EA019432B1

EA019432B1 - Жидкие композиции lh

Info

Publication number: EA019432B1
Application number: EA201070549A
Authority: EA
Inventors: Рита Агостинетто; Фабрицио Самаритани; Алессандра Дель Рио; Жоэль РИШАР
Original assignee: Мерк Сероно С.А.
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2014-03-31
Also published as: MX2010004639A; IL205105A0; MY153976A; PL2219607T3; KR101513181B1; CN101842083B; CN101842083A; CY1113121T1; BRPI0818324B8; CA2700662C; EP2219607A1; EP2219607B1; WO2009056569A9; BRPI0818324B1; SI2219607T1; ECSP10010224A; CA2700662A1; PT2219607E; RS52566B; UA101484C2

Abstract

Изобретение относится к жидким фармацевтическим композициям лютеинизирующего гормона (LH) для однодозового или многодозового введения.

Description

Настоящее изобретение относится к жидким фармацевтическим композициям лютеинизирующего гормона (ЬН), а также к способам получения таких композиций.

Предпосылки создания изобретения

Лютеинизирующий гормон (ЬН), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и хорионический гонадотропин (ХГ) представляют собой инъецируемые белки, относящиеся к классу гонадотропинов. ЬН, ФСГ и ХГ используются по отдельности и в сочетании при лечении бесплодия и расстройств репродуктивной функции как у женщин, так и у мужчин.

В естественных условиях ФСГ и ЬН продуцируются гипофизом. Для целей использования в фармацевтических препаратах ФСГ и ЬН, а также их варианты могут быть созданы по рекомбинантной технологии (рФСГ и рЛГ) или могут быть получены из мочи женщин в постменопаузе (мФСГ и мЛГ).

ФСГ используют для индукции овуляции (01) у женщин и при контролируемой гиперстимуляции яичников (КГЯ) в рамках вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). При проведении стандартного курса лечения, направленного на индукцию овуляции, пациентке проводят ежедневные инъекции ФСГ или варианта ФСГ (примерно от 75 до 300 МЕ ФСГ/день) в течение периода времени от примерно 6 до примерно 12 дней. При проведении стандартного курса лечения, направленного на контролируемую гиперстимуляцию яичников, пациентке проводят ежедневные инъекции ФСГ или варианта ФСГ (примерно 150-600 МЕ ФСГ/день) в течение периода времени от примерно 6 до примерно 12 дней.

ФСГ также применяют для индукции сперматогенеза у мужчин с олигоспермией. Курс лечения, включающий введение 150 МЕ ФСГ 3 раза в неделю в сочетании с 2500 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГч) два раза в неделю, позволял повысить количество спермы, вырабатываемой у мужчин с гипогонадотропным гипогонадизмом (Вигдиек с1 а1., 1997).

ЬН применяют при лечении женщин-пациенток в сочетании с ФСГ при 01 и при КГЯ, в частности тех пациенток, которые имеют очень низкие эндогенные уровни ЬН или которые резистентны к ЬН, например при лечении тех женщин, у которых имеется гипогонадотропный гипогонадизм (ГГ, группа I по классификации ВОЗ) или при лечении пациенток более зрелого возраста (т.е. в возрасте 35 лет или старше), а также при лечении тех пациенток, у которых имеется проблема имплантации или отмечались ранние выкидыши. ЬН в сочетании с ФСГ традиционно был доступен в виде препарата, известного как препарат на основе человеческих менопаузальных гонадотропинов (МГч), который получали экстракцией из мочи женщин в периоде менопаузы. Препарат МГч характеризуется соотношением активностей ФСГ :ЬН, равным 1:1.

ХГ действует на тот же рецептор, что и ЬН, и вызывает такие же реакции. ХГ характеризуется более длительным периодом полувыведения из кровотока, чем ЬН, и, в этой связи, обычно применяется в качестве пролонгированного источника ЬН активности. ХГ используют в курсах лечения 01 и КГЯ с целью имитации естественных пиковых уровней ЬН и для запуска овуляции. Инъекцию человеческого хорионического гонадотропина (хорионического гонадотропина человека) используют для инициации овуляции по окончании стимуляции под действием ФСГ или смеси ФСГ и ЬН. ХГ может также использоваться в сочетании с ФСГ для стимуляции в курсе лечения 01 и КГЯ с тем, чтобы обеспечить активность ЬН в ходе стимуляции у тех пациенток, для которых желательна ЬН-активность, например у таких пациенток, которые были отмечены выше.

ФСГ, ЬН и ХГ являются членами семейства гетеродимерных гликопротеиновых гормонов, которое также включает тиреотропный гормон (ТСГ). К этому семейству относятся гетеродимеры, включающие α- и β-субъединицу. Указанные субъединицы удерживаются вместе за счет нековалентного взаимодействия. Гетеродимер человеческого ФСГ (ФСГч) состоит из (ί) α-субъединицы зрелого гликопротеина из 92 аминокислот, которая будет одинакова и для других членов этого семейства человеческих белков (таких как хорионический гонадотропин (ХГ), лютеинизирующий гормон (ЬН) и тиреотропный гормон (ТСГ)); и (ίί) β-субъединицы зрелого белка из 111 аминокислот, которая уникальна для ФСГ (8йоте е1 а1., 1974 и 1988). Человеческий гетеродимерный ЬН состоит из (ί) α-субъединицы зрелого гликопротеина из 92 аминокислот и (и) β-субъединицы зрелого белка из 112 аминокислот, которая уникальна для ЬН (Кеи1тапп е1 а1., 1979; Та1табде е1 а1., 1984; Пббек & Та1табде, 1984). α- и β-субъединицы гликопротеинов могут демонстрировать тенденцию к диссоциации в составе композиций как результат их взаимодействия с консервантом, поверхностно-активным веществом и другими эксципиентами. Диссоциация субъединиц ведет к потере биологической активности (Кшейеп & Каткеу, 1975).

ФСГ используют в виде композиции, приготовленной для целей внутримышечной (в/м) или подкожной (п/к) инъекции. ФСГ доступен в лиофилизированной (твердой) форме во флаконах или ампулах с активностью 75 и 150 МЕ/флакон, срок годности которых составляет примерно два года при хранении при температуре 2-25°С. Раствор для инъекции получают при восстановлении лиофилизированного продукта водой для инъекции (\УН). Для индукции овуляции или при проведении контролируемой гиперстимуляции яичников рекомендуются ежедневные инъекции начальных доз, составляющих от 75 до 600 МЕ, в течение периода времени, достигающего примерно десяти дней. В зависимости от достигаемого у пациента ответа далее могут быть использованы повышенные дозы ФСГ в ходе лечения, включающего

- 1 019432 до трех циклов. В случае использования для введения пациенту лиофилизированных композиций необходимо провести восстановление нового флакона с лиофилизированным материалом с помощью разбавителя и затем, сразу после восстановления, вводить на ежедневной основе [Раскаде шкей Ν1700101Α, опубликованный в феврале 1996, для Регйпех™ (урофоллитропин для инъекций, очищенный) для подкожной инъекции от компании 8егопо ЬаЬогаЮпек, 1пс., Ραηάοίρΐι. МА].

ФСГ был также введен в состав композиции как в однодозовом, так и в многодозовом варианте в виде флаконов или ампул. При этом однодозовые варианты должны оставаться стабильными и активными при хранении вплоть до использования.

Многодозовые варианты должны не только оставаться стабильными и активными при хранении вплоть до использования, но должны также сохранять стабильность, активность и быть относительно свободными от бактерий в течение многодневного периода введения, после вскрытия запечатанной ампулы. По этой причине многодозовые варианты зачастую содержат бактериостатическое вещество.

ЬН вводят в состав композиции, подходящей для внутримышечной (в/м) или подкожной (п/к) инъекции. ЬН присутствует в лиофилизированном (твердом) виде во флаконах или ампулах, содержащих 75 МЕ/флакон, со сроком годности примерно два года, в условиях хранения при температуре 2-25°С. Раствор для инъекции получают путем восстановления лиофилизированного продукта водой для инъекций (ВЛИ). Для индукции овуляции или для достижения контролируемой гиперстимуляции яичников рекомендуются в сочетании с ФСГ ежедневные инъекции начальных доз от 75 до 600 МЕ ЬН в течение десяти дней.

В ЕР 0618808 (Аррйей Векеагсй 8ук!ет8 АР8 Но1йшд Ν.ν.) описывается фармацевтическая композиция, включающая твердую хорошо перемешанную смесь гонадотропина и стабилизирующего количества сахарозы, одной или в сочетании с глицином.

В ЕР 0814841 (АррНей Векеагсй 8у81еш8 АР8 НоИшд Ν.ν.) описывается стабильная жидкая фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный человеческий хорионический гонадотропин (хорионического гонадотропина человека) и стабилизирующее количество маннита.

В \νϋ 2004/087213 (Агек Тгайтд 8.А.) описывается жидкая и лиофильно высушенная фармацевтическая композиция, включающая фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) или его вариант и/или лютеинизирующий гормон (ЬН) или его вариант, а также поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, включающей Р1игошс® Р77, Р1игошс Р87, Р1игошс Р88 и Р1игошс Р68.

В νθ 2004/112826 (Агек Тгайшд 8.А.) описывается лиофильно высушенная композиция, включающая фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) или его вариант и лютеинизирующий гормон (ЬН) или его вариант, а также поверхностно-активные вещества, выбранные из полисорбата, включающего ΤνΕΕΝ 20, ΤνΕΕΝ 40 и ΤνΕΕΝ 80.

В νθ 00/04913 (Ε1ί Ы11у апй Со.) описывается композиция, включающая ФСГ или вариант ФСГ, содержащий α- и β-субъединицу и консервант, выбранный из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензетония, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смеси в водном разбавителе.

В νθ 2004/105788 (Ретпд Β.ν.) описывается фармацевтическая композиция, состоящая из ФСГ и хорионического гонадотропина человека, по меньшей мере в одном фармацевтически приемлемом носителе.

В ЕР 0448146 (Акзо Β.ν.) описывается стабилизированный гонадотропинсодержащий лиофилизат, включающий гонадотропин и стабилизирующий количество соли дикарбоновой кислоты.

В ЕР 0853945 (Акзо №Ье1 Β.ν.) описывается жидкая, содержащая гонадотропин композиция, отличающаяся тем, что данная композиция включает гонадотропин и стабилизирующее количество поликарбоновой кислоты или ее соли и тиоэфирное соединение.

Однако все еще остается потребность в стабильных жидких композициях ЬН или варианта ЬН в однодозовой или многодозовой форме для введения.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является создание жидких композиций ЬН или варианта ЬН, разработка способов их получения и способов фармацевтического или ветеринарного использования при лечении расстройств фертильности.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к жидкой композиции ЬН или варианта ЬН, включающей очищенный препарат ЬН или варианта ЬН и стабилизирующее количество аргинина или его солей и/или лизина или его солей.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения жидкой композиции ЬН или варианта ЬН, включающему стадии а) получения раствора ЬН или варианта ЬН и Ь) добавления к указанному раствору стабилизирующего количества аргинина или его солей и/или лизина или его солей.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к форме представления жидкой композиции ЬН или варианта ЬН, включающей жидкую композицию по настоящему изобретению, герметически закрытую в стерильных условиях в контейнер, подходящий для хранения до использования. Указанный

- 2 019432 контейнер может представлять собой ампулу, флакон, шприц-тюбик или картридж.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к производственному изделию, предназначенному для использования в случае человека, которое включает упаковочный материал и контейнер, содержащий жидкую композицию ЬН или варианте ЬН по настоящему изобретению и бактериостатическое вещество, где указанный упаковочный материал включает этикетку, указывающую, что такая композиция может выдерживаться в течение двадцати восьми дней или дольше после ее первого использования.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к использованию жидкой композиции ЬН или варианта ЬН в сочетании с жидкими композициями ФСГ или варианте ФСГ.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведено сравнение хроматографических профилей (по результатам ГФ-ВЭЖХ) композиций р-ЛГч с использованием разных концентраций (6, 12 и 24 мкг/мл), контейнеров и при разных объемах заполнения (0,25, 0,5 и 1 мл). Указанные композиции содержат, кроме р-ЛГч, также буфер, сахарозу, ΤΑΕΕΝ 80, метионин, бензиловый спирт, хлорид бензалкония и воду для инъекций. Пунктирные линии на чертежах соответствуют объему 0,25 мл, линии с точками соответствуют объему заполнения 0,5 мл и жирные линии соответствуют объему заполнения 1 мл. (А) 6 мкг/мл композиции р-ЛГч в шприцтюбике. (В) 6 мкг/мл композиции р-ЛГч в картридже. (С) 12 мкг/мл композиции р-ЛГч в шприц-тюбике. (Ό) 12 мкг/мл композиции р-ЛГч в картридже. (Е) 24 мкг/мл композиции р-ЛГч в шприц-тюбике. (Е) 24 мкг/мл композиции р-ЛГч в картридже. Пики продукта со временем удерживания 8,5 мин соответствуют интактным гетеродимерам (α- + β-субъединицы, соединенные через нековалентную связь), а пики с большим временем удерживания (9,5 мин) соответствуют свободным субъединицам. Аи обозначает единицы поглощения.

