CN101842083B

CN101842083B - Lh液体制剂

Info

Publication number: CN101842083B
Application number: CN2008801145250A
Authority: CN
Inventors: R·阿戈斯蒂内托; F·萨马利塔尼; A·德尔里奥; J·里查德
Original assignee: Merck Serono SA
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2028-10-29
Also published as: ES2393233T3; UA101484C2; JP5551601B2; WO2009056569A9; SI2219607T1; CN101842083A; US20100261649A1; PL2219607T3; US8664369B2; EA201070549A1; MY153976A; AU2008320844B2; AU2008320844A1; WO2009056569A1; EA019432B1; JP2011502968A; KR101513181B1; CA2700662A1; ZA201001907B; BRPI0818324B8

Abstract

本发明涉及单剂量或多剂量给药用的促黄体生成素(LH)的液体药物制剂。

Description

LH液体制剂

发明领域

本发明涉及促黄体生成素(LH)的液体药物制剂领域，也涉及这种制剂的生产方法。

发明背景

促黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和绒毛膜促性腺激素(CG)是可以注射的蛋白质，属于促性腺激素类。LH、FSH和CG单独或联合使用可以治疗不孕症和女性和男性患者的生殖系统疾病。

在自然界中，FSH和LH由垂体产生。作为药物使用的FSH和LH及其变体可以重组制得(rFSH和rLH)，也可以从绝经后妇女的尿液中制得(uFSH和uLH)。

FSH在女性患者中用于促排卵(OI)和控制卵巢过度刺激(COH)，作为一种辅助生殖技术(ART)。经典的促排卵治疗方案是，每天给患者注射FSH或FSH变体(大约75至300IU FSH/天)，持续大约6至12天的时间。经典的控制性卵巢过度刺激的治疗方案是，每天给患者注射FSH或FSH变体(大约150-600IU FSH/天)，持续大约6至12天的时间。

FSH也用于男性少精症患者，可以诱导精子生成。150IU FSH每周三次给药合并2500IU hCG每周二次使用的给药方案已经成功地使男性低促性腺激素型性腺功能减退症患者的精子数量得到提高(Burgues等，1997年)。

LH与FSH联合用于治疗女性OI和COH患者，特别是那些内源性LH水平非常低或对LH具有抗性的患者，比如患有低促性腺激素型性腺功能减退症(HH，WHO第1组)的病人或者年纪稍大的患者(即35岁或以上者)，以及存在胚胎着床或早期流产问题的患者。LH与FSH的联合传统上有一种称为人绝经期促性腺激素(hMG)的制剂，从绝经后妇女的尿液中分离得到。hMG与比例为1∶1的FSH∶LH的活性相当。

CG作用在与LH相同的受体上，引起同样的效应。CG的循环半衰期比LH长，因此，通常作为LH活性的长效来源使用。CG在OI和COH的治疗方案中用来模拟天然LH的峰值水平，诱发排卵。在用FSH或FSH与LH的混合物进行刺激的末期，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)用以诱发排卵。在治疗OI和COH的刺激周期，CG也可以与FSH一起使用，目的是在刺激周期为需要LH的患者提供LH活性，如上所述。

FSH、LH和CG是杂二聚体、糖蛋白激素家族的成员，该家族还包括促甲状腺激素(TSH)。这个家族的成员是包括一个α亚基和一个β亚基的杂二聚体。亚基之间通过非共价作用相互连接。人FSH(hFSH)杂二聚体的组成如下：(1)成熟肽92个氨基酸组成的糖蛋白α亚基，这个亚基为另一个人家族成员(即绒毛膜促性腺激素(“CG”)、促黄体生成素(“LH”)和促甲状腺激素(“TSH”))所共有；(2)成熟肽111个氨基酸组成的β亚基，这是FSH所独有的(Shome等，1974和1988年)。人LH杂二聚体组成如下：(1)成熟肽92个氨基酸组成的糖蛋白α亚基；(2)成熟肽112个氨基酸组成的β亚基，这是LH所独有的(Keutmann等，1979年；Talmadge等，1984年；Fiddes和Talmadge，1984年)。由于与防腐剂、表面活性剂和其他辅料的相互作用，糖蛋白的α和β亚基在制剂中可能容易发生游离。这些亚基的游离会导致生物活性的丧失(Reichert和Ramsey，1975年)。

FSH制成肌肉注射(IM)或皮下注射(SC)制剂。FSH以冻干(固体)形式供应，装在小瓶或安瓿瓶中，75IU/瓶和150IU/瓶，贮存在2-25℃下的保质期约为两年。用注射用水(WFI)将冻干产品重建形成注射溶液。对于诱发排卵和控制卵巢过度刺激，建议每日注射，初始剂量为75IU至600IU，注射至约10天。根据患者的反应，可以使用长达三个治疗周期，FSH剂量递增。使用冻干制剂，患者需要每天向一瓶新的冻干材料中加稀释剂使其复原为溶液，并在复原后迅速给药。[包装说明书N1700101A，1996年2月出版，Fertinex^TM(注射用尿促卵泡素，纯化品)皮下注射剂，SeronoLaboratories，Inc.，Randolph，MA].

FSH也制成单剂量和多剂量液体形式，装于小瓶或安瓿瓶中。单剂量形式在使用前的贮存过程中必须保持稳定并维持活性。

在安瓿密封完成后，多剂量形式不仅必须在使用前的贮存过程中保持稳定并维持活性，而且必须在给药期的几天内保持稳定、维持活性并保持相对无菌。为此，多剂量形式通常包含抑菌剂。

LH制成肌肉注射(IM)或皮下注射(SC)制剂。LH以冻干(固体)形式供应，装在小瓶或安瓿瓶中，75IU/瓶，贮存在2-25℃下的保质期约为两年。用注射用水(WFI)将冻干产品重建形成注射溶液。对于诱发排卵和控制卵巢过度刺激，建议与FSH联合应用，每日注射LH，初始剂量为75IU至600IU，注射至约10天。

EP 0 618 808(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)公开了一种包含促性腺激素和稳定量蔗糖(单独或与甘氨酸组合)的固体均质混合物的药物组合物。

EP 0 814 841(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)公开了一种稳定的液体药物组合物，包含重组人绒毛膜促性腺激素(hCG)和稳定量的甘露醇。

WO 2004/087213(Ares Trading S.A.)公开了一种液体和冻干药物组合物，包含卵泡刺激素(FSH)或其变体，和/或促黄体生成素(LH)或其变体，以及选自

F77、Pluronic F87、Pluronic F88和Pluronic F68的表面活性剂。

WO 2004/112826(Ares Trading S.A.)公开了一种冻干制剂，包含卵泡刺激素(FSH)或其变体，和促黄体生成素(LH)或其变体，以及选自吐温20、吐温40和吐温80等聚山梨醇酯的表面活性剂。

WO 00/04913(Eli Lilly and Co.)公开了一种包含FSH或FSH变体和防腐剂的制剂，其中FSH包含一个α和β亚基，防腐剂选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、羟苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞，或其混合物的水溶性稀释液。

WO 2004/105788(Ferring B.V.)公开了一种由负载在至少一种药学上可接受的载体上的FSH和hCG组成的药物组合物。

EP 0 448 146(AKZO N.V.)公开了一种稳定化的、含促性腺激素的冻干粉针，包含促性腺激素和稳定量的二羧酸盐组成。

EP 0 853 945(Akzo Nobel N.V.)公开了一种含促性腺激素的液体制剂，其特征在于，该制剂包含促性腺激素和稳定量的多聚羧酸或其盐类和硫醚化合物。

对单剂量或多剂量给药用LH或LH变体的稳定液体制剂仍有需求。

发明概述

本发明的目的是提供LH或LH变体的液体制剂，它们的制备方法，以及它们在治疗生育疾病上作为药物或兽药应用的方法。

第一个方面，本发明提供一种LH或LH变体的液体制剂，包含纯化的LH或LH变体制剂，和稳定量的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐。

第二个方面，本发明提供了一种LH或LH变体液体制剂的制备方法，包括的步骤是1)制成LH或LH变体的溶液，和2)在上述溶液中加入稳定量的精氨酸或其盐类和/或赖氨酸或其盐类。

第三个方面，本发明提供一种LH或LH变体液体制剂的成品形式，包含在消毒条件下密封在适合使用前贮存的容器中的本发明所述的液体制剂。容器可以是安瓿瓶、小瓶、注射器或储药器。

第四个方面，本发明提供一种人药用制品，包含包装材料和装有本发明所述LH或LH变体液体制剂的容器以及抗菌剂，其中所述的包装材料包含一个标签，指明这个制剂在第一次使用后可以保存28天或以上的时间。

本发明的另一目的是提供本发明所述的LH或LH变体液体制剂与FSH或FSH变体液体制剂联合使用的用途。

附图简要说明

图1显示了r-hLH制剂在不同浓度(6、12和24μg/ml r-hLH)，不同容器(注射器和储药器)和不同灌装量(0.25、0.5和1ml)情况下的色谱学性质比较(SE-HPLC)。除r-hLH以外，这些制剂还包含磷酸盐缓冲液、蔗糖、吐温20、甲硫氨酸、苯甲醇、苯扎氯铵和注射用水。点线对应于0.25ml的灌装量；短划线对应于0.5ml的灌装量；黑线对应于1ml的灌装量。(A)6μg/ml r-hLH制剂装于注射器中；(B)6μg/ml r-hLH制剂装于储药器中；(C)12μg/ml r-hLH制剂装于注射器中；(D)12μg/ml r-hLH制剂装于储药器中；(E)24μg/ml r-hLH制剂装于注射器中；(F)24μg/ml r-hLH制剂装于储药器中。保留时间在8.5分钟的峰对应于完整的杂二聚体(通过非共价键连接的α+β亚基)，而较高保留时间(大约9.5分钟)的峰对应于游离亚基。AU：吸光单位。

图2比较了合用与不合用抑菌剂的制剂用SE-HPLC法测得的杂二聚体百分比，分别是SAC/500/24μgBACL_cart和SAC/500/24μg_cart。(A)+40℃贮存三天(3d)后测定SE-HPLC；(B)+33℃贮存八天(8d)、四周(4w)、六周(6w)、八周(8w)和十三周(13w)后测定SE-HPLC。

发明详述

本发明的LH液体制剂具有改善的或更合适的性质或稳定性，对女性和/或男性不育症的治疗有用。

在一个优选实施方案中，本发明的液体制剂是皮下注射和/或肌肉注射制剂。

本发明的LH或LH变体液体制剂的合适性质和稳定性，通过防止或减少活性或稳定性的降低，或通过改善任何方面的给药有效性或满意度来获得，例如，通过给药方式、频率、剂量、舒适性、易用性等中的至少一种。

促黄体生成素(LH)，如本文中所使用的，是指作为全长成熟蛋白产生的LH，其中包括但不仅限于人LH或“hLH”，不管是重组产生的还是从人类来源，如绝经后妇女的尿液中分离得到的。

“LH变体”这一表述方式是为了涵盖氨基酸序列、糖基化模式或亚基间的连接与人LH不同，但却表现出LH活性的分子。

术语与LH相关的“活性”，是指LH制剂或混合制剂引发与LH相关的生物反应的能力，例如精囊增重法(Van Hell等，1964年)。LH的生物活性依据认可的LH标准来评价。

活性的测量用每毫升溶液的国际单位数(IU/ml)来表示，或者用每毫升溶液的百万国际单位数(MIU/ml)来表示。(1MIU/ml＝1,000,000IU/ml)。一个国际单位按照国立健康研究院(贝塞斯达，马里兰州)(National Instituteof Health，Bethesda，Maryland)出版的《研究参考试剂说明第35卷》中的描述进行计算。

LH或LH变体可用合适的方法生产，例如重组方法，若可能的话从天然来源中分离或纯化，或化学合成，或它们的任何组合。

术语“重组”用来指通过运用重组DNA技术制得的LH或LH变体的制备(例如见WO 85/01958)。用重组技术表达LH的方法的一个实例是通过用编码LH的α和β亚基的DNA序列(无论提供在一个载体还是两个载体上，每个亚基具有一个单独的启动子)转染真核细胞，如欧洲专利EP 0 211 894和EP 0 487 512所述。

另一个运用重组技术产生LH的例子是运用同源重组技术插入异源的调节片段，可操作性地连接编码LH亚基的内源性序列，如欧洲专利EP 0 505500(Applied Research Systems ARS Holding NV)所述。

卵泡刺激素(FSH)，如本文中所使用的，是指作为全长成熟蛋白产生的FSH，其中包括但不仅限于人FSH或“hFSH”，不管是重组产生的还是从人类来源，如绝经后妇女的尿液中分离得到的。

“FSH变体”这一表述是为了涵盖氨基酸序列、糖基化模式或亚基间的连接与人FSH不同，但却表现出FSH活性的分子。

术语与FSH相关的“活性”，是指FSH制剂或混合制剂引发与FSH相关生物反应的能力，例如Steelman-Pohley测定法中的精囊增重法(Steelman等，1953年)或女性患者的卵泡发育。女性患者的卵泡发育可以用超声来评估，例如，根据在刺激第8天平均直径达到或约为16mm的卵泡数量。FSH的生物活性依据认可的FSH标准来评价。

FSH变体的例子包括CTP-FSH，一种长效修饰的重组FSH，由野生型α-亚基和杂交β-亚基组成，其hCG的羧基末端肽已融合在FSH β-亚基的C-末端，如LaPolt等(1992年)或Klein等(2003年)所述。还包括单链CTP-FSH，它是一个由以下序列(从N-末端到C-末端)组成的单链分子：

βFSH

βhCG-CTP(113-145)

αFSH

其中βFSH表示FSH的β-亚基，βhCG-CTP(113-145)表示hCG的羧基末端肽，αFSH表示FSH的α-亚基，如Klein等(2002年)所述。

FSH变体的其他例子包括具有掺入α-和/或β-亚基的额外糖基化位点的FSH分子，如WO 01/58493(Maxygen)中所公开的，尤其是WO 01/58493中的权利要求10和11所公开的；以及具有亚基间S-S键的FSH分子，如WO98/58957所公开的。

FSH或FSH变体可用任何合适的方法产生，例如重组法，若可能的话从天然来源中分离或纯化，或化学合成，或它们的任一组合。

本发明所使用的FSH或FSH变体不仅可以用包括从哺乳动物细胞重组的方法制备，还可以从其他生物来源纯化得到，例如来自尿液来源。可接受的方法包括以下文献中所述，Hakola等(1997年)，Keene等(1989年)，Cerpa-Poljak等(1993年)，Dias等(1994年)；Flack等(1994年)，Valove等(1994年)，美国专利3,119,740和美国专利5,767,067。

术语“给与”或“给药”指的是将本发明的制剂引入到需要用其治疗某一疾病或身体状况的患者的体内。

术语“患者”指的是接受对某一疾病或身体状况治疗的一种哺乳动物。患者来自于，但不仅限于以下起源：人类、羊、猪、马、牛、兔等。

术语“水稀释液”是指含水的液体溶剂。水溶剂系统可以仅仅由水组成，也可以由水和另一种或多种易混溶的溶剂组成，还可以包含溶解质如糖、缓冲剂、盐或其它赋形剂。应用更普遍的非水溶剂是指短链有机醇(例如甲醇、乙醇、丙醇)，短链酮类(例如丙酮)，和多元醇(例如甘油)。

“等渗剂”是指一种在生理学上能耐受的化合物，它赋予制剂适当的张力，以防止跨细胞膜的水净流，所述细胞膜与制剂接触。

化合物如甘油，在已知浓度下被普遍用于上述目的。其他合适的等渗剂包括(但不限于)氨基酸或蛋白质(如甘氨酸或白蛋白)，盐(如氯化钠)，和糖(如葡萄糖，蔗糖和乳糖)。

术语“抑菌”或“抑菌剂”是指添加到制剂中作为一个抗菌剂的化合物或组合物。含有本发明所述制剂的可保存的LH或LH变体能很好地符合防腐剂效能的法定或监管指导方针，使其成为商业上可行的多用产品，尤其在人用方面。

抑菌剂的例子包括苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、羟苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞。

术语“缓冲液”或“生理学上可接受的缓冲液”是指制剂中已知对药用或兽药用安全的化合物的溶液，它们具有使制剂的pH值维持或控制在该制剂所需的pH范围内的作用。控制pH值在适度酸性pH至适度碱性pH范围的可接受的缓冲液包括(但不限于)诸如磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸之类化合物。“TRIS”是指2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，及其任何药理上可接受的盐。较佳的缓冲液为含盐水或一种可接受的盐的磷酸盐缓冲液。

术语“磷酸盐缓冲液”是指调节到所需pH值的含磷酸或其盐的溶液。一般来说，磷酸盐缓冲液由磷酸或磷酸盐(包括但不仅限于钠盐和钾盐)制得。本技术领域的专业人员所熟知的有几种磷酸盐，例如酸的一元、二元和三元钠盐和钾盐。磷酸盐也被认为可以作为盐的水合物形式出现。磷酸盐缓冲液可以覆盖一个pH值的范围，例如从pH 4左右至pH 10左右，优选的范围是从pH 5左右至pH 9左右，更优选的范围是在7.5左右至8.5左右，最优选的是在pH 8.0左右。

术语“小瓶”或“容器”泛指适合将LH和稀释剂在无菌状态下保存的贮液器。此处所使用的小瓶的例子包括安瓿瓶、储药器、泡罩包装，或适合将LH通过注射器、泵(包括渗透泵)、导管、透皮贴剂、肺或透粘膜喷雾递送给病人的其他贮液器。适合包装非肠道、肺、透粘膜或透皮给药产品的小瓶是本技术领域的专业人员所熟知的。

术语“稳定性”是指本发明制剂中LH的物理、化学和构象稳定性(包括维持生物活性)。蛋白制剂的不稳定性可能是由于蛋白质分子的化学降解或聚集，形成更高层次的聚集物，通过将杂二聚体解离为单体、去糖基化、糖基化修饰、氧化(特别是α-亚基)或任何其他结构修饰，它们使本发明中所包含的LH多肽降低至少一种生物活性。

“稳定的”溶液或制剂，其蛋白质的降解、修饰、聚集、生物活性降低等的程度被控制在可接受的范围，不随时间增加到难以接受的程度。该制剂最好能在6个月的时间里，在约1-10℃的温度范围内，更优选的是在约2-8℃，更优选的是在约4-5℃温度范围内，保持至少或大约80％标签所示的LH活性。LH活性可以用精囊增重测试法进行测定。

术语“治疗”是指为了达到卵泡或睾丸刺激或任何其他由LH调节的生理反应的目的，而对需要给予LH的患者进行给药、随访、管理和/或照顾。因此，治疗可以包括(但不限于)给予LH用以诱导或提高精子质量，刺激男性睾酮释放，或刺激女性卵泡发育或诱导女性排卵。

“多剂量使用”这一表述旨在包括用单个安瓿、小瓶或储药器容纳超过一次注射剂量的LH制剂的情况，例如2、3、4、5、6次或更多次的注射剂量。注射剂较佳为在至少或大约12小时、24小时、48小时等的时间内配制，最好为少于等于或约28天的时间。

注射剂可以按时间段分隔，例如，按6、12、24、48或72小时的时间。

蛋白质的“盐”是指酸加成盐或碱加成盐。这种盐最好是由蛋白质中的一个或多个带电荷基团与一个或多个生理上可接受的无毒阳离子或阴离子之间形成的。有机盐和无机盐包括，例如，由酸制备的盐，如盐酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富马酸、氢溴酸、乙醇酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、醋酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸、碳酸等的盐，或例如，铵、钠、钾、钙或镁盐。

研究发现，选自精氨酸、赖氨酸、或其混合物或盐的氨基酸是制备LH稳定液体制剂的一个合适稳定剂。因此，本发明第一个方面涉及含有促黄体生成素(LH)或其变体的液体促性腺激素制剂，其特征在于，所述的制剂包括稳定量的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐。

该液体制剂中包含的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐的稳定剂量是在或大约在10至150mg/ml总配方的浓度范围，更优选的是在或大约在20至60mg/ml。

优选的精氨酸或其盐的浓度是在或大约在10mg/ml至50mg/ml，更优选的是在或大约在20mg/ml至40mg/ml，尤其优选的是在或大约在25mg/ml至35mg/ml，最优选的是在或大约在31.5mg/ml。

优选的赖氨酸或其盐的浓度是在或大约在10mg/ml至50mg/ml，更优选的是在或大约在20mg/ml至40mg/ml，尤其优选的是在或大约在25mg/ml至35mg/ml，最优选的是在或大约在28.5mg/ml。

该液体制剂中的促黄体生成素(LH)优选的存在浓度是达到或大约在1至50μg/ml总配方的范围。

在一个实施方案中，促黄体生成素(LH)的存在浓度达到或大约在1至15μg/ml总配方的范围，尤其是当一次性使用时。

在另一个实施方案中，促黄体生成素(LH)的存在浓度达到或大约在15至30μg/ml总配方的范围，尤其是当多次使用时(多剂量)。

制剂中LH的浓度优选是达到或约为20IU/ml至2,000IU/ml，更优选的是达到或大约为50至1,000IU/ml，尤其优选的是达到或大约为100至600IU/ml。

LH优选用重组方法产生，尤其优选在用包含编码人糖蛋白α-亚基和LHβ-亚基的DNA表达载体或载体转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。编码α-和β-亚基的DNA可存在于相同或不同的载体上。

重组LH与从尿中获得的LH相比有几大优点。重组细胞培养与分离技术实现了批次之间的一致性。相比之下，从尿中获得LH批次之间在以下特征方面的差异很大，如纯度、糖基化模式、唾液酸糖苷化及亚基氧化。由于批次之间的高度一致性和重组LH的高纯度，这些激素可以很容易地使用诸如等电聚焦电泳(IEF)技术被识别和定量。重组LH的轻松识别和定量使得药瓶的填充可以依据激素的质量(按质量填充)，而不需要依赖生物活性的测定。

本发明的液体制剂中最好含有缓冲液，优选是磷酸盐缓冲液，首选的反离子是钠或钾离子。磷酸盐生理盐水缓冲液是本研究领域的专业人员所熟知的，例如Dulbecco’s磷酸盐缓冲生理盐水。全部溶液中缓冲液的浓度可以在或大约在1mM、5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM和500mM之间变化。优选的缓冲液浓度为或大约为10mM。尤其优选的是10mM磷酸盐离子pH值8.0左右的缓冲液。

缓冲液最好以这样一种方式调整，使本发明的液体制剂的pH值在约7.0至9.0左右，更优选的是在约7.5至8.5左右，其中包括约pH 7.8、pH 8.0和8.2。

本发明是针对LH或LH变体的液体制剂，可以是单剂量或多剂量制剂。

本发明的拟多剂量使用的液体LH制剂包含一种抑菌剂，如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、羟苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞。优选的是苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵的组合。抑菌剂的使用量以在多剂量注射期间(可能是在约12或24小时至约12或14天，较佳为在约6至约28天内)产生有效维持制剂基本无菌(适合注射)的浓度为准。

抑菌剂的存在浓度优选是在或大约在0.005至15mg/ml，更优选是在或大约在0.01至12mg/ml。

抑菌剂的存在浓度优选是在或大约在0.1％(抑菌剂质量/溶剂质量)至2.0％，更优选是在或大约在0.2％至1.0％。

在使用苯甲醇的情况下，特别优选的浓度是0.9％或1.2％。在使用苯酚的情况下，特别优选的浓度在或约0.5％。对于苯甲醇和苯扎氯铵组合的情况，特别优选的浓度分别是0.3％和0.001％。

本发明的制剂最好含有一种抗氧化剂，如甲硫氨酸、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸(EDTA)盐、二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)。最优选的是甲硫氨酸。抗氧化剂可以防止LH(特别是α-亚基)的氧化。

抗氧化剂，例如甲硫氨酸的存在浓度最好在或大约在0.01至5.0mg/ml，更优选的是在或大约在0.05至0.5mg/ml。

本发明的制剂最好含有一种表面活性剂。该表面活性剂优选自聚山梨醇酯，特别是吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)山梨醇单棕榈酸酯)和吐温80(聚氧乙烯(20)山梨醇单油酸酯)。最优选的是吐温20，优选浓度是在或大约在0.01至10mg/ml的范围内。

在一个优选的实施方案中，本发明的制剂包括至少25μg/ml r-hLH、1.65mg/ml Na₂HPO₄ 2H₂O、0.104mg/ml NaH₂PO₄ H₂O、31.5mg/ml精氨酸盐酸盐、0.05mg/ml吐温20、0.5mg/ml甲硫氨酸和5mg/ml苯酚。

在另一个优选的实施方案中，本发明的制剂包括至少25μg/ml r-hLH、1.65mg/ml Na₂HPO₄ 2H₂O、0.104mg/ml NaH₂PO₄ H₂O、28.5mg/ml赖氨酸盐酸盐、0.05mg/ml吐温20、0.5mg/ml甲硫氨酸和12mg/ml苯甲醇。

在另一个优选的实施例中，本发明的制剂包括至少25μg/ml r-hLH、1.65mg/ml Na₂HPO₄ 2H₂O、0.104mg/ml NaH₂PO₄ H₂O、28.5mg/ml赖氨酸盐酸盐、0.05mg/ml吐温20、0.5mg/ml甲硫氨酸、3mg/ml苯甲醇和0.01mg/ml苯扎氯胺。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种供多剂量使用的液体组合物，其中包含LH或LH变体，选自精氨酸、赖氨酸或其混合物或盐的稳定剂，及选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵的混合物的抑菌剂。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种制备供多剂量使用的液体药物组合物的方法，包括将LH或LH变体，选自精氨酸、赖氨酸或其混合物或盐的稳定剂，选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂，以及WFI(注射用水)，制成水溶液。

在另外一个优选的实施方案中，本发明提供了一个生产包装药物组合物的方法，包括配制含LH或LH变体，选自精氨酸、赖氨酸或其混合物或盐的稳定剂，及选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂的溶液。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了一个人用药物产品，包含一个药瓶，其中含有由LH或LH变体，选自精氨酸、赖氨酸、或其混合物或盐的稳定剂，及选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂组成的溶液，以及一个标明这种溶液在第一次使用后可以维持大约24小时或以上时间的标签。更好的是标签上标明这个溶液在第一次使用后可以维持至大约12或14天。

第一次使用之前，也就是在小瓶、安瓿或储药器的密封损坏之前，本发明的制剂可以保持至少在大约6个月，12个月或24个月。

在优选的储存条件下，在第一次使用之前，将这些制剂保存在远离亮光的地方(最好保存在黑暗处)，储存温度在约2-8℃，最好在约4-5℃。

如上所述，本发明提供了供单剂量和多剂量使用的、含抑菌剂的LH或LH变体的液体制剂。本发明的制剂适合于制药学或兽医学用途。

如上所述，在一个优选实施方案中，本发明提供了一个产品，包括包装材料和药瓶，瓶内包含由LH或LH变体，选自精氨酸、赖氨酸、或其混合物或盐的稳定剂，选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂组成的溶液，可任选地包含水稀释的缓冲液和/或其他辅料，其中所述的包装材料包含一个标签，标明这种溶液在第一次使用后可以维持24小时或以上的时间。

本发明的制剂在超过24个月的包装时间里(第一次使用之前)最好保持至少或大约80％的LH活性。LH活性可以用大鼠精囊增重测试法⁵测定。

本发明的制剂可由以下方法制备，该方法包括将LH或其变体，稳定量的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐，以及可任选地选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂以固体形式混合，或将LH或其变体，稳定量的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐，以及可任选地选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂溶解在水稀释剂中。组分的混合和在水稀释剂中的溶解按照常规的溶解和混合程序进行。为了制备一个合适的制剂，例如，将标准量的LH或LH变体的缓冲液溶液，与精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐和可任选地选自苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂的缓冲液溶液混合，用量足以提供所需浓度的蛋白质、精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐和可任选的抑菌剂。然后将所得溶液分配入药瓶、安瓿或储药器。该制备工艺的改变是本研究领域具备普通技能的人员可以认识到的。

例如，组分的添加顺序、是否使用其他添加剂、制剂制备时的温度和pH，都是可以根据给药浓度和给药方式来进行优化的因素。

在一个优选的实施方案中，本发明制剂的制造通过制备所有制剂组分各自的已知浓度储备液(例如磷酸钠缓冲液、精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐、吐温20、甲硫氨酸、LH)并按体积等分试液形成同一组合物的“母液”作为最终制剂。这个“母液”最好是通过一个

(Millipore)0.22微米PDF滤膜过滤，以去除微生物，然后将等分试液分配入各容器，如药瓶、安瓿或储药器中。

本发明的制剂可与包含FSH或FSH变体(如

)的制剂联合使用。

本发明的制剂可用经验证的设备给药。包含单瓶系统的例子，包括笔式注射设备，用来递送溶液剂如

Pen、

Pen、

和

本发明要求保护的产品包括包装材料。除了监管机构所要求的资料外，包装材料还提供该产品可使用的条件。对于单瓶溶液产品，标签应标明该溶液在第一次使用后可以储存24小时或以上的时间，最好是可以储存至12或14天。本发明要求保护的产品可用于人类医药产品的使用。

下面的实施例仅对本发明的制剂和组合物的制备提供进一步的说明。本发明的范围不应解释为仅限于由以下实施例构成。

实施例

材料

项目	生产商
		r-hLH	Laboratoires Serono SA
L-精氨酸盐酸盐	默克代码1.01544
		苯扎氯铵	Fluka代码12063
苯甲醇	默克代码1.00987
		间甲酚	默克代码8.09691
L-甘氨酸	默克代码5.00190
		L-赖氨酸盐酸盐	默克代码1.05701
甲硫氨酸	默克代码1.05707
		苯酚	默克代码1.00200
磷酸85％(Ph Eur，BP，NF)	默克代码1.00563
		氢氧化钠	默克代码1.06498
磷酸氢二钠二水合物	默克代码1.06580
		磷酸二氢钠一水合物	默克代码1.06346
无水硫酸钠	默克代码1.006649
		山梨醇	Sigma代码S-1876
蔗糖	默克代码1.07653
		海藻糖	默克代码1.08216
吐温20	默克代码8.22184
		水	milliQ

下面的研究评估了大量制剂的以下参数：

·稳定剂和/或抑菌剂的研究

·与FSH制剂的相容性

·与基本包装的相容性

·贮存后的稳定性特征

制剂是液体单剂量和多剂量制剂。对下列六种稳定剂进行了评价：

·L-精氨酸盐酸盐(实施例中的ARG或精氨酸)

·L-赖氨酸盐酸盐(实施例中的LYS或赖氨酸)

·海藻糖(TRE)

·L-甘氨酸(实施例中的GLY或甘氨酸)

·蔗糖(SAC)

·山梨醇(SOR)

对以下四种抑菌剂进行了多剂量制剂的评价：

·苯甲醇(BA)

·间甲酚(mCr)

·苯酚(Phe)

·苯甲醇和苯扎氯铵的组合(BACL)

实施例1-单剂量制剂的稳定剂研究

对六种稳定剂(蔗糖、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、山梨醇和海藻糖)进行测试，以提供稳定的单剂量制剂。接受测试的制剂总结于表1。

表1.含有不同稳定剂的若干r-hLH单剂量制剂的组成

组分量/ml

SAC/250

ARG/250

GLY/250

LYS/250

SOR/250

TRE/250

r-hLH

6μg

Na₂HPO₄ 2H₂O

1.65mg

NaH₂PO₄ H₂O

0.104mg

甲硫氨酸

250μg

吐温20

50μg

蔗糖

105mg

-

精氨酸

-

33mg

-

甘氨酸

-

23mg

-

赖氨酸

-

28mg

-

山梨醇

-

56,5mg

-

海藻糖

-

106mg

注射用水

足量至1ml

q.s.＝足量

每种溶液大约制备40ml，通过0.22μm滤膜过滤到22ml的不锈钢容器中，并在2-8℃，+25℃和+40℃条件下，储存于15ml塑料管中。连续1个月测试该溶液的蛋白质含量(SE-HPLC法)、氧化形式(RP-HPLC法)、聚集物(SE-HPLC法)和亚基形成(定性，SE-HPLC法)。用于本制剂的整套测试的结果在表2至5中报告。

表2.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+40℃)

T＝时间；d＝天

表3.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+25℃)

M＝月

表4.RP-HPLC法测得的氧化形式％

制剂	12天(+40℃)	1个月(+25℃)
			SAC/250	7,62	21,84
GLY/250	7,46	n.a.
			ARG/250	6,26	9,59
LYS/250	6,68	4,90
			SOR/250	6,62	24,58
TRE/250	19,95	10,45

n.a.＝未测定

表5.SE-HPLC法测得的r-hLH含量

制剂	T＝0	T＝1天(+40℃)	T＝4天(+40℃)	T＝0	T＝1个月(+25℃)
						SAC/250	5,50	4,20	4,50	5,50	5,40
GLY/250	6,10	5,10	5,10	6,10	5,03
						ARG/250	6,30	6,70	6,40	6,30	6,33
LYS/250	6,00	4,80	5,50	6,00	6,02
						SOR/250	5,30	4,80	5,10	5,30	4,93
TRE/250	5,40	4,80	5,40	5,40	5,23

基于这些结果，蔗糖、赖氨酸和精氨酸被选定为最佳辅料，以进一步研究其与递增剂量(250μg/ml和500μg/ml)的抗氧化剂甲硫氨酸的相容性。该测试溶液的组成见表6。应当注意的是，这些溶液是从头配制的。

表6.包含选定的稳定剂和不同量甲硫氨酸的r-hLH单剂量制剂的组成

组分数量/ml

SAC/250

ARG/250

LYS/250

SAC/500

ARG/500

LYS/500

r-hLH

6μg

Na₂HPO₄ 2H₂O

1.65mg

NaH₂PO₄ H₂O

0.104mg

甲硫氨酸

250μg

500μg

吐温20

50μg

蔗糖

105mg

-

105mg

-

精氨酸

-

33mg

-

33mg

-

赖氨酸

-

28mg

-

28mg

注射用水

足量至1ml

每种溶液配制大约100ml，通过0.22μm滤膜过滤到22ml的不锈钢容器中，并充填入1ml玻璃注射器，以测定药品与最终容器(1ml玻璃注射器+柱塞)的相容性。注射器在2-8℃，+25℃，+33℃和+40℃条件下储存。+33℃储存温度的引入是为了在太快(+40℃)与太慢(+25℃)的降解动力学性质中进行一个折衷。连续2-3个月测试该溶液的r-hLH含量(SE-HPLC法)，氧化形式(RP-HPLC法)，聚集物(SE-HPLC法)和亚基形成(定性，SE-HPLC法)。

用于表6所述制剂的整套测试的结果在表7至11中报告。

表7.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+40℃)

w＝周

表8.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+33℃)

表9.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+25℃)

表10.RP-HPLC法测得的氧化形式％

制剂	4天(+40℃)	8周(+25℃)	4周(+33℃)	6周(+33℃)
					SAC/250	6,13	7,32	9,72	20,13
SAC/500	17,37	35,78	39,12	45,93
					ARG/250	6,29	5,96	9,72	7,02
ARG/500	4,69	5,67	6,69	8,10
					LYS/250	5,24	5,05	8,00	8,63
LYS/500	3,25	4,02	5,71	6,84

表11.SE-HPLC法测得的r-hLH含量

制剂	T＝0	T＝4天(+40℃)	T＝8周(+25℃)	T＝4周(+33℃)	T＝6周(+33℃)	T＝8周(+33℃)
							SAC/250	5,03	3,09	5,09	5,31	4,74	未测定
SAC/500	6,27	4,92	6,00	5,96	5,63	6,20
							ARG/250	5,90	3,74	5,50	5,63	5,34	5,17
ARG/500	5,00	3,36	4,25	5,05	未测定	未测定
							LYS/250	6,14	4,54	5,74	5,83	5,58	5,84
LYS/500	6,08	3,91	5,61	5,73	5,49	5,48

根据这些结果，蔗糖与250μg/ml甲硫氨酸，赖氨酸与500μg/ml甲硫氨酸，精氨酸与两种浓度的甲硫氨酸都具有较高的相容性。

实施例2-r-hLH单剂量液体制剂与FSH多剂量液体制剂的相容性

鉴于实施例1所披露的结果，表6所描述的制剂与FSH制剂(例如Gonal-多剂量液体制剂)混合，并在25℃接触24小时后，根据以下方法进行测定：

-RP-HPLC法测定r-hFSH和r-hLH的α-亚基氧化形式(表12中报道了在％纯度的非氧化形式)

-SE-HPLC法测定聚集物定量

-RP-HPLC法测定r-hFSH和r-hLH滴度

-r-hFSH和r-hLH体内生物测定

-SDS-PAGE法测定r-hFSH和r-hLH的游离亚基和聚集物定量(数据未报道)

-视觉外观

这些结果报道于表12至14.

表12.RP-HPLC法测得的纯度和SE-HPLC法测得的％聚集物

h＝小时

表13.FSH和LH含量

*FSH理论含量：200IU＝15,48μg/ml；^#LH理论含量：100IU＝4μg/ml

表14.生物测定

所有测定的单剂量制剂与

多剂量制剂互相兼容，因为：

-没有FSH和LH含量损失

-不被氧化

-没有聚集和游离亚基解离(SDS-PAGE法)

-没有FSH和LH生物活性损失

实施例3-单剂量液体制剂的稳定性研究

基于上述实施例的结果，表6所描述的制剂，除含精氨酸的制剂以外，是在两种不同的r-hLH浓度(6μg/ml和12μg/ml)下制备的，储存于2-8℃和+25℃，根据严格的稳定性计划测定，测试依据以下分析方法：

-RP-HPLC法测定LH含量

-RP-HPLC法测定α-亚基氧化形式

-SDS-PAGE法测定游离亚基和聚集物

-生物测试

-溶液的pH值

-视觉外观

对所有借助于Stabileo 1.1软件被认定为稳定性参数的结果进行统计分析。

在2-8℃和25±2℃贮存下的r-hLH浓度(RP-HPLC法)

本制剂在2-8℃贮存6个月后，没有发现蛋白质含量有统计学意义上的显著降低，不论r-hLH的浓度如何(6μg/ml和12μg/ml)。在25±2℃贮存6个月后观察到一般降低0.4μg/月。

在2-8℃和25±2℃贮存下的r-hLH生物活性(生物测试)

本制剂在2-8℃和25±2℃贮存6个月后，没有发现生物活性的显著降低，不论r-hLH的浓度如何(6μg/ml和12μg/ml)。

SDS-PAGE法测得的亚基和聚集物百分率

在2-8℃和25℃贮存6个月后，SDS-PAGE法测得两种浓度下聚集物的百分率仍保持在2％以下。在2-8℃贮存6个月后，SDS-PAGE法测得两种浓度下亚基的百分率仍保持在2％以下。在25±2℃贮存6个月后一般降低大约5％/月。

RP-HPLC法测得的氧化形式百分率

在2-8℃贮存6个月后，测得大约0.4％/月的增加，在25℃±2℃贮存，则增加的范围为0.6-1.4％/月。

pH值和外观

在生产和贮存期间，没有任何外观(颜色、澄清度、可见颗粒)的改变，也没有pH值的变化。

实施例4-多剂量制剂的稳定剂和抑菌剂的相容性

测试六种稳定剂(蔗糖、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、山梨醇和海藻糖)与抑菌剂的相容性，以提供稳定的多剂量制剂。接受测试的制剂总结于表15。

表15.包含不同组合的稳定剂和抑菌剂的多种r-hLH多剂量制剂的组成

组分数量/ml

SAC/250BA

SAC/250mCr

SAC/250Phe

ARG/250BA

ARG/250mCr

ARG/250Phe

r-hLH

25μg

Na₂HPO₄ 2H₂O

1.65mg

NaH₂PO₄ H₂O

0.104mg

甲硫氨酸

250μg

吐温20

50μg

蔗糖

105mg

-

精氨酸

-

33mg

苯甲醇

0.90％

-

0.90％

-

间甲酚

-

0.30％

-

0.30％

-

苯酚

-

0.50％

-

0.50％

注射用水

足量至1ml

组分数量/ml

LYS/250BA

LYS/250mCr

LYS/250Phe

SOR/250BA

SOR/250mCr

SOR/250Phe

r-hLH

25μg

Na₂HPO₄ 2H₂O

1.65mg

NaH₂PO₄ H₂O

0.104mg

甲硫氨酸

250μg

吐温20

50μg

赖氨酸

28mg

-

山梨醇

-

56.5mg

苯甲醇

0.90％

-

0.90％

-

间甲酚

-

0.30％

-

0.30％

-

苯酚

-

0.50％

-

0.50％

注射用水

足量至1ml

组分数量/ml

GLY/250/BA

GLY/250/mCr

GLY/250/Phe

TRE/250/BA

TRE/250/mCr

TRE/250/Phe

r-hLH

25μg

Na₂HPO₄ 2H₂O

1.65mg

NaH₂PO₄ H₂O

0.104mg

甲硫氨酸

250μg

吐温20

50μg

甘氨酸

23mg

-

海藻糖

-

106mg

苯甲醇

0.90％

-

0.90％

-

间甲酚

-

0.30％

-

0.30％

-

苯酚

-

0.50％

-

0.50％

注射用水

足量至1ml

每种溶液大约制备40ml，通过0.22μm滤膜过滤，在2-8℃，+25℃和+40℃条件下贮存于15ml塑料管中。连续1个月测试该溶液的蛋白质含量(体积排斥-HPLC法，SE-HPLC法，数据未显示)，氧化形式(反相-HPLC法，RP-HPLC法)，聚集物(SE-HPLC法)和亚基形成(定性，SE-HPLC法)。用于本制剂的整套测试的结果报道于表16至18。

由于抑菌剂和表面活性剂(吐温20)不相容，所有含间甲酚(mCr)的溶液在生产出来以后就立即变为乳白色。

表16.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+40℃)

表17.SE-HPLC法测得的纯度(贮存温度：+25℃)

表18.RP-HPLC测得的氧化形式％

制剂	12天(+40℃)	1个月(+25℃)
			SAC/250/mCr	51,14	16,62
SAC/250/BA	14,07	8,83
			SAC/250/Phe	25,55	17,54
GLY/250/mCr	59,29	5,43
			GLY/250/BA	10,53	4,44
GLY/250/Phe	34,86	16,06
			ARG/250/mCr	65,27	3,13
ARG/250/BA	7,12	5,65
			ARG/250/Phe	15,49	11,27
LYS/250/mCr	44,05	16,36
			LYS/250/BA	13,69	9,30
LYS/250/Phe	56,55	17,86
			SOR/250/mCr	58,29	25,68
SOR/250/BA	13,51	8,49
			SOR/250/Phe	30,78	17,75
TRE/250/mCr	45,84	26,36
			TRE/250/BA	19,12	11,41
TRE/250/Phe	23,87	27,76

