JPH1036398A - 性腺刺激ホルモンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ｅＣＧα及びβ−サブユニット遺
伝子を導入したほ乳動物培養細胞を用いた新規な製造法
により、原料採取時期や血清ロットに依存しない品質の
安定したｅＣＧを提供すると。 【解決手段】 ヘテロダイマーサブユニットから構成さ
れるウマ性腺刺激ホルモンの各サブユニットをコードす
るＤＮＡを、同一又は別々の発現ベクターに挿入し、該
同一又は別々のベクターで宿主の真核細胞を形質転換
し、該組換え細胞を該性腺刺激ホルモンが発現する条件
で培養し、発現したホルモンを採取することを特徴とす
る糖鎖が結合しかつ生物学的活性を有するウマ性腺刺激
ホルモンの製造法を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウマ絨毛性ゴナド
トロピン（ｅＣＧ）を構成するα及びβ−サブユニット
をコードする遺伝子を組み込んでなる発現ベクターをほ
乳動物細胞などの糖蛋白の製造に適した宿主に導入し、
発現したｅＣＧを培養液から採取することを特徴とす
る、糖鎖が結合しかつゴナドトロピン活性を有する組換
え型ｅＣＧの効率的な製造法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】ｅＣＧは妊馬の尿絨毛膜の細胞が子宮内
膜に侵入してできた内膜杯で合成され絨毛膜から分泌さ
れる性腺刺激ホルモンで、ヒトや動物の受胎促進や過剰
排卵誘起に用いられる。他の性腺刺激ホルモンに比べて
分子量が大きく、腎臓のろ過装置を通過できないため
に、血清中にのみ認められる。ｅＣＧの現行製造法とし
ては、妊馬の血清を原料として、ｅＣＧを分泌している
時期の血清を採取し、エタノール沈殿法などにより分離
精製する方法が一般的に用いられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】妊馬の血清を原料とす
る従来のｅＣＧの製造法では、ウマの生産地域やウマの
繁殖シーズン（４−６月）が限定されるので、原料採取
や入手に制約が大きく、また原料供給自体が減少傾向に
ある。また、ｅＣＧは、ウマ以外の種に卵胞刺激ホルモ
ン（ＦＳＨ）と黄体形成ホルモン（ＬＨ）の両方に特徴
的な応答を引き起こすが、妊娠初期から中期にかけては
両活性比の変動が大きい。そのために、ロット間に活性
比のばらつきが生じ、受胎促進や過剰排卵誘起用に医薬
品として用いる場合には、これが原因となって薬効のば
らつきや副作用が生じる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ｅＣＧのα及
びβサブユニットをコードする遺伝子を組み込んでなる
発現可能な組換えプラスミドをほ乳動物細胞などの宿主
に導入すると、糖鎖が結合しかつ生物活性を有する組換
え型ｅＣＧが効率的に得られるという発見に基づく。ホ
ルモン活性を有するｅＣＧを効率的に製造するために
は、各サブユニットの発現、糖鎖の付加、ヘテロ二量体
の再構成、細胞外への分泌などが協調して行われること
が必要である。一般に、性腺刺激ホルモンは、非共有結
合で結合したα及びβ−サブユニットからなるヘテロ２
量体の糖蛋白ホルモンである。ウマ絨毛性ゴナドトロピ
ン（ｅＣＧ）も同様なヘテロ２量体からなる糖蛋白ホル
モンであり、α−サブユニットはウマ由来の他の性腺刺
激ホルモンと共通であるが、β−サブユニットがホルモ
ン間で異なり、これが生物活性の相違の構造的基礎をな
している。α-サブユニットは９６アミノ酸残基からな
り、５６番目と８２番目のＡｓｎ残基に糖鎖が結合して
いる。一方、β−サブユニットは、１４９アミノ酸残基
からなり、１３番目のＡｓｎ残基に１本、Ｃ末端領域の
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ残基に４〜１０本の糖鎖が結合してい
る。動物細胞などの真核細胞を宿主としてこれに導入可
能な発現ベクターを用いたタンパク質の生産方法が知ら
れている（例えば、Friedman, J. S., et al., Bio/tec
hnology, 7:359-369 (1989).; Mori, T., et al., Gen
e, 108:193-200 (1991).; Kemball-Cook, G., et al.,
Gene, 139:275-279 (1994).）。これらの方法は、蛋白
の生産性が高くかつグリコシル化が可能なので、特に糖
タンパク質の製造法として優れている。しかし、一般
に、タンパク質への糖鎖の結合は非常に複雑な機構によ
って制御されており、発現に用いる宿主細胞の選択はい
うに及ばず、遺伝子の導入・発現時期や培養培地の成分
などの様々な要因によって支配されている。従って、こ
れらの方法がどのようなタンパク質の生産に適している
かを推定することは、現在の技術レベルをもってしても
容易ではない。特に、ｅＣＧは、ほ乳動物の下垂体及び
胎盤由来の糖蛋白の中で最も高度にグリコシル化されて
おり、その分子量の約４５％が糖部分に由来する。ま
た、ウマ以外の種では、ＬＨレセプターだけでなくＦＳ
Ｈレセプターにも結合し、ＦＳＨ及びＬＨ様の両生物活
性を示す。ｅＣＧとウマＬＨのアミノ酸配列は同一であ
り、糖鎖構造の違いが生物活性を規定する典型的な例と
考えられている。このように、ｅＣＧのような性腺刺激
ホルモンでは、糖鎖の結合の有無やその結合様式がその
分泌能、サブユニットの会合、ホルモン活性やその持続
性などに大きく影響するが、このような構造と活性の相
関についての知見は全く蓄積されていないのが現状であ
る。

