JP5750471B2 - 組換え体ヒトfshの製造方法 - Google Patents
組換え体ヒトfshの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5750471B2 JP5750471B2 JP2013107676A JP2013107676A JP5750471B2 JP 5750471 B2 JP5750471 B2 JP 5750471B2 JP 2013107676 A JP2013107676 A JP 2013107676A JP 2013107676 A JP2013107676 A JP 2013107676A JP 5750471 B2 JP5750471 B2 JP 5750471B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human fsh
- recombinant human
- fsh
- column chromatography
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
1.組換え体ヒトFSHの製造方法であって,
(a)組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトFSHを培養液中に分泌させるステップと,
(b)該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと,
(c)上記ステップ(b)で得た培養上清を,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,
(d)上記ステップ(c)で回収された該画分を,色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,
(e)上記ステップ(d)で回収された該画分を,疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,
(f)上記ステップ(e)で回収された該画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップとを,
この順で含んでなるものである,製造方法。
2.陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,弱陽イオン交換体である上記1.の製造方法。
3.該弱陽イオン交換体が,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つものである,上記2の製造方法。
4. 該弱陽イオン交換体が,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を備えたものである,上記項2又は3の製造方法。
5.該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素がブルートリアジン色素である上記1ないし4の何れかの製造方法。
アミノ酸・・・3〜700mg/L,
ビタミン類・・・0.001〜50mg/L,
単糖類・・・0.3〜10g/L,
無機塩・・・0.1〜10000mg/L,
微量元素・・・0.001〜0.1mg/L,
ヌクレオシド・・・0.1〜50mg/L,
脂肪酸・・・0.001〜10mg/L,
ビオチン・・・0.01〜1mg/L,
ヒドロコルチゾン・・・0.1〜20μg/L,
インシュリン・・・0.1〜20mg/L,
ビタミンB12・・・0.1〜10mg/L,
プトレッシン・・・0.01〜1mg/L,
ピルビン酸ナトリウム・・・10〜500mg/L,及び
水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により,チミジン,ヒポキサンチン,慣用のpH指示薬および抗生物質を添加してもよい。
Sepharose 6 FF, Fast Flow(GEヘルスケア社)である。
pEF/myc/nucベクター(インビトロジェン社)を,KpnIとNcoIで消化し,EF-1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4
DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo(インビトロジェン社)を,BglIIおよびEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に,T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF-1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して,pE-neoベクターを構築した(図1−1及び図1−2)。
(5'-CTTGAAGCGTGTCAAAGTGG-3';配列番号4)を用いて一次PCR反応を行った。さらに得られたPCR産物を鋳型に,一次反応プラーマーHCG-A-Fよりやや3’側下流の位置の配列を持つプライマーHCGA-ORF-F(5'-GCGAATTCGCCACCATGGATTACTACAGAA-3';配列番号5),および一次反応プラーマーHCG-A-Rよりやや5’側上流の位置の配列を持つプライマーHCGA-ORF-R(5'-GCGAATTCTTAAGATTTGTGATAAT-3'配列番号6)を用いて二次PCR反応を行いヒトFSHα鎖のcDNAを増幅した。また,同様に,ヒト脳下垂体cDNAライブラリー(タカラバイオ)を鋳型にして,1次プラーマーFSH-F(5'-GACCACAGGTGAGTCTTGGC-3';配列番号7)およびFSH-R(5'-TGGTCCTTCAGGACAAGGGT-3';配列番号8)と2次プライマーFSH-F2(5'-GCGAATTCGCCACCATGAAGACACTCCAGT-3';配列番号9)及びFSH-R2(5'- TAAGAATGCGGCCGCCCACTGATCTTTATT-3';配列番号10)を用いて,PCR反応によりヒトFSHβ鎖のcDNAを増幅した。
pBluescriptIISK(-)に挿入した。得られたプラスミドDNAを,EcoRIで消化し,T4
DNAポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に,NotIで消化し,ヒトFSHβ鎖cDNAを切り出した。pE-hygrベクターをXbaIで消化し,T4 DNAポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に,NotIで消化した。このpE-hygrベクターに,ヒトFSHβ鎖cDNAを挿入し,ヒトFSHβ鎖発現用ベクターpE-hygr(FSHβ)とした(図4)。
CHO細胞(CHO-K1:American Type Culture Collectionより購入)に,Lipofectamine2000(lnvitrogen社)を用いて,前記発現用ベクターpE-neo(hCGα)および pE-hygr(FSHβ)を下記の方法でトランスフェクトした。すなわち,予めトランスフェクション前日にコンフルエントに近い細胞密度となるように3.5cm培養皿にCHO-K1細胞を播種し,一晩5%炭酸ガス通気下37℃で培養した。翌日,PBS(-)で2回洗浄した後,血清を含まないD-MEM/F12培地(インビトジェン社)1mLに交換した。Opti-MEM I培地(インビトロジェン社)で20倍に希釈したLipofectamine2000溶液とプラスミドDNA溶液(pE-neo(hCGα)13.2μg/mL /pE-hygr(FSHβ)6.6μg/mL)の等量混液を200μL添加し,37℃5時間トランスフェクションした。
前記種細胞を融解し,2×105個/mLの濃度に希釈して,まずIS CHO-V-GS培地で3日間培養した。次いで,IS CHO-V-GS培地と,L−グルタミンを8mM,ヒポキサンチンを10mg/L,チミジンを4mg/L,G418を0.12mg/mL及びハイグロマイシンBを80mg/L添加したCDoptiCHO(CD)培地(インビトロジェン社)を1:1の比率で混合した培地で細胞濃度を2×105個/mLに希釈して4日間,更にCD培地で細胞濃度を2×105個/mLに希釈し4日間,37℃で5%C02存在の下に静置培養し,拡大培養を行った。
回収した培養上清に,6NHClを添加して,培養上清のpHを5.5に調整し,沈殿物をフィルターろ過して除去した。この培養上清を,カラム体積の4倍量の50mMリン酸ナトリウム/100mM NaCl(pH5.5)溶液で平衡化した,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ陽イオン交換カラムであるCaptoMMCカラム(カラム体積;約10L,ベット高:約20cm)に,150cm/時の線流速で負荷し,吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積の4倍量の50mMリン酸ナトリウム/100mM NaCl(pH5.5)溶液でカラムを洗浄した後,カラム体積の5倍量の50mMリン酸ナトリウム/400mM NaCl(pH6.0)溶液で吸着蛋白質を溶出した。
NaCl(pH8.0)溶液で平衡化した色素カラムであるBlue
sepharose 6FFカラム(カラム体積:約6L,ベット高:約20cm)に,60cm/時の線流速で負荷し,吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積4倍量の50mM Tris-HCl/500mM
KCl(pH8.0)溶液でカラムを洗浄した後,カラム体積5倍量の50 mM
Tris-HCl/2M KCl/0.01%(w/v) Tween80(pH8.0)溶液で吸着蛋白質を溶出した。
NaCl(pH8.0)溶液で平衡化したPhenyl sepharose HPカラム(カラム体積:約6L,ベット高:約20cm)に,60cm/時の線流速で負荷し,吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積4倍量の50mM Tris-HCl,2.5M NaCl(pH8.0)溶液でカラムを洗浄した後,カラム体積5倍量の50mM Tris-HCl,1.6 M NaCl(pH8.0)溶液で吸着蛋白質を溶出した。
上記精製ヒトFSHを非還元・非加熱条件でSDS-PAGE電気泳動をした。ゲルをクマジー染色した結果,分子量約45kDaに単一バンドのみが認められた(図8)。このバンドは抗ヒトFSH抗体を用いたウェスタンブロッティングで染色され,ヒトFSHのものであった(データは示さず)。
3.5〜5.5の間に複数のバンドを認めた(図10)。これは,既報の組換えFSHの等電点電気泳動パターンと同様であった(Loumaye E., Human Reprod. Update 4: 862-881,1998)。
EIA用96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社)の各ウェルに,0.05M NaHCO3溶液で1μg/mLに希釈した抗ヒトFSHαサブユニット抗体(Leinco Technologies社)100μLを添加し室温で2時間以上静置して吸着させた。次いで,各ウェルを,0.05% Tween20を含むPBS(PBS-T)で3回洗浄したのち,各ウェルに,0.5%BSA及び0.05%Tween20を含むPBS(PBS-BT)で適度に希釈した検体またはヒトFSHスタンダード(シグマ社)を,100μL添加して室温で2時間以上静置した。次いで,各ウェルを,PBS-Tで3回洗浄したのち,各ウェルに,PBS-BTで1000倍希釈したPO標識抗ヒトFSHβ鎖抗体(Leinco Technologies社)を100μL添加して室温で2時間以上静置した。次いで,各ウェルを,PBS-Tで3回洗浄したのち,各ウェルに,基質溶液を100μLずつ添加し,室温で酵素反応を行った。上記基質溶液として,0.025Mクエン酸と0.05M Na2HPO4を混合してpH5.0に調整した緩衝液に,オルトフェニレンジアミン(OPD)を0.4mg/mLおよびH2O2を0.008%含むように添加したものを用いた。次いで,各ウェルに,2N H2SO4を100μLずつ添加して反応を停止させた後,各ウェルの492nmにおける吸光度を,96ウェル用プレートリーダーで測定した。
高速液体クロマトグラフィーはLC-20ASystem,SPD-20AV UV/VIS Detector(島津製作所)を用いて実施した。TSKgel Octadecyl-4PW(4.6mm径X150mm長,東ソー社)を,0.1%トリフルオロ酢酸を含む4%アセトニトリル溶液で平衡化した。これにサンプルを負荷し,アセトニトリル濃度を直線的に4%から18%に上昇させて溶出した。検出は214nmの吸光度を測定した。
