K-03 및 K-04뿐만 아니라 K-09도 다른 전체 제형들에 비해 탁월한 안정성을 나타낸다 (표 6 참조). 이들 제형 역시 L-아르기닌 (표 5 참조)을 포함한다. 표 4에서, 제형 E-09는 FSH 면역분석에서 역시 다른 전체 제형들과 비교해 최상의 안정성을 나타내며, 표 7은 제형 K-09가 다른 전체 제형들과 비교해 가장 우수한 FSH 면역분석 결과를 나타냄을 검증해준다.

표 3 30　±　 2℃ /65　±　5%　RH에서 1달 보관시 hCG 면역분석. 제형 E-09가 다른 전체 제형들 보다 우수한 안정성을 나타낸다. 제형 E-09는 L-아르기닌을 함유한다, 표 2 참조.

hCG [초기의 % ]		30℃±　2℃/65　±　5% RH
제형	초기	0.5개월	1개월
E-01	100	91	85
E-02	100	88	87
E-03	100	87	80
E-04	-	-	-
E-05	100	83	81
E-06	100	101	100
E-07	100	89	87
E-08	100	89	81
E-09 (L-아르기닌 HCl)	100	113	106
E-10	100	95	91
E-11	100	99	89
E-12	100	94	87
E-13	100	99	86
E-14	-	-	-
E-15	-	-	-

(제형 E-04, E-14 및 E-15는 발색으로 인해 검사에서 제외되었다)

표 4 30　±　2℃/65　±　5%　RH에서 3개월 보관 후 FSH 면역분석. 제형 E-09이 다른 전체 제형들에 비해 최상의 안정성을 나타낸다. 제형 E-09는 L-아르기닌을 포함한다, 표 2 참조.

FSH [초기에 대한 % ]	30℃±　2℃/65　±　5% RH
제형	초기	3개월
E-01	100	83
E-02	100	77
E-03	100	83
E-04	-	-
E-05	100	84
E-06	100	86
E-07	100	86
E-08	100	84
E-09 (L-아르기닌)	100	95
E-10	100	83
E-11	100	83
E-12	100	89
E-13	100	85
E-14	-	-
E-15	-	-

6.2 hMG 액체 제형의 안정성 - 3개월

일차 스크리닝으로부터 아르기닌이 첨가된 부가적인 제형을 스크리닝하였다.

표 5 액체 hMG 600 IU /ml의 조성물 안정성 실험 - 제형에 대한 개괄

배치 번호	완충제	계면활성제	보존제	항산화제	안정제/ 등장화제
K-01¹	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	1.5 mg/ml L-메티오닌	28.0 mg/ml L-아르기닌 HCl
K-02	1 mM 포스페이트⁴ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	1.0 mg/ml L-메티오닌	21.0 mg/ml 락토스 7.0 mg/ml NaCl
K-03	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ml L-메티오닌	25.3 mg/ml L-아르기닌 HCl
K-04	10 mM 포스페이트⁴ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	3.0 mg/ml M-크레솔	1.5 mg/ml L-메티오닌	29.3 mg/ml L-아르기닌 HCl
K-05²	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	1.0 mg/ml L-메티오닌	67.4 mg/ml 슈크로스
K-06	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	1.0 mg/ml L-메티오닌	74.6 mg/ml 슈크로스
K-07³	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	1.0 mg/ml L-메티오닌	38.3 mg/ml 만니톨
K-08	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	1.0 mg/ml L-메티오닌	34.7 mg/ml 만니톨
K-09⁶	10 mM 사이트레이트⁵ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	3.0 mg/ml M-크레솔	1.5 mg/ml L-메티오닌	20 mg/ml L-아르기닌 HCl 22.1 mg/ml 슈크로스
¹표 2의 제형 E-09와 동일함 ²표 2의 제형 E-12와 동일함 ³표 2의 제형 E-10과 동일함 ⁴10 mM 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물, 인산으로 pH 조정 ⁵10 mM 트리-소듐 사이트레이트 이수화물, 시트르산으로 pH 조정 ⁶강도는 530 IU/ml임

표 6 25　±　2℃/60　±　5%　RH에서 3개월 보관시 hCG 면역분석. 제형 K-01, K-03, K-04 및 K-09가 다른 전체 제형들에 비해 우수한 안정성을 나타낸다. 제형 K-01, K-03, K-04 및 K-09는 L-아르기닌을 포함한다, 표 5 참조.

hCG [초기에 대한 % ]		25℃±　2℃/65　±　5% RH
제형	초기	1개월	2개월	3개월
K-01 (L-아르기닌)	100	110	105	105
K-02	100	100	68	57
K-03 (L-아르기닌)	100	110	106	104
K-04 (L-아르기닌)	100	109	106	113
K-05	100	94	82	71
K-06	100	98	76	80
K-07	100	85	74	67
K-08	100	93	79	71
K-09 (L-아르기닌)	100	99	101	100

매우 명백하게도, L-아르기닌을 포함하는 제형들이 다른 안정화제를 포함하는 제형에 비해 훨씬 더 안정적이다. 예를 들어 3개월 후 제형 K-02과 K-03를 비교한다.

