KR101860830B1

KR101860830B1 - 당단백질 정제 방법

Info

Publication number: KR101860830B1
Application number: KR1020127016158A
Authority: KR
Inventors: 슈테펜 고레츠; 라르스 슈퇴클
Original assignee: 글리코토페 게엠베하
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2018-05-24
Also published as: AU2010324104C1; DK2504350T3; ES2626248T3; PL2504350T3; WO2011063943A1; LT2504350T; CA2781132A1; EP2325194A1; KR20120089755A; EP2504350A1; US20120252069A1; AU2010324104A1; CN102656182A; CN102656182B; US8846344B2; JP5840135B2; EP2504350B1; JP2013511481A; AU2010324104B2

Abstract

본 발명은 당단백질을 함유하는 액체를 a) 역상 크로마토그래피, b) 크기 배제 크로마토그래피, 및 c) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계에 적용시키는 것을 포함하는, 상기 당단백질의 정제를 위한 방법에 관한 것이다. 관심 당단백질을 생성시키기 위한 제조 방법이 또한 제공된다.

Description

당단백질 정제 방법{PROCESS FOR THE PURIFICATION OF GLYCOPROTEINS}

본 발명은 당단백질, 예를 들어, FSH(난포자극호르몬), LH(황체형성호르몬), CG(융모생식샘자극호르몬) 및 TSH(갑상샘-자극 호르몬)의 정제를 위한 방법, 및 각각의 정제 방법을 이용한 관심 재조합 당단백질의 제조에 관한 것이다.

당단백질은 폴리펩티드 측쇄에 공유적으로 부착된 올리고당류 사슬을 함유하는 단백질이다. 당단백질은 구조, 보호, 운반, 호르몬 또는 효소 기능을 포함하는 매우 다양한 여러 생물학적 기능을 가질 수 있다. 따라서, 다양한 당단백질이 약제로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 당단백질의 제공이 매우 요망된다. 여러 당단백질은 현재 재조합적으로 생성될 수 있으나, 이는 세포 배양 수거물로부터 표적화된 당단백질을 추출하기 위해 광범위한 정제 절차를 필요로 한다.

당단백질의 중요한 부류는 FSH, LH, CG 및 TSH를 포함하는 4개의 밀접하게 관련된 호르몬의 패밀리인 생식샘자극호르몬이다(Glycobiology, vol. 13, no. 3, pages 179-189, 2003). FSH는, 예를 들어, 여성 및 남성 환자 둘 모두에서 불임 및 생식 장애의 치료에 사용된다. 또한, hCG 및 LH는 단독으로 또는 FSH와 조합되어 생식능력 치료에서 사용된다.

사실상, FSH는 뇌하수체에 의해 생성된다. 약학적 사용을 위해, FSH는 재조합적으로 생성(rFSH)될 수 있거나, 이는 폐경후 여성의 소변으로부터 분리(uFSH)될 수 있다.

FSH는 배란유도(0I) 및 보조생식기술(ART)을 위한 과배란유도(controlled ovarian hyperstimulation, COH)로 여성 환자에서 사용된다. 배란유도를 위한 전형적 치료 요법에서, 약 6 내지 약 12일의 기간 동안 FSH 또는 변이체의 주사(약 75 내지 300 IU FSH/일)가 매일 투여된다. 과배란유도를 위한 전형적 치료 요법에서, 약 6 내지 약 12일의 기간 동안 FSH 또는 변이체의 주사(약 150-600 IU FSH/일, 뿐만 아니라 75 IU FSH/일만큼 낮게)가 매일 투여된다.

FSH는 또한 정자부족으로 고통받는 남성에서 정자발생을 유도하는데 사용된다. 매주 2회의 2,500 IU hCG와 조합된 매주 3회의 150 IU FSH를 이용한 요법은 저생식샘자극호르몬 생식샘저하증으로 고통받는 남성에서 정자 수에 있어서의 개선을 달성하는데 성공적이었다(Burgues et al.; Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6).