На фиг. 2 приведено сравнение процентного содержания гетеродимеров, рассчитанное по данным ГФ-ВЭЖХ при использовании композиции как содержащей, так и не содержащей бактериостатическое вещество, соответственно 8АС/500/24цдВАСЬ_саг1 и 8АС/500/24цд_сай. (А) ГФ-ВЭЖХ, проведенная через три дня (3 д) в условиях хранения при температуре 40°С. (В) ГФ-ВЭЖХ, проведенная через восемь дней (8 д), шесть недель (6 н), восемь недель (8 н) и тринадцать недель (13 н) в условиях хранения при температуре 33°С.

Подробное описание изобретения

Жидкие композиции ЬН по настоящему изобретению обладают улучшенными или более подходящими свойствами или стабильностью и применимы для лечения бесплодия у женщин и/или мужчин.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем жидкие композиции предназначены для подкожной и внутримышечной инъекции.

Подходящие свойства или стабильность жидких композиций ЬН или варианта ЬН по настоящему изобретению достигаются за счет предотвращения снижения потери активности или стабильности или за счет усовершенствования любого такого аспекта, как эффективность или желательный режим введения, например, по меньшей мере, путем улучшения характера композиции с точки зрения режима ее введения, частоты введения, дозировки, комфортности введения, легкости использования и т.п.

Лютеинизирующий гормон или ЬН в контексте настоящего описания относится к ЬН, получаемому в виде полноразмерного зрелого белка, который включает, без ограничения, человеческий ЬН (ЛГч) и который может быть получен по рекомбинантной методике или может быть выделен из источников че ловеческого происхождения, таких как моча женщин в постменопаузе.

Выражение вариант ЬН включает такие молекулы, которые отличаются по аминокислотной последовательности, характеру гликозилирования или по межсубъединичной связи от человеческого ЬН, но которые проявляют свойственную ЬН активность.

Термин активность применительно к ЬН относится к способности к композиции ЬН или смешанной композиции проявлять биологические ответы, ассоциированные с ЬН, такие как активность, выявляемая по методу повышения веса семенных пузырьков (Уаи Не11 е! а1., 1964). Биологическая активность ЬН оценивается с учетом принятых стандартов для ЬН.

Меру активности выражают в международных единицах на миллилитр раствора (МЕ/мл) или в мега - международных единицах на миллилитр раствора (ММЕ/мл) (1 ММЕ/мл=1000000 МЕ/мл).

Международная единица рассчитывается по правилам, приведенным в соответствующем каталоге реагентов (Кскеагсй ВеГегеисе Веадеп! ΝοΚ Νο. 35), опубликованном Национальным Институтом Здоровья США (№10опа1 1п8Йи1е оГ НеаИй, ВеФейа. Магу1аи4).

ЬН или вариант ЬН может быть получен в рамках соответствующего метода, например он может быть получен по рекомбинантной методике, при выделении или очистке из природных источников, в качестве одного из возможных вариантов, или путем химического синтеза либо при использовании любого их сочетания.

Использование термина рекомбинантный относится к препаратам ЬН или вариантам ЬН, которые получают при использовании технологии рекомбинантных ДНК (см., например, АО 85/01958). Одним примером метода экспрессии ЬН с использованием рекомбинантной технологии является трансфекция

- 3 019432 эукариотических клеток последовательностями ДНК, кодирующими а- и β-субъединицу кН, которые могут быть в составе одного вектора или двух векторов, при этом каждая субъединица содержит отдельный промотор, как описано в Европейских патентах Νο. ЕР 0211894 и ЕР 0487512.

Другой пример использования рекомбинантной технологии для получения ЕН включает применение гомологичной рекомбинации для целей встраивания гетерологичного регуляторного сегмента в оперативной связи с эндогенными последовательностями, кодирующими субъединицу ЕН, как описано в Европейском патенте Νο. ЕР 0505500 (ЛррЕеб Кезеагсй 8уз!етз АК8 Ηοΐάίηβ Ν.ν.).

Фолликулостимулирующий гормон, или ФСГ, в контексте настоящего описания относится к ФСГ, получаемому в виде полноразмерного зрелого белка, который включает, без ограничения, человеческий ФСГ, или ФСГч, который может быть получен по рекомбинантной методике или выделен из источников человеческого происхождения, таких как моча женщин в постменопаузе.

Выражение вариант ФСГ относится к таким молекулам, которые отличаются по аминокислотной последовательности, характеру гликозилирования или по межсубъединичной связи от человеческого ФСГ, но которые демонстрируют активность ФСГ.

Термин активность, применительно к ФСГ, относится к способности композиции ФСГ или смешанной композиции проявлять биологические ответы, ассоциированные с ФСГ, такие как повышение веса яичников в тесте Стилмана-Поли (81ее1тап е! а1., 1953) или рост фолликул у женщины. Рост фолликул у женщины-пациентки можно оценивать с использованием ультразвука, например, путем определения количества фолликул, имеющих диаметр, равный или примерно равный 16 мм на 8 день стимуляции. Биологическую активность оценивают с учетом принятого стандарта для ФСГ.

Примеры варианта ФСГ включают ККП-ФСГ, длительно действующий модифицированный рекомбинантный ФСГ, состоящий из α-субъединицы дикого типа и гибридной β-субъединицы, в котором карбоксиконцевой пептид хорионического гонадотропина человека был слит с С-концом β-субъединицы ФСГ, как описано Ба Ρο1! е! а1. (1992) или К1ет е! а1. (2003). В это определение также включается одноцепочечный ККП-ФСГ, представляющий собой одноцепочечную молекулу, состоящую из следующих последовательностей (от Ν-конца к С-концу):

βΕδΗ

βΠ06-0ΤΡ(113-145)

αΕδΗ

где вФСГ обозначает β-субъединицу ФСГ, вХГч СТР (113-145) обозначает карбоксиконцевой пептид хорионического гонадотропина человека и аФСГ обозначает α-субъединицу ФСГ, как было описано К1еш е! а1. (2002).

Другие примеры вариантов ФСГ включают молекулы ФСГ, содержащие дополнительные сайты гликозилирования, включенные в а- и/или β-субъединицу, как описано в ШО 01/58493 (Махудеп), в частности, в соответствии с описаниями, приведенными в пп.10 и 11 в ШО 01/58493, а также молекулы ФСГ с межсубъединичными 8-8-связями, как описано в ШО 98/58957.

ФСГ или вариант ФСГ может быть получен по любому подходящему методу, такому как рекомбинантная технология, путем выделения или очистки из природных источников в качестве одного из вариантов, или путем химического синтеза либо с использованием любого их сочетания.

ФСГ или вариант ФСГ, используемый согласно настоящему изобретению, может быть получен не только с помощью рекомбинантных технологий, включающих применение клеток млекопитающих, но также может быть очищен из других биологических источников, таких как моча. Подходящие методики включают технологии, описанные в Нако1а е! а1. (1997), Кеепе е! а1. (1989), Сегра-РоЦак е! а1. (1993), П1аз е! а1. (1994), Е1аек е! а1. (1994), Vа1ονе е! а1. (1994), патент США Νο. 3119740 и патент США Νο. 5767067.

Термин вводить или введение относится к введению композиции по настоящему изобретению в организм пациента при необходимости лечения у него заболевания или состояния.

Термин пациент обозначает млекопитающего, имеющего потребность в лечении заболевания или состояния. Указанные пациенты представляют собой, без ограничения, пациентов следующего происхождения: человек, овца, свинья, лошадь, корова, кролик и т.п.

Термин водный разбавитель относится к жидкому растворителю, который содержит воду. Водные системы растворителя могут состоять только из воды или могут состоять из воды плюс один или несколько смешивающихся растворителей и могут содержать растворенные вещества, такие как сахара, буферы, соли или другие эксципиенты. Чаще всего используемые неводные растворители включают короткоцепочечные органические спирты, такие как метанол, этанол, пропанол, короткоцепочечные кетоны, такие как ацетон, и полиспирты, такие как глицерин.

Термин изотонический агент представляет собой соединение, которое является физиологически толерантным и придает соответствующее тоническое свойство композиции для предупреждения просачивания воды через клеточные мембраны, контактирующие с композицией.

Соединения, такие как глицерин, обычно используют для указанных целей в известных концентрациях. Другие подходящие изотонические агенты включают, без ограничения, аминокислоты или белки (например, глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, декстроза, сахароза и лактоза).

Термин бактериостатический или бактериостатическое вещество относится к соединению или

- 4 019432 композициям, добавляемым в качестве антибактериального агента к препарату.

Консервированная композиция, содержащая ЬН или вариант ЬН по настоящему изобретению, предпочтительно удовлетворяет требованиям, установленным законодательными или регулирующими органами, регламентирующим эффективность консервации, которой должен обладать коммерческий подходящий продукт многоразового использования, предпочтительно у людей.

Примеры бактериостатиков включают фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), хлорид бензалкония, хлорид бензетония, дегидроацетат натрия и тимеросал.

Термин буфер или физиологически приемлемый буфер относится к растворам соединений, в отношении которых известно, что они безопасны для фармацевтического или ветеринарного использования в композициях и которые обладают эффектом по поддержанию или контролю рН композиции в диапазоне значений рН, желательных для композиции. Приемлемые буферы для целей контроля значений рН в диапазоне от умеренно кислых значений рН до умеренно щелочных значений рН включают, без ограничения, такие соединения, как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, ТРИС и гистидин. ТРИС относится к 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиолу и к любой его фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительно указанные буферы включают фосфатные буферы с солевым раствором или приемлемой солью.

Термин фосфатный буфер относится к растворам, содержащим фосфорную кислоту или ее соли, откорректированные до желательного значения рН. В основном фосфатные буферы получают из фосфорной кислоты или солей фосфорной кислоты, включающих, без ограничения, соли натрия и калия. Некоторые соли фосфорной кислоты широко известны в данной области, такие как одноосновные, двухосновные и трехосновные натриевые и калиевые соли кислоты. Соли фосфорной кислоты также встречаются в виде гидратов соли. Фосфатные буферы могут охватывать определенный диапазон рН, в частности от примерно рН 4 до примерно рН 10, предпочтительные диапазоны варьируют от примерно рН 5 до примерно рН 9, наиболее предпочтительный диапазон значений рН составляет от примерно 7,5 до примерно 8,5 и еще наиболее предпочтительно составляет примерно рН 8,0.

Термин флакон или контейнер в контексте настоящего описания относится к широкому перечню резервуаров, подходящих для содержания в нем ЬН и разбавителя в стерильном состоянии. Примеры флаконов согласно настоящему описанию включают ампулы, картриджи, блистерные упаковки или любой другой такого рода резервуар, подходящий для доставки ЬН пациенту с помощью шприца-тюбика, насоса, включая (осмотические), катетера, чрескожного пластыря, легочного или трансслизистого спрея. Флаконы, подходящие для упаковки продуктов с целью парентерального, легочного, трансслизистого или чрескожного введения, также известны в данной области.

Термин стабильность относится к физической, химической и конформационной стабильности ЬН в композициях по настоящему изобретению (включая сохранение биологической активности). Нестабильность белковой композиции может быть вызвана химической деградацией или агрегацией белковых молекул с образованием полимеров более высокого порядка, диссоциацией гетеродимеров до мономеров, дегликозилированием, модификацией характера гликозилирования, окислением (в частности, αсубъединицы) или любой другой структурной модификацией, которая снижает по меньшей мере только одну биологическую активность полипептида ЬН, включенного в композицию по настоящему изобретению.

Стабильный/ая раствор или композиция представляет собой такой/ую раствор или композицию, где степень деградации, модификации, агрегации, потери биологической активности и т.п. входящих в их состав белков соответствующим образом контролируется и не повышается с течением времени до неприемлемого уровня. Предпочтительно указанная композиция сохраняет по меньшей мере 80% или примерно 80% целевой активности ЬН в течение периода времени, составляющего до 6 месяцев, при температуре, составляющей 1-10°С или примерно 1-10°С, более предпочтительно при температуре 2-8°С или примерно 2-8°С, более предпочтительно при температуре 4-5°С или примерно 4-5°С. Активность ЬН может быть определена с использованием биотеста по повышению веса семенных пузырьков⁶.

Термин лечение относится к введению препарата, врачебному наблюдению за пациентом, ведению пациента и/или уходу за пациентом, в случае которого желательно введение ЬН для целей стимуляции фолликул или функции яичек или для проявления любой другой физиологической реакции, регулируемой ЬН. Таким образом, лечение может включать, без ограничения, введение ЬН для целей индукции образования спермы или улучшения качества спермы, стимуляции высвобождения тестостерона у мужчин или развития фолликул или индукции яичников у женщин.

Выражение мультидозовое использование в контексте настоящего описания включает использование одной ампулы, одного флакона или картриджа с композицией ЬН для проведения более чем одной инъекции, например для проведения 2, 3, 4, 5, 6 или более инъекций. Указанные инъекции предпочтительно проводят в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 12, 24, 48 ч или примерно столько и т.п., предпочтительно в течение периода времени, составляющего 28 дней или примерно 28 дней.

Указанные инъекции могут проводиться с временными интервалами, составляющими, например, 6,

- 5 019432

12, 24, 48 или 72 ч.

Соль белка представляет собой аддитивную соль основания или кислоты. Такие соли образуются предпочтительно между одной или несколькими заряженными группами в белке и любыми, одним или несколькими, физиологически приемлемыми, нетоксичными катионами или анионами. Органические и неорганические соли включают, например, такие соли, которые были получены на основе кислот, таких как хлористо-водородная, серная, сульфоновая, винная, фумаровая, бромисто-водородная, гликолевая, лимонная, малеиновая, фосфорная, янтарная, уксусная, азотная, бензойная, аскорбиновая, птолуолсульфоновая, бензолсульфоновая, нафталинсульфоновая, пропионовая, угольная и т.п., или, например, на основе аммония, натрия, калия, кальция или магния.

