CN108883061A - 稳定的液体促性腺激素制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及促性腺激素制剂的稳定化领域，特别是促性腺激素的液体制剂。通过赋形剂的特定组合实现稳定化，所述赋形剂优选为精氨酸和甲硫氨酸。在一个优选的实施方式中，所述制剂不包含缓冲剂。

Description

稳定的液体促性腺激素制剂
技术领域
本发明总体上涉及促性腺激素制剂的稳定化领域，特别是促性腺激素的液体制剂。通过赋形剂的特定组合实现稳定化，所述赋形剂优选为精氨酸和甲硫氨酸。在一个优选的实施方式中，所述制剂不包含缓冲剂。
背景技术
促性腺激素是一类激素，其基本上主要参与雌性和雄性的生育周期。促性腺激素可从尿液中提取，用于研究和治疗目的，然而，像例如hCG、LH和FSH等几种促性腺激素也可以重组产生。
特别地，促性腺激素可用于治疗不孕症。
四种主要促性腺激素均属于同一糖蛋白家族。这些是促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)和(人)绒毛膜促性腺激素(hCG)。所有这些促性腺激素都是异二聚体且由α和β亚基组成；对所有促性腺激素而言α亚基都是共同的，即对于所有上述四种促性腺激素α亚基都是相同的，而β亚基则分别不同。FSH的作用由不同的FSH受体介导。LH和HCG的β链具有82％的蛋白质序列同源性，并通过相同的LH受体发挥它们的作用。
FSH天然地由垂体前叶分泌，具有支持卵泡发育和排卵的功能。FSH包含92个氨基酸α亚基，也是其它糖蛋白激素所共有的，例如，LH和hCG，以及FSH独有的111氨基酸β亚基，其赋予激素的生物学特异性(Pierce and Parsons,1981,Glycoprotein hormones:structure and function,Ann Rev Biochem,50:465-495)。hCG的成熟β亚基由145个氨基酸组成。FSH和hCG中的每个亚基通过添加复合碳水化合物残基进行翻译后修饰。对于FSH，两个亚基均带有两个N-连接聚糖连接位点，氨基酸52和78的α亚基和氨基酸残基7和24的β亚基(Rathnam and Saxena,(1975)Primary amino acid sequence of folliclestimulating hormone from human pituitary glands.I.alpha subunit,J BiolChem.250(17):6735-6746；Saxena and Rathnam,(1976)Amino acid sequence of thebeta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands,JBiol Chem.251(4):993-1005))。因此，FSH被糖基化至约30％质量(Dias and Van Roey,(2001)Structural biology of human follitropin and its receptor.Arch MedRes.32(6):510-519；Fox et al.(2001)Three-dimensional structure of humanfollicle-stimulating hormone.Mol Endocrinol.15(3),379-89)。hCG的β亚基包含N-和O-糖基化(N-13，N-30，O-121，O 127，O-132和O-138)。hCG的β亚基中的额外糖基化使其比FSH的亲水性更强。β-亚基为受体相互作用提供特异性。
尿源性促性腺激素已经在临床上使用了40多年，并且它们的安全性已得到很好的证实。随着时间推移，与第一代相比，新一代高度纯化(HP)尿源性促性腺激素已被引入。通过增加另外的纯化步骤，例如阴离子交换和疏水作用色谱步骤，以除去没有FSH和/或LH生物活性的尿蛋白，来获得更高的纯度。新一代促性腺激素制剂的纯度显著提高有助于更全面的表征研究，其为组合物提供更多信息。
纯化的尿FSH和人类绝经期促性腺激素(hMG)都是从绝经后妇女的尿中分离出来的，已经在不孕症治疗中应用多年，以在辅助生殖技术(ART)之前，在接受控制性卵巢刺激(COS)的患者中诱导(单)排卵或刺激多个卵泡。FSH，(促卵泡素α，Merck Serono)和(促卵泡素β，Merck)的两种重组版本于20世纪90年代中期上市。这两种产物均在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达(Howles,C.M.(1996),geneticengineering of human FSH(Gonal-f),Hum Reprod.Update,2:172-191)。
CHO细胞通常用于生产药物重组蛋白。结构分析表明唾液酸仅通过α2,3-键连接。许多人类糖蛋白含有唾液酸残基的α2,3-和α2,6-键的混合物。因此，使用CHO系统表达的重组蛋白与其天然对应物在其末端唾液酸键的类型上不同。
不孕症
在本发明的上下文中，“不孕症”应被定义为能力下降或或无法受孕和生育后代。能够怀孕但后来又多次流产的妇女也被认为是不孕的。不孕症也被具体定义为在没有避孕的情况下经过一年的正常性交后未能怀孕。不孕症可能由多种原因引起。研究表明，略多于一半的不孕症病例是由女性状况引起的。其余病例是由精子疾病和不明原因引起的。目前有几种治疗不孕症的可能性。
这些可能性包括定时性交，使用辅助生殖技术(ARTs)，子宫内膜异位症、排卵诱导(OI)、纤维瘤和女性性功能障碍(FSD)的医药治疗以及纠正异常的手术。
在辅助生殖技术和OI中，使用刺激排卵的药物。其次是主要负责卵巢刺激的FSH，促性腺激素制剂还可能含有LH和/或hCG。
目前，在临床实践中，几种含有源自孕妇或绝经后妇女尿液的促性腺激素的不同药物产品被用于治疗不孕症，例如含有1:1的FSH和LH生物活性的HMG(人类绝经期促性腺激素)制剂(参见例如USP第35版，促性腺激素专论)，以及仅含有FSH生物活性的制剂。从1995年起，通过重组DNA技术生产的促性腺激素产品已经上市。
因此，重要的是提供单独或混合的促性腺激素化合物的稳定制剂。
因此，本发明的一个目的是提供一种或多种促性腺激素的制剂，特别是液体制剂，特别是包含hCG、任选与FSH组合的组合物的制剂，所述制剂是稳定的。本发明的另一个目的是提供一种稳定所述制剂的方法。又一个目的是提供这样一种制剂，其可以稳定12个月，优选24个月，更优选在储存条件下稳定24个月加上“在使用中”(即在室温下)1个月。
发明内容
本发明涉及稳定的液体促性腺激素制剂。在一个优选的实施方式中，所述制剂包含hCG。在另一个优选的实施方式中，所述制剂包含FSH和hCG。本发明所述制剂中的促性腺激素优选为尿源的或血浆源的，但在一个替代的实施方式中可以重组产生。
在下文中，术语“hMG”可与“尿促性腺激素”互换使用。大多数情况下，尿液中的促性腺激素来自人的尿液。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)有助于LH(促黄体生成激素)活性，这是目前批准的药物指适应症的原因。这是众所周知的事实，并且被描述为hMG制剂的SmPCs的一部分，例如产品，其被授权用于与目前要求保护的相同的适应症。在这些SmPCs中-包含FSH和LH活性，但另外证实hCG至少为LH提供一部分活性。因此，在本发明的上下文中对hCG的任何提及均包括包含可归因于hCG的LH活性的制剂。
优选实施方式包括以下内容：
1.一种液体促性腺激素药物制剂，其包含促性腺激素，含量为50至160mM的精氨酸，和含量为0.05至1.5mg/ml的甲硫氨酸，其中所述制剂不包含另外的缓冲剂，并且其中所述制剂的pH在6.0和7.5之间。
2.根据项目1所述的药物制剂，其中所述促性腺激素包含hCG(人绒毛膜促性腺激素)，和任选的FSH和/或LH。
3.根据项目1或2所述的药物制剂，其中所述促性腺激素包含hMG(人绝经期促性腺激素)。
4.根据项目1至3中任一项所述的药物制剂，其中所述促性腺激素(例如FSH，LH和/或hCG)是人源和尿源的。
5.根据项目1至3中任一项所述的药物制剂，其中所述促性腺激素(例如FSH，LH和/或hCG)是重组的。
6.根据前述项目中任一项所述的药物制剂，其另外包含防腐剂，优选苯酚。
7.根据前述项目中任一项所述的药物制剂，其另外包含表面活性剂，优选聚山梨醇酯，甚至更优选聚山梨醇酯20。
8.根据项目6或7所述的药物制剂，其中所述防腐剂，优选苯酚，以4-6mg/ml的量存在，优选以5mg/ml的量存在。
9.根据项目7或8所述的药物制剂，其中所述表面活性剂，优选聚山梨醇酯20，以0.001-0.05mg/ml的量存在，优选以0.005mg/ml的量存在。
10.根据前述项目中任一项所述的药物制剂，其中所述精氨酸优选为L-精氨酸HCl。
11.根据前述项目中任一项所述的药物制剂，其中hMG以300-900IU/ml的量存在，更优选以500-700IU/ml的量存在，甚至更优选以600-650IU/ml的量存在，非常优选以625IU/ml的量存在。
12.根据前述项目中任一项所述的药物制剂，其由以下组分组成：
-625IU/ml hMG
-0.15mg/ml甲硫氨酸
-150mM精氨酸
-5mg/ml苯酚
-0.005mg/ml聚山梨醇酯20
-注射用水(WFI)，和
-其中所述制剂的pH为6.8+/-0.3。
13.根据前述任一项所述的液体药物制剂，其用在治疗不孕症的方法中。
14.根据项目13所述用途的药物制剂，其中所述治疗是对排卵诱导(OI)、辅助生殖技术(ART)和/或男性性腺机能减退的治疗。
15.一种用于稳定包含hMG的液体药物制剂的方法，其包括以下步骤：
-提供一种人类女性尿液样本，
-提取hMG，
-将所述提取物与精氨酸和甲硫氨酸按照前述任一项中定义的量混合，
-任选地按照前述任一项中定义的量进一步加入苯酚和聚山梨醇酯，
-调节pH以提供pH在6.0和7.5之间的制剂，
-其中不添加另外的缓冲剂。
如上所述，促性腺激素，例如，FSH和hCG以及LH适用于治疗不孕症。在这方面，很明显，这些促性腺激素的液体制剂可能是不稳定的；即使是那些预定一次性使用的促性腺激素也是如此。如果液体制剂包含防腐剂，例如为所有多剂量制剂规定的防腐剂，则不稳定性甚至会更加明显。
本发明的制剂可分别用于一次性使用或多次使用。
在本发明制剂中配制的FSH可以是源自尿液或血浆的或重组FSH(rFSH)。在一个优选的实施方式中，FSH是尿FSH或rFSH；特别优选的是尿FSH。
如上所述，现在可以重组产生促性腺激素，如FSH，LH或hCG。因此，除非另有说明，否则本文提及的促性腺激素通常总是包括源自尿液或血浆以及重组(r)促性腺激素。因此，例如提及“FSH”也包括rFSH。FSH，hCG和LH的产生和氨基酸序列以及核酸序列都是本领域技术人员公知的。
可以在本发明的上下文中使用的序列如下：
FSH，LH和hCG α亚基(SEQ ID NO:1)
(另见Fiddes,J.C.and Goodman,H.M.The gene encoding the common alphasubunit of the four human glycoprotein hormones J.Mol.Appl.Genet.1(1),3-18(1981))
MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS(下划线部分是前导肽)(116)
FSH β亚基(SEQ ID NO:2)
(另见Saxena,B.B.and Rathnam,P.Amino acid sequence of the beta subunitof follicle-stimulating hormone from human pituitary glands J.Biol.Chem.251(4),993-1005(1976))
MKTLQFFFLFCCWKAICCNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(下划线部分是前导肽)(129)
hCG β亚基(SEQ ID NO:3)
(另见Fiddes,JC,Goodman HM.The cDNA for the beta-subunit of humanchorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough intothe3'-untranslated region Nature.1980Aug 14；286(5774):684-7)
MEMFQGLLLLLLLSMGGTWASKEPLRPRCR PINATLAVEKEGCPVCITVN TTICAGYCPTMTRVLQGVLP ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV SYAVALSCQC ALCRRSTTDC GGPKDHPLTCDDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ(下划线部分是前导肽)(165)
LH β亚基(SEQ ID NO:4)
(另见Sairam,M.R.and Li,C.H.Human pituitary lutropin.Isolation,properties,and the complete amino acid sequence of the beta-subunitBiochim.Biophys.Acta 412(1),70-81(1975))
MEMLQGLLLLLLLSMGGAWASREPLRPWCH
PINAILAVEKEGCPVCITVN
TTICAGYCPTMMRVLQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTC DHPQLSGLLFL(下划线部分是前导肽)(141)
在另一个实施方式中，所有实施方式的rFSH或rHCG分别是长效rFSH或rhCG。如本领域技术人员通常已知的，例如通过修饰FSH分子或通过修饰制剂，可以获得这样的长效FSH制剂。
因此，本文所用的“FSH”包括上述FSH的所有可能的尿衍生的或重组形式以及FSH形式的所有可能组合。还包括单次使用的制剂和多剂量使用的一种或多种的进一步制剂(相同或不同促性腺激素)。
一种可能的产品可以是包括FSH(在优选的实施方式中还包括hCG，和/或任选的LH，LH活性等)的制剂，它们都在不同的容器中。LH活性(如果存在的话)可能来源于LH或hCG。LH可以用等效剂量的hCG代替，反之亦然；本发明上下文中的“等效剂量”可以如本领域公知的那样计算。
特别优选的促性腺激素组合是FSH和hCG，优选在一个容器中作为hMG制剂，但任选地也可例如在不同容器中，例如小瓶或药筒。
也可在不同容器中提供的可能组合还包括：尿(u)FSH和uhCG或uFSH和uLH；进一步的(rhCG或rLH或rFSH)和(uhCG或uLH或rhCG或rLH)及其所有可能的排列。在一个非常优选的实施方式中，本发明的制剂包含FSH和hCG。在另一个同样优选的实施方式中，本发明的制剂包含hCG。
本发明的促性腺激素制剂是液体制剂。优选地，所述制剂是可注射的。制剂可以作为具有一种、两种或更多种药物组合物的产品提供，所述药物组合物包括FSH或FSH/hCG，和/或LH，用于单独或一起给药。如果单独给药，可以顺序给药。所述产品可以任何适当的包装提供。例如，产品可包含多个预填充注射器，每个注射器包括FSH(FSH组合物)，或另外的hCG(hCG组合物)，例如，其中注射器可以包装在泡罩包装或其它装置中以保持无菌。产品可任选地包含使用促性腺激素制剂的说明书。
根据进一步的方面，本发明的促性腺激素制剂作为多剂量制剂提供。然而，本发明还明确涉及预定用于单次使用的制剂。本发明还涉及作为试剂盒一部分的制剂的稳定化。这样的试剂盒包括至少一个容器，该容器包含一种或多种日剂量的促性腺激素，例如，FSH，或者例如两个容器(例如小瓶)，每个容器包含不同的促性腺激素，如hCG，以及例如进一步的说明(例如给药)和例如进一步的注射方法。在一个优选的实施方式中，使用用于多次注射的注射笔，由此将促性腺激素溶液填充在各自的药筒中。活性成分可以在不同的药筒中，但是当然可以同时注射，或者按顺序注射，如本领域技术人员公知的。而且，两种或多种活性成分可以在同一个药筒中。
在一个非常优选的实施方式中，本发明的制剂用于肠胃外使用，甚至更优选用于皮下注射。
在一个优选的实施方式中，hMG在制剂中的存在量为35-850IU/ml，优选50-800IU/ml，甚至更优选100-700IU/ml，最优选625IU/ml，通常在多剂量制剂中。
一种用于包含如上所述的hMG，和/或包含hMG，和/或hCG，和/或本发明所述的所有其它促性腺激素的多剂量制剂的赋形剂的特别优选的制剂，具有以下组成：
50-160mM精氨酸HCl，优选150mM精氨酸HCl
0.05至1.5mg/ml，优选0.15mg/ml，L-甲硫氨酸
0.001-0.05mg/ml，优选0.005mg/ml，聚山梨醇酯20
4.0至6.0mg/ml，优选5.0mg/ml，苯酚
pH 6.0至7.5，优选pH 6.8+/-0.3，(pH指整个溶液的pH)
WFI。
包含重组hCG和/或FSH的制剂的活性成分的典型浓度如下，尽管活性成分的浓度对本发明的性能没有任何影响：
对于rFSH：30-150μg/ml
对于rhCG：5-200μg/ml
这种重组制剂的优选赋形剂与上述多剂量hMG制剂的相同。典型的单剂量制剂也包括在本发明中，除了它们不包含防腐剂如苯酚之外，与上述相同。
