WO2020172728A1 - Gonadotrofina coriônica equina recombinante (recg) biologicamente ativa e processo para obtenção da mesma, composição veterinária e uso - Google Patents
Gonadotrofina coriônica equina recombinante (recg) biologicamente ativa e processo para obtenção da mesma, composição veterinária e uso Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to an improved process for the production of biologically active recombinant equine chorionic gonadotrophin, referred to herein as reCG or reCGa + b, to the reCG produced by the process of the present invention, to a veterinary composition comprising reCG, and the use of reCG or the composition comprising reCG.
- the reCG produced has a glycosylation profile similar to that of commercially available chorionic gonadotropins, and exhibits an in vivo activity level similar to that of luteinizing hormone (LH, acronym in English for Luteinizing Hormone) and follicle stimulating hormone (FSH, acronym in English for Follicle Stimulating Hormone).
- LH luteinizing hormone
- FSH follicle stimulating hormone
- the present invention has application in the field of biotechnology, more specifically, in the field of veterinary assisted reproduction, being especially suitable to be used in the treatment of veterinary conditions related to the reproduction and ovulation of mammals, for the manufacture of diagnostic kits or as a supplement for cell culture.
- eCG is especially used in beef cows raised in extensive management, and has also been used in superovulatory treatments of cows and heifers as an effective treatment option in irascible animals (MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle Reprod Nutr Dev 2002; 42 (6): 601 -1 1), since conventional hormonal treatments in cattle use the use of eight doses of purified commercial preparations of porcine FSH - Folltropin-V ® , Bioniche ® ( data obtained in the product insert).
- eCG is secreted by the equine uterus, more specifically by the endometrial chalices, which are formed around the forty-fifth day of gestation, remaining until around the eighty-fifth day.
- the secretion of this hormone which has a biological action similar to both FSH and LH, stimulates the development of ovarian follicles in the pregnant mare. Some of these follicles ovulate, but most become luteinized follicles due to the action similar to LH.
- Such accessory luteal bodies produce the progesterone necessary to maintain pregnancy in the mare (HAFEZ AND HAFEZ, Animal Reproduction. Editora Manole 2004; single volume).
- the eCG currently used for animal reproduction is purified from the plasma of pregnant mares (CHRISTAKOS E BAHL, Pregnant mare serum gonadotropin. Purification and physicochemical, biological, and immunological characterization. J Biol Chem 1979; 254 (10): 4253-61; MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nutr Dev 2002; 42 (6): 601 -1 1), being marketed as Folligon (Intervet); SincroeCG (Ourofino) and Novormon (Coopers), there is no commercially available recombinant eCG.
- CHRISTAKOS E BAHL Pregnant mare serum gonadotropin. Purification and physicochemical, biological, and immunological characterization. J Biol Chem 1979; 254 (10): 4253-61; MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nutr Dev 2002; 42 (6): 601 -1 1)
- This unique gonadotropin has the ability, in heterologous species, to bind to both FSFI and LH receptors, and to stimulate folliculogenesis stimulation (STEWART et al., Pregnant mare serum gonadotrophin: ratio of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone activities measured by radioreceptor assay. J Endocrinol 1976; 71 (3): 471 -82; COMBARNOUS, Original hypothesis on the specificity of the binding of glycoprotein hormones to their receptors. CR Seances Acad Sei III 1981).
- the recombinant gonadotropins have maximum biosafety, better performance in the results, no interference from other hormones and few contaminants, being, therefore, widely used in human reproductive medicine, representing great interest for veterinary assisted reproduction.
- Recombinant technology has proved that it is possible to produce complex proteins in a reproducible way.
- the structure of gonadotropins is difficult to reproduce, because, in addition to being composed of two transcribed chains and translated independently, there are also several post-translational modifications, particularly glycosylation, which in the case of eCG has a role fundamental in its biological activity (LOUMAGEL et al., Human follicle-stimulating hormone produced by recombinant DNA technology: a rewiew for clinicians.
- glycosylation process associated with the production of glycoproteins consists of adding carbohydrates to the polypeptide chains, which is a post-translational event that results in the addition of sugar chains to specific amino acid residues of asparagine (N-linked glycosylation) or serine / threonine (O-linked glycosylation) in a given polypeptide sequence.
- N-linked glycosylation N-linked glycosylation
- serine / threonine O-linked glycosylation
- the glycosylation process is the product of a complex sequence of enzymatic reactions that add, cleave and modify the carbohydrate portion of a glycoprotein. Anticipating the result of the coordinated action of these enzymes that participate in the glycosylation process is not an intuitive or direct activity, being very difficult to predict the glycosylation profiles that can be obtained from a certain cell type, or even the impact that profile fluctuations of gene expression or manipulations in the culture regimes may have on the final glycosylation profile (Al-Rubeai, Cell Engineering. Springer 2009; pg. 247-279). Therefore, several cell lines commonly used for heterologous production of proteins of therapeutic interest have varying capacities to promote glycosylation of glycoproteins.
- glycoprotein produced by a given genetically engineered cell line may have a different glycan structure than that presented by the natural glycoprotein, encoded by the expression vector.
- Polysaccharide chains modulate the biological activity of glycoproteins in several ways, promoting, for example: a) the decrease in plasma clearance and the consequent increase in half-life, b) mediation of molecular recognition processes; c) stabilization of the conformation of the polypeptide chain; and d) protection against proteolytic degradation (Al-Rubeai, Cell Engineering. Springer 2009; pages 247-279).
- eCG is a heterodimeric glycoprotein, composed of two polypeptide subunits, the a and b chains.
- the luteinizing hormone (eLH) and eCG have identical polypeptide chains, and it is the divergence regarding the structure of N- and O-glycans that determines the difference between the molecular weights and the biological activity of these two hormones: eCG an exceptional circulatory half-life compared to eLH (BOUSFIELD et al., Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin beta and equine luteinizing hormone ss by solid-phase Edman degradation.
- the carbohydrate chains of the two hormones, eLH and eCG exhibit differences in their structures: a the a subunit of eLH has two biantenary N-glycans finalized in sulfated N-acetylgalactosamines (S04-4-GalNAc), while the N-glycans attached to the a subunit of eCG are finalized in sialic acid at the a2,3 and a2,6 bonds (DAMM et al., Structure determination of the major N- and O-linked carbohydrate chains of the beta subunit from equine chorionic gonadotropin. Eur J Biochem.
- Both b subunits have up to 12 O-glycans extended with sialylated poly N-acetyl-lactosamine (a2,3) located in the terminal carboxy-peptide (CTP) serine or threonines of 28 amino acid residues (HOKKE et al., Structure determination of the disialylated poly- (N- acetyllactosamine) -containing O-linked carbohydrate chains of equine chorionic gonadotropin. Glycoconj J.
- equine chorionic gonadotropin mainly an artificial variant of reCG, consisting of a fusion protein between the b and b chains, which has been cloned and expressed in insect cells (LEGARDINIER et al. , Biological activities of recombinant equine luteinizing hormone / chorionic gonadotropin (eLFI / CG) expressed in Sf9 and Mimic insect cell lines.
- HESSER HESSER
- HESSER A survey of heterologous expression systems for the production of bovine follicle stimulating hormone and luteinizing hormone. All Dissertations 2011; Paper 692
- gonadotropins more specifically, follicle-stimulating hormones in CHO cells.
- FURUHASHI et al. Fusing the carboxyterminal peptide of the chorionic gonadotropin (CG) betasubunit to the common alphasubunit: retention of Olinked glycosylation and enhanced in vivo bioactivity of chimeric human CG.
- Mol Endocrinol. 1995 Jan; 9 (1): 5463 describes a hCG analog with a CTP-like polypeptide tail (English acronym for Carboxy Terminal Peptide), and relates the importance of glycosylation to the analog's biological activity.
- SUGAHARA et al. (SUGAHARA et al., Biosynthesis of a biological active single peptide Chain containing the human common a and chorionic gonadotropin b subunits in tandem. Proc Natl Acad Sei USA 1995; 92: 2041 - 2045) describes the biological activity of a single polypeptide chain with biological activity, containing a b subunit of hCG fused to a subunit a of gonadotrophins. [0022] Subsequently, SUGAHARA et al.
- NARAYAN et al. (NARAYAN et al., Functional expression of yoked human chorionic gonadotropin in baculovirus-infected insect cells. Mol Endocrinol. 1995; 9 (12): 1720-6) describes the simultaneous expression of the a and b subunits of eCG in insect cells, whose expression it is controlled by different promoters, in the same recombinant baculovirus, giving rise to proteins that are biologically active only in vitro.
- SFIIOTA et al. (SFIIOTA et al., Production of recombinant eCG with potent FSH-like activity by site-directed mutagenesis. Nippon Yakurigaku Zasshi 1997; 1 10 (1): 59P-62P) describes recombinant gonadotropins with different structures in view of the coupled oligosaccharides, and relates the biological activity of the mutants or variants.
- EP0974599 describes a variant of recombinant eCG and its corresponding DNA sequence, in addition to a pharmaceutical composition of said recombinant eCG for use as a veterinary drug.
- the variant form of the revealed recombinant eCG has the eCG a and b chains fused into a single polypeptide chain, having FSFI and LH type activity only in vitro.
- the inventors suggest its use as a medicine for animals, but do not demonstrate: a) the similarity between the glycosylation profile of the obtained recombinant form and that of the wild form; and b) the in vivo biological activity of the obtained recombinant eCG form.
- US 5,767,251 describes methods for generating recombinant human gonadotropins, including hCG, hLH and hFSFI, in which hormones composed of two different subunits are synthesized in the same cell by at least one expression vector, in which the expression of each subunit is controlled by a different promoter.
- hCG human gonadotropin
- hLH human gonadotropin
- hFSFI human gonadotropins
- the biological activity of hCG is easily differentiated from the activity of LH, because, unlike what occurs in horses, in humans, the b chains of these two gonadotropins are encoded by distinct genes.
- US 5,047,335 describes a process for controlling the glycosylation of recombinant proteins involving the use of genetically modified CHO cells to produce sialyltransferases, a class of glycosyltransferases. This additional production of sialyltransferases allows, for example, that recombinant glycoproteins, produced in this genetically modified CHO cell line, have a glycan structure closer to natural human glycoproteins.
- US 5,047,335 does not describe what combination of glycosyltransferases would be required to obtain recombinant eCG with biological activity.
- US 6,103,501, US 6,238,890 and US 6,987,172 describe artificial single-chain variants of gonadotropins that are naturally found in the form of heterodimers, such as CG, TSH, LH and FSH, and that can provide effects or functions, or can behave as agonists or antagonists of native hormones. Also in this case, the biological activity of human GC is easily differentiated from that of human LH, because, unlike what occurs in horses, in humans the b chains of these two gonadotropins are encoded by distinct genes. In addition, these documents do not describe what conditions would be necessary to obtain the recombinant eCG with biological activity.
- US 2010/120677 describes methods for the production of biologically active recombinant eFSH analogs and methods to improve reproduction in mammals using recombinant eFSH analogs.
- CA 2183564 describes methods to increase fertility by reducing the activity or levels of hormones with LH activity, and methods for selecting antibodies to specific portions of certain proteins, including LH and hCG, to reduce their biological activity .
- WO2016178087A1 describes methods for producing unmodified forms of eCG, or variants of eCG fused to the Fc portion (English acronym for “Fragment crystallizable region”) in the milk of transgenic animals, but fails to demonstrate biological activity in vivo of the forms of eCG produced.
- heterologous expression system based on mammalian cells is capable of promoting the post-translational modifications of the N-linked and O-linked glycosylation in large quantities of the recombinant eCG, necessary to differentiate the biological activity of the eCG that of eLH.
- the wild form of eCG is produced by a differentiated and highly specialized cell type, the cells of the endometrial chalices, and yet, at a very particular moment in the life of these animals, between the forty and eighty-fifth days of gestation .
- the details of the molecular events associated with the promotion of post-translational modifications of the eCG, particularly the glycosylation process, which are essential for its biological activity, are unknown.
- the present invention relates to an improved process for the production of a biologically active recombinant equine chorionic gonadotropin, in which the polypeptide chains a and b are produced in the same cell, and that said reCG presents a glycosylation profile similar to that of the commercially chorionic gonadotropins available.
- Said improved process is based on the process described in document PCT / BR2015 / 050047 of the same depositor.
- the Depositor found that, through the use of widespread techniques of molecular and cellular biology, coupled with the use of appropriate phenotypic selection strategies, it is possible select sub-phenotypes of cultured cell lines associated with obtaining a glycosylation profile similar to that found in wild eCG, thus ensuring that the recombinant eCG thus obtained has biological activities in vivo similar to the hormones FSH and LH.
- the reCG obtained by the improved process can be completely glycosylated, characterized by containing chains of N- and O-linked glycans containing a high content of terminal sialylation of the galactose residues, or, still, partially glycosylated, containing the disaccharide unit Gal - (1 -4) GlcNAc as an N-bound and / or O-bound terminal residue, or even the monosaccharide unit GlcNAc as an O-bound terminal residue.
- a recombinant equine chorionic gonadotrophin is produced, produced from the improved process of the present invention, said reCG produced from cDNA strands containing the coding sequences of the a and b strands separately and that said polypeptide chains a and b of reCG are completely or partially glycosylated.
- the present invention relates to a veterinary composition
- a veterinary composition comprising:
- the present invention relates to the use of the reCG of the invention or the composition of the invention, comprising said reCG, in the manufacture of a medicament for the treatment of medical conditions related to the reproduction and ovulation of mammalian animals, as an optimizing agent for in vitro fertilization; in the manufacture of kits for diagnosing veterinary conditions and protocols related to mammal ovulation; and in the manufacture of supplements for cell cultivation.
- Figure 1 illustrates the reCG a-chain coding sequence, along with the corresponding polypeptide sequence.
- the nucleotide and polypeptide sequences are represented, in which the amino acids are represented using the single letter code, from the alpha chain of reCG, and which correspond to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, respectively.
- Figure 2 illustrates the reCG b-chain coding sequence, along with the corresponding polypeptide sequence.
- the nucleotide and polypeptide sequences are represented, in which the amino acids are represented using the single letter code, from the beta chain of reCG, and which correspond to SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, respectively.
- Figure 3 illustrates the expression vector of the reCG chain a
- Figure 4 illustrates the reCG b-chain expression vector
- Figure 5 illustrates the reCG productivity after 96h of cultivation of the original mixed population CFIO-DG44 cGMP pcDNA 3.3 ⁇ eCG + pNU1 -aeCG and the enriched populations derived from this strategy.
- CFIO-EYFP negative control
- the normalized concentration of reCG in the culture media evaluated is expressed in IU / mL per million viable cells.
- Figure 6 illustrates the reCG productivity, determined by specific ELISA, in the conditions conditioned by enriched cell populations, which were generated during the second selection step with 30nM MTX and 750pg / mL of Geneticin (G418).
- the normalized concentration of reCG in the culture media evaluated is expressed in IU / mL per million viable cells.
- Figure 7 illustrates the productivity of reCG after 96h of cultivation of isolated clones by limiting dilution from enriched populations CHO-DG44 cGMP E9 30/750 (pcDNA3.3 ⁇ eCG + pNU1 -aeCG) and CHO-DG44 cGMP F9 30/750 (pcDNA3.3 ⁇ eCG + pNU1 -aeCG).
- the normalized concentration of reCG in the culture media evaluated is expressed in IU / mL per million viable cells.
- Figure 8 illustrates the structural characterization of the reCGa + b heterodimer using the Western Blot technique.
- Figure 9 illustrates the typical electrophoretic profile obtained from purified reCGa + b, observed after fractionation by electrophoresis in 12% non-denaturing polyacrylamide gel, followed by silver staining.
- Figure 10 illustrates the glycosylation profile obtained for the recombinant protein expressed by clone D3 (pcDNA3.3 ⁇ eCG + pNU1 -aeCG).
- Figures 1 1, 12 and 13 illustrate the functional in vivo evaluation in rats of reCGa + b, carried out by obtaining the profiles of the ovarian and uterine responses (organ weight) against the stimulus with different doses of reCGa + B.
- Figure 14 illustrates the functional in vivo evaluation in cows of reCGa + b, performed from obtaining the profile of ovarian response (follicle over-stimulation rate) against the stimulus with different doses of reCGa + b.
- SEQ ID NO: 1 illustrates a nucleotide sequence encoding eCG a chain.
- SEQ ID NO: 2 illustrates a nucleotide sequence encoding the eCG b-chain.
- SEQ ID NO: 3 illustrates an eCG a-chain protein sequence.
- SEQ ID NO: 4 illustrates an eCG b-chain protein sequence.
- the present invention deals with an improved process of producing a recombinant equine chorionic gonadotropin (reCG), in which polypeptide chains a and b are produced in the same cell and are completely or partially glycosylated.
- Said recombinant equine chorionic gonadotropin has a glycosylation profile similar to that of natural equine chorionic gonadotropin and has in vivo activity of the hormones FSFI and LH.
- said process comprises the steps of:
- the primers used for amplifying the cDNA sequences encoding the eCG a and b chains were designed from the complete coding sequences of each eCG subunit contained in the NCBI database (http: //www.ncbi.nlm.nih .gov; National Center for Biotechnology Information, US NLM - US National Library of Medicine, Bethesda, USA (NM_access number a: 001099763.1, b: 001490342.2) .There was no use of a computer program for the design of oligonucleotides.
- the amplification of the coding chains can be performed using the RT-PCR technique (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) and the products obtained are separated and purified by techniques usually known and used in the state of the art.
- the obtained amplicons are detected by agarose gel electrophoresis, isolated and purified using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healtcare, Carlsbad, CA, USA).
- the coding sequences for the a or b subunits of eCG were subcloned into the pNU1 and pcDNA 3.3 vectors, respectively.
- the vectors pNU1 -aeCG and pcDNA3.3-peCG were used, respectively, and primers were used that line up with the expression vectors pcDNA 3.3 and pNU-1, and also to aeCG and peCG inserts.
- the consensus sequences were assembled from the individual sequences obtained.
- the consensus sequences were analyzed in the BLASTn program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, Basic Local Alignment Search Tool ® , NCBI, US NLM), to verify their similarity with the consensus sequences of aeCG and peCG from Equus caballus, deposited in the NCBI database (NM_001 197093.1).
- the consensus nucleotide sequences encoding the aeCG and peCG chains are described as SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2, respectively.
- the nucleotide and polypeptide sequences of the aeCG and peCG chains can be seen in Figures 1 and 2, respectively.
- polypeptide sequences of the aeCG and peCG chains are described as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
- the coding regions obtained for the aeCG and peCG chains can be cloned into any plasmid vector that contains one or more strong promoters, including the chicken b-actin promoter and the cytomegalovirus promoter, multiple bacterial cloning site (MCS , acronym in English for Multiple Cloning Site), antibiotic resistance sequence for bacterial cloning, recombination sites, and the cDNA encoding the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) downstream of an internal ribosomal entry site (IRES- International ribosomal entry site).
- the expression plasmid vector suitable for the invention is the vector pNU-1, constructed by the depositor itself.
- other expression vectors, containing similar functional elements can be used, such as, for example, the pcDNA 3.3 vector, or other vectors of the pcDNA family.
- the vector pNU1 is derived from the vector pUC18 (MESSING AND VIEIRA, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 1982 Oct; 19 (3): 259-68), and has an MCS cloning cassette containing several sites for restriction enzymes, the coding DNA sequences inserted in the MCS are functionally linked and under the control of a hybrid promoter containing a cytomegalovirus enhancer element and a chicken b-actin promoter, as well as the cDNA encoding the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) downstream of an internal site for ribosome entry.
- MESSING AND VIEIRA The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 1982 Oct; 19 (3): 259-68
- MCS cloning cassette containing several sites for restriction enzymes, the coding
- This structure allows the concomitant expression of the cloned insert in the MCS, in this case aeCG, or peCG, and of DHFR, aiming at the gene complementation of double negative CHO cells for the DHFR gene, which, in turn, allows the selection of cells expressing high amounts of the product of interest after gene amplification, carried out through treatment with increasing doses of DHFR inhibitors.
- plasmidial expression vectors in the cell of interest can be performed by several techniques usually employed in the prior art. Among them, several types of transfection, for example, through cationic molecules, calcium-mediated transfection, PEI, electroporation and nucleofection.
- different alternatives can be used for the co-expression of the aeCG and peCG subunits.
- different expression vectors can be used to co-express the different subunits of the reCG protein, such as, for example, the expression vector pcDNA3.3 to express the peCG subunit, and the vector of pNU1 expression to express the aeCG subunit.
- the vectors pNU1 and pcDNA3.3 have different selection marks for stable cell transfectants, that is: DHFR, in the case of the vector pNU1, and Neomycin Phosphotransferase II (NPTII) in the case of the vector pcDNA3.3, which facilitates the selection process of positive stable co-transfectants, producing both subunits simultaneously.
- the stable co-transfection of the pcDNA3.3-peCG and pNU1 -aeCG vectors can be performed using different molar ratios of the respective vectors, for example, 2: 1, or even 1: 2, or preferably 1: 1.
- eCG is a complex molecule, presenting around 45% of its molecular mass consisting of post-translational modifications (glycosylation), it is necessary to use a robust expression system that allows the production of an eCG recombinant as similar as possible compared to wild-type eCG.
- the heterologous expression system of reCG according to the present invention was chosen because it allows the correct processing of newly synthesized polypeptide chains, the folding and assembly of its subunits a and b, in addition to the addition of complex type glycan chains, which it is essential for the recombinant eCG produced to have biological activity.
- a particular embodiment of the present invention involves a method for the identification of cellular sub-phenotypes producing a reCG molecule with biological activity in vivo from an initial mixed cell population generated through the stable co-transfection of the expression vectors of the a and b chains of reCG.
- the method provides a direct link between events of stable insertion of the expression vectors of the reCG a and b chains into the host cell genome and the production of biologically active forms of reCG without the need for manipulation or prior knowledge about the expression repertoire or profile. of particular enzymes of the glycosylation biosynthetic pathway.
- the biological response type eCG is recognized by observing the induction of a rapid and vigorous growth of uterine and ovarian tissues in immature rats.
- samples of conditioned medium by cell clones representing different cell sub-phenotypes are used to determine the biological activity in vivo type eCG, and, thus, to identify the clones producing biologically active forms of reCG.
- the cells used for the expression of reCG are cells of mammalian lineage or insect cells, or any cell lineage that is capable of providing profiles of gene expression of the enzymes of the glycosylation pathway of glycosylation compatible with obtaining biologically active forms reCG, even though the exact configuration of such expression profiles is unknown. Therefore, any other cell line that is capable of adding post-translational modifications similar to that obtained for the reCG profile defined for the present invention, and which has the same behavior when grown in vitro, such as, replication capacity, protein expression capacity, simple transfectability, among others, can be used.
- mammalian lineage cells were chosen; more preferably, cells of the CHO lineage, or derived from them. Even more preferably, the CHO-DG44-DHFR v ⁇ strain is used.
- other cell types subject to the same phenotypic selection process such as cells from the CHO, BHK, 293, Vero line or their derivatives, are suitable for the invention and can replace cells from the CHO-DG44-DHFR / - line.
- the initial step of selecting stable cell transfectants can be performed, for example, by using a nucleoside-free culture medium supplemented with the antibiotic G418, in the concentration range of 200 pg / ml to 1 mg / ml, more preferably 500 pg / ml.
- the initial mixed cell populations may be subjected to additional selection cycles, whether or not the previous selection of cell subpopulations expressing higher levels of reCGa + b, using increasing concentrations, in the range of 5 nM to 100 mM, from inhibitors of the DHFR enzyme, and antibiotic G418, in the concentration range from 500pg / mL to 2mg / MI.
- DHFR inhibitors are known in the art and may be suitable for use in the invention.
- the DHFR inhibitor suitable for the invention is Methotrexate (MTX).
- Cells deficient in DHFR enzyme production such as CHO-DG44 DHFR - / - cells, preferably used in the present invention, are suitable as they cannot survive when cultured in the absence of nucleosides, since this enzyme catalyzes the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate.
- these cells are transfected with constructions obtained from the vectors of the invention, which have the gene sequence corresponding to the DHFR enzyme, they become able to grow in the absence of nucleosides.
- ReCG overproducing cells can be grown in batches of production in monolayers or in suspension. Different reservoirs can be used, such as cultivation bottles of different sizes, plates, T flasks, spinners, disposable cultivation bags (bags) and other types of bioreactors with propellers or rounded blades, hollow fiber, among other configurations.
- Different reservoirs can be used, such as cultivation bottles of different sizes, plates, T flasks, spinners, disposable cultivation bags (bags) and other types of bioreactors with propellers or rounded blades, hollow fiber, among other configurations.
- the culture media employed can vary as long as they are able to supply the metabolic needs of the cells.
- reCG overproducing cells can be cultured in the presence or absence of fetal bovine serum (FCS).
- FCS fetal bovine serum
- the proportion of fetal bovine serum can be adapted according to the culture conditions to maintain cell viability and protein expression levels (from 1 to 100 pg / mL) within the same order of magnitude as the original standard.
- Cultivation media chemically defined or free of serum and proteins, containing substitutes for FCS, such as peptide growth factors and cell proliferation of various types, albumin, insulin, among others; or fetal or adult serum from other species, and supplemented with precursors used in the glycosylation pathways, are also suitable for use in the production of reCG. Cultivation should take place under defined environmental conditions, such as temperature between 25 and 40 ° C, relative proportion of CO2 between 1 and 10%, and pH between 5.0 and 8.0.
- the producing cell clones are grown in suspension and in chemically defined culture medium. When the cultivation is carried out in spinners, bags and bioreactors, the rotation used can vary between 10 and 200 rpm.
- the product obtained can be partially purified using known techniques for protein purification, with conditioned culture media containing reCGa + b being subjected to at least one of the following techniques: protein precipitation, for example, in the presence of ammonium sulfate; ultrafiltration; tangential filtration; or two different types of chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography.
- a recombinant equine chorionic gonadotropin produced from the process of the present invention.
- the recombinant equine chorionic gonadotropin of the invention is produced through biotechnological mechanisms on an industrial scale offering an alternative option to those obtained from equine plasma and involving bioethical factors.
- the reCG of the invention will not face the problems encountered in the state of the art related to the scarcity of the source of origin, constituting advantageously a new source of uninterrupted supply of reCG.
- the present invention relates to a veterinary composition
- a veterinary composition comprising:
- composition of the present invention may comprise, in addition to the reCG of the invention, adjuvants, preservatives, diluents, emulsifiers, stabilizers and other pharmacologically acceptable ingredients that are used in gonadotropin preparations for animal use.
- the present invention refers to the use (a) of the reCG or (b) of the veterinary composition of the invention, comprising said reCG, in the manufacture of a medicament for the treatment of veterinary conditions related to reproduction and ovulation mammalian animals, as an optimizing agent for in vitro fertilization; in the manufacture of kits for diagnosis of veterinary conditions and protocols related to the ovulation of mammals; and in the manufacture of supplements for cell cultivation.
- RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare ® , Buckinghamshire, England), following the manufacturer's recommendations.
- the concentration and purity of the RNA obtained were determined through quantification on a nanospectrophotometer (ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, USA) and reading the Abs260 / Abs280 and Abs260 / Abs230 nm absorbance ratio.
- ND-1000 Spectrophotometer NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, USA
- a 1.0pg aliquot of total equine pituitary RNA was used as a template for a reverse transcription reaction using the lmProm TM -11 RT enzyme kit (Promega Corporation, Madison, USA); Super Script II (Invitrogen), the reactions being carried out according to the manufacturer's recommendations.
- the samples were diluted 3 times in deionized water, obtaining a final volume of 60pL and stored at - 80 Q C.
- Example 2 Amplification of the coding strands for eCG a and 3, from this cDNA library, by PCR
- the primers used to amplify the cDNA sequences were designed based on the complete coding sequences of each of the two eCG subunits contained in the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; National Center for Biotechnology Information, U.
- the total equine pituitary tissue cDNA was used for the amplification of the coding sequences of both subunits of eCG.
- PCR polymerase chain reactions
- Buffer Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
- 0.2 mM dNTPs Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
- 2 mM MgS04 Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
- 400 nM primer Forward Thermo Fisher
- reaction was carried out under the following conditions: 94 Q C for 1 minute; 35 cycles of: 94 Q C for 30 seconds, 55 Q C (eCGa) or 58 ° C (eCGP) for 30 seconds and 68 Q C for 1 min; final extension at 68 Q C for 2 min.
- amplicons were detected using 2.0% agarose gels, stained with 0.5pg / mL of ethidium bromide, and the expected size product was isolated with a scalpel and purified using the GFX DNA and Band Purification Kit (GE Flealtcare, Carlsbad, CA, USA), according to the manufacturer's recommendations.
- pNU1 - aeCG the purified DNA fragment, previously obtained from a PCR reaction with primers 5 and 9 described in Table 1, was digested containing the aeCG coding region, with the restriction enzymes EcoR ⁇ and Noti, followed by thermal inactivation of the enzymes.
- the purified aeCG DNA fragment was ligated and the vector pNU1 co-digested with the restriction enzymes EcoR ⁇ and Noti. Aliquots of the binding reactions were used to transform Escherichia coli strain DFI10B bacteria by electroporation.
- the antibiotic ampicillin at a concentration of 100 pg / mL was used.
- Obtaining the recombinant plasmid was confirmed from obtaining its restriction profile with the enzymes EcoR ⁇ and Noti.
- the construction of the pcDNA3.3-peCG vector was performed by subcloning the eCG chain originally present in plasmid pNU1 - eCG.
- the vector pNU1 -peCG was digested with the restriction enzymes Xba ⁇ and Mss ⁇ for the release of the coding region of peCG and its purification by agarose gel electrophoresis and adsorption to silica.
- the purified PeCG DNA fragment was ligated and the pcDNA3.3 vector co-digested with the restriction enzymes Nhe ⁇ and Mss ⁇ .
- the vectors pNU1 -aeCG and pcDNA3.3-peCG were characterized by automated DNA sequencing, using the Big Dye® kit (Thermo Fisher Scientific TM) and the ABI Prism 3700 DNA Analyzer sequencer (Thermo Fisher ScientificT M ), and several primers that line up with the expression vectors pNU1 and pcDNA3.3, and in the inserts aeCG and peCG.
- the assembly of the consensus sequences of the pNU1 -aeCG and pcDNA3.3-peCG vectors was carried out from the individual sequences obtained, using the SeqMan program from the DNASTAR package.
- the schematic map of the expression vectors pNU1 -aeCG and pcDNA3.3-peCG are represented in Figures 1 and 2, respectively.
- Example 4 Stable lipofection co-transfection of pcDNA 3.3-3eCG and pNU1 -aeCG constructs in CFIO-DG44 cells cultured in suspension and maintained in a defined medium.
- the CFIO-DG44 cGMP cells used for the stable co-transfection of the aeCG and eCG chains are part of the Freedom DG44 system (Invitrogen ® ).
- the cells were cultured, according to the manufacturer's recommendations, in suspension and with agitation (100-120 rpm), in a “Spinner” flask containing 30ml_ of DG44 CD medium supplemented with 8mM L-glutamine and 0.18% Pluronic, in a humid atmosphere at 37 ° C and 8% C02. Every 3 or 4 days, cell culture was evaluated for cell density and percentage of viable cells, and subcultured to a density of about 3x10 5 viable cells / mL.
- the vectors pNU1 -aeCG and pcDNA3.3-peCG were linearized with the restriction enzyme Pvu ⁇ to optimize the insertion process of the expression cassettes of interest in the CHO-DG44 cell genome.
- the plasmids were purified by precipitation and quantified by spectrophotometry.
- 9pg of each plasmid was mixed with 600 ml of OptiPro SFM medium (Invitrogen).
- 15 ⁇ L of the FreeStyle Max Reagent (Invitrogen) reagent was mixed with 600 ml of OptiPro SFM medium (Invitrogen).
- the two mixtures were combined and incubated for 10 minutes at room temperature, to allow the formation of the complexes.
- the mixture of DNA and FreeStyle reagent was dripped onto the cells (1, 15 x 10 7 viable cells) while gently shaking the suspension. Then, the culture was kept in an incubator at 37 ° C and 8% CO2.
- Example 5 Selection of stable transfectants from CFIO-DG44 cells co-transfected stably with the expression vectors pcDNA 3.3-3eCG and pNU1 -aeCG
- the cells were transferred to the selection medium (OptiCFIO supplemented with 8mM glutamine and 500pg / mL G418). After about 20 days of cultivation in selection medium, a cell subpopulation resistant to the selection medium was obtained and, therefore, carriers of at least one copy of each of the vectors of interest integrated in their genome.
- the selection medium OptiCFIO supplemented with 8mM glutamine and 500pg / mL G418, After about 20 days of cultivation in selection medium, a cell subpopulation resistant to the selection medium was obtained and, therefore, carriers of at least one copy of each of the vectors of interest integrated in their genome.
- the conditioned medium for 96h of this original mixed population was collected to evaluate the productivity of reCGa + b through a specific ELISA (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG kit), following the manual provided by the manufacturer.
- the absorbance values were determined at 450nm by reading on a plate spectrophotometer (SpectraMax M2 - Molecular Devices).
- a standard curve, provided by the kit, was used as a reference for a 4-parameter logistical analysis.
- the concentration of reCG in the culture media was normalized by the number of viable cells at the time of collection. A productivity of 1.3 IU / mL / million viable cells was obtained in the initial mixed population.
- Example 6 Cell enrichment from the mixed population CHO-DG44 eCGa + eCGB based on the expression levels of reCG
- the enrichment protocol was performed by serial dilution of the mixed population CHO-DG44 cGMP pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG in culture medium (FortiCHO + 6mM L-glutamine + supplement HT 1 X + 10% of conditioned medium for 96 hours by the original mixed cell population) until a theoretical concentration of 2 viable cells was obtained in 200 ml of medium. These cells were seeded in 96-well plate wells, and placed in an incubator at 37 ° C and 5% CO2 for up to 25 days. The described protocol generated 10 populations, which were expanded until obtaining crops in a volume of 5mL.
- the media conditioned by 96h of these populations were collected, and evaluated for their productivity by ELISA (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA kit - DRG) to validate the enrichment obtained ( Figure 5).
- the test was carried out with conditioned and freshly collected culture media, diluted 100X in the kit diluent (Zero Standard).
- the conditioned medium was used for 96 hours by CFIO-DG44 cells stably transfected with the vector pNU1 - EYFP.
- the concentration of reCG in the culture media was normalized by the number of viable cells at the time of collection.
- Example 7 Enrichment of cellular suboopulations with higher levels of reCG expression from the selection of enriched cell populations CFIO-DG44 eCGa + eCGB E9 and F9 with increasing doses of MTX and G418
- a second stage of selection of the enriched mixed populations was carried out CHO DG44 cGMP D7 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG), CHO DG44 cGMP E9 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) and CHO DG44 cGMP F9 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) added to the culture medium (OptiCHO supplemented with 8mM Glutamine) 30nM MTX and 750pg / mL G418 until obtaining cell populations resistant to these doses of these drugs, or that is, populations with cell viability greater than 85%.
- Example 8 Isolation of cell clones with higher levels of reCG expression from enriched cell populations CHO-DG44 eCGa + eCGB E9 and F9 30 MTX / 750 G418
- Example 9 Structural characterization of reCGa + b by Western blot
- the quantification of eCG in the samples was performed using the anti-PMSG ELISA method (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG). Subsequently, the samples and the positive control (Novormon) were concentrated by ultrafiltration (Amicon Ultra 0.5 10K filter) to a final titre of 8000 IU / mL. The volume of conditioned medium of the negative control used was calculated in a way that proportionally represented the number of viable cells present at the time of collection of CHO-DG44 cGMP babq ⁇ E11 -300nM cells, and the volume used for the analysis of 75UI of reCG.
- the calculated volume of the negative control was concentrated by the same concentration factor used for the sample E1 1 -300nM.
- Three different amounts of eCG 25, 50 and 75UI were evaluated by electrophoresis (12% SDS-PAGE) in non-reducing conditions and without previous heat denaturation.
- electrophoresis 12% SDS-PAGE
- the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane by wet transfer for two hours.
- the membrane was blocked with a 5% solution of skimmed milk in 0.05% TBS-Tween for one hour.
- the membrane was marked for one hour with the primary anti-PMSG antibody (AP02036SU-N - Acris) diluted 1: 2000 in blocking solution, and incubated at room temperature.
- Example 10 Purification of reCGa + b by cation exchange chromatography
- the cation exchange chromatography was performed from the OptiCFIO culture medium conditioned for 96h by the cell clone CFIO-DG44 cGMP aeCG + bbq ⁇ D3 pnapcb. Before starting the purification procedure, the pH of the conditioned medium was adjusted to 6.5 by adding 10% HCI, which was then filtered through a 0.45pm filter. The cation exchange chromatography was performed using the commercial column Hitrap SP Fast Flow (particles of 90 miti, dimension of 16 x 25mm, 5mL of volume) with the aid of the chromatographic system Akta Purifier UPC 100 and program Unicom 5.31 (GE Flealthcare, Uppsala, Sweden).
- Channel A1 was fed with 0.1 M NaCI buffer and 8 mM Sodium acetate pH 3.5, channel A2 with 0.1 M Na2FIP04 buffer pH 4.4, channel B1 with 0.8 M NaCI buffer and 8mM Sodium acetate pH 3.5, and channel B2 with 2M NaCI buffer and 20mM Tris pH 7.
- a flow rate of 2 mL / min was used. The procedure was started with column equilibrium with 15 mL of OptiCFIO medium with the pFH adjusted to 6.6 with 10% v / v HCI. After sample injection, the first (buffer A1) and the second (buffer A2) washing steps, using 5 column volumes (VC) per wash.
- VC column volumes
- FIG. 9 represents the typical electrophoretic profile obtained from the purified reCGa + b, observed after fractionation by electrophoresis in a non-denaturing 12% polyacrylamide gel, followed by silver staining.
- Example 1 1 Analysis of the glycosylation profile of reCG
- the lectin binding step is followed by a washing step, and then the incubation step with an anti-digoxigenin antibody conjugated to the alkaline phosphatase enzyme, plus a washing step, followed by the detection step, using the BCIP alkaline phosphatase enzyme substrate (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate).
- the reaction is stopped with EDTA and the spectrophotometric reading is performed at 600nm.
- the conditioned medium was used for 96h by the CHO-DG44 cells stably transfected with the vector pNU1 -EYFP, which was submitted to the same purification protocol used for the purification of reCG, as described above.
- As a positive control 200 ng of eCG (Novormon) was used. The assay was performed in duplicate for each lectin. The results are shown in Figure 10.
- Example 12 Assessment of in vivo biological activity of reCGa + 3
- the conditioned medium samples were concentrated by ultrafiltration, using Vivaspin 20MI columns and 10kDa cut (GE Flealthcare). After the concentration step, the amount of reCGa + b was estimated by ELISA in concentrated medium samples and in the purified preparation of reCGa + b, and proceeded with subcutaneous injection of reCGa + b in rats of the Sprague-Dawley lineage. age between 23 and 25 days. To obtain the dose-response curve, the doses of reCGa + b of 1, 14, 2.28, 5.71, 11, 4, 22.8 and 45.7 pg were used, diluted in PBSA (diluent).
- eCG obtained from pregnant mares plasma (Novormon), doses of 1, 14, 2.28, 5.71 and 11.4 pg, diluted in PBSA, were used.
- a negative control the vehicle was injected.
- the injections were performed in 5 animals per dose or experimental group, and, approximately 72 hours after the injection, the animals were euthanized in a CO2 chamber, and the ovaries and uteri were dissected, dried and weighed.
- the final answer for each dose was obtained through the arithmetic mean of the weight of the organs (ovaries or uteri) of the five animals at each point. The increase in the weight of these organs, compared to negative controls, corresponds to the animal's biological response to the stimulus with eCG.
- Figures 11 A (conditioned medium samples) and 12A (purified reCG samples) represent the profiles of the ovarian and uterine responses to the stimulus with different evaluated reCGa + b doses
- Figures 11 B (samples of conditioned medium) and 12B (samples of purified reCG) represent the morphological aspects of the ovaries and uterus in view of the different experimental situations explored
- Figures 1 1 C (samples of conditioned medium) and 12C (samples of purified reCG) the dose curves responses obtained for ovaries, which were obtained by 4-parameter logistic regression, performed by the GraphPad Prisma 5.00 for Windows software (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), and used to calculate the effective dose (DE-50 or ED-50) for reCGa + b (clone D3 pnapcb) and Novormon.
- Example 13 Clinical trial performed on anesthetized cows
- a clinical trial was carried out on cows in anestrus with the product reCGa + b produced by clone D3 pnapcb.
- the study involved 40 female Nellore (Bos taurus indicus) and / or crossbred (Bos taurus taurus X Bos taurus indicus) females aged between 16 months and 10 years, weight compatible with the category and body condition score (ECC)> 2, 5 (scale from 1 to 5).
- the animals were kept in a paddock of Bracharia brizantha with a capacity of 1 AU / ha in a continuous grazing system during the experimental period and had free access to water and mineral salt.
- the 40 recruited females were divided into four treatment groups (CB050-1000 - reCGa + b 1000UI, CB050-2500 - reCGa + b 2500UI, Negative Control - saline and Positive Control Novormon 1000UI), so that each group contained 10 animals.
- the animals in the “Positive Control” group received a single dose of 1000 IU / animal, intramuscularly, 8 days after the start of the ovulation synchronization protocol.
- the animals in the “Negative Control” group received a single dose of 5mL of sterile saline.
- the animals were distributed in groups, where they received the treatments (1000UI or 2500UI of reCG of the invention; 1000UI of Novormon or 5 ml_ of negative control).
- the intravaginal progesterone device was removed and all animals received intramuscularly, 530pg of sodium Cloprostenol (PGF) and 1 mg of estradiol cypionate.
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Abstract
A presente invenção se refere à produção de uma gonadotrofina coriônica equina recombinante (reCG) biologicamente ativa, à uma composição veterinária compreendendo a reCG, e ao uso da reCG ou da composição compreendendo reCG. A reCG da presente invenção possui perfil de glicosilação semelhante àquele das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis e exibe nível de atividade in vivo correspondente ao eCG e semelhante ao dos hormônios FSH e LH. A presente invenção tem aplicação no campo da biotecnologia, mais especificamente, no campo de reprodução assistida veterinária, sendo especialmente adequada para ser utilizada para o tratamento de condições veterinárias relacionadas à reprodução e à ovulação de mamíferos, bem como para a fabricação de kits de diagnóstico ou como suplemento para o cultivo de células.
Description
“GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE (reCG) BIOLOGICAMENTE ATIVA E PROCESSO PARA OBTENÇÃO DA MESMA, COMPOSIÇÃO VETERINÁRIA E USO”
Campo Técnico
[0001] A presente invenção se refere a um processo aperfeiçoado de produção da gonadotrofina coriônica equina recombinante biologicamente ativa, aqui referidas como reCG ou reCGa+b, à reCG produzida através do processo da presente invenção, a uma composição veterinária compreendendo a reCG, e ao uso da reCG ou da composição compreendendo reCG.
[0002] A reCG produzida apresenta perfil de glicosilação semelhante ao das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis, e exibe nível de atividade in vivo semelhante ao do hormônio luteinizante (LH, acrónimo em inglês para Luteinizing Hormone) e hormônio folículo-estimulante (FSH, acrónimo em inglês para Follicle Stimulating Hormone).
[0003] A presente invenção tem aplicação no campo da biotecnologia, mais especificamente, no campo de reprodução assistida veterinária, sendo especialmente adequada para ser utilizada no tratamento de condições veterinárias relacionadas à reprodução e à ovulação de mamíferos, para a fabricação de kits de diagnóstico ou como suplemento para o cultivo de células.
Histórico da Invenção
[0004] Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades económicas nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância da pesquisa básica e tecnológica em reprodução bovina, especialmente na área de hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG).
[0005] Diversos hormônios são utilizados em técnicas de reprodução assistida veterinária e, nos últimos anos, a gonadotrofina coriônica equina tem despontado como primeira opção na indução da ovulação em vacas em anestro gestacional, nos protocolos de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF), visando melhorar os índices de fertilidade de fêmeas bovinas criadas
em regime extensivo (SÁ FILHO et ai, Equine chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone enhance fertility in a norgestomet-based, timed artifical insemination protocol in suckled Nelore ( Bos Indicus) cows. Theriogenology 2010; 73(5):651 -8; FERREIRA et al., Effect of different doses of equine chorionic gonadotropin on follicular and luteal dynamics and P/AI of high-producing Holstein cows. Anim Reprod Sei 2013; 140(1 -2) 26-33; CARVALHO et ai Equine chorionic gonadotropin improves the efficacy of a timed artificial insemination protocol in buffalo during the nonbreeding season. Theriogenology 2013;79(3) :423-8; BARREIROS et ai, Dynamics of follicular growth and progesterone concentrations in cyclic and anestrous suckling Nelore cows ( Bos indicus) treated with progesterone, equine chorionic gonadotropin, or temporary calf removal. Theriogenology 2014; 81 (5):651 -6).
[0006] A eCG é especialmente utilizada em vacas de corte criadas em manejo extensivo, e vem sendo utilizada, também, em tratamentos superovulatórios de vacas e novilhas como uma opção eficaz de tratamento em animais irascíveis (MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nutr Dev 2002; 42(6):601 -1 1 ), visto que os tratamentos hormonais convencionais em bovinocultura adotam a utilização de oito doses de preparações comerciais purificadas do FSH porcino - Folltropin-V®, Bioniche® (dados obtidos na bula do produto).
[0007] A eCG é secretada pelo útero equino, mais especificamente pelos cálices endometriais, que são formados ao redor do quadragésimo dia de gestação, permanecendo até ao redor do octogésimo quinto dia. A secreção deste hormônio, que possui ação biológica semelhante tanto ao FSH quanto ao LH, estimula o desenvolvimento de folículos ovarianos na égua gestante. Alguns destes folículos ovulam, mas a maioria transforma-se em folículos luteinizados devido à ação semelhante ao LH. Tais corpos lúteos acessórios produzem a progesterona necessária para manter a prenhez na égua (HAFEZ E HAFEZ, Reprodução Animal. Editora Manole 2004; volume único).
[0008] A eCG utilizada atualmente para reprodução animal é purificada a partir de plasma de éguas gestantes (CHRISTAKOS E BAHL, Pregnant mare serum
gonadotropin. Purification and physicochemical, biological, and immunological characterization. J Biol Chem 1979; 254(10):4253-61 ; MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nutr Dev 2002; 42(6):601 -1 1 ), sendo comercializada como Folligon (Intervet); SincroeCG (Ourofino) e Novormon (Coopers), não existindo uma eCG recombinante comercialmente disponível.
[0009] Esta gonadotrofina única possui a capacidade de, em espécies heterólogas, ligar-se aos receptores tanto de FSFI quanto de LH, e provocar o estímulo da foliculogênese (STEWART et al., Pregnant mare serum gonadotrophin: ratio of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone activities measured by radioreceptor assay. J Endocrinol 1976; 71 (3):471 -82; COMBARNOUS, Original hypothesis on the specificity of the binding of glycoprotein hormones to their receptors. C R Seances Acad Sei III 1981 ). Sua prolongada meia-vida plasmática, decorrente de sua alta quantidade de açúcares (MCINTOSFI et al., Pregnant mare serum gonadotrophin: rate of clearance from the circulation of sheep. J Reprod Fértil 1975; 44(1 ):95-100), permite que uma única aplicação deste hormônio seja eficiente para induzir ovulação, poupando, deste modo, o tempo gasto com manejo, e, ainda, diminuindo possíveis estresses dos animais submetidos ao tratamento superovulatório (KIMURA et al., Successful superovulation of cattle by a single administration of FSFI in aluminum hydroxide gel. Theriogenology 2007; 68(4):633-9).
[0010] Além da extração de gonadotrofinas ser uma tarefa laboriosa e dispendiosa, a falta de biossegurança do material resultante é bastante preocupante, visto que qualquer tentativa de purificação que preserve os hormônios glicoproteicos demonstra uma limitada capacidade de destruição de vírus resistentes (TFIARASANIT et al., Effects of recombinant human follicle stimulating hormone on follicle development and ovulation in the mare. Theriogenology 2006; 65(6):1071 -81 ). Além disso, pelo fato de ser um extrato biológico, existe uma grande variabilidade na atividade da glicoproteína entre os lotes de eCG, contribuindo, desta maneira, para a variabilidade na resposta
e na qualidade dos embriões obtidos (WILSON et al., Superovulation of cattle with a recombinant-DNA bovine follicle stimulating hormone. Animal Reproduction Science 1993;33(1 -4):71 -82).
[0011] Considerando-se o que foi exposto acima, e tomando-se em consideração o fato de que a fonte de origem da eCG é limitada (sangue de éguas prenhes), e, ainda, que existem fatores bioéticos relacionados à obtenção deste material, procura-se uma fonte de eCG que seja ilimitada, ética, e de obtenção mais prática e reprodutível, assegurando o fornecimento ininterrupto a um mercado consumidor crescente deste hormônio.
[0012] As gonadotrofinas recombinantes apresentam máxima biossegurança, melhor performance nos resultados, nenhuma interferência de outros hormônios e poucos contaminantes, sendo, desta maneira, usadas amplamente na Medicina Reprodutiva humana, representando grande interesse para a reprodução assistida veterinária. A tecnologia recombinante provou ser possível a produção de proteínas complexas de modo reprodutível. No entanto, a estrutura das gonadotrofinas é de difícil reprodução, pois, além de serem compostas por duas cadeias transcritas e traduzidas de maneira independente, existe a presença de várias modificações pós-traducionais, particularmente a glicosilação, que no caso da eCG tem um papel fundamental na sua atividade biológica (LOUMAGEL et al., Human follicle-stimulating hormone produced by recombinant DNA technology: a rewiew for clinicians. Human Reproduction 1995; v. 1 p. 188-199; MARTINUK et al., Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo. Biol Reprod. 1991 Oct;45(4):598-604).
[0013] Ao longo das últimas décadas, foram desenvolvidos inúmeros processos que permitiram a manipulação genética de células em cultura de tal forma que estas células passassem a produzir uma grande variedade de proteínas e glicoproteínas de interesse farmacêutico. Estes processos envolvem a utilização da tecnologia do DNA recombinante para a preparação de vetores de expressão contendo o material genético que codifica uma determinada proteína ou glicoproteína. Ao se introduzir o vetor de expressão
numa determinada linhagem celular em cultura, este material genético passa a instruir a maquinaria biossintética celular de tal forma que ocorra a síntese de uma proteína ou glicoproteína específica.
[0014] Entretanto, existem vários obstáculos associados à produção de glicoproteínas em uma determinada linhagem celular geneticamente modificada. O processo de glicosilação associado à produção de glicoproteínas consiste na adição de carboidratos às cadeias polipeptídicas, que é um evento pós-traducional que resulta na adição de cadeias de açúcar à resíduos de aminoácidos específicos de asparagina (glicosilação N-ligada) ou de serina/treonina (glicosilação O-ligada) numa determinada sequência polipeptídica. Numa glicoproteína, enquanto a porção polipeptídica é codificada por uma determinada sequência genética, sendo, desta forma, constante, as estruturas de carboidratos são variáveis, uma característica que é conhecida como micro- e macro-heterogeinidade. O processo de glicosilação é o produto de uma complexa sequência de reações enzimáticas que adicionam, clivam e modificam a porção de carboidratos de uma glicoproteína. Antecipar o resultado da ação coordenada destas enzimas que participam do processo de glicosilação não é uma atividade intuitiva ou direta, sendo muito difícil predizer os perfis de glicosilação que podem ser obtidos a partir de determinado tipo celular, ou ainda, o impacto que flutuações do perfil de expressão gênica ou manipulações nos regimes de cultivo podem ter sobre o perfil final de glicosilação (Al-Rubeai, Cell Engineering. Springer 2009; pág. 247-279). Portanto, várias linhagens celulares comumente utilizadas para a produção heteróloga de proteínas de interesse terapêutico possuem capacidades variáveis de promover a glicosilação de glicoproteínas. Entretanto, apesar destas células possuírem tais capacidades, a maquinaria celular de glicosilação não é controlada pelo vetor de expressão da proteína de interesse. Desta forma, a glicoproteína produzida por uma determinada linhagem celular geneticamente manipulada pode possuir uma estrutura de glicanos diferente daquela apresentada pela glicoproteína natural, codificada pelo vetor de expressão.
[0015] As cadeias polissacarídicas modulam a atividade biológica das glicoproteínas de várias formas, promovendo, por exemplo: a) a diminuição do “ clearance " plasmático e o consequente aumento do tempo de meia-vida; b) mediação de processos de reconhecimento molecular; c) estabilização da conformação da cadeia polipeptídica; e d) a proteção quanto a degradação proteolítica (Al-Rubeai, Cell Engineering. Springer 2009; pág. 247-279).
[0016] Assim como outras gonadotrofinas, eCG é uma glicoproteína heterodimérica, composta por duas subunidades polipeptídicas, as cadeias a e b. Em equídeos, o hormônio luteinizante (eLH) e a eCG possuem cadeias polipeptídicas idênticas, sendo que é a divergência quanto à estrutura dos N- e O-glicanos que determina a diferença entre os pesos moleculares e a atividade biológica destes dois hormônios: eCG apresenta uma excepcional meia-vida circulatória em comparação ao eLH (BOUSFIELD et al., Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin beta and equine luteinizing hormone ss by solid-phase Edman degradation. Biol Reprod. 2001 Jan;64(1 ):136-47). A arte anterior ensina que a remoção dos resíduos terminais de ácido siálico das cadeias de glicanos da eCG diminui dramaticamente a atividade in vivo desta glicoproteína, visto que sua meia-vida é reduzida de seis dias para aproximadamente 1 -2 horas (MARTINUK et al., Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo. Biol Reprod. 1991 Oct;45(4):598-604). A subunidade a da eCG, composta de 96 aminoácidos, exibe duas complexas cadeias oligossacarídicas N-ligadas, localizadas nos resíduos das asparaginas 56 e 82. Entretanto, as cadeias de carboidratos dos dois hormônios, eLH e eCG, exibem diferenças em suas estruturas: a subunidade a do eLH possui dois N-glicanos biantenários finalizados em N-acetilgalactosaminas sulfatadas (S04-4-GalNAc), enquanto que os N-glicanos anexados à subunidade a da eCG são finalizados em ácido siálico nas ligações a2,3 e a2,6 (DAMM et al., Structure determination of the major N- and O-linked carbohydrate chains of the beta subunit from equine chorionic gonadotropin. Eur J Biochem. 1990 Apr 20;189(1 ):175-83.), possivelmente estendido com repetições de lactosamina
(BOUSFIELD et al., Differential effects of alpha subunit Asparagine56 oligosaccharide structure on equine lutropin and follitropin hybrid conformation and receptor-binding activity. Biochemistry. 2004 Aug 24;43(33):10817-33). A subunidade b da eCG, composta de 149 resíduos de aminoácidos (SUGINO et al., Structural studies on equine glycoprotein hormones. Amino acid sequence of equine chorionic gonadotropin beta-subunit. J Biol Chem. 1987 Jun 25;262(18):8603-9), possui uma única cadeia de N-glicano localizada na Asn13, terminando com GalNAc sulfatada em eLH e a2,3Gal sialilada em eCG (SMITH et al., Equine lutropin and chorionic gonadotropin bear oligosaccharides terminating with S04-4-GalNAc and Sia alpha 2,3Gal, respectively. J Biol Chem. 1993 Jan 15;268(2):795-802; MATSUI et al., Structural analysis of N-linked oligosaccharides of equine chorionic gonadotropin and lutropin beta-subunits. Biochemistry. 1994 Nov 29;33(47):14039-48). Ambas subunidades b possuem até 12 O-glicanos estendidos com poli N-acetil-lactosamina sialilada (a2,3) localizados nas serinas ou treoninas do carboxi-peptídeo terminal (CTP) de 28 resíduos de aminoácidos (HOKKE et al., Structure determination of the disialylated poly-(N- acetyllactosamine)-containing O-linked carbohydrate chains of equine chorionic gonadotropin. Glycoconj J. 1994 Feb;11 (1 ):35-41 ; BOUSFIELD et al., Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin beta and equine luteinizing hormone ss by solid-phase Edman degradation. Biol Reprod. 2001 Jan;64(1 ):136-47).
[0017] Na literatura, diversos autores tentaram obter a gonadotrofina coriônica equina recombinante, principalmente uma variante artificial da reCG, consistindo de uma proteína de fusão entre as cadeias b e a, sendo que esta foi clonada e expressa em células de inseto (LEGARDINIER et al., Biological activities of recombinant equine luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (eLFI/CG) expressed in Sf9 and Mimic insect cell lines. Journal of Molecular Endocrinology 2005; 34:47-60); secretada em leite de coelhas transgênicas (GALET et al., Expression of an in vitro biologically active equine LFI/CG without C-terminal peptide (CTP) and/or beta26-1 10 disulphide bridge. J Endocrinol,
2001 ; 167(1 ):117-24); expressa em células de camundongos (GALET et al., Expression of a single betaalpha Chain protein of equine LH/CG in milk of transgenic rabbits and its biological activity. Mol Cell Endocrinol, 2001 ; 174(1 - 2):31 -40); e modificada e expressa como formas desglicosiladas em células CHO (células de ovário de Hamster Chinês). Somente para os dois primeiros sistemas citados acima foram realizados ensaios de atividade biológica in vivo, resultando em nenhuma atividade tipo eCG, fato este provavelmente decorrente da diferença nas cadeias de glicanos adicionados à eCG por estes sistemas de expressão.
[0018] Adicionalmente, o estado da técnica ensina métodos de produção de gonadotrofinas recombinantes, mas carece em propor uma maneira eficaz de se obter a reCG em grandes quantidades, e, ao mesmo tempo, com o perfil de glicosilação similar à eCG selvagem que garanta atividade in vivo da reCG similar àquela observada para a eCG selvagem.
[0019] HESSER (HESSER, A survey of heterologous expression systems for the production of bovine follicle stimulating hormone and luteinizing hormone. All Dissertations 2011 ; Paper 692) descreve a produção de gonadotrofinas, mais especificamente, de hormônios folículo-estimulante em células CHO.
[0020] FURUHASHI et al. (FURUHASHI et al., Fusing the carboxyterminal peptide of the chorionic gonadotropin (CG) betasubunit to the common alphasubunit:retention of Olinked glycosylation and enhanced in vivo bioactivity of chimeric human CG. Mol Endocrinol. 1995 Jan;9(1 ):5463) descreve um análogo de hCG com uma cauda polipeptídica do tipo CTP (acrónimo em inglês para Carboxy Terminal Peptide), e relaciona a importância da glicosilação para a atividade biológica do análogo.
[0021] SUGAHARA et al. (SUGAHARA et al., Biosynthesis of a biological active single peptide Chain containing the human common a and chorionic gonadotropin b subunits in tandem. Proc Natl Acad Sei USA 1995; 92:2041 - 2045) descreve a atividade biológica de uma cadeia polipeptídica única com atividade biológica, contendo uma subunidade b da hCG fusionada a uma subunidade a das gonadotrofinas.
[0022] Posteriormente, SUGAHARA et al. (SUGAHARA et al., Expression of biological active fusion genes enconding the common alpha subunit and the follicle-stimulating hormone beta subunit: Role of a linker sequence. J Biol Chem 1996; 271 :10445-10448) descreveu a conversão de um heterodimero de FSH para uma estrutura de cadeia única, e o impacto da ausência da sequência ligante na taxa de secreção e de ligação da dita proteína. Ainda, mostra que o alinhamento dos domínios a e b diferem do apresentado na forma de heterodímero.
[0023] NARAYAN et al. (NARAYAN et al., Functional expression of yoked human chorionic gonadotropin in baculovirus-infected insect cells. Mol Endocrinol. 1995; 9(12):1720-6) descreve a expressão simultânea das subunidades a e b da eCG em células de insetos, cuja expressão é controlada por diferentes promotores, em um mesmo baculovirus recombinante, dando origem a proteínas que são biologicamente ativas apenas in vitro.
[0024] SFIIOTA et al. (SFIIOTA et al., Production of recombinant eCG with potent FSH-like activity by site-directed mutagenesis. Nippon Yakurigaku Zasshi 1997; 1 10(1 ):59P-62P) descreve gonadotrofinas recombinantes com estruturas diferentes em vista dos oligossacarídeos acoplados, e relaciona a atividade biológica dos mutantes ou variantes.
[0025] O documento EP0974599 descreve uma variante da eCG recombinante e sua sequência de DNA correspondente, além de uma composição farmacêutica da dita eCG recombinante para utilização como droga veterinária. A forma variante da eCG recombinante revelada possui as cadeias a e b da eCG fusionadas em uma única cadeia polipeptídica, possuindo atividade do tipo FSFI e LH apenas in vitro. Os inventores sugerem a sua utilização como um medicamento para animais, mas não demonstram: a) a similaridade entre o perfil de glicosilação da forma recombinante obtida e aquele da forma selvagem; e b) a atividade biológica in vivo da forma da eCG recombinante obtida.
[0026] O documento US 5.767.251 descreve métodos para gerar gonadotrofinas humanas recombinantes, dentre as quais hCG, hLH e hFSFI,
em que os hormônios compostos por duas subunidades diferentes são sintetizados na mesma célula por pelo menos um vetor de expressão, no qual a expressão de cada subunidade é controlada por um promotor diferente. Neste caso, a atividade biológica de hCG é facilmente diferenciada da atividade de LH, pois, diferentemente do que ocorre em equinos, em humanos, as cadeias b destas duas gonadotrofinas são codificadas por genes distintos.
[0027] O documento US 5.047.335 descreve um processo para controlar a glicosilação de proteínas recombinantes envolvendo a utilização de células da linhagem CHO geneticamente modificadas de modo a passarem a produzir sialiltransferases, uma classe de glicosiltransferases. Esta produção suplementar de sialiltransferases permite, por exemplo, que glicoproteínas recombinantes, produzidas nesta linhagem das células CHO modificadas geneticamente, possuam uma estrutura de glicanos mais próxima das glicoproteínas humanas naturais. Entretanto, o documento US 5.047.335 não descreve qual combinação de glicosiltransferases seria necessária para a obtenção da eCG recombinante com atividade biológica.
[0028] Os documentos US 6.103.501 , US 6.238.890 e US 6.987.172 descrevem variantes artificiais de cadeia única de gonadotrofinas que são naturalmente encontradas sob a forma de heterodímeros, como, por exemplo, CG, TSH, LH e FSH, e que podem fornecer efeitos ou funções, ou podem se comportar como agonistas ou antagonistas dos hormônios nativos. Também neste caso, a atividade biológica da CG humana é facilmente diferenciada da atividade do LH humano, pois, diferentemente do que ocorre em equinos, em humanos as cadeias b destas duas gonadotrofinas são codificadas por genes distintos. Adicionalmente, esses documentos não descrevem quais condições seriam necessárias para obtenção da eCG recombinante com atividade biológica.
[0029] O documento US 2010/120677 descreve métodos para a produção de análogos de eFSH recombinante biologicamente ativo e métodos para melhorar a reprodução em mamíferos com o uso de análogos de eFSH recombinante.
[0030] O documento CA 2183564 descreve métodos para aumentar a fertilidade através da redução da atividade ou dos níveis dos hormônios com atividade LH, e métodos para selecionar anticorpos para porções específicas de certas proteínas, incluindo LH e hCG, para reduzir a sua atividade biológica.
[0031 ]0 documento WO2016178087A1 descreve métodos para a produção de formas não modificadas de eCG, ou de variantes da eCG fusionadas à porção Fc (acrónimo em inglês para “Fragment crystallizable region”) no leite de animais transgênicos, mas falha em demonstrar atividade biológica in vivo das formas de eCG produzidas.
[0032] O estado da técnica citado acima mostra os constantes esforços direcionados para o desenvolvimento de novas gonadotrofinas recombinantes e de processos para produzi-las com segurança, qualidade e de forma ilimitada, enfatizando, ainda mais, a necessidade de novas soluções e a importância da Pesquisa & Desenvolvimento nesse campo de atuação.
[0033] Permanece, desta forma, a necessidade de aperfeiçoamentos no processo de produção da eCG recombinante, de forma que esta seja produzida em grandes quantidades e, ao mesmo tempo, que dita eCG recombinante possua o perfil de glicosilação necessário para sua atividade biológica in vivo.
[0034] Assim, a partir deste conhecimento, com a presente invenção foi possível aprimorar métodos para produção da eCG recombinante, garantindo a produção de grandes quantidades da eCG recombinante que apresentem um perfil de glicosilação semelhante àquele das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis e, consequentemente, apresentem atividade biológica in vivo também semelhante àquela da eCG selvagem. Tais gonadotrofinas coriônicas recombinantes são produzidas através da seleção de fenótipos celulares específicos a partir de um sistema biotecnologicamente preparado para a alta expressão dessas estruturas.
