JP4719357B2 - Ｆｓｈ及びｆｓｈ変異体の製剤、製品及び方法 - Google Patents

Description

【０００１】
クロスレファレンス
本出願は１９９８年７月２３日に出願された米国仮出願６０／０９３９０６号、１９９８年７月３０日に出願された６０／０９４６１１号、１９９８年７月３１日に出願された６０／０９４７６７号、１９９８年９月１日に出願された６０／０９８７１１号、１９９８年９月１７日に出願された６０／１００６９６号の利益を請求し、それらの出願のそれぞれは全体が本発明細書の一部を構成する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または当業界で知られた濾胞刺激ホルモン変異体（ＦＳＨ変異体）の生成物を用いる新規な製剤、製品および方法に関する。本発明は、以前には治療用に存在しなかった、有益な、多数回使用（multi-use）の安定な溶液および製剤並びに医薬製品をも提供する。これらの製剤および製品は処置の期間にわたってＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の血清レベルを増加させるための治療レジメに特に有用である。従って、本発明は、特にＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含む、便利で安定な保存溶液、製剤および製品の必要性および不妊症の治療におけるこれらの製剤および製品を用いる必要性を満たす。
【０００３】
発明の背景
ＦＳＨは不妊症で使用される。患者は毎日または１日２回筋肉内（「ＩＭ」）または皮下（「ＳＣ」）注射により投与され、用量は反応に対し調節され、通常７５〜３００ＩＵ／日の範囲である。ＦＳＨの短い半減期のため、患者はその卵巣または精巣の反応に応じて、数日に渡って１日一度または二度注射されねばならない。ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のより安定な製剤は治療用途のための改良を提供するであろう。
【０００４】
ＦＳＨは、ＩＭまたはＳＣ以外の承認された投与様式により以前には投与されなかったが、他の治療タンパク質は長い日数に渡って投与されることが期待されている。長期にわたる正規のＳＣまたはＩＭ注射、経皮パッチ、移植、浸透ポンプ、ミクロポンプ、カートリッジ、肺運搬システム等を含む様々な運搬方法は、例えば、不愉快を減少させ、または投与を容易にする患者のコンプライアンスの促進に有用であろう。これらの長期の治療レジメは一般に安定な溶液または製剤中の保存剤を必要とする。
一態様において保存剤は、製剤中の有害な微生物の混入を防止し、または最小にする。従来の非タンパク質治療剤の場合、クロロヘキシジン、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、フェニルマーキュリックナイトレート、チメラロサール、安息香酸、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デハイドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールおよびそれらの様々な混合物等の抗微生物性の保存剤が、貯蔵期間および／または多数回使用レジメの間の無菌性を保証するため液体製剤にしばしば加えられる（Akers, MJ, Pharm. Technol. 8, 36-46, 1984; Gennnaro, AR., Romington's Pharmaceutical Sciences, 17版, Mack, Easton, PA., 1278-1280, 1985）。しかしながら、これらの保存剤はタンパク質の安定性に有害である傾向がある。例えば、非常に有効な保存剤であるｍ−クレゾールは、一般にタンパク質と結合し、変成させることが報告されている (Development of Pharmaceutical Parenteral Dosage Forms, Bontempo編, Marcel Dekker, Inc., New York, New York, 118-119頁、1997) 。それはヒト成長ホルモン等のホルモンの溶液安定性についての特別の困難をも示す (Maa YF および Hsu C, International Journal of Pharmaceutics, 140, 155-168頁、1996) 。
【０００５】
ＦＳＨはヘテロダイマーのグリコプロティンホルモンファミリーのメンバーであり、そのファミリーには甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、繊毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）が含まれる (Pierce JG およびParsons TF, Annu. Rev. Biochem., 50, 465-495, 1981; Baenziger およびGreen, Biochom. Biophys. Acta, 947, 287-306, 1988) 。このファミリーのメンバーは、一般には２つの異なるサブユニット間の非共有結合的相互作用により結合しているヘテロダイマーである。ヒトのＦＳＨ（ｈＦＳＨ）ヘテロダイマーは、(i)成熟の９２のアミノ酸のαサブユニット（これは他のヒトのファミリーメンバー、すなわち繊毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に共通である）；および(ii)ＦＳＨに独自な成熟の１１１のアミノ酸のβサブユニットからなる (Shome 等, J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 187-205(1974); Shome 等, J. Prot. Chem., 7: 325-339, 1988) 。そのαおよびβサブユニットは非共有結合的に結合し、従って、その結合はタンパク質の脱安定化剤により感受性である。
【０００６】
天然のヒトおよび他の哺乳動物のＦＳＨのαおよびβアミノ酸配列並びにこれらの配列のある変異体は１９８２年前に当業界によく知られており、哺乳動物細胞における活性なヒトおよび他の哺乳動物のＦＳＨのクローニングおよび発現は１９８５年前に成し遂げられた。その共通のゴナドトロピンα（またはＦＳＨα）サブユニットは精製されたタンパク質から配列決定され (Bellisario 等、J. Biol. Chem., 248; 6796(1973); Morgan 等, J. Biol. Chem., 250: 5247(1975)) 、後者はクローニングされ、発現された (Fiddes 等, Nature 281: 351(1979); Nature 286: 684(1981); J. Molec. Appl. Genet., 1: 3-18(1981)) 。ＦＳＨβサブユニットは精製されたタンパク質から配列決定された (Shome等, J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 187(1974); Saxena等, J. Biol. Chem. 251: 993(1976); Sairam 等, Biochem. J. 197: 541(1981); Fujiki, Biochem. Biophys. Acta, 624: 428(1980)) 。組込み遺伝学はヒトＣＧの組換的発現を報告し (Biotechnology Newswatch (3頁、1983年6月20日)；Chemical and Engineering News 61: 41(1983年11月21日); Genetic Technology News 3: 9(1983年12月12日); および活性形 (Biotechnology Newswatch, 1984年1月16日)）、 彼らはＦＳＨのクローニングの成功 (Genetic Engineering Newsletter 4: 4(1984年8月10日)）および哺乳動物細胞で製造した活性形の組換えＦＳＨ（ＤＮＡ 4：76、1985年1月16日発行）をも報告した。Amgen はＣＨＯ細胞中の活性なウシのＬＨの発現をも報告した (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7280(1985年11月))。
【０００７】
ヘテロダイマーのタンパク質ホルモンが生理学的または酸性条件下に解離し得ることを示すかなりな証拠が文献にある (Ryan, R. J. 等, Recent Prog. Hormone Res., 26: 105-137, 1970; Strickland, TW およびPuett, D.J., J. Biol. Chem., 257: 2954-2960, 1982; Reichert LE およびRamsey RB, J. Biol. Chem., 250: 3034-3040, 1975)。無傷のダイマーが生物学活性に必須であり、ＦＳＨの分泌に不可欠である (Baenziger JU およびGreen ED, Biochem. Biophys. Acta, 947: 287-306, 1988; Corless 等, J. Cell Biol., 104: 1173-1181, 1987)。ＦＳＨの不安定性に対抗する試みには、一本鎖分子を製造し、１つの安定な分子中に２つのサブユニットを導入する試み、および更なるジサルファイド結合を作り、２つのサブユニット間の相互作用を安定化させる試みがある (Sughara T.等, J. Biol. Chem., 271: 10445-10448, 1996; Heikoop J. C. 等, Nature Biotech, 15: 658-62, 1997)。
【０００８】
Donaldson（米国特許第５,１６２,３０６号）はＦＳＨおよびＬＨを含む獣医組成物に関する。これらの組成物はチモール（５−メチル−２（１−メチルエチル）フェノール）中で安定であることが示されている。Donaldson は、チモールは、開示されたＳＵＰＥＲ‐ＯＶ製剤中でグリコプロティンホルモンを損なわないであろう（米国特許第５,１６２,３０６号）Ｕ.Ｓ.Ｐ. ＸＸＩの保存剤のリスト中の１つの保存剤であることを報告する。
【０００９】
閉経後の女性からの尿由来のＦＳＨ（hＭＧ．Organonにより Menotropin または Humagon として、および Serono により urofollitropin または Metrodin として市販）が、Assisted Reproductive Technology （ＡＲＴ）プログラムに参加した排卵患者における多数の小胞の発育のため、および無排卵の不妊患者における排卵の誘発のため３０年以上の間注射物として用いられている (Fauser BCJM および Van Heusden AM, Endocrine Rev., 18, 71-106, 1997)。より最近、ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトＦＳＨ（rhＦＳＨ）が入手可能となった (Keene J. L. 等, J. Biol. Chem., 264: 4769-4752, 1989; Loumaye E. 等, Human Reprod. Update, 1: 188-1999, 1995; Olijve W. 等, Mol. Hum. Reprod., 2: 361-369, 1996)。
【００１０】
治療用ＦＳＨ（hＭＧまたはrhＦＳＨ）は、７５ＩＵ／バイアルおよび１５０ＩＵ／バイアルのアンプル中の凍結乾燥した形で現在提供されており、２〜２５℃で貯蔵する場合、１.５年〜２年の貯蔵寿命を有する。７５ＩＵまたは１５０ＩＵの出発用量を用いる毎日の注射によって、単一用量投与後の濃度より１.５〜２.５倍大きい定常状態濃度に到達するため、１０日までの間注射することが推賞されている。この投与レジメは、ＦＳＨが閾値機構により作用するので、治療的有効性に必要な濃度を生じる (Schoemaker J. 等, Ann. NY. Acad. Sci., 687: 296-299, 1933)。患者の反応によって、ＦＳＨの容量を増加させる３サイクルまでの治療を用いることができる。患者およびパートナーは、日ベースで、希釈剤を用いて凍結乾燥した物の新しいバイアルを再構築し、再構築後直ちにそれを投与する必要がある (Serono Laboratories, Inc., Randolph, MA による皮下注射用の Fertinex (注射用ウロホリトロピン、精製)について１９９６年１月に公開されたパッケージインサート Ｎ１７００１０１Ａ）。使用されなかった物質は捨てられる。
【００１１】
従って、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体タンパク質の安定な製剤および保存製剤、並びに関連する製品の開発により患者のコンプライアンスを増加させる当業界での必要が残っている。これらの安定な製品は、ＦＳＨによる妊娠治療等の、長期間の処置が必要であるか、または勧められる場合特に必要である。２４時間またはそれ以上の期間にわたる多数回使用のために用いることができ、承認されるＦＳＨまたはＦＳＨ変異体製品を提供する必要もある。本発明は、２４時間またはそれ以上の期間にわたる使用のために用いることもでき、承認される、ＦＳＨおよびＦＳＨ変異体の新規な安定な溶液および製剤並びに保存溶液および製剤、並びに関連する製品をも提供する。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の新規な製剤、それらの製造、妊娠障害の処置における医薬的または獣医的使用、および関連する製品を提供する。
一態様において、本発明は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体、および少なくとも一つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される保存剤又はそれらの混合物を水性の希釈剤中に含む保存溶液および製剤を提供する。場合により、保存溶液または製剤は選択された緩衝剤および塩を含む。
【００１３】
他の態様において、本発明は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体および選択した緩衝剤を含む安定な溶液および製剤を提供し、該緩衝剤は食塩または選択された塩と共に、リン酸塩緩衝剤である。
【００１４】
他の態様において、本発明は不妊症の処置方法を提供し、その方法は、その必要のある患者に、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも一つの保存剤、少なくとも一つのそれらの誘導体、またはそれらの混合物を含む溶液中のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の変異体の保存溶液を投与することを含む。
【００１５】
他の態様では、本発明は不妊症の処置方法を提供し、その方法は安定溶液中のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の安定製剤をその必要のある患者に投与することを含み、その安定溶液は好ましくは、食塩または選択された塩を有するリン酸塩緩衝液である。
【００１６】
本発明の他の態様では、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の少なくとも一つの多数回投与(multi-dose)製剤を製造する方法を提供し、その方法はＦＳＨまたはＦＳＨ変異体、およびフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される少なくとも一つの保存剤、それらの誘導体、またはそれらの混合物を水性希釈剤中で混合することを含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の少なくとも一つの安定な製剤を製造する方法を提供し、その方法は安定な溶液または製剤中でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を混合することを含み、好ましくはその安定な溶液または製剤は食塩または選択された塩を有するリン酸塩緩衝液である。
【００１８】
本発明のヒトの医薬用途のための製品をも提供し、その製品は包装材料、並びにＦＳＨまたはＦＳＨ変異体および保存剤の溶液を含むバイアルを含み、該包装材料は、そのような溶液が使用のために２４時間以上の期間にわたって保持され得るということを示すラベルを含む。本発明は更にヒトの医薬用途のための製品を提供し、その製品は包装材料、凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含む第１バイアル、および保存剤を含む第２バイアルを含み、該包装材料は、本明細書で更に記載する条件下での使用のため２４時間以上の期間保ち得る溶液を形成するため、保存剤溶液中でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を再構築することを患者に指示することを示すラベルを含む。
【００１９】
本発明はヒトの医薬用途のための製品をも提供し、その製品は、包装材料並びにＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の溶液および安定な溶液または製剤を含むバイアルを含み、その安定な溶液または製剤は好ましくは食塩または選択された塩を有するリン酸塩緩衝液であり、該包装材料はそのような溶液は２４時間以上使用のため保ち得ることを示すラベルを含む。
【００２０】
本発明は更にヒトの医薬用途のための製品をも提供し、その製品は包装材料、凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含む第１バイアル、および保存剤を含む第２バイアルを含み、該包装材料は、患者にＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を保存剤溶液中で再構築し、本明細書で更に記載する条件下で使用のため２４時間以上の期間にわたって保ち得る溶液を形成することを指示するラベルを含む。
【００２１】
本発明はヒトの医薬用途のための製品をも提供し、その製品は、包装材料、及び凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体及び好ましくは食塩または選択された塩を有するリン酸塩緩衝液である第２の安定溶液または製剤を含むバイアルを含み、その包装材料は患者がその安定な溶液中でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を再構築し、本明細書で更に記載する条件下で使用のため２４時間以上の期間にわたって保ち得る溶液を形成することを指示するラベルを含む。
【００２２】
発明の詳細な記述
本発明は一態様において、長期間の、または多数回使用のための、予期せぬほど安定な、そして／または適した、組換えおよび／または精製または単離したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の溶液および製剤、製品、使用または処置方法および医薬製品を提供する。
【００２３】
有用性
改良された、またはより適した性質または安定性を有する、これらのＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の溶液および製剤、製品、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を用いる使用および処置方法は、女性および／または男性の不妊治療に有用である。これらの製剤、製品は、注射による運搬、および別の運搬システム、例えば（限定するものではないが）鼻の、肺の、経粘膜の、経皮の、経口の、皮下の、筋肉内の、または非経口持続放出、乾燥の、または液体製剤での使用にさらに適している。そのＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の溶液および製剤は、単独でか少なくとも一つの更なるゴナドトロピンと組合せて、活性または安定性の損失を防止するか減少させることにより、または投与の有効性または望ましさのいずれかの側面を改良することにより、例えば様式、頻度、用量、快適さ、使用の容易性、インビトロおよびインビボの生物学的活性等の少なくとも１つにより、公知の商業的製品に比べてインビボの力価を増加させ得る。
【００２４】
引用
本明細書で引用するすべて刊行物および特許は、それらが本発明時、または引用した関連特許出願の出願時における技術水準を示すので、本明細書の一部を構成する。以下の文献は全体が本明細書の一部を構成する：Ausbel 等編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1987-1989); Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版、Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow および Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan 等編, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, N.Y.(1994-1999); Colligan 等編, Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, N.Y.(1998-1999)。
【００２５】
定義
濾胞刺激ホルモン「ＦＳＨ」（組換的に製造されたものであろうと単離されたものであろうと）、および濾胞刺激ホルモン変異体は当業界でよく知られている。本明細書で用いる「ＦＳＨ」は完全長の成熟タンパク質として製造されたＦＳＨを指し、組換え的に製造されたかまたはヒトの源から単離されたかにかかわらず、ヒトのＦＳＨすなわち「ｈＦＳＨ」を含むが、これに限定されない（Shome B. 等、J. Prot. Chem., 7: 325-339, 1988; Saxena B.B. および Rathnam P., J. Biol. Chem., 251: 993-1005, 1976; Watkins 等, DNA, 6: 205-212, 1987; Shome B. および Parlow A.F., J. Clin. Endocrinol. Metab., 39(1): 203-205, 1974; および Beck 等, DNA, 4: 76, 1985; 米国特許第5,405,945号および同第5,639,640号を参照。これらは本明細書の一部を構成する）。ヒトＦＳＨαサブユニットのタンパク質配列を配列番号５に示し、ヒトＦＳＨβサブユニットのタンパク質配列を配列番号６に示す。更に、様々なＦＳＨ変異体が当業界で知られ、または理解されている（Shome, J. Clin. Endocrin. Metab, 39: 187 (1974); Saxena, J. Biol. Chem., 251(4): 993-1005 (1976); 1978; Sairam 等, Biochem. J., 197: 541 (1981); Closset. Eur. J. Biochem. 86: 115-120; Fujiki, J. Biol. Chem., 253: 5363-5368 (1978); Sairam, Biochem. J., 197: 541-552 (1981) を参照。それぞれは独立に本明細書の一部を構成する）。先行技術のＦＳＨβサブユニットは、Saxena 配列、そしてまた、(a)進化的に保存された配列、または(b)周知の確認された配列決定の誤りについての Sairam の議論に関連する配列のジーナスを含む。更に、当業者は、先行技術が同定したアミノ酸の(i)化学的に類似のアミノ酸、または(ii)進化的に保存されたアミノ酸により置換は、このように改変されたｈＦＳＨβサブユニットからなるＦＳＨヘテロダイマーの生物学的活性に認知できる影響を有しないであろうことを認識する。
【００２６】
特に、Saxena hＦＳＨ配列についての Sairam's の注釈、そしてまた機能的なＦＳＨ分子間で同定されるアミノ酸置換についての彼の議論は先行技術におけるＦＳＨβ鎖配列のジーナスを定義する。より具体的には、１９８１年の Sairam の刊行物は、Sexena 等、Shome 等、Closset 等および Fujiki 等を引用して保存されたアミノ酸配列を同定する。Sairam, Biochem J. 197: 541，551 (1981)。先行技術は、(1) Sexena のＦＳＨβ鎖配列の Shome のそれに対する優先性を明白にし、(2)カルボキシ末端の不均一性 (heterogeneity) の問題に向け、(3) 該ホルモンの活性に必須でない種間の相異により影響される分子の部分を述べ、(4)種間並びにその３つのヒトグリコプロティンホルモン、ＦＳＨ、ＬＨおよびＴＳＨのβ鎖間の相同性から引き出されたガイダンスを強調する。
【００２７】
Ｃ末端の不均一性はブタのＦＳＨのそれを除いてすべての公開された配列について報告されている。ブタのＦＳＨではグルタミン酸が唯一のＣ末端残基であった。位置２７について、この位置に Saxena は一つのトリプトファン残基を割り当て、すべての先行技術の種の中で、ＦＳＨ−Ｂについての位置２４でのトリプトファンについて証明された進化的な保存に支持を見出した。位置４４および４６について、位置４４で残基はリジンではなくアルギニンであるべきであり、位置４６ではアルギニンではなくリジンであるべきことを Saxena は示す。豚、馬および羊の配列も位置４４でアルギニンを保存する進化的圧力を反映する。３つの位置２１、２１および４４での変化は、構造的に保存的な、または進化的保存的（「ホモロガス」）置換を含み、そのそれぞれは生活性を有する。
【００２８】
Sairam, Shome および Closset の文献のそれぞれは位置２１−２２における残基イソロイシン、セリンを開示し、一方、Saxena はロイシン、スレオニンを開示し、Fujiki はこれらの位置でイソロイシン、スレオニンを開示する。これらの開示のそれぞれは進化的に保存的な置換であるのみならず、構造的に保存的置換でもある。Sairam, Shome, Closset および Fujiki により開示されたアスパラギン酸、および Saxena, Closset および Sairam により開示されたアスパラギン間の、位置４１における変化は２つの進化的に保存された残基を含み、そのそれぞれは生活性を提供する。保存的置換および進化的に保存された置換についてのこれらの開示は、当業者がhＦＳＨ−Ｂ鎖ジーナス内でＦＳＨβ鎖バリアントを区別するためのガイドを与える。
【００２９】
本明細書でいうＦＳＨ変異体は、配列番号６の完全長成熟タンパク質より短いβサブユニットのカルボキシ末端削除物である。β鎖のカルボキシ末端バリアントは公知のαサブユニットとダイマーを形成し、ＦＳＨ変異体ヘテロダイマーを形成することが理解される。更に、多くの種のＦＳＨが知られており、以下のものを含むがこれらに限定されない。ブタのＦＳＨ（配列番号７および８）、ウマのＦＳＨ（配列番号３および４）、ウシのＦＳＨ（配列番号１および２）、ヒツジのＦＳＨ（配列番号９および１０）、および Combarnous Y., Endocrine Reviews, 13 (4), 670-691 (1992) （本明細書の一部を構成する）に引用されたもの。本明細書に更に提供される与えられた種から、他のカルボキシ末端変異体を当業者が作り、製造することができるであろうことが理解される。
【００３０】
ＦＳＨヘテロダイマーまたはＦＳＨ変異体ヘテロダイマーは、組換えなどの適当な方法により、場合に応じ天然源からの単離または精製により、若しくは化学的合成により、またはそれらの組合せにより製造できる。１つのαサブユニットと１つのβサブユニットを含むＦＳＨヘテロダイマーおよびＦＳＨ変異体ヘテロダイマーの非限定的な例には以下のものを含むが、それらに限定されない。
【化７】

【化８】

【００３１】
用語「組換」とは、組換えＤＮＡ技術の使用によるＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の組換的製造を言う（例えば、Boine 等, Seminars in Reproductive Endocrinology 10, 45-50, 1992 および本明細書で一般的に更に与えられ、例示されるもの）。ゲノムおよびｃＤＮＡクローンの配列は、数種のαおよびβサブユニットについて知られている (Fiddes, J.C. 等, J. of Mol. and Applied Genetics, 1: 3-18 (1981); Esch F. S. 等, DNA 5: 363-369 (1986); Watkins P. C. 等, DNA 6: 205-212 (1987); Hirai T. 等, J. Mol. Endocrinol. 5: 147-158 (1990); Maurer, R. A. 等, Mol. Endocrinol. 1: 717-723 (1987); Guzman K.等, DNA Cell Biol. 10: 593-601 (1991); Kumar T.R. 等, Gene. 1995年12月12日; 166 (2): 335-6; Kumar T.R. 等, Gene. 1995年12月12日; 166 (2): 333-4、それぞれの文献は本明細書の一部を構成する）。αおよびβサブユニットについてのＤＮＡ配列のいくつかを配列番号１４−２０として提供する。さらに、１つのベクターに、または別のプロモーターを有する、各ユニットについての２つのベクターに提供された、αおよびβサブユニットをコードＤＮＡ配列で真核生物細胞を形質転換するか、または当業界で理解される他の方法により無傷のダイマーを提供することができる。
【００３２】
本発明に従って用いるＦＳＨまたはＦＳＨ変異体は、哺乳動物細胞またはトランスジェニック調製物を含む組換的手段により製造されるばかりではなく、尿源等の他の生物学的源から精製してもよい。受容できる方法は、Hakola, K., Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59-69, 1997; Keene 等, J. Biol. Chem., 264: 4769-4775, 1989; Cerpa-Poljak 等, Endocrinology, 132: 351-356, 1993; Dias 等, J. Biol. Chem., 269: 25289-25294, 1994; Flack 等, J. Biol. Chem., 269: 14015-14020, 1994; および Valove 等, Endocrinology, 135: 2657-2661, 1994 並びに米国特許第3,119,740号に記載されたものを含み、これら文献は本明細書の一部を構成する。
【００３３】
ペプチドまたはタンパク質に関して用いる「実質的に純粋」とは、他のタンパク質分子を含む他の細胞性および非細胞性分子からの分離を意味する。実質的に純粋な調製物は、およそ少なくとも８５％純粋；好ましくはおよそ少なくとも９５％純粋である。「実質的に純粋」なタンパク質は、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を含む当業者に周知の様々な技術により製造することができる。
【００３４】
「投与する」という語は、病気または状態を処置するために本発明の製剤をその必要のある患者の身体に導入することを意味する。
【００３５】
「患者」という用語は、病気または状態について処置される哺乳動物を意味する。患者は、これに限るものではないが、次の起源のものである；人、羊、豚、馬、牛、ウサギ等。
【００３６】
「アルキルパラベン」という用語は、抗微生物剤として有用な生理学的に許容されるＣ１−Ｃ６アルキルパラベンをいう。非限定的な例には少なくとも１つのメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベンが含まれる。
【００３７】
「水性希釈剤」という用語は、水を含む液体の溶媒をいう。水性の溶媒系は水のみから、または水と１以上の混和性溶媒よりなってもよく、糖または他の賦形剤等の溶解した溶質を含んでもよい。より一般的に用いられる混和性溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール等の短鎖の有機アルコール、アセトン等の短鎖ケトン、グリセロール等のポリアルコールである。
【００３８】
「等張剤」は、生理学的に許容され、製剤に適当な等張性を与えて製剤に接触している細胞膜を横切る正味の水の流れを防止する化合物である。グリセリン等の化合物がそのような目的に公知の濃度で一般的に用いられる。限定するものではないが、他の適当な等張剤にはアミノ酸またはタンパク質（例えばメチオニンまたはアルブミン）、塩（例えば塩化ナトリウム）、および糖（例えばデキストローズ、シュクロースおよびラクトース）、および当業界で周知の多くの他のものが含まれる。
【００３９】
「保存剤」という用語は、抗微生物剤、抗真菌剤、抗マイコプラズマ剤、抗ウイルス剤、抗プリオン剤および／または抗細菌剤として作用する化合物または組成物をいう。本発明のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含む保存製剤は、商業的に利用できる多数回使用製品であるための保存的有効性についての法的または規則ガイドラインを満足する。適当な保存剤は、限定されるものではないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等）、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、フェニルマーキュリックナイトレート、チメロサール、安息香酸のうちの少なくとも１つ、および１以上の保存剤の混合物が含まれる。例えば、Wallhauser, K., Develop. Biol. Standard, 24, 9-28頁（Basel, S. Krager, 1974）を参照。
【００４０】
「リン酸塩緩衝液」という用語は、リン酸塩イオンを含む賦形剤をいう。一般的にリン酸塩緩衝液は、リン酸またはナトリウムおよびカリウム塩を含むリン酸の塩から製造する。リン酸のナトリウムおよびカリウム一塩基性、二塩基性および三塩基性の塩等の、リン酸のいくつかの塩が知られている。リン酸の塩は生じた塩の水和物として生ずることも知られている。リン酸塩緩衝液は、約pＨ４〜約pＨ１０等の広い範囲のpＨにわたり得、好ましくは約pＨ５〜約pＨ９の範囲であり、最も好ましくは約６〜約８の範囲である。好ましくは本発明の製剤は約６.８〜約７.８のpＨを有し、約pＨ７.０、７.２および７.４を含む。好ましいイオンはナトリウムおよびカリウムイオンであり、単独でか、または、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の場合のように溶液中に共に存在する。リン酸塩食塩水緩衝液は、Dulbecco のリン酸塩で緩衝化された食塩水等、当業界で周知である。全溶液中の塩濃度は、約５mＭ，９.５mＭ，１０mＭ，５０mＭ，１００mＭ，１５０mＭ，２００mＭ，２５０mＭおよび５００mＭの間で変り得る。好ましくは、イオン濃度は１０mＭ以上、または５０mＭ以上、または１００mＭ以上である。
【００４１】
「バイアル」という用語は、含まれた無菌の状態でＦＳＨおよび希釈剤を保持するのに適した容器である。本明細書で用いるバイアルの例には、アンプル、カートリッジ、ブリスターパッケージ、またはポンプ（浸透ポンプを含む）、カテーテル、経皮パッチ、カートリッジ、肺運搬、経粘膜運搬、または非経口運搬により患者にＦＳＨを運搬するのに適した他のものを含む。非経口、肺、経粘膜、または経皮投与のための包装製品に適したバイアルは当業界で周知であり、認識されている。
【００４２】
製剤の「安定」な製剤（好ましくは食塩または選択した塩を含むリン酸塩緩衝液である）は、その中のタンパク質の分解、改変、凝集、生物学的活性の損失の程度が、許容可能に調節でき、時間と共に非許容性を増加させないものである。安定性は当業界で周知の方法で評価でき、その方法は試料の光散乱、光の見かけの減衰（吸収、または光学密度）、サイズ（例えばサイズ排除クロマトグラフィー）、インビトロまたはインビボの生物学的活性および／または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を含む。安定性を評価する他の方法はよく知られており、本発明に従って用いることができる。
【００４３】
「処置する」という用語は、濾胞または精巣刺激またはＦＳＨにより制御されるいずれかの他の生理学的反応の目的に、ＦＳＨ投与が望ましい、患者のための投与、追跡検査、管理および／またはケアをいう。従って処理には、限定するものではないが、精子また濾胞の発育の誘導または改良のための、または排卵誘導のためのＦＳＨの投与が含まれる。更に、正常な精子形成を回復するための処置が男性の場合意図される。
【００４４】
「塩」はＦＳＨの生理学的に受容し得る塩である。そのような塩はタンパク質中のいずれかの１以上の荷電基と生理学的に許容し得る非毒性のカチオンまたはアニオンの間に形成される。有機および無機塩には、例えば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタリンスルホン酸、プロピオン酸、炭酸等の酸から製造したもの、または例えばアンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム塩がある。更なる、適当な塩は公知で、本明細書に含まれる。
【００４５】
「緩衝剤」または「生理学的に受容し得る緩衝剤」という用語は、製剤中の医薬的または獣医的に使用に安全であることが知られており、製剤に望まれるpＨ範囲の製剤のpＨを維持し、または調節する効果を有する化合物をいう。中くらいの酸性〜中くらいの塩基性のpＨに、pＨを調節する受容し得る緩衝剤には、限定するものではないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳおよびヒスチジンを含む。「ＴＲＩＳ」とは２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール、および医薬的に受容し得るいずれかのその塩をいう。好ましい緩衝剤は食塩または受容し得る塩と共にリン酸塩緩衝剤である。生理学的に受容し得、所望のレベルにpＨを調節するに適した他の緩衝剤は当業者に知られており、本明細書に含まれる。
【００４６】
ＦＳＨおよぴＦＳＨ変異体をコードする核酸
公知のＦＳＨ配列をコードするクローンを得るために、ポリヌクレオチド、または公知の核酸の配列をベースとするプローブを用いてcＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングできる。ゲノムＤＮＡまたはcＤＮＡとバイブリダイズさせ、同じ、または異なる生物中の相同なＤＮＡ配列を単離するためプローブを用いる得る。当業者は、様々な程度のハイブリダイゼーションのストリンジェシィーがアッセイで用い得ること、ハイブリダイゼーションまたは洗浄媒体がストリンジェントであり得ることを理解するであろう。ハイブリダイゼーションの条件がよりストリンジェントになるに従い、二本鎖形成が生ずるためにはプローブと標的間のより大きい度合いの相補性がなければならない。ストリンジェシーの程度は、温度、イオン強度、pＨ、およびホルムアミドのような部分的変性溶媒の存在により調節できる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェシィーは、例えばホルムアミドの濃度を０〜５０％の範囲内で操作することにより、反応溶液の極性を変化させることにより便利に変化させる。検出可能な結合に必要な相補性の程度（配列同一性）は、ハイブリダイゼーション媒体および／または洗浄媒体のストリンジェシィーに従って変るであろう。相補性の程度は至適には１００％であろうが、プローブおよびプライマーの僅かな配列の変化は、ハイブリゼーションおよび／または洗浄媒体のストリンジェシィーを減少させることにより相殺されることを理解すべきである。
【００４７】
ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅方法は周知であり、過度な実験の必要なしに、本明細書に示した教示およびガイドラインに基づいて、本発明に従い用い得る。ＰＣＲによる選択的な増幅方法は、ＦＳＨ変異体のβ鎖をコードするもののような核酸配列の小さいセグメントの加工を可能にする。そのような増幅技術は、便利な末端シグナル、制限部位等を増幅された配列に付加することを可能にする。
【００４８】
ＤＮＡまたはＲＮＡ増幅の公知の方法には、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連する増幅方法（例えば、米国特許第4,683,195号、4,683,202号、4,800,159号、4,965,188号 (Mullis 等）; 4,795,699号、および 4,921,794号（Tabor 等）; 5,142,033号（Innis）; 5,122,464号（Wilson 等）; 5,091,310号（Innis）; 5,066,584号（Gyllensten 等）; 4,889,818号（Gelfand 等）; 4,994,370号（Silver 等）; 4,766,067号（Biswas）; 4,656,134号（Ringold）参照)、並びに二本鎖ＤＮＡ合成のテンプレートとして標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡ媒介増幅（米国特許第5,130,238号(Malek等)（商標名ＮＡＳＢＡ），Ausubel 上記； Colligon 上記、Sambrook 上記参照）が含まれる。これらの特許の全内容は本明細書の一部を構成する。
【００４９】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ポリヌクレオチド配列および関連するＤＮＡ配列を、ゲノムＤＮＡまたはcＤＮＡライブラリーから直接増幅できる。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅方法は、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために、例えば、与えられたＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のいずれかを得るため、試料中の所望のmＲＮＡの存在を検出するための、核酸の配列決定をするための、また他の目的のためのプローブとして用いる核酸を作るために有用である。インビトロ増幅法による当業者を指導するのに十分な技術の例は、Berger, Sambrook および Ausubel 上記、そしてまた Mullis 等、米国特許第4,683,202号（1987）; および Innis 等、ＰＣＲ Protocols A Guide to Methods and Application, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) に見出される。ゲノムＰＣＲ増幅のための商業的に入手できるキットは当業界で公知である。例えば、Advantage GC Genomic PCR Kit (Clontech) を参照。Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Boehringer Mannheim）を用いて、長いＰＣＲ産物の収量を改良できる。
【００５０】
与えられたＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のいずれかを発現させるに必要な核酸は、Narang 等、Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979) のホスホトリエステル法；Brown 等、Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979) のホスホジエステル法; Beaucage 等、Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (1981) のジエチルホスホルアミダイト法; 例えば、Needham VanDevanter 等; Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984) に記載の自動合成機を用いる Beaucage および Caruthers, Tetra. Letts. 22 (20): 1859-1862 (1981) により記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法；および米国特許第4,458,066号の固体支持法による直接化学合成によっても製造できる。化学合成では一般に一本鎖オリゴヌクレオチドが製造され、相補配列とのハイブリダイゼーションにより、またはその一本鎖ストランドをテンプレートとして用いるＤＮＡポリメラーゼによる重合により、それを二本鎖ＤＮＡに変換し得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列は短い配列の結合により得られ得ることを理解するであろう。
【００５１】
組換え発現カセット
当業界で知られるように、組換え発現カセットを用いて、公知のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体についての公知のコード化された核酸を発現させることができる。核酸配列、例えば完全長のサブユニットをコードするcＤＮＡまたはゲノム配列を用いて、所望の宿主細胞中に導入できる組換え発現カセットを構築できる。しかしながら、機能的ヘテロダイマーを得るために、一つのプラスミドから、または別のプラスミドに導入し、両方のサブユニットを発現させねばならないことが理解されるであろう。組換え発現カセットは、各サブユニットについて意図する宿主細胞中でのポリヌクレオチドの転写を指揮する転写開始調節配列に作動可能に結合したポリヌクレオチドを典型的には含むであろう。そのような方法はＦＳＨを発現させるために当業界でよく知られている（例えば、ＣＨＯ細胞由来組換えヒトＦＳＨ（rhＦＳＨ）；（Keene J.L. 等, J. Biol. Chem., 264: 4769-4752, 1989; Loumaye E. 等, Human Reprod. Update, 1: 188-1999, 1995; Olijve W. 等, Mol. Hum. Reprod., 2: 361-369, 1996）。
【００５２】
異種および非異種（すなわち内在性）プロモーターの両方を、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体サブユニットをコードする核酸を発現させるため用いることができる。組換え技術による一般的な製造方法は、当業界で周知である。Sambrook 等, 1989; Ausubel 等, 1987-1989 を参照。それぞれはその全体が本明細書の一部を構成する。
【００５３】
ベクターおよび宿主細胞
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のαおよびβサブユニットについてコードされたポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに結合し得る。一般に、一つのプラスミドベクター（またはαおよびβサブユニットが別の発現ベクターに含まれるなら複数のベクター）を、リン酸カルシウム沈澱のような沈澱物中に、または荷電した脂質との複合体中に導入する。ベクターがウイルスであるなら、それは適当なパッケージング細胞系を用いてインビトロでパッケージングし、次に宿主細胞に形質導入できる。
【００５４】
各サブユニットについてのＤＮＡ挿入物は、ＳＶ４０初期および後期プロモーターおよびレトロウイルＬＴＲのプロモーター等の適当なプロモーターに作動可能に結合すべきである。他の適当なプロモーターは当業者に公知であろう。発現構築物は、転写開始、終了部位、並びに転写領域における翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含むであろう。該構築物により発現される成熟転写物のコード化部分は好ましくは転写されるべきｍＲＮＡの末端に適当に位置する開始における翻訳開始コドンおよび終了コドン（例えばＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むであろう。
【００５５】
発現ベクターは少くとも１つの選択マーカーを好ましくは含むであろう。そのようなマーカーには例えば、真核細胞培養の場合、ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはネオマイシン耐性、Ｅ．coliまたは他の細菌中での培養の場合、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適当な宿主の代表的な例には、限定するものではないが、酵母細胞等の真菌細胞；ＤrosphilaＳ２およびＳpodopteraＳ５９細胞等の昆虫細胞；限定するものではないがＣＨＯ、ＣＯＳ、ＡＶ−１２、ＨＥＰＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３およびＢowesメラノーマ細胞および植物細胞が含まれ、ＣＨＯ細胞が好ましい。上記宿主細胞についての適当な培地および培養条件は周知である。適当な真核性ベクターにはＳtratageneから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、並びにＰharmaciaから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。他の適当なベクターは当業者に明らかであろう。
【００５６】
宿主細胞へのベクター構築物またはベクター（複数）の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポーレーション、形質導入、または他の方法により行い得る。そのような方法は、Ｓambrook、（上記）１−４および１６−１８章；Ａusubel（上記）１，９，１３，１５，１６章等の多くの標準的な研究室マニュアルに記載されている。
【００５７】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体サブユニットが、融合タンパク質などの修飾された形態で発現し得ること、分泌シグナルばかりでなく更なる異種の機能的な領域をも含み得ることは予想される。例えば更なるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中、またはその後の取扱および貯蔵中の安定性および宿主細胞での持続性を改良できる。またペプチド部分をポリペプチドに付加して、精製を促進することもできる。そのような領域は所望のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の最終的な製造前に除去できる。そのような方法は、Ｓambrook（上記）、１７．２９−１７．４２および１８．１−１８．７４；Ａusubel（上記）、１６、１７および１８章等の多くの標準的な実験室マニュアルに一般的に記載されている。
【００５８】
宿主細胞中でのタンパク質の発現
本明細書で提供され、または公知の核酸配列を用いて、哺乳動物細胞等の組換え的に操作された真核細胞中でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のαおよびβサブユニットを発現し得る。２つのサブユニットを含むタンパク質をコードする核酸の発現のために利用可能な多くの発現システムを当業者は知り得ることが予期される。真核細胞中でのタンパク質の発現について公知の様々な方法を詳細に記載する試みは行わないであろう。
【００５９】
簡単に要約すると、公知のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体をコードする単離した核酸の発現は、αサブユニットおよびβサブユニットＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（構成性または誘導性である）に別々に作動可能に結合し、発現ベクターに導入することにより、典型的には達成されるであろう。或いはそのＤＮＡを挿入することによりベクターは適当なプロモーターを提供するであろう。そのベクターは真核細胞中での複製および組込みに適当であり得る。典型的な発現ベクターは転写および翻訳ターミネーター、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現の制御に有用な開始配列およびプロモーターを含む。クローン化された遺伝子の高レベルの発現を得るために、転写を指揮する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写／翻訳ターミネーターを最小でも含む発現ベクターを構築するのが望ましい。当業者は生物学的活性を減ずることなく改変をなし得ることを認識するであろう。いくつかの改変は、クローニング、発現または標的分子のゲノムへの導入を促進するためになされ得る。そのような改変は当業者によく知られており、例えば、便利に位置する制限部位または終了コドンまたは精製配列を提供することを含む。
【００６０】
或いは、所望のαおよびβサブユニットをコードする内在性のＤＮＡを含む宿主細胞中でターンオンする（操作する）ことにより核酸を宿主細胞中で発現し得る。そのような方法は、米国特許第５，５８０，７３４号、５，６４１，６７０号、５，７３３，７４６号、および５，７３３，７６１号に記載されているように周知であり、これら特許は全体が本明細書の一部を構成する。
【００６１】
真核生物中での発現
哺乳動物細胞等の多くの真核性発現システムは当業者に知られている。下に簡単に説明するように、公知のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のαおよびβサブユニットをコードする核酸をこれらの真核システムで発現できる。
【００６２】
酵母中での異種タンパク質の発現は周知である。Ｆ．Ｓherman等，Methods in Ｙeast Ｇenetics，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory（１９８２）は、酵母中でタンパク質を製造するのに利用できる様々な方法を記載するよく知られた著作である。真核性のタンパク質の製造のために広く用いられる酵母はＳaccharomyces cerevisiaeおよびＰichia pastorisである。ＳaccharomycesおよびＰichia中での発現のためのベクター、株およびプロトコールは公知であり、商業的提供者（例えばＩnvitrogon）から入手できる。適当なベクターは、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはアルコールオキシダーゼを含むプロモーター等の発現調節配列、複製起点、末端配列および所望により他のものを通常有する。
【００６３】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のαおよびβサブユニットをコードする配列は、例えば哺乳動物、昆虫または植物起源の細胞培養をトランスフェクトするに用いる様々な発現ベクターにも結合し得る。該ペプチドの製造に有用な細胞培養の例は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞システムはしばしば細胞の単層の形であろうが、哺乳動物細胞の懸濁液も用い得る。無傷のタンパク質を発現できる多くの適当な宿主細胞系が当業界で開発され、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、およびＣＨＯ細胞系を含み、ＬonzaからのＣＨＯ Ｋ１等のＣＨＯ細胞系が好ましい。これらの細胞のための発現ベクターには、複製起点、プロモーター（例えば、好ましくはＣＭＶプロモーター、ＨＳＶｔｋプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、後期または初期ＳＶ４０プロモーター、またはｐｇｋ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモーター）、エンハンサー（Ｑueen等，Ｉmmunol．Ｒev．８９：４９（１９８６）等の発現調節配列、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴＡｇポリＡ付加部位）および転写ターミネータ配列等のプロセス情報部位を含み得る。本発明のタンパク質の製造に有用な他の動物細胞は、例えばＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection Ｃatalogue of Ｃell Ｌines and Ｈybridomas（７版、１９９２）から入手可能である。好ましい宿主細胞はＣＨＯ−Ｋ１等のＣＨＯ細胞を含み、好ましいベクターはＧＳベクターを含み、それぞれは例えばＬonza Ｂiologics ＰＬＣ（Ｓlough，Ｂerkshire，Ｅngland，ＵＫ）から入手できる。
【００６４】
昆虫細胞でのＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のαおよびβサブユニットの発現に適当なベクターは通常ＳＦ９バキュロウイルに由来する。適当な昆虫細胞系にはカの幼虫、カイコ、アワヨトウ、ガ、およびＳchneider細胞系等のＤrosophia細胞系を含む（Ｓchneider，Ｊ．Ｅmbryol．Ｅxp．Ｍorphol．２７：３５３−３６５（１９８７）を参照）。
【００６５】
酵母についてと同様に、高級動物または植物宿主細胞を用いる場合、ポリアデニル化または転写ターミネーター配列をベクターに典型的には導入する。ターミネーター配列の例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含み得る。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓprague等，Ｊ．Ｖirol．４５：７７３−７８１（１９８３））。更に宿主細胞中で複製をコントロールする遺伝子配列を、ウシのパピローマウイルスタイプのベクター中に見出されるもの等のベクター中に導入してもよい。Ｍ．Ｓaveria−Ｃampo，Ｂovine Ｐapilloma Ｖirus ＤＮＡ，ａＥucaryotic Ｃloning Ｖector in ＤＮＡ Ｃloning，２巻、ａＰractical Ａpproach，Ｄ．Ｍ．Ｇlover編，ＩＲＬ Ｐress，Ａrlington，ＶＡ，２１３−２３８頁（１９８５）。
【００６６】
タンパク質の精製
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体は、発現すると、ライゼートに標準的なタンパク質単離技術を適用することにより細胞から単離できる。精製過程のモニターはウエスタンブロット技術または他の標準的なノムノアッセイ技術のラジオイムノアッセイを用いることにより行い得る。
【００６７】
αおよびβサブユニットを含むＦＳＨまたはＦＳＨ変異体は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養から回収し、精製できる。好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、カチオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組合せを精製のために用いる。αおよびβサブユニットを含むＦＳＨおよびＦＳＨ変異体には天然の精製した産物、および化学合成法の産物を含み、例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物を含む真核宿主から組換え技術により製造された産物を含む。組換製造法で用いる宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化され得、或いはグリコシル化され得ない。好ましいＦＳＨまたはＦＳＨ変異体は真核宿主中で起るようにグリコシル化される。更に、本発明のポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果としてのある場合には最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。そのような方法は、Ｓambrook（上記）、１７．３７−１７．４２章；Ａusubel（上記）、１０，１２，１３，１６，１８および２０章等の多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、これらの全体は本明細書の一部を構成する。
【００６８】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体およびポリペプチド
公知のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体には、限定されるものではないが、明細書の配列同定部分に挙げたこれらのタンパク質配列を含む。それらを以下に更に同定する。

【００６９】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体ヌクレオチド配列
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異ヌクレオチド配列には、限定するものではないが明細書の配列同定部分に挙げたαまたはβサブユニットをコードするこれらのヌクレオチド配列を含み、それらを以下に更に同定する。

【００７０】
配列番号１９および２０のＤＮＡはライゲートしたオリゴヌクレオチドからデザインし、構築した。配列番号１９と配列番号１４の相違は、αサブユニットタンパク質のコードされたアミノ酸配列を変化させない相違である。同様に配列番号２０および配列番号１５の相異はβサブユニットタンパク質のコードされたアミノ酸配列を変化させない相違である。
【００７１】
アミノ酸コード
本発明のタンパク質およびポリペプチドを構成するアミノ酸はしばしば短縮形で表される。アミノ酸の名称は、当業界でよく理解されているようにアミノ酸をその１文字コード、その３文字コード、名称、３つのヌクレオチドコドンにより表すことにより示される（Ａlberts等、Ｍolecular Ｂiology of the Ｃell，３版、Ｇarland Ｐublishing，Ｉnc．Ｎew Ｙork，１９９４を参照）
【表１】

【００７２】
上記のように、本発明は、好ましくは食塩または選択された塩と共にリン酸緩衝剤を含む安定な製剤、そしてまた保存剤を含む保存溶液および製剤、そしてまた医薬的に受容し得る製剤中にＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含む医薬または獣医用途に適した多数回使用の保存製剤を提供する。保存製剤は、水性稀釈剤中に、少くとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デハイドロ酢酸ナトリウム、チメロサールから選択される少くとも１つの保存剤またはそれらの混合物を含む。
【００７３】
上記のように、本発明は包装材料、および、場合により水性稀釈剤中に、上記の緩衝剤および／または保存剤と共にＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の溶液を含むバイアルを含む製品を提供し、該包装材料はそのような溶液は２４時間以上の期間にわたって保持し得ることを示すラベルを含み得る。本発明は更に、包装材料、凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含む第１バイアル、および上記緩衝剤または保存剤の水性稀釈物を含む第２バイアルを含む製品を含み、該包装材料は、患者にＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を水性希釈剤中で再構築し、２４時間以上の期間にわたって保持し得る溶液を形成するよう指示するラベルを含む。
【００７４】
本発明に従い用いるＦＳＨまたはＦＳＨ保存剤は、哺乳動物細胞またはトランスジェニック産物からを含む組換え方法により製造するか、または尿源から等の他の生物学的源から精製してもよい。受容し得る方法には、Ｈakola，Ｋ．，Ｍolecular and Ｃellular Ｅndocrinobgy，１２７：５９−６９，１９９７；Ｋeene等，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６４：４７６９−４７７５，１９８９；Ｃerpa−Ｐoljak等，Ｅndocrinology，１３２：３５１−３５６，１９９３；Ｄias等，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６９：２５２８９−２５２９４，１９９４；Ｆlack等，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６９：１４０１５−１４０２０，１９９４およびＶalove等，Ｅndocrinotogy，１３５：２６５７−２６６１，１９９４および米国特許第３，１１９，７４０号に記載のものが含まれ、これらの文献は本明細書の一部を構成する。
【００７５】
本発明の製剤のためにタンパク質を提供する方法は特に問題とされるものではない。好ましくは、ＦＳＨはそれぞれ配列番号５および６で与えられる一つのαサブユニットおよび一つのβサブユニットを含むヘテロダイマーであり、ＦＳＨ変異体は、それぞれ配列番号５および１１；５および１２；並びに５および１３で与えられる１つのαサブユニットと１つのβサブユニットを含むヘテロダイマーである。本発明の範囲の適当なＦＳＨまたはＦＳＨ変異体には、限定するものではないが少くとも１つの公知のαサブユニット配列および少くとも１つの公知のβサブユニットを含む（公知のαおよびβサブユニットについての配列表を参照）。
【００７６】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の非限定的例には以下のものがある：
【化９】

【化１０】

【００７７】
本発明の製品中のタンパク質ホルモンの範囲は、再構築により生じる量、もしウエット／ドライシステムなら、約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度を含むが、より低い、およびより高い濃度も作用可能であり、意図する運搬ビヒクルに依存する。例えば溶液製剤は、経皮パッチ、肺、経粘膜または浸透若しくはミクロポンプ法とは異なるであろう。ホルモン濃度は好ましくは約５．０μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５．０μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌである。
【００７８】
好ましくは、その水性稀釈剤は、場合により更に医薬的に受容し得る保存剤を含む。好ましい保存剤には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸塩、チメロサール、またはそれらの混合物によりなる群から選択されるものが含まれる。好ましくは保存剤はｍ−クレゾール、フェノール、クロロクレゾール、またはそれらの混合物であり、ｍ−クレゾールが最も好ましい。製剤中で用いる保存剤の濃度は抗微生物効果を生じるに十分な濃度である。そのような濃度は選択した保存剤に依存し、当業者により容易に決定される。例えば、ｍ−クレゾールまたはフェノール（単独または組合せて）は一般に約２３ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度である。驚くべきことに、特許請求する製剤で用いる保存剤は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の生物学的活性に悪影響を及ぼさず、多数回使用の投与を可能にする。
【００７９】
他の賦形剤、例えば等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存助剤も稀釈剤に、場合により、そして好ましくは添加し得る。グリセリン等の等張剤は一般に公知の濃度で使用する。グリセリンの濃度は一般に約１６ｍｇ／ｍｌである。生理学的に許容される緩衝剤を好ましくは添加し、改良されたｐＨ調節を提供する。製剤は約４〜約１０等の広いｐＨ範囲をカバーし得、好ましい範囲は約ｐＨ５〜約ｐＨ９であり、最も好ましい範囲は約６．０〜約８．０である。好ましくは、本発明の製剤は約６．８〜約７．８のｐＨを有する。好ましい緩衝剤にはリン酸塩緩衝剤が含まれ、最も好ましいのはリン酸ナトリウム、特にリン酸塩で緩衝化された食塩水（ＰＢＳ）である。
【００８０】
Ｔween２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート），Ｔween４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート），Ｔween８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐluronic Ｆ６８（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、またはポリソルベート２０若しくは８０またはポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐluronic polyls，他のブロック共重合体等の医薬的に許容され得る可溶化剤、並びにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ等のキレータを場合により製剤または組成物に加え、凝集を減少させてもよい。これらの添加剤は、ポンプ又はプラスチック容器を製剤を投与するために用いるなら特に有用である。医薬的に受容し得る界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を軽減する。特許請求する製剤は驚くほど安定である。本発明前には、ＦＳＨの保存、マルチユース製剤の製造は不安定のため不可能であると信じられていた。出願人は特許請求する製剤は約２〜約４０℃の温度で安全に保存され、そのタンパク質の生物学的活性を、２ケ月を越え、更に証明する期間保持し得ることを発見した。
【００８１】
本発明の製剤は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールまたはそれらの混合物を水性稀釈剤中で混合することを含む方法により製造し得る。水性稀釈剤中でのＦＳＨまたはＦＳＨ変異体および保存剤の混合は従来の溶解および混合方法を用いて行う。適当な製剤を調製するために、例えば緩衝化溶液中のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の計量した量を、緩衝化溶液中の所望の保存剤と、所望の濃度のタンパク質および保存剤を与えるのに十分な量で混合する。この方法の変形は当業者により認識されるであろう。例えば、成分を加える順序、更なる添加剤を用いるかどうか、製剤を調製する温度およびｐＨはすべて濃度および用いる投与手段のために最適化される因子である。
【００８２】
特許請求する製剤は、透明な溶液として、または保存剤および／または賦形剤、好ましくはリン酸塩緩衝剤および／または食塩および選択された塩を水性希釈剤中に含む第２バイアルで再構築される凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を含むバイアルを含む２つのバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアルまたは再構築を必要とする２つのバイアルは多数回再使用でき、患者処置の単一または多数サイクルに十分であり、従って現在利用できるより便利な処置レジメを提供する。
【００８３】
ここに特許請求する製品は２４時間以上の期間にわたる投与に驚くほど有用である。本発明の前には、そのような製品は即時使用の場合にのみ適当であり承認されている。患者は使用しない材料を捨てるよう指示され、これは浪費と出費をもたらす。従って、ここに特許請求する製品は患者に大きな利益をもたらす。特許請求する製剤は、約２〜約４０℃の温度で安全に貯蔵し得、２月を越える長い期間タンパク質の生物学的活性を保持し得ることを出願人は発見した。したがって溶液が２４、３６、４８、７２若しくは９６時間、若しくはそれ以上保持され、および／または用い得ることを示す包装ラベルが可能となる。保存稀釈剤を用いるなら、そのようなラベルは１年、１．５年〜２年までの使用を含み得る。
【００８４】
本発明におけるＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の溶液は水性希釈剤中でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を混合すること含む方法で調製し得る。混合は従来の溶解および混合方法を用いて行う。適当な稀釈剤を調製するために、例えば水または緩衝液中のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の計量した量を、所望の濃度のタンパク質および場合により保存剤を与えるのに十分な量で混合する。この方法の変形は当業者により認識されるであろう。例えば、成分を加える順序、更なる添加剤を用いるかどうか、製剤を調製する温度およびｐＨはすべて濃度および用いる投与手段のために最適化される因子である。
【００８５】
特許請求する製品は、透明な溶液として、または水性希釈剤を含む第２バイアルで再構築される凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のバイアルを含む２つのバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアルまたは再構築を必要とする２つのバイアルは多数回再使用でき、患者処置の単一または多数サイクルに十分であり、従って現在利用できるより便利な処置レジメを提供する。
【００８６】
透明な溶液、または水性媒体を含む第２バイアルで再構築される凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のバイアルを含む２つのバイアルを、薬局、病院、または他のそのような施設に提供することにより、本発明の製品を患者に間接的に提供してもよい。この場合の透明な溶液は、１ｌまたはそれ以上までであってもよく、薬局または病院が大きい容器からＦＳＨまたはＦＳＨ変異体溶液の少量を小さいバイアルへ移すため１又は数回取り出し、彼らの顧客および／または患者に提供してもよい。この場合の稀釈バイアルは１ｌまたはそれ以上までであってもよく、大きい容器から稀釈剤の少量を凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の再構築のため多数回取り出してもよい。薬局または病院が彼らの顧客および患者に提供する透明溶液または再構築したＦＳＨ若しくはＦＳＨ変異体溶液は、患者処置の一回また多数サイクルに十分であり、従って現在利用できるものより便利な処置レジメを提供する。
【００８７】
これらの一つのバイアル系を含む認められた装置は、Ｈumaject（登録商標）、ＮovoＰen（登録商標）、Ｂ−Ｄ Ｐen（登録商標）、ＡutoＰen（登録商標）およびＯptiＰen（登録商標）等の溶液運搬用のペン−インジェクター装置を含む。２つのバイアル系を含む認められた装置は、ＨumatroＰen（登録商標）等の再構築溶液の運搬のためにカートリッジ中で凍結乾燥した薬剤を再構築するためのペン−インジェクターシステムを含む。
【００８８】
ここに特許請求する製品は包装材料を含む。包装材料は、監督機関により要求される情報の外に、その製品を用い得る条件を提供する。本発明の包装材料は、水性稀釈液中でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を再構築し、溶液を形成し、その溶液を２４時間以上の期間にわたって使用するという指示を患者に与える。１つのバイアルの溶液製品の場合、ラベルはそのような溶液は２４時間以上の期間にわたって使用し得ることを示す。ここに特許請求する製品はヒトの医薬的製品使用に有用である。
【００８９】
本発明の製剤は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体、および好ましくは食塩または選択された塩を含むリン酸塩緩衝剤である選択した緩衝剤を混合することを含む方法により製造し得る。水性希釈剤中でのＦＳＨまたはＦＳＨ変異体および緩衝剤の混合は従来の溶解および混合方法を用いて行う。適当な製剤を調製するために、例えば水または緩衝液中のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の計量した量を、水中の所望の緩衝剤と、所望の濃度のタンパク質および緩衝剤を与えるのに十分な量で混合する。この方法の変形は当業者により認識されるであろう。例えば、成分を加える順序、更なる添加剤を用いるかどうか、製剤を調製する温度およびｐＨはすべて濃度および用いる投与手段のために最適化され得る因子である。
【００９０】
特許請求する製剤は、透明な溶液として、または保存剤または緩衝剤および賦形剤を水性希釈剤中に含む第２バイアルで再構築される凍結乾燥したＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のバイアルを含む２つのバイアルとして患者に提供し得る。単一の溶液バイアルまたは再構築を必要とする２つのバイアルは多数回再使用でき、患者処置の単一または多数サイクルに十分であり、従って現在利用できるより便利な処置レジメを提供する。
【００９１】
本明細書に記載する安定、または保存製剤または溶液中のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体は、様々な運搬方法により本発明に従い投与し得、その運搬方法には、ＳＣまたはＩＭ注射、経皮、肺、経粘膜、移植、浸透ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、経口、および当業界で周知の当業者に理解される他の手段を含む。
【００９２】
以下の実施例は本発明の製剤および組成物の製造を更に説明するためにのみ与えられる。本発明の範囲は以下の実施例のみからなると解釈すべきではない。
【００９３】
【実施例】
核酸／ポリペプチド実施例
実施例１
哺乳動物細胞におけるＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のクローニングおよび発現
典型的哺乳動物発現ベクターは、少くとも１つのプロモーター因子（ｍＲＮＡの転写開始を媒介する）、ポリペプチドコード配列、および転写終了および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。しかしながら、機能的なＦＳＨまたはＦＳＨ変異体はαおよびβサブユニットの両方を含むので、両サブユニットを発現させる手段が必要であり、それは各サブユニットのための１つのプロモーター要素を含む１つのベクターから両方のサブユニットを発現させることによるか、或いは２つのベクター（第１のサブユニットを発現させるプロモーターを含む第１のベクターおよび第２のサブユニットを発現させるプロモーターを有する第２のベクター）を用いることによる。
【００９４】
更に、各哺乳動物発現ベクターは１またはそれ以上のベクターに存在し得る因子を有し、その因子にはエンハンサー、Ｋozak配列、およびＲＮＡスプライシングのため供与および受容部が隣接する介在配列が含まれる。
【００９５】
非常に有効な転写は、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、レトロウイル、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長い末端反復配列（ＬＴＲＳ）、およびサイメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかしながら、細胞性因子も用い得る（例えばヒトのアクチンプロモーター）。ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を提供するのに用いる適当な発現ベクターには例えばｐＩＲＥＳ１neo、ｐＲetro−Ｏff、ｐＲetro−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、またはＰＬＮＣＸ（Ｃlontech Ｌabs，Ｐalo Ａlto，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈygro（＋／−）（Ｉnvitrogen）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐharmacia，Ｕppsala，Ｓweden）ｐＲＳＶcat（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２dhfr（ＡＴＣＣ ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）を含む。用い得る哺乳動物細胞にはヒトＨela２９３，Ｈ９およびＪurkat細胞、マウスＮＩＨ３ＴＳおよびＣ１２７細胞、Ｃos１、Ｃos７およびＣＶ１、ウズラＱＣｌ−３、マウスＬ細胞並びにチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が含まれる。
【００９６】
或いは、αおよびβサブユニッのための望ましいＤＮＡ配列は、染色体に組込まれると、各サブユニットを発現するそのＤＮＡ配列を含む安定な細胞系で発現し得る。dhfr，gpt、ネオマイシンまたはハイグロマイシン等の選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは当業界で知られているようにトランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【００９７】
該サブユニットのトランフェクトされたＤＮＡ配列は大量のコードされたポリペプチドを発現させるため増幅することもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、問題のＤＮＡ配列の数百または数千ものコピーを有する細胞系を発生させるのに有用である。他の有用なマーカーは酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）（Ｍurphy等，Ｂiochem．Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂebbington Ｂio／Ｔechnology １０：１６９−１７５（１９９２））である。これらのマーカーを用いて哺乳動物細胞を選択培地で培養し、最高の耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系は染色体に組込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞がタンパク質およびポリペプチドの製造にしばしば用いられる。
【００９８】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４はラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃullen等、Ｍolec．Ｃell．Ｂio，５：４３８−４４７（１９８５））およびＣＭＶエンハンサーの断片（Ｂoshart等、Ｃell ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。例えば制限酵素解裂部位ＢａｍＨ１、ＸｂａIおよびＡｓｐ７１８を有する多重クローニング部位は、問題のαおよびβをサブユニットのＤＮＡ配列のクローニングを容易にする。そのベクターは更に、ラットプレプロインシュリンの３’イントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終了シグナルを含む。
【００９９】
実施例２
ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のための発現プラスミドは、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体サブユニットをコードするｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉnvitrogen，Ｉnc．より入手し得る）にクローニングすることにより得られる。前述のように、各サブユニットは、別のベクターを宿主細胞に独立に入れるか、或いはαおよびβサブユニットの両方を発現するよう単一のベクターを操作することにより、機能性ヘテロダイマーを製造するよう発現することを要する。
【０１００】
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、（１）Ｅ．coliおよび他の原核細胞中での発育に有効なＥ．coliの複製起源；（２）プラスミドを含む原核細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、（３）真核細胞中での発育のためのＳＶ４０複製起源；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）赤血球凝集素断片（すなわち精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）、ＨＩＳタグ（例えばＡusbel（上記）参照）、それに続く終了コドンおよびポリアデニル化シグナルを含み、ｃＤＮＡがＣＭＶプロモーターの発現調節の下に便利に置かれ、ポリリンカー中の制限部位という手段によりＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に結合するよう配置する。ＨＡタグはＷilson等、Ｃell ３７：７６７−７７８（１９８４）に記載されているインフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチド由来のエピトープに対応する。ＨＡタグを標的ポリペプチド（αまたはβサブユニット）に融合させるとＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えポリペプチドの検出および回収を容易にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩは更に選択可能なネオマイシンマーカーを含む。
【０１０１】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のαおよびβサブユニットをコードするＤＮＡ断片をベクターのポリリンカー領域に別々にクローニングして、組換えポリペプチドの発現がＣＭＶプロモーターにより指揮されるようにする。ベクターへの挿入は場合によりＨＡエピトープと共に、或いはなしである。プラスミド構築戦略は以下のようである。各サブユニットについての寄託されたクローンのＦＳＨまたはＦＳＨ変異体のｃＤＮＡを便利な制限部位を含むプライマーを用いて増幅させる。
【０１０２】
各サブユニットについてのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクター、ｐｃＤＮＡI／Ａｍｐを適当な制限酵素で消化し、次に各サブユニットを消化したベクターに結合する。各ライゲーション混合物をＥ．coli株ＳＵＲＥ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems，１１０９９Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad，Ｌａ Ｊolla，ＣＡ９２０３７より入手可能）中に形質転換し、形質転換した培養物をアンピシリン媒地プレート上にプレートとし、そのプレートを次にアンピシリン耐性コロニの生育を可能にするためインキュベートする。各サブユニットについてのプラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体をコードする断片の存在のため制限分析また他の手段により調べる。
【０１０３】
組換えＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の発現のために、例えばＳambrook等，Ｍolecular Ｃloning：ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙork（１９８９）に記載されているようにＤＥＡＥ−デキストランを用いて、上記のように各サブユニットのための発現ベクターで共トランスフェクションする。細胞を、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の発現条件下にインキュベートする。
【０１０４】
ＦＳＨ ＨＡまたはＦＳＨ変異体ＨＡ融合ポリペプチドの発現は、例えばＨarlow等，Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual，２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＥＷ ＹＯＲＫ（１９８８）に記載されている方法を用いて、放射標識および免疫沈降により検出される。この目的のために、トランスフェクションの２日後、細胞を３５Ｓ−システインを含む媒地中で８時間インキュベートすることにより標識する。細胞および媒地を集め、細胞を洗浄し、上に引用したＷilson等により記載されているように、洗剤を含むＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０，０．１％ＳＤＳ，０．５％ＤＯＣ，５０ｍＭＴＲＩＳ，ｐＨ７．５）で溶菌する。タンパク質を細胞溶菌物および培地からＨＡ特異的モクロナール抗体を用いて沈降させる。沈降したタンパク質を次にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオクラフィーにより分析する。予期する大きさの発現生成物が細胞溶菌物中に見られ、負のコントロールでは見られない。
【０１０５】
ベクターｐＣ４はＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の各サブユニットの発現のために用いられる。或いは当業者は、単一ベクターからαおよびβサブユニットの両方を発現させるようｐＣ４を適応させることができるであろう。プラスミドｐＣ４はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈfｒ（ＡＴＣＣNo.３７１４６）の誘導体である。そのプラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの調節下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。αおよびβサブユニットプラスミドで共トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞またはジヒドロ葉酸活性を欠く他の細胞を、化学治療剤メトトレキセートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Life Technologies）中で細胞を培養することにより選択できる。メトトレキセート（ＭＴＸ）に耐性の細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増幅は十分文献に記載されている（例えば、F.W.Alt等, J. Biol. Chem. 253:1357-1370(1978); J.L.Hamlinおよび C.Ma, Biochem. and Biophys.Acta 1097:107-143(1990); および M.J.Pageおよび M.A.Sydenham, Biotechnology 9:64-68を参照）。高濃度のＭＴＸ中で生育した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として標的酵素ＤＨＦＲを過剰に発現することにより薬剤に対する耐性を得る。ＤＮＡ配列をＤＨＦＲ遺伝子に結合すれば、それは通常共増幅され、過剰発現する。この方法は増幅された遺伝子の１０００を越えるコピーを有する細胞系を発生させるのに用い得ることが知られている。次にメトトレキセートが引き出され時、宿主細胞の１以上の染色体に組込まれた、増幅されたＤＮＡ配列を含む細胞系が得られる。
【０１０６】
αおよびβサブユニットを発現させるために、プラスミドｐＣ４はラウス肉腫ウイルス（Cullen等，Molec.Cell.Biol. 5:438-447(1985)の長い末端反復配列の強力プロモータの後に問題のＤＮＡ配列を含み、更に、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時遺伝子のエンハンサーから単離された断片を含む（Boshart等、Cell 41:521-530(1985))。プロモーターの下流にＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８制限酵素解裂部位があり、ＤＮＡ配列の組込みを可能にする。これらのクローニングサイトの後に、プラスミドはラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部分を含む。他の高効率プロモーター、例えばヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、または他のレトロウイルス、例えばＨＩＶおよびＨＴＬＶＩからの長い末端反復配列をも発現のために用い得る。Clontech's Tet-0ff および Tet-on遺伝子発現システムおよび類似のシステムを用いて、哺乳動物細胞中で制御された方法でＦＳＨまたはＦＳＨ変異体を発現できる（M.Gossen およびH.Bujard, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))。ｍＲＮＡのポリアデニル化のため、他のシグナル、例えばヒト成長ホルモンまたはグロビンからのものも用い得る。染色体に組込まれたαおよびβサブユニットのＤＮＡ配列を有する安定な細胞系も、ｇｐｔ、Ｇ４１８ またはハイグロマイシン等の選択可能なマーカーで共トランスフェクトした際に選択できる。１を越える選択可能なマーカー、例えばＧ４１８およびメトトレキセートを用いるのが有利である。
【０１０７】
プラスミドｐＣ４を制限酵素で消化し、次に当業界で知られた方法により仔ウシ腸ホスファターゼを用いる脱ホスホリル化する。ベクターを次に１％アガロースゲルから単離する。
【０１０８】
各サブユニットについての完全長のＦＳＨまたはＦＳＨ変異体をコードするＤＮＡ配列を遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。非限定的な例にはＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の各サブユニットのコード化配列の部分に対応するか、または相補的なヌクレオチドを有する５’および３’プライマーを含む。
【０１０９】
増幅した断片を適当なエンドヌクレアーゼで消化し、次に１％アガロースゲルで再び精製する。各サブユニットについての単離された断片および脱ホスホリル化したベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて別々にライゲートする。Ｅ．coli ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂlue細胞を次に別に形質転換し、例えば制限酵素分析を用いて、ｐＣ４プラスミドに挿入された断片（またはベクターがαおよびβサブユニットの両方を発現するために適応させられているなら複数の断片）を含む細菌を同定する。
【０１１０】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠いたチャイニーズスター卵巣(ＣＨＯ)細胞をトランスフェクションに用いる。５μｇの発現プラスミドｐＣ４は、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏと共にリポフェクチンを用いて共トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、主要な選択可能なマーカー、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したアルファマイナスＭＥＭに接種する。２日後、トリプシン化して、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキセートおよび１ｎｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したアルファマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Greiner, Germany）に接種する。約１０〜１４日後単一のコロニーをトリプシン化して、異なった濃度のメトトレキセート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウエルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに接種する。最高のメトトレキセート濃度で生育したクローンをもっと高濃度のメトトレキセート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新しい６ウエルプレートに次に移す。同じ方法を１００〜２００ｍＭの濃度で生育するクローンが得られるまで繰り返す。所望の産物の発現を例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより、または逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
【０１１１】
本発明を先の記述または実施例に具体的に記載した以外のやり方で実施できることは明瞭であろう。
【０１１２】
本方法の多くの改変および変形が、Keene J.L.等、J.Biol.Chem., 264:4769-4752, 1989; Loumaye E 等，Human Reprod. Update, 1:188-1999, 1995; Olijve W.等，Mol. Hum.Reprod., 2:361-369,1996 に記載されたもの、そしてまた他のゴナドトロピンについて知られ、用いられている他の組換え技術を含め、組換えタンパク質発現に対して知られている。
【０１１３】
実施例３
ＡＶ１２細胞中での発現
発現カセットベクターｐＧＴＨをＡＶ１２中でのαサブユニットの発現に用いた。多くの発表された論文がＡＶ１２−６６４および／またはＡＶ１２−ＲＧＴ１８細胞の使用を記載する（Grinell, B.W.等，Blood 76(12):2546-54,1990; Burck, P.J.等，J.Biol.Chem.265(9)5170-7,1990; Parkinson, J.F.等，J.of Biol.Chem. 265(21):12602-10,1990; Grinnel, B.W.等，J.Biol.Chem.266(15):9778-85,1991; Wery,J.P.等，Nature 352(6330):79-82,1991; Berg, D.T.等，Biotechniques 14:972-9,1993; Gerlitz,B 等，Biochemical Journal 295(1):131-40,1993; Kursar,J.D.等，Molecular Pharmacology 46(2):227-34,1994; Desai,M.A.等，Molecular Pharmacology 48(4):648-57,1995; Obesity Research 3 Suppl, 4:4441s-4447s,1995; Desai,M.A.等，British Journal of Pharmacology 118(6):1558-64,1996; Kumar A.等，Cancer Research 56(23):5397-402,1996; Boggs,L.N.等，J.of Neurochemistry 57(3):1324-7,1996;Lucaites,V.L.等，Life Sciences 59(13):1081-95,1996; Schoepp,D.D.等，Neuropharmacology 35(12):1661-72,1996; Kumar,A.等，Cancer Research, 57(15):3111-4,1997; Urology,49(3)487-93,1997; Wainscott,D.B.等，Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology,357(1):17-24,1998; Wu,S.等，Brain Research-Molecular Brain Research,53(1-2):88-97,1988を参照）。同様に、刊行物はプラスミドｐＧＴＨの使用（Grinnel等，J.Biol.Chem. 266(15):9778-85,1991参照）およびプラスミドｐＧＴＤの使用を（Biolchemical Journal,295(Pt1):131-40,1993参照）を記載している。
【０１１４】
簡単に言うと、ｐＧＴＨは順次にいくつかの要素：ＳＶ４０初期プロモーター．ori、E.coli ハイグロマイシン耐性、ＳＶ４０スモール「ｔ」抗原スプライス部位／poly Ａ部位、ｐＢＲ３２２クローニングレムナント、ＢＫウイルス（Ｐ２株）クローニングレムナント、ポリーＣＡ２０／ＧＴ２０因子（合成オリゴヌクレオチド）、ＢＫウイルス（Ｐ２株）エンハンサー、ＡＤ２主要後期プロモーター／スプライストリパータイトリーダー、ＦＳＨαサブユニット配列のためのBcli挿入部位（終止コドンを含む）、ＳＶ４０「ｔ」抗原スプライス部位／ポリＡ部位；およびｐＢＲ３２２アンピシリン耐性／oriを含む。
【０１１５】
プラスミド構築物ｐＧＴＨ−αを、３６２−ｂｐ ＢcｌＩ ＦＳＨ ｃＤＮＡ断片をベクターの唯一のＢｃｌＩ部位（配列番号１９または１４の配列を参照）にクローニングすることにより、ヒトαサブユニット配列（配列番号５）を発現させるため作った。ＦＳＨαｃＤＮＡ断片ＤＮＡを、テンプレートとしてシャトルプラスミドｐＬＧＤ６３７を用いることによりＰＣＲ増幅により作った（ｐＬＧＤ６３７は合成／オリゴヌクレオチド組立ＦＳＨαｃＤＮＡ配列を含む）。ＢｃｌＩ挿入物のインテグリティを、配列決定および GenPeptデータベースとの比較により確認した。
【０１１６】
発現カセットベクターｐＧＴＤを用いて、ヒトβサブユニットＦＳＨ変異体配列（配列番号１１）を発現させた。ｐＧＴＤはＡＶ１２細胞中での発現のためのいくつかの要素を含む。ｐＧＴＤは順次に、ＢＫウイルス（Ｐ２株）クローニングレムナント，Ｐｏｌｙ−ＣＡ_２０／ＧＴ_２０因子（合成オリゴヌクレオチド）、ＢＫウイルス（Ｐ２株）エンハンサー、ＡＤ２主要後期プロモーター／スプライストリパータイトリーダー、ＦＳＨ変異体βサブユニットコード配列のためのＢｃｌ１挿入部位（終止コドンを含む）、ＳＶ４０スモール「ｔ」抗原スプライス部位／ポリＡ部位；ＳＶ４０初期プロモーター、ori，ネズミジハイドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡ、ＳＶ４０スモール「ｔ」抗原スプライス部位／ポリーＡ部位、およびｐＢＲ３２２アンピシリン耐性／oriを含む。
【０１１７】
プラスミド構築物ｐＧＴＤ−ｂＣＤ３を、３９３ｂｐ ＢｃｌＩ ＦＳＨβ−ｂＣＤ３ ｃＤＮＡ断片をｐＧＴＤベクターの唯一のＢｃｌＩ部位にクローニングすることにより、調製した（配列番号２０または１５を参照）。ＦＳＨβ−ＣＤ３ ｃＮＤＡ断片ＤＮＡを、テンプレートとしてシャトルプラスミドｐＬＧＤ６３８を用いて、ＰＣＲ増幅により作った（ｐＬＧＤ６３８は合成／オリゴヌクレオチド組立ＦＳＨβｃＤＮＡ配列を含む）。構築物のインテグリティを、配列決定により確認し、GenPeptデータベースに寄託されているヒトβサブユニット配列（アクセションナンバー４７６４４１）と比較した。
【０１１８】
簡単にいうと、ｐＧＴＨ−αおよびｐＧＴＤ−ｂＣＤ３プラスミドを線状化し、再精製し、次にアドヘレントＡＶ２３−ＲＧＴ１８細胞に共トランスフェクトした。２００μｇ／ｍｌのＧ４１８と共に、０．２５ｕＭのメトトレキセートおよび１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを培地を用いて選択し、ＡＶ１２−ＲＧＴ１８細胞のグルタメートトランポーター遺伝子型を維持した後に、個別の安定なクローンを手動によるか、またはフローアシストセルソーティングにより単離した。最大を産生するクローンを、商業的ＦＳＨ ＥＬＩＳＡキットを用いるならし培地の分析により同定した。いくつかのクローンを血清を含まない懸濁液に適応させ、更に精製して単離可能量のＦＳＨ変異体ヘテロダイマーを得た。
【０１１９】
実施例４
ＣＨＯ−Ｋ１細胞中の発現
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系（LONZA Biologics plc.）を培養して、配列番号５のαサブユニット及び配列番号１１のβサブユニットからなるＦＳＨ変異体ヘテロダイマーを製造した。
【０１２０】
発現ベクターカセットは、αサブユニット（配列番号５）をコードするＤＮＡ，およびβサブユニット（配列番号１１）をコードするＤＮＡを含み、２つの異なるプロモーターにより調節される：βサブユニットについてはＣＭＶおよびαサブユニットについてＥＦ１α。それぞれのαおよびβサブユニット配列はウシ成長ホルモンpolyＡテールを用いる。さらに該ベクターはＳＶ４０後期プロモーターにより調節され、ＳＶ４０ポリＡテールを含むグルタミンシンテターゼ遺伝子を含み、選択可能なマーカーとして用いる。
【０１２１】
その細胞系をＬ−メチオニンスルホキシミンの選択圧下にGibco ＢＲＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で培養した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＦＳＨ変異体を発現するマスターウエルを同定した。いくつかのマスターウエルをクローニングおよび増幅に付した。これらの実験により適当な力価を有するクローン性細胞系２Ｂ６．１Ｃ３．２５を得た。小スケールの振とうフラスコ（２０〜６０ｍｌ）中で行った発現の研究は、この系が７〜８日後に３０ｍｇ／ＬのＦＳＨ変異体を発現することを示した。
【０１２２】
実施例５
ＣＨＯまたはＡＶ−１２細胞からのＦＳＨ変異体の精製
配列番号５のαサブユニットおよび配列番号１１のβサブユニットからなるＦＳＨ変異体ヘテロダイマー精製は、ＣＨＯ−Ｋ１若しくはＡＶ１２細胞系または適当に利用できる他の製造系の単層または懸濁培養から、文献に記載され、当業界で知られた多くの方法により達成し得る。開示したＦＳＨ変異体を、媒地を含む培養物から単離する一つの方法は、培地を、タンパク質を精製するための、カチオン交換クロマトグラフィー、ダイアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過に付すことである。界面活性剤を含む懸濁培養の場合には、Ｑ−Sepharose工程等の更なる精製工程が必要かも知れない。ｐＨ、導電性、緩衝液組成および操作条件（カラムの大きさ、流速、等）をクロマトグラフィー工程に更に加え、または最適化し得る。純度および収率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（クーマシー染色およびウェスタンブロッティングの両方）、ＥＬＩＳＡ試験、排除クロマトグラフィーおよび２７７ｎｍにおけるＵＶ吸収によるタンパク質濃度または他の公知の技術により分析し得る。
【０１２３】
精製およびクロマトグラフィー的分別は、以下の各単離工程についての更なる詳細に従うことにより、達成し得る。単層培養の場合、カチオン交換カラムに適用する前にならし培地を濃縮し、ダイア濾過する。存在し得る洗剤を除去するために、懸濁培養の場合、Ｑ−セファロースバッチング工程を含み得る。
【０１２４】
１．濃縮
典型的には、ＡＶ１２懸濁培養の場合、０．０２〜０．０４％のPluronic Ｆ６８を用い、一方ＣＨＯ懸濁培養の場合、媒地中に０．１〜０．１８％用いる。遠心分離およびチーズクロスを通す濾過を用いて細胞培養群により透明化したならし培地を、Ｓ３ＹＭ１０スパイラルカートリッジ（Amicon #540633）と共にタンジェンシャルフロー濾過システムProFlux (ProFLux M12、Millipore）を用いて濃縮する。用いたPluronic Ｆ６８の量に依存して、媒地を４〜１０倍濃縮し、濃縮された媒地中に０．２〜０．４％のPluronic Ｆ６８が存在するようにする。濃縮後の最終容積は、ＣＨＯ−Ｋ１について８Ｌから、そしてＡＶ１２培養物について２４Ｌから出発して、通常２〜３Ｌである。
【０１２５】
２．Ｑ− Sepharose を用いるバッチング
濃縮前の出発ならし培地各１リットルに、５０ｍＬのFast-Fllow Q-Sepharose樹脂（Pharmacia 17-0510-01、20mM Tris-pH7.4で前平衡化）および２００ｍＭの最終伝導度（約２０ｍＳ／ｃｍ）を得るに十分なＮａＣｌを濃縮した媒地に加え、一晩ゆっくりと４℃で攪拌する。
【０１２６】
３．ダイア濾過
Ｑ−Sepharose樹脂と共に濃縮した媒地を一晩バッチングした後、樹脂を沈降させ、上清をデカントアウトし、Zeta Plus ３０−ＳＰフィルター（＃Ｂ０４０６、Sun Source）および流速１７０ｍｌ／分のMaster flexポンプを有するＣＵＮＯシステムを用いて濾過する。その媒地を次に約８００ｍｌまで更に濃縮し、Profluxシステム中で２０ｍＭ Tris ｐＨ７．４の５〜６容量を用いてダイア濾過する。この時点で、伝導度は約２ｍＳ／ｃｍである。ｐＨをＩＮ ＨＣｌで５に調節し、溶液をＣＵＮＯシステムで新しい Zeta Plus ３０−ＳＰフィルターを用いて再び濾過し、直ちにカチオン交換樹脂にのせる。
【０１２７】
４．カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
カラム：Pharmacia SP-Sepharose Fast Flow（１７−０７２９−０１）を用い、ＦＳＨの約１００〜２００ｍｇ（全タンパク質約５００〜６００ｍｇ）を５０ｍｌのカラムに充填する。緩衝剤はＡ）２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０；及びＢ）２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌである。
【０１２８】
試料をｐＨ５．０に調節し、濾過により清澄化し、直ちにカラムにのせ、４カラム容量で５ｍｌ／分で流した後、１５カラム容量にわたる０％〜５０％Ｂのグラジエントを開始する。３分の画分を集める（１５ｍｌ）。画分を１Ｍ Tris−ｐＨ８．０の４００ｍｌ中に集める。
【０１２９】
クーマシー染色ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを用い、ＦＳＨ含有画分を選択して、プールする（典型的にはプールの大きさは５０ｍｌカラムに対して２００〜２５０ｍｌである）。このプールを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に対して４℃で一晩透析して、伝導度を３ｍＳ／ｃｍ未満まで落とす。
【０１３０】
５．ダイアフィニティクロマトグラフィー（ＤＡＣ）
Prometic Biociences Inc.からのMimetic Blue Dye 1 A6XL、００９０−００５０を約４０ｍｇのＦＳＨについて５０ｍｌのカラムで用いる。緩衝液は、Ａ）２５ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．５（伝導度は４．５〜５ｍＳ／ｃｍである）； Ｂ）２５ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．５； Ｃ）２５ｍＭリン酸塩、１Ｍ ＫＣｌ，ｐＨ８．０である。
【０１３１】
ＣＥＸプールの透析の後、ｐＨを６．５に調節し、３ｍｌ／分でＤＡＣカラムにのせる。１００％Ａ〜５０％Ａのグラジエントの後、５０％Ｂを４カラム容量について適用し、次に５カラム容量について１００％緩衝液Ｃで溶出し、３分の画分（９ｍｌ）を集める。
【０１３２】
クーマーシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてＦＳＨ含有画分を選びプールする。典型的にはそのプールの大きさは５０ｍｌカラムの場合、９０〜１００ｍｌである。そのプールをMillipore Ultrafree遠心装置（ＵＦＶ２ＢＣＣ４０、５０００ ＭＷＣＯ、２０００rpmで回転）を用いて４ｍｌまで濃縮し、ゲル濾過カラムにのせる。
【０１３３】
６．ゲル濾過
カラム：BilPilot Superdex ７５ Prep Grade ３５／６００カラムを、５０〜１００ｍｇのＦＳＨについて用いる。緩衝液は１×ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ １０×ＰＢＳ、＃７００１１から調製）および１００ｍＭ ＮａＣｌである。緩衝液の最終組成は、１ｍＭの一塩基性リン酸カリウム、３ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、２５３ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４である。
【０１３４】
流速３ｍｌ／分で上記の１×ＰＢＳ中のＤＡＣ工程からのＦＳＨ４ｍｌをそのカラムにのせ、１分（３ｍｌ）の画分を集める。
【０１３５】
この工程後のＦＳＨの純度はクーマシーおよびシルバー染色ゲルにより、通常９５％を超える。
【０１３６】
製剤／製造実施例
実施例６
ＦＳＨの物理的安定性に及ぼす保存剤の影響
保存剤はタンパク質を変性または脱安定化し、または凝集を誘導する（Brange,J.および Langkjar,L., Acta Pharm.Nord,4,149-158,1992; Maa YF および Hsu C, International Journal of Pharmaceutics, 140, 155-168,1996）ので、様々な保存剤の存在下でのｕＦＳＨ（uFSH-Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin）の物理的安定性を動的光散乱法を用いて調べた。すべての測定値は、Lexel９５ アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、Brookhaven Instruments モデルＢＩ−２００ＳＭゴニオメーター、およびＢＩ９０００ＡＴオートコリレーターを用いて得た。データーパラメーターは、１００，０００カウント／秒に調節した初期光子カウント、３０秒持続、３１ダストカットオフ値、および９０°散乱角よりなる。
【０１３７】
１×ＰＢＳに対して一晩ｐＨ７．４で透析した１ｍｇ／ｍｌの尿の濾胞ホルモン（uFSH-Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin）の１．５ｍｌ溶液に保存剤を加えた。保存剤の濃度は適当な抗微生物活性を与えることが一般的に知られている濃度となるように選択した。層流フード中でこの試料を０．１μｍのAnotop-Plusフィルター（１０ｍｍ）を通して、１２ｍｍＤＬＳ試験管中に濾過した。その試料を３７℃で前もって平衡化しておいたＤＬＳホルダーに置いた。自己相関関数を２４時間の間１５分毎に測定し、分析して、流体力学的パラメーターを得た。この測定により、タンパク質分子の９９％以上が約５．７ｎｍという平均直径を有することがわかった。少ない割合（１％未満）が約２２０ｎｍという平均直径を有していた。保存剤の存在は、３７℃で２４時間後、分子の粒径分布を顕著に変化させなかつた。次に、２４時間における代表的なデータをＮＮＬＳ（Non Negative Linear Squares）プログラムを用いて表Ｉに示すよう解析した。分子の９９％以上が約５．７ｎｍの平均直径を有する粒子であった。結晶学的に測定した流体力学的半径と分子量を関係づける実験式を用いると（Squire, P.G.および Himmel, M.E., Arch.Bioch.Biophys., 196,165-177,1979）、この平均ＤＬＳ粒径は約３６，０００ダルトンに対応し、これはｕＦＳＨヘテロダイマーの分子量は一致する。粒子の残りの小部分（１％未満）は約２００ｎｍの平均直径を有していた。表ＶＩに示すこれらのデータは、調べた保存剤は試験した条件下でｕＦＳＨを顕著に凝集させないことを示す。
【０１３８】
【表２】
表ＶＩ 様々な保存剤を含む製剤中のｕＦＳＨの粒度分布

