ES2966262T3

ES2966262T3 - Formulación líquida estable de gonadotropina

Info

Publication number: ES2966262T3
Application number: ES20202758T
Authority: ES
Inventors: Helen Ulrika Sjögren; Charlotte Højer-Pedersen
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2037-02-24
Also published as: EP3791860A1; MY193138A; JP6932710B2; JOP20170046B1; CN108883061B; LT3419595T; AU2017222292B2; EP3791860B1; CO2018007810A2; US10792334B2; JP2021191760A; JP2023164573A; ZA201804944B; MD3419595T2; HUE064432T2; IL260626B1; IL260626A; GB201603280D0; EP3419595A1; SI3791860T1

Abstract

La presente invención pertenece en general al campo de la estabilización de formulaciones de gonadotropinas, en particular formulaciones líquidas de gonadotropinas. La estabilización se logra mediante una combinación particular de excipientes, preferiblemente arginina y metionina. En una realización preferida, la formulación no comprende un tampón. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación líquida estable de gonadotropina

Campo de la invención

La presente invención pertenece, en general, al campo de la estabilización de formulaciones de gonadotropina, en particular, formulaciones líquidas de gonadotropinas. La estabilización se consigue mediante una combinación particular de excipientes, concretamente arginina y sin tampón adicional.

Antecedentes

Las gonadotropinas son una familia de hormonas, que están implicadas esencial y principalmente en el ciclo de fertilidad de mujeres y hombres. Las gonadotropinas pueden obtenerse de la orina, tanto con fines de investigación como de tratamiento, sin embargo, varias gonadotropinas como, por ejemplo, hCG, LH y FSH, también pueden producirse de forma recombinante.

En particular, las gonadotropinas pueden emplearse en el tratamiento de la infertilidad.

Las cuatro gonadotropinas principales pertenecen todas a la misma familia de glucoproteínas. Estas son la hormona foliculoestimulante (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH) y coriogonadotropina (humana) (hCG). Todas estas gonadotropinas son heterodiméricas y consisten en una subunidad alfa y una beta; la subunidad alfa es común a todas, es decir, la misma para las cuatro gonadotropinas mencionadas anteriormente, mientras que la subunidad beta difiere, respectivamente. La acción de la FSH está mediada por un receptor de FSH distinto. Las cadenas beta de LH y hCG comparten un 82 % de homología de secuencia proteínica y ejercen sus acciones a través del mismo receptor de LH.

La FSH se secreta de forma natural por la glándula pituitaria anterior y funciona sustentando el desarrollo folicular y la ovulación. La FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común a las otras hormonas glucoproteínicas, por ejemplo, LH y HCG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos única para FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50: 465-495). La subunidad beta madura de la hCG está compuesta de 145 aminoácidos. Cada subunidad en FSH y hCG se modifica de forma postraduccional mediante la adición de residuos glucídicos complejos. Para la FSH, ambas subunidades portan dos sitios de adhesión de glucano ligado a N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los residuos aminoacídicos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, (1975) Primary amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17):6735-6746; Saxena y Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, J Biol Chem. 251 (4): 993-1005)). La FSH, por tanto, está glucosilada en aproximadamente un 30 % en masa (Dias y Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res.

32(6): 510-519; Foxet al.(2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol.

15 (3 ), 379-89). La subunidad beta de la hCG contiene tanto N- como O-glucosilación (N-13, N-30, O-121, O-127, O-132 y O-138). La glucosilación adicional en la subunidad beta de hCG hace que sea más hidrófila que la de la FSH. Las subunidades p proporcionan especificidad para la interacción con el receptor.

Las gonadotropinas obtenidas de orina se han usado clínicamente durante más de 40 años y su seguridad está bien establecida. Se han introducido nuevas generaciones de gonadotropina obtenida de orina altamente purificada (HP) en comparación con la primera generación a lo largo del tiempo. La pureza aumentada se obtiene añadiendo etapas de purificación adicionales, tales como etapas de cromatografía de intercambio aniónico e interacción hidrófoba para retirar las proteínas de la orina sin bioactividad de FSH y/o LH. La pureza significativamente aumentada de las preparaciones de gonadotropina de nueva generación facilita estudios de caracterización más exhaustivos que proporcionan información adicional sobre la composición.

La FSH urinaria purificada y las menotropinas menopáusicas humanas (hMG), ambas aisladas de la orina de mujeres posmenopáusicas, se han usado durante muchos años en el tratamiento de la infertilidad para inducir la (mono) ovulación o para estimular múltiples folículos en pacientes sometidas a estimulación ovárica controlada (COS) antes de tecnologías de reproducción asistida (ART). Dos versiones recombinantes de FSH, Gonal-F® (folitropina alfa, Merck Serono) y Puregon®/Follistim® (folitropina beta, Merck) llegaron a estar disponibles a mitad de la década de 1990. Ambos productos se expresan en líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) (Howles, C.M. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2: 172-191).

Las células CHO se usan habitualmente para la producción de proteínas recombinantes farmacéuticas. El análisis estructural ha identificado que el ácido siálico se fija exclusivamente mediante un enlace a2,3. Muchas glucoproteínas humanas contienen una mezcla tanto de enlaces a2,3 como a2,6 para residuos de ácido siálico. Por lo tanto, proteínas recombinantes expresadas usando el sistema de CHO diferirán de sus equivalentes naturales en su tipo de enlaces terminales de ácido siálico.

Infertilidad

En el presente contexto, "infertilidad" se definirá como la capacidad disminuida o la incapacidad de concebir y tener descendencia. Las mujeres que pueden quedar embarazadas, pero después tienen abortos repetidos también se dice que son infértiles. La infertilidad también se define en términos específicos como el fracaso en concebir después de un año de relaciones sexuales regulares sin anticoncepción. La infertilidad puede deberse a muchas causas. Los estudios han demostrado que un poco más de la mitad de los casos de infertilidad son el resultado de afecciones femeninas. Los casos restantes están causados por trastornos del esperma y por factores inexplicables. Actualmente hay varias posibilidades para tratar la infertilidad.

Esas posibilidades son una relación sexual programada, el uso de tecnologías de reproducción asistida (ART), un tratamiento médico de endometriosis, inducción de la ovulación (OI), fibroides y disfunción sexual femenina (FSD), y cirugía para corregir las anomalías.

En la tecnología de reproducción asistida y OI, se usan fármacos para estimular la ovulación. Junto a la FSH, que es principalmente responsable de la estimulación ovárica, las preparaciones de gonadotropina pueden contener Lh y/o hCG.

Actualmente se usan varias especialidades farmacéuticas diferentes que contienen hormonas gonadotropina obtenidas de orina de mujeres embarazadas o posmenopáusicas en la práctica clínica para el tratamiento de la infertilidad, tal como preparaciones de HMG (gonadotropina menopáusica humana) que contienen una relación 1:1 de bioactividad de FSH y LH (véase, por ejemplo, USP versión 35, monográfico para menotropinas), así como preparaciones que contienen solamente bioactividad de FSH. Desde 1995 en adelante, han llegado a estar disponibles productos de gonadotropina, fabricados por tecnología de ADN recombinante.

Por lo tanto, es importante proporcionar formulaciones estabilizadas de dichos compuestos de gonadotropina, en solitario o en una mezcla.

Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar formulaciones, en particular formulaciones líquidas, de una o más gonadotropinas, particularmente de una composición que comprende hCG, opcionalmente en una combinación con FSH, que sean estables. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para la estabilización de dichas formulaciones. Otro objeto es proporcionar dicha formulación que es estable durante 12 meses, preferiblemente durante 24 meses, incluso más preferiblemente durante 24 meses en condiciones de almacenamiento más 1 mes "en uso", es decir, a temperatura ambiente.

Sumario de la invención

La presente invención pertenece a las formulaciones líquidas estables de gonadotropina como se define adicionalmente en las reivindicaciones. En una realización preferida, estas formulaciones comprenden hCG. En una realización también preferida, esta formulación comprende tanto FSH como hCG. Las gonadotropinas en las formulaciones de la invención son preferiblemente obtenidas de orina u obtenidas de plasma, pero en una realización alternativa pueden producirse de forma recombinante.

A continuación, el término "hMG" se usará indistintamente con "gonadotropinas de la orina". Principalmente, las gonadotropinas de la orina serán de orina humana.

La coriogonadotropina humana (hCG) contribuye a la actividad de LH (hormona luteinizante), que es responsable de las indicaciones farmacéuticas actualmente aprobadas. Este es un hecho bien conocido, y se describe como parte de los SmPC de preparaciones de hMG como el producto Menopur®, aprobado para las mismas indicaciones reivindicadas actualmente. Menopur®, en estos SmPC, comprende actividad de FSH y LH, pero adicionalmente confirma que la hCG es responsable de al menos parte de la actividad de LH. Por tanto, cualquier referencia a hCG en el contexto de la presente invención abarca formulaciones que comprenden una actividad de LH que se puede atribuir a hCG.

Realizaciones preferidas incluyen las siguientes: y

1. Una formulación farmacéutica líquida de gonadotropina, que comprende una gonadotropina y arginina en una cantidad de 50 a 160 mM, en la que la formulación no comprende un tampón adicional, y en la que el pH de la formulación es entre 6,0 y 7,5.

2. La formulación farmacéutica del punto 1, en la que la gonadotropina comprende hCG (coriogonadotropina humana) y opcionalmente FSH y/o LH.

3. La formulación farmacéutica del punto 1 o 2, en la que la gonadotropina comprende hMG (gonadotropina menopáusica humana).

4. La formulación farmacéutica de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en la que la gonadotropina (tal como FSH, LH y/o hCG) es de origen humano y se obtiene de la orina.

5. La formulación farmacéutica de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en la que la gonadotropina (tal como FSH, LH y/o hCG) es recombinante.

6. La formulación farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, que comprende adicionalmente un conservante, preferiblemente fenol.

7. La formulación farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, que comprende adicionalmente un agente tensioactivo, preferiblemente un polisorbato, incluso más preferiblemente polisorbato 20.

8. La formulación farmacéutica del punto 6 o 7, en la que el conservante, preferiblemente el fenol, está presente en una cantidad de 4 - 6 mg/ml, preferiblemente en una cantidad de 5 mg/ml.

9. La formulación farmacéutica del punto 7 u 8, en la que el agente tensioactivo, preferiblemente el polisorbato 20, está presente en una cantidad de 0,001 - 0,05 mg/ml, preferiblemente en una cantidad de 0,005 mg/ml. 10. La formulación farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que la arginina es preferiblemente HCl de L-arginina.

11. La formulación farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que la hMG está presente en una cantidad de 300 - 900, más preferido 500 - 700, incluso más preferido 600 - 650, muy preferiblemente 625 UI/ml.

12. Una formulación farmacéutica líquida como se describe en uno cualquiera de los puntos precedentes, para su uso en un método de tratamiento de la infertilidad.

13. La formulación farmacéutica para el uso del punto 12, en la que el tratamiento es un tratamiento de inducción de la ovulación (OI), técnicas de reproducción asistida (ART) y/o hipogonadismo hipogonadotrópico en hombres.

14. Un método para la estabilización de una formulación farmacéutica líquida, que comprende hMG, que comprende las etapas de

- proporcionar una muestra de orina de una mujer humana

- extraer hMG

- preparar dicho extracto con arginina y metionina, en cantidades como se definen en cualquiera de los puntos precedentes,

- opcionalmente añadir además fenol y polisorbato en cantidades como se definen en cualquiera de los puntos precedentes,

- ajustar el pH para proporcionar una formulación con un pH entre 6,0 y 7,5,

- en el que no se añade tampón adicional.