Sumário da Invenção
[0035] Apesar de muitas gonadotrofinas heterodiméricas recombinantes terem sido produzidas com sucesso, envolvendo a utilização de técnicas de biologia molecular e celular, ainda não se alcançou a obtenção de uma forma
biologicamente ativa in vivo da eCG recombinante. Adicionalmente, desconhece-se qual sistema de expressão heterólogo baseado em células de mamífero é capaz de promover as modificações pós-traducionais do tipo glicosilação N-ligada e O-ligada em grandes quantidades da eCG recombinante, necessárias para se diferenciar a atividade biológica da eCG daquela do eLH.
[0036] Em éguas, a forma selvagem da eCG é produzida por um tipo celular diferenciado e altamente especializado, as células dos cálices endometriais, e ainda, num momento da vida destes animais muito particular, entre o quadragésimo e o octogésimo quinto dias de gestação. Os detalhes dos eventos moleculares associados à promoção das modificações pós- traducionais da eCG, particularmente o processo de glicosilação, os quais são essenciais para a sua atividade biológica, são desconhecidos. Assim, não é possível antecipar, com precisão, que tipos celulares, condições e fatores estão associados à obtenção de tal perfil de glicosilação compatível com uma atividade biológica do tipo eCG, destacando-se: 1 ) qual sistema de expressão heterólogo mimetizaria a combinação de enzimas e fatores encontrados nas células do cálice endometrial; ou ainda 2) quais são as condições de geração de um sistema heterólogo e quais são as condições de cultivo do sistema heterólogo associadas com a obtenção de um perfil de glicosilação da reCG compatível com a atividade biológica in vivo.
[0037] A presente invenção diz respeito a um processo aperfeiçoado de produção de uma gonadotrofina coriônica equina recombinante biologicamente ativa, no qual as cadeias polipeptídicas a e b são produzidas em uma mesma célula, e que dita reCG apresenta perfil de glicosilação semelhante àquele das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis. Dito processo aperfeiçoado é baseado no processo descrito no documento PCT/BR2015/050047 da mesma depositante.
[0038]Assim, de maneira surpreendente, a Depositante verificou que, através do emprego de técnicas amplamente difundidas de biologia molecular e celular, aliado ao uso de estratégias apropriadas de seleção fenotípica, é possível
selecionar sub-fenótipos de linhagens celulares em cultura associados à obtenção de um perfil de glicosilação similar àquele encontrado na eCG selvagem, garantindo, desta forma, que a eCG recombinante assim obtida possua atividades biológicas in vivo similares aos hormônios FSH e LH.
[0039] Este efeito técnico é ainda mais inesperado já que, até o momento, a arte anterior ensina que para obtenção de tal atividade seria necessário que pelo menos 50% das ramificações terminais das cadeias de glicanos da eCG estivessem sialiladas (MARTINUK et al., Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo. Biol Reprod. 1991 Oct;45(4):598-604). Mais especificamente, a reCG obtida pelo processo aperfeiçoado pode ser completamente glicosilada, caracterizada por conter cadeias de glicanos N- e O-ligados contendo um alto teor de sialilação terminal dos resíduos de galactose, ou, ainda, parcialmente glicosilada, contendo a unidade dissacarídica Gal-(1 -4)GlcNAc como resíduo terminal N-ligado e/ou O-ligado, ou, ainda, a unidade monossacarídica GlcNAc como resíduo terminal O-ligado.
[0040] De acordo com um primeiro aspecto, é provido um processo que compreende as etapas de:
(a) preparo e obtenção de sequências de DNA codificadoras das cadeias a e b da reCG;
(b) inserção das ditas sequências de DNA codificadoras em vetores de expressão, de tal forma que as ditas sequências de DNA codificadoras estejam funcionalmente ligadas a elementos promotores da transcrição gênica;
(c) manipulação genética de uma linhagem celular de interesse envolvendo a inserção genômica, em uma mesma célula, de um primeiro vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia a da reCG, e de um segundo vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia b da reCG;
(d) expressão de forma independente da primeira e da segunda sequências de DNA mencionadas, de tal forma que as cadeias polipeptídicas a e b sejam produzidas como moléculas separadas em uma mesma célula da linhagem celular de interesse mencionada, e, desta forma, ocorra a produção de grandes
quantidades do heterodímero formado entre as cadeias a e b com atividade biológica tipo eCG;
(e) isolamento de clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo
(f) cultivo dos clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo e
(g) recuperação da reCG com atividade biológica in vivo a partir do meio de cultivo condicionado pelos clones celulares produtores.
[0041] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é provida uma gonadotrofina coriônica equina recombinante, produzida a partir do processo aperfeiçoado da presente invenção, sendo dita reCG produzida a partir de cadeias de cDNA contendo as sequências codificadoras das cadeias a e b separadamente e que ditas cadeias polipeptídicas a e b da reCG são completamente ou parcialmente glicosiladas.
[0042] Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição veterinária compreendendo:
(a) uma quantidade veterinariamente eficaz da reCG produzida de acordo com a presente invenção;
(b) opcionalmente aditivos; e
(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0043] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere ao uso da reCG da invenção ou da composição da invenção, compreendendo a dita reCG, na fabricação de um medicamento para o tratamento de condições médicas relacionadas à reprodução e ovulação de animais mamíferos, como agente otimizador da fertilização in vitro; na fabricação de kits para diagnósticos de condições veterinárias e protocolos relacionados à ovulação de mamíferos; e na fabricação de suplemento para o cultivo de células.
Breve Descrição das Figuras
[0044] A Figura 1 ilustra a sequência codificadora da cadeia a da reCG, juntamente com a sequência polipeptídica correspondente. Em suma, estão representadas as sequências nucleotídicas e polipeptídicas, em que os
aminoácidos estão representados usando o código de única letra, da cadeia alfa da reCG, e que correspondem às SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3 da listagem de sequências, respectivamente.
[0045] A Figura 2 ilustra a sequência codificadora da cadeia b da reCG, juntamente com a sequência polipeptídica correspondente. Em suma, estão representadas as sequências nucleotídica e polipeptídica, em que os aminoácidos estão representados usando o código de única letra, da cadeia beta da reCG, e que correspondem às SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4 da listagem de sequências, respectivamente.
[0046] A Figura 3 ilustra o vetor de expressão da cadeia a da reCG
[0047] A Figura 4 ilustra o vetor de expressão da cadeia b da reCG
[0048] A Figura 5 ilustra a produtividade de reCG após 96h de cultivo da população mista original CFIO-DG44 cGMP pcDNA 3.3^eCG + pNU1 -aeCG e das populações enriquecidas derivadas desta estratégia. CFIO-EYFP (controle negativo) é o meio condicionado por 96h por células CFIO-DG44 cGMP transfectadas com o vetor pNU1 contendo a mensagem codificadora da proteína fluorescente EYFP. A concentração normalizada de reCG nos meios de cultura avaliados está expressa em UI/mL por milhão de células viáveis.
[0049] A Figura 6 ilustra a produtividade de reCG, determinada por ELISA específico, nos meios condicionados pelas populações celulares enriquecidas, que foram geradas durante a segunda etapa de seleção com 30nM de MTX e 750pg/mL de Geneticina (G418). A concentração normalizada de reCG nos meios de cultura avaliados está expressa em UI/mL por milhão de células viáveis.
[0050] A Figura 7 ilustra a produtividade de reCG após 96h de cultivo dos clones isolados através de diluição limitante a partir das populações enriquecidas CHO-DG44 cGMP E9 30/750 (pcDNA3.3^eCG + pNU1 -aeCG) e CHO-DG44 cGMP F9 30/750 (pcDNA3.3^eCG + pNU1 -aeCG). A concentração normalizada de reCG nos meios de cultura avaliados está expressa em UI/mL por milhão de células viáveis.
[0051] A Figura 8 ilustra a caracterização estrutural do heterodímero reCGa+b através da técnica de Western Blot.
[0052] A Figura 9 ilustra o perfil eletroforético típico obtido da reCGa+b purificada, observado após fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida 12% não desnaturante, seguido de coloração com prata.
[0053] A Figura 10 ilustra o perfil de glicosilação obtido para a proteína recombinante expressa pelo clone D3 (pcDNA3.3^eCG + pNU1 -aeCG).
[0054] As Figura 1 1 , 12 e 13 ilustram a avaliação funcional in vivo em ratas da reCGa+b, realizada a partir da obtenção dos perfis das respostas (peso dos órgãos) ovariana e uterina frente ao estímulo com diferentes doses de reCGa+b.
[0055] A Figura 14 ilustra a avaliação funcional in vivo em vacas da reCGa+b, realizada a partir da obtenção do perfil de resposta ovariano (taxa de superestimulação de folículos) frente ao estímulo com diferentes doses de reCGa+b.
Breve Descrição da Listagem de Sequências Biológicas
[0056] A SEQ ID NO:1 ilustra uma sequência nucleotídica codificadora da cadeia a da eCG.
[0057] A SEQ ID NO:2 ilustra uma sequência nucleotídica codificadora da cadeia b da eCG.
[0058] A SEQ ID NO: 3 ilustra uma sequência proteica da cadeia a da eCG.
[0059] A SEQ ID NO: 4 ilustra uma sequência proteica da cadeia b da eCG.
Descrição Detalhada da Invenção
[0060] A presente invenção trata de um processo aperfeiçoado de produção de uma gonadotrofina coriônica equina recombinante (reCG), no qual as cadeias polipeptídicas a e b são produzidas em uma mesma célula e são completamente ou parcialmente glicosiladas. Dita gonadotrofina coriônica equina recombinante apresenta perfil de glicosilação semelhante ao da gonadotrofina coriônica equina natural e apresenta atividade in vivo dos hormônios FSFI e LH.
[0061] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, dito processo
aperfeiçoado compreende as etapas de:
(a) preparo e obtenção de sequências de DNA codificadoras das cadeias a e b da reCG;
(b) inserção das ditas sequências de DNA codificadoras em vetores de expressão, de tal forma que as ditas sequências de DNA codificadoras estejam funcionalmente ligadas a elementos promotores da transcrição gênica;
(c) manipulação genética de uma linhagem celular de interesse envolvendo a inserção genômica, em uma mesma célula, de um primeiro vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia a da reCG, e de um segundo vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia b da reCG;
(d) expressão de forma independente da primeira e segunda sequências de DNA mencionadas, de tal forma que as cadeias polipeptídicas a e b sejam produzidas como moléculas separadas em uma mesma célula da linhagem celular de interesse mencionada, e, desta forma, ocorra a produção de grandes quantidades do heterodímero formado entre as cadeias a e b com atividade biológica tipo eCG;
(e) isolamento de clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo;
(f) cultivo dos clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo; e
(g) recuperação da reCG com atividade biológica in vivo a partir do meio de cultivo condicionado pelos clones produtores.
[0062] Os primers utilizados para a amplificação das sequências de cDNAs codificadoras das cadeias a e b da eCG foram desenhados a partir das sequências codificadoras completas de cada subunidade de eCG contidas na base de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; National Center for Biotechnology Information, U. S. NLM - U. S. National Library of Medicine, Bethesda, EUA (NM_access number a: 001099763.1 , b: 001490342.2). Não se fez uso de um programa computacional para o desenho dos oligonucleotídeos.
[0063] A amplificação das cadeias codificadoras pode ser realizada através da técnica de RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) e os produtos obtidos são separados e purificados por técnicas usualmente conhecidas e empregadas no estado da técnica. Preferencialmente, os amplicons obtidos são detectados por eletroforese em gel de agarose, isolados e purificados através do lllustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healtcare, Carlsbad, CA, EUA).
[0064] Em outro aspecto da invenção as sequências codificadoras das subunidades a ou b da eCG (SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2, respectivamente) foram subclonadas nos vetores pNU1 e pcDNA 3.3, respectivamente. Para o sequenciamento das regiões codificadoras das cadeias aeCG e peCG, utilizou- se os vetores pNU1 -aeCG e pcDNA3.3-peCG, respectivamente, e foram utilizados iniciadores que se alinham ao longo dos vetores de expressão pcDNA 3.3 e pNU-1 , e também aos insertos aeCG e peCG. Através dos cromatogramas originados e do programa SeqMan do pacote DNASTAR, foi realizada a montagem das sequências consenso a partir das sequências individuais obtidas. As sequências consenso foram analisadas no programa BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, Basic Local Alignment Search Tool®, NCBI, U. S. NLM), para verificar a similaridade destas com as sequências consenso das aeCG e peCG de Equus caballus, depositadas no banco de dados do NCBI (NM_001 197093.1 ). As sequências nucleotídicas codificadoras consenso das cadeias aeCG e peCG estão descritas como SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2, respectivamente. Ademais, as sequências nucleotídicas e polipeptídicas das cadeias aeCG e peCG podem ser visualizadas nas Figuras 1 e 2, respectivamente.
[0065] As sequências polipeptídicas das cadeias aeCG e peCG estão descritas como SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.
[0066] As regiões codificadoras obtidas para as cadeias aeCG e peCG podem ser clonadas em qualquer vetor plasmideal que contenha um ou mais promotores fortes, incluindo o promotor de b-actina de galinha e o promotor de citomegalovírus, sítio múltiplo de clonagem bacteriana (MCS, acrónimo em
inglês para Multiple Cloning Site), sequência de resistência a antibiótico para clonagem bacteriana, sítios de recombinação, e o cDNA codificador da enzima diidrofolato redutase (DHFR) à jusante de um sítio interno para entrada de ribossomos (IRES- International ribosomal entry site). Preferencialmente, o vetor plasmideal de expressão adequado para a invenção é o vetor pNU-1 , construído pela própria depositante. Entretanto, outros vetores de expressão, contendo elementos funcionais similares, podem ser utilizados, como, por exemplo, o vetor pcDNA 3.3, ou outros vetores da família pcDNA.
[0067] O vetor pNU1 é derivado do vetor pUC18 (MESSING E VIEIRA, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 1982 Oct;19(3):259-68), e possui um cassete de clonagem MCS contendo diversos sítios para enzimas de restrição, sendo que as sequências de DNA codificadoras inseridas no MCS estão funcionalmente ligadas e sob o controle de um promotor híbrido contendo elemento enhancer de citomegalovírus e promotor de b-actina de galinha, bem como o cDNA codificador da enzima diidrofolato redutase (DHFR) à jusante de um sítio interno para entrada de ribossomos.
[0068] Esta estrutura permite a expressão concomitante do inserto clonado no MCS, no caso a aeCG, ou a peCG, e do DHFR, visando a complementação gênica de células CHO duplo negativo para o gene DHFR, que, por sua vez, permite a seleção de células expressando altas quantidades do produto de interesse após amplificação gênica, realizada através de tratamento com doses crescentes de inibidores de DHFR.
[0069] Em uma realização particular da presente invenção, procedeu-se à cotransfecção estável dos vetores pcDNA3.3-peCG e pNU1 -aeCG nas células CHO-DG44 para a geração de clones celulares expressando estavelmente a proteína heterodimérica reCGa+b.
[0070] A inserção dos vetores plasmideais de expressão na célula de interesse (cotransfecção) pode ser realizada por diversas técnicas usualmente empregadas no estado da técnica. Dentre elas, diversos tipos de transfecção,
como por exemplo, por meio de moléculas catiônicas, transfecção mediada por cálcio, PEI, eletroporação e nucleofecção.
[0071] Com o objetivo de se obter o heterodímero reCGa+b, pode-se empregar diferentes alternativas para a co-expressão das subunidades aeCG e peCG. Assim, de forma ilustrativa e não limitativa, pode-se empregar diferentes vetores de expressão para co-expressar as diferentes subunidades da proteína reCG, como, por exemplo, o vetor de expressão pcDNA3.3 para expressar a subunidade peCG, e o vetor de expressão pNU1 para expressar a subunidade aeCG. Nesse exemplo em particular, os vetores pNU1 e pcDNA3.3 possuem marcas diferentes de seleção de transfectantes celulares estáveis, ou seja: a DHFR, no caso do vetor pNU1 , e a Neomicina Fosfotransferase II (NPTII) no caso do vetor pcDNA3.3, o que facilita o processo de seleção de co- transfectantes estáveis positivos, produzindo as duas subunidades simultaneamente. A co-transfecção estável dos vetores pcDNA3.3-peCG e pNU1 -aeCG pode ser executada empregando-se diferentes relações molares dos respectivos vetores, como por exemplo, 2:1 , ou ainda 1 :2, ou preferencialmente 1 :1.