【０１３９】
実施例７
ｕＦＳＨ製剤に関する熱変性の研究
溶媒条件の関数としてのｕＦＳＨ（uFSH-Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin）についての熱変性転移を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によりモニターした。実験は、ＶＰ−ＤＳＣマイクロカロリメーター（MicroCal inc., Northampton, MA; Plotnik, V.V.等，Anal.Biochem.,250:237-244,1997）で、データー獲取についてはVPViewerソフトウエアそしてデーター解析については Origin ＤＳＣソフトウエアを用いて行った。マッチさせた試料セルおよび対照セルをロリポップ（lollipop）の形にし、ワーキング容積０．５ｍｌでタンタルから作った。約１ｍｇ／ｍｌのｕＦＳＨ試料を適当な緩衝液に対して一晩透析し、タンパク質の濃度をＵＶ分光計により測定した。次にタンパク質をＤＳＣ実験のために０．４〜０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。透析物を対照溶液として用いた。試料および対照溶液を５分間脱気した後、充填ファネルを通して２．５ｍｌの針を用いてセル中に入れた。圧力は圧力キャップを用いて約３０ｐｓｉに保った。この研究のすべての実験について、対照セルおよび試料セルの両方において装置は緩衝液を一晩流し、試料実験前の熱履歴を確立した。データをツーステート（two-state）モデルを用いて Origin ＤＳＣソフトウエアで解析した（Sturtevant J.M., Annu.Rev.Phys.Chem., 38:463-488,1987）。異なる溶液条件での遷移温度（Ｔｍ）の中点を表ＶＩＩに要約する。該タンパク質は非常に共同的な遷移を受けｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中でＴｍは７７．３℃である。第１の走査直後の第２の走査における遷移の不存在により示されるように、熱変性は測定の時間スケールにおいて不可逆的である。しかしながら、解離したサブユニットは溶液中でモノマーとして存在し、このモノマーは次に再会合して、何日かのうちに生物学的に活性なダイマーを形成する（データー示さず）。以下に示す濃度での保存剤、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール、メチルパラベンおよびクロロクレゾールの添加の影響は表ＶＩＩに示すようにＴｍに対してごくわずかな効果を示す。
【０１４０】
【表３】
表ＶＩＩ ＤＳＣによりモニターし溶液中でのｕＦＳＨのＴｍに及ぼすｐＨ、塩および保存剤の影響

【０１４１】
実施例８
ｐＨの関数としてのｕＦＳＨの安定性
ＰＢＳ中のｕＦＳＨ（uFSH-Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin）の安定性を様々なｐＨについて測定した。ｐＨの函数としてのヘテロダイマーのパーセントを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりモニターした（表ＶＩＩＩ）。
【０１４２】
【表４】
表ＶＩＩＩ ＳＥＣによりモニターしたｐＨの函数としてのヘテロダイマーのパーセント