可注射的贮库形式可通过在生物可降解聚合物中形成促性腺激素(和其它试剂，如果存在的话)的微囊化基质来制备。基于聚合物的贮库形式/缓释系统根据它们的化学性质，可以为例如微米或纳米颗粒，水凝胶，胶束，乳液或植入物。根据促性腺激素与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制促性腺激素释放速率。生物可降解聚合物的实例包括聚丙交酯/聚乙交酯共聚物体系、聚乙烯吡咯烷酮、聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(乙二醇)、聚氨基酸、多糖例如透明质酸钠(NaHA)或其它盐、明胶、壳聚糖等。所有提到的聚合物都可以衍生或修饰，以优化蛋白质药物递送或其稳定性。贮库注射制剂也通过将促性腺激素包埋在脂质系统或作为与身体组织相容的胶束、脂质体或微乳液的聚合物脂质混合物中来制备。
可注射制剂可以例如通过细菌截留过滤器过滤和/或通过掺入灭菌剂来灭菌。在使用前可以形成可溶解或分散在无菌水或其它无菌注射介质中的无菌固体组合物。可在任何合适的容器中提供可注射制剂，例如如前所述的小瓶、预填充注射器、注射药筒等。
用作本发明所述药物组合物的制剂的各种组分的pH和精确浓度主要根据本领域的常规实践进行调整，参见例如由John P.Griffin和John O’Grady编辑的《药物医学教科书》，第五版。在一个优选的实施方式中，本发明所述的组合物作为肠胃外给药的组合物提供。制备肠胃外制剂的一般方法是本领域已知的，并描述于REMINGTON撰写的《药学科学与实践》上第780-820页。所述肠胃外组合物可以液体制剂形式提供或作为固体提供，所述固体将在给药前与无菌可注射介质混合。在一个特别优选的实施方式中，所述肠胃外组合物以剂量单位形式提供，以便于给药和剂量均匀性。
根据本发明配制的FSH、hCG和/或LH可以通过本领域公知的常规方法从尿液中获得，或者可以重组生产。对于可能的生产方法，进一步参考例如专利WO2009/127826。
本发明的一个优选实施方式是目前描述的包含hCG的制剂。
hCG可以通过本领域已知的任何方法获得。本发明所用的hCG包括尿源的(urinary-derived)hCG和重组hCG。特别优选包含尿源的hCG的制剂。还包括一种至少部分来源于hCG的具有LH活性(换句话说，hCG是负责该LH活性的分子)的制剂。可以通过本领域公知的任何方法从任何合适的来源(例如尿液和/或胎盘)中纯化人类来源的hCG。表达和纯化重组hCG的方法是本领域公知的。
LH可以通过本领域公知的任何方法获得。本发明所用的LH包括人源的(human-derived)LH和重组LH。可以通过本领域公知的任何方法从任何合适的来源(例如尿液)中纯化人源的LH。表达和纯化重组LH的方法是本领域已知的。
术语“药物组合物”在本发明中与“药物制剂”可互换使用。
本发明的稳定的药物组合物可用于治疗不孕症。本发明上下文中的“治疗不孕症”包括通过控制卵巢(超)刺激(COS)或包括控制卵巢刺激的步骤或阶段的方法治疗不孕症，例如子宫内受精(IUI)，体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)。该术语还包括排卵诱导(OI)或包括排卵诱导步骤或阶段的方法。该术语还包括治疗患有输卵管不孕症或不明原因不孕症的受试者的不孕症，包括治疗患有子宫内膜异位症，例如I期或II期子宫内膜异位症(根据美国生殖医学学会(ASRM)对子宫内膜异位症各阶段分类系统定义，修订的美国生殖医学协会子宫内膜异位症分类：1996年，生育和不育，1997年；67，817-821)的受试者，和/或治疗患有男性因素不孕症的伴侣受试者的不孕症。该术语优选包括在例如辅助生殖技术(ARTs)、排卵诱导(OI)或宫内授精(IUI)中的用途。所述药物组合物可用于例如使用已知FSH制剂或FSH和hCG制剂的医学适应症中。在一个典型的实施方式中，本发明的制剂用于与欧洲批准的的适应症相同的医学适应症，在一个示例性情况下，如下所示：
治疗女性和男性不孕症：
-无排卵妇女：MENOPUR可用于刺激闭经患者的卵泡发育。克罗米酚(或影响类固醇反馈机制的类似促排卵剂)是患有各种月经周期紊乱的妇女的首选治疗方法，包括无排卵周期和正常催乳素的黄体期功能不全，以及有内源性雌激素产生证据但正常催乳素和促性腺激素水平的闭经患者。然后可以选择无应答者进行尿促性素治疗。
-在医学辅助受精计划中接受超排卵的妇女：MENOPUR可用于在接受辅助受孕技术如体外受精(IVF)的患者种诱导多个卵泡发育。
-男性性腺机能减退：MENOPUR可与人绒毛膜促性腺激素(如Choragon)联合使用，以刺激精子发生。
或者在美国批准的的适应症如下：
作为辅助生殖技术(ART)周期的一部分，在排卵期妇女体内的多卵泡发育和妊娠。
或者，的治疗方案可以描述如下：
MENOPUR是指以下临床情况下的不孕症治疗：
无排卵，包括多囊卵巢疾病(PCOD)，在对克罗米芬治疗无效的妇女中。
为辅助生殖技术(ART)(例如体外受精/胚胎移植(IVF/ET)，配子输卵管内转移(GIFT)和卵胞浆内单精子注射(ICSI))诱导多个卵泡发育的控制性超排卵。
患有促性腺激素分泌不足的性腺机能减退症的妇女中卵泡发育的刺激。
本发明还提供了本文所述的稳定促性腺激素制剂(根据本发明的方面)在治疗不孕症或在制备治疗不孕症的药物中的用途。
在一个优选的实施方式中，本发明的制剂用于排卵诱导、辅助生殖技术(ART)和/或用于男性促性腺激素分泌不足的性腺机能减退。
所述药物组合物可进一步配制成众所周知的用于任何给药途径的组合物，例如口服、直肠、胃肠外、透皮(例如贴片技术)、静脉内、肌内、皮下、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(粉末、软膏剂或滴剂)或作为口腔或鼻喷雾剂。典型的组合物包含药学上可接受的载体，例如水溶液，无毒赋形剂，包括盐和防腐剂、缓冲剂等，如Remington的《药物科学》第十五版(Matt Publishing Company，1975)第1405-1412页和第1461-87页所述；和USP-NF，国家处方集XIV第十四版(美国药物协会，1975)等。本发明在一些实施方式中涉及一种制剂的具体规定，该制剂表现出令人惊讶的高稳定性和其它优点，例如没有不可接受的着色、没有不可接受的混浊度、注射时减少或没有疼痛、注射时减少或没有皮肤刺激。只有本发明的发现才能实现这一点，本发明的发现表明，特定的组分使本发明所述的液体促性腺激素制剂的有利性能和高稳定性成为可能。
尽管促性腺激素制剂已经在市场上几十年，但制剂科学家很清楚这些蛋白质的配方与许多困难有关。这些困难存在并且在许多因素的基础上发生很大变化，例如
-正在配制蛋白质的事实(蛋白质本身在任何情况下都很难配制)
-蛋白质被特异性糖基化的事实(糖基化可能受制造和赋形剂的特定选择的影响)
-配制的特定蛋白质(制剂化学性质根据实际蛋白质而显著变化：例如已显示，即使是密切相关的蛋白质，如FSH和hCG，在相同制剂中也表现不同，参见例如WO 2012/0137242)
-蛋白质是否是天然获得，例如尿液，或重组产生
-是否需要防腐剂(一些防腐剂达到了其预防微生物生长的预定目标，但对最终制剂的稳定性有负面影响。对于所有间甲酚，苯酚和苯甲醇(含或不含苯扎氯铵)都是如此，而这些是目前唯一获准与促性腺激素一起使用的防腐剂；此外，防腐剂可对着色产生负面影响，这取决于制剂中包含的其它赋形剂和活性成分)
-使用的特定表面活性剂(这些可能在某些情况下导致浑浊度，同样取决于相应制剂中包含的其它赋形剂)
-使用的特定缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲剂在注射时经常会导致疼痛和皮肤刺激)
-用于稳定化的特定赋形剂，其将以不可预知的方式稳定不同的组合物。
-取决于用于稳定化的赋形剂，其将以不可预知的方式稳定不同的组合物。
因此，制剂科学家一方面面临一系列多个问题，另一方面面临一系列多种可能的赋形剂，导致一方面提供具有良好稳定性而另一方面在注射时没有着色或混浊度或疼痛的制剂的复杂问题。
因此，非常令人惊讶的是，在本发明的pH范围内，本发明的精氨酸和甲硫氨酸组合在没有添加缓冲剂的情况下解决了这些特殊问题。
在这方面，“没有(添加/另外的)缓冲剂”和“不包括缓冲剂”在本申请中同义使用。该表达应表示制剂中没有添加/不存在被认为具有缓冲能力的其它化合物。如果溶液在添加预期会改变离子活性的物质时可以抵抗离子活性的变化，则称之为缓冲溶液。缓冲剂是赋予溶液这种抗性的物质或物质的组合。缓冲溶液是其中离子与能够除去或释放离子的物质平衡的系统。它指的是可以添加到溶液中而不会导致离子活性发生显著变化的材料的量。它被定义为添加的酸或碱(以克-当量/升表示)与pH单位变化的比率。通常通过调节缓冲物质的浓度(USP NF)将缓冲溶液的容量调节至使用条件。缓冲容量通常表示为导致一升所述溶液发生单位pH变化(优选在一个大气压和21℃下)的强酸(例如HCl)或强碱(例如NaOH)的当量(Eq)数(Skoog West和Holler，分析化学基础，第五版)。一当量HCl等于1摩尔HCl，一当量NaOH等于1摩尔NaOH。在本发明中，缓冲容量将表示为导致一升所述溶液发生单位pH变化的强酸(例如HCl)或强碱(例如NaOH)的当量(Eq)数。因此，根据本发明，所述制剂不应包含在本发明制剂所公开的pH范围内贡献≥0.5mEq/(升*pH)(优选在1atm，21℃下)的另外的缓冲剂。