Было обнаружено, что аминокислота, выбранная из группы, включающей аргинин, лизин или их смесь, или их соль, представляет собой подходящий стабилизирующий агент для получения стабильной жидкой композиции, включающей ЬН. В этой связи настоящее изобретение в первом своем аспекте относится к жидкой композиции гонадотропина, содержащей лютеинизирующий гормон (ЬН) или его вариант, отличающейся тем, что указанная композиция включает стабилизирующее количество аргинина или его солей и/или лизина и его солей.

Стабилизирующее количество аргинина или его солей и/или лизина и его солей, содержащееся в жидкой композиции, описывается концентрацией, составляющей от 10, точно или примерно, до 150 мл/мг, точно или примерно, от всей композиции, более предпочтительно от 20, точно или примерно, до 60 мг/мл, точно или примерно.

Предпочтительно концентрация аргинина или его солей составляет от 10 мг/мл, точно или примерно, до 50 мг/мл, точно или примерно, более предпочтительно от 20 мг/мл, точно или примерно, до 40 мг/мл, точно или примерно, еще более предпочтительно от 25 мг/мл, точно или примерно, до 35 мг/мл, точно или примерно, и наиболее предпочтительно составляет, точно или примерно, 31,5 мг/мл.

Предпочтительно концентрация лизина или его солей составляет от 10 мг/мл, точно или примерно, до 50 мг/мл точно или примерно, более предпочтительно от 20 мг/мл, точно или примерно, до 40 мг/мл, точно или примерно, еще более предпочтительно от 25 мг/мл, точно или примерно, до 35 мг/мл, точно или примерно, и наиболее предпочтительно составляет, точно или примерно, 28,5 мг/мл.

Лютеинизирующий гормон (ЬН) в составе жидкой композиции (ЬН) предпочтительно присутствует в концентрации от 1, точно или примерно, до 50 мкг/мл от всей композиции. В одном варианте осуществления настоящего изобретения лютеинизирующий гормон (ЬН) присутствует в концентрации, составляющей от 1, точно или примерно, до 15 мкг/мл, точно или примерно, от всей композиции, в частности, в том случае, когда она предназначается для однократного применения.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения лютеинизирующий гормон (ЬН) присутствует в концентрации, составляющей точно или примерно от 15 до 30 мкг/мл от всей композиции, в частности, если она предназначена для множественного (многодозового) использования.

Концентрация ЬН в композиции составляет 20 МЕ/мл, точно или примерно, до 2000 МЕ/мл, точно или примерно, более предпочтительно от 50, точно или примерно, до 1000 МЕ/мл, точно или примерно, и в особенности предпочтительно от 100 МЕ/мл, точно или примерно, до 600 МЕ/мл, точно или примерно.

Предпочтительно ЬН получают по рекомбинантной технологии, особенно предпочтительно его получают в клетках яичника китайского хомяка (СНО), трансфицированных одним или несколькими векторами экспрессии, включающими ДНК, которая кодирует α-субъединицу гликопротеина человека и βсубъединицу ЬН. ДНК, колирующая α- и β-субъединицы, может находиться на одном и том же векторе или на разных векторах.

Рекомбинантный ЬН имеет несколько преимуществ перед соответствующим гормоном, получаемым из мочи. Методики культивирования и выделения с использованием рекомбинантных клеток позволяют нивелировать различия между партиями. Тогда как, напротив, ЬН из мочи будет варьировать в значимой мере от партии к партии по таким показателям, как чистота, характер гликозилирования, сиалилирования и окисления субъединиц. В связи с большей однородностью партий и чистотой рекомбинантного ЬН гормоны могут быть легко идентифицированы и количественно определены с помощью таких методик, как, например, изоэлектрофокусирование (ИЭФ). Та легкость, с которой рекомбинантный ЬН может быть идентифицирован и количественно определен, позволяет заполнять флаконы на основании массы гормона (наполнение по массе), а не с учетом результатов биотестирования.

Предпочтительно жидкие композиции по настоящему изобретению содержат буфер, предпочтительно фосфатный буфер, в котором противоионы представлены предпочтительно ионами натрия и калия. Фосфатно-солевые буферы хорошо известны в данной области, в частности широко используется фосфатно-буферный раствор Дульбекко. Концентрации буфера в общей массе раствора могут варьировать и составлять, точно или примерно, 1, 5, 9,5, 10, 50, 100, 150, 200, 250 и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет, точно или примерно, 10 мМ. Особенно предпочтительным является буфер с концентрацией 10 мМ по фосфатным ионам и со значением рН, составляющим, точно или примерно, 8,0.

- 6 019432

Предпочтительно буфер корректируют таким образом, чтобы жидкие композиции по настоящему изобретению имели рН от 7,0, точно или примерно, до 9,0, точно или примерно, более предпочтительно от 7,5, точно или примерно, до 8,5, точно или примерно, включая такие значения, как рН 7,8, 8,0 и 8,2. Настоящее изобретения относится к жидким композициям на основе ЬН или варианта ЬН, которые могут быть представлены в однодозовой или многодозовой форме.

Те жидкие композиции ЬН, которые предназначены для многодозового использования, включают бактериостатическое вещество, такое как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), хлорид бензалкония, хлорид бензетония, дегидроацетат натрия и тимеросал. Предпочтительными соединениями являются бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония. Бактериостатическое вещество используется в количестве, которое будет давать концентрацию, эффективную для целей поддержания данной композиции в состоянии, по существу, лишенном бактерий (т.е. в виде, подходящем для инъекций), в течение всего периода проведения многодозовых инъекций, который может длиться от 12 до 24 ч или от 12 до 14 дней, точно или примерно, предпочтительно от 6 ч до 28 дней, точно или примерно.

Указанное бактериостатическое вещество предпочтительно присутствует в композиции в концентрации, составляющей от 0,005 до 15 мг/мл, точно или примерно, и более предпочтительно, от 0,01 до 12 мг/мл, точно или примерно. Указанное бактериостатическое вещество предпочтительно присутствует в композиции в концентрации, равной, точно или примерно, от 0,1 (масса бактериостатика/масса растворителя) до 2,0%, точно или примерно, и более предпочтительно от 0,2 до 1,0%, точно или примерно.

В случае использования бензилового спирта особенно предпочтительна концентрация 0,9% или 1,2%. В случае использования фенола особенно предпочтительна концентрация, составляющая 0,5%, точно или примерно. В случае использования сочетания бензилового спирта и хлорида бензалкония особенно предпочтительна концентрация 0,3 и 0,001% соответственно.

Предпочтительно композиции по настоящему изобретению содержат антиоксидант, такой как метионин, бисульфит натрия, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ) и бутилированный гидроксианизол (БГА). Наиболее предпочтителен метионин. Антиоксидант препятствует окислению ЬН (в особенности α-субъединицы).

Антиоксидант, например метионин, присутствует в концентрации, составляющей от 0,01 до 5,0 мг/мл, точно или примерно, и более предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/мл, точно или примерно.

Предпочтительно композиции по настоящему изобретению содержат поверхностно-активное вещество. Предпочтительно указанное поверхностно-активное вещество выбирают из группы полисорбатов, в частности представляет собой Τ\νΕΕΝ 20 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурат), Τ\νΕΕΝ 40 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмонопальмитат) и ΤνΕΕΝ 80 (полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат). Наиболее предпочтительным является Τ\νΕΕΝ 20 предпочтительно в концентрации, составляющей от 0,01 до 10 мг/мл, точно или примерно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем композиции включают по меньшей мере 25 мкг/мл р-ЛГч, 1,65 мг/мл Ыа₂НРО₄-2Н₂О, 0,104 мг/мл №1Н_;РО₄-Н₂О. 31,5 мг/мл моногидрохлорида аргинина, 0,05 мг/мл Τ\νΕΕΝ 20, 0,5 мг/мл метионина и 5 мг/мл фенола.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем композиции включают по меньшей мере 25 мкг/мл р-ЛГч, 1,65 мг/мл На₂НРО₄-2Н₂О, 0,104 мг/мл НаН₂РО₄-Н₂О, 28,5 мг/мл моногидрохлорида лизина, 0,05 мг/мл Τ\νΕΕΝ 20, 0,5 мг/мл метионина и 12 мг/мл бензилового спирта.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем композиции включают по меньшей мере 25 мкг/мл р-ЛГч, 1,65 мг/мл На₂НРО₄-2Н₂О, 0,104 мг/мл НаН₂РО₄-Н₂О, 28,5 мг/мл моногидрохлорида лизина, 0,05 мг/мл Τ\νΕΕΝ 20, 0,5 мг/мл метионина, 3 мг/мл бензилового спирта и 0,01 мг/мл хлорида бензалкония.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции для многодозового использования, включающей ЬН или вариант ЬН, стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из аргинина, лизина или их смеси, или их соли, а также бактериостатическое вещество, выбранное из группы, включающей бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу производства жидкой фармацевтической композиции для многодозового использования, включающему получение водного раствора, содержащего ЬН или вариант ЬН, стабилизирующее средство, выбранное из группы, состоящей из аргинина, лизина или их смеси, или их соли, а также бактериостатическое вещество, выбранное из группы, включающей бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония и νΕΊ (вода для инъекций).

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу производства упакованной фармацевтической композиции, включающему устройство для разливки раствора, содержащего ЬН или вариант ЬН, стабилизирующее средство, выбранное из группы, состоящей из аргинина,

- 7 019432 лизина или их смеси, или их соли, а также бактериостатическое вещество, выбранное из группы, включающей бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония.

В еще одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к производственному изделию фармацевтического назначения для использования человеком, которое содержит флакон с раствором, включающим ЬН или вариант ЬН, стабилизирующее средство, выбранное из группы, состоящей из аргинина, лизина или их смеси, или их соли, а также бактериостатическое вещество, выбранное из группы, включающей бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония, а также этикетку, на которой указано, что такой раствор может храниться, точно или примерно, в течение 24 ч или более после первого использования. Предпочтительно на этикетке указывается, что указанный раствор может храниться, точно или примерно, в течение 12 или 14 дней после первого использования.

До первого использования, то есть до вскрытия ампулы или картриджа, композиции по настоящему изобретению могут храниться, точно или примерно, в течение 6, 12 или 24 месяцев.

При соблюдении предпочтительных условий хранения до момента первого использования композиции хранят вдали от яркого света (предпочтительно в темноте), при температурах, составляющих, точно или примерно, 2-8°С, более предпочтительно, точно или примерно, 4-5°С.

Как указывалось выше, настоящее изобретение относится к жидким композициям ЬН или варианта ЬН для однократного и многодозового использования, содержащим бактериостатик.

Композиции по настоящему изобретению подходят для фармацевтического или ветеринарного применения.

Как указывалось выше, в предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к производственному изделию, включающему упаковочный материал и флакон с раствором, включающим ЬН или вариант ЬН, стабилизирующее средство, выбранное из группы, состоящей из аргинина, лизина или их смеси, или их соли, а также бактериостатическое вещество, выбранное из группы, включающей бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония, необязательно при наличии буферов и/или других эксципиентов, в водном разбавителе, где указанный упаковочный материал включает этикетку, где указывается, что такой раствор может храниться, точно или примерно, в течение 24 часов или более после первого использования.

Предпочтительно композиции по настоящему изобретению сохраняют по меньшей мере, точно или примерно, 80% от активности ЬН, имевшейся на момент упаковки, в течение 24 месяцев (до первого использования). Активность ЬН может быть определена с помощью биотеста на повышение веса семенных пузырьков⁵.

Композиции по настоящему изобретению могут быть получены в рамках способа, который включает смешивание ЬН или варианта ЬН и стабилизирующего количества аргинина или его солей и/или лизина или его солей, а также необязательно бактериостатического вещества, выбранного из бензилового спирта, фенола и сочетания бензилового спирта и хлорида бензалкония, в виде твердых веществ, или растворение ЬН или варианта ЬН и стабилизирующего количества аргинина или его солей и/или лизина или его солей, а также необязательно бактериостатического вещества, выбранного из бензилового спирта, фенола и сочетания бензилового спирта и хлорида бензалкония, в водном разбавителе. Смешивание компонентов и растворение их в водном разбавителе проводят с использованием стандартных методик растворения и смешивания. Для получения подходящей композиции, например, определенное количество ЬН или варианта ЬН в буферном растворе объединяют с аргинином или его солями и/или лизином или его солями и необязательно с бактериостатическим веществом, выбранным из бензилового спирта, фенола и сочетания бензилового спирта и хлорида бензалкония, в буферном растворе, в количествах, достаточных для получения белка, аргинина или его солей и/или лизина или его солей и необязательно бактериостатика в желательных концентрациях. Полученный раствор затем разливают во флаконы, ампулы или картриджи. Различные вариации этого процесса известны специалистам в данной области. Так, например, порядок добавления компонентов, если используются вспомогательные вещества, значения температуры и рН, при которых изготавливается композиция, представляют собой факторы, которые могут быть оптимизированы применительно к данной концентрации и используемым режимам введения.

В предпочтительном варианте композиции по настоящему изобретению изготавливают путем получения концентрированных растворов с известной концентрацией всех компонентов данной композиции (например, натрий-фосфатный буфер, аргинин и/или его соли, лизин и/или его соли, ΤΑΕΕΝ 20, метионин, ЬН) и затем отбора аликвоты точных объемов с образованием маточного раствора такого же состава, как и готовая композиция. Далее маточный раствор предпочтительно фильтруют через ΡΌΡ мембрану Ьигороге® (МИйроге) с размером пор 0,22 мкм для удаления микроорганизмов, после чего аликвоты вносят в отдельные контейнеры, такие как флаконы, ампулы или картриджи.

Композиции по настоящему изобретению могут использоваться в сочетании с композициями, включающими ФСГ или вариант ФСГ (например, 6оиа1-Р®).

Композиции по настоящему изобретению могут быть введены с использованием известных в практике устройств. Примеры таких одноразовых систем введения с флаконом включают шприцы-ручки для

- 8 019432 доставки, такие как Еаку1ес(®, Сопа1-Е® Реп, Нита)сс1®. ΝονοΡβη®, В-Э®Рсп. Аи1оРеи® и ОрИРеи®.

Продукты, заявленные в настоящем описании, включают упаковочный материал. При этом упаковочный материал содержит, кроме информации, требуемой по правилам регламентирующих органов, также указание о состояниях, при которых данный продукт может использоваться. В случае формы представления продукта в виде раствора в составе одного флакона имеется этикетка, где указывается, что такой раствор может храниться после первого использования в течение 24 ч или дольше, предпочтительно в течение периода времени, составляющего 12 или 14 дней. Заявленные в настоящем описании продукты предназначены для использования человеком в качестве фармацевтического продукта.

Приведенные ниже примеры даны для дальнейшей иллюстрации способов получения препаратов и композиций по настоящему изобретению. При этом область настоящего изобретения не ограничивается приведенными примерами, которые следует трактовать лишь как дополнительное пояснение.

Примеры Материалы

Компонент	Производитель
г-ЛГч, объемная форма	ЬаЬогаЪоьгез Зегопо ЗА
Ь-аргинин топокубгос?11ог1бе	Мегск собе 1.01544
Хлорид бензалкония	Пика собе 12063
Бензиловый спирт	Мегск соае 1.00987
М-крезол	Мегск собе 8.09691
Ь-глицин	Мегск собе 5,00190
Моногидрохлорид Ь-лизина	Мегск собе 1.05701
Метионин	Мегск собе 1.05707

Фенол	Мегск собе 1.00200
Ортофосфорная кислота 85% (ЕврФарм, ВР, ΝΕ) (РН Еиг, ВР, ΝΕ)	Мегск собе 1.00563
Гидроксид натрия	Мегск соае 1.06498
Дигидрат гидрофосфата динатрия	Мегск собе 1,06580
Моногидрат дигидрофосфата натрия	Мегск собе 1,06346
Безводный сульфат натрия	Мегск собе 1.006649
Сорбит	Зхдта соде 5-1876
Сахароза	Мегск собе 1.07653
Трегалоза	Мегск соае 1.03216
ΤΝΕΕΝ 20	Мегск собе 8.22184
Вода	тШЮ

Ниже приведены параметры, которые оценивались при анализе большого числа композиций: анализ стабилизирующих и/или бактериостатических средств;

совместимость с композициями ФСГ;

совместимость с первичной упаковкой;

профиль стабильности после хранения.

Рассматриваемые композиции представляли собой жидкие однодозовые и многодозовые композиции. Оценивали следующие шесть стабилизирующих средств:

моногидрохлорид Ь-аргинина (ЛВС или аргинин в примерах);

моногидрохлорид Ь-лизина (ЬУ8 или лизин в примерах);

трегалоза (ТВЕ);

Ь-глицин (СЬУ или глицин в примерах);

сахароза (8ЛС);

сорбит (8ОВ).

Оценивали указанные ниже четыре бактериостатических вещества для многодозовых композиций: бензиловый спирт (ВА);

м-крезол (тСг);

фенол (Рйе);

сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония (ВАСЬ).

Пример 1. Исследование стабилизирующих средств для многодозовых композиций.

- 9 019432

Проводили тестирование шести стабилизирующих средств (сахароза, аргинин, глицин, лизин, сорбит и трегалоза) с точки зрения их способности доставлять стабильные монодозовые композиции. Проанализированные, таким образом, композиции представлены в обобщенном виде в табл. 1.

Таблица 1 Состав нескольких однодозовых композиций р-ЛГч, содержащих различные стабилизирующие средства

Компоненты АтоипС/мл	5АС/250	АКС/250	εΐϊ/250	ΙΛ3/250	30Κ/250	ТВ.Е/250
р-ЛГч, объемы	6 мкг	б мкг	б мкг	б мкг	6 мкг	6 мкг
Ν3₂ΗΡ0₄ 2Н₂0	1,65 мг	1, 65мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг
Н₂0	0, 104	0, 104	0, 104	0,104	0,104	0,104
	мг	мг	мг	мг	мг	мг
Метионин	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг
ΤΗΕΕΝ 20	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг
Сахароза	105 мг	-	-	-	-	-
Аргинин	-	33 мг	-	-	-	-
Глицин		-	23 мг	-	-	-
Лизин	-	-	-	28 мг	-	-
Сорбит	-	-	-	-	56,5 мг	-
Трегалоза	-	-	-	-		10 6 мг
ЙГ1	4.5. до	Ч.6. до	4.5. ДО	Ч.8. ДО	4.8. ДО	4.8. ДО
	1мл	1мл	1мл	1мл	1мл	1мл

ц.8. = достаточное количество

Готовят каждый из растворов примерно по 40 мл, фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм в контейнер из нержавеющей стали объемом 22 и далее хранят при температуре 2-8°С, 25°С и 40°С в пластиковых пробирках объемом 15 мл. Растворы анализируют на содержание белка (по ГФ-ВЭЖХ), окисленных форм (по ОФ-ВЭЖХ), агрегатов (по ГФ-ВЭЖХ) и образование субъединиц (количественно, по ГФ-ВЭЖХ) в течение периода времени до 1 месяца. Результаты тестов, проведенных на полной панели, применительно к данному набору композиций показаны в табл. 2-5.

Таблица 2

Чистота препаратов по данным ГФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 40°С)

Композиция	% гетеродимеров	% свсбодньсх субъединиц	% агрегатов
т=о	Τ=1ά	Т=46	т=о	Τ=1ό	Т=4с!	Т=0	Т=16	Τ=4ό
ЗАС/250	96,37	62,27	50,61	0,00	33,71	45,04	3,63	4.02	4.36
ΟΕΥ/250	95,29	56.55	42,55	0,00	36.42	54.04	4,71	6,43	3,42
АНС/250	95,82	52,91	23,80	0,00	39,83	71,53	4,18	7,27	4.68
Ι.Υ3/250	95,66	63,26	36,55	0,00	32,57	59,85	4,35	4,18	3.60
8ОР/250	95,55	65,87	41,57	0,00	29,64	53,95	4,45	4,49	4,49
ТРЕ/250	92,73	58.22	42,41	0,00	32,62	48,63	7,28	9,16	8,97

Т = время;

= день (дни).

Таблица 3

Чистота препаратов по данным ГФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 25°С)

Композиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц	% агрегатов
Т=0	Τ=7ά	Т=1М	т=о	Т=7с!	Т=1М	Т=0	Τ=7ό	Т=1М
8АС/250	96.37	86,52	81.99	0.00	—	12.34	3,63	13,48	5,68
ΟΙ.Υ/250	95,29	97,41	78,52	0.00	—	18,64	4.71	2.59	2,84
АРЗ/250	95,82	98,01	80,80	0,00	—	16,15	4,18	2,00	3.05
Ι Υδ/250	95,66	99,20	80,83	0,00	—	17,19	4,35	0,81	1,99
8ОР/250	95,55	80,63	26,45	0,00	18,72	72,27	4,45	0,66	1,28
ТКЕ/250	92.73	95,29	74,86	0,00	—	17,24	7,28	4.71	7.91

М = месяц

Таблица 4 Процент окисленных форм по результатам ОФ-ВЭЖХ

Композиция	12 дней (+40°С)	1 месяц (+25⁶С)
8АС/250	7,62	21.84
СЬУ/250	7.46	п.а.
АКС/250	6.26	9,59
Ι-Υ8/250	6.68	4,90
8014/250	6.62	24,58
ТАЕ/250	19,95	10,45

п.а. = не применимо

- 10 019432

Таблица 5

Содержание р-ЛГч по данным ГФ-ВЭЖХ

Композиция	т=о	τ=ιυ (+4о°с)	Т=4й (+40°С)	Т=0	Т=1М (+25°С)
ЗАС/250	5,50	4,20	4.50	5,50	5,40
ΟΙ-Υ/250	6,10	5,10	5,10	6,10	5.03
АЕЮ/250	6,30	6,70	6,40	6,30	6,33
ίΥδ/250	6,00	4,80	5.50	6,00	6.02
8ОК/250	5,30	4,80	5.10	5,30	4.93
ТКЕ/250	5,40	4,80	5.40	5,40	5.23

На основании полученных результатов были выбраны сахароза, лизин и аргинин как лучшие эксципиенты для проведения дальнейших исследований их совместимости с возрастающими количествами метионина (250 и 500 мкг/мл), используемого в качестве антиоксиданта. Состав исследованных растворов приведен в табл. 6. Следует отметить, что эти растворы были получены ех ηονο.

Таблица 6

Состав однодозовых композиций р-ЛГч, содержащих выбранные стабилизирующие средства и различные количества метионина

Компоненты колмчество/мл	ЗАС/250	АН6/250	Ι-Υ5/250	3 АС/500	АЕЮ/500	ίΥδ/500
р-ЛГч объемн	6 мкг	6 мкг	6 мкг	6 мкг	6 мкг	6 мкг
Ца₂НРО₄ 2Н_гО	1.65 мг	1.65 мг	1.65 мг	1.65 мг	1.65мг	1.65 мг
№Н₂РО4 Н₂О	0.104 мг	0104мг	0.104мг	0.104мг	0.104 мг	0.104 мг
Метионин	250мкг	250 мкг	250 мкг	500 мкг	500 мкг	500 мкг
Тдаееп 20	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг
Сахароза	105мг	-		105мг	-	-
Аргинин		33 мг		-	33 мг	-
Лизин	-		28 мг		-	28 мг
ννη	Ч.а.до 1 мл	4-з.до 1 мл	Ч.8.ДС 1 мл	Ц.5.ДО 1 мл	Ц.З.ДО 1 мл	Ч.&.ДО 1 мл

Готовят каждый из растворов примерно по 100 мл, фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм в контейнер из нержавеющей стали объемом 22 мл и затем вводят для заполнения в стеклянные шприцы-тюбики объемом 1 мл для тестирования также совместимости между лекарственным веществом и контейнером для готового продукта (шприц-тюбик на 1 мл + поршень). Шприцы-тюбики хранят при температурах 2-8°С, 25°С, 33°С и 40°С. Условия хранения при температуре 33°С были введены для тестирования, с тем чтобы иметь компромиссные условия между слишком быстрой (40°С) и слишком низкой (25°С) кинетикой деградации продукта. Растворы далее анализировали на содержание р-ЛГч (по данным ГФ-ВЭЖХ), окисленных форм (по данным ОФ-ВЭЖХ), агрегатов (по данным ГФ-ВЭЖХ), для оценки образования субъединиц (количественно, по методу ГФ-ВЭЖХ), вплоть до 2-3 месяцев. Результаты тестов, проведенных на полной панели, применительно к данному набору композиций, описанных в табл. 6, показаны в табл. 7-11.

Таблица 7

Композиция	% гетероди- меров	% свободных субъединиц	% агрегатов	% гетеродимеров (2-8°С)
Т=0	Τ=4ά	Т=0	Τ=4ά	Т=0	Τ=4ά	Т=0	Т=13и
ЗАС/250	99, 12	38, 98	-	60,29	0,89	0, 74	99, 12	97,96
АКС/250	98, 30	9,16	-	90, 03	1,70	0, 83	98, 30	99, 23
ЬУЗ/250	98, 59	18, 27	-	81,02	1,41	0, 72	98, 59	99, 69
5АС/500	99, 34	33, 96	-	64, 11	0, 66	1, 93	99,34	98,66
АКС/500	98, 41	13,49	-	85, 94	1,59	0, 57	98,41	99,36
ЬУЗ/500	98, 72	29, 07	-	69, 89	1,22	1, 05	98,72	99,68

= недели.

- 11 019432

Таблица 8

Композиция	% гетеролимеров	% свободных субъединиц
Т=0	Τ=6ά	Т=4и	Т=6и	Т=8ы	Т=0	Τ=6ά	Т=4и	Т=6м	Т=8м
ЗАС/250	99,12	69, 75	65,46	64, 82	п.а.		29,25	46, 04	32,49	η. а.
АКС/250	98, 30	65, 03	39, 69	37,00	31,37	-	32,20	58,05	61,22	63,90
ЬУ2/250	98,52	74, 96	53, 95	46,28	43,23	-	23,59	44,42	52, 58	55, 09
ЗАС/500	Т=0	Τ=6ά	Т=4м	Т=6и	Т=8и	Т=0	Τ=6ά	Т = 4м	52, 34	η.а.
АКС/500	99,12	69, 75	65,46	64,82	η. а.	-	29,25	46, 04	65, 37	70,81
Ι.Υ2/500	98,30	65, 03	39,69	37,00	31,37	-	32,20	58,05	49, 04	53,24
Компо-	% гетеродимеров	% свободных субъединиц
ЗИНИЯ	Т = 0	Τ=6ά	Т=4й	Т=6ы	Т=8«	Т=0	Τ = 6ά	Т=4и	Т=6и	Т=8и
ЗАС/500	99, 34	71,26	43,14	27,77	η. а.	-	27,12	50,74	52, 34	п.а.
АКС/500	98,41	67, 04	38,04	32, 62	25,34	-	31,14	58,48	65,37	70,81
ЬУЗ/БОО	98,72	74, 03	52,81	49, 17	43,88	-	24,88	45, 07	49,04	53,24
ΚΟΜΠΟ-	% агрегатов
ЗИНИЯ	Τ’	= 0	Т=	6ά	Т = 4м	Т=	бы	Т-	8ы
5АС/250	о,	89	1,	01	η. а.	2,	70	η,	а.
АКС/250	1,	70	2,	77	2,26	1,	79	4,	74
ΙΛ5/250	1,	41	1,	45	1,64	1,	14	1,	69
ЗАС/500	о,	66	1,	63	19,90	6,	12	η .	а.
АКС/500	1,	59	1, 83	3,48	2,	02	3,	86

БУ8/500	1,	22	1,	09	2, 12	1,	79	2,	85

Таблица 9

Компо- зиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц	% агрегатов
Т=0	Т=4и	Т=8м	Т=0	Т=4н	Т=8м	Т=0	Т=4м	Τ=8ν
ЗАС/250	99, 12	98,36	76, 81	-	-	21,05	0,89	1, 65	2,15
АЙС/250	98, 30	79, 80	73,39	-	17,89	23, 99	1,70	2, 32	2, 63
ίΥΞ/250	98, 59	84,15	77, 60		13,78	21,23	1,41	п.а.	1,18
ЗАС/5С0	99, 34	η. а.	61,24		п.а.	33, 50	0, 66	п.а.	5,26
АКС/500	98,41	η, а.	69,45	-	п.а.	27,93	1,59	п.а.	2,63
ΓΥ3/500	98,72	η. а.	78,56	-	п.а.	19, 81	1,22	п.а.	1,64

Таблица 10

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ

Композиция	4 дня (+404)	8 недель (+25’0	4 недели ( + 33’С)	6 недель (+334)
ЗАС/250	6, 13	7,32	9,72	20,13
ЗАС/500	17,37	35,78	39,12	45,93
АКб/250	6,29	5, 96	9, 72	7,02
АКС/500	4, 69	5, 67	6, 69	8, 10
1Υ3/250	5,24	5, 05	8,00	8,63
ЬУЗ/500	3, 25	4,02	5,71	6, 84

Таблица 11 Содержание р-ЛГч по данным ГФ-ВЭЖХ

Композиция	т=о	Т=4 дня (+40°С)	Т=8 недель (+254)	Т=4 недели (+33’0	Т=6 недель (+334)	Т=8 недель (+зз4)
ЗАС/250	5, 03	3, 09	5,09	5,31	4,74	п.а.
ЗАС/500	6,27	4,92	6,00	5, 96	5, 63	6,20
АКС/250	5, 90	3,74	5, 50	5, 63	5, 34	5,17
АКС/500	5,00	3, 36	4,25	5, 05	п.а.	п.а.
ЬУЗ/250	6, 14	4, 54	5,74	5, 83	5, 58	5, 84
ЬУЗ/500	6, 08	3, 91	5, 61	5,73	5, 49	5,48

Согласно полученным результатам сахароза демонстрирует более высокую совместимость с 250 мкг/мл метионина, лизин - с 500 мкг/млм метионина и аргинин - с обеими концентрациями метионина.

Пример 2. Совместимость однодозовых жидких композиций р-ЛГч с многодозовой жидкой композицией ФСГ.

С учетом результатов, приведенных в примере 1, смешивают композиции, описанные в табл. 6, с композицией ФСГ (например, с многодозовой жидкой композицией Соиа1-Р®) и проводят их тестирова

- 12 019432 ние после 24-часового контакта при температуре 25°С в рамках указанных ниже методов:

ОФ-ВЭЖХ для оценки окисленных форм аг-субъединицы ФСГч и р-ЛГч (в табл. 12 показан процент чистоты относительно неокисленных форм);

ГФ-ВЭЖХ для количественной оценки уровня агрегатов;

ОФ-ВЭЖХ для определения титра р-ФСГч и р-ЛГч;

битест ίη νίνο для оценки р-ФСГч и р-ЛГч;

8Э8-РАСЕ для количественного определения свободных субъединиц и агрегатов р-ФСГч и р-ЛГч (данные не приведены);

данные визуального осмотра.

Полученные результаты приведены в табл. 12-14.

Таблица 12

Чистота по данным анализа в ОФ-ВЭЖХ и процент агрегатов по данным анализа в ГФ-ВЭЖХ

Композиция	% чистоты	% агрегатов
т=о	Т=24 Ь	Т=0	Т=24 И
5АС/250	98, 53	98, 61	0, 00	0,00
АЕС/250	97,29	99, 17	0,00	0,72
ΣΥ5/250	97, 81	97, 73	0,00	0,37
5АС/500	98, 50	98, 17	0,00	0,39
АКЗ/500	97,75	97,47	0,00	0, 69
Ι.Υ3/500	97,04	96,74	0,00	0,33

= часы

Таблица 13

Содержание ФСГ и ЬН

Композиция	Содержание р-ФСГч* ΟΟηΐ,Θηΐ.*	Содержание р-ЛГч #
т=о	Т=24Н	т=о	Т=24Ь
ЗАС/250	16,14	16,14	3, 67	3, 61
АКС/250	15, 45	16,01	4,15	4,21
Ι,Υ3/250	15, 35	15, 68	4,07	4, 15
ЗАС/500	16,29	16, 91	3,71	3, 70
АКС/500	16, 03	15, 80	4,15	4,05
ΒΥ5/500	15, 46	15, 69	4,05	4, 17

*ФСГ, теоретическое содержание: 200 МЕ=15,48 мкг/мл;

••[.II. теоретическое содержание: 100 МЕ=4 мкг/мл.

Таблица 14

Биотест

Композиция	Активность р-ФСГч	Активность р-ЛГч
Т=0	Т=24 ч	т=о	Т=24 ч
ЗАС/250	174,60	183,70	108.00	109,00

Все исследованные однодозовые композиции были совместимы с многодозовой композицией Сопа1-Б®, поскольку было показано отсутствие потери в содержании ФСГ и ЬН;

отсутствие окисления;

отсутствие агрегации и диссоциации до свободных субъединиц (по данным δΌδ-РАСЕ);

отсутствие потери в биологической активности ЬН и ФСГ.

Пример 3. Исследование стабильности однодозовых жидких композиций.

С учетом результатов, приведенных в предшествующих примерах, были получены композиции, описанные в табл. 6, за исключением тех, которые содержат аргинин, с двумя разными концентрациями р-ЛГч (6 и 12 мкг/мл), которые далее хранили при температуре 2-8°С и 25°С и затем тестировали в жестких условиях хранения, в рамках приведенных ниже методов анализа:

ОФ-ВЭЖХ для оценки содержания ЬН;

ОФ-ВЭЖХ для оценки окисленных форм а-субъединиц;

8Э8-РАСЕ для оценки уровня свободных субъединиц и агрегатов; биотест;

рН раствора;

визуальная оценка.

С помощью программного обеспечения 81аЫ1со 1.1 проводили статистический анализ результатов определения всех параметров, идентифицированных как связанные со стабильностью.

Концентрация р-ЛГч (по данным ОФ-ВЭЖХ) в условиях хранения при температурах 2-8°С и

- 13 019432

25±2°С.

Не было выявлено потери концентрации белка в композициях после 6-месячного хранения при температурах 2-8°С применительно к концентрации р-ЛГч (6 и 12 мкг/мл). После 6 месяцев хранения при температуре 25±2°С наблюдалось суммарное снижение указанной концентрации на уровне 0,4 мкг/месяц.

Биологическая активность р-ЛГч (по данным биотеста) в условиях хранения при температурах 2-8°С и 25±2°С.

Не наблюдалась релевантная потеря биологической активности исследованных композиций после 6-месячного хранения при температурах 2-8°С и 25±2°С применительно к концентрации р-ЛГч (6 и 12 мкг/мл).

Процент субъединиц и агрегатов по данным 8Ό8-ΡΆΟΕ.

Процентное содержание агрегатов по данным 8Ό8-ΡΆΟΕ сохраняется на уровне менее 2% в случае обеих концентраций после 6-месячного хранения при температурах 2-8°С и 25°С. Тогда как в условиях хранения при температурах 25±2°С через 6 месяцев наблюдается суммарное снижение на уровне примерно 5%/месяц.

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ.

Отмечается увеличение количества окисленных форм на уровне 0,4%/месяц после 6-месячного хранения при температурах 2-8°С и их повышение в диапазоне 0,6-1,4%/месяц в условиях хранения при температуре 25±2°С.

Значение рН и результаты визуального осмотра.

Не отмечалось изменений внешнего вида композиций при их визуальном осмотре (цвет, прозрачность, видимые частицы), а также каких-либо отклонений в значениях рН, определяемых как в ходе производства, так и при хранении.

Пример 4. Совместимость стабилизирующих и бактериостатических средств для много дозовых композиций.

Исследовали шесть стабилизирующих средств (сахароза, аргинин, глицин, лизин, сорбит и трегалоза) с точки зрения их совместимости с бактериостатическими средствами для целей доставки стабильных многодозовых композиций. Исследованные композиции приведены в суммарном виде в табл. 15.

Таблица 15

Состав нескольких многодозовых композиций р-ЛГч, содержащих различные сочетания стабилизирующих и бактериостатических средств

Компоненты количество/мл	5АС/250 ВА	5АС/250 тСг	ЗАС/250 РЬе	АОД/250 ВА	АКС/250 тСх	АК6/250 РИе
р-ЛГч, объемы.	25 мкг	25 мкг	25 мкг	2 5 мкг	2 5 мкг	25 мкг
Иа₂НР0₄ 2Н₂0	1,65 мг	1_г65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг
МаН₃Р0^ Н₂0	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг
Метионин	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг
ΤΗΕΕΝ 20	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг
Сахароза	105 мг	105 мг	105 мг	-
Аргинин	-	-	-	33 мг	33 мг	33 мг
Бензиловый спирт	0, 90%			0, 90%
м-крезол	-	0,30%	-	-	0,30%	-
Фенол	-	-	0,50%	-	-	0, 50%
КП	Ч - з до 1	д.з. до 1	4.8. ДО 1	Ч.з. до	Ч-з. до 1	Ч · в. до 1
	МЛ	мл	мл	1 мл 1	МЛ	МЛ
Компоненты	ΒΥ5/250	1Л5/250т	1.ΥΞ/250	2ОВ/250	ΞΟΚ/250	ΞΟΚ/250
количество/мл	ВА	Сг	РЪе	ВА	тСг	РПе
р-ЛГч, объемн.	25 мкг	25 мкг	25 мкг	25 мкг	2 5 мкг	25 мкг
Ма₂НР0, 2Н₂0	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг
Ν3Η₂Ρ0,) н_го	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг

- 14 019432

Метионин	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг
ТИЕЕМ 20	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг
Лизин	2 8 мг	28 мг	28 мг	-	-	-
Сорбит	-	-	-	56,5 мг	56,5 мг	56,5 мг
Бензиловый	0, 90%	-	-	0, 90%	-	-
спирт
м-крезол	-	0,30%	-	-	0, 30%	-
Фенол	-	-	0,50%	-	-	0,50%
ип	Ч-з. до 1	Ч.з. до 1	Ч-з. до 1	Ч-з. до	Ч-з. до 1	Ч.з. до 1
	МЛ	МЛ	МЛ	1 мл	МЛ	мл 1
Компоненты	СЬУ/250/	СЬУ/250/	СЬУ/250/	ТКЕ/250/	ТКЕ/250/	ТКЕ/250/
количество/мл	БА	тСг	РЬе	ВА	тСг	РЬе
р-ЛГч,	25 мкг	2 5 мкг	25 мкг	25 мкг	2 5 мкг	2 5 мкг
объемн.
Νη₂ΗΡ0₄ 2Н₂0	1, 65 мг	1,65 мт	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг
МаН₂РО₄ Н₃0	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг
Метионин	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг	250 мкг
ΤΗΕΕΝ 20	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг
Глицин	23 мг	2 3 мг	23 мг	-	-	-
Трегалоза	-	-	-	106 мг	106 мг	106 мг
Бензиловый	0,90%	-	-	0, 90%	-	-
спирт
м-крезол	-	0,30%	-	-	0, 30%	-
Фенол	-	-	0,50%	-	-	0,50%
ИЕ1	Ч. а. до 1	Ч.з. до 1	Ч.з. до 1	ς.з. до	Ч.з, до 1	Ч.з. до 1
	МЛ	МЛ	МЛ	1 мл	мл	МЛ

Готовят растворы, каждый по 40 мл, фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С, 25°С и 40°С в пластиковых пробирках объемом 15 мл. Далее растворы анализируют на содержание белка (по методу гель-фильтрации-ВЭЖХ, ГФ-ВЭЖХ, данные не показаны), на уровень окисленных форм (по методу ВЭЖХ с обращением фазы, ОФ-ВЭЖХ), агрегатов (по ГФ-ВЭЖХ) и для оценки образования субъединиц (количественно, по ГФ-ВЭЖХ) в течение периода времени до 1 месяца. Результаты полного набора тестов, проведенных на всей совокупности исследуемых композиций, приведены в табл. 16-18. Все растворы, содержащие м-крезол (тСг), становятся опалесцирующими даже сразу после производства в связи с несовместимостью бактериостатика и поверхностно-активного вещества (Τ\\'ΕΕΝ 20).

- 15 019432

Таблица 16

Чистота продукта по данным ГФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 40°С)

Композиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц	% агрегатов
Т=0	Τ=1ά	Τ-4ά	Т=0	Т= 1с1	Τ=4ά	Т=0	Τ=1ά	Τ=4ά
5АС/250/тСг	98,91	89,61	52,93		η. а.	23,67	1, 10	10,38	23,41
2АС/250/ВА	95,50	74,04	51,52	-	22,65	45,12	4, 50	3,33	3,36
ЗАС/250/₽Ье	98,34	74,20	67,13		19, 63	23,71	1,66	5,57	9, 17
С1Л/250/тСг	97,95	96, 54	86, 76	-	9, 55	η . а .	2, 05	3,14	η. а .
СЬУ/250/ΒΑ	96,08	59,58	41,59	-	37,82	56,45	3, 92	2,61	1, 97
ΟΕΥ/250/Рке	96,49	74,71	86,06	-	20,01	9,22	2, 51	5,28	4,73
АКС/250/гаСг	97,94	70,34	44,39	-	28,39	53,33	2, 06	1,29	2,29
АКС/250/ВА	91,44	35,99	15,91	-	58,99	79, 65	8, 57	5,03	4,45
АРС/250/₽Ье	95,31	63,27	29,12	-	33,75	67,18	4, 69	2,98	3,70
Композиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц	% агрегатов
Т=0	Τ-1ά	Τ=4ά	Т=0	Τ=1ά	Τ=4ά	Т=0	Τ=1ύ	Т=4с1
ЬУЗ/250/тСг	98, 19	81,57	65,68	-	17,99	33,10	1, 81	η. а.	1,22
ЬУЗ/250/ΒΑ	94,75	47,94	33, 61		48,59	63,14	5,26	3, 48	3,26
ЬУ5/250/РЬе	97, 91	72,68	56,73		26,13	42,26	2, 09	1,16	1,01
ЗОВ/250/тСг	90,46	86,33	58,78		η. а.	18,87	9, 55	13,68	22,36
50К/250/ВА	94,08	62,71	45,27	-	64,17	47,22	5, 93	3,13	7, 52
50В/250/Рйе	94,74	70,58	55, 75	-	22,30	32,76	5,26	7,13	11,50
ТКЕ/250/тСг	86,07	77,26	40,60	-	η. а.	20,87	13, 93	22,74	38,53
ΤΚΕ/25Ο/ΒΆ	94,74	69,53	42,19	-	21,36	44,22	5, 26	9,12	12,88
ТВЕ/25О/РЬе	91,05	85,29	54,89	-	η. а.	24,28	8, 95	14,72	20, 83

Таблица 17

Чистота продукта по данным ГФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 25°С)

Композиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц	% агрегатов
Т=0	Т=7с1	Т=1М	Т=0	Τ=7ά	Т=1М	Т=0	Τ=7ά	т»1м
8АС/250/шСг	98, 91	53, 76	69,30	-	31,19	15, 13	1, 10	14,34	15,57
5АС/250/ВА	95, 50	95,04	75,84	-	-	14, 66	4, 50	4, 96	9,50
5АС/250/Рйе	98, 34	93, 82	85,49	-	-	-	1, 66	6, 18	14, 51
СЬУ/250/тСг	97, 95	97,00	95,39	-	-	-	2, 05	3, 00	4,62

СИ/250/ВА	96, 08	97,63	68, 21	-	-	28,42	3, 92	2,37	2,17
01Л/250/РЬе	96,49	97,44	93, 19	-	-	-	2,51	2,57	6, 10
ЙКС/250/тСг	97, 94	98, 73	78, 33	-	-	19, 73	2,06	1,28	1,94
АКС/250/ВА	91, 44	97,38	79,79	-	-	18, 91	8,57	2, 63	1, 31
АКС/250/РЬе	95, 31	98,33	82, 18		-	16,59	4,69	1,67	1,23
ЬУЗ/250/тСг	98, 19	98,28	95,38		-	-	1, 81	1,73	4,27
ΣΥ3/250/ΒΑ	94,75	97, 39	82,54	-	-	14, 66	5,26	2, 61	2,80
ЬУЗ/250/Рйе	97,91	99,55	98, 61	-	-	-	2,09	0,46	1,40
5ОВ/250/тСг	90, 46	82, 65	64,24	-	-		9, 55	17,23	35,76
ЕОК/250/ВА	94,08	95, 93	68,59	-		21,99	5, 93	4, 08	9, 43
ЗОК/250/РНе	94, 74	92, 55	81, 96	-	-	-	5,26	7,46	18,05
ΤΒΕ/250/тСг	86, 07	75,78	45,61	-	-	-	13, 93	24,23	54,40
ТКЕ/250/ВА	94,74	91,22	67,28	-	-	13,75	5,26	8,79	18, 97
ТКЕ/250/РПе	91, 05	84, 53	66,79	-	-	-	8, 95	15,47	33,22

- 16 019432

Таблица 18

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ

Композиция	12 дней (+40^вС)	1 месяц (+25^&С)
ЗАС/250/тСг	51, 14	16, 62
5АС/250/ВА	14,07	8,83
ЗАС/250/РЬе	25, 55	17, 54
СЬУ/250/тСг	59,29	5,43
СЬУ/250/ВА	10, 53	4,44
СЬУ/250/РЬе	34,86	16, 06
АКС/250/тСг	65,27	3, 13
АВС/250/ВА	7, 12	5, 65
АКС/250/РИе	15,49	11,27
Ι,ΥΞ/250/тСг	44,05	16, 36
ЬУЗ/250/ΒΑ	13, 69	9,30
Ь¥3/250/РЛе	56, 55	17, 86
ЗОК/250/тСг	58,29	25, 68
ЗОК/250/ВА	13, 51	8,49
ЗОК/250/РЬе	30, 78	17, 75
ΤΚΕ/250/тСг	45, 84	26, 36
ТВ.Е/250/ВА	19,12	11, 41
ΤΚΕ/250/РЬе	23, 87	27,76

На основании полученных результатов были выбраны сахароза, лизин и аргинин как лучшие стабилизирующие средства для их дальнейшего исследования с точки зрения совместимости с повышенным количеством метионина (500 мкг/мл). Бензиловый спирт, фенол и сочетание бензилового спирта и хлорида бензалкония были выбраны в качестве бактериостатических средств. Исследованные композиции описаны в обобщенном виде в табл. 19.

Таблица 19

Состав нескольких многодозовых композиций р-ЛГч, содержащих выбранные стабилизирующие средства и разные бактериостатические средства

Компоненты количество/мл	5АС/500 ВА	ЗАС/500 ВАСЬ	ЗАС/500 РЬе	АВС/500 ВА	АйС/500 ВАСЬ	АВЙ/500 РЬе
р-ЛГч, объемн.	2 5 мкг	25 мкг	2 5 мкг	25 мкг	25 мкг	25 мкг
Ма₂НР0₄ 2Н₂0	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг
МаН₂Р0₄ Н₂0	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг
Метионин	500 мкг	500 мкг	500 мкг	500 мкг	500 мкг	500 мкг
ΤΝΕΕΝ 20	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг	50 мкг
Сахароза	105 мг	105 мг	105 мг		-	-
Аргинин	-	-	-	33 мг	3 3 мг	33 мг
Бензиловый спирт	1,2%	0, 30%		1,2%	0,30%
Хлорид бензалкония		0,001%			0,001%
Фенол	-	-	0, 50%	-	-	0, 50%
ип	ς.8. до 1 мл	ς.8. до 1 мл	4*5. ДО 1 мл	ς.8. до 1 мл	ς.8. до 1 мл	д.з. до 1 мл
Компоненты количество/мл	ЬУЗ/500/ВА	Ь¥3/500/ВАСЬ	Ъ¥5/500/РЬе
р-ЛГч, объемн.	25	мкг	25	мкг	25	мкг
Ма₂НР0₄ 2Н₂0	1,65 мг	1,65 мг	1,65 мг
ν&η₂ρο₄ Н₂0	0,104 мг	0,104 мг	0,104 мг
Метионин	500	мкг	500	мкг	500	мкг
ΤΚΕΕΝ 20	50	мкг	50	мкг	50	мкг
Лизин	28	мг	28	мг	28	мг

- 17 019432

Бензиловый спирт	1, 2%
Хлорид бензалкония
Фенол	-
ип	д.з. до 1 мл

0, 30%
0,001%
-	0,50%
д.з. до 1 мл	д.5. до 1 мл

Готовят растворы, каждый по 100 мл, фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм и вводят для заполнения в картриджи на 3 мл. Используют указанную ниже первичную упаковку:

стеклянные картриджи на 3 мл (Νιιονη Отр1) с силиконовым покрытием;

гофрированные колпачки с кодами САР I 3МЬ ЫН075-1-Н1В РМ 257/2 (Нс1уос1 Рйагта);

плунжеры с покрытием: Нс1уос1 Υ9282 РМ257/2, с покрытием ОтпгДех.

Картриджи хранят при температурах 2-8°С, 25°С и 40°С с последующим анализом содержания белка (по ГФ-ВЭЖХ), уровня окисленных форм (по ОФ-ВЭЖХ), агрегатов (по ГФ-ВЭЖХ) и для оценки образования субъединиц (количественно, по методу ГФ-ВЭЖХ) в течение периода времени до 2 месяцев. Результаты полного набора тестов, проведенных на второй совокупности исследуемых композиций, приведены в табл. 20-26.

Таблица 20

Композиция	%гетеродимеров гетеродимеров	% свободных субъединиц	% агрегатов
т=о	Ί>3 дня	т=о	Т=3 дня	Т=0	Т=3 дня
ЗАС/500/ВА	100, 00	60,01	-	39,55	-	0, 44
ЗАС/500/ВАСЬ	100,00	67,39	-	32, 34	-	0,27
ЗАС/500/₽Ье	99, 66	65,01	-	31,27	0,34	3, 72
АКС/500/ВА	99, 91	45, 63	-	54,65	0,10	—
АНС/500/ВАСЬ	99, 93	44, 67	-	55,33	0,07	-
АКС/500/РЬе	99,93	61, 97	-	38,03	0,08	-

ЬУЗ/500/ΒΑ	99, 93	61,71	-	38,30	0,08	-
ЬУЗ/500/ВАСЬ	99, 95	61, 33	-	38,68	0,06	-
ЬУЗ/500/РЬе	99,93	76, 03	-	23, 59	0, 08	0,39

Таблица 21

Чистота продукта по данным ГФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 33°С)

Композиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц с	% агрегатов
Т=0	Τ=3ω	Т=4м	Τ=8ω	Т=0	Τ=3ν	Т=4м	Т=0	Т=3м
5АС/500/ВА	100,00	76, 56	71,22	59,22	-	22, 03	26, 35	/	1,43
ЗАС/500/ВАСЬ	100,00	81,49	78,95	63,53	-	17, 26	20,10	/	1,26
ЗАС/500/РЬе	99,66	76,24	67,13	51,10	-	14,26	18, 03	0, 34	9, 51
АВС/500/ВА	99,91	71, 90	71,52	61,41	-	27, 89	27, 73	0, 10	0,21
АКС/500/ВАСЬ	99,93	69,08	66,86	57,22	-	30, 67	32, 94	0, 07	0,26
АВО/500/ВЬе	99,93	86, 11	76,74	75, 51	-	13,76	22, 55	0,08	0,14
ΑΥ3/500/ΒΑ	99,93	83,09	76,72	67,30	-	16,76	22,50	0,08	0,16
ЬУг/БОО/ВАСЬ	99,95	81,03	75,21	70,20	-	18,88	24, 64	0,06	0, 09
ЪУ8/500/РИе	99, 93	87,29	80,51	68, 85	-	12, 10	18,53	0, 08	0, 62

Таблица 22

Композиция	% гетеродимеров	% свободных субъединиц с	% агрегатов
Т=0	Т=4м	Τ=8ν	Т=0	Т=4ы	т=о
8АС/500/ВА	100,00	83, 85	82,87	-	14,69	-
8АС/500/ВАСЬ	100,00	86, 30	85,78	-	13,06	-
5АС/500/РНе	99,66	79,35	75,26	-	13,39	0,34
АНС/500/ВА	99,91	82,32	82,13	-	17, 39	0,10
АКС/500/ВАСЪ	99,93	80,42	80,77	-	19, 25	0,07
АКС/500/РИе	99,93	84,59	80,95	-	15,13	0,08
ЪУ5/500/ВА	99,93	85,04	85,10	-	13,78	0,08
ЬУЗ/500/ВАСЬ	99, 95	84,24	86,22	-	15, 42	0,06
ЪУ5/500/₽Ье	99, 93	85, 41	81,22	-	13, 68	0,08

- 18 019432

Таблица 23

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 33°С)

Композиция	Т=0	Т=3 недели	Т=8 недель	Т=13 недель
ЗАС/500/ВА	1,12	5,21	4,21	4,26
ЗАС/500/ВАСЬ	0, 90	5, 59	4, 90	4,46
ЗАС/500/РЬе	0, 99	8,28	6, 01	16,14
АК2/500/ВА	0, 69	4,52	4, 13	2, 65
АКС/500/ВАСЬ	1, 13	4,57	3, 57	2, 97
АРС/500/РЬе	0, 94	4,60	5, 24	4, 82
ЬУЗ/500/ΒΑ	1, 53	5, 71	16,34	8, 77
ЬУЗ/500/ВАСЬ	1, 60	4,49	5, 83	5,70
ЬУЗ/500/РЬе	0, 66	9, 66	34,97	25,51