【０１４３】
実施例９
ｕＦＳＨの保存および非保存製剤の安定性
ｕＦＳＨ（uFSH-Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin）をＰＢＳ（Dulbecco のＧＩＢＣＯ）中で調製し、更にＰＢＳで濃度約５０μｇ／ｍｌまで希釈した。タンパク質濃度をHewlett Packard Model 8452A ダイオードアレイ分光光度計で測定した。
【０１４４】
ｕＦＳＨ溶液の一部を、重さを測定したｍ−クレゾール試料を含むビーカーに加え、ｍ−クレゾールの最終濃度を約３．１６ｍｇ／ｍｌとした。保存および非保存溶液のアリコートをプラスチックの遠心管中に置き、約２２℃、３７℃および４５℃で２３８日までインキュベートした。様々な時点で、アリコートを平衡化した Superdex−７５ ＨＲ１０／３０カラム（Pharmacia）の中に注入し、常温でＰＢＳ中０．５ｍｌ／分で流した。溶出液を２１４ｎｍでモニターした。ヘテロダイマーの存在は、表ＩＩＩに示すように、ダイマピータとモノマーピークの総面積でダイマーピークの面積割った比から計算した。６４日後、ｍ−クレゾールを含む溶液中のｕＦＳＨ分子の約７９％が３７℃で無傷のダイマーとして残り、５２％以上が４５℃でダイマーとして存在する。驚くべきことに、室温で６３日後に、非保存および保存溶液の両方でｕＦＳＨダイマーの最小の解離があった。２３℃、３７℃、および４５℃において、４、８、１６、２１、２８、２９、４３、６３、６４、１２６、１２７、２３７および２３８日に、非保存及び保存溶液の両方中でｕＦＳＨヘテロダイマーの一般的に比較的小さい解離が存在することは注目すべきである。
【表５】
表ＩＸ 保存および非保存ｕＦＳＨ溶液中でのダイマーの％

【０１４５】
実施例１０
ｕＦＳＨ試料の生物学的活性測定
ｃＡＭＰ感受性のｂ−ラクタマーゼ（ＢＬＡＭ）リポーターベクター（Zlokarnik等、1998、Science、279:84-88）で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ハイグロマイシン選択可能マーカーをコードするヒトＦＳＨ受容体発現ベクターでトランスフェクトした。生き残った細胞を１０μｇ／ｍｌのＦＳＨ（Sigma）で５時間処理し、青の蛍光の最高強度を示すＦＳＨ活性化細胞の集団をＦＡＣＳにより同定し、単離した。このポリクローナルな集団を、エクスパンドさせ、１０μｇ／ｍｌのＦＳＨで５時間処理し、ＦＡＣＳを単一細胞クローンに分類した。２つのクローン細胞系をＢＬＡＭマイクロタイタープレート検定により分析し、６〜８倍の青／緑比の増加を示した。ＢＬＡＭ発現の最大の増加倍数を有するＦＳＨ−Ｒを次のＦＳＨ検定に用いる細胞系として選択した。
【０１４６】
ｃＡＭＰ感受性のＢＬＡＭポーターを有するＦＳＨ受容体細胞系を、ポリ−Ｄ−リジンをコートした９６ウエルの黒壁の組織培養プレート中に、２０，０００細胞／ウエルで、１００μｌの増殖培地（ＤＭＥＭカタログナンバー１１９６５−０９２、１０％ＦＢＳ、５５０μｇ／ｍｌジェンタマイシン）に接種し、５％ＣＯ_２下３７℃で一晩インキュベートした。増殖培地を１００μｌの分析培地（ＤＭＥＭカタログナンバー１１９６５−０９２、０．５％ＦＢＳ、５００μｇ／ｍｌジェンタマイシン）で置き換え、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。その分析培地を除去し、示した濃度のＦＳＨを含む分析培地１００μｌを次に各ウエルに加え、そのプレートを５％ＣＯ_２下、３７℃で５時間インキュベートした。ＤＭＳＯ中の１ｍＭのＣＣＦ２−ＡＭの６μｌ、１ｍｌの２％のＰＥＧ−４００中の６μｌのプルロン酸（０．１％酢酸ＤＭＳＯ中１００μｇ／ｍｌ）および１０％ＥＳＳ（Aurola Biosciences）よりなる、２０μｌのＢＬＡＭ基質ローディングを各ウエルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、緑色（３９５ｎｍ励起／５３０ｎｍ発光）蛍光強度に対する青色（３９５ｎｍ励起／４６０ｎｍ発光）蛍光光度の比をCytofluor（Perseptives Biosystems、シリーズ４０００マルチウエルプレートリーダー）を用いて測定した。ＦＳＨの存在による青／緑の比の倍率の増加を、それぞれの比を対照試料の青／緑比で割ることにより計算した。
【０１４７】
尿のＦＳＨ（uFSH-Vitro Diagnostics-Urofollitropin）のＰＢＳ中の５０μｇ／ｍｌの溶液（試料Ａ）を実施例９のように調製した。この溶液の一部を９０℃で１０分間加熱して、ヘテロダイマーの９９％以上を２つのモノマーに解離させ（ＳＥＣ分析により示される）、このアッセイにおいて負の対照（試料Ｂ）として用いた。ＦＳＨ溶液の他の一部を約３．１５ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾールを含むよう改変した（試料Ｃ）。これら３つの試験試料の生物学的活性を２つの別のプレート上でのＦＳＨ−Ｒ２９３−Ｃｒｅ−ＢＬＡＭ試験で評価した。各プレートにおける３回の分析の平均を表Ｘに示す。このデータはその試験が非常に再現性よく行われることを示す。解離したヘテロダイマーは生活性を失うこと（試料Ｂ）、およびｍ−クレゾールを含む製剤中のＦＳＨ（試料Ｃ）は完全な生物学的活性を保持することも示された。
【表６】
表Ｘ ＦＳＨ受容体生物学的活性における青／緑倍率増加

【０１４８】
実施例１１
保存および非保存ｕＦＳＨ試料の生物学的活性測定
尿のＦＳＨ（uFSH-Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin）試料を実施例１０に記載のようにインビトロ生物学的活性アッセイで測定した。２３℃での１１月後のＰＢＳ中の２つのｕＦＳＨ試料（すなわち、ｍ−クレゾールを有する、及び有しないＰＢＳ中）のインビトロアッセイの結果を表ＸＩで対照と比較した。データは、保存および非保存ｕＦＳＨ試料はこのアッセイで１１月後完全な生物学的活性を維持することを示す。
【０１４９】
【表７】
表ＸＩ 保存および非保存ｕＦＳＨ溶液の２３℃での１１月後のインビトロ生物学的活性

【０１５０】
実施例１２
保存および非保存ｒＦＳＨ変異体のカートリッジ適合性
製剤化したｒＦＳＨ変異体（αサブユニット配列番号５；βサブユニット配列番号１１）溶液のカートリッジとの適合性を試験するために、表１２に示す試料の４ｍｌ溶液を、以下に示すストック溶液から調製した。
ＰＢＳ中の１．８５ｍｇ／ｍｌのｒＦＳＨ変異体
ＰＢ中の１．７３ｍｇ／ｍｌのｒＦＳＨ変異体
ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール
ＰＢ中の２０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール
ＰＢ中の２０％グリセロール
１×ＰＢＳ
【０１５１】
混合後、各溶液１．７ｍｌを個々のカートリッジにピペットで入れ、頭部空間は最小にした。２つのカートリッジを各試料について満たした。キャップでカートリッジを密栓した。そのカートリッジを次に３０℃で２０日間インキュベートした。充填後、試料の残りを対照試料として役立てるための４０℃でインキュベートした。これらの試料のインビトロ活性を、実施例１１に記載の方法を用いて、３０℃での２０日間のインキュベーションの後に測定した。これらの試料の活性を、ゼロ時間での対応する対照試料と比較した。下の表ＸＩＩに示すように、ＰＢＳ中の５０μｇ／ｍｌのｒＦＳＨ試料、ＰＢＳおよび３．１５ｍｇ／ｍｌのクレゾール中の２００μｇ／ｍｌの試料はカートリッジ中で安定である（カートリッジ１およびカートリッジ４）。これ等の試料は３０℃での２０日のインキュベーションの後に完全に活性のままである。しかしながら、ＮａＣｌを含まないリン酸塩緩衝液中の試料はこれらの条件下で力価が小さい。リン酸塩緩衝液および１．６％グリセロール中のｒＦＳＨ試料の活性は対照の活性に比べて減少する（カートリッジ２およびカートリッジ３）
【０１５２】
【表８】
表ＸＩＩ ３０℃で２０日間カートリッジ中でインキュベートした保存および非保存試料のインビトロ活性

【０１５３】
これらの実施例により証明されるように、記載した方法および技術に従い、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の驚くほど安定な組成物および製剤を作り出すことができる。これらの組成物および製剤は今特許請求する製品の開発をもたらす。およそ１９７０以降、製品に印刷された情報は、品物（item）および発明が新規性および進歩性などの法律の他の要件を全体として満足する限り、特許性の判断から、その製品が除外されるものではないと判示している。従来教示されているＦＳＨまたはＦＳＨ変異体の製品は、２４時間またはそれ以上使用のために安定な現在特許請求する製品とは異なって、そのような溶液は即時使用のためにのみ適しており、使用後は中味は捨てなければならないということを明白に教示しているので、本発明の製品は従来技術と区別され、異なる、新規で進歩性のある発明を包含する。
【０１５４】
本発明の原理、好ましい態様および操作様式を明細書で記載した。しかしながら保護されることを意図する発明は、開示した個々の形態に限定されると解釈すべきではない。何故ならそれらは限定ではなく説明とみなすべきであるからである。本発明の精神から逸脱することなく変形や変化が当業者によりなされ得る。
【０１５５】
実施例９
保存および非保存ＦＳＨ変異体試料の製剤安定性
リン酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ，Dulbecco, ＧＩＢＣＯ）中の約１ｍｇ／ｍｌの組換えＦＳＨ変異体（αサブユニット配列番号５；βサブユニット配列番号１１）のストック溶液を、ＰＢＳまたはｍ−クレゾールを含むＰＢＳで５０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌまで希釈し、ｍ−クレゾール濃度を３．１５ｍｇ／ｍｌとした。同様に他の試料の組を保存剤として１０ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを用いて製造した。保存および非保存溶液の１ｍｌアリコートを、プラスチックのエッペンドルフ管中で３月まで、４、２２、３７℃でインキュベートした。様々な時点で、ＰＢＳで平衡化したSuperdex ７５ゲル濾過カラム（Pharmacia）中にアリコートを注入し、常温で、０．０７ｍｌ／分の流速および操作時間３５分で実験した。検出は２１４ｎｍでのＵＶ吸収によりモニターした。ピーク面積を積分し、ヘテロダイマーのパーセントを、ダイマーおよびモノマーピークの全面積に対するヘテロダイマーピーク面積の割合として計算した。表ＩＸに示すように、室温またはそれ以下の温度での３月のインキュベーションの後に、様々な溶液条件下で最小のヘテロダイマーの解離があった。５０％を越えるヘテロダイマーが３７℃での３月のインキュベーションの後に無傷で残る。ヘテロダイマーの安定性は溶液濃度が高いほど大きい。
【０１５６】
【表９】
ＳＥ−ＨＰＬＣでモニターしたｒＦＳＨ変異体のヘテロダイマーの安定性

【配列表】

Claims (10)

1. 水性希釈剤中に、α及びβサブユニットを含むＦＳＨ又はＦＳＨ変異体（該ＦＳＨ変異体はＦＳＨのカルボキシ末端欠失をもつβサブユニットを有する）、並びにｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、およびそれらの混合物よりなる群から選択される保存剤を含み、単一の溶液バイアルの形態であることを特徴とする、ヒト治療用の多数回使用製剤。
2. ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体の濃度が１．０μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、該製剤が更に等張剤および生理学的に受容できる緩衝剤を含む請求項１に記載の製剤。
3. ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体の濃度が５．０μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌであり、等張剤が塩化ナトリウムであり、生理学的に受容できる緩衝剤がリン酸塩緩衝剤である請求項２に記載の製剤。
4. ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体が以下のものよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
   

   

   
5. ＦＳＨ変異体を含む請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
6. 化合物：
   

   

   であるＦＳＨ変異体を含む請求項１〜５のいずれかに記載の製剤。
7. ヒトＦＳＨ：
   

   

   を含む請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
8. 不妊症を処置するための請求項１〜７のいずれかに記載の製剤。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の多数回使用製剤を製造する方法であって、ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体（該ＦＳＨ変異体はＦＳＨのカルボキシ末端欠失をもつβサブユニットを有する）、及びｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、およびそれらの混合物よりなる群から選択される保存剤を水性希釈剤中で混合することを特徴とする方法。
10. 包装材料、および請求項１〜８のいずれかに記載の製剤を含むバイアルからなるヒトの医薬用途の製品であって、該包装材料は、該溶液が２４時間以上の期間にわたって保持され得ることを示すラベルを含む製品。