표 7 25　±　2℃/60　±　5%　RH에서 3개월 보관시 FSH 면역분석. 제형 K-09가 다른 전체 제형들에 비해 가장 우수한 FSH 면역분석 결과를 나타낸다. 제형 K-09는 L-아르기닌을 포함한다, 표 5 참조.

FSH [초기에 대한 %]		25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	초기	1개월	2개월	3개월
K-01 (L-아르기닌)	100	112	112	111
K-02	100	104	106	87
K-03 (L-아르기닌)	100	108	120	107
K-04 (L-아르기닌)	100	108	112	112
K-05	100	107	116	111
K-06	100	109	117	115
K-07	100	101	112	104
K-08	100	107	107	109
K-09 (L-아르기닌)	100	112	120	119

hCG에 대한 결과는, 또한 FSH의 결과를 검증해준다 - 예를 들어, 3개월 후 제형 K-02와 K-03를 비교한다.

6.3 완충력 실험

완충성 물질, 예컨대 소듐 포스페이트 및 소듐 사이트레이트는 생리학적으로 허용되는 완충제로서, pH를 원하는 범위 내에 유지시키기 위해 흔히 첨가된다. 트리-소듐 사이트레이트 이수화물 및 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물은 완충력을 이용해 완충성 물질로서 조사한다. 완충력은 pH를 지정된 스텝으로 이동시키기 위해 필요한 산 또는 염기의 양으로, 즉 pH를 전술한 바와 같이 mEq 산 또는 염기/(L x pH unit)로 계산되는 1 pH unit/L DP로 이동시키는데 필요한 0.2 N HCl/NaOH ㎕ 양으로 계산된다.

표 8 조성물의 완충력 실험 - 제형 개괄

배치 번호	완충제	계면활성제	보존제	항산화제	안정제/ 등장화제
C-01	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ml L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl⁴
C-02	5 mM 사이트레이트¹ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ml L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl⁴
C-03	10 mM 사이트레이트¹ pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ml L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl⁴
C-04³	1 mM ² 포스페이트 pH 6.5	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	1.0 mg/ml L-메티오닌	31.76 mg/ml Na₂SO₄ x 10 H₂O (14 mg/ml 소듐 설페이트)
¹트리-소듐 사이트레이트 이수화물 ²0.8 mM Na₂HPO₄ x 12 H₂O 및 약 0.2 mM H₃PO₄ pH 6.5으로 조정 ³기준 위약 ⁴= 25.3 mg/ml L-아르기닌 HCl

완충력을 측정하기 위해 수행한 적정의 결과를 도 1에 도시한다. 곡선의 기울기가 완충력이며, 예를 들어 기울기가 가파를수록 완충력이 낮다는 것을 의미한다. 도 1에서, 배치 C-04 (기준 제형)가 완충력이 가장 낮은 완충력다는 것을 알 수 있다. hMG의 경우 해당 pH 영역 6.8 ± 0.3에서, hMG 제형들 모두 C-01 (완충제 무첨가), C-02 (5 mM 트리-소듐 사이트레이트 이수화물) 및 C-03 (10 mM 트리-소듐 사이트레이트 이수화물) 비슷한 완충력을 가지며, 1 mM 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물을 포함하는 기준 제형 보다 높은 완충력을 가진다. 기준 제형의 타겟 pH는 6.5이다. 제형 C-01, C-02 및 -03은 안정한 pH를 가진 것으로 공지된 기준과 비교한다. 기준 제형 C-04에 대한 복수의 안정성 실험들이 수행되었으며, pH 변화는 관찰되지 않았다.

하기 표 9는 완충력 실험 결과를 나타낸다.

표 9 완충력 실험. hMG의 경우, 제형의 해당 pH 6.8 영역에서, hMG 제형들 모두 기준 위약 제형 보다 우수한 완충력을 가진다.