Таблица 24

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ (хранение при температуре 25°С)

Композиция	т=о	Т=4 недели	Т=8 недель	Т=13 недель
ЗАС/500/ВА	1,12	2, 04	2, 19	2, 44
ЗАС/500/ВАСЬ	0, 90	2, 10	2,31	2, 23
ЗАС/500/РЬе	0, 99	2, 68	5, 72	7, 50
АКС/500/ВА	0, 69	1,40	1,61	1,65
АВе/500/ВАСЬ	1, 13	1, 46	2,31	1,89
АКС/БОО/РЬе	0, 94	1,31	2,77	2,35
ЪУЗ/БОО/ВА	1, 53	2, 51	3, 35	4,73
ЪУЗ/500/ВАСЬ	1, 60	1,96	3, 14	3,47
ЪУЗ/БОО/РЬе	0, 66	4, 05	11,38	22, 52

Таблица 25

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ

Композиция	Т=0	Т=13 недель (+5’С)	Т=0	Т=3 дня ( + 40’0
5АС/500/ВА	1,12	1,11	1,12	1,16
5АС/500/ВАСИ	0, 90	1,29	0, 90	1,25

ЗАС/500/РКе	0, 99	2, 51	0, 99	1,47
АК6/500/ВА	0, 69	1, 03	0, 69	0, 64
АК6/500/ВАСЬ	1,13	1, 16	1, 13	1,06
АКб/500/РИе	0, 94	2, 02	0, 94	1,47
Ι.Υ5/500/ΒΑ	1,53	2, 03	1,53	1,84
Ъ¥3/500/ВАСЬ	1,60	1, 56	1, 60	1,58
ЪУЗ/500/Р1яе	0, 66	п.а.	0, 66	3,10

Таблица 26

Содержание р-ЛГч по данным ГФ-ВЭЖХ

Композиция	т=о	Т=3дня (+40’0)	Т=3нед ( + 33’0	Т=4нед (+33’С)	Т=8нед < + 33°О	Т=4нед (+25’С)	Т=8нед (+25°С)
ВАС/500/ВА	20,38	21,70	21,05	22,54	16, 47	23, 70	18,43
ЗАС/500/ВАСЬ	21,73	22, 06	21,31	22, 64	18, 77	23, 65	18,10
ЗАС/500/РЬе	21,24	21,49	21,02	22,53	20, 71	22, 66	17,23
АКС/500/ВА	22,23	18,86	19, 52	24 , 64	16, 14	25, 26	17,69
АКС/500/ВАСЬ	22,38	21, 48	21,71	23, 52	16, 86	24, 18	19,34
АКС/500/РЬе	21,34	22, 38	20, 60	23, 09	16, 99	24 41	16,32
1Υ3/500/ΒΑ	20,33	20, 93	18, 85	22, 10	14, 93	24,24	17,36
ЪУЗ/500/ВАСЬ	23, 83	21,78	20, 68	23, 44	15, 50	24,07	18,60
ЪУЗ/500/РЬе	21,34	21,05	20, 20	21,89	16, 50	22,99	16,56

Полученные результаты подтвердили совместимость стабилизирующих средств с повышенным количеством метионина (см. пример 1). Дополнительно, эти результаты показали, что бактериостатические вещества совместимы с метионином в количестве 500 мкг/мл.

- 19 019432

Пример 5. Совместимость многодозовых жидких композиций р-ЛГч с многодозовой жидкой композицией ФСГ.

На основании результатов, описанных в примере 4, проводили смешивание композиций р-ЛГч в картриджах на 3 мл с композицией ФСГ (например, с многодозовой жидкой композицией Сопа1-Б®) и далее тестировали их после 24-часового контакта при температуре 25°С с использованием приведенных ниже методик:

ГФ-ВЭЖХ для оценки чистоты;

ОФ-ВЭЖХ для определения окисленных форм α-субъединицы р-ФСГч и р-ЛГч;

биотест ίη νίνο для определения р-ФСГч и р-ЛГч;

8Ό8-ΡΑΟΕ для количественного определения свободных субъединиц и агрегатов р-ФСГч и р-ЛГч (данные не приведены);

измерение рН раствора;

визуальная оценка.

Полученные результаты представлены в табл. 27-29.

Таблица 27

Чистота продукта по данным ГФ-ВЭЖХ

Композиция	% гетеродимеров	% агрегатов
Т=0	Т=24й	Т=0	Т=24И
5АС/500/ВА	98,28	98, 41	0, 30	1,09
ЗАС/500/ВАСЪ	98,85	99, 66	0, 00	0,43
ЗАС/500/РЬе	98,18	97,68	0,27	0,54
АКС/500/ВА	98,31	98, 61	0,28	0, 98
АНС/500/ВАСЬ	97,68	98, 52	0, 33	0,53
АЕС/500/РЬе	97,89	97, 73	0, 44	0,77
ΣΥ5/500/ΒΑ	97,35	97, 51	0, 38	1,09
ЪГЗ/500/ВАСЬ	97, 97	98, 82	0, 28	0,81
ЬТЗ/500/РИе	98,29	98, 40	0, 37	1,01

Таблица 28

Содержание ФСГ и ЬН

Композиция	Содержание р-ФСГч*	Содержание р-ЛГч #
Т=0	Т=24 Ь	Т=0	Т=24 Ь
ЗАС/500/ВАСЬ	29,50	31,15	7,20	8,31
5АС/500/РНе	30,88	31,28	7, 34	7, 54
АКС/500/ВА	30,46	31,00	8, 02	8, 44
АЕС/500/ВАСЬ	32,23	32, 84	7, 12	7, 40
АКС/500/₽Не	30,07	31, Об	7,78	8, 05
ЪУ5/500/ВА	30,91	32,11	6,88	7, 25
ЬУЗ/500/ВАСЪ	28,57	31, 66	6,64	7,62
ЪУЗ/500/РЬе	28, 75	31,25	6,80	7,47

* Расчетное количество ФСГ: 200 МЕ=30,96 мкг/мл.

# Расчетное количество ЛГ1: 100 МЕ=8 мкг/мл.

Таблица 29

Биотестирование

Композиция	Активность р-ФСГч	Активность р-ЛГч
Т=0	Т=24 Ь	Т=0	Т=24 Ь
ЗАС/500/ВАСЬ	365,7	355, 0	227, 0	212,7
ЙНС/500/РНе	387, 5	393, 0	231, 4	243,0

Все исследованные многодозовые композиции совместимы с многодозовой композицией Сопа1-Б®, поскольку отмечается отсутствие потерь в содержании ФСГ и ЬН;

отсутствие окисления;

отсутствие агрегации (по данным ГФ-ВЭЖХ);

отсутствие образования агрегатов и субъединиц по данным 8Ό8-ΡΑΟΕ;

отсутствие потерь в биологической активности ЬН и ФСГ. Пример 6. Совместимость с первичной упаковкой.

Для тестирования совместимости между композициями р-ЛГч и контейнерами для готовой продукции (шприцы и картриджи) провели исследование матрицы для оценки следующих параметров: эффект концентрации р-ЛГч: 6, 12, 24 мкг/мл;

- 20 019432 эффект заполняемого в контейнере объема: 0,25, 0,5, 1 мл;

влияние типа контейнера: стеклянный шприц на 1 мл и стеклянный картридж на 3 мл;

эффект бактериостатического вещества: композиции получают с использованием и без использования бактериостатиков и хранят в картриджах объемом 3 мл.

Одну композицию (8ЛС/500/ВЛСЬ) получили с разной активностью р-ЛГч и ввели в контейнеры, соблюдая разные объемы заполнения. Провели качественную оценку партий продукта в рамках ГФВЭЖХ в течение периода времени до 1 недели при температуре 33°С. Результаты проиллюстрированы на фиг. 1(Л-Р). На фиг. 2(А-В) проиллюстрировано сравнение процентного содержания гетеродимеров, по данным анализа композиции методом ГФ-ВЭЖХ, в композиции при добавлении и без добавления бактериостатических веществ. Результаты, приведенные на фиг. 1 и 2, позволяют сделать следующие выводы:

не отмечается воздействие контейнера на композиции в случае концентраций 12 и 24 мкг/мл;

не отмечается влияние заполняемого объема на композиции в случае концентраций 12 и 24 мкг/мл; отмечается положительный эффект повышенной концентрации на диссоциацию субъединиц;

не отмечается различий между партиями, содержащими и не содержащими бактериостатики;

более высокая стабильность ассоциируется с более высокой концентрацией р-ЛГч.

Пример 7. Исследование стабильности многодозовых жидких композиций.

На основании результатов, описанных в предыдущих примерах, выбрали четыре композиции, описанные в табл. 19 (8ЛС/500/ВЛСЬ, ЬУ8/500/ВЛ, ΕΥδ/500/ВЛСЬ и ЛК.С/500/РНе). которые поместили на хранение при температурах 2-8°С и 25°С и протестировали в жестких условиях оценки стабильности, с использованием в программе тестирования следующих методов:

ОФ-ВЭЖХ для оценки содержания ЬН;

ОФ-ВЭЖХ для определения уровня окисленных форм α-субъединиц;

ОФ-ВЭЖХ для определения содержания фенола;

ОФ-ВЭЖХ для определения содержания хлорида бензалкония;

ОФ-ВЭЖХ для определения содержания бензилового спирта;

δΌδ-ΡΛΟΕ для определения содержания свободных субъединиц и агрегатов;

биотестирование;

измерение рН раствора;

визуальный осмотр.

Количество лизина и аргинина в указанных выше композициях откорректировали (в частности, довели содержание моногидрохлорида Ь-лизина до 28,5 мг и моногидрохлорида Ь-аргинина до 31,5 мг) для оптимизации изотонических свойств композиции.

Провели статистический анализ результатов, полученных по всем параметрам, которые были идентифицированы как указывающие на стабильность, с использованием для анализа программного обеспечения δίαΝ^ 1.1.

Концентрация р-ЛГч (по данным ОФ-ВЭЖХ) при хранении в условиях температур 2-8°С и 25±2°С.

В композициях не наблюдалось статистически значимых потерь в концентрации белка после 12месячного хранения при температуре 2-8°С. Обычно наблюдаемое снижение после 6-месячного хранения при температуре 25±2°С составляло 0,4 мкг/мл.

Биологическая активность р-ЛГч (по данным биотеста) при хранении в условиях температур 2-8°С и 25±2°С.

Не отмечалось релевантной потери в биологической активности композиций после 12-месячного хранения при температурах 2-8°С и 25±2°С.

Процент субъединиц и агрегатов по данным δΌδ-ΡΛΟΕ.

Процентное содержание агрегатов по данным δΌδ-ΡΛΟΕ остается ниже 2% для всех композиций после их 12-месячного хранения при температурах 2-8°С и 25°С.

Процентное содержание субъединиц по данным δΌδ-ΡΛΟΕ возрастает свыше 32% для всех композиций после их 6-месячного хранения при температуре 25°С.

Процент окисленных форм по данным ОФ-ВЭЖХ.

В композициях δΑί-ΌΧΙ/βΑΟΈ· и ΑΚΌ/500/Ρ1κ отмечается сниженный уровень образования окисленных форм.

Величина рН, визуальный осмотр.

Не отмечалось изменений ни во внешнем виде композиций (цвет, прозрачность, видимые частицы), ни по величине рН как в ходе производства, так и при хранении.

Содержание бактериостатических веществ.

Оценивали целевые количества фенола и бензилового спирта и не было выявлено потерь при измерении в точках от 6 до 12 месяцев. Количество хлорида бензалкония ниже целевого значения (6 мкг/мл, а не 10 мкг/мл) было выявлено в композиции δΑС/500/ВΑС^ в точке оценки 6 месяцев.

Эффективность бактериостатических веществ.

Результаты тестов по оценке бактериостатической эффективности, проведенные в Т=0, с повтором

- 21 019432 анализа в точке 9 месяцев показаны в табл. 30-33.