确定和计算缓冲容量的方法
缓冲容量可以通过如下确定和计算。
用酸(例如HCl)或碱(例如NaOH)滴定一定体积的待测溶液。应该使用合适浓度的酸和碱，例如0.2N，来进行足够精确的滴定。
通过向测试溶液中加入少量HCl或NaOH来进行滴定。对于每次添加，记录添加的体积和相应的pH。
将累积的酸和碱的体积相对于测量的pH作图，参见例如附图1。对相关pH区域进行线性最小二乘回归拟合，并计算R2以确认拟合线的有效性。
以mEq/(升×pH单位)表示的缓冲容量通过线性回归法计算。
公式1
其中，
x＝缓冲容量[以1个pH单位移动pH的μL 0.2N HCl/NaOH]
Y-b＝1个PH单位
α＝斜率；
和
公式2
其中mEq是酸或碱的毫当量，由浓度给出，例如0.2N HCl/NaOH，等于0.2当量/LHCl/NaOH，等于200mEq/L HCl/NaOH。
x＝缓冲容量[mEq/升×pH单位]
Y-b＝1个pH单位
c＝酸或碱的浓度，例如对于
V＝所述溶液的体积
106为从μL到L的换算因子
使用公式2和批次C-01pH范围6.564-6.947的计算示例，来自表9：
为了确定一种组分是否会对缓冲容量产生≥0.5mEq/(升×pH单位)的贡献，对于含有组分的溶液和不含成分的相同溶液，缓冲容量如上所述确定。两种解决方案所确定的缓冲容量的差异给出了给定组分对缓冲容量的贡献。
术语“没有(添加/另外的)缓冲剂”和“不包含缓冲剂”也意味着本发明的制剂不包含以下缓冲剂中的任何一种(FDA批准的pH在6-7.5范围内胃肠外使用的缓冲剂)：
组氨酸
磷酸盐
柠檬酸盐
氨丁三醇(Tris)
羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)
碳酸盐
此外，这些术语还表示不包括任何其它FDA批准的胃肠外使用的缓冲剂，特别是
醋酸盐
己二酸
硫酸铵
琥珀酸盐
天冬酰胺
天冬氨酸
谷氨酸盐(谷氨酸)
甘氨酸
乳酸盐
赖氨酸
马来酸盐(马来酸)
富马酸盐(富马酸)
苹果酸盐
葡甲胺
丙酸盐
丙氨酸
苯丙氨酸
半胱氨酸
异亮氨酸
亮氨酸
脯氨酸
丝氨酸
酒石酸盐
苏氨酸
色氨酸
酪氨酸
缬氨酸
在没有添加缓冲剂的情况下，通常假定最终溶液的pH不能容易地保持在期望的范围内(而且在调整过程中难以达到特定的目标pH)(在本发明中，pH应该在6.0至7.5之间，更优选在6.5至7.4之间，优选为6.8或约6.8)，但是会剧烈波动。
保持药品的准确pH非常重要。pH定义了稳定性、活性和保质期等参数。因此，药物制剂通常用缓冲剂配制。可以使用各种缓冲剂，并且它们被选择为在所需的pH下有效。在几乎所有现有促性腺激素制剂中经常使用的示例性缓冲剂是磷酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂需要在制剂期间，特别是在其储存期间，在制剂可能暴露的条件范围内为制剂提供稳定的pH。找到这样一种合适的缓冲液通常是非常有挑战性的，然后在某些情况下，有效的缓冲剂会给制剂带来不希望的副作用，如注射柠檬酸盐缓冲剂时的疼痛。所有缓冲剂都具有作为制剂中的附加成分的固有缺点，这使得制剂过程变得复杂，存在有害地影响其它成分、稳定性、保质期和最终用户的可接受性的风险。
然而，本发明的发明人出人意料地提供了不存在缓冲剂的制剂，而制剂没有任何不可接受的pH波动。该制剂包含精氨酸作为稳定化合物。精氨酸在其pKa附近具有+/-1个pH单位的预期缓冲容量，pKa在2.17、12.5和9.04。因此，在本发明的优选pH范围内(例如，在6.0和7.5之间，更优选在6.5和7.4之间，优选在6.8或约6.8)没有缓冲能力。然而，令人惊讶地发现，精氨酸对本发明所述的特定制剂中的pH具有很强的稳定影响。在现有技术的任何领域都没有描述精氨酸的这种作用。
有利地，不含本发明定义的缓冲剂的该制剂的提法还提供了注射时疼痛减少或没有疼痛以及注射时皮肤刺激减少或没有皮肤刺激的制剂。这与例如使用柠檬酸盐缓冲剂且已被证明会在注射时导致皮肤刺激和疼痛的制剂相反。
本发明的精氨酸可以是精氨酸，或者可以是精氨酸HCl，或者甚至更优选的是L-精氨酸(HCl)。精氨酸的量优选在50至160mM的范围内，更优选80至160mM，甚至更优选约为150mM。
从以下实施例中可以看出，精氨酸对FSH和hCG的氧化具有明显影响。然而，发明人确实显示出了特别高的稳定效果。非常令人惊讶的是，如果促性腺激素与高稳定量的精氨酸(例如150mM)组合，它们然后能够提供稳定且仅显示最小的氧化的液体促性腺激素制剂(在可接受的水平，参见下面的实施例部分)。
因为效果是在远离精氨酸pKa值的pH范围内，即在pH 6.0至7.5的范围内获得的，这是特别令人惊讶的。这是本发明的优选pH范围。在一个特别优选的实施方式中，pH在6.5至7.4的范围内。甚至更优选pH范围在6.5至7.2之间。最优选的pH为6.8+/-0.3。
令人惊讶地，低抗氧化剂量的甲硫氨酸，优选L-甲硫氨酸，能够防止不希望的氧化。这种低量可以低至0.05mg/ml，但可以高达2.5mg/ml。在一个优选的实施方式中，甲硫氨酸的量在0.1至1.5mg/ml之间。在一个更优选的实施方式中，甲硫氨酸的量在0.1至1mg/ml之间。在一个甚至更优选的实施方式中，甲硫氨酸的量在0.1至0.5mg/ml之间。最优选的实施方式是0.15mg/ml的甲硫氨酸。精氨酸的高氧化能力可以通过如此低量的甲硫氨酸来抵消和克服是根本无法预测的。
更预料不到的是，发现精氨酸比其它已知的稳定剂，如蔗糖，具有更显著的稳定作用，而蔗糖是一种非常频繁添加且非常确定的稳定剂。
制剂可包括合适的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂和/或介质。合适的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物，植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。
在本发明中，特别是对于多剂量制剂，进一步优选的是添加防腐剂。非常优选该防腐剂为苯酚。在另一个优选的实施方式中，苯酚的加入浓度为4.0至6.0mg/ml，优选5.0mg/ml苯酚。令人惊讶地，与其它众所周知的防腐剂相比，苯酚在特定的本发明制剂的上下文中也是有利的，因为尽管存在这种防腐剂，也不会导致着色并且非常稳定，即使在长时间内也是如此，如实施例部分所示。
在本发明中进一步优选的是添加表面活性剂。非常优选的表面活性剂是聚山梨醇酯，甚至更优选聚山梨醇酯20。在进一步优选的实施方式中，聚山梨酯20以0.001-0.05mg/ml的浓度加入，优选0.005mg/ml聚山梨醇酯20。有利的是，尽管存在这种防腐剂，本发明的制剂与聚山梨醇酯20混合不会导致浑浊，并且非常稳定，即使在长时间内也是如此，如实施例部分所示。
除了上面已经列出的添加剂之外，所述组合物还可以包含其它添加剂，例如但不限于(进一步)防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以包括抗菌剂和抗真菌剂以防止微生物生长，并且包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚类、山梨酸等。此外，可能期望包括张度剂。然而，本发明的制剂不包含另外的缓冲剂。
在某些情况下，为了延长作用，希望减缓皮下或肌肉注射中促性腺激素如FSH(和其它活性成分，如果存在的话)的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或非晶材料的液体悬浮液来实现。吸收速率然后取决于溶解速率，而溶解速率反过来又取决于晶体尺寸和晶体形式。或者，通过将FSH组合溶解或悬浮在油性介质中来实现肠胃外施用的FSH组合形式的延迟吸收。
根据本发明，发明人致力于研究某些化合物对液体促性腺激素制剂稳定性的影响；在此，研究了几种化合物的稳定和不稳定作用。此外，发明人试图改善所得制剂的透明度、着色程度和注射时的疼痛。
术语“稳定性”可以指化学稳定性，涉及氨基酸序列中的共价修饰，但是在蛋白质稳定性的上下文下，它也可以指物理稳定性，其涉及蛋白质折叠状态(即天然状态)的变化，不包括共价键断裂。在本发明中，术语“稳定性”是指促性腺激素制剂的生物稳定性，特别是FSH和hCG的生物稳定性。蛋白质制剂的物理不稳定性可能是由蛋白质分子聚集形成更高级的聚集体，由异二聚体解离成单体，或者由降低本发明中包括的例如FSH蛋白质(和其它活性成分，如果存在的话)的至少一种生物活性的任何其它构象变化引起的。