Como se describe anteriormente, las gonadotropinas, por ejemplo, FSH y hCG, así como LH son adecuadas para el tratamiento de la infertilidad. A ese respecto, ha quedado claro que las formulaciones líquidas de estas gonadotropinas pueden ser inestables; esto es cierto incluso para esas gonadotropinas que están destinadas a un solo uso. La inestabilidad puede ser incluso más pronunciada si las formulaciones líquidas comprenden un conservante, que se prescribe, por ejemplo, para todas las formulaciones multidosis.

Las presentes formulaciones pueden estar destinadas a un solo uso o a múltiples usos, respectivamente.

La FSH formulada en las presentes formulaciones puede ser FSH obtenida de la orina o de plasma o recombinante (rFSH). En una realización preferida, la FSH es de la orina o rFSH; es particularmente preferida la FSH de la orina.

Como se menciona anteriormente, ahora es posible producir gonadotropinas, como FSH, LH o hCG de forma recombinante. Por tanto, una referencia aquí a una gonadotropina en general siembre incluye tanto la gonadotropina obtenida de la orina o plasma, como la recombinante (r), salvo que se especifique otra cosa. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "FSH" también abarca rFSH. La producción y las secuencias de aminoácidos, así como las secuencias de ácido nucleico de FSH, hCG y LH son todas bien conocidas por los expertos en la materia.

Las secuencias que pueden usarse en el contexto de la presente invención son de la siguiente manera:

Subunidad alfa de FSH, LH y hCG (SEQ ID NO:1)

(véase también Fiddes, J.C. y Goodman, H.M. The gene encoding the common alpha subunit of the four human glycoprotein hormones J. Mol. Appl. Genet. 1 (1), 3-18 (1981))

i. ll) y' V R < VA A ; V r i ^ l ■IVl HSA<pdvqdc pfctlqen p f fsqpg a pi lqcm gcc fsí a yptp lrs kktm lvqkn>vTSESTCCVAKSYN RVTVMGGFKVEh HTACHCSTCYYn KS ( la parle subrayada es el pé piído lele') (116)

Subunidad beta de FSH (SEQ ID NO:2)

(véase también Saxena, B.B. y Rathnam, P. Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands J. Biol. Chem. 251 (4), 993-1005 (1976))

M KTLQf FFLFCCWKAICCNSCtLTNITI AlEKEECRFClSINT íWCAü YCVTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYfc 1VR

VPGCAH HADS LYTYPVATQC HCGKC DSD 5TDCTV RG LG PSYCS FG E M KE (la pane subrayada eselpépüdo

líder) (129}

Subunidad beta de hCG (SEQ ID NO:3)

(véase también Fiddes, JC, Goodman HM. The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region Nature. 14 de agosto 1980; 286(5774):684-7)

MEMFQGLLLLLLLSMGGTWASKEPLRFRCK PINATLAVEK EGCPVCITVN i TICAGYCPT MTRVLQGVLP

ALPQWCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPW SYAVAL5CQC ALCRR5TTDC GGPKDHPLTC DDPRf QDSSS

5KAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ ( la parte subrayada es el péptido líder} (165)

Subunidad beta de LH (SEQ ID NO:4)

(véase también Sairam, M.R. y Li, C.H. Human pituitary lutropin. Isolation, properties, and the complete amino acid sequence of the beta-subunit Biochim. Biophys. Acta 412 (1), 70-81 (1975))

M E MLOG LLL LLLLSMGG A W A3R E P LR P WCH PINA1UWEKEGCPVCITVN

TTICAGYC PT M M RV LQAVL PP L PQWCTYRDVRF E SI RLPG C PRG VDP W 5 F PVA LSC RC G PCRR5T5 DC

GGPKOHPLTC DHPQLSGLLFL ( la parte subrayada es el péptido líder) (141)

En una realización alternativa, la rFSH o la rHCG de todas las realizaciones es una rFSH o rhCG de acción prolongada, respectivamente. Dichas formulaciones de FSH de acción prolongada, por ejemplo, pueden obtenerse como conocen en general los expertos en la materia, por ejemplo, modificando la molécula de FSH o modificando la formulación.

"FSH", como se usa en este documento, por tanto, abarca todas las posibles formas obtenidas de la orina o recombinantes de la FSH mencionada anteriormente, así como todas las posibles combinaciones de formas de FSH. También se abarca una formulación para un solo uso y una o más formulaciones adicionales (de la misma gonadotropina o una diferente) para uso multidosis.

Un posible producto puede ser una formulación que incluye FSH (en una realización preferida que incluye también hCG y/u opcionalmente LH, actividad de LH, etc.), todo en recipientes diferentes. La actividad de LH, si está presente, puede originarse de LH o hCG. La LH puede remplazarse por una dosis equivalente de hCG y viceversa; una "dosis equivalente" en ese contexto puede calcularse como es bien conocido en la técnica.

Una combinación de gonadotropina particularmente preferida es la de FSH y hCG, preferiblemente como una formulación de hMG en un recipiente, pero opcionalmente también, por ejemplo, en diferentes recipientes, como, por ejemplo, viales o cartuchos.

Posibles combinaciones, que pueden proporcionarse también en diferentes recipientes, también incluyen: (u)FSH de la orina y uhCG o uFSH y uLH; además (rhCG o rLH o rFSH) y (uhCG o uLH o rhCG o rLH), y todas las posibles permutaciones de las mismas. En una realización muy preferida, la formulación de la invención comprende FSH y hCG. En otra realización igual de preferida, la formulación de la invención comprende hCG.

Las formulaciones de gonadotropina de la presente invención son formulaciones líquidas. Preferiblemente, la formulación es inyectable. Las formulaciones pueden suministrarse como un producto que tiene una, dos o más composiciones farmacéuticas que incluyen FSH o FSH/hCG, y/o LH, para su administración por separado o conjunta. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto puede suministrarse en cualquier envase apropiado. Por ejemplo, un producto puede contener varias jeringas prellenadas que incluyen cada una FSH (una composición de FSH), o adicionalmente hCG (una composición de hCG), por ejemplo, en el que las jeringas pueden envasarse en un envase alveolado u otro medio para mantener la esterilidad. Un producto opcionalmente puede contener instrucciones para usar las formulaciones de gonadotropina.

De acuerdo con un aspecto adicional, la formulación de gonadotropina de la invención se proporciona como una preparación multidosis. La presente invención, sin embargo, también se refiere explícitamente a formulaciones destinadas a un solo uso. La presente invención también pertenece a una estabilización de formulaciones como parte de un kit. Dicho kit comprenderá al menos un recipiente que comprende una o más dosis diarias de la gonadotropina, por ejemplo, FSH o, por ejemplo, dos recipientes (por ejemplo, un vial), comprendiendo cada uno una gonadotropina diferente como hCG y, por ejemplo, instrucciones adicionales (por ejemplo, para la administración) y, por ejemplo, un medio adicional para inyección. En una realización preferida, se usa una pluma de inyección para múltiples inyecciones, por lo que la solución de gonadotropina se llena en cartuchos respectivos. Los ingredientes activos pueden estar en diferentes cartuchos, pero pueden inyectarse, por supuesto, simultáneamente o en orden secuencial, como es bien conocido por los expertos en la materia. Además, dos o más ingredientes activos pueden estar dentro del mismo cartucho.

En una realización muy preferida, la presente formulación es para uso parenteral, incluso más preferido para inyección subcutánea.

En una realización preferida, la hMG está presente en la formulación en una cantidad de 35 - 850 Ul/ml, preferiblemente 50 - 800 UI/ml, incluso más preferido 100 - 700 UI/ml, mucho más preferido 625 UI/ml, típicamente en una formulación multidosis.

Una formulación particularmente preferida de excipientes para una formulación multidosis que comprende hMG como anteriormente, y/o que comprende hMG, y/o hCG, y/o todas las demás gonadotropinas mencionadas dentro de la presente invención, tiene la siguiente composición:

50- 160 mM de HCl de arginina, preferiblemente 150 mM de HCl de arginina

de 0,05 a 1,5 mg/ml, preferiblemente 0,15 mg/ml de L-metionina

0,001 - 0,05 mg/ml, preferiblemente 0,005 mg/ml de polisorbato 20

de 4,0 a 6,0 mg/ml, preferiblemente 5,0 mg/ml de fenol

pH 6,0 a 7,5, preferiblemente pH 6,8 /- 0,3, (el pH se refiere al pH de la solución completa.) WFI.

Concentraciones típicas del ingrediente activo para formulaciones que comprenden hCG y/o FSH recombinantes son las siguientes, aunque la concentración del ingrediente activo no tiene ninguna influencia sobre el funcionamiento de la presente invención:

Para rFSH: 30 - 150 pg/ml

Para rhCG: 5 - 200 pg/ml

Los excipientes preferidos para dichas formulaciones recombinantes son los mismos que se describen anteriormente para la formulación de hMG multidosis. También se abarcan formulaciones de un solo uso típicas en esta invención y serían las mismas que se describen anteriormente con la excepción de que no comprenderían un conservante, como fenol.

Pueden prepararse formas de liberación retardada inyectables formando matrices microencapsuladas de la gonadotropina (y otros agentes, si estuvieran presentes) en polímeros biodegradables. Las formas de liberación retardada/sistemas de liberación mantenida basados en polímero pueden ser, dependiendo de su naturaleza química, por ejemplo, micro- o nanopartículas, hidrogeles, micelas, emulsiones o implantes. Dependiendo de la relación de gonadotropina a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación de gonadotropina. Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen sistemas copoliméricos poliláctido/poliglicólido, polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos), poli(etilenglicol), poliaminoácidos, polisacáridos, por ejemplo, hialuronato de sodio (NaHA) u otras sales de los mismos, gelatina, quitosano, etc. Todos los polímeros mencionados pueden derivatizarse o modificarse para optimizar el suministro de fármaco proteínico o su estabilidad. Las formulaciones inyectables de liberación retardada también se preparan atrapando la gonadotropina en sistemas lipídicos, o mezclas lipídicas poliméricas como micelas, liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, y/o incorporando agentes esterilizantes. Es posible formar composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables pueden suministrarse en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo, vial, jeringa prellenada, cartuchos de inyección y similares, como se describe anteriormente.

El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de una formulación para su uso como una composición farmacéutica como se describe en este documento se ajustan principalmente de acuerdo con práctica rutinaria en este campo, véase, por ejemplo, The textbook of Pharmaceutical Medicine, quinta edición, editado por John P. Griffin y John O'Grady. En una realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para administración parenteral. Los métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales son conocidos en la técnica y se describen en REMINGTON; Th e SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY,supra,en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales pueden suministrarse en formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de su administración. En una realización especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.

La FSH, hCG y/o LH que pueden formularse de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse por medios convencionales de la orina, como es bien conocido en la técnica, o pueden producirse de forma recombinante. Para posibles métodos de producción, se hace referencia además a, por ejemplo, el documento WO 2009/127826.

Una realización preferida de la invención es la formulación actualmente descrita que comprende hCG.