ヒトFSHの活性測定はラット卵巣重量増加法で行った(Steelman S., Endocrinology 53(6): 604-616, 1953)。体重約45〜65gの雌性SDラット(日本チャールスリバー)を,入荷後3日間飼育して馴化させた。ラットに,試料希釈液を用いて0.2mLに希釈した被験試料又はヒトFSHスタンダードを,1日目の午後,2日目の午前,正午,午後,3日目の午前および午後の計6回皮下投与した。5日目に,ラットの卵巣を摘出し,重量を測定した。ヒトFSHスタンダードには,「First international standard for Follicule Stimulating Hormone,(FSH)
Recombinant,Human for Bioassay ; NIBSC code 92/642 ; WHO 」を用いた。また,試料希釈液は,hCG製剤(10000IU,日本薬局方)3アンプルに,1アンプルにつき添付溶解液2mLを加えて溶解し(5000IU/mL),得られた溶液4.0mLとウシ血清アルブミン3.0gを,適量のリン酸塩緩衝液(pH7.1)に加えて溶解した後,上記緩衝液で全量250mLに調整,これを,0.22μmメンブレンフィルターでろ過して調製した。1群5匹のラットに,希釈倍率を変えた4種類の被験試料を投与し力価の推定を行った後,本試験を行った。本試験は,卵巣質量が95〜105mgになると推定される希釈倍率のものを高濃度群,高濃度群の1.5〜2倍の希釈倍率のものを低濃度群とし,1群10匹で,2−2用量検定法により,ヒトFSHの活性を測定した。
Claims (7)
- 医薬として使用できる組換え体ヒトFSHの製造方法であって,
(a)ヒトFSHα鎖cDNAをEF−1αプロモーター及びその第1イントロンの下流に組み込んでなる発現ベクターと,ヒトFSHβ鎖cDNAをEF−1αプロモーター及びその第1イントロンの下流に組み込んでなる発現ベクターをそれぞれ構築するステップと,
(b)それらの発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトして組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞を作成するステップと,
(c)該細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトFSHを培養液中に分泌させるステップと,
(d)該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと,
(e)上記ステップ(d)で得た培養上清を,50〜250mMの塩を含むpH5〜6.5に調整した緩衝液により平衡化した陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSHを該カラムに結合させ,次いで300〜900mMの塩を含むpH5〜6.5に調整した緩衝液により組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,
(f)上記ステップ(e)で回収された該画分に,最終濃度がそれぞれ0.3%(v/v)及び1%(w/v)となるようにトリ−n−ブチルリン酸及びTween80を添加し,室温で6時間静置して該画分をウイルス不活化するステップと,
(g)上記ステップ(f)でウイルス不活化された画分を,pH7.8〜8.2の緩衝液により平衡化した色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSHを該カラムに吸着させ,次いで1.8〜2.2Mの塩を含むpH7.8〜8.2の緩衝液により組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,
(h)上記ステップ(g)で回収された該画分を,pH7.8〜8.2に調整した緩衝液により平衡化したフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSHを該カラムに吸着させ,次いで1.2〜1.8Mの塩を含むpH7.8〜8.2に調整した緩衝液により組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,
(i)上記ステップ(h)で回収された該画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップとを,
この順で含んでなり,
但し上記ステップ(c)〜(i)において有機溶媒が使用されないものである製造方法であって,
且つ該製造方法により得られる組換え体ヒトFSHが,そのまま医薬として使用できる純度を有し,比活性が14000〜18000IU/mgであるものである製造方法。 - 陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,弱陽イオン交換体である請求項1の製造方法。
- 該弱陽イオン交換体が,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つものである,請求項2の製造方法。
- 該弱陽イオン交換体が,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を備えたものである,請求項2又は3の製造方法。
- 該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素がブルートリアジン色素である請求項1ないし4の何れかの製造方法。
- 該そのまま医薬として使用できる純度が,該組換え体ヒトFSHをRP−HPLC分析したときα鎖のピーク及びβ鎖のピーク以外のピークが面積比で約1%にとどまるものである,請求項1ないし5の何れかの製造方法。
- 該比活性が,ラット卵巣重量増加法により測定されたものである,請求項1ないし6の何れかの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013107676A JP5750471B2 (ja) | 2013-05-22 | 2013-05-22 | 組換え体ヒトfshの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013107676A JP5750471B2 (ja) | 2013-05-22 | 2013-05-22 | 組換え体ヒトfshの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011133752A Division JP2011172602A (ja) | 2011-06-15 | 2011-06-15 | 組換え体ヒトfshの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013153770A JP2013153770A (ja) | 2013-08-15 |