“稳定的”溶液或制剂是指其中蛋白质的聚集、解离、构象修饰、生物活性丧失等程度受到可接受的控制，并且不会随着时间不可接受地增加。可通过本领域公知的方法评估稳定性，包括测量样品的光散射、目测透明度和/或着色、吸光度或光密度、分子尺寸测定(例如通过尺寸排阻色谱或场流分级)、体外或体内生物活性和/或通过差示扫描量热法(DSC)。
本发明的制剂在储存条件下稳定12个月，优选在储存条件下稳定16个月，甚至更优选24个月，甚至更优选在储存条件下稳定24个月加上在“使用中”(即在室温下)1个月。“储存条件”下的稳定性是指制剂在冷却环境，例如在5℃±3℃下储存。在本发明的上下文中，“室温”是指30℃或30℃以下，优选15-25℃，优选18-25℃，最优选25±2℃。
为了确定在本制剂的上下文中的稳定性，使用了众所周知的FSH和hCG(免疫)测定法，这些测定法是本领域技术人员公知的并且在此仅概括地描述如下：
用于氧化的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)
通过RP-HPLC、C4柱梯度洗脱和210nm处的UV检测来测定蛋白质的氧化。
酶联荧光分析法(ELFA)
FSH和hCG的免疫活性在使用自动分析仪仪器(BioMérieux，法国)分别与FSH和hCG对应的试剂盒中进行的夹心免疫测定中测定。
尺寸排阻色谱法(SEC)
rFSH的纯度通过尺寸排阻色谱法(SEC)在蛋白质范围3-70kDa和210nm处进行UV检测的SEC柱上测定。
疏水相互作用色谱法(HIC)
用疏水相互作用色谱法(HIC)，通过在具有烷基酰胺基团的柱上梯度洗脱和在220nm处的UV检测，测定rhCG的纯度。
FSH和LH生物测定法
使用生物体内测定法测定FSH和LH效力，分别采用Steelman-Pohley(FSH)和精囊增重试验(LH)。
用于评估稳定性的其它方法在本领域中是公知的，并且也可以根据本发明使用。
FSH和LH活性测定是由世界卫生组织生物标准化专家委员会(WHO ECBS)使用2000年11月的尿FSH和尿LH的第四国际标准进行标准化的，并且是本领域技术人员公知的。
众所周知，几种防腐剂对促性腺激素制剂具有明显的破坏稳定作用，在此令人惊讶地发现，本发明所述制剂，特别是含有精氨酸和甲硫氨酸，但不含缓冲剂，特别稳定-甚至在长时间内甚至在苯酚存在下也是如此。
本发明要求保护的精氨酸和甲硫氨酸的组合对液体hMG制剂具有稳定作用，这种稳定作用比已知稳定剂如蔗糖的稳定作用以更加有利和令人惊讶的方式更显著。与已知的稳定剂如蔗糖相比，改善的稳定效果尤其令人惊讶。此外，非常出乎意料的是，尽管没有缓冲剂，本发明组合的稳定效果仍然显著。
从现有技术已知，在药物FSH制剂中发生FSH降解，这已通过专利WO2012/013742中提供的实施例证实。FSH会随着时间和温度的变化而降解。
似乎加热时发生的三级和二级FSH结构的构象展开是一种两态转变(当蛋白质聚集受到限制时)。这种展开可能独立于亚基解离(四元结构的变化)。
此外，在现有技术中清楚的是，含有防腐剂如苯甲醇或苯酚的FSH，其中这种防腐剂是必需的，例如作为液体FSH制剂中的抗微生物剂，明显对FSH多剂量制剂的稳定性有负面影响。这里，与不含防腐剂的FSH制剂相比，FSH的长期稳定性降低，FSH的变性温度降低，并且已经变性的形式具有更低水平的二级结构。
本发明还涉及一种稳定液体促性腺激素制剂的方法，其中所述方法包括向所述制剂中加入精氨酸和甲硫氨酸的步骤，所述制剂不包含缓冲剂。
附图说明
图1：滴定曲线。曲线的斜率显示了缓冲容量，例如陡峭的斜率显示了低缓冲容量。
图2：基于25℃的响应优化器结果。垂直线显示L-精氨酸和L-甲硫氨酸的水平以及FSH和hCG免疫测定中的响应为Y(以IU/ml计)。R2 HCG：92.15％和R2 FSH：67.31％。
所有研究均通过额外进行的实时数据确认。
具体实施方式
实施例
实施例1
1背景与介绍
几种不同的含有源自绝经后或怀孕妇女尿液的促性腺激素的药物产品被用于治疗不孕症，例如hMG(人类绝经促性腺激素)制剂。hMG以一比一的比例具有促卵泡激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)活性。
FSH、LH和人绒毛膜促性腺激素(hCG)属于复合型糖蛋白激素的促性腺激素家族。它们是由α-和β-亚基组成的异二聚体。对于这三种促性腺激素，92个氨基酸的α-亚基是共同的，β-亚基是独特的，使它们具有不同的生物学特性(Wolfenson C.et al.2005,Batch-to-batch consistency of human-derived gonadotropin preparations compared withrecombinant preparations.Reproductive BioMedicine.Vol 10No.4:442-454；Shen,S.T.,Cheng,Y.S.,Shen,T.Y.,and Yu,J.Y.2006,Molecular cloning of follicle-stimulating hormone(FSH)-beta subunit cDNA from duck pituitary.Gen.CompEndocrinol.148:388-394；Fox,K.M.,Dias,J.A.,and Van,R.P.2001,Three-dimensionalstructure of human follicle-stimulating hormone.Mol.Endocrinol.15:378-389；Burova,T.,Lecompte,F.,Galet,C.,Monsallier,F.,Delpech,S.,Haertle,T.,andCombarnous,Y.2001,Conformational stability and in vitro bioactivity ofporcine luteinizing hormone.Mol.Cell Endocrinol.176:129-134.糖蛋白激素在非共价连接的亚基解离后都失去了生物活性(Alevizaki,M.and Huhtaniemi,I.2002,Structure-function relationships of glycoprotein hormones；lessons frommutations and polymorphisms of the thyrotrophin and gonadotropin subunitgenes.Hormones.(Athens.)1:224-232)。
LH和hCG结合到相同的受体，因此都具有LH活性。在hMG中，LH活性主要来源于hCG。
本发明的目的是开发一种用于皮下注射的液体制剂形式的促性腺激素制剂。对于多剂量注射，通常需要添加防腐剂(Meyer,B.K.,Ni,A.,Hu,B.,and Shi,L.2007,Antimicrobial preservative use in parenteral products:past andpresent.J.Pharm.Sci.96:3155-3167；Chang,B.S.and Hershenson,S.PracticalApproaches to Protein Formulation Development.In Rational Design of StableProtein Formulations.J.F.Carpenter and M.C.Manning,editors.2002,Plenum Publ.,New York.1-25；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins.2000,CRC Press,Boca Raton)。
一般来说，蛋白质的天然(生物活性)结构对其周围环境非常敏感，例如制剂的组成、容器/封闭系统、pH和温度，确定合适的促性腺激素液体制剂是一个难点，筛选了不同的赋形剂。在本发明的工作中，使用FSH免疫测定法、hCG免疫测定法、生物测定法、RP-HPLC测定氧化蛋白质、滴定和pH，对各种hMG制剂的缓冲容量和实时稳定性进行了研究，如下文详细描述。
2待研究的产品
2.1材料
2.1.1药物(DS)
hMG-HP药物(DS)由阿根廷Instituto Massone S.A.制造，hMG-HP DS由丹麦哥本哈根的费林制药(Ferring Pharmaceuticals)A/S以粉末形式接收。
根据英国药典(BP)的当前版本测定药物中的FSH和LH生物活性。如果需要，还可以根据USP 35版本进行该测定。hMG中FSH:LH的生物活性为1:1，因此FSH和LH的平均测定生物活性用于配制药物产品。因此，当hMG的浓度给定为例如625IU/ml时，它等于625IU/ml FSH和625IU/ml LH的生物活性。
2.1.2赋形剂
表1列出了这项工作中使用的赋形剂。
表1赋形剂列表
2.1.3容器封闭系统
对于稳定性研究，主要包装材料是带有橡胶塞和铝/塑料盖的玻璃小瓶，或带有橡胶柱塞和压接盖的玻璃筒。
