PT2219607E

PT2219607E - Formulações líquidas de lh

Info

Publication number: PT2219607E
Application number: PT08844750T
Authority: PT
Inventors: Fabrizio Samaritani; Rita Agostinetto; Alessandra Del Rio; Joel Richard
Original assignee: Merck Serono Sa
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2012-08-31
Also published as: MX2010004639A; IL205105A0; MY153976A; PL2219607T3; KR101513181B1; CN101842083B; CN101842083A; CY1113121T1; BRPI0818324B8; CA2700662C; EP2219607A1; EA019432B1; EP2219607B1; WO2009056569A9; BRPI0818324B1; SI2219607T1; ECSP10010224A; CA2700662A1; RS52566B; UA101484C2

Description

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DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES LÍQUIDAS DE LH"

Campo da Invenção A invenção refere-se ao campo de formulações farmacêuticas liquidas de hormona luteinizante (LH), bem como a métodos de produção de tais formulações.

Antecedentes da Invenção A hormona luteinizante (LH), a hormona estimulante do foliculo (FSH) e a gonadotrofina coriónica (CG) são proteínas injetáveis recaindo na classe das gonadotrofinas. A LH, FSH e CG são utilizadas isoladamente e em combinação no tratamento de infertilidade e de distúrbios reprodutivos em pacientes tanto do sexo feminino como masculino.

Na natureza, a FSH e a LH são produzidas pela glândula pituitária. Para utilização farmacêutica, a FSH e LH e suas variantes podem ser produzidas de forma recombinante (rFSH e rLH), ou podem ser produzidas a partir da urina de mulheres na pós-menopausa (uFSH e uLH). A FSH é utilizada em pacientes do sexo feminino na indução de ovulação (10) e em hiperestimulação dos ovários controlada (HOC) para tecnologias de reprodução assistida (TRA) . Num regime de tratamento típico para indução de ovulação, são administradas a uma paciente injeções diárias de FSH ou de uma variante de FSH (cerca de 75 a 300 UI de FSH/dia) durante um período de desde cerca de 6 a cerca de 12 dias. Num regime de tratamento típico para hiperestimulação dos ovários controlada, são administradas a uma paciente injeções diárias de FSH ou de uma variante 2 de FSH (cerca de 150-600 UI de FSH/dia) durante um período de cerca de 6 a cerca de 12 dias. A FSH é também utilizada para induzir espermatogénese em homens sofrendo de oligospermia. Um regime utilizando 150 UI de FSH 3 vezes por semana em combinação com 2500 UI de hCG duas vezes por semana tem sido bem-sucedido no alcance de uma melhoria na contagem de espermatozóides em homens sofrendo de hipogonadismo hipogonadotrófico (Burguês et al., 1997) . A LH é utilizada em pacientes do sexo feminino, em combinação com FSH em IO e HOC, particularmente nas pacientes com níveis muito baixos de LH endógena ou resistência a LH, tais como mulheres sofrendo de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH, grupo I da OMS) ou pacientes mais velhas (i.e., com 35 anos ou mais) e pacientes nas quais o problema é a implantação do embrião ou o aborto precoce. A LH, em combinação com a FSH, tem estado tradicionalmente disponível numa preparação denominada gonadotrofinas da menopausa humana (hMG), extraída a partir de urina de mulheres na pós-menopausa. A hMG tem uma razão 1:1 de atividade de FSH:LH. A CG atua no mesmo receptor que a LH e desencadeia as mesmas respostas. A CG tem uma semivida em circulação mais longa do que a LH e é portanto vulgarmente utilizada como uma fonte de atividade de LH de ação prolongada. A CG é utilizada em regimes de IO e HOC para imitar o pico de LH natural e desencadear a ovulação. Uma injeção de gonadotrofina coriónica humana (hCG) é utilizada para desencadear a ovulação no final da estimulação com FSH ou uma mistura de FSH e LH. A CG pode também ser utilizada em 3 conjunto com FSH durante a estimulação para 10 e HOC, para proporcionar atividade de LH durante a estimulação em pacientes nas quais a atividade de LH é desejável, tais como as mencionadas acima. A FSH, LH e CG são membros da familia das hormonas glicoproteicas heterodiméricas que também inclui a hormona estimulante da tiroide (TSH). Os membros desta família são heterodímeros, compreendendo uma subunidade <x e uma β. As subunidades são mantidas juntas através de interações não covalentes. 0 heterodímero da FSH humana (hFSH) consiste em (i) uma subunidade alfa da glicoproteína de 92 aminoácidos madura, que também é comum aos outros membros da família humana (i.e., gonadotrofina coriónica ("CG"), hormona luteinizante ("LH") e hormona estimulante da tiroide ("TSH"), e (ii) uma subunidade beta de 111 aminoácidos madura que é única para FSH (Shome et al., 1974 e 1988.). 0 heterodímero da LH humana consiste em (i) a subunidade alfa da glicoproteína de 92 aminoácidos madura, e (ii) a subunidade beta de 112 aminoácidos madura que é única para LH (Keutmann et al., 1979; Talmadge et al., 1984; Fiddes e Talmadge, 1984) . As subunidades alfa e beta das glicoproteínas podem ter tendência para se dissociar em formulações devido à interação com um conservante, tensioativo e outros excipientes. A dissociação das subunidades leva à perda de atividade biológica (Reichert e Ramsey, 1975). A FSH é formulada para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . A FSH é fornecida na forma liofilizada (sólida) em frascos ou ampolas de 75 Ul/frasco e 150 Ul/frasco com uma validade de cerca de dois anos quando armazenadas a 2-25°C. Uma solução para injeção é formada 4 através de reconstituição do produto liofilizado com água para injeção (API) . Para indução de ovulação ou hiperestimulação dos ovários controlada, são recomendadas injeções diárias com doses iniciais de 75 UI a 600 UI durante até cerca de dez dias. Dependendo da resposta da paciente, podem ser utilizados até três ciclos de tratamento com doses crescentes de FSH. Com formulações liofilizadas, é necessário que a paciente reconstitua um novo frasco de material liofilizado com diluente e o administre imediatamente após a reconstituição numa base diária (Bula N1700101 A, publicada em Fevereiro de 1996, para Fertinex™ (urofolitropina para injeção, purificada) para injeção subcutânea, por Serono Laboratories, Inc., Randolph, MA). A FSH foi também formulada em formatos líquidos tanto de dose única como multidose, em frascos ou ampolas. Os formatos de dose única devem permanecer estáveis e ativos em armazenamento antes da utilização.

Os formatos multidose têm de não só permanecer estáveis e ativos em armazenamento antes da utilização, como também manter-se estáveis, ativos e relativamente livres de bactérias ao longo do período de administração de múltiplos dias, após o selo da ampola ter ficado comprometido. Por esta razão, os formatos de multidose contêm geralmente um agente bacteriostático. A LH é formulada para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . A LH é fornecida na forma liofilizada (sólida) em frascos ou ampolas de 75 Ul/frasco com uma validade de cerca de dois anos quando armazenada a 2-25°C. Uma solução para injeção é formada através de 5 reconstituição do produto liofilizado com água para injeção (API). Para indução de ovulação ou hiperestimulação dos ovários controlada, em conjunto com FSH, são recomendadas injeções diárias com doses iniciais de 75 UI a 600 UI de LH durante até cerca de 10 dias. A EP 0 618 808 (Applied Research Systems ARS Holding NV) divulga uma composição farmacêutica compreendendo uma mistura intima sólida de gonadotrofina e uma quantidade estabilizante de sacarose sozinha ou em combinação com glicina. A EP 0 814 841 (Applied Research Systems ARS Holding NV) divulga uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo gonadotrofina coriónica humana recombinante (hCG) e uma quantidade estabilizante de manitol. WO 2004/087213 (Ares Trading SA) divulga uma composição farmacêutica líquida e uma liofilizada compreendendo hormona estimulante do folículo (FSH) ou uma variante sua e/ou da hormona luteinizante (LH) ou uma variante sua, bem como um tensioativo selecionado a partir de Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 e Pluronic F68. WO 2004/112826 (Ares Trading SA) divulga uma formulação liofilizada compreendendo hormona estimulante do folículo (FSH) ou uma variante sua e hormona luteinizante (LH) ou uma variante sua, bem como um tensioativo selecionado a partir de um polissorbato incluindo Tween 20, Tween 40 e Tween 80. WO 00/04913 (Eli Lilly and Co.) divulga uma formulação compreendendo FSH ou uma variante de FSH, contendo uma 6 subunidade alfa e beta, e um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzilico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo e semelhantes) , cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas destes num diluente aquoso.

A EP 0 448 146 (AKZO NV) divulga um liofilizado estabilizado contendo gonadotrofina compreendendo uma gonadotrofina e uma quantidade estabilizante de um sal de ácido dicarboxilico. A EP 0 853 945 (Akzo Nobel NV) divulga uma formulação liquida contendo gonadotrofina caracterizada por a formulação compreender uma gonadotrofina e quantidades estabilizantes de um ácido policarboxílico ou um sal deste e de um composto tioéter.

Continua a existir a necessidade de formulações liquidas estáveis de LH ou de uma variante de LH para administração em dose única ou em multidose.

Sumário da Invenção É um objetivo da invenção proporcionar formulações liquidas de LH ou de uma variante de LH, métodos para a sua preparação, e métodos para a sua utilização farmacêutica ou veterinária no tratamento de distúrbios de fertilidade. 7

Num primeiro aspeto, a invenção proporciona uma formulação liquida de LH ou de uma variante de LH compreendendo uma preparação purificada de LH ou de uma variante de LH, um tampão fosfato e uma quantidade estabilizante de arginina ou de sais seus e/ou lisina ou sais seus, de acordo com a reivindicação 1.

Num segundo aspeto, a invenção proporciona um processo para a preparação de uma formulação liquida de LH ou de uma variante de LH compreendendo os passos de a) formação de uma solução de LH ou variante de LH, e b) adição à referida solução de uma quantidade estabilizante de arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus, e tampão fosfato, de acordo com a reivindicação 23.

Num terceiro aspeto, a invenção proporciona uma forma de apresentação de uma formulação líquida de LH ou variante de LH compreendendo a formulação líquida de acordo com a invenção, hermeticamente selada sob condições estéreis num recipiente adequado para armazenamento antes da utilização de acordo com a reivindicação 22. 0 recipiente pode ser uma ampola, um frasco, uma seringa, ou um cartucho.