JP5750471B2 true JP5750471B2 (ja) | 2015-07-22 |
Family
ID=49049618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013107676A Expired - Fee Related JP5750471B2 (ja) | 2013-05-22 | 2013-05-22 | 組換え体ヒトfshの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5750471B2 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL346127A1 (en) * | 1998-07-23 | 2002-01-28 | Lilly Co Eli | Fsh and fsh variant formulations, products and methods |
US7741455B2 (en) * | 2004-11-09 | 2010-06-22 | Ares Trading Sa | Method for purifying FSH |
EP2360171A1 (en) * | 2004-12-23 | 2011-08-24 | Novo Nordisk Health Care AG | Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin K-dependent protein of interest |
US8604175B2 (en) * | 2005-12-09 | 2013-12-10 | Ares Trading S.A. | Method for purifying FSH or a FSH mutant |
-
2013
- 2013-05-22 JP JP2013107676A patent/JP5750471B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2013153770A (ja) | 2013-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2009273427A (ja) | 組換え体ヒトfshの製造方法 | |
JP5065391B2 (ja) | ヒトエリスロポエチンの製造方法 | |
AU2010234028B2 (en) | Method for purifying recombinant FSH | |
AU2019203609B2 (en) | Methods of producing long acting CTP-modified growth hormone polypeptides | |
KR101173717B1 (ko) | Fsh를 정제하는 방법 | |
CN102656182B (zh) | 纯化糖蛋白的方法 | |
US20180362610A1 (en) | Long-acting recombinant follicle-stimulating hormone and use thereof | |
CZ20031157A3 (en) | Method of purification of interferon-beta | |
UA78488C2 (en) | Process for cleaning recombinant hcg and pharmaceutical composition | |
JP6231559B2 (ja) | 高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンタンパク質の製造方法及び精製方法 | |
JP5750471B2 (ja) | 組換え体ヒトfshの製造方法 | |
JP2011172602A (ja) | 組換え体ヒトfshの製造方法 | |
CN109563145B (zh) | 长效凝血因子及其制备方法 | |
JP2018508465A (ja) | 長時間作用性ctp修飾成長ホルモンポリペプチドを生成する方法 | |
RU2694598C1 (ru) | Клеточная линия huFSHKKc6 - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и способ получения ФСГ с использованием данной линии | |
JPH1036285A (ja) | 新規な性腺刺激ホルモン及びその製造方法 | |
JPH1036398A (ja) | 性腺刺激ホルモンの製造法 | |
JPH1036399A (ja) | 新規な性腺刺激ホルモン及びその製造法 | |
JP2008266268A (ja) | ネコエリスロポエチンの製造方法。 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130522 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20140430 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140909 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141105 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150512 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150518 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5750471 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |