CN102656182B

CN102656182B - 纯化糖蛋白的方法

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Publication number: CN102656182B
Application number: CN201080056651.2A
Authority: CN
Inventors: S·戈勒兹; L·施特克尔
Original assignee: Glycotope GmbH
Current assignee: Cantonbio Co ltd
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: AU2010324104B2; PL2504350T3; CN102656182A; KR101860830B1; EP2504350A1; WO2011063943A1; DK2504350T3; AU2010324104C1; US8846344B2; JP2013511481A; ES2626248T3; EP2504350B1; CA2781132A1; LT2504350T; US20120252069A1; KR20120089755A; EP2325194A1; JP5840135B2; AU2010324104A1

Abstract

本发明涉及纯化糖蛋白的方法，包括对含有所述糖蛋白的液体进行下述步骤：a)反相色谱法，b)尺寸排阻色谱法，和c)疏水相互作用色谱法。还提供产生目的糖蛋白的制备方法。

Description

纯化糖蛋白的方法

本发明涉及纯化糖蛋白，比如FSH(卵泡刺激激素)，LH(黄体化激素)，CG(绒毛膜促性腺激素)和TSH(甲状腺-刺激激素)的方法，以及使用各自的纯化过程制备重组目的糖蛋白。

糖蛋白是含有共价连接至多肽侧链的低聚糖链的蛋白。糖蛋白能够具有非常多样的不同生物学功能，包括结构、保护性、载体、激素或酶功能。相应地，各种糖蛋白能够用作药物。从而，高度希望提供这样的糖蛋白。现今数种糖蛋白能够重组地产生，然而其需要繁复的纯化程序来将靶标糖蛋白自细胞培养收获物中提出。

一类重要的糖蛋白是促性腺激素，四种紧密相关的激素类的家族，其包括FSH，LH，CG和TSH(Glycobiology,vol.13,no.3,pages 179-189,2003)。FSH用于例如在女性和男性患者中治疗不育和繁殖障碍。另外，hCG和LH也用于生育治疗，单独或与FSH组合。

在自然界，FSH通过垂体腺产生。对于药物用途，FSH可以重组地产生(rFSH)，或者其可以分离自经绝后女性的尿(uFSH)。

FSH用于女性患者的排卵诱导(OI)和控制性卵巢过度刺激(COH)的辅助繁殖技术(ART)。在典型的排卵诱导治疗方案中，对患者每日给予FSH或变型(约75至300IU FSH/天)的注射剂，持续约6至约12天的时间段。在典型的控制性卵巢过度刺激治疗方案中，每日对患者给予FSH或变型(约150-600IU FSH/天，但是也低至75IU FSH/天)注射剂，持续约6至约12天的时间段。

FSH也用来诱导罹患精液缺乏的男性的精子发生。用150IU FSH 3次/周与2'500IU hCG两次/周组合的方案已成功实现罹患促性腺激素分泌不足型性腺功能减退症男性的精子计数的改善(Burgues等人;Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulatinghormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of malehypogonadotrophic hypogonadism.Spanish Collaborative Group onMale Hypogonadotrophic Hypogonadism;Hum.Reprod.;1997,12,980-6)。

因为，FSH在治疗生育障碍中的重要性，提供高纯度和高特异活性的FSH是希望的。FSH治疗需要重复注射。高度纯化FSH制剂能够经皮下给予，允许患者自行给药，从而增加患者舒适度和顺从性。

Lynch等人(The extraction and purification of human pituitaryfollicle-stimulating hormone and luteinising hormone ;ActaEndocrinologica,1988,288,12-19)描述纯化人类垂体FSH的方法。该方法牵涉阴离子和阳离子交换色谱法，免疫亲和萃取和尺寸排阻色谱法。

WO 98/20039(IBSA Institut Biochimique SA)描述纯化人类尿FSH的方法，开始于称为人类绝经促性腺激素(hMG)的尿提取物。该方法使用在弱碱性阴离子交换树脂DE[Xi]AE的离子交换色谱法，随后在具有蒽醌衍生物作为配体的树脂上的亲和色谱法。

WO 00/63248(Instituto Massone SA)描述自人尿纯化促性腺激素，包括FSH的方法。该方法牵涉下述步骤：采用磺基丙基类强阳离子树脂的离子交换色谱法，采用强阴离子树脂的离子交换色谱法，和疏水相互作用色谱法(HIC)。

Chiba等人[Isolation and partial characterisation of LH,FSH andTSH from canine pituitary gland;Endocrinol.J.,1997,44,205-218]描述纯化犬垂体促性素，包括FSH的技术，用Concanavalin(Con)A亲和色谱法，疏水相互作用色谱法(HIC)和Cu⁺⁺的固定化金属离子色谱法。

WO 88/10270(Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)描述自尿纯化人类FSH的方法。该方法牵涉免疫色谱，其中FSH-特异性固定化的单克隆抗体通过二乙烯基砜结合至Sepharose 4B，随后反相HPLC。

EP 1106623A1公开通过使用染料亲和色谱法自生物学样品例如人类垂体腺或人类经绝后尿的纯化FSH的方法。

纯化重组FSH的方法公开于WO 2005/063811 A1，WO2006/051070 A1，WO 2007/065918 A2和WO 2009/000913 A1。

WO 2009/000913 A1公开产生FSH的细胞克隆，用该细胞克隆产生FSH并且纯化自细胞培养物上清液获得的重组FSH的方法。纯化可以通过专家已知的一个或多个步骤进行，包括离子交换色谱法，疏水相互作用色谱法，羟基磷灰石色谱法，亲和色谱法和凝胶过滤。

WO 2005/063811 A1公开纯化重组FSH的方法：用步骤(1)离子交换色谱法，(2)固定化金属离子色谱法，和(3)疏水相互作用色谱法。

WO 2006/051070 A1公开纯化重组FSH的方法：用步骤(1)染料亲和色谱法，(2)疏水相互作用色谱法，和(3)反相色谱法，它们可以以任意次序进行。

WO 2007/065918 A2公开纯化重组FSH方法：用步骤(1)染料亲和色谱法，(2)弱阴离子交换色谱法，(3)疏水相互作用色谱法，和(4)强阴离子交换色谱法，它们可以以任意次序进行。

因此，本发明目的是提供优选成本有效的纯化过程，其以高收率和纯度产生糖蛋白比如FSH。

相应地，本发明涉及糖蛋白比如FSH的纯化方法，包括对含有所述糖蛋白的液体进行下述步骤：

a)反相色谱法(RPC)；

b)尺寸排阻色谱法(SEC)；和

c)疏水相互作用色谱法(HIC)。

步骤a)，b)和c)可以以任意次序进行。优选的是，反相色谱法或疏水相互作用色谱法作为三个色谱法步骤中的第一步进行。在更优选实施方式中，反相色谱法作为三个色谱法步骤中的第一步进行。

纯化过程可以任选地包含额外的步骤，例如离子交换色谱法比如阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法，亲和色谱法比如染料亲和色谱法，免疫亲和色谱法，凝集素亲和色谱法或过硼酸盐亲和色谱法，过滤比如透析过滤，超滤或纳米过滤，和/或至少一个病毒灭活步骤。在优选实施方式中，本发明过程包括离子交换色谱法(AEX)作为第四色谱法步骤。

在优选实施方式中，步骤(a)，(b)和(c)以这样的次序进行

(1)反相色谱法，

(2)尺寸排阻色谱法，和

(3)疏水相互作用色谱法。

优选作为第一色谱法步骤进行RPC，原因是该实施方式使得可以选择将相当"粗制的"生物学液体比如粗制糖蛋白、天然来源液体、细胞培养基或细胞溶解产物直接加载于RPC上，任选地描述如下的在清洁(例如过滤)、浓缩和/或缓冲剂交换步骤之后。该实施方式提供的优势是，即使在使用这种样品液体的情况下，能够将高量的样品加载与色谱法柱上，而不存在堵塞或过载柱的危险。另外，RPC需要的缓冲剂条件不会导致样品溶液组分的过度团聚。总体来说，用RPC作为第一色谱法步骤减少了在开始色谱纯化之前所必需的制备步骤数，并且允许使用高量的样品溶液，该样品溶液含有高量的除目的糖蛋白之外的其它组分。

在又一优选实施方式中，在尺寸排阻色谱法(2)之后且在疏水相互作用色谱法(3)之前进行阴离子交换色谱法(d)。如上文描述，除了所述步骤以及在所述步骤之间还可以进行额外的步骤。

本发明的纯化方法提供高纯度的糖蛋白比如FSH，其可以然后配制为药物组合物。纯度通常高于90%，优选>95%w/w，更优选>99%w/w，甚至更优选>99.5%w/w，按总蛋白质计。另外，本发明的纯化方法可容易地放大，甚至达到工业规模，而不需显著改变纯化条件。

形成根据本发明的纯化过程的原料的粗制糖蛋白可以以天然来源提供或者得自天然来源的液体或者通过重组技术比如在含有糖蛋白的细胞培养收获物中得到。一般地，在进行第一色谱步骤之前，得自天然来源或细胞收获物、优选细胞收获物的原料首先进行清洁(例如过滤)，然后任选地浓缩(例如用超滤)和/或进行缓冲剂交换(例如经过透析过滤步骤)。

在色谱法步骤中，使用一般可商购的树脂，优选聚合物类树脂或琼胶糖类树脂。还可能使用膜色谱法，其中树脂用官能化膜比如Sartobind^TM膜(Sartorius)或ChromaSorb^TM(Millipore)替换。

本发明纯化过程的步骤在下文更详细地描述。

反相色谱法步骤(a)

该过程牵涉反相色谱法(a)步骤。在优选实施方式中，特别是在重组糖蛋白的情况下，将反相色谱法用作捕获步骤，其中糖蛋白得以富集，例如自天然来源液体或细胞培养收获物。优选在自RPC柱洗脱之后施行病毒灭活。

"反相色谱法"根据本发明尤其是指这样的色谱法步骤，其中使用非极性固定相和优选极性流动相。在反相色谱法中，通常极性化合物首先洗脱，而非极性化合物得以保留。

反相色谱法通常这样进行：平衡并加载柱，随后洗涤，然后洗脱，各自使用优选含有有机溶剂比如乙腈或异丙醇的缓冲剂。有机溶剂比如异丙醇能够用于在洗脱之后病毒灭活。

平衡、加载、洗涤和洗脱优选通过用这样的流动相进行，其缓冲于弱碱性pH，例如为或约为pH7至8.5，更优选为或约为7.5。在优选实施方式中，缓冲物质是磷酸缓冲剂，优选磷酸钠。适用于pH为或约为7.5的替代缓冲液包括BES，MOPS，乙酸铵，TES，HEPES。

优选，在步骤(a)之后不进行缓冲剂交换，利于随后进行步骤(b)(SEC)的情况。那么，缓冲剂交换能够通过随后SEC实现：通过将后续色谱法步骤比如AEX或HIC色谱法的优选缓冲剂用作运行缓冲剂。

在优选实施方式中，用于RPC步骤的缓冲溶液含有有机溶剂，对于不同色谱法步骤阶段(平衡、加载、洗涤和洗脱)调节其浓度。优选，有机溶剂是可与水混合的有机溶剂比如乙腈或醇(比如甲醇、乙醇等)，更优选异丙醇。

在平衡和加载缓冲溶液中，以及在洗涤缓冲溶液中，有机溶剂优选包含为总缓冲溶液的5至15%v/v的量，优选总缓冲溶液的5至12%v/v的量。洗涤缓冲剂一般地等同于加载缓冲剂。优选地，有机溶剂在洗脱缓冲溶液中比在加载缓冲剂中量更高，优选为总缓冲溶液15至22%v/v的量，更优选总缓冲溶液16至20%v/v的量。

在优选实施方式中，反相色谱法步骤能够包括病毒灭活步骤。病毒灭活可以通过在有机溶剂优选异丙醇或乙醇存在下温育加载至、结合至或洗脱自柱的蛋白质实现。优选选择温育时间和温育温度以引起希望的病毒灭活度，其尤其取决于所用有机溶剂的浓度和性质。另外，这些参数也应取决于待纯化糖蛋白的稳定性进行调节。例如，蛋白质温育至少15分钟，优选至少30分钟，至少45分钟，至少1小时，至少2小时，至少3小时或至少6小时。温育能够在低温比如等于或低于4°C或等于或低于10℃进行，或者其能够在约室温进行。温育能够直接进行：在将样品加载至柱上之后，在洗涤步骤期间或在其之后，在施用洗脱缓冲剂之后但在洗脱糖蛋白之前，或者在洗脱糖蛋白之后。如果异丙醇用作有机溶剂，病毒灭活优选在至少15%(v/v)，优选约18%(v/v)的异丙醇浓度下完成。在该情况下，糖蛋白优选温育约2小时，优选在室温下。优选地，病毒灭活在自反相色谱法柱洗脱糖蛋白之后，优选在所用的洗脱缓冲剂中进行。然而，在自柱洗脱之后，任选地可以将其它组分加入糖蛋白溶液，尤其是用于增强病毒灭活和/或糖蛋白稳定性。在RPC期间用病毒灭活步骤的情况下，则本发明方法可以不用任意其它病毒灭活步骤地进行。然而，各种病毒灭活步骤还可以相组合，例如在RPC期间的病毒灭活和如本文描述的经由纳米过滤和/或经由pH调整的病毒灭活。

在特别优选实施方式中，RPC步骤(平衡，加载，洗涤，洗脱)的产品-接触缓冲液含有抗氧化剂，比如L-甲硫氨酸。另选的抗氧化剂包括叔丁基-4-甲氧基苯酚，2,6-二(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚；焦亚硫酸氢钾或钠，亚硫酸氢钠。

反相柱物质由疏水物质可以连接至的树脂构成。典型的柱物质是二氧化硅和聚苯乙烯；疏水配体可以任选地连接。在经取代树脂的情况下，树脂用疏水配体取代，所述配体一般地选自(但不限于)脂族，比如C₂，C₄，C₆，C₈，C₁₀，C₁₂，C₁₄，C₁₆，或C₁₈或它们的衍生物例如氰基丙基(CN-丙基)，或支化脂族，或苯类芳族比如苯基，或其它极性或非极性配体。配体可以是这些配体中两个或更多个的混合物。适宜的聚苯乙烯类树脂包括，不受限制地，Rohm Haas供给的树脂(例如Amberlite XAD或Amberchrom CG)，Polymer Labs供给的树脂(例如PLRP-S)，GEHealthcare供给的树脂(例如来源RPC)，Applied Biosystems供给的树脂(例如Poros R)。特别优选的树脂是Source 30RPC(GE Healthcare)。

柱物质的制备过程和最佳特征常常需要在树脂与配体之间插入联接基团也称为间隔物(spacer)。本发明方法中的其它参数包括载量，也即加载至柱的蛋白质的量，以及流速。这些参数可以通过本领域技术人员已知的实验进行优化。

一般地，糖蛋白以至少约0.1mg每ml树脂，例如至少约0.2mg，0.5mg，1mg，2mg，5mg，10，或20mg每ml树脂；或0.1-200mg，例如0.1-100mg，0.5-100mg，1-50mg，或2-30mg每mL树脂的浓度加载至柱上；优选载量为至少1mg每mL树脂。堆积树脂体积的测量一般以悬浮或相似模式完成。

尺寸排阻色谱法步骤(b)

本发明过程也牵涉尺寸排阻色谱法(b)步骤，例如用于进一步纯化和/或再缓冲糖蛋白。尺寸排阻色谱法包括平衡并将先前色谱法步骤的洗脱物加载至用缓冲剂平衡的凝胶过滤基质的步骤，所述缓冲剂具有贮藏或进一步处理糖蛋白所希望的组合物，pH一般为6.5至9，优选约8.5。

对于进行尺寸排阻色谱法，凝胶一般选自高分子凝胶的组，包括但不限于右旋糖酐类凝胶比如Sephadex(例如Sephadex G-25)或聚丙烯酰胺凝胶比如Sephacryl(例如Sephacryl-S400)，琼胶糖类凝胶比如Superose或Sepharose(例如Sepharose CL-4B)，和制备自两种凝胶的复合物凝胶比如Superdex 200组合右旋糖酐(Sephadex^TM)和交联琼胶糖(Superose^TM)凝胶。

在优选实施方式中，缓冲剂选自磷酸钠，乙酸铵，MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，Bis-Tris(2-二(2-羟基乙基)氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙二醇)，ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)，PIPES(哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)，ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)，BES(N,N-二(2-羟基乙基)-2-氨基乙烷-磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)，TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)，HEPES(N-2-羟基乙基-哌嗪-N’-2-乙磺酸)，优选磷酸钠或乙酸铵，更优选乙酸铵。

任选地，所述缓冲剂此外包含无机盐，优选碱土金属卤化物，更优选氯化钾或氯化钠，最优选氯化钠，其中所述无机盐的浓度是约0至500mM，优选0至300mM，最优选约0至50mM。在优选实施方式中，缓冲剂是不含盐(salt free)。

在特别优选实施方式中，SEC(平衡，加载，洗脱)步骤(b)的产品-接触缓冲液含有抗氧化剂，比如L-甲硫氨酸。备择抗氧化剂包括叔丁基-4-甲氧基苯酚，2,6-二(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚；焦亚硫酸氢钾或钠，亚硫酸氢钠。

尺寸排阻色谱法还包括通过等度洗脱来自所述凝胶过滤基质洗脱糖蛋白的步骤，也即洗脱缓冲剂具有与用于平衡和/或加载的缓冲剂大致相同的、优选相同的组成。可以通过280nm的UV吸收记录溢流(flowthrough)，收集含有糖蛋白的级分。

疏水相互作用色谱法步骤(c)

本发明过程也牵涉疏水相互作用色谱法(c)步骤。疏水相互作用色谱法通常通过平衡并加载柱、随后洗涤和随后洗脱来进行。

疏水相互作用色谱法(HIC)是利用蛋白疏水特性的分离方法。吸附作用通过在蛋白质非极性区域与固体支持物上的固定化疏水配体之间的疏水相互作用得以加强。吸附在含水流动相中于高盐浓度实现，通过降低盐浓度使得便于洗脱。疏水相互作用色谱法物质是用疏水配体比如乙基、丁基、苯基或己基基团的取代的基质。优选的物质是用丁基或苯基配体取代的基质。

疏水相互作用色谱法(HIC)树脂是本领域已知的，且包括树脂比如Butyl Sepharose(GE Healthcare)，苯基Sepharose(低和高取代)，辛基Sepharose和烷基Sepharose(全部来自GE Healthcare；其它HIC树脂来源包括Biosepra，法国；E.Merck，德国；BioRad USA)。

在优选实施方式中，疏水相互作用色谱法用树脂比如ButylSepharose HP(可得自GE Healthcare)进行。应理解步骤(c)可以用具有相似特征的替代树脂进行。可以使用的备择树脂如下：Toyopearl Butyl650M(可得自Tosoh Biosep Inc.)，苯基Sepharose 6Fast Flow(低取代)；苯基Sepharose 6Fast Flow(高取代)；Butyl Sepharose 4Fast Flow；辛基Sepharose 4Fast Flow；苯基Sepharose High Performance；Source15ETH；Source 15ISO；Source 15PHE全部来自GE Biosciences(800)526-3593。其它树脂是：Hydrocell C3或C4；Hydrocell Phenyl，来自BioChrom Labs Inc.(812)234-2558；(参见www.biochrom.com)。

在优选实施方式中，平衡、加载、洗涤和洗脱缓冲剂选自磷酸钠，MES，Bis-Tris，ADA，PIPES，ACES，BES，MOPS，TES，HEPES，优选磷酸钠。在HIC树脂上的结合通常通过使用高电导率的平衡和加载缓冲剂来实现，所述缓冲剂例如通过加入盐比如NaCI、(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄，优选硫酸铵来获得。优选的盐浓度是1至2M，优选约1.5M(NH₄)₂SO₄。洗涤一般地使用加载缓冲剂。疏水相互作用色谱法的洗脱步骤优选通过降低流动相电导率(降低盐浓度)进行。所述减少能够以线性方式或分步实现。

优选使用这样的平衡、加载、洗涤和洗脱缓冲剂，其具有为或约为6至为或约为9，更优选为或约为7.0至为或约为8.5，最优选为或约为7.5的pH。特别优选的平衡、加载和洗涤缓冲剂系统含有磷酸钠和硫酸铵，优选pH为或约为7.5。优选的洗脱缓冲剂含有pH为或约为7.5的磷酸钠。

在特别优选实施方式中，HIC步骤(c)(平衡、加载、洗涤、洗脱)的产品-接触缓冲液含有抗氧化剂，比如L-甲硫氨酸。备择抗氧化剂包括叔丁基-4-甲氧基苯酚，2,6-二(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚；焦亚硫酸氢钾或钠，亚硫酸氢钠。

额外的步骤

除了三个主要色谱法步骤(a)，(b)和(c)，本发明过程可以任选地包括本领域技术人员已知的额外的步骤，例如色谱法步骤，过滤步骤或病毒灭活步骤。优选的额外的步骤是离子交换色谱法比如阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法，亲和色谱法比如染料亲和色谱法，免疫亲和色谱法，凝集素亲和色谱法或过硼酸盐亲和色谱法，过滤比如透析过滤，超滤或纳米过滤，或病毒灭活。

阴离子交换色谱法步骤(d)

在优选实施方式中，本发明过程还包含阴离子交换色谱法(d)。阴离子交换色谱法通常通过平衡和加载柱，随后洗涤并随后洗脱来进行。

阴离子交换色谱法这样进行：优选用季铵树脂，比如CaptoQ(可得自GE Healthcare)，或具有相似特征的树脂比如ToyoPearl QEA(可得自Tosoh)，Q Sepharose FF(可得自GE Healthcare)或Fractogel EMD，Fractogel TMAE或Fractogel HICAP(可得自Merck KGaA，Darmstadt德国)。

阴离子交换色谱法树脂优选通过使用具有温和碱性pH的缓冲剂来平衡的，加载和洗涤，所述温和碱性pH例如为或约为7.2至为或约为9.0，或为或约为8.0至为或约为9.0，最优选为或约为8.5。适宜的缓冲液包括，例如硼酸缓冲剂，三乙醇胺/亚氨基二乙酸，三(2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇)，磷酸钠，乙酸铵，曲辛(N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸)，N-二羟乙基甘氨酸(2-(二(2-羟基乙基)氨基)乙酸)，TES，HEPES，TAPS(N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)。最优选乙酸铵，pH为或约为8.5。

自离子交换树脂的洗脱通过由加入盐优选NaCl来增加流动相电导率而实现。适宜的缓冲液包括，例如硼酸缓冲剂，三乙醇胺/亚氨基二乙酸Tris，乙酸铵，曲辛，N-二羟乙基甘氨酸，TES，HEPES，TAPS。优选是乙酸铵。

阴离子交换色谱法能够用来选择性地洗脱不同的电荷同种型，这些不同类型主要源自糖蛋白聚糖部分的不同唾液酸化和/或硫酸化水平。

糖蛋白这样构建：肽骨架和低聚糖以O-连接方式连接至丝氨酸和/或苏氨酸残基的OH-基团和/或以N-连接方式连接至天冬酰胺的酰胺基团。低聚糖结构常常终止于带负电的糖神经氨酸(也命名为唾液酸)。

糖蛋白产品的体内活性显得受末端半乳糖的唾液酸化度影响。例如De Leeuw等人(1996，Mol Hum Reprod.1996年5月；2(5)：361-9)显示具有高唾液酸含量的FSH同种型引发相比具有较低唾液酸含量的那些较高的特异活性，原因是延长的循环半衰期。然而，具有较低唾液酸含量的FSH同种型显示较高的受体结合活性。因此，对于FSH特定应用，可以需要具有不同唾液酸化度的不同同种型。

术语"同种型"，如本文所用，是指含有糖蛋白的糖蛋白制剂/级分，所述糖蛋白具有等同或很相似的氨基酸序列以及共同的等电点，但是它们可以在所连接的半乳糖基和唾液酰基的程度、复杂性、性质、触角性和次序上有区别。根据本发明的同种型还可以包含相同或很相似的氨基酸序列和等电点的多种糖蛋白形式，其额外地区别于其它的电荷携带修饰比如乙酰化和硫酸化。术语"很相似的氨基酸序列"指出蛋白质也的氨基酸序列包含功能等同于野生型氨基酸序列和从而发挥相同功能的那些序列。尤其是，"很相似的氨基酸序列"共享与参比氨基酸序列至少70%，优选至少80%，至少90%，至少95%，最优选至少98%的序列同源性，优选序列同一性；在一段连续氨基酸内代表整个参比氨基酸序列的至少50%，优选至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，更优选100%。

从而，糖蛋白同种型优选能够通过它们的等电点和氨基酸序列进行定义，而各种这样定义的同种型可以实际上包含严格化学意义的多个同种型(具有相同原子组分但空间结构不同的分子)。尤其是，相同同种型的不同糖蛋白的等电点差异优选不超过2单元，更优选不超过1单元，不超过0.5单元或不超过0.2单元，而最优选等电点差异不超过0.1单元。

对于不同地带电同种型比如不同地唾液酸化的同种型的选择性洗脱来说，优选使用两种或更多种，优选pH和/或盐含量不同的两种洗脱缓冲液A和B，它们各自基于例如乙酸铵，硼酸缓冲剂，三乙醇胺/亚氨基二乙酸，Tris，磷酸钠，乙酸铵，曲辛，N-二羟乙基甘氨酸，TES，HEPES或TAPS，优选乙酸铵。使用不同的洗脱缓冲液，洗脱能够以分步方式进行，首先用一种洗脱缓冲剂，然后用另一种洗脱缓冲剂，任选地也用洗脱缓冲液的不同混合物进行一种或多种中间洗脱步骤。另选地或额外地，洗脱能够使用梯度进行，开始于第一混合比例的洗脱缓冲液(例如100%的第一洗脱缓冲剂)，逐渐变为第二混合比例的洗脱缓冲液(例如100%的第二洗脱缓冲剂)。

首先使用的洗脱缓冲剂(缓冲剂A)通常能够是a)温和酸性缓冲剂，其不含，或b)中性或温和碱性缓冲剂，具有低含盐量比如NaCl(优选20至200mM)。缓冲剂A能够用来洗脱低电荷例如低唾液酸化度的糖蛋白。在变型a)中，缓冲剂A具有的pH例如为或约为3.0至为或约为6.5，或为或约为4.0至为或约为6.0，最优选为或约为5。在变型b)中，缓冲剂A具有pH例如为或约为7.0至9.0，优选8.5。

第二使用的洗脱缓冲剂(缓冲剂B)通常是含盐的温和碱性缓冲剂，含盐量比缓冲剂A更高，其能够用来洗脱高电荷例如高唾液酸化度的糖蛋白。缓冲剂B具有的pH例如为或约为7.0至为或约为9.0，或为或约为8.0至为或约为9.0，最优选为或约为8.5。盐优选是NaCl。缓冲剂B中的含盐量优选是200mM至1M。