La hCG puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica. La hCG como se usa en este documento incluye hCG obtenida de la orina y hCG recombinante. Se particularmente preferida una formulación que comprende hCG obtenida de la orina. También se abarca una formulación que tiene actividad de LH que se obtiene, al menos parcialmente, de hCG (en otras palabras: la hCG es la molécula que es responsable de esta actividad de LH). La hCG obtenida de seres humanos puede purificarse de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina y/o placenta) por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresión y purificación de hCG recombinante son bien conocidos en la técnica.

La LH puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica. La LH, como se usa en este documento, incluye LH obtenida de seres humanos y LH recombinante. La LH obtenida de seres humanos puede purificarse de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresión y purificación de LH recombinante son conocidos en la técnica.

La expresión "composición farmacéutica" se usa en este documento indistintamente con "formulación farmacéutica".

La composición farmacéutica estable de la presente invención puede usarse para el tratamiento de la infertilidad. "El tratamiento de la infertilidad" en el contexto de esta invención incluye tratamiento de la infertilidad por (hiper)estimulación ovárica controlada (COS) o métodos que incluyen una etapa o fase de estimulación ovárica controlada, por ejemplo, inseminación intrauterina (IUI), fertilizaciónin vitro(IVF) o inyección intracitoplásmica de esperma (ICSI). La expresión también incluye inducción de la ovulación (OI) o métodos que incluyen una etapa o fase de inducción de la ovulación. La expresión también incluye tratamiento de la infertilidad en un sujeto que tiene infertilidad tubal o inexplicable, incluyendo tratamiento de la infertilidad en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo, endometriosis en estadio I o estadio II (como se define por el sistema de clasificación de la American Society for Reproductive Medicine (ASRM) para los diversos estadios de endometriosis, clasificación revisada de la endometriosis de la American Society for Reproductive Medicine: 1996, Fertil Steril 1997; 67, 817-821), y/o en un sujeto con una pareja con infertilidad de factor masculino. La expresión preferiblemente incluye el uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (ART), inducción de la ovulación (OI) o inseminación intrauterina (IUI). La composición farmacéutica puede usarse, por ejemplo, en indicaciones médicas donde se usan preparaciones conocidas de FSH o preparaciones de FSH y hCG. En una realización típica, la presente formulación se usa para las mismas indicaciones médicas que las indicaciones aprobadas para Menopur ®, en Europa, como sigue, en un caso ejemplar:

Tratamiento de infertilidad femenina y masculina:

• Mujeres anovuladoras: Puede usarse MENOPUR para estimular el desarrollo de folículos en pacientes amenorreicas. Clomifeno (o un agente inductor de la ovulación similar que influye en los mecanismos de retroalimentación esteroideos) es el tratamiento preferido para mujeres con una diversidad de alteraciones del ciclo menstrual, incluyendo insuficiencia luteínica con ciclos de anovulación y con prolactina normal, y también pacientes amenorreicas con evidencia de producción de estrógenos endógenos, pero niveles normales de prolactina y normales de gonadotropina. Las que no responden después pueden seleccionarse para tratamiento con menotrofina.

• Mujeres que se someten a superovulación dentro de un programa de fertilización asistido médicamente:

Puede usarse MENOPUR para inducir del desarrollo de múltiples folículos en pacientes que se someten a una técnica de concepción asistida tal como fertilización in vitro (IVF).

• Hipogonadismo hipogonadotrópico en hombres: Puede administrarse MENOPUR en combinación con coriogonadotropina humana (por ejemplo, Choragon) para la estimulación de la espermatogénesis.

o las indicaciones aprobadas para Menopur® en Estados Unidos como sigue:

Desarrollo de múltiples folículos y embarazo en mujeres ovuladoras como parte de un ciclo de tecnología de reproducción asistida (ART).

Como alternativa, las opciones de tratamiento con Menopur® pueden describirse como sigue:

Se indica MENOPUR para el tratamiento de la infertilidad en las siguientes situaciones clínicas: Anovulación, incluyendo poliquistosis ovárica (PCOD), en mujeres que han sido resistentes al tratamiento con citrato de clomifeno.

Hiperestimulación ovárica controlada para inducir el desarrollo de múltiples folículos para tecnologías de reproducción asistida (ART) (por ejemplo, fertilizacióninvitro/transferencia de embriones (IVF/ET), trasferencia intratubárica de gametos (GIFT) e inyección intracitoplásmica de esperma (ICSI)).

Estimulación del desarrollo de folículos en mujeres con hipogonadismo hipogonadotrópico.

La presente invención también proporciona el uso de las formulaciones de gonadotropina estabilizadas descritas en este documento (de acuerdo con aspectos de la invención) para, o en la fabricación de un medicamento para, el tratamiento de la infertilidad.

En una realización preferida, la formulación de la presente invención se usa para la inducción de la ovulación, técnicas de reproducción asistida (ART) y/o para el hipogonadismo hipogonadotrópico en hombres.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse además en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parche), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como un pulverizador bucal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución acuosa, excipientes atóxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, quinta edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1461 a 87; y USP-NF, The National Formulary XIV, decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros. La presente invención se refiere, en algunas realizaciones, a la provisión específica de una formulación que muestra tanto estabilidad sorprendentemente alta como ventajas adicionales, como ausencia de coloración inaceptable, ausencia de turbidez inaceptable, dolor reducido o ausente tras la inyección, e irritación reducida o ausente de la piel tras la inyección. Esto ha llegado a ser posible solamente con los hallazgos de la presente invención que muestra que componentes particulares posibilitan el funcionamiento ventajoso y la alta estabilidad de las formulaciones líquidas de gonadotropina descritas en este documento.

Aunque las formulaciones de gonadotropina han estado en el mercado durante varias décadas hasta ahora, los científicos de formulación son muy conscientes de que la formulación de estas proteínas está asociada con varias dificultades. Estas dificultades existen y varían enormemente basándose en muchos factores, como

• El hecho de que se esté formulando una proteína (las proteínas de este tipo son difíciles de formular en cualquier caso)

• El hecho de que la proteína esté glucosilada específicamente (la glucosilación podría verse influida por la selección específica de la fabricación y los excipientes)

• La una o más proteínas específicas formuladas (la química de formulación varía significativamente dependiendo de la proteína real: se ha demostrado, por ejemplo, que incluso proteínas muy relacionadas como FSH y hCG se comportan de manera diferente en la misma formulación, véase, por ejemplo, el documento WO 2012/013742)

• Si la proteína se obtuvo o no de la naturaleza, por ejemplo, orina, o se produjo de forma recombinante • Si se necesita un conservante (algunos conservantes cumplen su objetivo pretendido de protección contra el crecimiento microbiano, pero afectan a la estabilidad de la formulación final negativamente. Esto es cierto para todos de m-cresol, fenol y alcohol bencílico (con o sin cloruro de benzalconio), que son actualmente los únicos conservantes autorizados para su uso con gonadotropinas; además, los conservantes pueden tener un efecto negativo sobre la coloración, dependiendo de los excipientes adicionales y el ingrediente activo comprendido en la formulación)

• El agente tensioactivo específico usado (estos podrían dar lugar, en algunos casos, a turbidez, de nuevo dependiendo de los excipientes adicionales comprendidos en una formulación respectiva)

• El tampón específico usado (por ejemplo, el tampón citrato frecuentemente dará lugar a dolor e irritación de la piel tras inyección)

• Los excipientes específicos usados para la estabilización, que estabilizarán diferentes composiciones de maneras impredecibles.

• Dependiendo del excipiente usado para la estabilización que estabilizará diferentes composiciones de maneras impredecibles.

Por tanto, los científicos de formulación se enfrentan a un conjunto de múltiples problemas por un lado y un conjunto de una multitud de posibles excipientes por otro lado, dando lugar a un problema complejo para proporciona una formulación con una buena estabilidad por un lado y sin coloración o turbidez o dolor tras la inyección por otro lado.

Por lo tanto, fue bastante sorprendente que la presente formulación,sin la adición de tampónresolviera estos problemas particulares, en el presente intervalo de pH.

A este respecto, "sin (la adición de) tampón/un tampón (adicional)" y "no comprende un tampón" se usan como sinónimos en esta solicitud. Esta expresión significará que no se añade/no hay presente compuesto adicional en la formulación que se consideraría que tiene capacidad tamponante. Se dice que una solución está tamponada si resiste cambios en la actividad de un ion tras la adición de sustancias que se espera que cambien la actividad de ese ion. Los tampones son sustancias o combinaciones de sustancias que confieren esta resistencia a una solución. Las soluciones tamponadas son sistemas en que el ion está en equilibrio con sustancias que pueden eliminar o liberar el ion. Se refiere a la cantidad de material que puede añadirse a una solución sin provocar un cambio significativo en la actividad del ion. Se define como la relación de ácido o base añadida (en gramos de equivalentes/l) al cambio en unidades de pH. La capacidad de una solución tamponada se ajusta a las condiciones de uso, habitualmente mediante el ajuste de las concentraciones de sustancias tamponantes (USP NF). La capacidad tamponante se expresa normalmente como el número de equivalentes (equiv.) de ácido fuerte (por ejemplo, HCl) o base (por ejemplo, NaOH) que provoca que un litro de la solución en cuestión experimente un cambio de una unidad en el pH (preferiblemente a una atmósfera y 21 °C) (Skoog West y Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, quinta edición). Un equivalente de HCl es igual a un mol de HCl y un equivalente de NaOH es igual a un mol de NaOH. En la presente invención la capacidad tamponante se expresará como el número de equivalentes (equiv.) de ácido fuerte (por ejemplo, HCl) o base (por ejemplo, NaOH) que provoca que un litro de la solución en cuestión experimenta un cambio de una unidad en el pH. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, la formulación no comprenderá un tampón adicional, que contribuye con > 0,5 mequiv./(litro*pH) (preferiblemente a 1 atm, 21 °C) en el intervalo de pH que se divulga para las formulaciones de la presente invención.

Método para determinar y calcular la capacidad tamponante

La capacidad tamponante puede determinarse y calcularse como sigue.

Un volumen determinado de la solución a ensayar se valora con ácido, por ejemplo, HCl o base, por ejemplo, NaOH. Deben usarse concentraciones adecuadas de ácido y base, por ejemplo, 0,2 N para hacer una valoración suficientemente precisa.

La valoración se realiza añadiendo pequeñas alícuotas de HCl o NaOH a la solución de ensayo. Por cada adición, se documenta el volumen añadido y el pH correspondiente.

El volumen acumulado de ácido y base se representa frente al pH medido, véase, por ejemplo, la figura 1. Se realiza un ajuste de regresión lineal de mínimos cuadrados para el área de pH pertinente y se calcula R2 para confirmar la validez de la línea ajustada.

La capacidad tamponante expresada en mequiv./(litroxunidad de pH) se calcula por regresión lineal.

Ecuación í

Y — b

Y= QX+ bW X =

a

donde;

x = capacidad tamponante [gl de HCl/NaOH 0,2 N para mover el pH 1 unidad de pH]

Y-b = 1 unidad de pH

a= pendiente y

( K - i 0 x C

X — ----------------a x/ x106

Donde mequiv. es los miliequivalentes de ácido o base que se da a partir de la concentración, por ejemplo, HCl/NaOH 0,2 N que es igual a 0,2 equivalentes/l de HCl/NaOH que es igual a 200 mequiv./l de HCl/NaOH.

x = capacidad tamponante [mequiv./litroxunidad de pH]

Y-b = 1 unidad de pH

HCl/NaOH [2J2! ="ÍSfíf

C = concentración of ácido o base, por ejemplo, para

V = volumen de solución en cuestión

106 factor de corrección de gl a litro

Ejemplo de cálculo usando la ecuación 2 y el lote C-01intervalo de pH 6,564-6,947, de la tabla 9:

1<x2(10>

* = — 1 ,32 meqmJ|1¡liD X midad depH)

0,001507 x 0,1X 1000000

Para determinar si un componente contribuirá con >0,5 mequiv./(litroxunidad de pH) a la capacidad tamponante, la capacidad tamponante se determina como se describe anteriormente para una solución con el componente y para la misma solución sin el componente. La diferencia en la capacidad tamponante determinada para las dos soluciones da la contribución del componente dado a la capacidad tamponante.

Las expresiones "sin (la adición de) tampón/un tampón (adicional)" y "no comprende un tampón" también significa que la formulación de la presente invención no comprende uno cualquiera de los siguientes tampones (que son tampones aprobados por la FDA para uso parenteral en el intervalo de pH 6,0 - 7,5):

Histidina

Fosfato

Citrato

Trometamina (Tris)

Ácido hidroxietilpiperazin etanosulfónico (HEPES)

Carbonato

Además, las expresiones también significan que no se incluye ninguno de los tampones aprobados por la FDA adicionales para uso parenteral, en particular

Acetato

Ácido adípico

Sulfato de amonio

Succinato

Asparagina

Ácido aspártico

Glutamato (ácido glutámico)

Glicina

Lactato

Lisina

Maleato (ácido maleico)

Fumarato (ácido fumárico)

Malato

Meglumina

Propionato

Alanina

Fenilalanina

Cisteína

Isoleucina

Leucina

Prolina

Serina

Tartrato

Treonina

Triptófano

Tirosina

Valina

Sin la adición de un tampón, habitualmente se supone que el pH de la solución final no puede mantenerse fácilmente en el intervalo deseado (y será difícil que alcance un pH diana específico durante el ajuste) (en la presente invención, el pH debe estar entre 6,0 y 7,5, más preferido entre 6,5 y 7,4, preferiblemente en o alrededor de 6,8), pero fluctuará enormemente.

Es extremadamente importante mantener el pH correcto para un producto farmacéutico. El pH define parámetros como la estabilidad, la actividad y la vida útil. Por esa razón, las formulaciones farmacéuticas habitualmente se formulan con un tampón. Está disponible una diversidad de agentes tamponantes y se seleccionan para que sean eficaces al pH deseado. Tampones ejemplares que se usan normalmente en prácticamente todas las formulaciones de gonadotropina existentes son tampón fosfato y tampón citrato. El tampón tiene que proporcionar a la formulación un pH mantenido sobre el intervalo de condiciones a las que podría exponerse la formulación durante su formulación y, en particular, durante el almacenamiento de la misma. A menudo es bastante problemático encontrar dicho tampón adecuado, y después, en algunos casos, un tampón eficaz proporciona a la formulación efectos secundarios indeseados, como dolor tras la inyección para tampones citrato. Todos los tampones tienen la desventaja inherente de ser un ingrediente adicional en la formulación, lo que complica el proceso de formulación, impone un riesgo de afectar perjudicialmente a otros ingredientes, a la estabilidad, a la vida útil y a la aceptabilidad por el usuario final.

Los autores de la presente invención, sin embargo, han proporcionado sorprendentemente formulaciones donde no hay tampón presente, mientras que las formulaciones no tienen ninguna fluctuación inaceptable del pH. Las formulaciones comprenden arginina como compuesto estabilizante. La arginina tendría una capacidad tamponante esperada de /-1 unidad de pH alrededor de su pKa, que está en 2,17, en 12,5 y en 9,04. Por tanto, no se espera capacidad tamponante en el intervalo de pH preferido de esta invención (por ejemplo, entre 6,0 y 7,5, más preferido entre 6,5 y 7,4, preferiblemente en o alrededor de 6,8). No obstante, se descubrió sorprendentemente que la arginina tiene una fuerte influencia estabilizante sobre el pH en las formulaciones particulares descritas en este documento. Ningún efecto de este tipo de la arginina se ha descrito en otra parte en la técnica anterior.

Ventajosamente, la provisión de esta formulación sin un tampón como se define en este documento también proporciona una formulación con dolor reducido o ausente tras la inyección e irritación reducida o ausente tras la inyección. Esto es contrario a las formulaciones que usan, por ejemplo, tampón citrato que se ha demostrado que da lugar a irritación de la piel y dolor tras la inyección.

La arginina de esta invención puede ser arginina, o puede ser HCl de arginina, o incluso más preferido, L-arginina (HCl). La cantidad de arginina está preferiblemente en el intervalo entre 50 y 160 mM, más preferido 80 - 160 mM, incluso más preferido a aprox. 150 mM.

Como puede observarse a partir de los ejemplos a continuación, la arginina tiene un efecto pronunciado sobre la oxidación de FSH y hCG. Sin embargo, los autores de la invención demostraron un efecto estabilizante particularmente alto. De forma bastante sorprendente, entonces pudieron proporcionar una formulación líquida de gonadotropina que era estable y mostraba solamente oxidación mínima (en niveles aceptables, véase la sección de ejemplo a continuación), si la gonadotropina se combinaba con una cantidad estabilizante alta de arginina (por ejemplo, 150 mM).

Esto fue particularmente sorprendente ya que el efecto se obtuvo en un intervalo de pH muy alejado de los valores de pKa de arginina, concretamente en un intervalo de pH de pH 6,0 a 7,5. Este es el intervalo de pH preferido para la presente invención. En una realización particularmente preferida, el pH está en el intervalo de 6,5 a 7,4. Incluso más preferido es un intervalo de pH entre 6,5 y 7,2. Mucho más preferido es un pH de 6,8 /- 0,3.

Sorprendentemente, en un aspecto de referencia, una baja cantidad antioxidante de metionina, preferiblemente L-metionina, pudo evitar los acontecimientos de oxidación indeseables. Esta baja cantidad podía ser tan baja como 0,05 mg/ml, pero podía llegar hasta 2,5 mg/ml. En este aspecto de referencia, la cantidad de metionina es entre 0,1 y 1,5 mg/ml. En un aspecto de referencia adicional, la cantidad de metionina es entre 0,1 y 1 mg/ml. En un aspecto de referencia adicional, la cantidad de metionina es entre 0,1 y 0,5 mg/ml. Un aspecto de referencia adicional tiene metionina a 0,15 mg/ml. No pudo preverse en absoluto que la alta potencia de oxidación de arginina podría haberse contrarrestado y superado por dicha baja cantidad de metionina.

Fue incluso más sorprendente el hallazgo de que la arginina tenían un efecto estabilizante mucho más pronunciado que otros agentes estabilizantes conocidos, por ejemplo, sacarosa, que es un estabilizante añadido bastante frecuentemente y muy bien establecido.

Las formulaciones pueden incluir excipientes, diluyentes, disolventes y/o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados. Ejemplos de excipientes, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.

Es más preferido, especialmente para formulaciones multidosis, en la presente invención la adición de un conservante. Es muy preferido que este conservante sea fenol. En una realización preferida adicional, el fenol se añade a una concentración de 4,0 a 6,0 mg/ml, preferiblemente 5,0 mg/ml de fenol. Sorprendentemente, el fenol también es ventajoso en el contexto de la presente formulación específica, en comparación con otros conservantes bien conocidos, porque no da lugar a coloración y es muy estable, incluso sobre un periodo de tiempo prolongado, a pesar de la presencia de este conservante, como se muestra en la sección de ejemplo.

Es más preferida en la presente invención la adición de un agente tensioactivo. Es muy preferido que este tensioactivo sea un polisorbato, incluso más preferido polisorbato 20. En una realización preferida adicional, el polisorbato 20 se añade a una concentración de 0,001 - 0,05 mg/ml, preferiblemente 0,005 mg/ml de polisorbato 20. Ventajosamente, la formulación de esta invención, preparada con polisorbato 20, no da lugar a turbidez y es muy estable, incluso sobre un periodo de tiempo prolongado, a pesar de la presencia de este conservante, como se muestra en la sección de ejemplo.

Las composiciones también pueden contener aditivos adicionales además de los ya enumerados anteriormente, tales como, aunque sin limitación conservantes (adicionales), agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Pueden incluirse agentes antibacterianos y antifúngicos para evitar el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenoles, ácido sórbico y similares. Además, puede ser deseable incluir agentes de tonicidad. La formulación de la presente invención, sin embargo,no comprende un tampón adicional.

En algunos casos, para lograr acción prolongada, es deseable ralentizar la absorción de la una o más gonadotropinas tales como FSH (y otros ingredientes activos, si estuvieran presentes) desde la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede conseguirse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con baja solubilidad en agua. La tasa de absorción depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una formación de combinación de FSH administrada por vía parenteral se consigue disolviendo o suspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleoso.

De acuerdo con la presente invención, los autores de la invención hicieron esfuerzos por investigar el efecto de determinados compuestos sobre la estabilidad de una formulación liquida de gonadotropina; aquí, se investigaron los efectos estabilizantes, así como desestabilizantes de varios compuestos. Además, los autores de la invención buscaron mejorar la formulación resultante en cuanto a su transparencia, grado de coloración y dolor tras la inyección.

El término "estabilidad" puede referirse a estabilidad química, que implica modificación covalente en la secuencia de aminoácidos, pero en el contexto de estabilidad de proteínas, la estabilidad también puede referirse a estabilidad física, que implica cambios del estado plegado de la proteína (es decir, el estado natural) sin incluir escisión de enlaces covalentes. En la presente invención, el término "estabilidad" se refiere a la bioestabilidad de formulaciones de gonadotropinas, en particular FSH y hCG. La inestabilidad física de una formulación de proteínas puede estar provocada por la agregación de las moléculas proteínicas para formar agregados de orden superior, por disociación de los heterodímeros en monómeros o por cualquier otro cambio conformacional que reduzca al menos una actividad biológica de, por ejemplo, proteínas FSH (y otros ingredientes activos, si estuvieran presentes) incluidas en la presente invención.

Una solución o formulación "estable" es una en la que el grado de agregación, disociación, modificación conformacional, pérdida de actividad biológica y similares, de las proteínas en la misma se controla aceptablemente, y no aumenta inaceptablemente con el tiempo. La estabilidad puede evaluarse por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la medición de la dispersión de la luz de una muestra, inspección visual de la transparencia y/o coloración, absorbancia o densidad óptica, determinaciones de tamaño molecular (por ejemplo, por cromatografía por exclusión de tamaño o fraccionamiento por flujo de campo), actividad biológicain vitrooin vivoy/o por calorimetría diferencial de barrido (DSC).

La presente formulación es estable durante 12 meses en condiciones de almacenamiento, preferiblemente 16 meses en condiciones de almacenamiento, incluso más preferido durante 24 meses, incluso más preferiblemente durante 24 meses en condiciones de almacenamiento más 1 mes "en uso", es decir, a temperatura ambiente. La estabilidad en "condiciones de almacenamiento" se refiere a almacenamiento de la formulación en un entorno refrigerado, por ejemplo, a 5 °C ± 3 °C. "Temperatura ambiente", en el presente contexto, se entiende que se refiere a en o por debajo de 30 °C, preferiblemente 15 - 25 °C, preferiblemente 18 - 25 °C, mucho más preferido 25 ± 2 °C.

Para determinar la estabilidad en el contexto de la presente formulación se usaron (inmuno)ensayos bien conocidos para FSH y hCG, que son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen en este documento, por consiguiente, solamente en términos generales como sigue:

RP-HPLC para la oxidación

La oxidación de las proteínas se determinó por RP-HPLC, por elución en gradiente en una columna C4 y detección UV a 210 nm.

Ensayo enzimático fluorescente (ELFA)

La inmunoactividad de FSH y hCG se determinó en un inmunoensayo no competitivo realizado usando un instrumento analizador automático VIDAS® (BioMérieux, Francia) con kits VIDAS® correspondientes a FSH y hCG, respectivamente.

Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)

La pureza de rFSH se determinó con cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) en una columna SEC con intervalo de proteína de 3-70 kDa y detección UV a 210 nm.

Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)

La pureza de rhCG se determinó con cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) por elución en gradiente en una columna con grupos alquilamida y detección UV a 220 nm.

Bioensayo de FSH y LH

La potencia de FSH y LH se determinó usando ensayos biológicosin vivo; ensayo de Steelman-Pohley (FSH) y ensayo de aumento de peso de la vesícula seminal (LH), respectivamente.

Otros métodos para evaluar la estabilidad son bien conocidos en la técnica y también pueden usarse de acuerdo con la presente invención.

Los ensayos de actividad de FSH y LH se normalizan usando la Cuarta Norma Internacional para FSH de la Orina y LH de la Orina, noviembre de 2000, del Comité de Expertos sobre Normalización Biológica de la Organización Mundial de la Salud (CENB de la OMS) y son bien conocidos por los expertos en la materia.

Se sabía que varios conservantes tienen un efecto desestabilizante pronunciado sobre formulaciones de gonadotropina y se descubrió sorprendentemente aquí que la formulación de la invención descrita, en particular que comprende arginina, pero no tampón, era particularmente estable, incluso sobre un periodo de tiempo prolongado e incluso en presencia de fenol.

La formulación actualmente reivindicada de la reivindicación 1 tiene un efecto estabilizante sobre una formulación líquida de hMG que es, de una manera ventajosa y sorprendente, incluso más pronunciado que los efectos estabilizantes de los estabilizantes conocidos, como, por ejemplo, sacarosa. El efecto de estabilización mejorado en comparación con los estabilizantes conocidos, como sacarosa, es particularmente sorprendente. Además, bastante inesperado, los efectos estabilizantes de la combinación de la invención fueron pronunciados a pesar de la ausencia de un tampón.

Se ha sabido por la técnica anterior que hay degradación de FSH que se produce en formulaciones farmacéuticas de FSH y esto se ha confirmado por ejemplos proporcionados en el documento WO 2012/013742. La FSH se degradará tanto como una función del tiempo, así como una función de la temperatura.

Parece que el desplegamiento conformacional de las estructuras terciaria y secundaria de FSH que se produce tras calentamientos es una transición de dos estados (cuando la agregación de proteínas está limitada). Este desplegamiento puede ser independiente de la disociación de subunidades (cambios en la estructura cuaternaria).

Además, quedó claro en la técnica anterior que la FSH, que contiene un conservante como alcohol bencílico o fenol, donde dichos conservantes son necesarios, por ejemplo, como agentes antimicrobianos en formulaciones líquidas de FSH, afectan claramente a la estabilidad de formulaciones multidosis de FSH de una manera negativa. Aquí, la estabilidad a largo plazo de FSH se disminuye, la temperatura de desnaturalización de FSH es menor y las formas ya desnaturalizadas tienen un nivel menor de estructuras secundarias que formulaciones de FSH que no contienen conservantes.

La presente invención también pertenece a un método para la estabilización de una formulación líquida de gonadotropina, en el que el método comprende la etapa de una adición de arginina y metionina a dicha formulación, que no comprende un tampón.

Lista de figuras

Figura 1: Curva de valoración. La pendiente de las curvas muestra la capacidad tamponante, por ejemplo, una pendiente pronunciada representa una capacidad tamponante baja.

Figura 2 : Optimizador de respuesta basado en resultados a 25 °C. Las líneas verticales muestran el nivel de L-arginina y L-metionina y las respuestas en el inmunoensayo de FSH y hCG como Y (en UI/ml). R2<hcg>: 92,15 % y R2<fsh>: 67,31 %.

Todos los estudios se confirmaron mediante los datos instantáneos realizados adicionalmente.

Ejemplos

Ejemplo 1

1 Antecedentes e introducción

Se usan varias especialidades farmacéuticas diferentes que contienen hormonas gonadotropina obtenidas de la orina de mujeres posmenopáusicas o embarazadas en el tratamiento de la infertilidad, tales como preparaciones de hMG (gonadotropina menopáusica humana). La hMG tiene actividad de hormona foliculoestimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH) en una relación uno a uno.

La FSH, LH y coriogonadotropina humana (hCG) pertenecen a la familia de gonadotropinas de hormonas glucoproteínicas complejas. Son heterodímeros compuestos de una subunidad a y una p. La subunidad a de 92 aminoácidos es común para estas tres gonadotropinas, las subunidades p son únicas, dándoles sus diferentes características biológicas (Wolfenson C.et al.2005, Batch-to-batch consistency of human-derived gonadotropin preparations compared with recombinant preparations. Reproductive BioMedicine. Vol 10 n.° 4:442-454; Shen, S. T., Cheng, Y. S., Shen, T. Y., y Yu, J. Y. 2006, Molecular cloning of follicle-stimulating hormone (FSH)-beta subunit cDNA from duck pituitary. Gen. Comp Endocrinol. 148:388-394; Fox, K. M., Dias, J. A., y Van, R. P. 2001, Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol. Endocrinol. 15:378-389; Burova, T., Lecompte, F., Galet, C., Monsallier, F., Delpech, S., Haertle, T., y Combarnous, Y. 2001, Conformational stability and in vitro bioactivity of porcine luteinizing hormone. Mol. Cell Endocrinol. 176:129-134. Las hormonas glucoproteínicas pierden todas su bioactividad tras disociación de las subunidades unidas no covalentemente (Alevizaki, M. y Huhtaniemi, I. 2002, Structure-function relationships of glicoprotein hormones; lessons from mutations and polimorphisms of the thyrotrophin and gonadotropin subunit genes. Hormones. (Atenas.) 1:224-232).

La LH y hCG se unen al mismo receptor y, por lo tanto, ambas poseen actividad de LH. En hMG, la actividad de LH es originaria principalmente de hCG.

El objetivo de la presente invención es desarrollar una formulación de gonadotropina como una formulación líquida, para inyección subcutánea. Para inyección multidosis, típicamente es necesaria la adición de un conservante (Meyer, B. K., Ni, A., Hu, B., y Shi, L. 2007, Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. J. Pharm. Sci. 96:3155-3167; Chang, B. S. y Hershenson, S. Practical Approaches to Protein Formulation Development. In Rational Design of Stable Protein Formulations. J. F. Carpenter y M. C. Manning, editores. 2002, Plenum Publ., Nueva York. 1-25; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. 2000, CRC Press, Boca Raton).

Como, en general, la estructura natural (bioactiva) de las proteínas es muy sensible a su entorno, por ejemplo, la composición de la formulación, los sistemas de recipiente/cierre, el pH y la temperatura, es tarea difícil identificar una formulación líquida adecuada para gonadotropinas, se cribaron diferentes excipientes. En el presente trabajo se investiga la capacidad tamponante y la estabilidad instantánea de diversas formulaciones de hMG usando un inmunoensayo de FSH, un inmunoensayo de hCG, un bioensayo, RP-HPLC para la determinación de proteínas oxidadas, valoración y pH como se describe a continuación en detalle.

2 Producto a estudiar

2.1 Materiales

2.1.1 Sustancia farmacéutica (DS)

La sustancia farmacéutica (DS) hMG-HP se fabricó por el Instituto Massone S.A. Argentina. La DS hMG-HP se recibe como un polvo de Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhague, Dinamarca.

La determinación de la actividad biológica de FSH y LH en la sustancia farmacéutica se realizó de acuerdo con la versión actual de la Farmacopea Británica (BP). También es posible, si se desea, realizar esta determinación de acuerdo con la versión USP 35. La bioactividad de FSH:LH en hMG es 1:1 y, por lo tanto, la bioactividad promedio determinada de FSH y LH se usa para preparar la especialidad farmacéutica. Por tanto, cuando la concentración de hMG se da como, por ejemplo, 625 UI/ml, es igual a una bioactividad de 625 UI/ml de FSH y 625 UI/ml de LH.

2.1.2 Excipientes

Se describe una lista de los excipientes usados en este trabajo en la tabla 1.

Tabla 1 Lista de excipientes

Nombre Calidad FabricanteGránulos de hidróxido de sodio Ph Eur, BP, JP, NF Merck Ácido clorhídrico, humeante al 37 % Ph Eur, BP, JP, NF Merck

Ácido cítrico monohidrato Ph Eur, BP, JPE, USP Merck Ácido orto-fosfórico al 85 % Ph Eur, BP, JPE, NF Merck Citrato de trisodio dihidrato Ph Eur, BP, JPE, USP Merck Hidrogenofosfato de disodio Ph Eur, BP, JPE, USP Merck dodecahidrato

L-histidina EMPROVE® exp Ph Eur, USP Merck

L-metionina USP, multifarmacopeico J.T. Baker L-arginina Ph Eur, USP Merck Monoclorhidrato de L-arginina Calidad farmacéutica, EP, JP, USP Sigma-Aldrich Sacarosa EMPROVE® exp Ph. Eur, BP, JPE, NF Merck

D-(+)-trehalosa deshidratada > 99 % GMPc Sigma-Aldrich Manitol Merck Lactosa monohidrato Ph Eur, BP, NF, JP Merck Glicina EMPROVE® Ph.Eur., BP, JPE, USP Merck Cloruro de sodio EMPROVE, Ph.Eur., BP, USP Merck Polisorbato 20 Ph.Eur, NF, JPE J.T. Baker Poloxámero 188 Adecuado para producción farm. biol., Ph.Eur., Merck

NF

Fenol Ph.Eur, JP, USP Merck Meta-cresol Ph. Eur. / USP calidad parenteral Hedinger Agua Milli-Q - Millipore2.1.3 Sistema de recipiente y cierre

Para los estudios de estabilidad, los materiales de envasado principales fueron viales de vidrio con tapones de caucho y tapas de alu/plástico, o cartuchos de vidrio con émbolos de caucho y tapas con reborde.

3 Procedimiento de fabricación

3.1 Preparación

Todas las formulaciones se fabrican a escala de laboratorio.

Para preparar la solución de la especialidad farmacéutica (DP), se mezclan secuencialmente soluciones madre de cada excipiente y sustancia farmacéutica (DS). Antes de añadir hMG y la dilución final hasta el volumen, el pH de cada formulación se ajusta, cuando es necesario. Las soluciones madre de todos los excipientes y hMG se preparan en agua Milli-Q.

3.2 Filtración estéril y llenado aséptico

Las formulaciones para la estabilidad se filtran a esterilidad con filtro Millipore de PVDF de 0,22 pm. La filtración estéril se realiza en una poyata LAF usando materiales sometidos a autoclave.

El llenado se realiza después de filtración. Los recipientes se llenan con solución de muestra. Todos los viales y cartuchos se llenan en condiciones de tipo aséptico en una poyata LAF e inmediatamente se cierran con tapones de caucho o tapas con reborde. Fuera de la poyata LAF, los viales llenados se precintan con tapas a presión de aluminio.

4 Condiciones de almacenamiento

4.1 Condiciones de almacenamiento

Los recipientes que contienen formulaciones de especialidad farmacéutica se almacenan en condiciones aceleradas durante hasta 3 meses a 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR y/o durante hasta un mínimo de 6 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR. A cada temperatura de almacenamiento, los recipientes se almacenan en posiciones verticales. Los cartuchos se almacenan horizontalmente. Todos los recipientes se protegen de la luz.

5 Métodos analíticos

Los métodos analíticos usados en los estudios se describen a continuación.

5.1 Procedimiento de valoración

De acuerdo con USP-NF como se describe previamente, se dice que una solución está tamponada si resiste cambios en la actividad de un ion tras la adición de sustancias que se espera que cambien la actividad de ese ion. Los tampones son sustancias o combinaciones de sustancias que confieren esta resistencia a una solución. Las soluciones tamponadas son sistemas en que el ion está en equilibrio con sustancias que pueden eliminar o liberar el ion. Capacidad tamponante se refiere a la cantidad de material que puede añadirse a una solución sin provocar un cambio significativo en la actividad del ion. Se define como la relación de ácido o base añadida (en gramos de equivalentes/l) al cambio en unidades de pH. La capacidad de una solución tamponada se ajusta a las condiciones de uso, habitualmente mediante el ajuste de las concentraciones de sustancias tamponantes. La capacidad tamponante se expresar normalmente como el número de equivalentes (equiv.) de ácido fuerte o base que provoca que un litro de la solución en cuestión experimente un cambio de una unidad en el pH, dando la unidad mequiv./(litroxpH) que se usó para la determinación de la capacidad tamponante en la presente invención. Esto significa que la capacidad tamponante se define como el número de moles (equivalentes) de H+/OH- necesario para cambiar el pH de un litro de solución de tampón en una unidad.

La capacidad tamponante se determinó usando formulación de placebo (placebo aquí se refiere a formulaciones sin ingrediente activo) ajustada a pH diana como punto de partida. Se usó NaOH/HCl 0,2 N para valorar el pH al alza o a la baja. El pH se midió después de cada adición de NaOH/HCl 0,2 N y se documentó el volumen de NaOH/HCl 0,2 N. La cantidad de NaOH/HCl 0,2 N se representó como valores X y el pH como valores Y. Se realizó regresión lineal ajustada alrededor de pH 6,8 para placebo de hMG (pH diana) y alrededor de pH 6,5 para placebo de referencia (pH diana). La capacidad tamponante puede calcularse como los pl de HCl/NaOH 0,2 N para mover el pH en 0,01 unidad de pH/l de DP y como miliequivalentes (mequiv.) de ácido o base/(litroxunidad de pH), como se describe anteriormente en la definición.

5.2 Inmunoensayo de FSH y hCG

El inmunoensayo de FSH y hCG se determinó por ELFA no competitivo.

5.3 Proteínas oxidadas

La oxidación de las proteínas se determinó por RP-HPLC.

5.4 pH

El pH se midió de acuerdo con Ph. Eur.

6 Resultados

Los resultados de los estudios de estabilidad, la evaluación del agente tamponante en un estudio de capacidad tamponante, así como los resultados de estabilidad del estudio de diseño del experimento (DoE) se presentan a continuación.

Tabla 2 Composición de formulaciones líquidas de hMG (600 Ul/ml)

N.° de Tampón Tensioactivo Conservante Estabilizante/agente de lote tonicidad

E-01 Fosfato 10 mM1 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 41,3 mg/ml de manitol

pH 6,8 polisorbato 20 cresol

E-02 Fosfato 10 mM1 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 85,9 mg/ml de trehalosa

pH 6,8 polisorbato 20 cresol

E-03 Fosfato 10 mM1 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 74,3 mg/ml de sacarosa

pH 6,8 poloxámero 188 cresol

E-04 Fosfato 10 mM1 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 18,8 mg/ml de glicina

pH 6,8 poloxámero 188 cresol

E-05 Fosfato 10 mM1 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de fenol 67,7 mg/ml de sacarosa

pH 6,8 polisorbato 20

E-06 Fosfato 10 mM1 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de fenol 6,8 mg/ml de NaCl

pH 6,8 polisorbato 20

E-07 Fosfato 10 mM1 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de fenol 37,6 mg/ml de manitol

E-08 Citrato 10 mM2 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 71,1 mg/ml de sacarosa

pH 6,8 polisorbato 20 cresol

E-09 Citrato 10 mM2 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 29,3 mg/ml de HCl de L-arginina pH 6,8 polisorbato 20 cresol

E-10 Citrato 10 mM2 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 39,5 mg/ml de manitol

pH 6,8 poloxámero 188 cresol

E-11 Citrato 10 mM2 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de fenol 74,7 mg/ml de trehalosa

pH 6,8 polisorbato 20

E-12 Citrato 10 mM2 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de fenol 64,5 mg/ml de sacarosa

pH 6,8 poloxámero 188

E-13 Citrato 10 mM2 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de fenol 6,5 mg/ml de NaCl

pH 6,8 poloxámero 188

E-14 Histidina 10 mM 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 77,5 mg/ml de sacarosa

pH 6,8 polisorbato 20 cresol

E-15 Histidina 10 mM 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 19,6 mg/ml de glicina

pH 6,8 poloxámero 188 cresol

1 Hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato 10 mM, pH ajustado con ácido fosfórico

2 Citrato de trisodio dihidrato 10 mM, pH ajustado con ácido cítrico________________

6.1 Estabilidad de formulación líquida de hMG/3 meses

Las moléculas proteínicas pueden estabilizarse añadiendo excipientes a la solución, por ejemplo, sales, glúcidos o aminoácidos, pero el grado de estabilización tras la adición de diferentes glúcidos, sales y aminoácidos varía enormemente entre diferentes formulaciones. Aquí, se realizaron estudios de estabilidad iniciales para cribar diversos estabilizantes en combinación con conservantes y tampones en una formulación líquida de hMG. Sorprendentemente, los resultados muestran un efecto estabilizante superior de L-arginina, como se muestra en las tablas 3 y 6 para el inmunoensayo de hCG y las tablas 4 y 7 para el inmunoensayo de FSH.

La formulación E-09 muestra una estabilidad superior en comparación con todas las demás formulaciones. La formulación E-09 es la única formulación que contiene L-arginina (véase la tabla 2). La formulación K-01, K-03 y K-04, así como K-09 muestran estabilidad superior en comparación con todas las demás formulaciones (véase la tabla 6). Estas formulaciones de nuevo contienen L-arginina (véase la tabla 5). En la tabla 4, la formulación E-09 sobresale con la mejor estabilidad en comparación con todas las demás formulaciones, también para el inmunoensayo de FSH y la tabla 7 confirma que la formulación K-09 muestra el resultado de inmunoensayo de FSH más alto en comparación con todas las demás formulaciones.

Tabla 3 Inmunoensaye de hCG durante 1 mes de almacenamiento a 302"C/B515%de HR.

La formulación tos muestra estabilidad superior en comparación con todas las demás formulaciones. La formulación E-09 contiene L-arginina, véase la tabla 2.

: cow j.$%de HR s

■:Fom. ación E-04, E 14 y E 15 exdudas cel ensayo dedeo a odoración)

Tabla 4 Inmunoensayo de FSH después de 3 meses de almacenamiento a 3012'C/65± 5% de HR.

La formulación E-09 muestra la mejor estabilidad en comparación con todas las demás formulaciones. La formulación E-Ü9 contiene L-arginina. véase la tabla 2.

i M I l dela ¡nidal] ,WO Í^Ofií - de HR

(Fonmulac ón E C4. E 14 y E 1 o axdudas del ensayo debido a coloración;

6.2 Estabilidad de formulación líquida de hMG - 3 meses

Del cribado inicial, se cribaron formulaciones adicionales con arginina.

Tabla 5 Estudio de estabilidad de la composición para hMG líquida de 600 UI/ml - Resumen de formulaciones N.° Tampón Tensioactivo Conservante Antioxidante Estabilizante/agente de de tonicidad lote

K-011 Citrato 10 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 1,5 mg/ml de L- 28,0 mg/ml de HCl de L-mM5 pH 6,8 polisorbato 20 cresol metionina arginina

K-02 Fosfato 1 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 1,0 mg/ml de L- 21.0 mg/ml de lactosa mM4 pH 6,8 polisorbato 20 cresol metionina 7.0 mg/ml de NaCl K-03 Citrato 10 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- 25,3 mg/ml de HCl de L-mM5 pH 6,8 poloxámero 188 fenol metionina arginina

K-04 Fosfato 10 0,005 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 1,5 mg/ml de L- 29,3 mg/ml de HCl de L-mM4 pH 6,8 polisorbato 20 cresol metionina arginina

K-052 Citrato 10 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,0 mg/ml de L- 67,4 mg/ml de sacarosa mM5 pH 6,8 poloxámero 188 fenol metionina

K-06 Citrato 10 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 1,0 mg/ml de L- 74,6 mg/ml de sacarosa mM5 pH 6,8 poloxámero 188 cresol metionina

K-073 Citrato 10 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 1,0 mg/ml de L- 38,3 mg/ml de manitol mM5 pH 6,8 poloxámero 188 cresol metionina

K-08 Citrato 10 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,0 mg/ml de L- 34,7 mg/ml de manitol mM5 pH 6,8 poloxámero 188 fenol metionina

K-096 Citrato 10 0,1 mg/ml de 3,0 mg/ml de m- 1,5 mg/ml de L- 20 mg/ml de HCl de L-mM5 pH 6,8 poloxámero 188 cresol metionina arginina

22,1 mg/ml de sacarosa 1 Igual que la formulación E-09 de la tabla 2

2 Igual que la formulación E-12 de la tabla 2

3 Igual que la formulación E-10 de la tabla 2

4 Hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato 10 mM, pH ajustado con ácido fosfórico

5 Citrato de trisodio dihidrato 10 mM, pH ajustado con ácido cítrico

6 La concentración es 530 UI/ml

Tabla G Inmunoensayo de hCG durante2meses de almacenamiento a 25 iz°C/60 i 5% deHR.

Las formulaciones K-01. K-03, K-04 y K-09 muestran estabilidad superior en comparación

con todas las demás formulaciones. La formulación K-01- K-03. K-04 y K-09 contienen

L-aixii nina, véase la tabla 5.__________________________________________________

<hc.'t;>%de la inicial<l * 2° í>± de HR

Muy claramente, las formulaciones que comprenden L-arginina son mucho más estables que las que comprenden diferentes agentes estabilizantes. Compárense, por ejemplo, la formulación K-02 y K-03 después de tres meses.

Tabla? Inmunoensayode FSH durante 3 meses de almacenamiento a15 ±Z'C/SO 5% deHR.

La formulación K-09 muestra el resultado de FSH mas alto en comparación con todas las

demas formulaciones. La formulación K-09 contiene L-arglnina, véase la tabla 5.

i-'Mi [%de la ini 25t> 2'T.WI r SW de HR

Formulación I 1 mes 2 meses 3 meses

K-0J 12 112 ni

(L-wgpni 100

K-02 KM 04 1Q6 K7

K-03 S 120 107

(L-a'gni 100

K-W os 112 112

í L-argini 100

K-05 100 07 116 111

K-OS 100 W í 17 115

K-07 KM 01. 112 104

K-03Í ICIO 07 107 Itw

K-09 12 120 119

:_-argin 100

Los resultados para hCG también se confirman para FSH, compárense, por ejemplo, la formulación K-02 y K-03 después de tres meses.

6.3 Estudios de capacidad tamponante

Los agentes tamponantes, por ejemplo, fosfato de sodio y citrato de sodio son tampones fisiológicamente tolerados y se añaden bastante normalmente para mantener el pH en un intervalo deseado. Se evalúan citrato de trisodio dihidrato e hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato como agentes tamponantes por medio de la capacidad tamponante. La capacidad tamponante se calcula como la cantidad de ácido o base necesaria para mover el pH un grado predefinido, es decir, la cantidad de pl de HCl/NaOH 0,2 N necesaria para mover el pH 1 unidad de pH/l de DP calculada como mequiv. de ácido o base/(litroxunidad de pH) como se explica anteriormente.

Tabla 8 Estudio de capacidad tamponante de la composición - Resumen de formulaciones

N.° Tampón Tensioactivo Conservante Antioxidante Estabilizante/agente de de tonicidad lote

C-01 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM4 pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

C-02 Citrato 5 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM4 mM1 pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

C-03 Citrato 10 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM4 mM1 pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

C-043 Fosfato 1 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,0 mg/ml de L- 31,76 mg/ml de Na2SO4 x 10 mM2 pH 6,5 polisorbato 20 fenol metionina H2O (14 mg/ml de sulfato de sodio)

1 Citrato de trisodio dihidrato

2 Na2HPO4 x 12 H2O 0,8 mM y aprox. H3PO40,2 mM a pH 6,5

3 Placebo de referencia

4 Igual a 25,3 mg/ml de HCl de L-arginina

El resultado de la valoración realizada para determinar la capacidad tamponante se representa en la figura 1. La pendiente de las curvas muestra la capacidad tamponante, por ejemplo, una pendiente pronunciada representa una capacidad tamponante baja. A partir de la figura 1 puede observarse que el lote C-04 (formulación de referencia) tiene la capacidad tamponante más baja. En el área de pH pertinente 6,8 ± 0,3 para hMG, todas las formulaciones de hMG C-01 (sin tampón), C-02 (citrato de trisodio dihidrato 5 mM) y C-03 (citrato de trisodio dihidrato 10 mM) tienen capacidad tamponante similar y una capacidad tamponante mayor que la formulación de referencia que contiene hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato 1 mM. El pH diana para la formulación de referencia es 6,5. Las formulaciones C-01, C-02 y -03 se comparan con la referencia que se sabe que tiene un pH estable. Se han realizado numerosos estudios de estabilidad de la formulación de referencia C-04 sin ningún desplazamiento observado en el pH.

La siguiente tabla 9 muestra los resultados del estudio de capacidad tamponante:

Tabla 9 Estudio de capacidad tamponante. En el área de pH pertinente 6,8 de la formulación para hMG, todas las formulaciones de hMG tienen una capacidad tamponante mayor que la formulación de placebo de referencia.

Sorprendentemente, la capacidad tamponante de la formulación de hMG sin tampón (C-01) es mayor que la formulación de referencia C-04. El componente excipiente principal en la formulación de hMG es L-arginina a una concentración de 120 mM. Los valores de pKa para L-arginina son pKa1 = 2,17; pKa2 = 9,04 y pKa3 = 12,5 (Handbook of Pharmaceutical Excipients. 2015, Pharmaceutical Press, Londres). Es muy inesperado que la arginina muestra suficiente comportamiento tamponante lejos de los valores de pKa.

6.4 Estudios de oxidación

Después de 3 meses de almacenamiento a 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR, la formulación E-09 que contiene L-arginina (véase la tabla 5) ha aumentado el nivel de proteínas oxidadas en un 241 % del valor inicial (véase la tabla 10 a continuación). Esta es una cantidad muy alta y hay casos donde dichas cantidades altas de oxidación no son deseables. Por lo tanto, se realizaron estudios adicionales para investigar si este problema podía superarse.

Hay varias elecciones de antioxidantes que pueden usarse en formulaciones proteínicas. Puede añadirse metionina para evitar la oxidación, mediante un mecanismo propuesto de competición con la oxidación de los residuos de metionina en las proteínas. El resultado de añadir metionina a una formulación que contiene arginina se muestra en la tabla 10. Las formulaciones K-01, K-03, K-04 y K-09 contienen arginina y metionina y el nivel de proteínas oxidadas está clara y ventajosamente reducido. La formulación K-01 (con metionina) es la misma formulación que la formulación E-09 (sin metionina). Comparando estos dos lotes puede observarse que el nivel de proteínas oxidadas se reduce tremendamente por la metionina.

Tabla 10 % de au mentó de protei ñas oxidadas desde las in¡dales d únante 3 meses de

almacenamiento a 30±2°t¡&>±B%deHR.La formulación E-09 contiene arginina y

nada de metionina. La formulación K-01, K-03, K-04 y K-09 condenen arginina y metion¡na,

i Formulación E C4. E J4 y E isexdudasdel ensayo debido a coloración')

En conclusión, estos dos estudios demuestran un efecto tremendamente estabilizante de la arginina y un afecto antioxidante incluso de cantidades bajas de metionina en una formulación de gonadotropinas.

6.5 Estudio de estabilidad DoE

Combinando los resultados de los estudios anteriores, y el estudio de capacidad tamponante, se realizó un estudio DoE para investigar las interacciones entre arginina y metionina y para determinar las concentraciones óptimas de estos dos excipientes.

Tabla 11 Composiciones para estudio de estabilidad DoE para hMG líquida de 600 Ul/ml - Resumen de formulaciones

N.° Tampón2 Tensioactivo Conservante Antioxidante Estabilizante/agente de de isotonicidad lote

D-01 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 80 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

D-02 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 160 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

D-03 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 0,8 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

D-04 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 0,8 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

D-05 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 0,1 mg/ml de L- HCl de L-arginina 160 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

D-06 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 0,1 mg/ml de L- HCl de L-arginina 80 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

D-073 Sin tampón 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM pH 6,8 poloxámero 188 fenol metionina

D-083 Citrato 10 0,1 mg/ml de 5,0 mg/ml de 1,5 mg/ml de L- HCl de L-arginina 120 mM mM1 pH 6,8 poloxámero 188 fenol metionina

1 Citrato de trisodio deshidratado 2 El pH se ajusta con HCl/NaOH 0,2 N para formulaciones sin tampón y NaOH 0,2 N/0,5 M

3 Ácido cítrico monohidrato para formulación con tampón citrato de trisodio dihidrato

Incluidas como formulaciones de referencia

6.5.1 Inmunoensayo de FSH

Los resultados de estabilidad de inmunoensayo de FSH durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR se enumeran en la tabla 12.

Tabla 12 Resultados de inmunoensayo de FSH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR. La descripción completa de todas las formulaciones se enumera en la tabla 11.

FSH [UI/ml] 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR Formulación 1 mes 2 meses 3 mesesD-01 516 468 462

D-02 521 503 478

D-03 511 513 474

D-04 515 490 477

D-05 532 513 473

D-06 518 458 493

D-07 518 482 490

D-08 514 472 481

El cálculo estadístico se realizó para la actividad de FSH [UI/ml] para evaluar la influencia e interacción de arginina y metionina. El resultado de la evaluación estadística confirma que la L-arginina tiene una influencia estadística significativa sobre los resultados de estabilidad del inmunoensayo de FSH. La metionina no tiene influencia estadística significativa sobre los resultados de estabilidad del inmunoensayo de FSH. No hubo interacción estadística significativa entre la arginina y la metionina para este parámetro de respuesta.

6.5.2 Inmunoensayo de hCG

Los resultados de estabilidad de inmunoensayo de hCG durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR se enumeran en la tabla 13.

Tabla 13 Resultados de inmunoensayo de hCG durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR. La descripción completa de todas las formulaciones se enumera en la tabla 11.______________________________ h I ml 2 ° ± 2 ° ± HR

El cálculo estadístico se realizó para la actividad de hCG [UI/ml] para evaluar la influencia e interacción de arginina y metionina. El resultado de la evaluación estadística confirma que la arginina tiene una influencia estadística significativa sobre los resultados de estabilidad del inmunoensayo de hCG. El contenido de metionina tiene una influencia mínima a 25 °C sobre los resultados de estabilidad del inmunoensayo de hCG. Queda claro que sobre una concentración baja (0,1 mg/ml) de metionina no es detectable aumento adicional en la estabilidad aumentando la concentración incluso hasta 1,5 mg/ml. No hubo interacción estadística significativa entre la arginina y la metionina para este parámetro de respuesta.

6.5.3 Proteínas oxidadas

En los estudios de estabilidad anteriores, se observó sorprendentemente que la presencia de arginina tiene un efecto tremendamente estabilizante. Sin embargo, la adición de arginina provocó un nivel aumentado de proteínas oxidadas. Puede añadirse metionina para evitar esta oxidación y este estudio investiga el equilibrio de concentración entre arginina como estabilizante y metionina como antioxidante.

Los resultados de estabilidad de la cantidad de proteínas oxidadas [% de aumento desde la inicial] durante almacenamiento durante 6 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 3 meses a 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR para formulaciones con arginina y metionina (en el intervalo de concentración 0,1 -1,5 mg/ml) se enumeran a continuación. Para comparaciones, se incluye también la formulación E-09 con arginina y sin metionina en la Tabla 14.

Tabla 14 Resultados de proteínas oxidadas durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR. La descripción completa de todas las formulaciones se da en la tabla 11.

A partir de la tabla 14 se observa sorprendentemente que incluso pequeñas cantidades de metionina son suficientes para evitar la oxidación en el intervalo de concentración completo de arginina.

6.5.4 Sumario de DoE

Para concluir y resumir los resultados del DoE, se aplicó el optimizador de respuesta en Minitab, véase la figura 2. La herramienta optimizadora de respuesta de Minitab muestra la manera en que diferentes ajustes de factores experimentales, por ejemplo, concentraciones de arginina y metionina afectan a las respuestas previstas, por ejemplo, el inmunoensayo de FSH [UI/ml] y el inmunoensayo de hCG [UI/ml] para el diseño factorial. El diagrama de optimización muestra el efecto de cada factor (columnas) sobre las respuestas (filas). Las líneas en negrita verticales en el gráfico representan los ajustes actuales del factor. Los números presentados en la parte superior de una columna muestran los ajustes del nivel de factor actuales (en corchetes). Las líneas discontinuas horizontales y los números correspondientes representan las respuestas para el nivel de factor actual. El optimizador de respuesta se basará en resultados a 25 °C. El resultado de aplicar el optimizador de respuesta se representa en la figura 2. La mejor estabilidad (conveniencia de compuesto) se obtiene a altas concentraciones de arginina y bajas concentraciones de metionina.

6.6 Estudio de pH

En el estudio de capacidad tamponante se demostró que no era necesario un agente tamponante en la formulación de hMG, usando solamente arginina para estabilizar el pH en el intervalo de pH deseado.

Para confirmar que el pH se mantiene durante el almacenamiento, se midió durante 6 meses de almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de<h>R y 3 meses a 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR. Los resultados se enumeran en la tabla 15.

El pH diana para todas las formulaciones fue pH 6,8 y el pH de todas las formulaciones fue 6,8 en el punto temporal inicial. El pH fue bastante estable, pero aumentaba ligeramente hasta aproximadamente 6,9 después de 2 meses y mantenía un pH de alrededor de 6,9 hasta 6 meses de almacenamiento. Los resultados de hasta 6 meses de almacenamiento confirman la estabilidad del pH en el intervalo de concentración ensayado de arginina.

Tabla 15 Resultados del estudio de pH

______________________30 °C ± 2 °C/65 ± 5 % 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR

Form Inici 2 mes 3 me 2 meses 3 meses 6 mesesD-01 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9

D-02 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8

D-03 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8

D-04 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8

D-05 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8

D-06 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8

D-07 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8

D-08 6,8 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9

7 Conclusión

Muy sorprendentemente, la capacidad tamponante de la formulación de hMG sin tampón es mayor que la referencia con hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato 1 mM. El componente excipiente principal en la formulación de hMG es arginina. Los valores de pKa para arginina son pKa1 = 2,17; pKa2 = 9,04 y pKa3 = 12,5. Es inesperado que la arginina muestra suficiente comportamiento tamponante lejos de sus valores de pKa. Sin embargo, los resultados muestran claramente que no se necesita agente tamponante adicional en la formulación de hMG en el intervalo de pH actual. La arginina en solitario es suficiente para mantener el pH en el intervalo de pH deseado. La estabilidad del pH se confirmó en el estudio DoE que ensaya un intervalo de concentración de arginina durante 6 meses de almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 3 meses de almacenamiento a 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR que confirmó las observaciones en el estudio de capacidad tamponante.

La adición de arginina a la formulación líquida de hMG de la invención demostró tener un efecto tremendamente estabilizante sobre formulaciones líquidas de hMG. Sin embargo, también se descubrió que la arginina provocaba un nivel alto de proteínas oxidadas. Se demostró que la adición de metionina evitaba la oxidación en comparación con una formulación sin metionina.

Durante 6 meses de almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 3 meses de almacenamiento a 30 ± 2 °C/65 ± 5 % de HR, se demostró que incluso una pequeña concentración de metionina evita la oxidación.

Al concluir los resultados de estos estudios se observa claramente que la adición de arginina es suficiente para mantener el pH al nivel de pH deseado. La adición de arginina estabiliza la formulación de gonadotropina ensayada tremendamente en una formulación líquida. Ningún otro aminoácido, glúcido o sal ensayada mostró un efecto estabilizante similar. El nivel de proteínas oxidadas se aumenta significativamente mediante la adición de arginina, sin embargo, la adición de cantidades incluso bajas de metionina evita la oxidación de las proteínas. Sorprendentemente, incluso cantidades pequeñas de metionina son suficientes para evitar la oxidación independientemente de la concentración de arginina.

Ejemplo 2

Los autores de la presente invención confirmaron además que la presente formulación de la invención ventajosa también sería adecuada para estabilizar la formulación de gonadotropina recombinante respectiva.

Para su aprovechamiento, se prepararon FSH recombinante y hCG recombinante (con las secuencias como se describen anteriormente, respectivamente) de acuerdo con métodos bien conocidos.

Se realizó un estudio de estabilidad acelerado para dos formulaciones, que comprenden rhCG o rFSH, respectivamente, como se describe a continuación.

El sorprendente efecto estabilizante observado de arginina también se ha confirmado en proteínas recombinantes. Se han formulado tanto rFSH como rhCG en 5 mg/ml de fenol, 0,15 mg/ml de L-metionina, HCl de arginina 150 mM, 0,005 mg/ml de polisorbato 20, pH 6,8. Para simplificar el análisis de la estabilidad de las proteínas, rFSH y rhCG se formularon en diferentes recipientes.

Tabla 16:

Esto confirma completamente que la presente formulación de la invención con arginina, pero no tampón adicional, y con una baja cantidad de metionina es adecuada para estabilizar gonadotropinas recombinantes también.

Ejemplo 3

Se realizaron estudios adicionales, en los que se evaluó la siguiente composición:

Tabla 17 Composición de formulación líquida de hMG de 625 Ul/ml

N.2 Tampón1 Tensioactivo Conservante Antioxidante Estabilizante/agente de de tonicidad

lote

J-01 Sin tampón 0,005 mg/ml de 5,0 mg/ml de 0,15 mg/ml de L- HCl de L-arginina 150 mM pH 6,8 polisorbato 20 fenol metionina

1 El pH se ajusta con HCl/NaOH I 0,2 N

Estabilidad de la formulación diana

Al combinar todos los resultados previos, se confirmó la buena estabilidad para la formulación anterior, como sigue:Tabla 18 Inmunoensayo de FSH________________________________________________________________Resultados de estabilidad de inmunoensayo de FSH durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de humedad relativa (HR) y 12 meses a 5 ± 3 °C:

Resultados de inmunoensayo de FSH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR, y 12 meses a 5 ± 3 °C.

FSH [% de la inicial] 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR 5 °C ± 3 °C Formulación Inicial 1 mes 2 meses 3 meses 3 meses 12 mesesJ-01 100 95,2 95,9 98,8 96,8 100,5 Los resultados confirman la estabilidad determinada por inmunoensayo de FSH.

Tabla 19 Inmunoensayo de hCG____________________________________________________________________Los resultados de estabilidad de inmunoensayo de hCG durante almacenamiento durante 1 mes a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR se enumeran en la tabla 19 y 12 meses a 5 ± 3 °C.

Resultados de inmunoensayo de hCG durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C.

hCG [% de la inicial] 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR 5 °C ± 3 °C Formulación Inicial 1 mes 3 meses 12 mesesJ-01 100 88,3 94,1 89,5

Los resultados confirman la estabilidad determinada por inmunoensayo de hCG.

Tabla 20 Proteínas oxidadas

Resultados de estabilidad de la cantidad de proteínas oxidadas [% de aumento desde la inicial] durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C.

Resultados de proteínas oxidadas durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C. Proteínas oxidadas [% de aumento 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR 5 °C ± 3 °C desde la inici l

Formulación 1 mes 2 meses 3 meses 3 meses 12 mesesJ-01 1,8 5,7 7,9 2,6 11

pH

Los resultados de estabilidad de pH durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C muestran un pH estable.

Tabla 21 Resultados de pH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C._______ _____________ pH_____________ 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR 5 °C ± 3 °C Formulación Inicial 1 meses 2 meses 3 meses 3 meses 12 mesesJ-01 6,9 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8

Ejemplo 4

Además de lo anterior, los autores de la presente invención también realizaron un estudio de bioensayo (almacenamiento de 6 meses a 25 °C para los lotes DoE).

Bioensayo de FSH (Steelman-Pohley)

Los resultados del bioensayo de FSH durante almacenamiento durante 6 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR se enumeran en la tabla 22.

Tabla 22 Resultados de bioensayo de FSH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR. La descripción completa de todas las formulaciones se da en la tabla 11._______________________________________________

FSH [% de la potencia indicada (600 UI/ml)] 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR

es

Los resultados confirman la estabilidad determinada por bioensayo de FSH.

Bioensayo de LH (aumento de peso seminal)

Los resultados del bioensayo de LH durante almacenamiento durante 6 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR se enumeran en la tabla 23.

Tabla 23 Resultados de bioensayo de LH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR. La descripción completa de todas las formulaciones se da en la tabla 11._______________________________________________

LH l n i in i Iml 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR es

Los resultados confirman la estabilidad determinada por bioensayo de LH.

Además, la composición del ejemplo 3 también se ensayó en un bioensayo de FSH y LH, con los siguientes resultados: Los resultados de estabilidad del bioensayo de FSH durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C se enumeran en la tabla 24:

Tabla 24: Resultados de bioensayo de FSH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C.

FSH [% de la potencia indicada (625 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR 5 °C ± 3 °C Formulación Inicial 1 mes 2 meses 3 meses 3 meses 12 meses

J-01 94,7 93,6 94,5 97,6 95,8 96,1

Los resultados confirman la estabilidad determinada por bioensayo de FSH.

Los resultados de estabilidad del bioensayo de LH durante almacenamiento durante 3 meses a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C se enumeran en la tabla 25.

Tabla 25 Resultados de bioensayo de LH durante almacenamiento a 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 12 meses a 5 ± 3 °C.

LH [% de la potencia indicada (625 25 °C ± 2 °C/60 ± 5 % de HR 5 °C ± 3 °C Formulación Inicial 1 mes 2 meses 3 meses 3 meses 12 meses

J-01 102,1 102,2 99,0 100,0 101,5 100,0

Los resultados confirman la estabilidad determinada por bioensayo de LH.

8 Abreviaturas y definiciones

BP Farmacopea británica

DoE Diseño del experimento

DS Sustancia farmacéutica

FSH Hormona foliculoestimulante

hCG Coriogonadotropina humana

hMG Gonadotropina menopáusica humana

hMG-HP Gonadotropina menopáusica humana altamente purificada

JP Farmacopea Japonesa

LH Hormona luteinizante

MD Dosis múltiple

NF Vademécum Nacional de Especialidades Farmacéuticas

Ph Eur Farmacopea Europea

PS 20 Polisorbato 20

USP Farmacopea Estadounidense

WFI Agua para inyección

Claims

REIVINDICACIONES

2. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la gonadotropina comprende hCG (coriogonadotropina humana) y opcionalmente FSH y/o LH.

3. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en la que la gonadotropina comprende hMG (gonadotropina menopáusica humana).

4. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la gonadotropina comprende FSH, LH y/o hCG de origen humano, obtenidas de la orina.

5. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la gonadotropina comprende FSH, LH y/o hCG recombinante.

6. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un conservante, preferiblemente fenol.

7. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un agente tensioactivo, preferiblemente un polisorbato, incluso más preferiblemente polisorbato 20.

8. La formulación farmacéutica de la reivindicación 6 o 7, en la que el conservante, preferiblemente el fenol, está comprendido en una cantidad de 4 - 6 mg/ml, preferiblemente en una cantidad de 5 mg/ml.

9. La formulación farmacéutica de la reivindicación 7 u 8, en la que el agente tensioactivo, preferiblemente el polisorbato 20, está comprendido en una cantidad de 0,001 - 0,05 mg/ml, preferiblemente en una cantidad de 0,005 mg/ml.

10. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la arginina es preferiblemente HCl de L-arginina.

11. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la hMG está comprendida en una cantidad de 300 - 900, preferiblemente 500 - 700 UI/ml.

12. Una formulación farmacéutica líquida como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso en un método de tratamiento de la infertilidad.

13. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 12, en la que el tratamiento es un tratamiento de inducción de la ovulación (OI), técnicas de reproducción asistida (ART) y/o hipogonadismo hipogonadotrópico en hombres.

- proporcionar una muestra de orina de una mujer humana,

- extraer la hMG de la muestra,

- preparar dicho extracto con arginina y metionina, en cantidades como se definen en cualquiera de las reivindicaciones precedentes,

- opcionalmente añadir además fenol y polisorbato en cantidades como se definen en cualquiera de las reivindicaciones precedentes,

- ajustar el pH de la formulación entre 6,0 y 7,5,

- en el que no se añade tampón adicional.