[0072]Como a eCG é uma molécula complexa, apresentando em torno de 45% de sua massa molecular consistindo de modificações pós-traducionais (glicosilação), faz-se necessário o uso de um sistema de expressão robusto que permita a produção de uma eCG recombinante o mais similar possível em comparação com a eCG do tipo selvagem. O sistema de expressão heterólogo da reCG de acordo com a presente invenção foi escolhido por permitir o processamento correto de cadeias polipeptídicas recém-sintetizadas, o dobramento e a montagem de suas subunidades a e b, além da adição de cadeias de glicanos do tipo complexo, o que é fundamental para que o eCG recombinante produzido tenha atividade biológica. No entanto, existe muita variabilidade nos padrões de glicosilação entre diferentes células de mamíferos, e até mesmo numa mesma linhagem celular de mamíferos, devido ao fato da maquinaria enzimática de adição de oligossacarídeos às proteínas diferir entre as linhagens celulares ou entre sub-fenótipos de uma mesma
linhagem celular, gerando glicoformas com diferentes graus e tipos de glicosilação e atividades biológicas distintas. Devido à grande variabilidade de sub-fenótipos celulares possíveis quanto a composição da rota biossintética de glicosilação, aliada a complexidade do perfil de glicosilação devido aos fenômenos de micro- e macro-heterogeinidade, faz-se necessário o emprego de uma estratégia eficiente de seleção fenotípica.
[0073] Uma realização particular da presente invenção envolve um método para a identificação de sub-fenótipos celulares produzindo uma molécula de reCG com atividade biológica in vivo a partir de uma população celular mista inicial gerada através da co-transfecção estável dos vetores de expressão das cadeias a e b da reCG. O método proporciona uma ligação direta entre eventos de inserção estável dos vetores de expressão das cadeias a e b da reCG no genoma das células hospedeiras e a produção de formas biologicamente ativas da reCG sem a necessidade de manipulação ou conhecimento prévio sobre o repertório ou o perfil de expressão gênica de enzimas particulares da rota biossintética da glicosilação.
[0074] Em um aspecto particular deste método, de acordo com a presente invenção, a resposta biológica tipo eCG é reconhecida através da observação da indução de um crescimento rápido e vigoroso dos tecidos uterinos e ovarianos em ratas imaturas. Assim, amostras de meio condicionado por clones celulares representando diferentes sub-fenótipos celulares são utilizadas para a determinação da atividade biológica in vivo tipo eCG, e, desta forma, identificar os clones produzindo formas de reCG biologicamente ativas.
[0075] As células utilizadas para a expressão da reCG são células de linhagem mamífera ou células de insetos, ou ainda qualquer linhagem celular que seja capaz de proporcionar perfis de expressão gênica das enzimas da rota biossintética da glicosilação compatíveis com a obtenção de formas biologicamente ativas da reCG, ainda que a exata configuração de tais perfis de expressão seja desconhecida. Portanto, qualquer outra linhagem celular que seja capaz de adicionar as modificações pós-traducionais semelhantes ao obtido para o perfil de reCG definido para a presente invenção, e que tenha o
mesmo comportamento quando cultivada in vitro, como por exemplo, capacidade de replicação, capacidade de expressão da proteína, transfectabilidade simples, dentre outros, pode ser utilizada.
[0076] Preferencialmente, foram escolhidas células de linhagem mamífera; mais preferencialmente, células da linhagem CHO, ou delas derivadas. De maneira ainda mais preferida, é utilizada a linhagem CHO-DG44-DHFRv·. Todavia, outros tipos celulares passíveis do mesmo processo de seleção fenotípica, como por exemplo, células da linhagem CHO, BHK, 293, Vero ou seus derivados, são adequados para a invenção e podem substituir as células da linhagem CHO-DG44-DHFR /-
[0077] Para a co-expressão estável das subunidades aeCG e peCG nas células CHO-DG44, a etapa inicial de seleção dos transfectantes celulares estáveis pode ser realizada, por exemplo, através da utilização de meio de cultivo livre de nucleosídeos suplementado com o antibiótico G418, na faixa de concentrações de 200 pg/mL a 1 mg/mL, mais preferencialmente 500 pg/mL. Posteriormente, as populações celulares mistas inicias podem ser submetidas a ciclos de seleção adicionais, após ou não a seleção prévia de subpopulações celulares expressando níveis mais elevados de reCGa+b, empregando-se concentrações crescentes, no intervalo de 5 nM a 100 mM, de inibidores da enzima DHFR, e do antibiótico G418, no intervalo de concentrações de 500pg/mL a 2mg/MI.
[0078] Diversos inibidores de DHFR são conhecidos no estado da técnica e podem ser adequados para uso na invenção. Preferencialmente, o inibidor de DHFR, adequado para a invenção é o Metotrexato (MTX).
[0079] Células deficientes na produção da enzima DHFR, como as células CHO-DG44 DHFR-/-, preferencialmente utilizadas na presente invenção, são adequadas pois elas não conseguem sobreviver quando cultivadas na ausência de nucleosídeos, visto que esta enzima catalisa a redução de diidrofolato a tetraidrofolato. Assim, quando estas células são transfectadas com construções obtidas a partir dos vetores da invenção, que possuem a
sequência gênica correspondente à enzima DHFR, elas se tornam capazes de crescer na ausência de nucleosídeos.
[0080] As células superprodutoras de reCG podem ser cultivadas em bateladas de produção em monocamadas ou em suspensão. Podem ser empregados diferentes reservatórios, tais como garrafas de cultivo de diferentes tamanhos, placas, frascos T, spinners, bolsas de cultivo descartáveis ( bags ) e outros tipos de biorreatores com hélices ou pás arredondadas, fibra oca, dentre outras configurações.
[0081] Os meios de cultivo empregados podem variar desde que eles sejam capazes de suprir as necessidades metabólicas das células. Além disso, as células superprodutoras de reCG podem ser cultivadas na presença ou ausência de soro fetal bovino (FCS). A proporção de soro fetal bovino pode ser adaptada de acordo com as condições de cultivo para manter a viabilidade celular e os níveis de expressão da proteína (de 1 a 100 pg/mL) dentro da mesma ordem de magnitude do padrão original.
[0082] Meios de cultivo quimicamente definidos ou livres de soro e proteínas, contendo substitutos do FCS, tais como fatores peptídicos de crescimento e proliferação celular de diversos tipos, albumina, insulina, entre outros; ou soro fetal ou adulto de outras espécies, e suplementados com precursores utilizados nas vias de glicosilação, também são adequados para serem utilizados na produção de reCG. O cultivo deve ocorrer em condições ambientais definidas, tais como, temperatura de cultivo entre 25 e 40 °C, proporção relativa de CO2 entre 1 e 10%, e pH entre 5,0 e 8,0. Preferencialmente, para a produção do heterodímero reCGa+b, os clones celulares produtores são cultivados em suspensão e em meio de cultivo quimicamente definido. Quando 0 cultivo for realizado em spinners, bags e biorreatores a rotação empregada pode variar entre 10 e 200 rpm.
[0083] Para alcançar maior massa e pureza da proteína de interesse, 0 produto obtido pode ser parcialmente purificado empregando técnicas conhecidas para purificação de proteínas, sendo que os meios de cultura condicionados contendo reCGa+b são submetidos a pelo menos uma das seguintes técnicas:
precipitação de proteínas, como por exemplo, na presença de sulfato de amónio; ultrafiltração; filtração tangencial; ou a dois tipos distintos de cromatografia, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade.
[0084] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é provida uma gonadotrofina coriônica equina recombinante, produzida a partir do processo da presente invenção. Ao contrário das opções comercialmente disponíveis, a gonadotrofina coriônica equina recombinante da invenção é produzida através de mecanismos biotecnológicos em escala industrial oferecendo uma opção alternativa àquelas que são obtidas do plasma equino e envolvem fatores bioéticos. Além disso, a reCG da invenção não enfrentará os problemas encontrados no estado da técnica relacionados à escassez da fonte de origem, constituindo vantajosamente uma nova fonte de fornecimento ininterrupto de reCG.
[0085] Ao produzirmos uma reCG com padrão de glicosilação similar ao das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis e que apresente o mesmo nível de atividade in vivo dos hormônios FSH e LH proporcionamos a obtenção de um produto com atividade biológica, ao menos, semelhante. Essa característica também não é apresentada pelas gonadotrofinas coriônicas recombinantes conhecidas no estado da técnica, as quais sequer apresentavam atividade biológica in vivo.
[0086] Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição veterinária compreendendo:
a) uma quantidade veterinariamente eficaz da reCG produzida de acordo com a presente invenção;
(b) opcionalmente aditivos; e
(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0087] A composição da presente invenção pode compreender, além da reCG da invenção, adjuvantes, preservativos, diluentes, emulsificantes, estabilizantes e outros ingredientes farmacologicamente aceitáveis e que são empregados em preparações de gonadotrofinas para uso animal.
[0088] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere ao uso (a) da reCG ou (b) da composição veterinária da invenção, compreendendo dita reCG, na fabricação de um medicamento para o tratamento de condições veterinárias relacionadas à reprodução e ovulação de animais mamíferos, como agente otimizador da fertilização in vitro; na fabricação de kits para diagnóstico de condições veterinárias e protocolos relacionados à ovulação de mamíferos; e na fabricação de suplemento para o cultivo de células.
EXEMPLOS
G0089Ί Exemplo 1 : Extração de RNA e síntese de cDNA a partir de uma hipófise equina
[0090] Uma glândula hipófise foi obtida através da necropsia de um cavalo ( Equus caballus), macho, raça meio-sangue árabe, de 19 anos e imediatamente acondicionada em RNAholder (Bioagency® Biotecnologia), a 4°C, até ser macerada em nitrogénio líquido, utilizando-se cadinho e pistilo. O RNA total foi extraído deste macerado de hipófise utilizando-se o lllustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare®, Buckinghamshire, England), seguindo as recomendações do fabricante. A concentração e pureza do RNA obtido foram determinadas através de quantificação em nanoespectrofotômetro (ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, EUA) e leitura da relação de absorbância Abs260/Abs280 e Abs260/Abs230 nm.
[0091] Uma alíquota de 1 ,0pg de RNA total de hipófise equina foi utilizado como molde para uma reação de transcrição reversa, utilizando o kit da enzima lmProm™-ll RT (Promega Corporation, Madison, EUA); Super Script II (Invitrogen), sendo as reações realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Ao final, as amostras foram diluídas 3 vezes em água deionizada, obtendo-se um volume final de 60pL e estocadas a - 80QC.
[0092] Exemplo 2: Amplificação das cadeias codificantes para eCG a e 3, a partir desta biblioteca de cDNA, por PCR
[0093] Os primers utilizados para amplificação das sequências de cDNA foram desenhados baseando-se nas sequências codificadoras completas de cada uma das duas subunidades de eCG contidas na base de dados do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov; National Center for Biotechnology Information, U.
S. NLM - U. S. National Library of Medicine, Bethesda, EUA (NM_access number a: 001 099763.1 , b: 001490342.2) e sintetizados pela empresa Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA™ /Thermo Fisher Scientific Inc. Os primers liofilizados foram reconstituídos em solução tampão 1 0mM Tris-CI (pH 8,0) para gerar uma solução estoque a 1 00mM e soluções de uso a 10mM. As sequências dos primers utilizados na amplificação dessas cadeias e seus intermediários obtidos nos passos de Engenharia Genética estão discriminadas na Tabela 1 .
Tabela 1 . Sequências dos primers para amplificação das sequências
codificadoras de reCGa e reCG .
Oligonucleotídeos Sequências (5’- 3’)
1 - eCGb F 5’- AT GG AG ACGCT CCAGGGGCT - 3’
2 - eCGb R 5’- AG AAGT CTTT ATT GGG AGGGG AT G AG AG- 3’
3 - eCGa F 5’-TTT CCT GAT GG AG AGTTT ACAACGCAG- 3’
4 - eCGa R 5’-TT AAAT CTT GT GGT G AT AGCACGTGCT G-3’ .
5 - Mut eCGa R Not\ 5’-GCGCGGCCGCTT AAAT CTT GTT GTGGT G-3’
6 - Mut eCGb F EcoRI 5’-CGGAATTCGCCACCATGGAGACGCTC-3’
7 - union F 5'-CCCAAT AAAG ACTT CTTTT CCT GAT GG AG AG-3’
8 - union R 5’- CT CT CCAT CAGG AAAAG AAGT CTTT ATTGGG-3’
9 -Mut EcoRI eCGa F pep 5’GCGG AATTCGCCACCAT GG ATT ACT ACAGAAAACATGC3’ 10- Mut Notl eCGb R stop 5OGCGCGGCCGCTCAAGAAGTCTTTATTGGGAG3’
Negrito: sítios de restrição para as enzimas EcoRI ( primer forward) e Notl (primer reverse) Sublinhado: sequência consenso de Kozak.
[0094] O cDNA total de tecido hipofisário equino foi utilizado para a amplificação das sequências codificadoras de ambas as subunidades de eCG.
[0095] Os primers (9) e (5) foram utilizados para amplificar a sequência codificadora de eCGp completa, e a sequência codificadora da eCGa completa foi amplificada utilizando-se os primers (6) e (1 0).
[0096] Para a amplificação, as reações de polimerase em cadeia (PCR) foram realizadas utilizando-se a enzima High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA™). A 1 00 ng de amostras de cDNA de hipófise equina foram adicionados 1 X tampão High Fidelity PCR
Buffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 0,2 mM de dNTPs (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 2mM de MgS04 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 400 nM de primer Forward (Thermo Fisher
Scientific Inc., Waltham, EUA), 400 nM de primer Reverse (Thermo Fisher
Scientific Inc., Waltham, EUA), 1 ,0 U da enzima DNA polimerase descrita acima e água deionizada para completar 50,0pL de volume de reação. A reação foi conduzida sob as seguintes condições: 94QC por 1 minuto; 35 ciclos de: 94QC por 30 segundos, 55QC (eCGa) ou 58°C (eCGP) por 30 segundos e 68QC por 1 min; extensão final a 68QC por 2 min.
[0097] Os amplicons foram detectados através de géis de agarose a 2,0%, corados com 0,5pg/mL de brometo de etídeo, e o produto de tamanho esperado foi isolado com bisturi e purificado através do GFX DNA and Band Purification Kit (GE Flealtcare, Carlsbad, CA, EUA), segundo recomendações do fabricante.
Í00981 Exemplo 3: Clonaqem das cadeias eCGa e eCGB nos vetores de expressão pcDNA 3.3 e pNU-1 para células de mamífero
[0099] Para a obtenção do vetor de expressão da cadeia alfa da reCG, pNU1 - aeCG, digeriu-se o fragmento de DNA purificado, previamente obtido a partir de uma reação de PCR com os primers 5 e 9 descritos na Tabela 1 , e contendo a região codificadora da aeCG, com as enzimas de restrição EcoR\ e Noti, seguida de inativação térmica das enzimas. Procedeu-se com a ligação do fragmento de DNA aeCG purificado e o vetor pNU1 co-digerido com as enzimas de restrição EcoR\ e Noti. Alíquotas das reações de ligação foram utilizadas para a transformação de bactérias Escherichia coli cepa DFI10B por eletroporação. Para a seleção das colónias recombinantes contendo o vetor pNU1 -aeCG, utilizou-se o antibiótico ampicilina na concentração de 100 pg/mL.
[00100] A obtenção do plasmídeo recombinante foi confirmada a partir da obtenção do seu perfil de restrição com as enzimas EcoR\ e Noti. A construção do vetor pcDNA3.3-peCG foi realizada através da subclonagem da cadeia eCG presente originalmente no plasmídeo pNU1 - eCG. Para tanto, digeriu-se o vetor pNU1 -peCG com as enzimas de restrição Xba\ e Mss\ para a liberação
da região codificadora da peCG e sua purificação por eletroforese em gel de agarose e adsorção à sílica. Procedeu-se com a ligação do fragmento de DNA PeCG purificado e o vetor pcDNA3.3 co-digerido com as enzimas de restrição Nhe\ e Mss\. Alíquotas das reações de ligação foram utilizadas para a transformação de bactérias Escherichia coli cepa XL1 -Blue por eletroporação. Para a seleção das colónias recombinantes contendo o vetor pcDNA3.3-peCG, utilizou-se o antibiótico ampicilina na concentração de 100 pg/mL. A obtenção do plasmídeo recombinante foi confirmada a partir da obtenção do seu perfil de restrição com a enzima Mlu\.