使用不同的洗脱缓冲液和梯度或分步洗脱，加载于阴离子交换色谱法柱上的不同的糖蛋白同种型将取决于其电荷在不同的级分中洗脱。例如，待纯化的糖蛋白可以出现在流过级分中，也即其仅弱地结合至阴离子交换色谱法柱或者完全不与其结合，其可以用第一洗脱缓冲剂，特定混合比例的第一和第二洗脱缓冲剂，或者用第二洗脱缓冲剂进行洗脱。糖蛋白级分用于进一步纯化步骤，从而，待纯化的糖蛋白同种型主要取决于糖蛋白所希望的应用。无关的其它糖蛋白同种型能够用阴离子交换色谱法步骤除去。关于FSH，例如仅具有高唾液酸化度和从而具有高循环半衰期的FSH，或仅具有低唾液酸化度和从而具有高受体结合活性的FSH，可以得以纯化。

在特别优选实施方式中，离子交换色谱法的产品-接触缓冲液(平衡，洗涤，洗脱)含有抗氧化剂，优选L-甲硫氨酸。备择抗氧化剂如上文所述。

作为备择或除标准阴离子交换色谱法以外，能够进行色谱聚焦。色谱聚焦是根据其等电点(pI)差异分离蛋白的色谱法技术。尤其是，能够使用带电固定相，加载于色谱聚焦柱上的蛋白能够用pH梯度洗脱。例如，固定相可以带正电而pH梯度可以从第一pH进展至第二较低pH，例如从约pH 9至约pH 6或者从约pH 7至约pH 4。由于特定色谱聚焦条件，按其等电点顺序的蛋白洗脱物和优选特定pI的蛋白聚焦至窄带中。由于pH高于其pI的蛋白带负电且结合至带正电固定相而导致移动减慢。在洗脱梯度pH达到蛋白质pI的情况下，其整体呈电荷中性，从而随流动相流动而迁移。在低于蛋白质pI的pH，蛋白质由于带正电荷而被固定相排斥，从而将其加速。由此在聚焦区后部的蛋白迁移比前部那些更快速，逐渐形成更窄的蛋白带。在该环境下，具有最高pI的蛋白质第一洗脱，具有最低pI的蛋白质最后洗脱。

适宜的固定相是，例如，用带电缓冲胺比如Mono P(可得自GEHealthcare)取代的介质或者其它阴离子交换色谱法物质。对于形成洗脱pH梯度，能够使用适宜的缓冲系统比如Polybuffer 74或Polybuffer 96(可得自GE Healthcare)。柱的平衡、加载和洗涤能够用任意条件完成，该条件下目的糖蛋白和/或任意杂质结合至柱物质。例如，可以使用上述阴离子交换色谱法条件。在用降低的pH梯度的情况下，优选将具有等于或高于洗脱梯度开始pH的pH的缓冲剂用于平衡、加载和/或洗涤。在用增加的pH梯度的情况下，优选将具有等于或低于洗脱梯度开始pH的pH的缓冲剂用于平衡、加载和/或洗涤。优选，对于平衡、加载和洗涤，使用的缓冲剂具有类似洗脱开始的pH梯度的那些。

总体过程

反相色谱法、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法和阴离子交换色谱法的步骤可以以任意次序进行，尽管优选首先进行反相色谱法步骤。剩余步骤可以以任意次序进行，尽管优选按照(1)反相色谱法，(2)尺寸排阻色谱法，(3)阴离子交换色谱法，(4)疏水相互作用色谱法的次序。任选的是随后的超滤和/或透析过滤的浓缩和/或缓冲剂交换步骤(5)，和纳米过滤的步骤(6)。

在优选实施方式中，纯化根据本发明的糖蛋白的方法不包括免疫亲和色谱法和/或阳离子交换色谱法。更优选，根据本发明的方法不包括除本文描述那些之外的任何其它色谱步骤。根据本发明的方法优选包括仅三种色谱步骤，也即反相色谱法、尺寸排阻色谱法和疏水相互作用色谱法，或者仅四种步骤，也即反相色谱法、尺寸排阻色谱法、阴离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法。阴离子交换色谱法还可以用上述的色谱聚焦步骤替换。

然而，还可以进行除此以外以及在步骤之间其它非色谱步骤，优选本文描述的那些优选，这些其它步骤包括用于减少或灭活不希望或危险物质比如细菌、病毒、核酸或朊病毒蛋白的步骤，例如无菌过滤、纳米过滤、吸附和/或pH灭活步骤。在备择实施方式中，除上述步骤之外，根据本发明的过程可以包含用于减少或灭活不希望或危险物质的色谱步骤，包括例如吸附色谱法。优选，本发明的纯化过程包含至少一个，更优选至少两种，最优选至少三种病毒减少或灭活步骤。在这方面，也可以将根据本发明的纯化过程的色谱法步骤，尤其是尺寸排阻色谱法步骤(b)，用作病毒减少步骤，原因是它们通常将病毒与糖蛋白分离。例如，病毒和病毒类颗粒与糖蛋白相比具有大得多的尺寸，从而在尺寸排阻色谱法期间有效地与其分开。

另外，根据本发明的方法优选在尺寸排阻色谱法之前直接和/或在其之后直接不包括缓冲剂交换步骤。尤其是，如果本发明方法进行以(1)反相色谱法，(2)尺寸排阻色谱法，任选的(3)阴离子交换色谱法，和(4)疏水相互作用色谱法的次序，优选在反相色谱法与尺寸排阻色谱法之间和/或在尺寸排阻色谱法与阴离子交换色谱法或疏水相互作用色谱法之间无缓冲剂交换。

其它步骤

在第一色谱法步骤之前(特别在反相色谱法步骤之前)，可以希望进行超滤步骤以浓缩粗制糖蛋白。另外，额外地透析过滤步骤可以在第一色谱法步骤之间进行以进行缓冲剂交换。超滤步骤和透析过滤步骤可以同时地或按顺序地进行。超滤和/或透析过滤优选用膜进行具有的截断值为或约为3-30kD，最优选为或约为10kD。然而，本发明也涵盖这样的纯化过程，其中在第一色谱法步骤之前不进行超滤步骤和/或不进行透析过滤步骤。

在优选实施方式中，在一种或多种色谱法步骤之后(特别在色谱法最终步骤之后)，对糖蛋白样品进行超滤和/或透析过滤步骤。优选进行超滤和/或透析过滤以获得具有所希望组合物的整体料(bulk)。超滤(和/或透析过滤)优选用截断值为或约为3-30kD，最优选为或约为10kD的膜进行。优选的是，在超滤和/或透析过滤期间对预配制剂缓冲剂施行缓冲剂交换，所述预配制缓冲剂例如选自磷酸钠，枸橼酸钠，MES，Bis-Tris，ADA，PIPES，ACES，BES，MOPS，TES，HEPES，优选磷酸钠，优选含有稳定剂例如蔗糖和抗氧化剂比如L-甲硫氨酸的磷酸钠。pH优选为6.5至7.5，更优选约7.0至7.1。

在根据本发明的纯化过程能够进行的其它任选步骤包括一种或多种无菌过滤步骤。这些步骤能够用来除去生物学污染比如真核和/或原核细胞，尤其是细菌，和/或病毒。优选，这些步骤在纯化过程结束时或接近结束时进行以预防在无菌过滤步骤之后的进一步污染。为了除去细菌或其它细胞，用于无菌过滤的滤器优选具有的孔径尺寸为0.22μm或少，优选0.1μm或少。为了除去病毒或病毒类颗粒，可以进行描述如下的纳米过滤步骤。

根据本发明的纯化过程中能够进行的又一额外步骤是经由在特定pH温育糖蛋白的病毒灭活步骤。例如，糖蛋白在4.0或少，优选约pH 3.6的pH温育。温育时间优选为至少15分钟，至少30分钟，至少60分钟，至少90分钟，至少2小时，至少3小时或至少6小时。温育可以在低温度比如10℃或少或4℃或少，或在约室温进行。例如，糖蛋白物质可以在约3.6的pH在约室温温育约90分钟。该病毒灭活步骤能够在纯化过程期间的任意时间进行，优选在最后色谱法步骤之后进行。

在一种优选实施方式中，本发明过程包括次序如下所示的下述步骤：

(0)超滤(任选地额外的透析过滤步骤；优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)；

(1)反相色谱法(RPC)(优选用Source 30RPC柱)；

(1a)超滤(优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)；

(2)尺寸排阻色谱法(优选用Superdex 200柱)；

(3)阴离子交换色谱法(优选用CaptoQ柱)；

(4)疏水相互作用色谱法(HIC)(优选用Butyl HP柱)；

(5)超滤和/或透析过滤(优选使用具有的截断值为10kD的膜)。

可以希望的是对糖蛋白样品进行纳米过滤步骤，尤其是病毒清除步骤；也即降低糖蛋白制剂被源自细胞培养物的病毒或病毒类颗粒污染的风险。纳米过滤可以在纯化过程的任意阶段进行，然而，特别优选在色谱程序之后进行纳米过滤。纳米过滤可以进行多于一次，例如其可以进行两次。优选纳米过滤装置具有的孔径尺寸为约15至20nm。

在又一优选实施方式中，本发明方法从而包括以如下所示次序的下述步骤：

(0)超滤(优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)，

(1)反相色谱法(RPC)(优选用Source 30RPC柱)

(1a)超滤(优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)，

(2)尺寸排阻色谱法(优选用Superdex 200柱)；

(3)阴离子交换色谱法(优选用CaptoQ柱)；

(4)疏水相互作用色谱法(HIC)(优选用Butyl HP柱)；

(5)超滤和/或透析过滤(优选使用具有的截断值为10kD的膜)；

(6)纳米过滤(优选包括病毒清洁(clarification))。

上述特定纯化过程优选不再包括任何其它色谱法步骤和/或超滤步骤和/或透析过滤步骤地进行。然而，在特别的实施方式中，上述纯化过程可以还包括额外步骤，尤其是本文描述的额外步骤中的一种或多种，例如用于除去或灭活不希望或和/或危险物质的那些。

优选的是，抗氧化剂或具有抗氧化及捕获效果的游离氨基酸或二肽包括在根据本发明的纯化方法的各步骤的某些或全部之中。更特别地，抗氧化剂存在于用来纯化和/或浓缩和/或过滤糖蛋白比如FSH的缓冲液中的任意之中。抗氧化剂在处理期间防止糖蛋白比如FSH氧化。A优选的抗氧化剂是L-甲硫氨酸。优选，L-甲硫氨酸以为或约为0,1至10mM的浓度使用。抗氧化剂的其它实例包括叔丁基-4-甲氧基-苯酚，2,6-二(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚；焦亚硫酸氢钾或钠，亚硫酸氢钠。游离氨基酸和具有抗氧化及捕获效果的二肽的实例是组氨酸，牛磺酸，甘氨酸，丙氨酸，肌肽，鹅肌肽，1-甲基组氨酸或其组合。

本发明优势在于纯化过程是高度有效的，减少色谱步骤数至最少3个色谱步骤，或者在包括富集高度唾液酸化的糖蛋白分子的情况下，减少至最少4个色谱步骤。尤其是，使用根据本发明的纯化过程，成本昂贵且有问题的纯化步骤尤其比如亲和力纯化步骤，特别是免疫亲和纯化步骤，变得不再必要且可以避免。本发明方法提供高度的糖蛋白纯度和特定生物活性，其>90%，优选>98%，更优选>99%w/w，各自按例如通过HCP-ELISA测量的总蛋白质计。另外，根据本发明的纯化过程提供令人惊讶地高的原料中存在的目的糖蛋白的回收。

糖蛋白

糖蛋白是含有多肽侧链的低聚糖链(聚糖)共价连接至的蛋白。糖蛋白可以包含一种或多种聚糖，其优选偶合至多肽的氮原子(N-糖基化)或氧原子(O-糖基化)。从而，糖蛋白可以是N-糖基化的和/或O-糖基化的。优选，糖蛋白包含天然聚糖。然而，术语"糖蛋白"包含蛋白或多肽，其具有天然聚糖和/或非天然聚糖，尤其是合成产生的聚糖和/或包含非天然或修饰的单糖单元的聚糖。

待纯化的糖蛋白优选选自促性腺激素的组，比如FSH(卵泡-刺激激素)，CG(绒促性素)，LH(黄体化激素)和TSH(甲状腺-刺激激素)包括其全部同种型和变型。术语"糖蛋白"，"FSH"，"CG"，"LH"和"TSH"，如本申请中所有，总是包括所述糖蛋白的全部同种型和变型，特别是下文描述和在步骤(d)(AEX)的那些。术语"促性腺激素"根据本发明优选是指天然促性腺激素比如FSH、CG、LH和TSH但也指其重组形式以及其任意同种型、变型和类似物。优选，促性腺激素的同种型、变型和类似物展示天然促性腺激素的一种或多种生物学活性。然而，根据本发明的纯化糖蛋白的方法也适于纯化其它糖蛋白例如红细胞生成素，各种抗体，尤其是单克隆抗体，粒性白细胞，粒细胞巨噬细胞-群落-刺激因子，和组织纤溶酶原活化剂。

贮藏/冻干

上述纯化过程得到且含有纯化糖蛋白的液态组合物可以原样或者在纯化之后冷冻贮藏，洗脱物可以进行冻干("冷冻-干燥")以除去溶剂。所得液体或冻干的产品称为"糖蛋白料(Bulk)"。

配制剂

本发明的或根据本发明方法纯化的糖蛋白可以配制用于任意类的给药方法，优选用于肌内或皮下注射，优选皮下注射。糖蛋白配制剂可以冷冻-干燥，在该情况下临注射之前将其溶于注射用水。糖蛋白配制剂还可以是液体配制剂，在该情况下其能够直接注射，而不事先溶解。配制剂可以含有已知赋形剂和稳定剂且可以额外包含抗氧化剂和/或表面活性剂。糖蛋白配制剂可以是单剂量或多剂量。如果是多剂量，则其应优选含有抑菌剂，例如烷基苄酯，苯甲醇，间-甲酚，麝香草酚或苯酚，优选甲基苄酯或间-甲酚。单剂量配制剂还可以包含抑菌剂。适宜的配制剂描述于例如WO 2004/087213，WO 00/04913，WO 2007/092829和EP0853945，通过援引加入本文。

本发明的糖蛋白可以与已知赋形剂和稳定剂例如蔗糖和甘露醇一起配制。其还可以包含抗氧化剂比如甲硫氨酸。其还可以包含表面活性剂，比如吐温(优选吐温80)，或普流罗尼克(Pluronic)(优选普流罗尼克F68)。

在特别优选的多剂量配制剂中，通过本发明方法产生的糖蛋白这样配制：将其与蔗糖、磷酸缓冲剂(pH 6.5至7.5)、普流罗尼克F68、甲硫氨酸和抑菌剂一起溶解在注射用水中。

适应症

本发明的糖蛋白适用于糖蛋白作为指征的全部治疗中。例如FSH特别适用于排卵诱导中的皮下给药，辅助繁殖技术的控制性卵巢过度刺激，和治疗精液缺乏。其可以与其它促性腺激素比如LH和CG组合使用。其还可以与增加对FSH应答的其它化合物一起使用，比如柠檬酸氯米芬，芳香酶抑制剂比如阿那曲唑、来曲唑、法倔唑和YM-511。另外，LH和CG还可以在生育治疗中单独使用。

重组糖蛋白

使用术语"重组"是指通过使用重组DNA技术产生的糖蛋白比如FSH的制剂。用重组技术表达糖蛋白的方法的一个实例是用包含编码目的糖蛋白的DNA序列的表达媒介转染适宜宿主细胞优选真核宿主细胞。通常，表达媒介携带驱动糖蛋白表达的强启动子例如CMV或SV40，以及已掺入媒介的用于选择宿主细胞的适宜的选择标记物。转染可以是稳定的或暂时的。适宜的重组表达系统是现有技术中熟知的，从而不需要详述。优选，真核宿主细胞选自灵长类细胞，优选人类细胞和啮齿动物细胞，优选CHO细胞。为了重组表达FSH，将真核宿主细胞用编码FSH的α和β亚单位的DNA序列转染，于一种媒介或于两种媒介上提供具有单独启动子的各亚单位，描述于欧洲专利号EP 0 211 894和EP 0 487512。编码FSH的DNA可以是cDNA或者其可以含有内含子。

使用重组技术产生FSH的又一实例是通过使用同种重组来将在操作连接中的异源调节片段插入编码FSH亚单位之一或两种的内源序列，描述于欧洲专利号EP 0 505 500(Applied Research Systems ARSHolding NV)。还预期这样方法，比如公开于WO 99/57263(TranskaryoticTherapies)的那些，其中将亚单位之一异源地插入细胞中，而另一亚单位经过借助同种重组插入异源调节片段而活化基因组序列来表达。本发明的方法可以用来纯化用这些方法和其它方法中任意表达的FSH。

根据本发明纯化过程用于纯化天然以及重组糖蛋白，包括同种型及其变型。糖蛋白同种型优选是指如前文所定义的同种型。术语"变型"优选涵盖衍生自天然糖蛋白的糖蛋白，比如其突变体形式，其融合蛋白，其片段和/或具有不同糖基化模式的糖蛋白。还包括糖蛋白的模拟化合物，包括包含拟糖结构和/或拟肽结构的蛋白。优选，糖蛋白变型和/或同种型展示一种或多种活性，其定性地和/或定量地相似或等同于天然糖蛋白的那些。

措辞"糖蛋白变型"比如"FSH变型"意在涵盖氨基酸序列，糖基化位点数(包括额外或删除的糖基化位点)或亚单位间连接与人类糖蛋白不同但展示其活性的一种或多种的那些分子。FSH变型的实例包括CTP-FSH，长效的修饰重组FSH，由野生型[α]-亚单位和杂交[β]-亚单位组成，其中hCG的羧基末端肽已稠合至FSH[β]-亚单位的C-末端，如LaPoIt等人的描述;Endocrinology;1992,131,2514-2520;or Klein等人;Development and characterization of a long-acting recombinant hFSHagonist;Human Reprod.2003，18，50-56]。还包括单链CTP-FSH，其是由下述序列(自N-末端至C-末端)组成的单链分子：

[β]FSH，[β]hCG CTP(113-145)，[α]FSH

其中[β]FSH表示FSH的[β]-亚单位，[β]hCG CTP(113-145)表示hCG的羧基末端肽和[α]FSH表示FSH的[α]-亚单位，如Klein等人的描述[Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chainrecombinant human follicle-stimulating hormone containing the humanchorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey,Fertility & Sterility;2002,77,1248-1255]。FSH变型的其它实例包括具有掺入[α]-和/或[β]-亚单位的额外的糖基化位点的FSH分子，如WO01/58493(Maxygen)的公开，和具有亚基间S-S键的FSH分子，如WO98/58957的公开。FSH变型的其它实例包括嵌合的分子，其包含来自FSH的序列和来自hCG或LH的序列，比如描述于WO 91/16922和WO92/22568的那些。

本文提及的FSH变型也包括β亚单位的羧基末端缺失，其比完全长度的成熟蛋白质更短。应理解β链的羧基末端变型与已知α亚单位形成复合物以形成FSH变型异二聚体。另外，FSH变型也包括融合蛋白，其中α-链和β-链或其部分在一个多肽链中组合，优选包含两条链间的连接体。在FSH融合蛋白的其它实例中，FSH链之一或两者稠合至抗体或其部分比如抗体的Fc片段。

本文提及的FSH变型也包括来自不同的种类例如马(Equuscaballus)，猪(Sus scrofa)，牛(Bos taurus)，猫(Felis catus)，犬(Canisfamiliaris)的FSH。

在优选实施方式中，FSH在血清中或在不含血清的媒介中重组地产生。在又一优选实施方式中，根据本发明方法产生的纯化FSH适于皮下给药，这使得患者自行给药成为可能。

上述关于FSH作示范性糖蛋白的糖蛋白变型也以相似方式适用于其它糖蛋白，酌情，尤其适用于其它促性腺激素比如LH，TSH和CG。

措辞"粗制重组糖蛋白"是指在进行任意色谱步骤之前来自表达重组细胞的糖蛋白的细胞培养物上清液。该措辞涵盖上清液的粗形式(自细胞分离)以及浓缩和/或过滤和/或超滤的上清液。