3制造过程
3.1混合
所有制剂均以实验室规模制造。
为了药物产品溶液(DP)的混合，将每种赋形剂和药物(DS)的储备溶液依次混合。在加入hMG和稀释至最终体积之前，必要时调节每种制剂的pH。所有赋形剂和hMG的储备溶液在Milli-Q水中制备。
3.2无菌过滤和无菌灌装
用微孔PVDF 0.22μm过滤器无菌过滤稳定性制剂。使用高压灭菌材料在LAF工作台中进行无菌过滤。
过滤后进行灌装。容器中充满样品溶液。所有小瓶和药筒在无菌条件下在LAF工作台中填充，并立即用橡胶塞或压接帽封闭。在LAF工作台外面，填充的小瓶用铝制翻盖密封。
4储存条件
4.1储存条件
含有药品制剂的容器在加速条件下在30±2℃/65±5％RH下储存长达3个月，和/或在25±2℃/60±5％RH下储存至少6个月。在每个储存温度下，容器以垂直位置存放。药筒水平存放。所有容器都避光。
5分析方法
研究中使用的分析方法描述如下。
5.1滴定过程
如前所述，根据USP-NF，如果溶液在添加预期会改变离子活性的物质时抵抗离子活性的变化，则称之为缓冲的。缓冲剂是赋予溶液这种抗性的物质或物质组合。缓冲溶液是其中离子与能够除去或释放离子的物质平衡的系统。缓冲容量是指可以添加到溶液中而不会导致离子活性发生显著变化的材料的量。其被定义为添加的酸或碱(以克-当量/升计)与pH单位变化的比率。通常通过调节缓冲物质的浓度，将缓冲溶液的容量调节至使用条件。缓冲容量通常表示为导致一升所述溶液发生单位pH变化的强酸或强碱的当量(Eq)数，给出了用于测定本发明中缓冲容量的单位mEq/(升×pH)。这意味着缓冲容量被定义为将一升缓冲溶液的pH值改变一个单位所需的H+/OH-的摩尔数(当量)。
使用调节至目标pH的空白对照剂(空白对照剂在此指的是不含活性成分的制剂)制剂作为起始点来测定缓冲容量。使用0.2N NaOH/HCl来滴定，使pH值上升或下降。每次加入0.2N NaOH/HCl后测量pH值，并记录0.2N NaOH/HCl的体积。将0.2N NaOH/HCl的量绘制为X值，并将pH绘制为Y值。对于hMG空白对照剂(目标pH)，在pH 6.8附近进行拟合线性回归，对于参考空白对照剂(目标pH)，在pH 6.5附近进行拟合线性回归。如上文定义中所述，缓冲容量可以计算为将pH移动0.01pH单位/L DP所用的μL 0.2N HCl/NaOH，也可以计算为毫当量(mEq)酸或碱/(升×pH单位)。
5.2 FSH和hCG免疫测定
通过夹心ELFA测定FSH和hCG免疫测定。
5.3氧化蛋白质
通过RP-HPLC测定蛋白质的氧化。
5.4 pH
根据Ph.Eur测量pH。
6.结果
稳定性研究的结果，缓冲容量研究中缓冲剂的评估以及实验设计(DoE)研究的稳定性结果如下所示。
表2液体hMG(600IU/ml)制剂的组合物
1 10mM十二水合磷酸氢二钠，用磷酸调节pH
2 10mM柠檬酸三钠二水合物，用柠檬酸调节pH
6.1液体hMG制剂的稳定性/3个月
可以通过向溶液中加入赋形剂例如盐、碳水化合物或氨基酸来稳定蛋白质分子，但是加入不同的碳水化合物、盐和氨基酸后的稳定程度在不同的制剂之间有很大差异。在此，进行了初始稳定性研究，以筛选hMG液体制剂中各种稳定剂与防腐剂和缓冲剂的组合。出人意料的是，结果显示L-精氨酸用于如表3和表6所示的hCG免疫测定和用于如表4和表7所示的FSH免疫测定具有优异的稳定效果。与所有其它制剂相比，制剂E-09显示出优异的稳定性。制剂E-09是唯一含有L-精氨酸的制剂(见表2)。与所有其它制剂相比，制剂K-01、K-03和K-04以及K-09显示出优异的稳定性(见表6)。这些制剂也含有L-精氨酸(见表5)。在表4中，对于FSH免疫测定，制剂E-09与所有其它制剂相比也具有最佳稳定性，表7证实了制剂K-09与所有其它制剂相比显示出最高的FSH免疫测定结果。
表3在30±2℃/65±5％RH下储存1个月期间的hCG免疫测定。与所有其它制剂相比，制剂E-09显示出优异的稳定性。制剂E-09含有L-精氨酸，参见表2。
(制剂E-04，E-14和E-15因着色而被排除在测试之外)
表4在30±2℃/65±5％RH下储存3个月后进行FSH免疫测定。与所有其它制剂相比，制剂E-09表现出最佳的稳定性。制剂E-09含有L-精氨酸，参见表2。
(制剂E-04，E-14和E-15因着色而被排除在测试之外)
6.2液体hMG制剂的稳定性-3个月
从最初的筛选中筛选出含有精氨酸的其它制剂。
表5液体hMG 600IU/ml的组成物稳定性研究—制剂概述
1与表2中的制剂E-09相同
2与表2中的制剂E-12相同
3与表2中的制剂E-10相同
4 10mM十二水合磷酸氢二钠，用磷酸调节pH
5 10mM柠檬酸三钠二水合物，用柠檬酸调节pH
6强度为530IU/ml
表6在25±2℃/60±5％RH下储存3个月期间的hCG免疫测定。与所有其它制剂相比，制剂K-01、K-03、K-04和K-09显示出优异的稳定性。制剂K-01、K-03、K-04和K-09含有L-精氨酸，参见表5。
非常清楚，包含L-精氨酸的制剂比包含不同稳定剂的制剂稳定得多。比较例如三个月后的制剂K-02和K-03。
表7在25±2℃/60±5％RH下储存3个月期间的FSH免疫测定。与所有其它制剂相比，制剂K-09显示出最高的FSH免疫测定结果。制剂K-09含有L-精氨酸，参见表5。
对于FSH，hCG的结果也得到证实——例如，比较三个月后的制剂K-02和K-03。
6.3缓冲容量研究
缓冲剂例如磷酸钠和柠檬酸钠是生理耐受的缓冲剂，通常加入它们以保持pH在所需范围内。通过缓冲容量对柠檬酸三钠二水合物和十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂进行评价。缓冲容量计算为将pH移动预定步骤所需的酸或碱的量，即如上所述，将pH移动1pH单位/L DP所需的μL 0.2N HCl/NaOH的量，计算为mEq酸或碱/(升×pH单位)。
表8组合物缓冲容量研究—制剂概述
1柠檬酸三钠二水合物
2 0.8mM Na2HPO4×12H2O和约0.2mM H3PO4调至pH 6.5
3参考空白对照剂
4等于25.3mg/ml L-精氨酸HCl
进行滴定以确定缓冲容量的结果如图1所示。曲线的斜率表示缓冲容量，例如陡峭的斜率代表低缓冲容量。从图1可以看出，批次C-04(参考制剂)具有最低的缓冲容量。在hMG的相关pH区域6.8±0.3，所有hMG制剂C-01(无缓冲液)，C-02(5mM柠檬酸三钠二水合物)和C-03(10mM柠檬酸三钠二水合物)具有相似的缓冲容量，且有比含有1mM十二水合磷酸氢二钠的参考制剂更高的缓冲容量。参考制剂的目标pH为6.5。将制剂C-01、C-02和-03与已知具有稳定pH的参考制剂进行比较。已经进行了许多参考制剂C-04的稳定性研究，没有观察到任何pH的漂移。
下表9示出了缓冲容量研究的结果：
表9缓冲容量研究。在与hMG制剂相关的pH 6.8区域，所有hMG制剂都具有比参考空白对照剂制剂更高的缓冲容量。
(C-01和C-04被提及两次，因为缓冲容量分别在两个不同pH值附近的pH范围内计算)
令人惊讶的是，不含缓冲剂(C-01)的hMG制剂的缓冲容量高于参考制剂C-04。hMG制剂中的主要赋形剂成分是浓度为120mM的L-精氨酸。L-精氨酸的pKa值为pKa1＝2.17；pKa2＝9.04和pKa3＝12.5(药用赋形剂手册.2015年,药学出版社,伦敦)。预料不到的是，精氨酸在远离pKa值时表现出足够的缓冲能力。
6.4氧化研究
在30±2℃/65±5％RH下储存3个月后，含有L-精氨酸的制剂E-09(见表5)将氧化蛋白质的水平相对初始值提高了241％(见下表10)。这是一个非常高的量，并且在某些情况下，这样高的氧化量是不希望的。
因此，进一步研究以研究是否可以克服这个问题。
有几种可供选择的抗氧化剂可用于蛋白质制剂。可以加入甲硫氨酸，通过与蛋白质中甲硫氨酸残基的氧化竞争的机制，来防止氧化。向含有精氨酸的制剂中加入甲硫氨酸的结果如表10所示。制剂K-01，K-03，K-04和K-09含有精氨酸和甲硫氨酸，氧化蛋白质的水平明显且有利地降低了。制剂K-01(含甲硫氨酸)与制剂E-09(不含甲硫氨酸)相同。比较这两个批次，可以看出甲硫氨酸极大地降低了氧化蛋白质的水平。
表10在30±2℃/65±5％RH下储存3个月期间，氧化蛋白质相较初始增加的％。制剂E-09含精氨酸而不含甲硫氨酸。制剂K-01，K-03，K-04和K-09含精氨酸和甲硫氨酸，参见表5。
(制剂E-04，E-14和E-15因着色而被排除在外)
总之，这两项研究表明，精氨酸具有极大的稳定作用，在促性腺激素的制剂中，即使是少量的甲硫氨酸也具有抗氧化的作用。
6.5 DoE稳定性研究
结合上述研究的结果和缓冲容量研究，进行DoE研究，以研究精氨酸和甲硫氨酸之间的相互作用，并确定这两种赋形剂的最佳浓度。
表11用于液体hMG 600IU/ml的DoE稳定性研究的组合物—制剂概述
1柠檬酸三钠二水合物
2对于没有缓冲剂的制剂，用0.2N HCl/NaOH调节pH；
3对于含有柠檬酸三钠二水合物缓冲剂的制剂，用0.2N NaOH/0.5M柠檬酸一水合物调节pH包括作为参考制剂
6.5.1 FSH免疫测定
表12中列出了在25±2℃/60±5％RH下储存3个月期间FSH免疫测定的稳定性结果。
表12在25±2℃/60±5％RH下储存期间FSH免疫测定的结果。表11列出了所有制剂的完整描述。
对FSH活性[IU/ml]进行统计学计算，以评估精氨酸和-甲硫氨酸的影响和相互作用。统计学评估的结果证实L-精氨酸对FSH免疫测定稳定性结果有统计学上的显著影响。甲硫氨酸对FSH免疫测定稳定性结果没有显著的统计学影响。对于该响应参数，精氨酸和甲硫氨酸之间没有统计学上的显著相互作用。
6.5.2 hCG免疫测定
表13中列出了在25±2℃/60±5％RH下储存3个月期间hCG免疫测定的稳定性结果。
表13在25±2℃/60±5％RH下储存期间hCG免疫测定的结果。表11列出了所有制剂的完整描述。
对hCG活性[IU/ml]进行统计学计算，以评估精氨酸和甲硫氨酸的影响和相互作用。统计学评估的结果证实精氨酸对hCG免疫测定稳定性结果有统计学上的显著影响。在25℃下甲硫氨酸含量对hCG免疫测定稳定性结果影响较小。很明显，在低(0.1mg/ml)的甲硫氨酸浓度下，通过增加浓度，即使高达1.5mg/ml也不会进一步提高稳定性。对于该响应参数，精氨酸和甲硫氨酸之间没有统计学上的显著相互作用。
6.5.3氧化蛋白质
在上述稳定性研究中，令人惊讶地观察到，精氨酸的存在具有极大的稳定作用。然而，添加精氨酸导致氧化蛋白质的水平增加。可加入甲硫氨酸以防止这种氧化，并且本研究考察了精氨酸作为稳定剂和甲硫氨酸作为抗氧化剂之间的浓度平衡。
下面列出了含有精氨酸和甲硫氨酸(浓度范围0.1-1.5mg/ml)的制剂，在25±2℃/60±5％RH下储存6个月期间和在30±2℃/65±5％RH下储存3个月期间，氧化蛋白量[相对于初始增加的％]的稳定性结果。为了比较，表14中还包括含有精氨酸而不含甲硫氨酸的制剂E-09。
表14在25±2℃/60±5％RH和30±2℃/65±5％RH下储存期间氧化蛋白质的结果。
表11列出了所有制剂的完整描述。
从表14中可以出人意料地看出，即使少量的甲硫氨酸也足以防止精氨酸在整个浓度范围内的氧化。
6.5.4 DoE概述
为了得出并总结DoE的结果，应用了Minitab中的响应优化器，参见图2。Minitab响应优化器显示不同的实验因子设置例如精氨酸和甲硫氨酸浓度如何影响预测响应例如因子设计的FSH免疫测定[IU/ml]和hCG免疫测定[IU/ml]。优化图显示了每个因子(列)对响应(行)的影响。图表上的垂直粗线表示当前的因子设置。列顶部显示的数字显示了当前因子水平设置(方括号中)。水平虚线和相应的数字表示当前因子水平的响应。响应优化器将基于25℃的结果。应用响应优化器的结果如图2所示。在高浓度精氨酸和低浓度甲硫氨酸下获得最佳稳定性(综合期望值)。
6.6 pH研究
在缓冲容量研究中，显示在hMG制剂中不需要缓冲剂，仅使用精氨酸将pH稳定在所需的pH范围内。
为了证实pH在储存期间保持不变，测定了在25±2℃/60±5％RH下储存6个月和在30±2℃/65±5％RH下储存3个月的pH。结果列于表15中。
所有制剂的目标pH为pH 6.8，并且在初始时间点所有制剂的pH为6.8。pH相当稳定，但在储存2个月后略有增加至约6.9，并保持pH在约6.9至储存6个月。结果长达6个月的储存证实了在精氨酸的测试浓度范围内pH的稳定性。
表15 PH研究结果
7结论
非常令人惊讶的是，不含缓冲剂的hMG制剂的缓冲能力高于含1mM十二水合磷酸氢二钠的参考制剂。hMG制剂中的主要赋形剂组分是精氨酸。精氨酸的pKa值为pKa1＝2.17；pKa2＝9.04，pKa3＝12.5。预料不到的是，精氨酸表现出在远离其pKa值时具有足够的缓冲行为。然而，结果清楚地表明，在当前pH范围内，hMG制剂中不需要另外的缓冲剂。仅精氨酸就足以将pH保持在所需的pH范围内。DoE研究证实了pH的稳定性，该研究测试了在25±2℃/60±5％RH下储存6个月和在30±2℃/65±5％RH下储存3个月的精氨酸的浓度范围，这证实了缓冲容量研究中的观察结果。
向本发明的液体hMG制剂中加入精氨酸显示出对液体hMG制剂具有极大的稳定作用。然而，还发现精氨酸导致高水平的氧化蛋白质。与不含甲硫氨酸的制剂相比，表明添加甲硫氨酸可防止氧化。
在25±2℃/60±5％RH下储存6个月和在30±2℃/65±5％RH下储存3个月，显示即使是小浓度的甲硫氨酸也能防止氧化。
总结这些研究的结果可以清楚地看出，加入精氨酸足以将pH维持在期望的pH水平。精氨酸的加入极大地稳定了液体制剂中被测促性腺激素制剂。没有其它被测试的氨基酸、糖或盐显示出类似的稳定效果。通过添加精氨酸，氧化蛋白质的水平显著增加，然而添加甚至少量的甲硫氨酸会防止蛋白质氧化。令人惊讶的是，即使少量的甲硫氨酸也足以防止氧化，而与精氨酸的浓度无关。
实施例2
本发明人进一步证实，本发明有利的创造性制剂也适用于稳定相应的重组促性腺激素制剂。
为此，根据公知的方法制备重组FSH和重组hCG(分别具有上述序列)。
如下所述，对两种制剂进行了加速稳定性研究，分别包括rhCG或rFSH。
在重组蛋白质中也证实了观察到的精氨酸的惊人的稳定作用。rFSH和rhCG都是在5mg/ml苯酚、0.15mg/ml L-甲硫氨酸、150mM精氨酸HCl、0.005mg/ml聚山梨醇酯20、pH 6.8下配制的。为了简化蛋白质稳定性的分析，将rFSH和rhCG配制在不同的容器中。
表16
这充分证实了本发明的含有精氨酸，但没有另外的缓冲剂，并且含有少量甲硫氨酸的制剂也适用于稳定的重组促性腺激素。
实施例3
进行了进一步的研究，其中评估了以下组合物：
表17液体hMG 625IU/ml制剂的组合物
1采用0.2N HCl/NaOH调节PH
目标制剂的稳定性
结合所有先前的结果，证实了上述制剂的良好稳定性，如下所示：
表18 FSH免疫测定
FSH免疫测定在25±2℃/60±5％相对湿度(RH)下储存3个月和5±3℃下储存12个月的稳定性结果：
在25±2℃/60±5％RH下储存期间和5±3℃下储存12个月期间FSH免疫测定结果
结果证实了FSH免疫测定法测定的稳定性。
表19 hCG免疫测定
在25±2℃/60±5％RH下储存1个月期间和在5±3℃下储存12个月的hCG免疫测定的稳定性结果列于表19中。
在25±2℃/60±5％RH下储存期间和5±3℃下储存12个月期间hCG免疫测定结果
结果证实了hCG免疫测定法测定的稳定性。
表20氧化蛋白质
在25±2℃/60±5％RH下储存3个月和在5±3℃下储存12个月期间氧化蛋白质的量[相对初始增加的％]的稳定性结果。
在25±2℃/60±5％RH下储存期间和5±3℃下储存12个月期间氧化蛋白质的结果
pH
在25±2℃/60±5％RH下储存3个月和在5±3℃下储存12个月期间的pH稳定性结果显示出稳定的pH。
表21在25±2℃/60±5％RH储存期间和在5±3℃下储存12个月期间的pH结果
实施例4
除上述之外，本发明人还进行了生物测定研究(对于DoE批次，在25℃下储存6个月)。
FSH生物测定(Steelman-Pohley)
表22列出了在25±2℃/60±5％RH下储存6个月期间FSH生物测定的稳定性结果。
表22在25±2℃/60±5％RH下储存期间FSH生物测定的结果。表11中给出了所有制剂的完整描述。
结果证实了FSH生物测定法测定的稳定性。
LH生物测定(精液增重)
在25±2℃/60±5％RH下储存6个月期间LH生物测定的稳定性结果列于表23中。
表23在25±2℃/60±5％RH下储存期间LH生物测定的结果。表11中给出了所有制剂的完整描述。
结果证实了LH生物测定法测定的稳定性。
此外，还在FSH和LH生物测定中测试了实施例3的组合物，结果如下：
表24列出了在25±2℃/60±5％RH下储存3个月和5±3℃下储存12个月期间FSH生物测定的稳定性结果：
表24在25±2℃/60±5％RH下储存期间和在5±3℃下储存12个月期间的FSH生物测定的结果。
结果证实了通过FSH生物测定法测定的稳定性。
在25±2℃/60±5％RH下储存3个月期间和5±3℃下储存12个月期间LH生物测定的稳定性结果列于表25中。
表25在25±2℃/60±5％RH下储存期间和在5±3℃下储存12个月期间的LH生物测定的结果。
结果证实了LH生物测定法测定的稳定性。
8缩写和定义
BP 英国药典
DoE 实验设计
DS 药物
FSH 促卵泡激素
hCG 人绒毛膜促性腺激素
hMG 人绝经期促性腺激素
hMG-HP 人绝经期促性腺激素-高度纯化
JP 日本药典
LH 促黄体生成激素
MD 多剂量
NF 美国国家药品集
Ph Eur 欧洲药典
PS 20 聚山梨醇酯20
USP 美国药典
WFI 注射用水
序列表
<110> 辉凌公司
<120> 稳定的液体促性腺激素制剂
<130> HE183650
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 前导肽(人类)
<400> 1
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro
20 25 30
Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro
50 55 60
Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu
65 70 75 80
Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly
85 90 95
Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr
100 105 110
Tyr His Lys Ser
115
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> 前导肽(人类)
<400> 2
Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile
1 5 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys
20 25 30
Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly
35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys
50 55 60
Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg
65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val
85 90 95
Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys
100 105 110
Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys
115 120 125
Glu
<210> 3
<211> 165
<212> PRT
<213> 前导肽(人类)
<400> 3
Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly
1 5 10 15
Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile
20 25 30
Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr
35 40 45
Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val
50 55 60
Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val
85 90 95
Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu
100 105 110
Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu
115 120 125
Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
130 135 140
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
145 150 155 160
Pro Ile Leu Pro Gln
165
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> 前导肽(人类)
<400> 4
Met Glu Met Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly
1 5 10 15
Gly Ala Trp Ala Ser Arg Glu Pro Leu Arg Pro Trp Cys His Pro Ile
20 25 30
Asn Ala Ile Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr
35 40 45
Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Met Arg Val
50 55 60
Leu Gln Ala Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln Val Val Cys Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val
85 90 95
Asp Pro Val Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Arg Cys Gly Pro
100 105 110
Cys Arg Arg Ser Thr Ser Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu
115 120 125
Thr Cys Asp His Pro Gln Leu Ser Gly Leu Leu Phe Leu
130 135 140

Claims (15)

1.一种液体促性腺激素药物制剂，其包含促性腺激素，含量为50至160mM的精氨酸，和含量为0.05至1.5mg/ml的甲硫氨酸，其中所述制剂不包含另外的缓冲剂，并且其中所述制剂的pH在6.0和7.5之间。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于，所述促性腺激素包含hCG(人绒毛膜促性腺激素)，和任选的FSH和/或LH。
3.根据权利要求1或2所述的药物制剂，其特征在于，所述促性腺激素包含hMG(人绝经期促性腺激素)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述促性腺激素包含人源、尿源的FSH，LH和/或hCG。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述促性腺激素包含重组FSH，LH和/或hCG。
6.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其另外包含防腐剂，优选苯酚。
7.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其另外包含表面活性剂，优选聚山梨醇酯，甚至更优选聚山梨醇酯20。
8.根据权利要求6或7所述的药物制剂，其特征在于，所述防腐剂，优选苯酚，含量为4-6mg/ml，优选为5mg/ml。
9.根据权利要求7或8所述的药物制剂，其特征在于，所述表面活性剂，优选聚山梨醇酯20，含量为0.001-0.05mg/ml，优选为0.005mg/ml。
10.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述精氨酸优选为L-精氨酸HCl。
11.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其特征在于，hMG的含量为300-900IU/ml，优选500-700IU/ml。
12.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其由以下组分组成：
-625IU/ml hMG
-0.15mg/ml甲硫氨酸
-150mM精氨酸
-5mg/ml苯酚
-0.005mg/ml聚山梨醇酯20
-注射用水(WFI)，和
-其中所述制剂的pH为6.8+/-0.3。
13.一种根据前述权利要求中任一项所述的液体药物制剂，其用在治疗不孕症的方法中。
14.根据权利要求13的用途的药物制剂，其特征在于，所述治疗是对排卵诱导(OI)、辅助生殖技术(ART)和/或男性性腺机能减退的治疗。
15.一种用于稳定包含hMG的液体药物制剂的方法，其包括以下步骤：
-提供一种人类女性尿液样品，
-从所述样品中提取hMG，
-将提取物与精氨酸和甲硫氨酸按照前述任一项中定义的量混合，
-任选地按照前述任一项中定义的量进一步加入苯酚和聚山梨醇酯，
-调节制剂的pH在6.0和7.5之间，
-其中不添加另外的缓冲剂。
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