Num quarto aspeto, a invenção proporciona um artigo de fabrico para utilização farmacêutica humana, compreendendo material de embalamento e um recipiente compreendendo a formulação líquida de LH ou variante de LH de acordo com a invenção e um agente bacteriostático, em que o referido material de embalamento compreende uma etiqueta que indica que tal formulação pode ser mantida ao longo de um período de vinte e oito dias ou mais após a primeira utilização. É um outro objetivo da invenção proporcionar a utilização de uma formulação liquida de LH ou variante de LH de acordo com a invenção em combinação com formulações liquidas de FSH ou variante de FSH, de acordo com a reivindicação 26.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a comparação de perfis cromatográficos (através de SE-HPLC) de formulações de r-hLH com diferentes concentrações (6, 12 e 24 pg/mL de r-hLH), recipientes (seringa e cartucho) e volumes de enchimento (0,25, 0,5 e 1 mL) . Estas formulações, para além de r-hLH, contêm tampão fosfato, sacarose, Tween 20, metionina, álcool benzilico, cloreto de benzalcónio e água para injeção. As linhas ponteadas correspondem a um volume de enchimento de 0,25 mL; as linhas tracejadas correspondem a um volume de enchimento de 0,5 mL, e as linhas pretas a um volume de enchimento de 1 mL. (A) 6 pg/mL de formulação de r-hLH em seringa. (B) 6 pg/mL de formulação de r-hLH em cartucho. (C) 12 pg/mL de formulação de r-hLH em seringa. (D) 12 pg/mL de formulação r-hLH em cartucho. (E) 24 pg/mL de formulação de r-hLH em seringa. (F) 24 pg/mL de formulação de r-hLH em cartucho. Os picos a um tempo de retenção de 8,5 minutos correspondem aos heterodimeros intactos (subunidades alfa+beta ligadas através de uma ligação não covalente), enquanto os picos a um tempo de retenção mais elevado (cerca de 9,5 minutos) correspondem às subunidades livres. UA: unidade de absorvância. A Figura 2 mostra a comparação da percentagem de heterodimeros calculada através de SE-HPLC na formulação com e sem a combinação de agentes bacteriostáticos, respetivamente SAC/500/24pgABCL cart e SAC/500/24pg cart. 9 (A) SE-HPLC realizada após três dias (3d) com armazenamento a +40°C. (B) SE-HPLC realizada após oito dias (8d), quatro semanas (4s), seis semanas (6s), oito semanas (8s) e treze semanas (13s) com armazenamento a +33°C.

Descrição Detalhada da Invenção

As formulações líquidas de LH da presente invenção têm propriedades ou estabilidade melhoradas ou mais adequadas, e são úteis para tratamento de infertilidade em mulheres e/ou homens.

Numa forma de realização preferida, as formulações líquidas da invenção são para injeção subcutânea e/ou intramuscular.

As propriedades ou estabilidade adequadas das formulações líquidas de LH ou variante de LH de acordo com a invenção são obtidas através de prevenção ou redução da perda de atividade ou estabilidade, ou através da melhoria de qualquer aspeto da eficácia ou conveniência de administração, p.ex. através de pelo menos um de modo, frequência, dosagem, conforto, facilidade de utilização e semelhantes.

Hormona luteinizante, ou LH, tal como aqui utilizado, refere-se a LH produzida como uma proteína madura inteira, que inclui, mas não se limita a LH humana ou "hLH", produzida de forma recombinante ou isolada a partir de fontes humanas, tais como a urina de mulheres na pós-menopausa.

Pretende-se que a expressão "variante de LH" englobe as moléculas que diferem na sequência de aminoácidos, no 10 padrão de glicosilação ou na ligação inter-subunidades da LH humana mas que exibem atividade de LH. O termo "atividade" em relação a LH, refere-se à capacidade de uma formulação de LH ou de uma formulação mista, para desencadear respostas biológicas associadas a LH, tais como o método de ganho de peso de vesículas seminais (Hell Van et al., 1964) . A atividade biológica de LH é avaliada em relação a um padrão aceite para LH. A medida da atividade é expressa em Unidades Internacionais por mililitro de solução (UI/mL) ou em Mega Unidades Internacionais por mililitro de solução (MUI/mL). (1 MUI/mL = 1.000.000 IU/mL). Uma Unidade Internacional é calculada tal como descrito em Research Reference Reagent Note No. 35, publicada pelo National Institute of Health, Bethesda, Maryland. A LH ou variante de LH pode ser produzida através de qualquer método adequado, tal como de forma recombinante, através de isolamento ou purificação a partir de fontes naturais conforme possa ser o caso, ou através de síntese química ou qualquer combinação destas. A utilização do termo "recombinante" refere-se a preparações de LH ou de uma variante de LH que são produzidas através da utilização de tecnologia de ADN recombinante (ver por exemplo WO 85/01958). Um exemplo de um método de expressão de LH utilizando tecnologia recombinante é através de transfecção de células eucarióticas com as sequências de ADN codificando uma subunidade alfa e beta de LH, proporcionadas num vetor ou em dois vetores com cada subunidade possuindo um promotor 11 separado, tal como é descrito nas patentes Europeias nos. EP 0 211 894 e EP 0 487 512.

Outro exemplo da utilização de tecnologia recombinante para produzir LH é através da utilização de recombinação homóloga para inserir um segmento regulador heterólogo em ligação operativa com sequências endógenas codificando as subunidades de LH, como descrito na patente Europeia no. EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV).

Hormona estimulante do foliculo, ou FSH, tal como aqui utilizado refere-se à FSH produzida como uma proteína madura inteira que inclui, mas não se limita a FSH humana ou "hFSH", produzida de forma recombinante ou isolada a partir de fontes humanas, tais como a urina de mulheres na pós-menopausa.

Pretende-se que a expressão "variante de FSH" englobe as moléculas que diferem na sequência de aminoácidos, no padrão de glicosilação ou na ligação inter-subunidades da FSH humana, mas que exibem atividade de FSH. O termo "atividade" em relação a FSH, refere-se à capacidade de uma formulação de FSH ou de uma formulação mista, para desencadear respostas biológicas associadas a FSH, tal como ganho de peso dos ovários no ensaio de Steelman-Pohley (Steelman et ai., 1953), ou crescimento folicular numa paciente. O crescimento folicular numa paciente pode ser avaliado através de ultrassons, por exemplo, em termos do número de folículos possuindo um diâmetro médio de, ou de cerca de, 16 mm no dia 8 de estimulação. A atividade biológica é avaliada em relação a um padrão aceite para FSH. 12

Exemplos de variantes de FSH incluem CTP-FSH, uma FSH recombinante modificada de ação prolongada, consistindo na subunidade α de tipo selvagem e numa subunidade β hibrida em que o péptido carboxi-terminal de hCG foi fundido com o terminal C da subunidade β de FSH, tal como descrito em LaPolt et al. (1992) ou em Klein et al. (2003). Também está incluído CTP-FSH de cadeia simples, uma molécula de cadeia simples, consistindo nas seguintes sequências (do terminal N para o terminal C): 12 βΗΞΗ βΗΟΘ-ΟΤΡ(113-145)

aFSH em que βΗεΗ significa a subunidade β de FSH, βϊιΟΘ-ΟΤΡ (113 — 145) significa o péptido carboxi-terminal de hCG e aFSH significa a subunidade α de FSH, tal como descrito por Klein et al. (2002).

Outros exemplos de variantes de FSH incluem moléculas de FSH possuindo locais de glicosilação adicionais incorporados na subunidade α e/ou β, tal como divulgado em WO 01/58493 (Maxygen), particularmente tal como divulgado nas reivindicações 10 e 11 de WO 01/58493, e moléculas de FSH com ligações S-S intersubunidades, tal como divulgado em WO 98/58957. A FSH ou variante de FSH pode ser produzida através de qualquer método adequado, tal como de forma recombinante, através de isolamento ou purificação a partir de fontes naturais conforme seja o caso, ou através de síntese química, ou através de qualquer combinação destes. 13 A FSH ou variante de FSH utilizada de acordo com a presente invenção pode ser produzida não só através de meios recombinantes, incluindo a partir de células de mamífero, mas também pode ser purificada a partir de outras fontes biológicas, tal como a partir de fontes urinárias. Metodologias aceitáveis incluem as descritas em Hakola et al. (1997), Keene et al. (1989), Cerpa-Poljak et al. (1993), Dias et al. (1994), Flack et al. (1994), Valove et al. (1994), Patente U.S. 3,119,740 e Patente US no. 5,767,067. O termo "administrar" ou "administração" significa introduzir uma formulação da presente invenção no corpo de um paciente em necessidade deste para tratamento de uma doença ou condição. O termo "paciente" significa um mamífero que é tratado para uma doença ou condição. Os pacientes são da, mas não se limitam à, seguinte origem: humana, ovina, suína, equina, bovina, de coelho e semelhantes. O termo "diluente aquoso" refere-se a um solvente líquido que contém água. Os sistemas de solventes aquosos podem ser constituídos unicamente por água, ou podem consistir em água mais um ou mais solventes miscíveis, e podem conter solutos dissolvidos, tais como açúcares, sais, tampões ou outros excipientes. Os solventes não aquosos mais vulgarmente utilizados são os álcoois orgânicos de cadeia curta, tais como, metanol, etanol, propanol, cetonas de cadeia curta, tais como acetona, e poliálcoois, tais como glicerol. 14

Um "agente de isotonicidade" é um composto que é fisiologicamente tolerado e confere uma tonicidade adequada a uma formulação para evitar o fluxo liquido de água através das membranas celulares que estão em contacto com a formulação. Compostos tais como glicerina, são vulgarmente utilizados para esses fins a concentrações conhecidas. Outros agentes de isotonicidade adequados incluem, mas não se limitam a, aminoácidos ou proteínas (p.ex. glicina ou albumina), sais (p.ex. cloreto de sódio), e açúcares (p.ex. dextrose, sacarose e lactose). 0 termo "bacteriostático" ou "agente bacteriostático" refere-se a um composto ou a composições adicionados a uma formulação para atuar como um agente antibacteriano. Uma formulação conservada contendo LH ou variante de LH da presente invenção satisfaz de preferência as normas legais ou reguladoras para eficácia de conservante para ser um produto multiusos comercialmente viável, de preferência em humanos. Exemplos de bacteriostáticos incluem fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzilico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo e semelhantes), cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, desidroacetato de sódio e timerosal. 0 termo "tampão" ou "tampão fisiologicamente aceitável" refere-se a soluções de compostos que se sabe serem seguros para utilização farmacêutica ou veterinária em formulações e que têm o efeito de manter ou controlar o pH da formulação no intervalo de pH desejado para a formulação. Tampões aceitáveis para controlo do pH num pH moderadamente ácido a moderadamente básico incluem, mas não se limitam a, compostos tais como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS, e histidina. "TRIS" refere-se a 2-amino-2- 15 hidroximetil-1,3,-propanodiol, e a qualquer sal seu farmacologicamente aceitável. Os tampões preferidos são tampões fosfato tais como com solução salina ou um sal aceitável. 0 termo "tampão fosfato" refere-se a soluções contendo ácido fosfórico ou sais seus, ajustado a um pH desejado. Geralmente os tampões fosfato são preparados a partir de ácido fosfórico, ou um sal de ácido fosfórico, incluindo, mas não se limitando a sais de sódio e de potássio. Vários sais de ácido fosfórico são conhecidos na técnica, tais como sais de sódio e potássio monobásicos, dibásicos, e tribásicos do ácido. Sabe-se também que os sais de ácido fosfórico ocorrem como hidratos do sal que ocorre. Os tampões fosfato podem cobrir um intervalo de pH, tal como de cerca de pH 4 a cerca de pH 10, e intervalos preferidos de cerca de pH 5 a cerca de pH 9, e um intervalo mais preferido de, ou cerca de, 7,5 a, ou cerca de, 8,5, de maior preferência de, ou cerca de, pH 8,0. 0 termo "frasco" ou "recipiente" refere-se amplamente a um reservatório adequado para a retenção de LH e diluente num estado estéril contido. Exemplos de um frasco tal como aqui utilizado incluem ampolas, cartuchos, pacotes de bolhas, ou outros recipientes adequados para a distribuição de LH ao paciente através de seringa, bomba (incluindo osmótica), cateter, adesivo transdérmico, spray pulmonar ou transmucosa. Os frascos adequados para produtos de embalamento para administração parentérica, pulmonar, transmucosa ou transdérmica são bem conhecidos e reconhecidos na técnica. 16 0 termo "estabilidade" refere-se à estabilidade fisica, quimica e de conformação da LH nas formulações da presente invenção (incluindo manutenção da atividade biológica). A instabilidade de uma formulação proteica pode ser causada por degradação quimica ou agregação das moléculas proteicas para formar polímeros de ordem superior, através de dissociação dos heterodimeros em monómeros, desglicosilação, modificação da glicosilação, oxidação (particularmente da subunidade a) ou qualquer outra modificação estrutural que reduza pelo menos uma atividade biológica de um polipéptido de LH incluido na presente invenção.

Uma solução ou formulação "estável", é uma em que o grau de degradação, modificação, agregação, perda de atividade biológica e semelhantes, de proteínas ai existentes é aceitavelmente controlada, e não aumenta inaceitavelmente com o tempo. De preferência, a formulação mantém pelo menos, ou cerca de, 80% da atividade de LH marcada ao longo de um periodo de 6 meses a uma temperatura de, ou cerca de, 1-10°C, de maior preferência de, ou cerca de, 2-8°C, ainda de preferência de, ou cerca de, 4-5°C. A atividade de LH pode ser medida utilizando o bioensaio de ganho de peso da vesícula seminal6. 0 termo "tratamento" refere-se à administração, ao acompanhamento, à gestão e/ou aos cuidados a um paciente para o qual a administração de LH é desejável para o fim de estimulação do folículo ou dos testículos ou qualquer outra resposta fisiológica regulada por LH. O tratamento pode assim incluir, mas não se limita a, administração de LH para a indução ou o melhoramento da qualidade do esperma, estimulação da libertação de testosterona no sexo 17 masculino, ou desenvolvimento folicular ou para indução da ovulação no sexo feminino. A expressão "utilização multidose" pretende incluir a utilização de uma única ampola, frasco, ou cartucho de uma formulação de LH para mais do que uma injeção, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais injeções. As injeções são de preferência feitas ao longo de um periodo de pelo menos, ou cerca de, 12 horas, 24 horas, 48 horas, etc., de preferência até um periodo de, ou cerca de, 28 dias. As injeções podem ser espaçadas no tempo, por exemplo, por um periodo de 6, 12, 24, 48 ou 72 horas.

Um "sal" de uma proteína é um sal de adição ácida ou básica. Tais sais são de preferência formados entre qualquer um ou mais dos grupos carregados na proteína e qualquer um ou mais catiões ou aniões fisiologicamente aceitáveis, não tóxicos. Sais orgânicos e inorgânicos incluem, por exemplo, os preparados a partir de ácidos tais como clorídrico, sulfúrico, sulfónico, tartárico, fumárico, bromídrico, glicólico, cítrico, maleico, fosfórico, succínico, acético, nítrico, benzóico, ascórbico, p-toluenossulfónico, benzenossulfónico, naftalenossulfónico, propiónico, carbónico, e semelhantes, ou por exemplo, de amónio, sódio, potássio, cálcio, ou magnésio.

Verificou-se que um aminoácido selecionado a partir do grupo de arginina, lisina ou uma mistura ou um sal seu é um agente estabilizante adequado para a preparação de uma formulação líquida estável compreendendo LH. Portanto, o primeiro aspeto da invenção refere-se a uma formulação líquida de gonadotrofina contendo hormona luteinizante (LH) ou uma variante sua caracterizado por a referida formulação 18 compreender uma quantidade estabilizante de arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus. A concentração de arginina ou sais seus é de 10 mg/mL a 50 mg/mL, de preferência de, ou cerca de, 20 mg/mL a, ou cerca de, 40 mg/mL, mais especialmente de preferência de, ou cerca de, 25 mg/mL a, ou cerca de, 35 mg/mL, de maior preferência de, ou cerca de, 31,5 mg/mL. A concentração de lisina ou sais seus é de 10 mg/mL a 50 mg/mL, de preferência de, ou cerca de, 20 mg/mL a, ou cerca de, 40 mg/mL, mais especialmente de preferência de, ou cerca de, 25 mg/mL a, ou cerca de, 35 mg/mL, mais preferencialmente de, ou cerca de, 28,5 mg/mL. A hormona luteinizante (LH) contida na formulação liquida está de preferência presente a uma concentração de, ou cerca de, 1 a, ou cerca de, 50 pg/mL da formulação total. Numa forma de realização, a hormona luteinizante (LH) está presente a uma concentração de, ou cerca de, 1 a 15 pg/mL da formulação total, em particular quando se pretende para utilização única. Noutra forma de realização, a hormona luteinizante (LH) está presente a uma concentração de, ou cerca de, 15 a 30 pg/mL da formulação total, em particular quando se pretende para utilização múltipla (multidose). A concentração de LH na formulação é de preferência de, ou cerca de, 20 UI/mL a, ou cerca de, 2.000 UI/mL, de maior preferência de, ou cerca de, 50 a, ou cerca de, 1.000 UI/mL, particularmente de preferência de, ou cerca de, 100 UI/mL a, ou cerca de, 600 UI/mL. 19

De preferência, a LH é produzida de forma recombinante, especialmente de preferência é produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO) transfetadas com um vetor ou vetores de expressão compreendendo ADN codificando para a subunidade alfa da glicoproteína humana e a subunidade beta de LH. 0 ADN codificando as subunidades alfa e beta pode estar presente nos mesmos vetores ou diferentes. A LH recombinante tem várias vantagens sobre os seus equivalentes urinários. As técnicas de cultura e isolamento utilizando células recombinantes permitem consistência entre os lotes. Em contraste, a LH urinária varia muito de lote para lote, em caracteristicas tais como pureza, padrão de glicosilação, sialilação e oxidação das subunidades. Devido à maior consistência de lote para lote e pureza da LH recombinante, as hormonas podem ser prontamente identificadas e quantificadas utilizando técnicas tais como focagem isoeléctrica (IEF) . A facilidade com que a LH recombinante pode ser identificada e quantificada permite o enchimento de frascos em massa da hormona (enchimento em massa), em vez de enchimento através de bioensaio.

De preferência, as formulações liquidas da presente invenção têm um tampão, de preferência um tampão fosfato, sendo os contra-iões preferidos iões de sódio ou potássio. Tampões fosfato salinos são bem conhecidos na técnica, tais como solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. As concentrações dos tampões na solução total podem variar entre, ou cerca de, 1 mM, 5 mM, 9,5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, e 50 0 mM. De preferência, a concentração do tampão é de , ou cerca de, 10 mM.

Particularmente preferido é um tampão 10 mM em iões fosfato com um pH de, ou cerca de, 8,0. 20

De preferência, o tampão é ajustado de tal forma que as formulações líquidas da presente invenção tenham um pH entre, ou cerca de, 7,0 e, ou cerca de, 9,0, de preferência de, ou cerca de, 7,5 a, ou cerca de incluindo de cerca de pH 7,8, pH 8,0, e 8,2. A invenção é dirigida a formulações líquidas de LH ou variante de LH que podem ser de dose única ou multidose.

As formulações líquidas de LH da invenção que se destinam a utilização multidose compreendem um agente bacteriostático, tal como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo e semelhantes) , cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, desidroacetato de sódio e timerosal. Os preferidos são o álcool benzílico, fenol, e uma combinação de álcool benzílico e cloreto de benzalcónio. O agente bacteriostático é utilizado numa quantidade que produzirá uma concentração que seja eficaz a manter a formulação essencialmente livre de bactérias (adequada para injeção) ao longo do período de injeção multidose, que pode ser de, ou cerca de, 12 ou 24 horas a, ou cerca de, 12 ou 14 dias, de preferência de, ou cerca de, 6 a, ou cerca de, 28 dias. O agente bacteriostático está de preferência presente numa concentração de, ou cerca de, 0,005 a, ou cerca de, 15 mg/mL, de maior preferência de, ou cerca de, 0,01 a, ou cerca de, 12 mg/mL. O agente bacteriostático está de preferência presente numa concentração de, ou cerca de, 0,1% (massa de bacteriostático/massa de solvente) a, ou cerca de, 2,0%, de maior preferência de, ou cerca de, 0,2% a, ou cerca de, 1,0%. No caso do álcool benzílico, é particularmente preferida uma concentração de 0,9% ou 1,2%. 21

No caso do fenol, é particularmente preferida uma de, ou cerca de, 0,5%. No caso de uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio, é particularmente preferida uma concentração de 0,3% e 0,001%, respetivamente.

De preferência, as formulações da invenção contêm um antioxidante, tal como metionina, bissulfito de sódio, sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisole butilado (BHA). O mais preferido é a metionina. O antioxidante previne a oxidação do LH (particularmente da subunidade a). 0 antioxidante, p.ex. metionina, está de preferência presente a uma concentração de, ou cerca de, 0,01 a, ou cerca de, 5,0 mg/mL, de maior preferência de, ou cerca de, 0,05 a, ou cerca de, 0,5 mg/mL.

De preferência, as formulações da invenção contêm um agente tensioativo. De preferência, o tensioativo é selecionado a partir do grupo de polissorbatos, em particular Tween 20 (monolaurato de sorbitano-polioxietileno (20)), Tween 40 (monopalmitato de sorbitano-polioxietileno (20)) e Tween 80 (monooleato de sorbitano-polioxietileno (20) ) . O mais preferido é o Tween 20, de preferência a uma concentração de, ou cerca de, 0,01 a, ou cerca de, 10 mg/mL.

Numa forma de realização preferida, as formulações da invenção compreendem pelo menos 25 pg/mL de r-hLH, 1,65 mg/mL de Na2HPC>4.2H2O, 0,104 mg/mL de NaBbPCp.tbO, 31,5 mg/mL de monocloridrato de arginina, 0,05 mg/mL de Tween 20, 0,5 mg/mL de metionina e 5 mg/mL de fenol. 22

Noutra forma de realização preferida, as formulações da invenção compreendem pelo menos 25 pg/mL de r-hLH, 1,65 mg/mL de Na2HP04.2H2O, 0,104 mg/mL de Na^PCq.^O, 28,5 mg/mL de monocloridrato de lisina, 0,05 mg/mL de Tween 20, 0,5 mg/mL de metionina e 12 mg/mL de álcool benzilico.

Noutra forma de realização preferida, as formulações da invenção compreendem pelo menos 25 pg/mL de r-hLH, 1,65 mg/mL de Na2HPC>4.2H2O, 0,104 mg/mL de NaH2PC>4.H20, 28,5 mg/mL de monocloridrato de lisina, 0,05 mg/mL de Tween 20, 0,5 mg/mL de metionina, 3 mg/mL de álcool benzilico e 0,01 mg/mL de cloreto de benzalcónio.

Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona uma composição farmacêutica liquida, para utilização multidose, compreendendo LH ou uma variante de LH, um agente estabilizante selecionado a partir do grupo de arginina, lisina ou uma mistura ou um sal destas, e um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio.

Noutra forma de realização preferida, a invenção proporciona um método para o fabrico de uma composição farmacêutica liquida, para utilização multidose, compreendendo a formação de uma solução aquosa de LH ou variante de LH, um agente estabilizante selecionado a partir do grupo de arginina, lisina ou uma mistura ou um sal destas, e um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio, e API (água para injeção) . 23

Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção proporciona um método para o fabrico de uma composição farmacêutica embalada compreendendo o dispensar uma solução compreendendo LH ou variante de LH, um agente estabilizante selecionado a partir do grupo de arginina, lisina ou uma mistura ou um sal destas, e um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio.

Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção proporciona um artigo de fabrico para utilização farmacêutica humana, compreendendo um frasco compreendendo uma solução de LH ou variante de LH, um agente estabilizante selecionado a partir do grupo de arginina, lisina ou uma mistura ou um sal destas, e um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio, e uma etiqueta indicando que tal solução pode ser mantida durante um periodo de, ou cerca de, vinte e quatro horas ou mais após a primeira utilização. De preferência, a etiqueta indica que a solução pode ser mantida até, ou cerca de, 12 ou 14 dias após a primeira utilização.

Antes da primeira utilização, isto é antes do selo do frasco, ampola ou cartucho ter sido quebrado, as formulações da invenção podem ser mantidas durante pelo menos, ou cerca de, 6 meses, 12 meses ou 24 meses. Sob as condições de armazenamento preferidas, antes da primeira utilização, as formulações são mantidas ao abrigo de luz intensa (de preferência no escuro), a temperaturas de, ou cerca de, 2-8°C, de preferência de, ou cerca de, 4-5°C. 24

Tal como observado acima, a invenção proporciona formulações liquidas de LH ou variante de LH para utilização única e utilização multidose, contendo um bacteriostático. As formulações da invenção são adequadas para utilização farmacêutica ou veterinária.

Tal como observado acima, numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um artiqo de fabrico, compreendendo material de embalaqem e um frasco compreendendo uma solução de LH ou variante de LH, um agente estabilizante selecionado a partir do grupo de arginina, lisina ou uma mistura ou um sal destas, um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio, opcionalmente com tampões e/ou outros excipientes, num diluente aquoso, em que o referido material de embalagem compreende uma etiqueta indicando que tal solução pode ser mantida ao longo de um periodo de vinte e quatro horas ou mais após a primeira utilização.

De preferência, as formulações da invenção mantêm pelo menos, ou cerca de, 80% da atividade de LH no momento do embalamento ao longo de um periodo de 24 meses (antes da primeira utilização). A atividade de LH pode ser medida utilizando o bioensaio de ganho de peso da vesícula seminal de rato5.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas através de um processo que compreende a mistura de LH ou uma variante sua com uma quantidade estabilizante de arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus, e, opcionalmente, um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de 25 álcool benzílico e cloreto de benzalcónio como sólidos ou dissolvendo LH ou uma variante sua e uma quantidade estabilizante de arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus, e, opcionalmente, um agente bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio num diluente aquoso. A mistura dos componentes e a sua dissolução num diluente aquoso é realizada utilizando procedimentos de dissolução e de mistura convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de LH ou variante de LH em solução tamponada é combinada com arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus e, opcionalmente, um bacteriostático selecionado a partir de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio numa solução tamponada em quantidades suficientes para proporcionar a proteína, arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus e o bacteriostático opcional nas concentrações desejadas. A solução resultante é então dispensada para frascos, ampolas ou cartuchos. Variações deste processo serão reconhecidas por um vulgar perito na técnica. Por exemplo, a ordem dos componentes adicionados, se são utilizados aditivos adicionais, a temperatura e o pH a que a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meios de administração utilizados.

Numa forma de realização preferida, as formulações da invenção são feitas através de preparação de soluções de reserva individuais de concentração conhecida de todos os componentes da formulação (p.ex. tampão fosfato de sódio, arginina ou sais seus e/ou lisina ou sais seus, Tween 20, metionina, LH), e aliquotando quantidades volumétricas para 26 formar uma "solução-mãe" da mesma composição que a formulação final. A "solução-mãe" é de preferência filtrada através de uma membrana de PDF de 0,22 micrómetros Duropore® (Millipore), para remover microrganismos e são depois dispensadas alíquotas para recipientes individuais, tais como frascos, ampolas ou cartuchos.

As formulações da presente invenção podem ser utilizadas em combinação com formulações compreendendo FSH ou variante de FSH (p.ex. Gonal-F®) .

As formulações da presente invenção podem ser administradas utilizando dispositivos reconhecidos. Exemplos compreendendo estes sistemas de frasco único incluem dispositivos de caneta injetora para distribuição de uma solução tal como EasyJect®, Gonal-F® Pen, Humaject®, NovoPen®, B-D® Pen, AutoPen® e OptiPen®.

Os produtos presentemente reivindicados incluem material de embalagem. O material de embalagem proporciona, para além da informação requerida pelas agências reguladoras, as condições sob as quais o produto pode ser utilizado. Para o produto em solução em frasco único, a etiqueta indica que uma tal solução pode ser armazenada após a primeira utilização durante um período de vinte e quatro horas ou mais, de preferência durante até 12 ou 14 dias. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para utilização do produto farmacêutico humano.

Os exemplos seguintes são proporcionados meramente para ilustrar melhor a preparação das formulações e composições da invenção. O âmbito da invenção não deverá ser entendido como consistindo meramente nos seguintes exemplos. 27

Exemplos

Materiais

Artigo Fabricante r-hLH em Bruto Laboratories Serona SA Monocloridrato de L-arginina Merck código 1.01544 Cloreto de benzalcónio Fluka código 12063 Álcool benzilico Merck código 1.00987 m-Cresol Merck código 8.09691 L-Glicina Merck código 5.00190 Monocloridrato de L-Lisina Merck código 1.05701 Metionina Merck código 1.05707 Fenol Merck código 1.00200 Ácido orto-fosfórico a 85% (Ph Eur, BP, NF) Merck código 1.00563 Hidróxido de sódio Merck código 1.06498 Hidrogeno-fosfato-dissódico di-hidratado Merck código 1.06580 Di-hidrogeno-fosfato de sódio mono-hidratado Merck código 1.06346 Sulfato de sódio anidro Merck código 1.006649 Sorbitol Sigma código S-1876 Sacarose Merck código 1.07653 Trealose Merck código 1.08216 Tween 20 Merck código 8.22184 Água milliQ 0 seguinte estudo avaliou os seguintes parâmetros para um grande número de formulações: 28

Investigação sobre estabilização e/ou agentes bacteriostáticos

- Compatibilidade com formulações de FSH - Compatibilidade com embalagem primária - Perfil de estabilidade após armazenamento

As formulações foram formulações liquidas de monodose e multidose. Os seguintes seis agentes estabilizantes foram avaliados:

Monocloridrato de L-arginina (ARG ou arginina nos exemplos) - Monocloridrato de L-lisina (LYS ou lisina nos exemplos) - Trealose (TRE) - L-glicina (GLY ou glicina nos exemplos) - Sacarose (SAC) - Sorbitol (SOR)

Os seguintes quatro agentes bacteriostáticos foram avaliados para as formulações multidose: - Álcool benzilico (AB) - M-cresol (mCr) - Fenol (Fe) - Combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio (ABCL)

Exemplo 1 - Investigação sobre agentes estabilizantes para formulações monodose

Seis agentes de estabilização (sacarose, arginina, glicina, lisina, sorbitol e trealose) foram testados para distribuir formulações monodose estáveis. As formulações testadas estão resumidas na Tabela 1. 29

Tabela 1. Composição de várias formulações monodose de r-hLH contendo diferentes agentes estabilizantes

Componentes Quantidade/mL SAC/250 ARG/250 GLY/250 LYS/250 SOR/250 TRE/250 r-hLH em bruto 6 pg 6 pg 6 pg 6 pg 6 pg 6 pg Na2HP04.2H20 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2H20 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg Metionina 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg Sacarose 105 mg - - - - - Arginina - 33 mg - - - Glicina - - 23 mg - - - Lisina - - - 2 8 mg - - Sorbitol - - - 56,5 mg - Trealose - - - - - 106 mg API q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL q.s. = quantidade suficiente

Cerca de 40 mL de cada solução foram preparados, filtrados através de uma membrana de 0,22 pm num suporte de aço inoxidável de 22 mL, e armazenados a 2-8°C, +25°C e +40°C em tubos de plástico de 15 mL. As soluções foram testadas quanto ao teor de proteína (através de SE-HPLC), formas oxidadas (através de RP-HPLC), agregados (através de SE-HPLC) e formação de subunidades (qualitativamente, através de SE-HPLC) até 1 mês. Os resultados do painel completo de testes aplicados a este conjunto de formulações são relatados nas Tabelas 2 a 5.

Tabela 2. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +40°C) 30

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres % de agregados T=0 T=ld T=4d T=0 T=ld T=4d T=0 T=ld T=4d SAC/250 96, 37 62,27 50, 61 0,00 33, 71 45, 04 3, 63 4,02 4,36 GLY/250 95,29 56, 55 42,55 0,00 36, 42 54,04 4,71 6, 43 3, 42 ARG/250 95, 82 52, 91 23, 80 0,00 39, 83 71,53 4,18 7,27 4, 68 LYS/250 95, 66 63,26 36,55 0,00 32, 57 59, 85 4,35 4,18 3, 60 SOR/250 95, 55 65, 87 41,57 0,00 29, 64 53, 95 4,45 4,49 4,49 TRE/250 92,73 58,22 42,41 0,00 32, 62 48, 63 7,28 9, 16 8, 97 Τ = tempo; d = dia(s)

Tabela 3. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +25°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres % de agregados T=0 T=7d T=1M T=0 T=7d T=1M T=0 T=7d T=1M SAC/250 96, 37 86, 52 81, 99 0,00 - 12,34 3, 63 13,48 5, 68 GLY/250 95,29 97,41 78,52 0,00 - 18, 64 4,71 2,59 2,84 ARG/250 95, 82 98,01 80,80 0,00 - 16, 15 4,18 2,00 3,06 LYS/250 95, 66 99,20 80,83 0,00 - 17,19 4,35 0,81 1, 99 SOR/250 95,55 80, 53 25, 45 0,00 18,72 72,27 4,45 0,66 1,28 TRE/250 92,73 95,29 74,86 0,00 - 17,24 7,28 4,71 7, 91 M = mês

Tabela 4. % de formas oxidadas através de RP-HPLC

Formulação 12 dias (+40°C) 1 Mês (+25°C) SAC/250 7, 62 21,84 GLY/250 7,46 n. d. ARG/250 6,26 9,59 LYS/250 00 yo 4, 90 31 SOR/250 6, 62 24,58 TRE/250 19, 95 10,45 n.d. = não disponível

Tabela 5. Teor de r-hLH através de SE-HPLC

Formulação T=0 T=ld (+40°C) T=4d (+40°C) T=0 T=1M (+25°C) SAC/250 5,50 4,20 4,50 5,50 5, 40 GLY/250 6, 10 5, 10 5,10 6,10 5, 03 ARG/250 6, 30 6,70 6,40 6, 30 6,33 LYS/250 6, 00 4,80 5, 50 6, 00 6, 02 SOR/250 5,30 4,80 5,10 5, 30 4, 93 TRE/250 5,40 4,80 5,40 5, 40 5,23

Com base nestes resultados, a sacarose, a lisina e a arginina foram selecionadas como os melhores excipientes para continuarem a ser investigados quanto à sua compatibilidade com uma quantidade crescente (250 pg/mL e 500 pg/mL) de metionina como antioxidante. A composição das soluções testadas é relatada na Tabela 6. Deve notar-se que estas soluções foram preparadas ex novo.

Tabela 6. Composição de formulações monodose de r-hLH contendo os agentes estabilizantes selecionados e uma quantidade diferente de metionina

Componentes Quantidade/mL SAC/250 ARG/250 LYS/250 SAC/500 ARG/500 LYS/500 r-hLH em bruto 6 pg 6 pg 6 pg 6 pg 6 pg 6 pg Na2HP04.2H20 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2HzO 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg Metionina 250 pg 250 pg 250 pg 500 pg 500 pg 500 pg 32

Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg Sacarose 105 mg - - 105 mg - - Arginina - 33 mg - - 33 mg - Lisina - - 2 8 mg - 2 8 mg API q. s. para q. s. para q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Cerca de 100 mL de cada solução foram preparados, filtrados através de uma membrana de 0,22 pm de um suporte de aço inoxidável de 22 mL, e enchidos em seringas de 1 mL de vidro para testar também a compatibilidade entre a substância medicamentosa e o recipiente final (seringa de vidro de 1 mL + êmbolo). As seringas foram armazenadas a 2-8°C, +25°C, +33°C e +40°C. A temperatura de armazenamento de +33°C foi introduzida a fim de ter um compromisso entre uma cinética de degradação muito rápida (+40°C) e uma muito baixa (+25°C). As soluções foram testadas quanto ao teor de r-hLH (através de SE-HPLC), formas oxidadas (através de RP-HPLC), agregados (através de SE-HPLC) e formação de subunidades (qualitativamente, através de SE-HPLC) até 2-3 meses. Os resultados do painel completo de teste aplicado às formulações descritas na Tabela 6 são relatados nas Tabelas 7 a 11.

Tabela 7. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +40°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres % de agregados % de heterodimeros T=0 T=4d T=0 T=4d T=0 T=4d T=0 T=13s SAC/250 99, 12 38, 98 - 60,29 0,89 0,74 99, 12 97,96 ARG/250 98,30 9,16 - 90,03 1,70 0,83 98,30 99,23 33 LYS/250 98,59 18,27 - 81,02 1,41 0,72 98,59 9 9,69 SAC/500 99, 34 33, 96 - 64,11 0, 66 1, 93 99, 34 98, 66 ARG/500 98,41 13,49 - 85, 94 1,59 0,57 98,41 99,36 LYS/500 98,72 29, 07 - 69,89 1,22 1,05 98,72 99, 58 s = semanas

Tabela 8. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +33°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres T=0 T=6d T=4 s T=6s T=8 s T=0 T=6d T=4 s T=6s T=8s SAC/250 99,12 69,75 65,46 64,82 n. d. - 29,25 46, 04 32,49 n. d. ARG/250 98,30 65,03 39, 69 37,00 31,37 - 32,20 58,05 61,22 63, 90 LYS/250 98,59 74,96 53, 95 46, 28 43,23 - 23,59 44,42 52,58 55, 09 SAC/500 99,34 71,26 43, 14 27,77 n. d. - 27,12 50, 74 52,34 n. d. ARG/500 98,41 67,04 38,04 32,62 25,34 - 31,14 58,48 65,37 70, 81 LYS/500 98,72 74,03 52,81 49, 17 00 00 co - 24,88 45, 07 49, 04 53,24 Formulação % de agregados T=0 T=6d T=4 s T=6s T=8 s SAC/250 0,89 1,01 n. d. 2,70 n. d. ARG/250 1,70 2,77 2,26 1,79 4,74 LYS/250 1,41 1,45 1, 64 1, 14 1, 69 SAC/500 0, 66 1, 63 19, 90 6, 12 n. d. ARG/500 1,59 1,83 3,48 2,02 3,86 LYS/500 1,22 1,09 2,12 1,79 2,85

Tabela 9. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +25°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres % de agregados T=0 T=4 s T=8s T=0 T=4 s T=8s T=0 T=4 s T=8s SAC/250 99, 12 98,36 76, 81 - - 21,05 0,89 1, 65 2,15 34 ARG/250 98,30 79, 80 73,39 - 17,89 23, 99 1,70 2,32 2, 63 LYS/250 98,59 84,15 77, 60 - 13,78 21,23 1,41 n. d. 1,18 SAC/500 99, 34 n. d. 61,24 - n. d. 33,50 0, 66 n. d. 5,26 ARG/500 98,41 n. d. 69, 45 - n. d. 27, 93 1,59 n. d. 2, 63 LYS/500 98,72 n. d. 78,56 - n. d. 19, 81 1,22 n. d. 1, 64

Tabela 10. % de formas oxidadas através de RP-HPLC

Formulação 4 dias 8 semanas 4 semanas 6 semanas (+40°C) (+25°C) (+33°C) (+33°C) SAC/250 6, 13 7,32 9, 72 20,13 ARG/250 17,37 35,78 39, 12 45, 93 LYS/250 6,29 5, 96 9, 72 7, 02 SAC/500 4, 69 5, 67 6,69 8, 10 ARG/500 5,24 5, 05 8,00 8, 63 LYS/500 3,25 4,02 5,71 6, 84

Tabela 11. Teor de r-hLH através de SE-HPLC

Formulação T=0 T=4 T=8 T=4 T=6 T=8 dias semanas semanas semanas semanas (+40°C) (+25°C) (+33°C) (+33°C) (+33°C) SAC/250 5, 03 3,09 5,09 5,31 4,74 n. d. ARG/250 6, 27 4, 92 6,00 5, 96 5, 63 6,20 LYS/250 5, 90 3,74 5,50 5, 63 5,34 5, 17 SAC/500 5, 00 3,36 4,25 5, 05 n. d. n. d. ARG/500 6, 14 4,54 5,74 5, 83 5,58 5, 84 LYS/500 6, 08 3, 91 5, 61 5,73 5,49 5,48

Com base nestes resultados a sacarose mostrou uma maior compatibilidade com 250 pg/mL de metionina, a lisina com 35 500 μg/mL de metionina e a arginina com ambas as concentrações de metionina.

Exemplo 2 - Compatibilidade de formulações liquidas

monodose de r-hLH com a formulação liquida multidose de FSH

Tendo em vista os resultados divulgados no Exemplo 1, as formulações descritas na Tabela 6 foram misturadas com uma formulação de FSH (i.e. formulação liquida multidose Gonal-F®) e testadas após 24 h de contacto a 25°C de acordo com os métodos abaixo: - RP-HPLC para as formas oxidadas da subunidade cx de r-hFSH e r-hLH (na Tabela 12 sob a % de pureza são relatadas as formas não-oxidadas) - SE-HPLC para a quantificação de agregados - RP-HPLC para o titulo de r-hFSH e r-hLH,

- bioensaio in vivo de r-hFSH e r-hLH SDS-PAGE para quantificação das subunidades livres e agregados de r-hFSH e r-hLH (dados não publicados), - Aspeto visual.

Os resultados são relatados nas Tabelas 12 a 14.

Tabela 12. Pureza através de RP-HPLC e % de agregados através de SE-HPLC

Formulação % de pureza % de agregados T=0 T=24 h T=0 T=24 h SAC/250 98,53 98,61 0,00 0,00 ARG/250 97,29 99, 17 0,00 0,72 LYS/250 97,81 97,73 0,00 0,37 SAC/500 98,50 98,17 0,00 0,39 36 ARG/500 97,75 97,47 0,00 0, 69 LYS/500 97,04 96, 74 0,00 0,33 h = horas

Tabela 13. Teor de FSH e LH

Formulação Teor de r-hFSHx Teor de r-hLH* T=0 T=2 4 h T=0 T=2 4 h SAC/250 16, 14 16, 14 3, 67 3, 61 ARG/250 15,45 16,01 4,15 4,21 LYS/250 15,35 15, 68 4,07 4,15 SAC/500 16,29 16, 91 3,71 3,70 ARG/500 16, 03 15,80 4,15 4,05 LYS/500 15,46 15, 69 4,05 4, 17 *FSH teórico: 200 UI = 15,48 pg/mL; LH teórico 100 UI = 4

μg/mL

Tabela 14. Bioensaio

Formulação Atividade de r-hFSHx Atividade de r-hLH* o II EH T=2 4 h o II EH T=2 4 h SAC/250 174,60 183,70 108,00 109,00

Todas as formulações monodose testadas eram compatíveis com a formulação multidose Gonal-F® uma vez que houve: - Ausência de perda de teor de FSH e LH, - Ausência de oxidação, - Ausência de agregação e dissociação de subunidades livres (através de SDS-PAGE) - Ausência de perda de bioatividade de LH e FSH. 37

Exemplo 3 - Estudo de estabilidade de formulações liquidas monodose

Com base nos resultados dos exemplos anteriores, as formulações descritas na Tabela 6, exceto aquelas contendo arginina, foram preparados a duas concentrações diferentes de r-hLH (6 pg/mL e 12 pg/mL), armazenadas a 2-8°C e +25°C e testadas de acordo com um plano de estabilidade rigoroso e de acordo com os seguintes métodos analíticos:

- RP-HPLC para o teor de LH - RP-HPLC para as formas oxidadas da subunidade α - SDS-PAGE para subunidades livres e agregados - Bioensaio - pH da solução - Aspeto visual

Foi realizada uma análise estatística sobre os resultados de todos os parâmetros que foram identificados como indicadores de estabilidade com o auxilio do software Stabileo 1.1.

Concentração de r-hLH (através de RP-HPLC) após armazenamento a 2-8°C e 25±2°C Não foi observada perda estatisticamente significativa na concentração proteica para as formulações após 6 meses de armazenamento a 2-8°C qualquer que seja a concentração de r-hLH (6 pg/mL e 12 pg/mL) . Uma diminuição comum de 0,4 pg/mês foi observada após 6 meses de armazenamento a 25±2°C.

Bioatividade de r-hLH (bioensaio) após armazenamento a 2-8°C e 25±2°C 38 Não se observou perda relevante na bioatividade para as formulações após 6 meses de armazenamento a 2-8°C e a 25±2°C quaisquer que seja a concentração de r-hLH (6 pg/mL e 12 pg/mL).

% de subunidades e agregados através de SDS-PAGE A percentagem de agregados através de SDS-PAGE permanece abaixo de 2% para ambas as concentrações após 6 meses de armazenamento a 2-8°C e 25°C. A percentagem de subunidades através de SDS-PAGE permanece abaixo de 2% para ambas as concentrações após 6 meses de armazenamento a 2-8°C. Uma diminuição comum de cerca de 5%/mês foi observada após 6 meses de armazenamento a 25°C±2°C.

% de formas oxidadas através de RP-HPLC

Um aumento de cerca de 0,4%/mês foi medido após 6 meses de armazenamento a 2-8°C e um aumento no intervalo de 0,6-1,4%/mês a 25°C±2°C. pH e aparência Não foi observada nenhuma alteração na aparência (cor, clareza, partículas visíveis) nem no pH durante o fabrico e após armazenamento.

Exemplo 4 - Compatibilidade de agentes de estabilização e bacteriostáticos para formulações multidose

Seis agentes estabilizantes (sacarose, arginina, glicina, lisina, sorbitol e trealose) foram testados quanto à 39 39 agentes multidose na Tabela compatibilidade com proporcionar formulações testadas estão resumidas bacteriostáticos para estáveis. As formulações 15.

Tabela 15. Composição de várias formulações multidose de r-hLH contendo diferentes combinações de agentes estabilizantes e bacteriostáticos

Componentes Quantidade/mL SAC/250 AB SAC/250 mCr SAC/250 Fe ARG/250 AB ARG/250 mCr ARG/250 Fe r-hLH em bruto 25 μς 25 ng 25 ng 25 ng 25 ng 25 ng Na2HP04.2HZ0 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2Hz0 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg Metionina 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg Sacarose 105 mg 105 mg 105 mg - - - Arginina - - - 33 mg 33 mg 33 mg Álcool 0,90% - - 0,90% - - Benzilico m-Cresol - 0,30% - - 0,30% - Fenol - - 0,50% - 0,50% API q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para q.s. para 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL Componentes LYS/250 LYS/250 LYS/250 SOR/250 SOR/250 SOR/250 Quantidade/mL AB mCr Fe AB mCr Fe r-hLH em 25 Hg 25 pg 25 Hg 25 pg 25 pg 25 pg bruto Na2HP04.2H20 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2H20 0,104 0,104 0,104 0,104 0,104 0,104 mg mg mg mg mg mg Metionina 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg Lisina 2 8 mg 2 8 mg 28 mg - - - Sorbitol - - - 56,5 mg 56,5 mg 56,5 mg Álcool 0,90% - - 0,90% - - Benzilico 40

m-Cresol - 0,30% - - 0,30% - Fenol - 0, 50% - - 0,50% API q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. para 1 para 1 para 1 para 1 para 1 para 1 mL mL mL mL mL mL Componentes GLY/250 GLY/250 GLY/250 TRE/250 TRE/250 TRE/250 Quantidade/mL AB mCr Fe AB mCr Fe r-hLH em 25 pg 25 pg 25 pg 25 pg 25 pg 25 pg bruto Na2HP04.2H20 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2H20 0,104 0,104 0, 104 0,104 0,104 0,104 mg mg mg mg mg mg Metionina 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg 250 pg Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg Glicina 23 mg 23 mg 23 mg - - - Trealose - - - 106 mg 106 mg 106 mg Álcool 0,90% - - 0,90% - - Benzilico m-Cresol - 0,30% - - 0,30% - Fenol - - 0,50% - - 0,50% API q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. para 1 para 1 para 1 para 1 para 1 para 1 mL mL mL mL mL mL

Cerca de 40 mL de cada solução foram preparados, filtrados através de uma membrana de 0,22 pm e armazenados a 2-8°C, +25°C e +40°C em tubos de plástico de 15 mL. As soluções foram testadas quanto ao teor de proteína (através de HPLC de exclusão de tamanho, SE-HPLC, dados não mostrados), formas oxidadas (através de HPLC de fase reversa, RP-HPLC), agregados (através de SE-HPLC) e formação de subunidades (qualitativamente, através de SE-HPLC) até 1 mês. Os resultados do painel completo de testes aplicados a este conjunto de formulações são relatados nas Tabelas 16 a 18. Todas as soluções contendo m-Cresol (mCr) tornaram-se opalescentes mesmo imediatamente após fabrico, devido a uma 41 incompatibilidade entre o agente bacteriostático e o tensioativo (Tween 20).

Tabela 16. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +40°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres % de agregados T=0 T=ld T=4d T=0 T=ld T=4d T=0 T=ld T=4d SAC/250/mCr 98, 91 89, 61 52, 93 - n. d. 23, 67 1,10 10,38 23, 41 SAC/250/AB 95,50 74,04 51,52 - 22, 65 45,12 4,50 3, 33 3,36 SAC/250/Fe 98,34 74,20 67,13 - 19, 63 23, 71 1, 66 5, 57 9, 17 GLY/250/mCr 97, 95 96, 54 86,76 - 9, 55 n. d. 2,05 3, 14 n. d. GLY/250/AB 96, 08 59, 58 41,59 - 37,82 56,45 3, 92 2, 61 1, 97 GLY/250/Fe 96,49 74,71 86,06 - 20,01 9,22 2,51 5,28 4,73 ARG/250/mCr 97, 94 70,34 44,39 - 28,39 53,33 2,06 1,29 2,29 ARG/250/AB 91,44 35, 99 15, 91 - 58, 99 79, 65 8,57 5, 03 4,45 ARG/250/Fe 95,31 63,27 29, 12 - 33,75 67,18 4, 69 2, 98 3,70 LYS/250/mCr 98, 19 81,57 65, 68 - 17, 99 33, 10 1,81 n. d. 1,22 LYS/250/AB 94,75 47, 94 33, 61 - 48,59 63, 14 5,26 3,48 3,26 LYS/250/Fe 97, 91 72, 68 56, 73 - 26, 18 42,26 2,09 1,16 1,01 SOR/250/mCr 90,46 86, 33 58,78 - n. d. 18,87 9, 55 13, 68 22,36 SOR/250/AB 94,08 62,71 45,27 - 64,17 47,22 5, 93 3, 13 7,52 SOR/250/Fe 94,74 70,58 55,75 - 22,30 32,76 5,26 7,13 11,50 TRE/250/mCr 86, 07 77,26 40, 60 - n. d. 20,87 13, 93 22,74 38,53 TRE/250/AB 94,74 69, 53 42,19 - 21,36 44,22 5,26 9, 12 12,88 TRE/2 5 0/Fe 91, 05 85,29 54,89 - n. d. 24,28 8, 95 14,72 20,83

Tabela 17. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +25°C)

Formulação % de % de % de agregados 42 heterodimeros subunidades livres T=0 T=7d T=1M T=0 T=7d T=1M T=0 T=7d T=1M SAC/250/mCr \—1 OD 53,76 69, 30 - 31,19 15, 13 1,10 14,34 15,57 SAC/250/AB 95,50 95, 04 75, 84 - - 14, 66 4,50 4, 96 9, 50 SAC/250/Fe 98,34 93, 82 85,49 - - - 1, 66 6, 18 14,51 GLY/250/mCr 97, 95 97,00 95,39 - - - 2,05 3, 00 4, 62 GLY/250/AB 96, 08 97, 63 68,21 - - 28,42 3, 92 2,37 2,17 GLY/250/Fe 9 6,49 97,44 93,19 - - - 2,51 2,57 6, 10 ARG/250/mCr 97, 94 98,73 78,33 - - 19, 73 2,06 1,28 1, 94 ARG/250/AB 91,44 97,38 79,79 - - 18, 91 8,57 2, 63 1,31 ARG/2 5 0/Fe 95,31 98,33 82,18 - - 16,59 4, 69 1, 67 1,23 LYS/250/mCr 98, 19 98,28 95,38 - - - 1,81 1,73 4,27 LYS/250/AB 94,75 97,39 82,54 - - 14, 66 5,26 2, 61 2,80 LYS/250/Fe 97, 91 99, 55 98, 61 - - - 2,09 0,46 1,40 SOR/250/mCr 90,46 82, 65 64,24 - - - 9, 55 17,23 35,76 SOR/250/AB 94,08 95, 93 68,59 - - 21, 99 5, 93 4,08 9, 43 SOR/250/Fe 94,74 92,55 81, 96 - - - 5,26 7,46 18,05 TRE/250/mCr co o 75,78 45, 61 - - - 13, 93 24,23 54,40 TRE/250/AB 94,74 91,22 67,28 - - 13,75 5,26 8,79 18, 97 TRE/2 5 0/Fe 91, 05 84,53 66,79 - - - 8, 95 15,47 33,22

Tabela 18. % de formas oxidadas através de RP-HPLC

Formulação 12 dias (+40°C) 1 Mês (+25°C) SAC/250/mCr 51,14 16, 62 SAC/250/AB 14,07 8,83 SAC/250/Fe 25,55 17,54 GLY/250/mCr 59,29 5,43 GLY/250/AB 10,53 4,44 GLY/250/Fe 34,86 16,06 ARG/250/mCr 65,27 3, 13 43 ARG/250/AB 7,12 5, 65 ARG/250/Fe 15,49 11,27 LYS/250/mCr 44,05 16,36 LYS/250/AB 13, 69 9, 30 LYS/250/Fe 56,55 17,86 SOR/250/mCr 58,29 25, 68 SOR/250/AB 13,51 8,49 SOR/250/Fe 30,78 17,75 TRE/250/mCr 45, 84 26, 36 TRE/250/AB 19,12 11,41 TRE/250/Fe 23,87 27,76

Com base nestes resultados, a sacarose, a lisina e a arginina foram selecionadas como os melhores agentes estabilizantes para continuarem a ser investigadas quanto à sua compatibilidade com uma quantidade maior de metionina (500 pg/mL). O álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio foram selecionados como agentes bacteriostáticos. As formulações testadas estão resumidas na Tabela 19.