배치	완충제	타겟 pH에서의 완충력	pH 범위	α (기울기)	완충력 : mEq 산 또는 염기/(L x pH 단위)
C-01	완충제 무첨가	6.8	6.564 - 6.947	0.001507	1.32
C-01	완충제 무첨가	7.0	6.786 - 7.193	0.000822	2.44
C-02	5 mM 트리-소듐 사이트레이트 이수화물	6.8	6.599 - 6.951	0.000672	2.96
C-03	10 mM 트리-소듐 사이트레이트 이수화물	6.8	6.572 - 6.946	0.000750	2.66
C-04 (기준)	1 mM 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물	6.5	6.199 - 6.752	0.002700	0.74
C-04 (기준)	1 mM 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물	6.8	6.582 - 6.982	0.002091	0.96

(C-01 및 C-04는, 각각 다른 2가지 pH 범위에서 완충력을 계산하여, 2번 기재된다)

놀랍게도, 완충제가 무첨가된 hMG 제형 (C-01)의 완충력이 기준 제형 C-04 보다 우수하다. hMG 제형에서 주요 부형제는 120 mM 농도의 L-아르기닌이다. L-아르기닌의 pKa 값은 pKa₁ = 2.17; pKa₂ = 9.04 및 pKa₃ = 12.5이다 (Handbook of Pharmaceutical Excipients. 2015, Pharmaceutical Press, London). 아르기닌은 pKa 값과는 거리가 먼 매우 충분한 완충 거동을 나타낼 것으로는 거의 예상되지 않는다.

6.4 산화 실험

30　±　2℃/65　±　5%　RH에서 3개월 보관 후, L-아르기닌을 포함하는 제형 E-09 (표 5 참조)는 산화된 단백질의 수준이 초기 값의 241%까지 증가되었다 (아래 표 10 참조). 이는 매우 높은 수준이며, 이러한 높은 산화 수준이 바람직하지 않은 경우가 있다.

따라서, 이러한 문제를 극복할 수 있는지를 연구하기 위한 추가의 실험들을 수행하였다.

단백질 제형에 사용될 수 있는 항산화제에는 몇가지 선택이 존재한다. 메티오닌은 단백질내 메티오닌 잔기의 산화와 경쟁하는 것으로 제안된 기전에 의해 산화를 방지하기 위해 첨가될 수 있다. 아르기닌을 포함하는 제형에 메티오닌 첨가 결과는 표 10에 나타낸다. 제형 K-01, K-03, K-04 및 K-09는 아르기닌 및 메티오닌을 함유하며, 산화된 단백질의 수준이 명백하고 유의하게 감소된다. 제형 K-01 (메티오닌 첨가)은 제형 E-09 (메티오닌 무첨가)와 동일한 제형이다. 이 2가지 배치를 비교한 결과, 산화된 단백질의 수준이 메티오닌에 의해 상당히 감소됨을 알 수 있다.

표 10 30　±　2℃/65　±　5%　RH에서 3개월 보관하는 동안 초기 대비 산화된 단백질의 증가 % . 제형 E-09는 아르기닌을 포함하나, 메티오닌은 포함하지 않는다. 제형 K-01, K-03, K-04 및 K-09는 아르기닌 및 메티오닌을 둘다 포함한다, 표 5를 참조한다.

산화된 단백질 [초기 대비 증가% ]	30℃±　2℃/65　±　5% RH
제형	3개월
E-01	44
E-02	39
E-03	47
E-04	-
E-05	37
E-06	43
E-07	36
E-08	51
E-09 (아르기닌 첨가, 메티오닌 무첨가)	241
E-10	55
E-11	47
E-12	53
E-13	46
E-14	-
E-15	-
K-01 (아르기닌 및 메티오닌)	24
K-03 (아르기닌 및 메티오닌)	12
K-04 (아르기닌 및 메티오닌)	8
K-09 (아르기닌 및 메티오닌)	13

(제형 E-04, E-14 및 E-15는 발색으로 인해 제외됨)

결론적으로, 이러한 2종의 실험에서 아르기닌의 상당한 안정화 효과와 메티오닌의 심지어 소량 사용으로도의 항-산화 효과가 고나도트로핀 제형에서 입증된다.

6.5 DoE 안정성 실험

상기 실험의 결과와 완충력 실험의 결과를 종합하여, 아르기닌 및 메티오닌 간의 상호작용을 조사하고, 이들 2종의 부형제의 최적의 농도를 결정하기 위해 DoE 실험을 수행하였다.