[00101] Os vetores pNU1 -aeCG e pcDNA3.3-peCG foram caracterizados por sequenciamento de DNA automatizado, utilizando o kit Big Dye® (Thermo Fisher Scientific™) e o sequenciador ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Thermo Fisher ScientificTM), e diversos iniciadores que se alinham ao longo dos vetores de expressão pNU1 e pcDNA3.3, e nos insertos aeCG e peCG. A montagem das sequências consenso dos vetores pNU1 -aeCG e pcDNA3.3-peCG foi realizada a partir das sequências individuais obtidas, utilizando-se o programa SeqMan do pacote DNASTAR. O mapa esquemático dos vetores de expressão pNU1 -aeCG e pcDNA3.3-peCG estão representados nas Figuras 1 e 2, respectivamente.
[00102] Exemplo 4: Co-transfeccão estável por lipofeccão das construções pcDNA 3.3-3eCG e pNU1 -aeCG em células CFIO-DG44 cultivadas em suspensão e mantidas em meio definido.
[00103] As células CFIO-DG44 cGMP utilizadas para a co-transfecção estável das cadeias aeCG e eCG fazem parte do sistema Freedom DG44 (Invitrogen®). As células foram cultivadas, segundo as recomendações do fabricante, em suspensão e sob agitação (100-120 rpm), em frasco tipo “Spinner” contendo 30ml_ de meio CD DG44 suplementado com 8mM de L- glutamina e 0,18% de Pluronic, em atmosfera úmida a 37°C e 8%C02. A cada 3 ou 4 dias, o cultivo celular foi avaliado quanto à sua densidade celular e porcentagem de células viáveis, e subcultivado para uma densidade de cerca de 3x105 células viáveis/mL.
[00104] Os vetores pNU1 -aeCG e pcDNA3.3-peCG foram linearizados com a enzima de restrição Pvu\ para otimização do processo de inserção dos cassetes de expressão de interesse no genoma das células CHO-DG44. Após linearização, os plasmídeos foram purificados por precipitação e quantificados por espectrofotometria. Para a co-transfecção, 9pg de cada plasmídeo foram misturados a 600mI_ de meio OptiPro SFM (Invitrogen). Em paralelo, 15 pL do reagente FreeStyle Max Reagent (Invitrogen) foram misturados a 600 mI_ de meio OptiPro SFM (Invitrogen). Em seguida, as duas misturas foram combinadas e incubadas por 10min à temperatura ambiente, para permitir a formação dos complexos. Posteriormente, a mistura de DNA e reagente FreeStyle foi gotejada nas células (1 ,15 x 107 células viáveis) agitando-se suavemente a suspensão. Em seguida, o cultivo foi mantido em incubadora à 37°C e 8% CO2.
[00105] Exemplo 5: Seleção dos transfectantes estáveis a partir das células CFIO-DG44 co-transfectadas estavelmente com os vetores de expressão pcDNA 3.3-3eCG e pNU1 -aeCG
[00106] Cerca de 48h após a co-transfecção as células foram transferidas para 0 meio de seleção (OptiCFIO suplementado com 8mM de glutamina e 500pg/mL de G418). Após cerca de 20 dias de cultivo em meio de seleção, obteve-se uma sub-população celular resistente ao meio de seleção e, portanto, portadoras de pelo menos uma cópia de cada um dos vetores de interesse integrados no seu genoma.
[00107] O meio condicionado por 96h desta população mista original foi coletado para avaliação da produtividade de reCGa+b através de um ELISA específico ( kit Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG), seguindo 0 manual provido pelo fabricante. Os valores de absorbância foram determinados a 450nm por leitura em um espectrofotômetro de placa (SpectraMax M2 - Molecular Devices). Uma curva padrão, fornecida pelo kit, foi utilizada como referência para uma análise logística de 4-parâmetros. Normalizou-se a concentração de reCG nos meios de cultura pelo número de
células viáveis no momento da coleta. Obteve-se a produtividade de 1 ,3UI/mL/milhão de células viáveis na população mista inicial.
[00108] Exemplo 6: Enriquecimento celular a partir da população mista CHO-DG44 eCGa + eCGB baseado nos níveis de expressão do reCG
[00109] O protocolo de enriquecimento foi realizado por diluição seriada da população mista CHO-DG44 cGMP pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG em meio de cultura (FortiCHO + L-glutamina 6mM + suplemento HT 1 X + 10% de meio condicionado por 96 horas pela população celular mista original) até a obtenção de uma concentração teórica de 2 células viáveis em 200mI_ de meio. Essas células foram semeadas em poços de placa de 96 poços, e colocadas para crescer em incubadora a 37°C e 5% de CO2 por até 25 dias. O protocolo descrito gerou 10 populações, que foram expandidas até a obtenção de cultivos em volume de 5mL. Os meios condicionados por 96h dessas populações foram coletados, e avaliados quanto à sua produtividade por ELISA ( kit Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG) para a validação do enriquecimento obtido (Figura 5). O ensaio foi realizado com meios de cultivo condicionados e recém coletados, diluídos 100X no diluente do kit (Zero Standard). Como controle negativo, utilizou-se 0 meio condicionado por 96 horas pelas células CFIO-DG44 transfectadas estavelmente com 0 vetor pNU1 - EYFP. Normalizou-se a concentração de reCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta.
[00110] Na Figura 5, pode-se observar que 0 protocolo de enriquecimento da população mista CFIO DG44 cGMP pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG gerou três populações enriquecidas em células produtoras de reCG, a saber: as populações enriquecidas D7, E9 e F9, que expressam cerca de 2, 2,5 e 5 vezes mais reCG, respectivamente, do que a população mista original.
[00111] Exemplo 7: Enriquecimento de suboopulacões celulares com níveis mais elevados de expressão do reCG a partir da seleção das populações celulares enriquecidas CFIO-DG44 eCGa + eCGB E9 e F9 com doses crescentes de MTX e G418
[00112] Efetuou-se uma segunda etapa de seleção das populações mistas enriquecidas CHO DG44 cGMP D7 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG), CHO DG44 cGMP E9 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) e CHO DG44 cGMP F9 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) adicionando-se ao meio de cultivo (OptiCHO suplementado com 8mM de Glutamina) 30nM de MTX e 750pg/mL de G418 até a obtenção de populações celulares resistentes a essas doses dessas drogas, ou seja, populações com viabilidade celular superior a 85%.
[00113] A avaliação da produtividade das populações celulares geradas durante o protocolo da segunda etapa de seleção com MTX e G418 foi realizada utilizando-se o kit de ELISA anti-PMSG ( Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - Alpcó), de acordo com as orientações do fabricante. Como controle negativo, utilizou-se o meio condicionado por 96h pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1 -EYFP. Normalizou-se a concentração de reCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta. Os resultados estão representados na Figura 6.
[00114] Na Figura 6, pode-se observar que a segunda etapa de seleção com MTX e G418 permitiu a seleção de subpopulações celulares com produtividades superiores àquelas das populações enriquecidas originais. Entre elas, destaca-se a subpopulação mista CHO DG44 cGMP E9 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) 30nM MTX + 750pg/mL G418 (30/750), cujo aumento na produtividade foi cerca de 9x em relação à população enriquecida original. As outras subpopulações celulares tiveram incremento na produtividade da ordem de 3x maior que as populações enriquecidas originais.
[00115] Exemplo 8: Isolamento de clones celulares com níveis mais elevados de expressão do reCG a partir das populações celulares enriquecidas CHO-DG44 eCGa + eCGB E9 e F9 30 MTX/750 G418
[00116] O isolamento de clones celulares foi realizado conforme recomendado no manual do distribuidor do sistema FreedomTM [Freedom™ DG44 Kit - For transfection of CHO DG44 Cells (cGMP banked) and development of stable cell lines for protein production - Publication Part Number
MAN0003649 - Revision Date 27 April 201 1 , pgs 53 a 57] Foi realizada uma diluição seriada dos cultivos celulares das populações enriquecidas CHO DG44 cGMP E9 30/750 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) e CHO DG44 cGMP E9 30/750 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) de forma que, ao final desse procedimento, obtivéssemos uma suspensão celular de concentração teórica de 37,5 células viáveis/mL.
[00117] Distribuiu-se 20mI_ dessas suspensões celulares por poço de placas de 384 poços de cultivo não aderente. Dessa forma, a densidade celular por poço ficou, teoricamente, 0,75 célula/poço. O meio de cultivo utilizado durante o isolamento dos clones consistiu de FortiCHO, L-glutamina 6mM, suplemento HT 1 X, 1 mM de Piruvato de sódio, e 10% de meio condicionado por 96 horas pela respectiva população celular mista. A placa de 384 poços foi mantida em uma incubadora a 37QC e 5% CO2.
[00118] Cerca de 2h após 0 plaqueamento, avaliou-se 0 número de células por poço ao microscópio, verificando-se que parte dos poços que continham células, possuíam uma única célula. O crescimento celular foi avaliado a cada três ou quatro dias. Os clones que atingiram uma densidade celular na faixa de centenas de células/poço foram inicialmente transferidos para poços de uma placa de cultivo para células não aderentes de 96 poços, posteriormente, para poços de uma placa de cultivo para células não aderentes de 24 poços, e, finalmente para garrafas T25 não aderentes, em condições regulares de cultivo, ou seja, em meio OptiCHO suplementado com 8mM de glutamina, e mantidos a 37QC e 8% CO2. Foram obtidos nove clones a partir da população enriquecida CHO DG44 cGMP E9 30/750 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG) e 10 clones a partir da população enriquecida CHO DG44 cGMP F9 30/750 (pNU1 -aeCG + pcDNA3.3-peCG).
[00119] Avaliou-se a produtividade da reCGa+b dos clones isolados por ELISA específico para eCG ( Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - Alpcó), de acordo com as orientações do fabricante. Para a realização do ensaio, utilizou-se os meios de cultivo condicionados por 96 horas e recém coletados. Como controle negativo, utilizou-se 0 meio condicionado por 96
horas pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1 - EYFP. Normalizou-se a concentração de eCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta. Os resultados estão representados na Figura 7. Foi obtido um clone com produtividade aproximadamente 28 UI/mL/milhão de células viáveis (clone D3 pnapcb).
Exemplo 9: Caracterização estrutural da reCGa+b por Western blot
[00120] A técnica de Western blot foi utilizada para a caracterização estrutural especifica das moléculas de eCG produzidas de forma recombinante, tanto na sua forma fusionada reCGpa, quanto do heterodímero reCGa+b. Amostras de meio condicionado por 96h foram coletados a partir do cultivo das células CFIO-DG44 cGMP paeCG E1 1 -300nM, produtoras da forma fusionada reCGpa, das células CFIO-DG44 cGMP a+b D3 pnapcb, produtoras do heterodímero reCGa+b, e de células CFIO-DG44 cGMP EYFP (controle negativo). A quantificação de eCG nas amostras foi realizada pelo método de ELISA anti-PMSG (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG). Posteriormente, as amostras e o controle positivo (Novormon) foram concentrados por ultrafiltração (Filtro Amicon Ultra 0,5 10K) para um título final de 8000 UI/mL. O volume de meio condicionado do controle negativo utilizado foi calculado de forma que representasse proporcionalmente o número de células viáveis presentes no momento da coleta das células CHO-DG44 cGMP babqΰ E11 -300nM, e o volume utilizado para a análise de 75UI de reCG. Posteriormente, o volume calculado do controle negativo foi concentrado pelo mesmo fator de concentração utilizado para a amostra E1 1 -300nM. Três diferentes quantidades de eCG (25, 50 e 75UI) foram avaliadas por eletroforese (12% SDS-PAGE) em condições não redutoras e sem desnaturação prévia por calor. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose por transferência úmida por duas horas. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com solução de 5% de leite desnatado em TBS- Tween 0,05% por uma hora. Em seguida, a membrana foi marcada por uma hora com o anticorpo primário anti-PMSG (AP02036SU-N - Acris) diluído 1 :2000 em solução de bloqueio, e incubada a temperatura ambiente.
Posteriormente, foram realizadas três lavagens de 10min cada da membrana com solução de TBS-Tween 0,05%, e, posteriormente, incubou-se a membrana por 45min com o anticorpo secundário anti-lgG de coelho (anti-rabbit conjugado com HRP - horseradish peroxidase - Sigma-Aldrich #A4914) diluído em solução de bloqueio na diluição de 1 :2.000. Após três lavagens de 10min cada com TBST, a membrana foi incubada por 5min com o substrato da enzima peroxidase, e o sinal luminescente foi registrado em filme radiográfico.
[00121] A reCGpa produzida pelo clone E1 1 -300nM e a reCGa+b produzida pelo clone D3 pnapcb apresentaram imunorreatividade ao anticorpo anti-eCG utilizado (Figura 8). Adicionalmente, determinou-se que a reCGpa produzida pelo clone E1 1 -300nM possui peso molecular aparente de aproximadamente 40 KDa, e que a reCGa+b produzida pelo clone D3 pnapcb apresenta peso molecular aparente de 45 kDa em condições não redutoras e sem desnaturação prévia por calor (Figura 8).
[00122] Exemplo 10: Purificação da reCGa+b por cromatoqrafia de troca catiônica
[00123] A cromatografia de troca catiônica foi realizada a partir do meio de cultivo OptiCFIO condicionado por 96h pelo clone celular CFIO-DG44 cGMP aeCG + bbqΰ D3 pnapcb. Antes do início do procedimento de purificação, ajustou-se o pH do meio condicionado para 6,5 através da adição de HCI 10%, que foi então filtrado em filtro de 0,45pm. A cromatografia de troca catiônica foi realizada empregando-se a coluna comercial Hitrap SP Fast Flow (partículas de 90 miti, dimensão de 16 x 25mm, 5mL de volume) com auxílio do sistema cromatográfico Akta Purifier UPC 100 e programa Unicom 5.31 (GE Flealthcare, Uppsala, Sweden). O canal A1 foi alimentado com o tampão NaCI 0,1 M e 8mM Acetato de sódio pH 3,5, o canal A2 com o tampão Na2FIP04 0,1 M pH 4,4, o canal B1 com o tampão NaCI 0,8M e 8mM Acetato de sódio pH 3,5, e o canal B2 com o tampão NaCI 2M e Tris 20mM pH 7. Ao longo da cromatografia, utilizou-se um fluxo de 2 mL/min. Iniciou-se o procedimento com o equilíbrio da coluna com 15 mL de meio OptiCFIO com o pFH ajustado para 6,6 com HCI 10% v/v. Após injeção da amostra, seguiu-se com a primeira
(tampão A1 ) e a segunda (tampão A2) etapas de lavagem, utilizando 5 volumes de coluna (VC) por lavagem. A eluição foi realizada em regime isocrático, em fluxo de 2 mL/min, utilizando-se 5 VC do tampão na linha B1 , e na sequência foi realizada a lavagem e reconstituição da coluna com 3 VC do tampão na linha B2. Durante o procedimento, coletou-se a fração correspondente a segunda fração de 5 mL referente a etapa de eluição. A Figura 9 representa o perfil eletroforético típico obtido da reCGa+b purificada, observado após fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida 12% não desnaturante, seguido de coloração com prata.
[00124] Exemplo 1 1 : Análise do perfil de glicosilacão da reCG
[00125] A metodologia utilizada para avaliação qualitativa do perfil de glicosilação presente na reCGa+b foi adaptada em relação àquela descrita por Legardinier e colaboradores (LEGARDINIER et al., Mammalian-like nonsialyl complex-type N-glycosylation of equine gonadotropins in Mimic insect cells. Glycobiology. 2005 15(8): 776-90), e que se baseia na utilização de um painel de lectinas para detecção de resíduos específicos das cadeias oligossacarídicas na molécula de reCG. Ela envolve, primeiramente, a imobilização das proteínas purificadas a serem analisadas em poços de placa de 96 poços quimicamente tratada para otimização da adsorção proteica (NUNC-lmmuno Plate/ MaxiSorp-NUNC) e posterior sondagem por lectinas que reconhecem especificamente diferentes estruturas de glicanos.