Таблица 30

Результаты тестирования бактериостатической эффективности многодозовой композиции 8АС/500/ВЛСЬ

Микроорганизм	Ьод снижения против Т=0
Т=6 час	Т=24 час	Т=7 дней	Т=14 дней	Т=2 8 дней
3 СарЬу1ососсиз	>3	>3	>3	>3	Нет
аигеиз					снижения
Рзеидотопаз	>3	>3	>3	>3	Нет
аегид1поза					снижения
Езскег:гсЫа	Не	Не	>3	>3	Нет
соИ	исслед.	исслед.			снижения
Сап<Нс1а	Не	Не	>3	>3	Нет
а1Ысапз	исслед.	исслед.			повышения
АзрегдШиз	Не	Не	1,3	>3	Нет
п!дег	исслед.	исслед.			повышения

Таблица 31

Результаты тестирования бактериостатической эффективности многодозовой композиции Т¥8/500/ВАСЬ

Микроорганизм	Ьод снижения против Т=0
Т=6 час	Т=24 час	Т=7 дней	Т~14 дней	Т=28 дней
3£арЬу1 ососсиз	>3	>3	>3	>3	Нет
аигеиз					снижения
Рзеидопюпаз	>3	>3	>3	>3	Нет
аегидгпоза					снижения
ЕзсЬег1сЫа	Не	Не	>3	>3	Нет
соН	исслед.	исслед.			снижения
СапсИ^а	Не	Не	>3	>3	Нет
а1Ысапз	исслед.	исслед.			повышения
АзрегдШиз	Не	Не	3,3	>3	Нет
птдег	исслед.	исслед.			повышения

Таблица 32

Результаты тестирования бактериостатической эффективности многодозовой композиции ЬУ8/500/ВА

Микроорганизм	Ъод снижения против Т=0
Т=6 час	Т-24 час	Т-7 дней	Т-14 дней	Т=28 дней
51ар^у1ососсиз	1,05	>3	>3	>3	Нет
аиг&из					снижения
РзеиРотопаз	>3	>3	>3	>3	Нет
аегид1поза					снижения
Езс^ег1с^1а	Не	Не	>3	>3	Нет
соН	исслед.	исслед.			снижения
СапсИ &а	Не	Не	>3	>3	Нет
а1Ысапз	исслед.	исслед.			повышения
АзрегдШиз	Не	Не	>3	>3	Нет
п!дег	исслед.	исслед.			повышения

- 22 019432

Таблица 33

Результаты тестирования бактериостатической эффективности многодозовой композиции ЛК.С/500/Р11е

Микроорганизм	Ьод снижения против Т=0
т=6 час	т=24 час	Т-7 дней	Т-14 дней	Т=28 дней
3£арку1ососсиз	0,73	>3	>3	>3	Нет
аигеиз					снижения
Рзеис1отопаз	>3	>3	>3	>3	Нет
аегид1поза					снижения
ЕзсВег1сЛ1а	Не	Не	>3	>3	Нет
соИ	исслед.	исслед.			снижения
СапсИ <3а	Не	Не	>3	>3	Нет
а1Ысапз	исслед.	исслед.			повышения
АзрегдШиз	Не	Не	>3	>3	Нет
п!дег	исслед.	исслед.			повышения

Композиции, содержащие сочетание 0,3% бензилового спирта + 0,001% хлорида бензалкония и сахарозу или лизин (8ЛС/500/ВЛСЬ и ΕΥδ/500/ВЛСЬ), соответствовали критерию А Европейской Фармакопеи, даже если количество хлорида бензалкония было ниже целевого значения (6 мкг/мл вместо 10 мкг/мл). Композиция, содержащая 0,5% фенола (ЛРС/500/РНе). и композиция, содержащая 1,2% бензилового спирта (ΕΥ8/500/ΒΆ), соответствовали критерию В Европейской Фармакопеи.

Заключение.

Все многодозовые композиции продемонстрировали хороший профиль стабильности после 12месячного хранения при температурах 2-8°С.

- 23 019432

Список цитированной литературы.

Вигдиез еС а1.; ЗиЬсиЬапеоиз зе1£-ас!т1п1зЬгаЫоп о£ ЫдЬ1у ρυτίίίβά ίοΐϋοΐβ зЪ1ти1аЫпд Потопе ап<1 Ьитап сЬогхопхс допабоРгорЬгп £ог ЪЬе ГгеаГтепЬ οί та1е 5 ЪуродопасАоСгорЬхс ЬуродопасНзт. 5рап1$Ъ Со11аЪогаЫуе Сгоир оп Ма1е НуродопайоЪгорМс НуродопасНзт; Нилъ ДергооЬ; 1997, 12(5): 9806

Сегра-Ро1зак еС а1.; 1зое1есЪг1с сЬагде о£ гесотЫпапЪ Ьитап £о111с1е-з£11пи1а£1пд Ьогтопе 1зо£огтз йеЬегтхпез гесерСог а££1п±£у апб ίη νίΛτο ЫоасЫухЪу; Епс1осг1по1оду; 1993, 132(1): 351-356

Бгаз ес а!.; КесерЬог ЫпсИлд апс! £ипс£1опа1 ргорегЫез о£ сЫтегхс Ьитап £ο11ί£ϋορίη ргерагес! Ьу ап ехсЬапде ЬеЬмееп а зта11 ЬускгорЬШс хпЪегсузЪехпе 1оор о£ Ьитап ίοΐ1ΐΡΓορίη апс! Ьитап 1и£гор1п; <7, ΒίοΙ. Скет.; 1994, 269(41): 25289-25294

Γίάάθδ & Та1тас1де; БЬгисЬиге, ехргеззхоп, апс! еуо1и£1оп о£

Ъке депез £ог ЬЬе Ьитап д1усоргоЪеа.л Ьогтопез; ЯесепС Вгод.

Ногт. Кез.; 1984, 40: 43-78

Е1аск еС а!.; 51£е-сНгес£ес1 тикадепезтз άβίίηβδ РЬе ίηάίνίάυβί го1ез о£ ЬЬе д1усозу1а£1оп з1Се5 оп £о1Ис1е5Ыти1аЫпд Ьогтопе; 2. ΒίοΙ. СЬет. ; 1994, 269(19): 14015-14020

Нако1а е£ а1.; КесотЫпапЪ га£ £о111с1е-з£1ти1а£1пд Ьогтопе; ргойисРгоп Ьу СЬхпезе ЬатзЬег оуагу се11з, риг1£1са£1оп апб £ипс£1опа1 сЬагасЪегтгаЫоп; Мо1еси1аг апс1 20 Се11и1аг Епс1осг1по1оду, 1997, 127 (1) : 59-69

Кеепе е£ а1.; Ехргезз1оп о£ Ыо1од1са11у асНге Ьитап £ο1ϋ£.Γορΐη ίη СЬхпезе ЬатзЬег оуагу се11з; 2. ΒίοΙ. СЪет.; 1989, 264(9): 4769-4775

КеиЬтапп ес а1.; ЗЬгисЪиге о£ Ьитап Ιυίθίηίζίης Ьогтопе Ье£а зиЬипхЬ: βνίάοηοβ £ог ге1а£ес! сагЬоху1-£егпипа1 зедиепсе аггюпд сег£а1п рерЫЬе Ьогтопез; В1осПет. Βίορίτγε. Вез. Соттип.; 1979, 90(3): 842-848

Κΐθίη еС а1.; РЬагтасокхпеЫсз апс! рЬагтасо^упатхсз о£ з1пд1е-сЬа1п гесотЫпапЪ Ьитап £о1Ис1е-з1;1ти1аЪ1пд Ьогтопе сопРахпхпд РЬе Ьитап сЬог1оп1С допас!оЪгорЫп сагЬохуЪегт1ла1 ρερίίάβ ίη £Ье гЬезиз топкеу; ГегЫИЪу & ЗЬеыШу; 2002,

- 24 019432

77(6): 1248-1255

К1е1п еС а1.; БеуеЗортепН апс! сЬагасНег!ζβίίοη οί а 1опдасНгпд гесотЬйпапН НЕ5Н адопьзН; Нитап Пергой. ; 2003, 18(1): 50-56

ЬаРо1Ъ еС а1.; ЕпИапсеб зН1гпи1а£ίοη οί ίοΐΐίοΐβ таНигаНхоп апб. оуи1а£огу ронеп£1а1 Ьу 1опд асНгпд £о111с1е-зН1ти1аН1пд Ногтопе адоп1з£з νίί,Η ехНепбеб сагЬоху1-Ьегт1па1 рерЫбез; Епдосг1по1оду; 1992, 131(6): 2514-2520

КеисНегЪ & Катзеу; ϋί32θοΐθίίοη οί Нитап £о1Ис1ез51ти1а£1пд Ногтопе. Сотраггзоп νίίΗ 1иНе1п121пд Ногтопе; 3. ΒίοΙ. СНел!.; 1975, 250(8): 3034-3040

ЗНоте е£ а1.; Нитап ίοΐϋοΐβ з£1ти1аН1пд Ногтопе: £1гз£ ргороза! £ог £Не аттпо асхб зедиепсе о£ нНе Ногтопе-зрес1£1с, ЬеНа зиЬиптН (ЪЕЗНЬ); >3. С11п. ЕпЗосг1по1. Ме1:аЬ. , 1974;39(40:203-205

ЗНоте, ес а!.; А ΓΘθνβΙυβίίοη οί ИНе атЗпо асьб зедиепсе οί Нитап ίοΙΙίίΓορΐη ЬеНаэиЬипИ; 3. РгоС. СЬет.; 1988, 7(4): 325-339

ЗЬее1тап ес а!.; Аззау οί нНе £оШс1е з£1ти1а£1пд Ногтопе Ьазеб оп ННе аидтепЪаЫоп μϊ£Η Нитап οΗοΓίοηίο допабоНгорНгп; ЕпЗосг!по!оду; 1953, 53(6): 604-616

Та1табде еС а!.; Ενοίυίίοη οί £Не депез ίοτ нНе Ьега зиЬипьНз οί Нитап сНогпопйс допабоНгорьп апб Ιυίθίηίζίης Ногтопе; №а£иге; 1984, 307: 37-40 νβίονβ еС а1. ; КесерНог ЫпсНпд апб з1дпа1 ЪгапзбисЫоп аге бьззосьаЫе Гипс£1опз гедийгхпд άίίίθτβηΐ. зьНез оп £оШс1е-з1:11Т1и1аЫпд Ногтопе; Епс1осг1гю1оду; 1994, 135(6): 2657-2661

Уап Не11 е£ а1.; Е££ес5з о£ Нитап тепораиза1 допабоНгорНьп ргерага51опз ίη бНЕегепН 5 Ь1оаззау теННобз; АсСа ЕпЗосг1пе1од1са; 1964, 47: 409-418

ЕРО 211 894

ЕР	448	146
ЕР	487	512
ЕР	505	500 10 ЕР 0 618 808
ЕР	814	841
ЕР	853	945

ИО 85/01958

ИО 98/58957 15 ИО 00/04913

ЙО 01/58493

ИО 2004/087213

ИО 2004/105788

ИО 2004/112826 20 1)3 3119740 из 5767067

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Жидкая композиция, содержащая лютеинизирующий гормон (ЬН) или его вариант, раскрытый в описании, отличающаяся тем, что указанная композиция включает фосфатный буфер и стабилизирующее количество аргинина или его солей в концентрации, составляющей от примерно 10 до примерно 50 мг/мл, и/или лизина или его солей в концентрации, составляющей от примерно 10 до примерно 50 мг/мл.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный лютеинизирующий гормон (ЬН) представляет собой лютеинизирующий гормон человека (ЛГч).
3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный лютеинизирующий гормон (ЬН)

- 25 019432 представляет собой рекомбинантный лютеинизирующий гормон человека (р-ЛГч).
4. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный лютеинизирующий гормон (ЬН) представляет собой лютеинизирующий гормон, полученный из мочи человека (м-ЛГч).
5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что композиция содержит указанный лютеинизирующий гормон (ЬН) в концентрации, составляющей от примерно 1 до примерно 50 мг/мл.
6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что композиция содержит указанный фосфатный буфер в концентрации, составляющей примерно от 1 до примерно 100 мМ.
7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный фосфатный буфер представляет собой натрий-фосфатный буфер.
8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая поверхностноактивное вещество.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что указанное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.
10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что композиция содержит полисорбат 20 в концентрации, составляющей от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл.
11. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит метионин.
12. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что композиция содержит указанный метионин в концентрации, составляющей от примерно 0,01 до примерно 5,0 мг/мл.
13. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит бактериостатическое вещество.
14. Композиция по п.13, отличающаяся тем, что указанное бактериостатическое вещество выбрано из группы, состоящей из бензилового спирта, фенола и сочетания бензилового спирта и хлорида бензалкония.
15. Композиция по п.13 или 14, отличающаяся тем, что композиция содержит указанное бактериостатическое вещество в концентрации, составляющей от примерно 0,005 до примерно 15 мг/мл.
16. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит воду для инъекций.
17. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая рН в диапазоне значений от примерно 7,5 до примерно 8,5.
18. Композиция по любому из пп.3-17, включающая по меньшей мере 25 мкг/мл р-ЛГч, 1,65 мг/мл №₂НРО₄-2Н₂О, 0,104 мг/мл ΝαΙ ЬРО₄-1ЬО. 31,5 мг/мл моногидрохлорида Ь-аргинина, 0,05 мг/мл полисорбата 20, 0,5 мг/мл метионина и 5 мг/мл фенола.
19. Композиция по любому из пп.3-17, включающая по меньшей мере 25 мкг/мл р-ЛГч, 1,65 мг/мл №₂НРО₄-2Н₂О, 0,104 мг/мл №Н₂РО₄-Н₂О, 28,5 мг/мл моногидрохлорида лизина, 0,05 мг/мл полисорбата 20, 0,5 мг/мл метионина и 12 мг/мл бензилового спирта.
20. Композиция по любому из пп.3-7, включающая по меньшей мере 25 мкг/мл р-ЛГч, 1,65 мг/мл №₂НРО₄-2Н₂О, 0,104 мг/мл №Н₂РО₄-Н₂О, 28,5 мг/мл моногидрохлорида лизина, 0,05 мг/мл полисорбата 20, 0,05 мг/мл метионина, 3 мг/мл бензилового спирта и 0,01 мг/мл хлорида бензалкония.
21. Лекарственное средство, включающее композицию по любому из пп.1-20.
22. Способ получения композиции по любому из пп.1-20, включающий разбавление лютеинизирующего гормона (ЬН) раствором эксципиентов.
23. Применение композиции по любому из пп.1-20 для получения лекарственного средства для лечения инфертильности у женщин и/или мужчин.
24. Применение композиции по любому из пп.1-20 в сочетании с жидкой композицией, включающей фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) или его вариант для лечения инфертильности у женщин и/или мужчин.