制备糖蛋白的过程

还提供通过进行本文描述的纯化糖蛋白过程用于制备目的糖蛋白的过程。糖蛋白能够得自天然来源或重组地获得。

在优选实施方式中，提供制备目的糖蛋白的过程，包括下述步骤：

i)重组地表达目的糖蛋白；

ii)纯化所述重组地表达的目的糖蛋白，通过对含有所述糖蛋白的液体进行至少下述步骤：

a)反相色谱法，

b)尺寸排阻色谱法，和

c)疏水相互作用色谱法。

各自制备过程导致产生很纯的糖蛋白，其尤其适用于药物配制剂中。

所述制备过程优选包含与纯化过程结合的至少一种或更多种上述步骤。上述各公开内容也适用于根据本发明的制备过程，请参照上述公开以避免重复。

另外，根据本发明的制备过程可以包括将目的糖蛋白配制为药物配制剂形式的步骤。适宜的液体或冻干的配制剂是现有技术中已知的且描述与上文，请参见上述各自的公开。

优选，通过根据本发明的制备方法产生的目的糖蛋白选自促性腺激素，优选选自FSH、CG、LH和TSH。

实验部分

下述实验说明本发明的过程，且不以任何方式期望限制本公开。

步骤0：超滤

形成粗制FSH的原料源自含有重组FSH的细胞培养物上清液。

在超滤步骤之前，在室温经2μm深滤器过滤清洁上清液。然后，用具有的截断值为或约为10kD的膜，不超过1.2巴的跨膜压力进行超滤。

步骤1：反相色谱法(Source30 RPC柱)

加载缓冲剂：20mM磷酸钠，pH 7.5/10%v/v异丙醇(含有甲硫氨酸)

洗脱缓冲剂：20mM磷酸钠，pH 7.5/18%v/v异丙醇(含有甲硫氨酸)

将得自浓缩和超滤(步骤0)的物质用浓度相当于加载缓冲剂的异丙醇补充。将Source30柱用加载缓冲剂平衡。在将物质加载至柱上之后，通过加载缓冲剂将未结合的物质洗出约15CV。通过将异丙醇浓度增加至18%v/v洗脱FSH在洗脱缓冲剂中(约8CV)。通过超滤浓缩洗脱液以进行后续步骤。该步骤在室温下进行。

步骤1a：超滤

对步骤1(RPC)的洗脱物进行室温下的超滤，使用具有截断值为或约为10kD的膜，跨膜压力不超过1.2巴，将洗脱物浓缩为约10%的SEC柱体积。

步骤2：尺寸排阻色谱法(Superdex 200柱)

运行缓冲剂：15mM乙酸铵，pH 8.5(含有甲硫氨酸)

对步骤1a的洗脱物质进行SEC柱，用运行缓冲剂平衡。在等度条件下洗脱FSH，保留时间明显(约0.6-0.7CV)。该色谱法步骤在后续步骤之前提供纯化和缓冲剂交换。SEC步骤在室温下进行。

步骤3：阴离子交换色谱法(CaptoQ柱)

加载缓冲剂：15mM乙酸铵，pH 8.5(含有甲硫氨酸)

洗脱缓冲剂A：15mM乙酸铵，pH 5(含有甲硫氨酸)

洗脱缓冲剂B：15mM乙酸铵，pH 8.5(含有甲硫氨酸)-0.25MNaCl

然后，将得自步骤2(SEC)的物质应用于用加载缓冲剂平衡的阴离子交换树脂。加载缓冲剂(约10CV)将未结合的物质洗出。在使用洗脱缓冲剂B(含有较多带电FSH分子)的第二洗脱步骤之前，用洗脱缓冲剂A(含有较少带电FSH分子)部分洗脱FSH。两个洗脱步骤均以分步方式进行。AEX在室温下进行。

步骤4：疏水相互作用色谱法(HIC)(Butyl HP柱)

加载缓冲剂：20mM磷酸钠，pH 7.5-1.5M，硫酸铵(含有甲硫氨酸)

洗脱缓冲剂：20mM磷酸钠，pH 7.5(含有甲硫氨酸)

将得自用缓冲剂B洗脱阴离子交换色谱法柱(较高酸性FSH分子)的物质用加载缓冲剂调节至1.5M硫酸铵，将其加载于用加载缓冲剂平衡的Butyl-HP Sepharose柱上。在洗出未结合的物质之后，通过以线性方式降低硫酸铵浓度至0，自柱洗脱FSH。HIC步骤在室温下进行。

步骤5：透析过滤(具有的截断值为10kD膜)

预配缓冲剂：9-10mM磷酸钠，pH 7.0-7.1

0.1g/l甲硫氨酸

50mg/ml蔗糖

然后，对来自步骤4(HIC)的洗脱物在室温下应用透析过滤。通过该步骤，缓冲剂替换为预配缓冲剂并调节至所希望的浓度。

步骤6：纳米过滤

将来自透析过滤步骤的产品直接施用至压力约2巴的20nm纳米过滤装置。该步骤在室温下进行。

步骤(-1)至(6)的过程得到FSH，纯度按总蛋白质计为>99.99%w/w，由HCP-测试测得(宿主细胞蛋白质水平<0.01%w/w)。

Claims

1.纯化促性腺激素的方法，包括对含有所述促性腺激素的液体进行下述步骤：

a)反相色谱法，

b)尺寸排阻色谱法，和

c)疏水相互作用色谱法；

其中所述步骤以所指出的顺序进行，

而其中所述促性腺激素是FSH。

2.根据权利要求1的方法，其中在反相色谱法步骤a)中洗脱缓冲剂含有有机溶剂。

3.根据权利要求2的方法，其中所述有机溶剂是异丙醇。

4.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中在尺寸排阻色谱法步骤b)中进行缓冲剂交换。

5.根据权利要求1或2的方法，额外地包含选自色谱法步骤、过滤步骤和病毒灭活步骤的一个或多个步骤。

6.根据权利要求5的方法，其中所述一个或多个步骤选自离子交换色谱法、亲和色谱法、透析过滤、超滤、纳米过滤和病毒灭活。

7.根据权利要求1或2的方法，额外地包含阴离子交换色谱法步骤d)。

8.根据权利要求7的方法，其中在尺寸排阻色谱法步骤b)之后进行阴离子交换色谱法步骤d)。

9.根据权利要求7的方法，其中在阴离子交换色谱法步骤d)中使用含有至少一种盐的洗脱缓冲剂。

10.根据权利要求8的方法，其中在阴离子交换色谱法步骤d)中使用含有至少一种盐的洗脱缓冲剂。

11.根据权利要求7的方法，其中所述促性腺激素的不同带电同种型得以分离。

12.根据权利要求8至10中任一项的方法，其中所述促性腺激素的不同带电同种型得以分离。

13.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述促性腺激素重组地产生。

14.根据权利要求1至3中任一项的方法，包括按顺序进行下述步骤

(0)超滤：

(1)反相色谱法；

(1a)任选地超滤；

(2)尺寸排阻色谱法；

(3)阴离子交换色谱法；

(4)疏水相互作用色谱法；

(5)超滤和/或透析过滤；

(6)纳米过滤。

15.制备目的促性腺激素的方法，包括下述步骤：

i)重组地表达目的促性腺激素；

ii)通过对含有所述促性腺激素的液体进行至少下述步骤，纯化所述重组地表达的目的促性腺激素：

a)反相色谱法，

b)尺寸排阻色谱法，和

c)疏水相互作用色谱法；

其中所述步骤以所指出的顺序进行，

而其中所述促性腺激素是FSH。

16.根据权利要求15的制备方法，包括下述步骤中的至少一个：

i)如权利要求1至14中所定义的一个或多个步骤；和/或

ii)将目的促性腺激素配制为药物配制剂形式的步骤。