[00126] Cerca de 200 pg das proteínas purificadas produzidas pelo clone D3 pnapcb foram diluídos em tampão carbonato de sódio 0,1 M pH 9,6, e dispensados em poços da placa anteriormente mencionada. A imobilização foi realizada em câmera úmida por cerca de 16 horas. Após esta etapa, os poços foram lavados com solução fosfato salina sem Ca2+ e Mg2+ (PBSA), e bloqueados com tampão TBS + 0,05% Tween20 + 2% Polivinilpirrolidona K30 por 2 horas a 4°C.
[00127] Após nova lavagem, foi realizada a etapa de ligação das lectinas a resíduos específicos das cadeias laterais de glicanos. Foi utilizado um painel de cinco lectinas conjugadas à digoxigenina, e que são componentes de um kit
comercial (D/G Glycan Differentiation Kit Roché). As lectinas conjugadas utilizadas, e os respectivos resíduos de glicanos reconhecidos estão resumidos na Tabela 2 abaixo:
Tabela 2: Painel de lectinas utilizado para caracterização do perfil de
glicosilação da reCGa+b.
[00128] A etapa de ligação das lectinas é seguida por uma etapa de lavagem, e, na sequência, a etapa de incubação com um anticorpo anti- digoxigenina conjugado à enzima fosfatase alcalina, mais uma etapa de lavagem, seguida da etapa de detecção, utilizando-se o substrato da enzima fosfatase alcalina BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato). A reação é interrompida com EDTA e a leitura espectrofotométrica é realizada à 600nm. Como controle negativo, utilizou-se o meio condicionado por 96h pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1 -EYFP, o qual foi
submetido ao mesmo protocolo de purificação utilizado para a purificação da reCG, conforme descrito acima. Como controle positivo, utilizou-se 200 ng de eCG (Novormon). O ensaio foi realizado em duplicata para cada lectina. Os resultados estão representados na Figura 10.
[00129] O padrão observado para o controle positivo Novormon indica que a molécula de eCG selvagem apresenta um perfil de glicosilação que inclui sialilação terminal nos resíduos O- e N-ligados (lectinas SNA e MAA), compatível com aquele descrito na literatura (LEGARDINIER et al., Mammalian-like nonsialyl complex-type N-glycosylation of equine gonadotropins in Mimic insect cells. Glycobiology. 2005 15(8): 776-90). Em relação à reCGa+b produzida pelo clone D3 pnapcb, podemos observar um padrão incompleto de glicosilação, com ausência da sialilação terminal nos resíduos O- e N-ligados (lectina DSA), indicando a terminação da cadeia de glicanos na unidade dissacarídica Gal-(1 -4)GlcNAc nas cadeias de glicanos N- e/ou O-ligadas, e/ou a terminação da cadeia de glicanos na unidade monossacarídica GlcNAc como resíduo terminal O-ligado.
[00130] Exemplo 12: Avaliação da atividade biológica in vivo da reCGa+3
[00131] Todos os experimentos envolvendo animais, bem como métodos adotados para criação e formas de manutenção e experimentação, seguiram as normas do Comité de Ética em Experimentação Animal (CEUA) do Instituto de Química da USP. O estudo foi conduzido através do ensaio recomendado pela Farmacopeia Britânica, descrito por Cole & Erway (Cole and Erway, 1941 ). Os animais foram organizados em grupos de 5 a 10 animais por caixa, recebendo água e ração esterilizadas e ad libitum, e mantidos em períodos de 12h de luz e 12h de escuridão, a 22°C constantes. O ensaio para avaliação da atividade biológica in vivo da eCG se baseia na determinação do efeito dose- resposta do hormônio nos pesos ovariano e uterino de ratas pré-púberes. Para a avaliação funcional in vivo da reCGa+b recombinante produzida pelo clone celular D3 pnapcb, utilizou-se tanto amostras de meio de cultivo condicionado
por 96h por estas células (Figura 1 1 ), bem como uma preparação da reCGa+b purificada por cromatografia de troca catiônca a partir de amostra de meio condicionado por 96 pelo clone D3 pnapcb (Figura 12). Adicionalmente, avaliou-se a atividade biológica in vivo da reCG presente em amostras de meio condicionado por 96h por clones produtores adicionais (clones F22, L2, L13, I8D14 e I14D14) (Figura 13). As amostras de meio condicionado foram concentradas por ultrafiltração, utilizando-se colunas Vivaspin 20MI e de corte de 10kDa (GE Flealthcare). Após a etapa de concentração, estimou-se a quantidade reCGa+b por ELISA nas amostras de meio condicionado concentradas e na preparação purificada da reCGa+b, e procedeu-se com a injeção subcutânea da reCGa+b em ratas da linhagem Sprague-Dawley de idade entre 23 e 25 dias. Para obtenção da curva dose-resposta, foram utilizadas as doses de reCGa+b de 1 ,14, 2,28, 5,71 , 1 1 ,4, 22,8 e 45,7 pg, diluídas em PBSA (diluente). Para o produto comercial de referência, eCG obtido a partir de plasma de éguas prenhes (Novormon), empregou-se as doses de 1 ,14, 2,28, 5,71 e 1 1 ,4 pg, diluídas em PBSA. Como controle negativo, procedeu-se com a injeção do veículo. As injeções foram realizadas em 5 animais por dose ou grupo experimental, e, cerca de 72 horas após a injeção, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, e os ovários e úteros foram dissecados, secos e pesados. A resposta final para cada dose foi obtida através da média aritmética do peso dos órgãos (ovários ou úteros) dos cinco animais de cada ponto. O aumento no peso destes órgãos, comparativamente aos controles negativos, corresponde à resposta biológica do animal ao estímulo com eCG. Relativo ao clone D3 pnapcb, as Figuras 11 A (amostras de meio condicionado) e 12A (amostras de reCG purificada) representam os perfis das respostas ovariana e uterina frente ao estímulo com diferentes doses de reCGa+b avaliadas, as Figuras 11 B (amostras de meio condicionado) e 12B (amostras de reCG purificada) representam os aspectos morfológicos dos ovários e úteros frente as diferentes situações experimentais exploradas, e as Figuras 1 1 C (amostras de meio condicionado) e 12C (amostras de reCG purificada) as curvas dose-resposta obtidas para os
ovários, que foram obtidas por regressão logística de 4-parâmetros, realizada pelo software GraphPad Prisma 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego Califórnia USA, www.graphpad.com), e utilizadas para o cálculo da dose efetiva (DE-50 ou ED-50) para a reCGa+b (clone D3 pnapcb) e o Novormon. Pode-se observar que o tratamento com a reCGa+b (clone D3 pnapcb) apresentou um perfil de resposta uterina e ovariana muito similar àquele observado após tratamento com o produto de referência, com uma razão das ED50 dos dois hormônios de aproximadamente 2. Entretanto, o mesmo padrão de respostas ovarianas não foi observado a partir de amostras de meio condicionado de outros clones (Figura 13, clones F22, L2, L13, I8D14 e I14D14), sendo que inclusive, para um deles (clone F22), apesar de apresentar uma produtividade volumétrica de reCG (-20UI/106 células/96 horas) similar à de outros clones, o reCG produzido por este clone não apresentou atividade biológica in vivo alguma. Estes resultados demonstram a heterogeneidade de formas da reCG produzidas por diferentes clones celulares, e como a utilização da ferramenta de varredura clonal baseada na observação da indução de um crescimento rápido e vigoroso dos tecidos uterinos e ovarianos em ratas imaturas é imprescindível para a identificação de configurações da molécula de reCG com atividade biológica in vivo.
[00132] Exemplo 13: Ensaio clínico realizado em vacas em anestro
[00133] Um ensaio clínico foi realizado em vacas em anestro com o produto reCGa+b produzido pelo clone D3 pnapcb. O estudo envolveu 40 fêmeas bovinas Nelore (Bos taurus indicus) e/ou mestiças (Bos taurus taurus X Bos taurus indicus) com idade entre 16 meses e 10 anos, peso compatível com a categoria e escore de condição corpórea (ECC) >2,5 (escala de 1 a 5). Os animais foram mantidos em piquete de Bracharia brizantha com lotação de 1 UA/ha em sistema de pastejo contínuo durante o período experimental e tiveram acesso livre a água e ao sal mineral.
[00134] Foram incluídos no estudo animais que não apresentavam doenças reprodutivas; não receberam nenhum tipo de procedimento reprodutivo (inseminação, cobertura ou colheita de embriões) 28 dias antes do
início do experimento; estavam clinicamente saudáveis ao início do período experimental e não receberam quaisquer tratamentos de doenças nos 10 dias anteriores ao estudo; não tinham recebido administração de qualquer produto hormonal nos 30 dias precedentes ao estudo; apresentavam escore de condição corporal acima de 2,5 (escala de 1 a 5, AYRES et. al., Validation of body condition score as a predictor of subcutaneous fat in Nelore (Bos indicus) cows. Livest. Sei. 2009; 123:175-179). Para ser incluído no estudo um dos ovários do animal deveria apresentar folículo dominante.
[00135] As 40 fêmeas recrutadas, foram distribuídas em quatro grupos de tratamentos (CB050-1000 - reCGa+b 1000UI, CB050-2500 - reCGa+b 2500UI, Controle Negativo - salina e Controle Positivo Novormon 1000UI), de forma que cada grupo continha 10 animais. Os animais dos grupos tratados com as formulações CB050, preparada através da concentração da proteína reCG contida no sobrenadante da cultura de células por ultrafiltração, receberam uma dose única de 1000 UI (CB050-1000) ou 2500 UI (CB050-2500) de reCG via intramuscular, oito dias após o início do protocolo de sincronização da ovulação. Os animais do grupo“Controle Positivo” receberam uma única dose de 1000UI/animal, por via intramuscular, 8 dias após o início do protocolo de sincronização da ovulação. Os animais do grupo “Controle Negativo” receberam uma única dose de 5mL de solução fisiológica estéril.
[00136] No dia do início do estudo (D0), os animais foram avaliados quanto ao escore de condição corporal, estado geral de saúde e avaliação reprodutiva via ultrassonografia transretal. Nesse mesmo dia (D0), iniciou-se o protocolo de sincronização da emergência da onda folicular. A sincronização consistiu na administração intramuscular de 2mg de benzoato de estradiol, 530pg de cloprostenol sódico juntamente com a inserção de um dispositivo intravaginal contendo 1 g de progesterona. Cinco dias após o início do protocolo (D5) as fêmeas foram homogeneamente distribuídas de acordo com a idade, escore de condição corporal, presença de corpo lúteo e população folicular no D0 em 4 grupos experimentais, com 10 animais cada, conforme descrito acima. Nesse momento, os animais foram distribuídos em grupos, onde receberam os
tratamentos (1000UI ou 2500UI de reCG da invenção; 1000UI de Novormon ou 5 ml_ de controle negativo). Oito dias depois (D8), o dispositivo intravaginal de progesterona foi removido e todos os animais receberam por via intramuscular, 530pg de Cloprostenol sódico (PGF) e 1 mg de cipionato de estradiol.
[00137] As avaliações ultrassonográficas (Kai Xin, KX 5100, Xuzhou KaiXin Electronic Instrument Company Ltd, China; Figura 10) foram realizadas em todos os animais do estudo, nos momentos: seleção dos animais (D0) e no D8 para avaliação da quantidade de folículos grandes, soma da quantidade de folículos médios e grandes, taxa de superestimulação 1 (soma de folículos grades por fêmea) e taxa de superestimulação 2 (soma de folículos médios e grandes por fêmea).
[00138] Pode-se observar na Figura 14, que as respostas quanto à quantidade de folículos grandes, à soma da quantidade de folículos médios e grandes, e às taxas de superestimulação 1 e 2 associadas ao tratamento com 2500UI de reCG foi praticamente idêntica àquela observada nos animais tratados com 1000UI de eCG comercial (Novormon), atestando a atividade biológica in vivo àa reCG em uma das espécies-alvo (vacas).
Claims
1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
(a) preparar e obter sequências de DNA codificadoras das cadeias a e b da reCG,
(b) inserir as ditas sequências de DNA codificadoras em vetores de expressão, de tal forma que as ditas sequências de DNA codificadoras estejam funcionalmente ligadas a elementos promotores da transcrição gênica,
(c) manipular geneticamente uma linhagem celular de interesse envolvendo a inserção genômica, em uma mesma célula, de um primeiro vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia a da reCG, e de um segundo vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia b da reCG,
(d) Co-transfectar estavelmente os vetores de expressão das cadeias a e b da reCG na linhagem celular de interesse de forma a gerar populações celulares mistas expressando independentemente a primeira e a segunda sequências de DNA mencionadas, de tal forma que as cadeias polipeptídicas a e b sejam produzidas como moléculas separadas em uma mesma célula da linhagem celular de interesse mencionada,
(e) isolar sub-fenótipos ou clones celulares a partir de uma população celular mista inicial gerada através da co-transfecção estável dos vetores de expressão das cadeias a e b da reCG,
(f) identificar clones ou sub-fenótipos celulares associados à produção de formas biologicamente ativas da reCG através da avaliação da presença de atividade biológica tipo eCG em amostras de meio de cultivo condicionado por clones celulares representando diferentes sub-fenótipos celulares, sendo a atividade biológica tipo eCG reconhecida através da observação da indução de um crescimento rápido e vigoroso dos tecidos uterinos e ovarianos em ratas imaturas,
(g) cultivar o clone celular geneticamente modificado expressando a
reCG biologicamente ativa, e
(h) recuperar a reCG biologicamente ativa a partir do meio de cultivo condicionado pelo clone celular geneticamente modificado.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que as sequências codificadoras das cadeias a e b da reCG estarem definidas nas sequências nucleotídicas SEQ ID N0.1 e SEQ ID NO.2, respectivamente.
3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que as sequências codificadoras das cadeias a e b da reCG estarem clonadas em vetores de expressão diferentes.
4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão da cadeia a da reCG é o vetor plasmideal pNU1.
5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão da cadeia b da reCG é o vetor plasmideal pcDNA 3.3.
6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que a linhagem celular de interesse é derivada de células de mamíferos.
7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a linhagem celular de interesse é a CHO-DG44.
8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que as cadeias polipeptícas a e b da reCG possuem as sequências de aminoácidos definidas nas sequências SEQ ID NO.3 e SEQ ID NO.4 respectivamente, são produzidas pela linhagem celular de interesse, e secretadas pela mesma na forma de um heterodímero com atividade biológica na espécie alvo.
9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que proporciona uma taxa de expressão de reCG na faixa de 1 a 100 mg/L.
10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação é realizada por pelo menos um dentre os seguintes métodos cromatográficos: troca iônica e cromatografia de afinidade, precipitação de proteínas, ultrafiltração ou filtração tangencial.
1 1. GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE
BIOLOGICAMENTE ATIVA, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo processo definido nas reivindicações 1 a 10.
12. GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE
BIOLOGICAMENTE ATIVA, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo fato de que as cadeias polipeptícas a e b da reCG estão completamente ou parcialmente glicosiladas.
13. GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE
BIOLOGICAMENTE ATIVA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as cadeias polipeptícas a e b da reCG estão parcialmente glicosiladas, e contêm a unidade dissacarídica Gal-(1 -4)GlcNAc como resíduo terminal N-ligado e/ou O-ligado, e/ou ainda a unidade monossacarídica GlcNAc como resíduo terminal O-ligado.
14. COMPOSIÇÃO VETERINÁRIA, caracterizada pelo fato de que compreende:
(a) uma quantidade veterinariamente eficaz da reCG definida pelas reivindicações 1 1 a 13;
(b) opcionalmente aditivos; e
(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. USO DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, definida na reivindicação 1 1 , ou da composição veterinária definida na reivindicação 14 contendo dita gonadotrofina, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de condições veterinárias e protocolos relacionados à reprodução e à ovulação de mamíferos.
16. USO DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, definida na reivindicação 1 1 , ou da composição definida na reivindicação 14 contendo dita gonadotrofina, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de kit de diagnóstico de condições veterinárias e protocolos relacionados à reprodução e à ovulação de mamíferos.
17. USO DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE
BIOLOGICAMENTE ATIVA, definida na reivindicação 1 1 , ou da composição definida na reivindicação 14 contendo dita gonadotrofina, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de suplemento para o cultivo de células.
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