생식능력 장애의 치료에서의 FSH의 중요성으로 인해, 높은 순도 및 높은 특이적 활성의 FSH의 제공이 요망된다. FSH 처리는 반복 주사를 필요로 한다. 고도로 정제된 FSH 제조물은 피하 투여되어, 환자에 의한 자가-투여를 가능케 함으로써, 환자 편의 및 순응성이 증가될 수 있다.

문헌[Lynch et al. (The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19)]에는 사람 뇌하수체 FSH를 정제하기 위한 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피, 면역친화성 추출 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다.

WO 98/20039호(IBSA Institut Biochimique SA)에는 사람폐경생식샘자극호르몬(hMG)으로 언급되는 소변 추출물을 이용하여 시작하는 사람 소변 FSH의 정제를 위한 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 DE[Xi]AE 타입의 약한 염기성 음이온 교환 수지에서의 이온-교환 크로마토그래피 후, 리간드로서 안트라퀴논 유도체를 갖는 수지에서의 친화성 크로마토그래피를 이용한다.

WO 00/63248호(Instituto Massone SA)에는 사람 소변으로부터의 FSH를 포함하는 생식샘자극호르몬의 정제를 위한 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 설포프로필 타입의 강한 양이온 수지를 이용한 이온 교환 크로마토그래피, 강한 음이온 수지를 이용한 이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 단계를 포함한다.

문헌[Chiba et al. [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218]]에는 콘카나발린(Con) A 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 Cu⁺⁺를 갖는 고정된 금속 이온 크로마토그래피를 이용하여 FSH를 포함하는 개과 뇌하수체 생식샘자극호르몬을 정제하기 위한 기술이 기재되어 있다.

WO 88/10270호(Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)에는 소변으로부터 사람 FSH를 정제하기 위한 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 디비닐 설폰에 의해 Sepharose 4B에 결합된 FSH-특이적인 고정된 모노클로날 항체를 이용한 면역크로마토그래피 후의 역상 HPLC를 포함한다.

EP 1 106 623 A1호에는 염료 친화성 크로마토그래피의 사용에 의해 생물학적 샘플, 예를 들어, 사람 뇌하수체 또는 사람 폐경후 소변으로부터 FSH를 정제하는 방법이 개시되어 있다.

재조합 FSH의 정제를 위한 방법은 WO 2005/063811 A1호, WO 2006/051070 A1호, WO 2007/065918 A2호 및 WO 2009/000913 A1호에 개시되어 있다.

WO 2009/000913 A1호에는 FSH 생성 세포 클론, 이러한 세포 클론을 이용한 FSH 생성 방법, 및 세포 배양 상층액으로부터 수득된 재조합 FSH를 정제하는 방법이 개시되어 있다. 정제는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 젤 여과를 포함하는 전문가에게 공지된 하나 이상의 단계에 의해 수행될 수 있다.

WO 2005/063811 A1호에는 (1) 이온 교환 크로마토그래피, (2) 고정된 금속 이온 크로마토그래피, 및 (3) 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 이용한 재조합 FSH의 정제를 위한 방법이 개시되어 있다.

WO 2006/051070 A1호에는 임의의 순서로 수행될 수 있는 (1) 염료 친화성 크로마토그래피, (2) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 (3) 역상 크로마토그래피 단계를 이용하는 재조합 FSH의 정제를 위한 방법이 개시되어 있다.

WO 2007/065918 A2호에는 임의의 순서로 수행될 수 있는 (1) 염료 친화성 크로마토그래피, (2) 약한 음이온 교환 크로마토그래피, (3) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 (4) 강한 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하는 재조합 FSH의 정제를 위한 방법이 개시되어 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 바람직하게는 FSH와 같은 당단백질이 높은 수율 및 순도가 되도록 하는 비용-효율적인 정제 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 FSH와 같은 당단백질을 함유하는 액체를, a) 역상 크로마토그래피(RPC); b) 크기 배제 크로마토그래피(SEC); 및 c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계에 적용시키는 것을 포함하는 상기 당단백질에 대한 정제 방법에 관한 것이다.

단계 a), b) 및 c)는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 역상 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피가 상기 3개의 크로마토그래피 단계 중 첫번째로 수행되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 구체예에서, 역상 크로마토그래피가 상기 3개의 크로마토그래피 단계 중 첫번째로 수행된다.

정제 방법은 임의로 추가 단계, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, 염료 친화성 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피 또는 퍼보레이트(perborate) 친화성 크로마토그래피, 여과, 예를 들어, 정용여과(diafiltration), 초여과 또는 나노여과(nanofiltration), 및/또는 적어도 하나의 바이러스 비활성화 단계를 포함할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 네번째 크로마토그래피 단계로서 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 포함한다.

한 바람직한 구체예에서, 단계 (a), (b) 및 (c)는 (1) 역상 크로마토그래피, (2) 크기 배제 크로마토그래피, 및 (3) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 순서로 수행된다.

첫번째 크로마토그래피 단계로서 RPC를 수행하는 것이 바람직한데, 이는 이러한 구체예가 임의로 하기에 기재되는 바와 같은 청소(예를 들어, 여과), 농축 및/또는 완충액 교환 단계 후에 다소 "가공되지 않은(raw)" 생물학적 액체, 예를 들어, 미정제 당단백질, 천연원 액체, 세포 배양 배지 또는 세포 용해질을 RPC에 직접 로딩하기 위한 선택을 제공하기 때문이다. 이러한 구체예는, 상기 샘플 액체를 이용하는 경우에 많은 양의 샘플이 컬럼의 클로깅(clogging) 또는 오버로딩(overloading)의 위험 없이 크로마토그래피 컬럼에 로딩될 수 있다는 장점을 제공한다. 또한, RPC에 필요한 완충액 조건은 샘플 용액 성분의 과도한 응집을 발생시키지 않는다. 요약하면, 첫번째 크로마토그래피 단계로서 RPC를 이용하는 것은 크로마토그래피 정제 시작 전에 필요한 준비 단계의 수를 감소시키고, 관심 당단백질 외에 많은 양의 다른 성분을 갖는 많은 양의 샘플 용액의 사용을 가능케 한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 (d)가 크기 배제 크로마토그래피 (2) 후, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (3) 전에 수행된다. 상기 기재된 바와 같이, 상기 단계에 더하여, 및 또한 상기 단계들 사이에 추가 단계가 수행될 수 있다.

본 발명의 정제 방법은 높은 순도의 FSH와 같은 당단백질을 제공하며, 이는 이후에 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 순도는 일반적으로 전체 단백질을 기준으로 90% 초과, 바람직하게는 95% w/w 초과, 더욱 바람직하게는 99% w/w 초과, 더욱 더 바람직하게는 99.5% w/w 초과이다. 또한, 본 발명의 정제 방법은 정제 조건에서 큰 변화 없이 산업적 규모로 용이하게 확장가능하다.

본 발명에 따른 정제 방법을 위한 시작 물질을 형성하는 미정제 당단백질은 천연원의 액체로 제공되거나 이로부터 수득될 수 있거나, 예를 들어, 당단백질을 함유하는 세포 배양 수거물에서와 같은 재조합 기술에 의해 제공되거나 수득될 수 있다. 전형적으로, 천연원 또는 세포 수거물, 바람직하게는 세포 수거물로부터 수득되는 바와 같은 시작 물질은 첫번째 크로마토그래피 단계에 의해 포획되기 전에 먼저 정화(예를 들어, 여과에 의함)된 후, 임의로 농축(예를 들어, 초여과를 이용함) 및/또는 완충액 교환(예를 들어, 정용여과 단계를 통함)된다.

크로마토그래피 단계에서, 전형적으로 시판되는 수지가 사용되고, 바람직하게는 중합체 기반 수지 또는 아가로오스 기반 수지가 사용된다. 수지가 작용기화된 막(functionalised membrane), 예를 들어, Sartobind™ 막(Sartorius) 또는 ChromaSorb™(Millipore)으로 대체되는 막 크로마토그래피를 이용하는 것이 또한 가능하다.