【０００５】本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ｅ
ＣＧを構成するα及びβサブユニットをコードする遺伝
子を組み込んでなる発現ベクターを、ほ乳動物細胞など
の糖蛋白の製造に適した宿主に導入し、発現したｅＣＧ
を培養液から採取することにより、動物細胞中で付加・
修飾された糖鎖を有するα及びβサブユニットから構成
され、かつ卵胞刺激ホルモン様活性と黄体形成ホルモン
様活性の両方の活性を有する組換え型ｅＣＧを効率的に
製造できることを見いだし、本発明を完成させるに至っ
た。

【０００６】

【発明の実施の形態】ｅＣＧは、αとβの２つのサブユ
ニットからなるヘテロ二量体である。その生産に利用す
るα及びβの各サブユニットをコードする遺伝子は、既
知の配列を利用して一般的な方法、例えば、ＰＣＲやサ
ザンハイブリダイゼーションにより遺伝子ライブラリー
からクローニングすることができる（Fiddes, J. & Goo
dman,H. M., Nature, 281:351-356 (1979).; Godine,
J. E., et al., J. Biol. Chem., 257:8368-8371 (198
2).; Golos, T. G., et al., DNA and Cell Biology, 1
0:367-380 (1991).; Stewart, F., et al., J. Endocri
nol., 115:341-346 (1987).; Sherman, G. B., et al.,
Mol. Endocrinol., 6:951-959 (1992).)。

【０００７】遺伝子ライブラリーは、常法に従って妊馬
の胎盤組織から抽出したｍＲＮＡから逆転写酵素を用い
て作製したｃＤＮＡライブラリーを用いてもよいし、市
販のｃＤＮＡライブラリーを購入して用いてもよい。遺
伝子を効率的に発現させてタンパク質を生産させるため
には、宿主細胞内で機能するプロモーターの支配下に目
的遺伝子を連結すればよい。遺伝子の発現に用いるプロ
モーターは、実質的に細胞内で発現可能なものであれ
ば、特に制約なく用いることができるが、高い生産量を
得るためには、強力な活性を有するプロモーターを利用
することが望ましい。

【０００８】好ましいプロモーターの例としては、サイ
トメガロウィルス主要ＩＥ遺伝子プロモーターやラウス
肉腫ウィルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０Ｅ遺伝子プ
ロモーター、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺
伝子プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ
遺伝子プロモーター、ヒトβ−アクチン遺伝子プロモー
ター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックタン
パク質プロモーター、マウス乳がんウィルスプロモータ
ー、フィブロネクチンプロモーターなどを挙げることが
できる。これらのプロモーターは、それぞれ単独で用い
てもよいし、また異なるプロモーターを２種並べて用い
たり、２種のプロモーターを融合させて用いてもよい。

【０００９】ｅＣＧを生産するために用いる宿主として
は、要は糖鎖が結合しかつゴナドトロピン活性を有する
ｅＣＧを安定に生産する能力を有するものであれば、特
に制約なく用いることができるが、好適な細胞株として
は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、新生
仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウス乳がん細胞（Ｃ
−１２７）、マウス線維芽細胞（Ｌ及びＮＩＨ３Ｔ
３）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＶ−１）、ヒト子
宮頸部がん由来細胞（ＨｅＬａ）、マウス骨髄腫細胞
（Ｓｐ２／０）、ヒトＢリンパ芽球様細胞（Ｎａｍａｌ
ｗａ）、ラット下垂体腫瘍細胞（ＧＨ３）などを挙げる
ことができる。

【００１０】遺伝子の導入に用いるベクターとしては、
目的の遺伝子の発現に必要なプロモーター、エンハンサ
ー、ポリＡシグナル、選択マーカーなどを備えているも
のであれば制約なく用いることができるが、市販のベク
ターをそのままあるいは改良して用いることもできる。
特に好ましいベクターとしては、ｐＣＭＶ（Pharminge
n, USA）、ｐＡＢＷＮ（Niwa, H., et al., Gene, 108:
193-200 (1991).)などを挙げることができる。また、遺
伝子の細胞内への導入法については特に制約はなく、一
般的な方法、例えば、リン酸カルシウムゲル共役沈澱法
やリポソーム法などを用いることができる。

【００１１】導入した遺伝子を増幅することにより、遺
伝子のコピー数を増大させた高発現株を得ることができ
る。一般的には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ)を薬剤増幅マーカーとして、段階的にＤＨＦＲに対
する阻害剤であるメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を増
大させることにより、遺伝子を増幅することができる
が、グルタミンシンテターゼ遺伝子を増幅マーカーとし
て、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）で増幅する方
法や、ウシパピローマウィルスゲノムの６９％からなる
ＤＮＡが細胞中で環状の二本鎖ＤＮＡのエピソームとし
て安定に存在することを利用して、薬剤耐性マーカー遺
伝子（例えば、弱いプロモーター制御下の変異型ネオマ
イシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）とともにベ
クターを導入することにより、宿主染色体へ組み込んで
増幅する方法などを用いることもできる。

【００１２】また、目的物質の生産性を高めるために、
制御遺伝子やがん遺伝子を導入して、プロモーターやエ
ンハンサーを活性化する方法を利用することもできる。
また、α及びβの各サブユニット遺伝子は同一の発現ベ
クター上にコードされていてもよいし、異なる発現ベク
ター上にコードされていてもよい。異なる発現ベクター
に各サブユニット遺伝子がコードされている場合は、両
組換えプラスミドを同時に宿主に導入してもよいし、別
々の細胞に導入後得られた各サブユニットからヘテロダ
イマーを再構成してもよい。

【００１３】培養方法や培養条件には特に制約はなく、
要は宿主細胞が増殖し、導入した遺伝子が発現し、所定
の位置に糖鎖が結合し、かつ生物学的に活性なｅＣＧが
得られればよい。培養するための培地としては、有血清
培地、無血清培地又はそれらを適宜組み合わせて用いる
ことができる。

【００１４】培養液からの単離精製は、ｅＣＧ又は他の
性腺刺激ホルモンの精製に用いる通常の方法を用いるこ
とができる。例えば、硫安沈澱、吸着沈澱、エタノール
沈澱などの沈澱法、ゲルろ過、陰イオン又は陽イオン交
換クロマト、逆相クロマト、疎水クロマトなどの各種ク
ロマト工程を適宜組み合わせて用いることができる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもの
でない。 参考例１．ＰＣＲによるｅＣＧ遺伝子のクローニング １．プライマーの設計と合成 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してｅＣＧ遺伝
子をクローニングするために、反応に用いるプライマー
の遺伝子配列を以下のように設計し、ＤＮＡ Oligo-100
0 synthesizer(Beckman Instruments, Inc., USA）を用
いて化学合成した。ｅＣＧα−サブユニット遺伝子に対
するプライマーは以下のように設計した。ヒト、ラッ
ト、ベンガルザル（Fiddes, J. & Goodman, H. M., Nat
ure, 281:351-356 (1979).; Godine, J. E., et al.,
J. Biol. Chem., 257:8368-8371 (1982).; Golos, T.
G., et al., DNA and Cell Biology, 10:367-380 (199
1).）のプレ−α−サブユニットの遺伝子配列情報を基
に、４残基のシグナル配列を含むｅＣＧα−サブユニッ
トに対するＮ末端側（＋鎖）混合プライマー：５'-ＡＧ
ＧＡＧ（Ｃ／Ａ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡＴＴ（Ｇ／
Ａ）ＣＴＡＣ- ３' （配列番号：３）（開始コドンの９
塩基上流から１２塩基下流）を合成した。また、Ｃ末端
付近の配列情報（Stewart, F., et al., J. Endocrino
l., 115:341-346 (1987).）を基に、Ｃ末端側（−鎖）
プライマー：５'-ＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴ
ＡＡＡＴ- ３' （配列番号：４）（終始コドンの１８塩
基下流から３塩基上流）を合成した。

【００１６】一方、ｅＣＧβ−サブユニット遺伝子に対
しては、既知の配列情報（Sherman,G. B., et al., Mo
l. Endocrinol., 6:951-959 (1992).)を基に、Ｎ末端側
（＋鎖）プライマー：５'-ＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧ
ＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ- ３' （配列番号：５）（開始
コドンの９塩基上流から１５塩基下流）とＣ末端側（−
鎖）プライマー：５'-ＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＴＣ
ＴＴＴＡＴＴＧＧ- ３' （配列番号：６）（終始コドン
の８塩基下流から１５塩基上流）を合成した。

【００１７】２．ウマ胎盤組織からのｍＲＮＡの抽出 妊娠７０日の北海道野生馬（３才）を全身麻酔下で開腹
し、胎盤組織から内膜杯（endometrical cup）を摘出し
た。冷凍庫で凍結保存した後、Sambrookらの方法（Samb
rook, J., et al., Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Press, Cold Spr
ing Harbor. (1989).)に従って内膜杯からＲＮＡを抽出
し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法を用いて精製した。

【００１８】３．ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成は、Ｍ−ＭｕＬＶ（Moloney Murine Leu
kemia Virus)由来の逆転写酵素を利用したFirst-strand
cDNA synthesis kit(Pharmacia LKB Biotechnology, U
ppsala, Sweden）を用いて行った。５μｇのＲＮＡを含
む溶液を６５℃で加熱した後、氷中で急冷した。熱変性
ＲＮＡにｃＤＮＡ反応液１１μｌ、ＤＴＴ１μｌ、Ｍ−
ＭｕＬＶプライマー１μｌを加え、３７℃で１時間保温
した。得られた反応混合物をＰＣＲ増幅にそのまま用い
た。

【００１９】４．ＰＣＲによる遺伝子クローニング ＰＣＲ（Quick Thermo−II、Nippon Genetics 、Tokyo)
による遺伝子断片の増幅は２．５unitのｐｆｕポリメラ
ーゼ（Stratagene, CA, USA)を用いて、変性（９１℃、
１分）、アニール（３７℃、１分）、伸長（７２℃、２
分）のサイクルを３０回繰り返して行った。ＰＣＲで増
幅した各ＤＮＡ断片を、１ｍＭＥＤＴＡを含む４０ｍＭ
Ｔris-酢酸緩衝液を用いたアガロースゲル（１％）電気
泳動で解析した。得られたＤＮＡ断片が、塩基配列から
予想される泳動位置（α−サブユニット遺伝子：３８７
ｂｐ；β−サブユニット遺伝子：５２４ｂｐ）に検出さ
れることを確認した。

【００２０】５．ＰＣＲ断片のサブクローニングと塩基
配列の決定 ＰＣＲ断片をｐＵＣ１１９（宝酒造、京都）のＳmaＩサ
イトに挿入し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（Stratagen
e, CA, USA)に導入した。得られた形質転換体から組換
えプラスミドを抽出し、QIA prep-spin plasmid kit(QI
AGEN, Chatsworth, USA)で精製した。ｅＣＧα及びβ−
サブユニットをコードする組換えプラスミドを、それぞ
れ、ｐＵＣｅＣＧα１及びｐＵＣｅＣＧβ１と命名し
た。各組換えプラスミドの挿入断片の塩基配列をジデオ
キシ・チェイン・ターミネーション法で解析し、所定の
配列を有することを確認した。

【００２１】実施例１．組換え型ｅＣＧ発現ベクターの
構築と導入 １．各サブユニット遺伝子の５’末端へのＸhoＩサイト
の導入 ｅＣＧのα及びβ−サブユニット遺伝子断片の５’末端
にＰＣＲ増幅法により制限酵素ＸhoＩ切断部位を付加し
た。ｐＵＣｅＣＧα１を鋳型として、ＸhoＩサイトと K
ozakサイト（Kozak, M., Cell, 44:283 (1986).)を含む
５’側プライマー（ｅＣＧαＸｈｏ）：５'-ＧＴＡＣＴ
ＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡ-
３' （配列番号：７）とＭ１３逆鎖プライマー：５'-Ｃ
ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ- ３' （配列番号：
８）を用いてαサブユニット遺伝子を増幅し、５’末端
にＸｈｏＩサイトと Kozakサイトを導入した。同様に、
ｐＵＣｅＣＧβ１を鋳型として、ＸhoＩサイトと Kozak
サイトを含む５’側プライマー（ｅＣＧβＸｈｏ）：
５'-ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧ
ＣＴＣＣＡＧ- ３' （配列番号：９）とＭ１３逆鎖プラ
イマー：５'-ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ-
３' （配列番号：８）を用いてβサブユニット遺伝子を
増幅し、５’末端にＸhoＩサイトと Kozakサイトを導入
した。ＰＣＲフラグメントをｐＵＣ１１９のＳmaＩサイ
ト連結した。挿入断片のＰＣＲ増幅で生じたｐＵＣ１１
９ベクターの重複部分をＰstＩで切断し連結することに
より欠失させた。２種類の生成プラスミド（ｐＵＣｅＣ
ＧαＸｈｏ、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏ）の挿入断片を解析
し、ｅＣＧα及びβサブユニットの５’末端にＸhoＩサ
イトが存在することを確認した。

【００２２】２．発現ベクターの構築 ほ乳動物系発現ベクターｐＡＢＷＮ（１１ｋｂ）は、β
−アクチンプロモーターに基づく強力なプロモーター、
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ゲノムの６９％のサ
ブ領域、及び弱いプロモータに支配される変異型ネオマ
イシンホスフォトランスフェラーゼII遺伝子からなり、
ネオマイシンアナログＧ４１８への耐性を付与する（Mi
yazaki, J. I., et al., Gene, 79:269-277 (1989).; N
iwa, H.,et al., Gene, 108:193-200 (1991).）。 ｐ
ＡＢＷＮのＢＰＶフラグメントをＨind III で欠失さ
せ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、ＮotＩリンカ
ーを挿入してｐＡＢ２を作製した。ｐＵＣｅＣＧαＸｈ
ｏからｅＣＧα−サブユニットを含むＸhoＩ／ＳalＩ断
片を切り出し、ｐＡＢ２のＸhoＩサイトに導入してｐＡ
Ｂ２ｅＣＧαを作製した。

【００２３】一方、ｐＡＢＷＮのネオマイシン耐性遺伝
子をＳalＩで欠失させ、ＮotＩリンカーを挿入してｐＡ
Ｂ３を作製した。ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏからｅＣＧβ−
サブユニットを含むＸhoＩ／ＳalＩ断片をｐＡＢ３のＸ
hoＩサイトに挿入してｐＡＢ３ｅＣＧβを作製した。ｐ
ＡＢ２ｅＣＧαとｐＡＢ３ｅＣＧβをＰvuＩとＮotＩで
切断し、ｅＣＧα−サブユニットｃＤＮＡを含む断片
（４．２ｋｂ）とβ−サブユニットｃＤＮＡを含む断片
（１０．２ｋｂ）を結合し、両サブユニットの同時発現
ベクターを作製し、ｐＡＢｅＣＧα／β（１４．４ｋ
ｂ）と命名した。

【００２４】３．組換えプラスミドの細胞への導入 チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ja
panese Cancer Research Resources Bank, Tokyo）は、
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）を補い、１０％
（v/v)ＦＣＳを含むＨam'sＦ１２培地（Gibco BRL, Gai
thersburg, MD, USA）で加湿５％ＣＯ₂インキュベータ
中３７℃で培養した。これらの細胞に、リポフェクトア
ミン法によりｐＡＢｅＣＧα／βを導入した。６×１０
⁵ 個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む４ｍｌ培養液を６０ｍｍ
シャーレに採取し、５０−８０％confluent になるまで
ＣＯ₂ インキュベータ中３７℃で２４時間培養した。感
染の日に６μｇのＤＮＡと３００μｌのＯpti-ＭＥＭＩ
（Gibco BRL, USA）に懸濁した４０μｇのリポフェクト
アミン（Gibco BRL, USA）を１２×７５ｍｍ滅菌試験管
で混合し、室温で３０分反応させＤＮＡ／脂質複合体を
形成させた。この間、細胞を４ｍｌ無血清Ｏｐｔｉ−Ｍ
ＥＭＩ培地で１回洗浄した。複合体を含む各試験管に
１．８ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地を加えて穏やかに
混合し、洗浄した細胞に重層してＣＯ₂ インキュベータ
中で３７℃で５時間培養した。その後、２倍濃度のＦＣ
Ｓを含む２．４ｍｌ生育培地を、感染混合物を除去せず
に加えた。感染２４時間後と７２時間後に、培養液の１
／３０量を新鮮な生育培地に移し継代培養した。