Tabela 19. Composição de várias formulações multidose de r-hLH contendo os agentes estabilizantes selecionados e diferentes agentes bacteriostáticos

Componentes Quantidade/mL SAC/500 AB SAC/500 ABCL SAC/500 Fe ARG/500 AB ARG/500 ABCL ARG/500 Fe r-hLH em bruto 25 μς 25 ug 25 yg 25 pg 25 μg 25 μg Na2HP04.2H20 1, 65 mg 1, 65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2H20 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg Metionina 500 pg 500 pg 500 pg 500 pg 500 pg 500 pg Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg 50 pg Sacarose 105 mg 105 mg 105 mg - - Arginina - - - 33 mg 33 mg 33 mg 44

Álcool Benzílico 1,2% 0,30% - 1,2% 0,30% - Cloreto de Benzalcónio 0,001% 0,001% Fenol - - 0,50% - - 0,50% API q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL Componentes Quantidade/mL LYS/500/AB LYS/500/ABCL LYS/500/Fe r-hLH em bruto 25 μg 25 pg 25 pg Na2HP04.2H20 1,65 mg 1,65 mg 1,65 mg NaH2P04.2H20 0,104 mg 0,104 mg 0,104 mg Metionina 500 pg 500 pg 500 pg Tween 20 50 pg 50 pg 50 pg Lisina 28 mg 28 mg 28 mg Álcool Benzílico 1,2% 0,30% - Cloreto de Benzalcónio 0,001% Fenol - - 0,50% API q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL q.s. para 1 mL

Cerca de 100 mL de cada solução foram preparados, filtrados através de uma membrana de 0,22 μιη e enchidos em cartuchos de 3 mL. Foi utilizada a seguinte embalagem primária:

Cartuchos de vidro de 3 mL (Nuova Ompi) siliconizados Tampas metálicas código CAP J 3ML L1H075-1-H1-B FM 257/2 (Helvoet Pharma) Êmbolos revestidos: Helvoet V9282 FM257/2 Omniflex revestidos.

Os cartuchos foram armazenados a 2-8°C, +25°C e 40°C para serem testados quanto ao teor de proteina (através de SE-HPLC), formas oxidadas (através de RH-HPLC), agregados (através de SE-HPLC) e formação de subunidades (qualitativamente, através de SE-HPLC) até 2 meses. 45

Os resultados do painel completo de testes aplicados a este segundo conjunto de formulações são relatados nas Tabelas 20-26.

Tabela 20. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +40°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades % de agregados livres T=0 T=3 dias T=0 T=3 dias T=0 T=3 dias SAC/500/AB 100,00 60,01 - 39,55 - 0,44 SAC/500/ABCL 100,00 67,39 - 32,34 - 0,27 SAC/500/Fe 99, 66 65,01 - 31,27 0,34 3,72 ARG/500/AB 99, 91 45, 63 - 54,65 0,10 - ARG/500/ABCL 99, 93 44, 67 - 55,33 0,07 - ARG/500/Fe 99, 93 61,97 - 38,03 0,08 - LYS/500/AB 99, 93 61,71 - 38,30 0,08 - LYS/500/ABCL 99, 95 61,33 - 38,68 0,06 - LYS/500/Fe 99, 93 76,03 - 23,59 0,08 0,39

Tabela 21. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +33°C)

Formulação % de heterodimeros % de subunidades livres % de agregados T=0 T=3s T=4s T=8s T=0 T3s T=4s T=0 T=3s SAC/500/AB 100,00 76,56 71,22 59,22 - 22,03 26,35 / 1,43 SAC/500/ABCL 100,00 81,49 78,95 63, 53 - 17,26 20,10 / 1,26 SAC/500/Fe 99, 66 76,24 67,13 51,10 - 14,26 18,03 0,34 9, 51 ARG/500/AB 99, 91 71,90 71,52 61,41 - 27,89 27,73 0,10 0,21 ARG/500/ABCL 99, 93 69,08 66, 86 57,22 - 30,67 32,94 0,07 0,26 ARG/500/Fe 99, 93 86,11 76, 74 75, 51 - 13, 76 22,55 0,08 0,14 LYS/500/AB 99, 93 83,09 76, 72 67,30 - 16, 76 22,50 0,08 0,16 LYS/500/ABCL 99, 95 81,03 75, 21 70,20 - 18,88 24,64 0,06 0,09 LYS/500/Fe 99, 93 87,29 80,51 68,85 - 12,10 18,53 0,08 0,62 46

Tabela 22. Pureza através de SE-HPLC (temperatura de armazenamento: +25°C)

Formulação % heterodímero % subunidades livres % agregados T=0 T=4s T=8s T=0 T=4s T=0 SAC/500/AB 100,00 83, 85 82, 87 - 14,69 - SAC/500/ABCL 100,00 86,30 85,78 - 13,06 - SAC/500/Fe 99, 66 79,35 75,26 - 13,39 0,34 ARG/500/AB 99, 91 82,32 82, 13 - 17,39 0,10 ARG/500/ABCL 99, 93 80,42 80,77 - 19,25 0,07 ARG/500/Fe 99, 93 84,59 80, 95 - 15, 13 0,08 LYS/500/AB 99, 93 85,04 85, 10 - 13,78 0,08 LYS/500/ABCL 99, 95 84,24 86, 22 - 15,42 0,06 LYS/500/Fe 99, 93 85,41 81,22 - 13, 68 0,08

Tabela 23. % de formas oxidadas através de RP-HPLC (temperatura de armazenamento: +33°C)

Formulação 1-3 II o T=3 semanas T=8 semanas T=13 semanas SAC/500/AB 1,12 5,21 4,21 4,26 SAC/500/ABCL 0,90 5,59 4, 90 4,46 SAC/500/Fe 0,99 8,28 6,01 16, 14 ARG/500/AB 0,69 4,52 4,13 2, 65 ARG/500/ABCL 1,13 4,57 3,57 2, 97 ARG/500/Fe 0, 94 4,60 5,24 4,82 LYS/500/AB 1,53 5,71 16,34 8,77 LYS/500/ABCL 1,60 4,49 5, 83 5,70 LYS/500/Fe 0,66 9, 66 34,97 25,51

Tabela 24. % de formas oxidadas através de RP-HPLC (temperatura de armazenamento: +25°C)

Formulação T=0 T=4 semanas T=8 semanas T=13 semanas SAC/500/AB 1,12 2,04 2,19 2,44 SAC/500/ABCL 0,90 2,10 2,31 2,23 SAC/500/Fe 0,99 2,68 5,72 7,50 ARG/500/AB 0,69 1,40 1,61 1, 65 ARG/500/ABCL 1,13 1,46 2,31 1,89 ARG/500/Fe 0, 94 1,31 2,77 2,35 LYS/500/AB 1,53 2,51 3,35 4,73 LYS/500/ABCL 1,60 1,96 3, 14 3,47 LYS/500/Fe 0,66 4,05 11,38 22,52 47

Tabela 25. % de formas oxidadas através de RP-HPLC

Formulação t=o T=13 semanas (+5°C) T=0 T=3 dias (+40°C) SAC/500/AB 1,12 1,11 1,12 1,16 SAC/500/ABCL 0,90 1,29 0,90 1,25 SAC/500/Fe 0,99 2,51 0,99 1,47 ARG/500/AB 0,69 1,03 0,69 0,64 ARG/500/ABCL 1,13 1,16 1,13 1,06 ARG/500/Fe 0,94 2,02 0,94 1,47 LYS/500/AB 1,53 2,03 1,53 1,84 LYS/500/ABCL 1,60 1,56 1,60 1,58 LYS/500/Fe 0,66 n. d. 0,66 3, 10

Tabela 26. Teor de r-hLH através de SE-HPLC

Formulação 1-3 II o T=3d (+40°C) T=3s (+33°C) T=4s (+33°C) T=8s (+33°C) T=4s (+25°C) T=8s (+25°C) SAC/500/AB 20,38 21,70 21,05 22,54 16,47 23,70 18,43 SAC/500/ABCL 21,73 22,06 21,31 22,64 18,77 23, 65 18,10 SAC/500/Fe 21,24 21,49 21,02 22,53 20,71 22,66 17,23 ARG/500/AB 22,23 18,86 19, 52 24,64 16, 14 25,26 17,69 ARG/500/ABCL 22,38 21,48 21,71 23, 52 16, 86 24,18 19,34 ARG/500/Fe 21,34 22,38 20,60 23,09 16, 99 24,41 16,32 LYS/500/AB 20,33 20,93 18,85 22,10 14,93 24,24 17,36 LYS/500/ABCL 23,83 21,78 20,68 23, 44 15, 50 24,07 18,60 LYS/500/Fe 21,34 21,05 20,20 21,89 16, 50 22,99 16, 56

Estes resultados confirmaram a compatibilidade dos agentes estabilizantes com uma quantidade maior de metionina (ver Exemplo 1) . Além disso, os resultados mostraram que os agentes bacteriostáticos são compatíveis com 500 pg/mL de metionina.

Exemplo 5 - Compatibilidade de formulações liquidas

multidose de r-hLH com a formulação liquida multidose de FSH 48

Com base nos resultados do Exemplo 4, as formulações de r-hLH em cartuchos de 3 mL foram misturadas com uma formulação de FSH (i.e. formulação líquida multidose Gonal-F®) e testadas após 24 h de contacto a 25°C de acordo com os métodos abaixo: SE-HPLC para pureza RP-HPLC para título de r-hFSH e r-hLH, RP-HPLC para formas oxidadas da subunidade cx de r-hFSH e r-hLH,

Bioensaio in vivo de r-hFSH e r-hLH SDS-PAGE para quantificação das subunidades livres e aqreqados de r-hFSH e r-hLH (dados não publicados) pH de solução,

Aspeto visual.

Os resultados são relatados nas Tabelas 27 a 29.

Tabela 27. Pureza através de SE-HPLC

Formulação % de heterodimeros % de agregados T=0 T=24 h T=0 T=24 h SAC/500/BA 98,28 98,41 0,30 1,09 SAC/500/ABCL 98,85 99, 66 0,00 0,43 SAC/500/Fe 98,18 97, 68 0,27 0,54 ARG/500/BA 98,31 98, 61 0,28 0,98 ARG/500/ABCL 97,68 98,52 0,33 0,53 ARG/500/Fe 97,89 97, 73 0,44 0,77 LYS/500/BA 97,35 97,51 0,38 1,09 LYS/500/ABCL 97,97 98, 82 0,28 0,81 LYS/500/Fe 98,29 98,40 0,37 1,01 49

Tabela 28. Teor de FSH e LH

Formulação Teor de r-hFSH* Teor de r-hLH# T=0 T=24 h T=0 T=24 h SAC/500/ABCL 29, 50 31,15 7,20 8,31 SAC/500/Fe 30,88 31,28 7,34 7,54 ARG/500/BA 30,46 31,00 8,02 8,44 ARG/500/ABCL 32,23 32, 84 7,12 7,40 ARG/500/Fe 30,07 31,06 7,78 8,05 LYS/500/BA 30,91 32,11 6, 88 7,25 LYS/500/ABCL 28,57 31, 66 6, 64 7,62 LYS/500/Fe 28,75 31, 25 6, 80 7,47

*FSH teórico: 200 UI=30,96 yg/mL; #LH teórico: 100 UI=8 yg/mL

Tabela 29. Bioensaio

Formulação Atividade de r-hFSH Atividade de r-hLH T=0 T=2 4 h T=0 T=2 4 h SAC/500/ABCL 365,7 355,0 227,0 212,7 ARG/500/Fe 387,5 393,0 231,4 243, 0

Todas as formulações multidose testadas são compatíveis com a formulação multidose Gonal-F® uma vez que houve:

Ausência de perda de teor de FSH e LH,

Ausência de oxidação,

Ausência de agregação (através de SE-HPLC)

Ausência de formação de agregados e subunidades através de SDS-PAGE

Ausência de perda de bioatividade de HL e FSH

Exemplo 6 - Compatibilidade com a embalagem primária

Para testar a compatibilidade entre as formulações de r-hLH e os recipientes finais (seringas e cartuchos), um estudo matriz foi posto em prática para testar os seguintes parâmetros:

Efeito da concentração de r-hLH: 6 pg/mL, 12 pg/mL, 24 pg/mL, 50

Efeito do volume de enchimento: 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL,

Tipo de recipiente: seringa de vidro de 1 mL e cartucho de vidro de 3 mL,

Efeito do agente bacteriostático: formulações preparadas com e sem os agentes bacteriostáticos e armazenadas em cartuchos de 3 mL.

Uma formulação (SAC/500/ABCL) foi preparada a diferentes forças de r-hLH e enchida nos recipientes a diferentes volumes de enchimento. Os lotes foram comparados qualitativamente através de SE-HPLC até 1 semana a +33°C. Os resultados são relatados na Figura 1 (A-F). Na Figura 2 (A-B) é comparada a percentagem de heterodimeros através de SE-HPLC na formulação com e sem a combinação de agentes bacteriostáticos. Observando os resultados das Figuras 1 e 2, podem ser tiradas as seguintes conclusões:

Nenhum impacto do recipiente nas formulações a 12 pg/mL e 24 pg/mL

Nenhum impacto do volume de enchimento nas

formulações a 12 pg/mL e 24 g/mL

Efeito positivo da maior concentração na dissociação de subunidades

Nenhuma diferença entre os lotes com ou sem bacteriostáticos A maior estabilidade está relacionada com uma concentração de r-hLH mais elevada.

Exemplo 7 - Estudo de estabilidade de formulações liquidas multidose

Com base nos resultados dos exemplos anteriores, quatro formulações descritas na Tabela 19 (SAC/500/ABCL, LYS/500/AB, LYS/500/ABCL e ARG/500/Fe) foram armazenadas a 51 2-8°C e +25°C e testadas de acordo com um rigoroso plano de estabilidade e de acordo com os seguintes métodos analíticos:

RP-HPLC para teor de LH RP-HPLC para formas oxidadas da subunidade α RP-HPLC para teor de fenol RP-HPLC para teor de cloreto de benzalcónio RP-HPLC para teor de álcool benzílico SDS-PAGE para subunidades livres e agregados

Bioensaio pH da solução

Aspeto visual A quantidade de lisina e arginina nas formulações acima foi ajustada (i.e., monocloridrato de L-lisina a 28,5 mg e monocloridrato de L-arginina a 31,5 mg) para otimizar a isotonicidade das formulações. Uma análise estatística foi realizada sobre os resultados de todos os parâmetros que foram identificados como indicadores de estabilidade com o auxílio do software Stabileo 1,1.

Concentração de r-hLH (através de RP-HPLC) após armazenamento a 2-8°C e 25+2°C Não foi observada perda estatisticamente significativa na concentração proteica para as formulações após 12 meses de armazenamento a 2-8°C. Foi observada uma diminuição comum de 0,4 pg/mês após 6 meses de armazenamento a 25±2°C.

Bioatividade de r-hLH (bioensaio) após armazenamento a 2-8°C e 25±2°C Não foi observada perda relevante na bioatividade para as formulações após 12 meses de armazenamento a 2-8°C e a 25±2°C. 52

% de subunidades e agregados através de SDS-PAGE A percentagem de agregados através de SDS-PAGE permanece abaixo de 2% para todas as formulações após 12 meses de armazenamento a 2-8°C e 25°C. A percentagem de subunidades através de SDS-PAGE aumenta acima de 32% após 6 meses a 25°C para todas as formulações.

% de formas oxidadas através de RP-HPLC SAC/500/ABCL e ARG/500/Fe apresentam o menor aumento de formas oxidadas. pH e aparência Não foi observada nenhuma alteração na aparência (cor, clareza, partículas visiveis) nem no pH durante o fabrico e após armazenamento.

Teor de agentes bacteriostáticos

As quantidades alvo de fenol e álcool benzilico foram detetadas e não foram medidas perdas nos pontos de verificação da estabilidade de 6 meses e 12 meses. Uma quantidade de cloreto de benzalcónio abaixo do alvo (6 pg/mL, em vez de 10 pg/mL) foi medida na formulação SAC/500/ABCL no ponto de verificação da estabilidade de 6 meses.

Eficácia de agentes bacteriostáticos

Os resultados dos testes de eficácia de bacteriostáticos, realizados em T=0 e repetidos após 9 meses nas formulações são relatados nas Tabelas 30 a 33.

Tabela 30. Resultados do teste de eficácia bacteriostática na formulação multidose SAC/500/ABCL 53

Microrganismo Log da redução vs. T=0 T=6 h T=2 4 h T=7 dias T=14 dias T=28 dias Staphylococcus aureus >3 >3 >3 >3 sem redução Pseudomona aeruginosa >3 >3 >3 >3 sem redução Escherichia coli não testado n. t. >3 >3 sem redução Candida albicans n. t. n. t. >3 >3 sem aumento Aspergillus niger n. t. n. t. 1,8 >3 sem aumento

Tabela 31. Resultados do teste de eficácia bacteriostática na formulação multidose LYS/500/ABCL

Microrganismo Log da redução vs. T=0 T=6 h T=24 h T=7 dias T=14 dias T=28 dias Staphylococcus aureus >3 >3 >3 >3 sem redução Pseudomona aeruginosa >3 >3 >3 >3 sem redução Escherichia coli não testado n. t. >3 >3 sem redução Candida albicans n. t. n. t. >3 >3 sem aumento Aspergillus niger n. t. n. t. 3, 3 >3 sem aumento

Tabela 32. Resultados do teste de eficácia bacteriostática na formulação multidose LYS/500/AB

Microrganismo Log da redução vs. T=0 T=6 h T=2 4 h T=7 dias T=14 dias T=28 dias Staphylococcus aureus 1,05 >3 >3 >3 sem redução Pseudomona aeruginosa >3 >3 >3 >3 sem redução Escherichia coli não testado n. t. >3 >3 sem redução Candida albicans n. t. n. t. >3 >3 sem aumento Aspergillus niger n. t. n. t. 3, 3 >3 sem aumento 54

Tabela 33. Resultados do teste de eficácia bacteriostática na formulação multidose ARG/500/Fe

Microrganismo Log da redução vs. T=0 T=6 h T=24 h T=7 dias T=14 dias T=28 dias Staphylococcus aureus 0,73 >3 >3 >3 sem redução Pseudomona aeruginosa >3 >3 >3 >3 sem redução Escherichia coli não testado n. t. >3 >3 sem redução Candida albicans n. t. n. t. >3 >3 sem aumento Aspergillus niger n. t. n. t. >3 >3 sem aumento

As formulações contendo a combinação de álcool benzilico a 0,3% + cloreto de benzalcónio a 0,001%, e sacarose ou lisina (SAC/500/ABCL e LYS/500/ABCL) satisfizeram os Critérios A da European Pharmacopeia, mesmo se a quantidade de cloreto de benzalcónio estava abaixo do alvo (6 pg/mL, em vez de 10 pg/mL) . A formulação contendo fenol a 0,5% (ARG/500/Fe) e a formulação contendo álcool benzilico a 1,2% (LYS/500/AB) satisfizeram os Critérios B da European

Pharmacopeia.

Conclusões

Todas as formulações multidose mostraram um bom perfil de estabilidade após 12 meses de armazenamento a 2-8°C.

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Lisboa, 27 de Agosto de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação líquida contendo hormona luteinizante (LH) ou uma variante sua caracterizada por a referida formulação compreender um tampão fosfato e uma quantidade estabilizante de arginina ou sais seus a uma concentração de 10 a 50 mg/mL e/ou lisina ou sais seus a uma concentração de 10 a 50 mg/mL.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, em que a hormona luteinizante (LH) é hormona luteinizante humana (hLH).

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a hormona luteinizante (LH) é hormona luteinizante humana recombinante (r-hLH).

4. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a hormona luteinizante (LH) é hormona luteinizante humana urinária (u-hLH).

5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a hormona luteinizante (LH) está presente a uma concentração de, ou cerca de, 1 a, ou cerca de, 50 pg/mL.

6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tampão fosfato está presente a uma concentração de 1 a 10 mM.

7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tampão fosfato é de preferência tampão fosfato de sódio. 2

8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um tensioativo.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 8_, em que o tensioativo é Polissorbato 20.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 9_, em que o Polissorbato 20 está presente a uma concentração de 0,01 a 10 mg/mL.

11. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda metionina.

12. Formulação de acordo com a reivindicação 11, em que a metionina está presente a uma concentração de 0,01 a 5,0 mg/mL.

13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um agente bacteriostático.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 13, em que o agente bacteriostático é selecionado a partir de qualquer um de álcool benzilico, fenol, e uma combinação de álcool benzilico e cloreto de benzalcónio.

15. Formulação de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o agente bacteriostático está presente a uma concentração de 0,005 a 15 mg/mL. 3

16. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda água para injeção.

17. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores possuindo um pH no intervalo de 7,5 a 8,5.

18. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo pelo menos 25 pg/mL de r-hLH, 1,65 mg/mL de Na2HP04.2H2O, 0,104 mg/mL de NaH2P04. H20, 31,5 mg/mL de monocloridrato de L- arginina, 0,05 mg/mL de Tween 20, 0,5 mg/mL de metionina e 5 mg/mL de fenol.

19. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 compreendendo pelo menos 25 pg/mL de r-hLH, 1,65 mg/mL de Na2HP04.2H20, 0,104 mg/mL de NaH2P04.H20, 28,5 mg/mL de monocloridrato de lisina, 0,05 mg/mL de Tween 20, 0,5 mg/mL de metionina e 12 mg/mL de álcool benzilico.

20. Formulações de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 compreendendo pelo menos 25 pg/mL de r-hLH, 1,65 mg/mL de Na2HP04.2H20, 0,104 mg/mL de NaH2P04.H20, 28,5 mg/mL de monocloridrato de lisina, 0,05 mg/mL de Tween 20, 0,5 mg/mL de metionina, 3 mg/mL de álcool benzilico e 0,01 mg/mL de cloreto de benzalcónio.

21. Composição farmacêutica compreendendo a formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20. 4

22. Forma de apresentação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 hermeticamente selada sob condições estéreis num recipiente adequado para armazenamento antes da utilização.

23. Processo para a preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, compreendendo a diluição da hormona luteinizante (LH) com uma solução de excipientes.

24. Utilização da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para a preparação de um medicamento.

25. Utilização da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para a preparação de um medicamento para o tratamento da infertilidade nas mulheres e/ou nos homens.

26. Utilização da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 em combinação com uma formulação líquida compreendendo hormona estimulante do folículo (FSH) ou uma variante sua.

27. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para o tratamento de infertilidade nas mulheres e/ou nos homens. Lisboa, 27 de Agosto de 2012