基于上述结果，蔗糖、赖氨酸和精氨酸被选定为最佳稳定剂，用以进一步研究其与增量甲硫氨酸(500μg/ml)的相容性。苯甲醇、苯酚和苯甲醇与苯扎氯胺的组合物被选定为抑菌剂。接受测试的制剂总结于表19。

表19.包含选定稳定剂和不同抑菌剂的多种r-hLH多剂量制剂的组成

每种溶液大约制备100ml，通过0.22μm滤膜过滤，充填入3ml储药器中。使用下述基本包装：

-经硅化处理的3ml玻璃储药器(Nuova Ompi)

-卷曲瓶盖代码CAP J 3ML L1H075-1-H1B FM 257/2(HelvoetPharma)

-涂药柱塞：Helvoet V9282FM257/2 Omniflex涂层.

储药器贮存在2-8℃，+25℃和+40℃，测试其在2个月内的蛋白质含量(SE-HPLC法)，氧化形式(RP-HPLC法)，聚集物(SE-HPLC法)和亚基形成(定性，SE-HPLC法)。

用于第二组制剂的整套测试的结果报道在表20至26中。

表20.SE-HPLC测得的纯度(贮存温度：+40℃)

表21.SE-HPLC测得的纯度(贮存温度：+33℃)

表22.SE-HPLC测得的纯度(贮存温度：+25℃)

表23.RP-HPLC测得的氧化形式的百分比％(贮存温度：+33℃)

制剂	T＝0	T＝3周	T＝8周	T＝13周
					SAC/500/BA	1,12	5,21	4,21	4,26
SAC/500/BACL	0,90	5,59	4,90	4,46
					SAC/500/Phe	0,99	8,28	6,01	16,14
ARG/500/BA	0,69	4,52	4,13	2,65
					ARG/500/BACL	1,13	4,57	3,57	2,97
ARG/500/Phe	0,94	4,60	5,24	4,82
					LYS/500/BA	1,53	5,71	16,34	8,77
LYS/500/BACL	1,60	4,49	5,83	5,70
					LYS/500/Phe	0,66	9,66	34,97	25,51

表24.RP-HPLC测得的氧化形式的百分比％(贮存温度：+25℃)

制剂	T＝0	T＝4周	T＝8周	T＝13周
					SAC/500/BA	1,12	2,04	2,19	2,44
SAC/500/BACL	0,90	2,10	2,31	2,23
					SAC/500/Phe	0,99	2,68	5,72	7,50
ARG/500/BA	0,69	1,40	1,61	1,65
					ARG/500/BACL	1,13	1,46	2,31	1,89
ARG/500/Phe	0,94	1,31	2,77	2,35
					LYS/500/BA	1,53	2,51	3,35	4,73
LYS/500/BACL	1,60	1,96	3,14	3,47
					LYS/500/Phe	0,66	4,05	11,38	22,52

表25.RP-HPLC测得的氧化形式百分比％

制剂	T＝0	T＝13周(+5℃)	T＝0	T＝3天(+40℃)
					SAC/500/BA	1,12	1,11	1,12	1,16
SAC/500/BACL	0,90	1,29	0,90	1,25
					SAC/500/Phe	0,99	2,51	0,99	1,47
ARG/500/BA	0,69	1,03	0,69	0,64
					ARG/500/BACL	1,13	1,16	1,13	1,06
ARG/500/Phe	0,94	2,02	0,94	1,47
					LYS/500/BA	1,53	2,03	1,53	1,84
LYS/500/BACL	1,60	1,56	1,60	1,58
					LYS/500/Phe	0,66	未测定	0,66	3,10

表26.SE-HPLC测得的r-hLH含量

制剂	T＝0	T＝3天(+40℃)	T＝3周(+33℃)	T＝4周(+33℃)	T＝8周(+33℃)	T＝4周(+25℃)	T＝8周(+25℃)
								SAC/500/BA	20,38	21,70	21,05	22,54	16,47	23,70	18,43
SAC/500/BACL	21,73	22,06	21,31	22,64	18,77	23,65	18,10
								SAC/500/Phe	21,24	21,49	21,02	22,53	20,71	22,66	17,23
ARG/500/BA	22,23	18,86	19,52	24,64	16,14	25,26	17,69
								ARG/500/BACL	22,38	21,48	21,71	23,52	16,86	24,18	19,34
ARG/500/Phe	21,34	22,38	20,60	23,09	16,99	24,41	16,32
								LYS/500/BA	20,33	20,93	18,85	22,10	14,93	24,24	17,36
LYS/500/BACL	23,83	21,78	20,68	23,44	15,50	24,07	18,60
								LYS/500/Phe	21,34	21,05	20,20	21,89	16,50	22,99	16,56

上述结果证实了稳定剂与增量甲硫氨酸之间的相容性(参见实施例1)。此外，该结果还显示抑菌剂与500μg/ml甲硫氨酸是可以配伍的。

实施例5-r-hLH多剂量液体制剂与FSH多剂量液体制剂的相容性

根据实施例4的结果，将贮存于3ml储药器中的r-hLH制剂与FSH制剂(即

多剂量液体制剂)混合，在25℃接触24小时后按照下述方法进行测定：

-SE-HPLC法测定纯度

-RP-HPLC法测定r-hFSH和r-hLH滴度

-RP-HPLC法测定r-hFSH和r-hLH的α-亚基氧化形式

-r-hFSH和r-hLH体内生物活性测试

-SDS-PAGE法测定r-hFSH和r-hLH的游离亚基以及聚集物定量(数据未报道)

-溶液的pH值

-可视外观

结果列于表27至29。

表27.SE-HPLC测得的纯度

表28.FSH和LH含量

*FSH理论含量：200IU＝30,96μg/ml；^#LH理论含量：100IU＝8μg/ml

表29.生物测定

所有接受测试的多剂量制剂与

多剂量制剂都是可以配伍的，因为：

-未出现FSH和LH含量的损失

-未被氧化

-没有沉淀(SE-HPLC法)

-没有聚集物和亚基的生成(SDS-PAGE法)

-未出现LH和FSH生物活性的损失

实施例6-与基本包装的相容性

为了测试r-hLH制剂与最终容器(注射器和储药器)之间的相容性，设置矩阵试验来测试以下参数：

-r-hLH浓度的影响：6μg/ml，12μg/ml，24μg/ml，

-充填体积的影响：0.25ml，0.5ml，1ml，

-容器类型：1ml玻璃注射器和3ml玻璃储药器，

-抑菌剂的影响：包含和不含抑菌剂的制剂，贮存在3ml储药器中。

一种制剂(SAC/500/BACL)被制备成不同的r-hLH浓度，充填在不同灌装量的容器中。采用SE-HPLC法定性地比较33℃放置一周批次之间的变化。研究结果发布在图1(A-F)中。图2(A-B)比较了制剂中含有与不含抑菌剂组合时，SE-HPLC法测得的杂二聚体百分比。