【００２５】４．感染クローンの選択とスクリーニング （１）Ｇ４１８選択 ８００μｇ／ｍｌのネオマイシンアナログＧ４１８（Gi
bco BRL, USA）を含む生育培地で感染後２週間培養する
ことにより、安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞感染体を選択し
た。大きくて生育の良好なコロニーをクローニングシリ
ンダでピックアップし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を
含む生育培地で４週間培養した。 （２）導入細胞のＲＴ−ＰＣＲ解析 得られたプラスミド導入細胞をＲＴ−ＰＣＲで解析し
た。上澄みを除去して細胞を回収し、Chomczynski の抽
出法（Chomczynski, P., Bio Techniques, 15:532-536
(1993).)を用いてtotal ＲＮＡを調製した。

【００２６】５μｇのＲＮＡを用い、逆転写酵素により
ｃＤＮＡを合成し、下記のプライマーを用いてＰＣＲで
増幅した（Min, K. S., et al., J. Reprod. Dev., 40:
301-305(1994).）。αサブユニットに対しては、順鎖プ
ライマー（ｅＣＧαＸｈｏ）：５'-ＧＴＡＣＴＣＧＡＧ
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡ- ３' （配
列番号：７）と逆鎖プライマー（ｅＣＧα）：５'-ＣＡ
ＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴ- ３' （配列
番号：４）を用いた。また、βサブユニットに対して
は、順鎖プライマー（ｅＣＧβＸｈｏ）：５'-ＴＣＧＣ
ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ
- ３' （配列番号：９）と逆鎖プライマー（ｅＣＧ
β）：５'-ＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＡＴ
ＴＧＧ- ３' （配列番号：６）を用いた。ＰＣＲ産物を
アガロースゲル電気泳動で解析し、α及びβサブユニッ
ト遺伝子に対するプライマーによってＤＮＡ断片が増幅
され、所定の分子量を有することを確認した。

【００２７】（３）導入細胞のノーザンブロット解析 次に、２０μｇのＲＮＡを用いてノーザンブロット解析
を行った。ノーザンブロットのプローブとして、ｅＣＧ
αとｅＣＧβ遺伝子のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（それぞれ
０．３８ｋｂと０．５２ｋｂ）を３，０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌの[ α-³²Ｐ] ｄＣＴＰ（New England Nuclear, Bo
ston, MA, USA）でラベルした。２０μｇのＲＮＡを、
５０％ホルムアミドと６.５％ホルムアルデヒドを含む
電気泳動用緩衝液（２０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、
５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、６
５℃で１５分間加熱した。ＲＮＡをホルムアミドを含む
１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜、Ｈybon
d-Ｎ（Amersham, UK）に転写した。

【００２８】５０％ホルムアミド、０．０２％ＳＤＳ、
０．１％ラウロイルサルコシンを含む５×ＳＳＣ中で１
％のブロッキング試薬（Boehringer Mannheim Yamanouc
hi、Tokyo)を用いて４２℃で４時間プレハイブリダイゼ
ーション後、[ α-³² Ｐ] ｄＣＴＰでラベルした各プロ
ーブを用いて一晩４２℃でハイブリダイズした。反応終
了後、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用いて２５℃
で５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用い
て６０℃で２０分間洗浄した（Sambrook, J.,et al., M
olecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed, Col
d Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. (198
9).)。Ｘ線フィルムを−８０℃で２４時間膜に対して密
着させて感光させた。それぞれ所定の位置にハイブリバ
ンドが得られることから、α及びβ−サブユニット遺伝
子が発現していることを確認した。

【００２９】実施例２．組換え型ｅＣＧの生産と解析 １．組換えｅＣＧの生産 安定な細胞（１×１０⁶ 細胞）を７５ｃｍ² 培養フラス
コ中でpreconfluencyまで生育させ、Ｇ４１８を含まず
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）を添加した５ｍｌの無血清ＣＨＯ−Ｓ−
ＳＦＭII培地（Gibco BRL, USA）で１回洗浄した。２０
ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ中３７℃で４８時間培養した
後、培養培地を集め、１００，０００×ｇ、４℃で６０
分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた上澄みを、
膜濃縮装置 Amicon centriplus（Amicon, USA)を用い
て、５，０００ｒｐｍ、４℃、６０分の条件で７倍に濃
縮し、ラジオイムノアッセイとバイオアッセイに供し
た。

【００３０】２．組換え型ｅＣＧのラジオイムノアッセ
イによる定量 得られたｅＣＧをポリクローナル抗体Ａ５４０／Ｒ１Ｈ
（UCB-Bioproducts, SA, USA）を用いたラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）で定量した。２００μｌの０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（０．０１７ＭＮa₂ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ
₂ Ｏ，０．００３ＭＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．９％（w/v)Ｎa
Ｃｌ、０．５％（w/v)ＢＳＡ、０．２％（w/v)Ｎa Ｎ
3)、１００μｌの標準ｅＣＧ（６．２５、１２．５、２
５，５０，１００，２００，４００ｎｇ）又は所定量の
サンプル、１００μｌのウサギ抗ｅＣＧ抗血清（７μｇ
／ｍｌ）とＣloramin Ｔ法（Katayama, Y., et al., J.
Biochem., 108:37-41 (1990).）により¹²⁵Iでラベルし
た１００μｌのｅＣＧ（２０，０００ｃｐｍ／１００μ
ｌ）を各試験管に加えた。４℃で一晩インキュベートし
た後、５００μｌの抗ウサギ沈降抗体を各試験管に加
え、３０分間インキュベートし、２ｍｌのリン酸緩衝液
を加え、３，０００回転で１５分間遠心し、上澄みを吸
引除去し、放射活性をカウントした。得られた結果を妊
馬血清から精製した天然型ｅＣＧと比較したところ、組
換え型ｅＣＧは、用いた抗体に対して天然型ｅＣＧと全
く同様の結合性を示した。また、各アッセイのプロット
から天然型ｅＣＧ換算で組換え型ｅＣＧの濃度を定量し
たところ、約２１０ｎｇ／μｌであった。

【００３１】３．組換えｅＣＧの糖鎖結合の解析 得られたｅＣＧの糖鎖の結合の有無を解析した。０．５
％ＳＤＳ、５０mM２−ＭＥ、５０mM Tris ・ HCl （pH7.
0)の組成のバッファー中に２ｍｇ／ｍｌとなるようにｅ
ＣＧを溶解し、５分間煮沸した。この溶液を１０μｌと
り、５μｌの７．５％界面活性剤ノデニットＰ４０及び
０．３単位のＮ−グリコシダーゼ（Genzyme 、USA)、１
０ミリ単位のＯ−グリコシダーゼ（Genzyme 、USA)、１
０ミリ単位のノイラミニダーゼ（Boehringer Mannheim)
と蒸留水を加えて３０μｌとした。３７℃で１８時間イ
ンキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッ
ファー（×４）（２５０mM Tris ・ HCl(pH6.8)、４０％
（W/V)グリセロール、２０％２−ＭＥ、１０％ＳＤＳ、
０．００５％ＢＰＢ）を加え、反応を停止させた。

【００３２】糖鎖分解処理サンプルを未処理サンプルと
比較して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）で分離し、抗αサブユニット抗体及び抗β
サブユニット抗体を用いたウェスタンブロッティングを
行った。未処理の組換え型ｅＣＧの各サブユニットは、
いずれも、アミノ酸配列より予想される分子量より高分
子側に泳動し、糖鎖分解酵素で処理することにより分子
量が低下し、泳動位置はアミノ酸配列より予想される位
置とほぼ一致した。これより、得られた組換え型ｅＣＧ
のα及びβサブユニットに糖鎖が結合していることを確
認した。

【００３３】実施例３．組み換え型ｅＣＧの生物活性 １．Ｌｅｙｄｉｇ細胞を用いたＬＨ様活性の定量 組換え型ｅＣＧのＬＨ様活性を、ラットＬｅｙｄｉｇ細
胞を用いた in vitro培養系（Dufau, M. L., et al.,
J. Clin. Endocrinol. Metab., 39:610-613 (1974).)で
定量した。４匹の６０日齢ＳpragueＤawley （ＳＤ）ラ
ットからこう丸を摘出し、注意深くdecapsulate した。
細胞を０．２５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼと１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含む１９９培地（Gibco BRL, USA）に懸濁
し、３４℃で３０分間１５０サイクル／分で振とうし
た。

【００３４】tubuleの分散が完了するや否や、試験管を
室温で５分間垂直におき、tubuleフラクションを沈降さ
せた。上澄みをナイロンガーゼで濾過し、６００×ｇで
１４分間遠心し、沈降したinterstitial cell を１９９
培地に再懸濁した。２４ウェルプレートの各ウェルに１
×１０⁶ 個の細胞を含む０．５ｍｌの培地と０．１ｍｌ
の天然ｅＣＧ（２〜１２８ｎｇ）又はＲＩＡで定量した
組換えサンプル（２〜１２８ｎｇ）を加えた。３４℃で
４時間振とうしながらインキュベートした後、２，５０
０ｒｐｍで１０分間遠心し、テストステロンを含む培養
上清を得た。

【００３５】培地中に分泌したテストステロンの濃度
は、塩田らの方法（Shiota, K., et al., Endocrine.
J., 38:541-549 (1991).)に従い、ＲＩＡ法で測定し
た。培養上清を２回ジエチルエーテルで抽出し、１ｍｌ
のアセトンで希釈し、混合物を二つに分割した。それぞ
れを試験管に入れ、５００μｌのアッセイ用緩衝液
（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％（w/
v)ＮａＣｌ、０．０５％（w/v)ＮａＮ₃ 、０．１％（w/
v)ゼラチン）、１５００倍希釈した１００μｌの抗テス
トステロン抗血清と１００μｌの ³Ｈ−テストステロン
（１０，０００ｃｐｍ）を加えた。４℃で一晩インキュ
ベート後、２００μｌの活性炭溶液（０．６２５％（w/
v)Ｎorita Ａ、アッセイ用緩衝液に溶解した０．０６２
５％（w/v)デキストランＴ−７０）を加え、４℃で２０
分間インキュベートした。

【００３６】３，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し
た後、上澄みをバイアルにデカンテーションで移し、そ
れに３ｍｌのシンチレータ（トルエンに溶解した４．２
％（v/v)のＬiquifluor ＴＭ）を加え、放射活性を液体
シンチレータでカウントした。組換えｅＣＧの相対刺激
活性は、テストステロンの分泌を刺激する half-maxima
l の濃度（ＥＤ５０）から求めた。得られた結果を天然
型ｅＣＧと比較して表１に示した。天然型ｅＣＧと同様
に組換え型ｅＣＧも２０−２００ｎｇ／ｍｌの範囲に渡
って比例関係が得られた。

【００３７】

【表１】

【００３８】２．Granulosa 細胞を用いたＦＳＨ様活性
のバイオアッセイ in vitro バイオアッセイは、Dahlらの方法（Dahl, K.
D., et al., Methodsin Enzymology, 168:414-422 (198
9).)に従い、２１〜２２日齢ラット由来のGranulosa 細
胞を用いて行った。ＦＳＨで誘導される細胞中のアロマ
ターゼ活性によって19−ヒドロキシアンドロステンジオ
ンから生成するエストラジオールの量を測定した。約１
０ｍｇのＤＥＳを含むsilastic capsules （10mm）をＳ
Ｄラットに移植し、Granulosa 細胞の増殖を刺激した。
４日後、動物を頚部脱臼で犠牲にし、卵巣を切開し, de
capsulate した。 卵胞を２７ゲージ注射針で穿刺し、
granulosa 細胞を注意深くＭｃＣｏｙ's５ａ培地（Gibc
o BRL, USA）に絞りだした。細胞を８００ｒｐｍで５分
間遠心し、上澄みを除去し、細胞を新鮮な培地で洗浄
し、再度遠心した。

【００３９】細胞を同じ培地に再懸濁し、最終濃度を５
〜８×１０⁴ 生細胞／６０μｌに調整した。４００μｌ
のＧＡＢアッセイ培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１
００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタ
ミン、１μＭアンドロステンジオン、１０^-7ＭＤＥＳ、
３０ｎｇ／ｍｌｈＣＧ、１μｇ／μｌインシュリン、
０．１２５ｍＭＭｉｘ in ＭｃＣｏｙ's５ａ培地）を２
４ウェルプレートの各ウェルに加え、４０μｌのサンプ
ル（２〜６４ｎｇの天然ｅＣＧ又はＲＩＡで定量した組
換え型サンプル）と６０μｌの細胞懸濁液を加えた。細
胞は湿潤９５％エアーと５％ＣＯ₂ 雰囲気下で３日間培
養した。培養終了後、１，０００ｒｐｍで３分間遠心
し、エストラジオールを含む培養上清を得た。

【００４０】培地中に放出されたエストラジオール濃度
はテストステロンと同様ＲＩＡ法で測定した。すなわ
ち、培地を２回ジエチルエーテルで抽出し、１ｍｌのア
セトンで希釈し、混合物を二つに分割した。それぞれを
試験管に入れ、５００μｌのアッセイ用緩衝液（０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％（w/v)ＮａＣ
ｌ、０．０５％（w/v)ＮａＮ₃ 、０．１％（w/v)ゼラチ
ン）、４，５００倍希釈した１００μｌの抗エストラジ
オール抗血清と１００μｌの ³Ｈ−エストラジオール
（１０，０００ｃｐｍ）を加えた。４℃で一晩インキュ
ベート後、２００μｌの活性炭溶液（０．６２５％（w/
v)Ｎorita Ａ、アッセイ用緩衝液に溶解した０．０６２
５％（w/v)デキストランＴ−７０）を加え、４℃で２０
分間インキュベートした。

【００４１】３，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し
た後、上澄みをバイアルにデカンテーションで移し、そ
れに３ｍｌのシンチレータ（トルエンに溶解した４．２
％（v/v)Ｌiquifluor ＴＭ）を加え、放射活性を液体シ
ンチレータでカウントした。組換えｅＣＧの相対刺激活
性は、エストラジオールの分泌を刺激する half-maxima
l の濃度（ＥＤ５０）から求めた。得られた結果を天然
型ｅＣＧと比較して表２に示した。培地に添加したｅＣ
Ｇ濃度に依存してエストラジオール濃度が増加した。

【００４２】

【表２】

【００４３】実施例４．ｅＣＧの生物活性のロット間の
比較 ｅＣＧのα及びβサブユニットをコードする遺伝子を組
み込んだ発現ベクターを有する組換え体を実施例２記載
の方法に従い培養し、開始４８時間後の培養液を回収し
た。この操作を反復することにより、培養上清中に分泌
された組換えｅＣＧを含む異なるロットの培養液を得
た。一方、採取時期の異なる数種類の妊馬血清を入手
し、各血清に関して１：１に純水で希釈して、１，００
０ｍｌ当たり６０ｇの安息香酸サトリウムを添加して吸
着沈澱後、５４０ｍｌ当たり５００ｍｌのエタノールを
添加し、生成した沈澱を除去することにより部分精製し
た。各サンプル中のｅＣＧの含量を実施例２記載のラジ
オイムノアッセイ法で定量した後、実施例３記載の方法
に従って、各サンプルのＦＳＨ及びＬＨ活性を測定し
た。測定に用いたｅＣＧ４０ｎｇ／ｍｌ当たりのエスト
ラジオール及びテストステロンの放出量、両者の比率を
求め、その結果を表３に示した。

【００４４】

【表３】

【００４５】

【発明の効果】ｅＣＧα及びβ−サブユニット遺伝子を
導入したほ乳動物培養細胞を用いた新規な製造法によ
り、原料採取時期や血清ロットに依存しない品質の安定
したｅＣＧを得ることができた。

【００４６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：記載せず トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ 起源： ・生物名：ウマ（Ｅｑｕｉｄｅａ） ・組織の種類：胎盤 直接の起源： ・ライブラリー名：ｃＤＮＡ ・クローン名：ＣＨＯ−Ｋ１（ｐＡＢｅＣＧα／β） 配列の特徴： ・特徴を表す記号：sig peptide ・存在位置：-24..-1 ・特徴を決定した方法：Ｅ Met Asp Tyr Tyr Arg Lys His Ala Ala Val Ile Leu Ala Thr Leu Ser -24 -20 -15 -10 Val Phe Leu His Ile Leu His Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr -5 1 5 Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys 10 15 20 Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala 25 30 35 40 Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Arg Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn 45 50 55 Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val 60 65 70 Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu Glu Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys 75 80 85 Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile 90 95

【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：１６９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：記載せず トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ 起源： ・生物名：ウマ（Ｅｑｕｉｄｅａ） ・組織の種類：胎盤 直接の起源： ・ライブラリー名：ｃＤＮＡ ・クローン名：ＣＨＯ−Ｋ１（ｐＡＢｅＣＧα／β） 配列の特徴： ・特徴を表す記号：sig peptide ・存在位置：-20..-1 ・特徴を決定した方法：Ｅ Met Glu Thr Leu Gln Gly Leu Leu Leu Trp Met Leu Leu Ser Val Gly -20 -15 -10 -5 Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile 1 5 10 Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Ile Cys Ile Thr 15 20 25 Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val 30 35 40 Met Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ile Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg 45 50 55 60 Glu Leu Arg Phe Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val 65 70 75 Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro 80 85 90 Cys Gln Ile Lys Thr Thr Asp Cys Gly Val Phe Arg Asp Gln Pro Leu 95 100 105 Ala Cys Ala Pro Gln Ala Ser Ser Ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gln 110 115 120 Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser 125 130 135 140 Ser His Pro Leu Pro Ile Lys Thr Ser 145 149

【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGAGMGCYA TGGATTRCTA C

【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACTTGGTGA AACCTTTAAA T

【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCACCGAGGA TGGAGACGCT CCAG

【００５１】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTAGTTCAAG AAGTCTTTAT TGG

【００５２】配列番号：７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTACTCGAGC CACCATGGAT TACTACAGA

【００５３】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC

【００５４】配列番号：９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGCTCGAGC CACCATGGAG ACGCTCCAG

【図面の簡単な説明】

【図１】α及びβサブユニット遺伝子のサブクローニン
グによるｐＵＣｅＣＧα１及びｐＵＣｅＣＧβ１の構築
を示す図である。

【図２】各サブユニット遺伝子の５’末端へのＸｈｏＩ
サイトの導入によるｐＵＣｅＣＧαＸｈｏ及びｐＵＣｅ
ＣＧβＸｈｏの構築を示す図である。

【図３】ｐＡＢ２ｅＣＧαの構築を示す図である。

【図４】ｐＡＢ３ｅＣＧβの構築を示す図である。

【図５】発現転移ベクターｐＡＢｅＣＧα／βの構築を
示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物細胞中で付加・修飾された糖鎖を有
   するαサブユニット及びβサブユニットから構成される
   性腺刺激ホルモンが、卵胞刺激ホルモン様活性と黄体形
   成ホルモン様活性を有することを特徴とするウマ性腺刺
   激ホルモン。
2. 【請求項２】 αサブユニットが配列表の配列番号１記
   載のアミノ酸番号１〜９６のアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする請求項１記載のウマ性腺刺激ホルモン。
3. 【請求項３】 βサブユニットが配列表の配列番号２記
   載のアミノ酸番号１〜１４９のアミノ酸配列を有するこ
   とを特徴とする請求項１記載のウマ性腺刺激ホルモン。
4. 【請求項４】 ヘテロダイマーサブユニットから構成さ
   れるウマ性腺刺激ホルモンの各サブユニットをコードす
   るＤＮＡを、同一又は別々の発現ベクターに挿入し、該
   同一又は別々のベクターで宿主の真核細胞を形質転換
   し、該組換え細胞を該性腺刺激ホルモンが発現する条件
   で培養し、発現したホルモンを採取することを特徴とす
   る、請求項１記載の糖鎖が結合しかつ生物学的活性を有
   するウマ性腺刺激ホルモンの製造法。
5. 【請求項５】 αサブユニットをコードするＤＮＡが配
   列表の配列番号１記載の分泌に必要なリーダー配列を含
   むアミノ酸番号−２４〜９６のアミノ酸配列をコードす
   るＤＮＡであることを特徴とする請求項４記載のウマ性
   腺刺激ホルモンの製造法。
6. 【請求項６】 βサブユニットをコードするＤＮＡが配
   列表の配列番号２記載の分泌に必要なリーダー配列を含
   むアミノ酸番号−２０〜１４９のアミノ酸配列をコード
   するＤＮＡであることを特徴とする請求項４記載のウマ
   性腺刺激ホルモンの製造法。
7. 【請求項７】 発現ベクターがαサブユニットをコード
   する請求項５記載のＤＮＡとβサブユニットをコードす
   る請求項６記載のＤＮＡを同時に組み込んでなる自律複
   製可能な発現ベクターであることを特徴とする請求項４
   記載のウマ性腺刺激ホルモンの製造法。
8. 【請求項８】 宿主がほ乳動物由来の培養可能な細胞で
   あることを特徴とする請求項４記載のウマ性腺刺激ホル
   モンの製造法。
9. 【請求項９】 前記ほ乳動物細胞由来の培養可能な細胞
   がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項４記載
   のウマ性腺刺激ホルモンの製造法。