표 11 액체 hMG 600 IU /ml에 대한 DoE 안정성 실험용 조성물 - 제형 개괄

배치 번호	완충제 ²	계면활성제	보존제	항산화제	안정제/ 등장화제
D-01	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ml L-메티오닌	80 mM L-아르기닌 HCl
D-02	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ml L-메티오닌	160 mM L-아르기닌 HCl
D-03	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	0.8 mg/ml L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl
D-04	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	0.8 mg/ml L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl-
D -05	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	0.1 mg/ml L-메티오닌	160 mM L-아르기닌 HCl
D -06	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	0.1 mg/ml L-메티오닌	80 mM L-아르기닌 HCl
D -07³	완충제 무첨가 pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl
D -08³	10 mM 사이트레이트¹ pH 6.8	0.1 mg/ml Poloxamer 188	5.0 mg/ml 페놀	1.5 mg/ L-메티오닌	120 mM L-아르기닌 HCl
¹트리-소듐 사이트레이트 탈수화물 ²완충제 무첨가 제형의 경우 0.2 N HCl/NaO로 조정하고, 트리-소듐 사이트레이트 이수화물 완충제가 첨가된 제형의 경우에는 0.2 N NaOH/0.5 M 시트르산 일수화물로 pH 조정 ³기준 제형으로서 포함됨

6.5.1 FSH 면역분석

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월간 보관시 FSH 면역분석의 안정성 결과는 표 12에 나타낸다.

표 12 25　±　2℃/60　±　5%　RH에서 보관시 FSH 면역분석 결과. 전체 제형에 대한 상세 설명은 표 11에 열거된다.

FSH [ IU /ml]		25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	초기	1개월	2개월	3개월
D-01	516	501	468	462
D-02	521	492	503	478
D-03	511	503	513	474
D-04	515	505	490	477
D-05	532	521	513	473
D-06	518	488	458	493
D-07	518	528	482	490
D-08	514	499	472	481

아르기닌 및 메티오닌의 영향 및 상호작용을 평가하기 위해 FSH 활성 [IU/ml]에 대해 통계학적 계산을 수행하였다. 통계학적 평가 결과, L-아르기닌이 FSH 면역분석 안정성 결과에 통계학적으로 유의한 영향을 미치는 것으로 검증되었다. 메티오닌은 FSH 면역분석 안정성 결과에 통계학적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 이러한 반응 파라미터에 대해 아르기닌 및 메티오닌 간의 통계학적으로 유의한 상호작용은 존재하지 않았다.

6.5.2 hCG 면역분석

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월 보관하는 동안, hCG 면역분석의 안정성 결과를 표 13에 나타낸다.

표 13 25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관시 hCG 면역분석 결과. 전체 제형에 대한 상세 내용은 표 11에 열거된다.

hCG [IU/ml]		25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	초기	1개월	2개월	3개월
D-01	83	82	75	56
D-02	87	83	93	76
D-03	93	93	88	70
D-04	86	91	87	70
D-05	90	98	92	85
D-06	87	85	72	61
D-07	93	92	88	71
D-08	91	96	94	81

아르기닌 및 메티오닌의 영향 및 상호작용을 평가하기 위해 hCG 활성 [IU/ml]에 대해 통계학적 계산을 수행하였다. 통계학적 평가 결과, 아르기닌이 hCG 면역분석 안정성 결과에 통계학적으로 유의한 영향을 미치는 것으로 검증되었다. 메티오닌은 hCG 면역분석 안정성 결과에 25℃에서 약간의 영향을 나타내었다. 메티오닌의 낮은 농도 (0.1 mg/ml) 보다 높게, 농도를 심지어 최대 1.5 mg/ml까지 증가시킴으로써, 안정성 증가가 검출되지 않는다는 것이 명확해졌다. 이러한 반응 파라미터에 대해 아르기닌 및 메티오닌 간의 통계학적으로 유의한 상호작용은 존재하지 않았다.

6.5.3 산화된 단백질

상기 안정성 실험에서, 놀랍게도 아르기닌의 존재가 상당한 안정화 효과를 나타냄을 관찰하였다. 그러나, 아르기닌 첨가로 산화된 단백질 수준이 증가하였다. 산화를 방지하기 위해 메티오닌을 첨가할 수 있으며, 본 실험에서는 안정화제로서 아르기닌과 항산화제로서 메티오닌 간의 농도 균형을 조사하였다.

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 6개월, 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 3개월 보관하는 동안, 아르기닌 및 메티오닌 (농도 범위 0.1-1.5 mg/ml)이 첨가된 제형에서, 산화된 단백질 양에 대한 안정성 결과 [초기 대비 증가%]를 아래에 나타낸다. 비교를 위해, 아르기닌은 첨가되나 메티오닌은 첨가되지 않은 제형 E-09를 표 14에 포함시켰다.

표 14 25 ± 2℃/60 ± 5% RH 및 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 보관하는 동안의 산화된 단백질에 대한 결과. 전체 제형에 대한 상세 내용은 표 11에 열거된다.

산화된 단백질 [초기 대비 증가%]	30℃±　2℃/65　±　5% RH			25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	1개월	2개월	3개월	1개월	2개월	3개월	6개월
D-01	5.5	4.1	8.3	10.1	4.1	9.6	6.9
D-02	9.9	8.5	10.3	11.7	11.7	6.6	8.5
D-03	10.9	10.0	11.4	12.3	13.3	11.8	12.8
D-04	8.9	8.4	8.9	8.9	11.2	9.8	8.9
D-05	12.9	13.8	13.8	13.3	20.5	11.0	15.2
D-06	7.0	9.8	11.6	10.7	7.9	9.3	11.2
D-07	14.0	10.1	11.1	14.5	13.5	15.0	10.1
D-08	7.6	9.5	7.6	13.3	9.0	11.8	7.6
E-09 (L-메티오닌 무첨가)	-	-	241	-	-	-	-

표 14로부터, 놀랍게도, 소량의 메티오닌 만으로도 아르기닌의 전체 농도 범위에서 산화를 방지하는데 충분함을 알 수 있다.

6.5.4 DoE 요약

DoE 결과에 대한 결론을 내리고 이를 요약하기 위해, Minitab에서 반응 옵티마이저 (response optimizer)를 적용하였다 (도 2 참조). Minitab Response Optimizer tool은 서로 다른 실험 요인 설정, 예를 들어, 아르기닌 및 메티오닌 농도가 예측된 반응, 예를 들어 요인 설계 (factorial design)에서 FSH 면역분석 [IU/ml] 및 hCG 면역분석 [IU/ml]에 영향을 미치는 방식을 보여준다. 최적화 플롯은 반응 (가로)에 대한 각 요인 (세포)의 영향을 나타낸다. 그래프에서 진한 수직선은 현 요인 설정 (current factor level setting)을 표시한다. 가로 상단에 표시된 숫자는 현 요인 레벨 설정 ([]으로 표시됨)을 표시한다. 수평 점선과 각각의 숫자는 현 요일 레벨에 대한 반응을 표시한다. 반응 옵티마이저는 25℃ 결과를 기초로 할 것이다. 반응 옵티마이저를 적용한 결과는 도 2에 나타낸다. 최상의 안정성 (종합 만족도)은 아르기닌 고농도 및 메티오닌 저농도에서 달성된다.

6.6 pH 실험

완충력 실험에서, 단순히 아르기닌을 사용해 pH를 원하는 pH 범위에서 안정화함으로써, 완충성 물질은 hMG 제형에 필수적이지 않다는 것이 입증되었다.

보관하는 동안에 pH가 유지되는 지를 확인하기 위해, 25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 6개월간 보관하는 동안, 30　±　2℃/65　±　5%　RH에서 3개월간 보관하는 동안 측정하였다. 그 결과는 표 15에 나타낸다.

전체 제형들의 타겟 pH는 pH 6.8이었으며, 전체 제형들은 처음에 pH 6.8이었다. pH는 매우 안정적이었지만, 2개월 후 약 6.9까지 약간 상승하였으며, 최대 6개월 보관하였을 때 pH 약 6.9에서 유지되었다. 최대 6개월 보관 결과는 아르기닌의 테스트 농도 범위에서 pH의 안정성을 검증해준다.

표 15 pH 실험 결과

pH		30℃±　2℃/65　±　5% RH		25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	초기	2개월	3개월	2개월	3개월	6개월
D-01	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.9
D-02	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.8
D-03	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.8
D-04	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.8
D-05	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.8
D-06	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.8
D-07	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.8
D-08	6.8	6.9	6.9	6.9	6.9	6.9

7 결론

매우 놀랍게도, 완충제가 무첨가된 hMG 제형의 완충력은 1 mM 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물이 첨가된 기준 제형 보다 우수하다. hMG 제형의 주 부형제 성분은 아르기닌이다. 아르기닌의 pKa 값은 pKa₁ = 2.17; pKa₂ = 9.04 및 pKa₃ = 12.5이다. 아르기닌은 이 pKa 값에서 거리가 먼 충분한 완충 거동을 나타낼 것으로 예상되지 않았다. 그러나, 그 결과, 추가적인 완충성 물질이 현재의 pH 범위에서 hMG 제형에 필요하지 않다는 것이 명백하게 확인된다. 아르기닌 단독으로도 pH를 원하는 pH 범위로 유지시키는데 충분하다. pH 안정성은 25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 6개월, 30　±　2℃/65　±　5%　RH에서 3개월 보관하는 동안 아르기닌 농도 범위를 조사하는 DoE 실험에서 검증되었으며, 이는 완충력 실험에서의 관찰 결과를 검증해주었다.

본 발명의 hMG 액체 제형에 아르기닌을 첨가하면, hMG 액체 제형에 상당한 안정화 효과가 나타나는 것으로 입증되었다. 그러나, 아르기닌은 산화된 단백질을 다량 생성시키는 것으로 확인되었다. 메티오닌의 첨가가 메티오닌 첨가되지 않은 제형과 비교해 산화를 방지하는 것으로 입증되었다.

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 6개월, 30　±　2℃/65　±　5%　RH에서 3개월 보관하는 동안, 메티오닌은 심지어 적은 농도로도 산화를 방지하는 것으로 확인되었다.

이러한 실험 결과를 통해, 아르기닌의 첨가가 pH를 원하는 pH 수준에서 유지시키는데 충분하다는 것이 명확하게 확인된다. 아르기닌의 첨가는 액체 제형의 고나도트로핀 시험 제형을 상당히 안정시킨다. 테스트한 아미노산, 당 또는 염 어느 것도 유사한 안정화 효과를 나타내지 않았다. 아르기닌의 첨가에 의해 산화된 단백질 수준이 현저하게 증가되지만, 메티오닌의 심지어 소량 첨가로 단백질 산화가 방지되었다. 놀랍게도, 메티오닌은 소량으로도 아르기닌의 농도와 독립적으로 산화를 방지하는데 충분하다.

실시예 2

본 발명자들은, 본 발명의 유익한 포뮬레이션이 해당 재조합 고나도트로핀 제형을 안정화하는데 적합한 지를 추가로 검증하였다.

이를 위해, 재조합 FSH 및 재조합 hCG (각각 전술한 서열을 가짐)를 공지된 방법에 따라 제조하였다.

가속화된 안정성 실험을 rhCG 또는 rFSH를 전술한 바와 같이 각각 포함하는 2종의 제형에 대해 수행하였다.

아르기닌에서 관찰된 놀라운 안정화 효과는 또한 재조합 단백질에서도 검증되었다. rFSH 및 rhCG 둘다 5 mg/ml 페놀, 0.15 mg/ml L-메티오닌, 150 mM 아르기닌 HCl, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, pH 6.8 중에 제형으로 조제하였다. 단백질 안정성 분석을 단순화하기 위해, rFSH 및 rhCG를 서로 다른 용기에서 제형으로 조제하였다.

표 16:

	면역활성 ( IU /ml]
	초기	1개월, 30℃	2개월, 30℃	4개월, 30℃	16개월, 5℃
FSH [33.3 ㎍/ml]	464	444	456	469	435
rhCG [50 ㎍/ml]	711	680	656	600	685
	SEC ( rFSH 순도, % )
	초기	1개월, 30℃	2개월, 30℃	4개월, 30℃	16개월, 5℃
FSH [33.3 ㎍/ml]	98.9	98.6	98.3	97.9	96.9
	HIC ( rhCG 순도, % )
	초기	1개월, 30℃	2개월, 30℃	4개월, 30℃	14개월, 5℃
rhCG [50 ㎍/ml]	98.8	96.8	93.3	89.4	99.9

본 발명의 아르기닌이 첨가되나 추가적인 완충제는 첨가되지 않고, 메티오닌이 소량 첨가된 제형이, 물론 재조합 고나도트로핀을 안정화하는데 적합하다는 것이 충분히 검증된다.

실시예 3

추가적인 실험을 수행하였으며, 하기 조성물을 분석하였다:

표 17 액체 hMG 625 IU /ml 제형의 조성물

배치 번호	완충제 ¹	계면활성제	보존제	항산화제	안정제/ 등장화제
J-01	완충제 무첨가 pH 6.8	0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20	5.0 mg/ml 페놀	0.15 mg/ml L-메티오닌	150 mM L-아르기닌 HCl
¹pH는 0.2 N HCl/NaOH로 조정됨

타겟 제형의 안정성

이전의 결과들을 모두 종합하여, 상기 제형에서 다음과 같이 양호한 안정성이 검증되었다:

표 18 FSH 면역분석

25 ± 2℃/60 ± 5% 상대습도 (RH)에서 3개월, 5 ± 3℃에서 12개월 보관하는 동안 FSH 면역분석의 안정성 결과:

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월, 5 ± 3℃에서 12개월 보관하는 동안 FSH 면역분석의 결과.

FSH [초기에 대한 %]		25℃±　2℃/60　±　5% RH			5℃±　3℃
제형	초기	1개월	2개월	3개월	3개월	12개월
J-01	100	95.2	95.9	98.8	96.8	100.5

그 결과, FSH 면역분석에 의해 측정된 바와 같이 안정성이 검증된다.

표 19 hCG 면역분석

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 1개월, 5 ± 3℃에서 12개월 보관하는 동안 hCG 면역분석의 안정성 결과를 표 19에 열거한다:

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관하는 동안, 그리고 5 ± 3℃에서 12개월 보관하는 동안 hCG 면역분석의 결과.

hCG [초기에 대한 % ]		25℃±　2℃/60　±　5% RH	5℃±　3℃
제형	초기	1개월	3개월	12개월
J-01	100	88.3	94.1	89.5

그 결과, hCG 면역분석에 의해 측정된 바와 같이 안정성이 검증된다.

표 20 산화된 단백질

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월 보관하는 동안, 그리고 5 ± 3℃에서 12개월간 보관하는 동안, 산화된 단백질의 양에 대한 안정성 결과 [초기 대비 증가%].

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관시, 그리고 5 ± 3℃에서 12개월간 보관하는 동안의 산화된 단백질 결과.

산화된 단백질 [초기 대비 증가% ]	25℃±　2℃/60　±　5% RH			5℃±　3℃
제형	1개월	2개월	3개월	3개월	12개월
J-01	1.8	5.7	7.9	2.6	11

pH

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월간 그리고 5 ± 3℃에서 12개월간 보관시 pH 안정성 결과는 안정적인 pH를 나타낸다.

표 21. 25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관시, 그리고 5 ± 3℃에서 12개월 보관시 pH 결과.

pH		25℃±　2℃/60　±　5% RH			5℃±　3℃
제형	초기	1개월	2개월	3개월	3개월	12개월
J-01	6.9	6.7	6.8	6.7	6.7	6.8

실시예 4

전술한 바와 더불어, 본 발명자들은 또한 생물분석 실험을 수행하였다 (DoE 배치들을 25℃에서 6개월 보관).

FSH 생물분석 ( Steelman - Pohley )

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 6개월간 보관하는 동안 FSH 생물분석의 안정성 결과를 표 22에 열거한다.

표 22　　25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관하였을 때 FSH 생물분석 결과. 전체 제형에 대한 상세 내용은 표 11에 열거된다.

FSH [언급된 효능에 대한 % ( 600 IU /ml)]	25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	6개월
D-01	98.8
D-02	100.7
D-03	102.0
D-04	104.7
D-05	103.4
D-06	101.0
D-07	102.6
D-08	104.9

그 결과, FSH 생물분석에 의해 측정된 바와 같이 안정성이 검증된다.

LH 생물분석 (정낭 무게 증가)

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 6개월간 보관하는 동안 LH 생물분석의 안정성 결과를 표 23에 열거한다.

표 23　　25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관하였을 때 LH 생물분석 결과. 전체 제형에 대한 상세 내용은 표 11에 열거된다.

LH [언급된 효능에 대한 % ( 600 IU /ml)]	25℃±　2℃/60　±　5% RH
제형	6개월
D-01	87.8
D-02	101.3
D-03	90.9
D-04	95.6
D-05	97.5
D-06	95.0
D-07	97.3
D-08	100.1

그 결과, LH 생물분석에 의해 측정된 바와 같이 안정성이 검증된다.

아울러, 실시예 3의 조성물을 대상으로 FSH 및 LH 생물분석으로 테스트하였으며, 하기 결과를 수득하였다:

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월 그리고 5 ± 3℃에서 12개월 보관시 FSH 생물분석의 안정성 결과들을 표 24에 나타낸다:

표 24: 25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관시 그리고 5 ± 3℃에서 12개월 보관시 FSH 생물분석의 결과들

FSH [지정된 효능에 대한 % ( 625 IU /ml)]		25℃±　2℃/60　±　5% RH			5℃±　3℃
제형	초기	1개월	2개월	3개월	3개월	12개월
J-01	94.7	93.6	94.5	97.6	95.8	96.1

그 결과, FSH 생물분석에 의해 측정된 안정성이 검증된다.

25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 3개월 그리고 5 ± 3℃에서 12개월 보관시 LH 생물분석의 안정성 결과들을 표 25에 나타낸다:

표 25: 25 ± 2℃/60 ± 5% RH에서 보관시 그리고 5 ± 3℃에서 12개월 보관시 LH 생물분석의 결과들

LH [지정된 효능에 대한 % (625 IU /ml)]		25℃±　2℃/60　±　5% RH			5℃±　3℃
제형	초기	1개월	2개월	3개월	3개월	12개월
J-01	102.1	102.2	99.0	100.0	101.5	100.0

이들 결과는 LH 생물분석에 의해 측정된 안정성을 검증해준다.

8 약어 및 정의

BP 영국 약전

DoE 실험 계획

DS 약물 물질

FSH 난포 자극 호르몬

hCG 인간 융모성 고나도트로핀

hMG 인간 폐경기 고나도트로핀

hMG-HP 인간 폐경기 고나도트로핀-고도로 정제됨

JP 일본 약전

LH 황체형성 호르몬

MD 다회 투여

NF 국가의약품집

Ph Eur 유럽 약전

PS 20 폴리소르베이트 20

USP 미국 약전

WFI 주사용수

SEQUENCE LISTING <110> Ferring B.V. <120> STABLE LIQUID GONADOTROPIN FORMULATION <130> HE183650 <160> 4 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> 1..24 <223> leader peptide <400> 1 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> 1..18 <223> leader peptide <400> 2 Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 1 5 10 15 Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30 Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60 Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110 Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125 Glu <210> 3 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> 1..20 <223> leader peptide <400> 3 Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly 1 5 10 15 Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile 20 25 30 Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr 35 40 45 Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val 50 55 60 Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val 85 90 95 Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu 100 105 110 Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu 115 120 125 Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro 130 135 140 Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr 145 150 155 160 Pro Ile Leu Pro Gln 165 <210> 4 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> 1..20 <223> leader peptide <400> 4 Met Glu Met Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly 1 5 10 15 Gly Ala Trp Ala Ser Arg Glu Pro Leu Arg Pro Trp Cys His Pro Ile 20 25 30 Asn Ala Ile Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr 35 40 45 Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Met Arg Val 50 55 60 Leu Gln Ala Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln Val Val Cys Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val 85 90 95 Asp Pro Val Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Arg Cys Gly Pro 100 105 110 Cys Arg Arg Ser Thr Ser Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu 115 120 125 Thr Cys Asp His Pro Gln Leu Ser Gly Leu Leu Phe Leu 130 135 140

Claims

고나도트로핀의 약학적 액체 제형으로서,
고나도트로핀, 50 내지 160 mM 함량의 아르기닌 및 0.05 내지 1.5 mg/ml 함량의 메티오닌을 포함하고,
상기 제형이 추가적인 완충제를 포함하지 않으며,
상기 제형의 pH가 6.0 내지 7.5인, 약학적 액체 제형.
제1항에 있어서,
상기 고나도트로핀이 hCG (인간 융모성 고나도트로핀)과, 선택적으로 FSH 및/또는 LH를 포함하는, 약학적 액체 제형.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 고나도트로핀이 hMG (인간 폐경기 고나도트로핀)을 포함하는, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고나도트로핀이 인간 기원의, 뇨-유래 FSH, LH 및/또는 hCG를 포함하는, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고나도트로핀이 재조합 FSH, LH 및/또는 hCG를 포함하는, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
보존제, 바람직하게는 페놀을 더 포함하는, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트, 보다 더 바람직하게는 폴리소르베이트 20을 더 포함하는, 약학적 액체 제형.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 보존제, 바람직하게는 상기 페놀이 4 - 6 mg/ml의 함량, 바람직하게는 5 mg/ml의 함량으로 포함되는, 약학적 액체 제형.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 20이 0.001 - 0.05 mg/ml의 함량, 바람직하게는 0.005 mg/ml의 함량으로 포함되는, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아르기닌이 바람직하게는 L-아르기닌 HCl인, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hMG가 300 - 900 IU/ml, 바람직하게는 500 - 700 IU/ml의 함량으로 포함되는, 약학적 액체 제형.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 액체 제형이,
- 625 IU/ml hMG
- 0.15 mg/ml 메티오닌
- 150 mM 아르기닌
- 5 mg/ml 페놀
- 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 및
- 주사용수 (WFI)로 구성되며,
상기 제형의 pH가 6.8 +/- 0.3인, 약학적 액체 제형.
불임의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약학적 액체 제형.
제13항에 있어서,
상기 치료가 배란 유도 (OI), 보조생식기술 (ART) 및/또는 남성의 저성선자극호르몬성 성선기능 저하증 (hypogonadotrophic hypogonadism)의 치료인, 약학적 액체 제형.
hMG를 포함하는 약학적 액체 제형의 안정화 방법으로서,
- 인간 여성으로부터 뇨 샘플을 수득하는 단계,
- 상기 샘플로부터 hMG를 추출하는 단계,
- 추출물을 아르기닌 및 메티오닌과, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 정해진 양으로 혼합 (compounding)하는 단계,
- 선택적으로, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 정해진 양으로 페놀 및 폴리소르베이트를 추가로 첨가하는 단계,
- 제형의 pH를 6.0 내지 7.5로 조정하는 단계를 포함하며,
추가적인 완충제는 첨가되지 않는, 약학적 액체 제형의 안정화 방법.