根据图1和2给出的结果，可以得出以下结论：

-在12μg/ml与24μg/ml的浓度下容器对制剂没有影响

-在12μg/ml与24μg/ml的浓度下灌装量对制剂没有影响

-浓度增加对亚基解离有正向作用

-有或没有抑菌剂，批次之间无差异

-较高的稳定性与较高的r-hLH浓度相关。

实施例7-多剂量液体制剂的稳定性研究

基于上述实施例的结果，表19中描述的四种制剂(SAC/500/BACL，LYS/500/BA，LYS/500/BACL和ARG/500/Phe)在2-8℃和+25℃的条件下贮存，按照严格的稳定性计划根据以下分析方法进行测试：

-RP-HPLC法测定LH的含量

-RP-HPLC法测定α-亚基氧化形式

-RP-HPLC法测定苯酚的含量

-RP-HPLC法测定苯扎氯胺的含量

-RP-HPLC法测定苯甲醇的含量

-SDS-PAGE法测定游离亚基和聚集物

-生物活性测试

-溶液的pH值

-可视外观

对上述制剂中赖氨酸和精氨酸的量进行调整(即L-赖氨酸盐酸盐为28.5mg和L-精氨酸盐酸盐为31.5mg)，以优化制剂的等渗性。

在2-8℃和25±2℃下贮存的r-hLH浓度(RP-HPLC法测定)

本制剂在2-8℃贮存12个月后，没有发现蛋白质含量有统计意义上的显著降低。在25±2℃贮存6个月后一般降低0.4μg/月。

在2-8℃和25±2℃下贮存的r-hLH生物活性(生物活性测试)

本制剂在2-8℃和25±2℃贮存12个月后，没有发现生物活性的显著降低。

SDS-PAGE法测得的亚基和聚集物百分率％

所有制剂在2-8℃和25℃贮存12个月后，SDS-PAGE法测得的聚集物百分率仍保持在2％以下。

所有制剂在25℃贮存6个月后，SDS-PAGE法测得的亚基百分率增加到32％以上。

RP-HPLC法测得的氧化形式百分率％

SAC/500/BACL和ARG/500/Phe呈现出氧化形式的较低增长。

pH值和外观

在生产和贮存期间，未观察到任何外观(颜色、澄清度、可见颗粒)的改变，也未观察到pH值的变化。

抑菌剂的含量

苯酚和苯甲醇的含量检测达到目标，在6个月至12个月的稳定性检验点没有检测到含量降低。制剂SAC/500/BACL在6个月的稳定性检验点被检出苯扎氯胺的含量低于标准(测得的是6μg/ml，而不是10μg/ml)。

抑菌剂的效果

制剂在T＝0的时间点和9个月后的重复试验中，抑菌效果测试的结果发布于表30至33。

表30.多剂量制剂SAC/500/BACL的抑菌效果测试结果

表31.多剂量制剂LYS/500/BACL的抑菌效果测试结果

表32.多剂量制剂LYS/500/BA的抑菌效果测试结果

表33.多剂量制剂ARG/500/Phe的抑菌效果测试结果

包含0.3％苯甲醇+0.001％苯扎氯胺和蔗糖或赖氨酸(SAC/500/BACL和LYS/500/BACL)的组合的制剂符合《欧洲药典》的标准A，即使苯扎氯胺的量低于目标(6μg/ml，而不是10μg/ml)。

包含0.5％苯酚的制剂(ARG/500/Phe)和包含1.2％苯甲醇的制剂(LYS/500/BA)符合《欧洲药典》的标准B。

结论

所有多剂量制剂在2-8℃贮存12个月后，都显示出很好的稳定性。

Claims

1.含浓度为1-50μg/ml的促黄体生成素的液体制剂，其特征在于，所述制剂中包含磷酸盐缓冲液和稳定数量的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐，

所述精氨酸或其盐的浓度为10mg/ml至50mg/ml，

所述赖氨酸或其盐的浓度为10mg/ml至50mg/ml。

2.如权利要求1所述的制剂，其中，促黄体生成素是人促黄体生成素。

3.如权利要求1或2所述的制剂，其中，促黄体生成素是重组人促黄体生成素。

4.如权利要求1或2所述的制剂，其中，促黄体生成素是人尿促黄体生成素。

5.如权利要求1所述的制剂，其中，磷酸盐缓冲液以1mM至100mM的浓度存在。

6.如权利要求1或5所述的制剂，其中，磷酸盐缓冲液是磷酸钠缓冲液。

7.如权利要求1所述的制剂，还包含一种表面活性剂。

8.如权利要求7所述的制剂，其中，表面活性剂是聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯。

9.如权利要求8所述的制剂，其中，聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯以0.01mg/ml至10mg/ml的浓度存在。

10.如权利要求1所述的制剂，还包含甲硫氨酸。

11.如权利要求10所述的制剂，其中，甲硫氨酸以0.01mg/ml至5.0mg/ml的浓度存在。

12.如权利要求1所述的制剂，还包含一种抑菌剂。

13.如权利要求12所述的制剂，其中，抑菌剂选自苯甲醇、苯酚以及苯甲醇与苯扎氯胺的组合。

14.如权利要求12或13所述的制剂，其中，抑菌剂以0.005mg/ml至15mg/ml的浓度存在。

15.如权利要求1所述的制剂，还包含注射用水。

16.如权利要求1所述的制剂，其pH范围为7.5至8.5之间。

17.如权利要求1所述的制剂，至少包含25μg/ml重组人促黄体生成素、1.65mg/ml Na₂HPO₄ 2H₂O、0.104mg/ml NaH₂PO₄ H₂O、31.5mg/ml L-精氨酸盐酸盐、0.05mg/ml聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、0.5mg/ml甲硫氨酸和5mg/ml苯酚。

18.如权利要求1所述的制剂，至少包含25μg/ml重组人促黄体生成素、1.65mg/ml Na₂HPO₄ 2H₂O、0.104mg/ml NaH₂PO₄ H₂O、28.5mg/ml赖氨酸盐酸盐、0.05mg/ml聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、0.5mg/ml甲硫氨酸和12mg/ml苯甲醇。

19.如权利要求1所述的制剂，至少包含25μg/ml重组人促黄体生成素、1.65mg/ml Na₂HPO₄ 2H₂O、0.104mg/ml NaH₂PO₄ H₂O、28.5mg/ml赖氨酸盐酸盐、0.05mg/ml聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、0.5mg/ml甲硫氨酸、3mg/ml苯甲醇和0.01mg/ml苯扎氯胺。

20.药物组合物，包含权利要求1至19之一所述的制剂。

21.权利要求1至19之一所述制剂的制备方法，包括用磷酸盐缓冲液和稳定数量的精氨酸或其盐和/或赖氨酸或其盐稀释促黄体生成素，所述精氨酸或其盐的浓度为10mg/ml至50mg/ml，所述赖氨酸或其盐的浓度为10mg/ml至50mg/ml。

22.权利要求1至19之一所述制剂在制备女性和/或男性不育症治疗药物上的用途。

23.权利要求1至19之一所述制剂与含卵泡刺激素的液体制剂联合应用在制备治疗女性和/或男性不育症的药物上的用途。