본 발명의 정제 방법의 단계는 하기에 보다 상세히 기재된다.

역상 크로마토그래피 단계 (a)

본 발명의 방법은 역상 크로마토그래피 (a)의 단계를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 특히 재조합 당단백질의 경우, 당단백질이, 예를 들어, 천연원 액체 또는 세포 배양 수거물로부터 부화되는 포획 단계로 역상 크로마토그래피가 사용된다. RPC 컬럼으로부터의 용리 후에 바이러스 비활성화를 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 "역상 크로마토그래피"는 특히 비-극성 정지상 및 바람직하게는 극성 이동상이 사용되는 크로마토그래피 단계를 의미한다. 역상 크로마토그래피에서, 보통 극성 화합물이 먼저 용리되고, 비-극성 화합물이 보유된다.

역상 크로마토그래피는 보통 컬럼의 평형화 및 로딩 후, 각각 바람직하게는 아세토니트릴 또는 이소프로판올과 같은 유기 용매를 함유하는 완충액을 이용한 세척 및 이후의 용리에 의해 수행된다. 이소프로판올과 같은 유기 용매가 용리 이후의 바이러스 비활성화에 사용될 수 있다.

평형화, 로드(load), 세척 및 용리는 바람직하게는 약간 알칼리성의 pH, 예를 들어, pH 7 또는 약 pH 7 내지 8.5, 더욱 바람직하게는 7.5 또는 약 7.5의 pH에서 이동상 완충을 이용하여 수행된다. 한 바람직한 구체예에서, 완충 종은 포스페이트 완충액, 바람직하게는 소듐 포스페이트이다. 7.5 또는 약 7.5의 pH에 대해 적절한 대안적 완충액은 BES, MOPS, 암모늄 아세테이트, TES, HEPES를 포함한다.

이후에 단계 (b)(SEC)가 수행되는 경우에서 단계 (a) 후에 완충액 교환이 수행되지 않는 것이 바람직하다. 완충액 교환은 런닝(running) 완충액으로서 AEX 또는 HIC 크로마토그래피와 같은 다음 크로마토그래피 단계에 바람직한 완충액을 이용함으로써 이후의 SEC에 의해 달성될 수 있다.

한 바람직한 구체예에서, RPC 단계에 사용되는 완충 용액은 유기 용매를 함유하며, 이의 농도는 크로마토그래피 단계의 여러 단계(평형화, 로드, 세척 및 용리)에 대해 조정된다. 바람직하게는, 유기 용매는 수 혼화성 유기 용매, 예를 들어, 아세토니트릴 또는 알콜(예를 들어, 메탄올, 에탄올 등), 더욱 바람직하게는 이소프로판올이다.

평형화 및 로딩 완충 용액, 및 세척 완충 용액에서, 유기 용매는 바람직하게는 전체 완충 용액의 5 내지 15% v/v, 바람직하게는 전체 완충 용액의 5 내지 12% v/v의 양으로 함유된다. 세척 완충액은 전형적으로 로딩 완충액과 동일하다. 용리 완충 용액에서, 유기 용매는 바람직하게는 로딩 완충액 보다 많은 양, 바람직하게는 전체 완충 용액의 15 내지 22% v/v, 더욱 바람직하게는 전체 완충 용액의 16 내지 20% v/v의 양으로 함유된다.

바람직한 구체예에서, 역상 크로마토그래피 단계는 바이러스 비활성화 단계를 포함할 수 있다. 바이러스 비활성화는 유기 용매, 바람직하게는 이소프로판올 또는 에탄올의 존재하에서 컬럼에 로딩되거나, 컬럼에 결합되거나, 컬럼으로부터 용리된 단백질을 인큐베이션시킴으로써 달성될 수 있다. 인큐베이션 시간 및 인큐베이션 온도는 바람직하게는 요망되는 정도의 바이러스 비활성화를 실시하기 위해, 특히 사용되는 유기 용매의 농도 및 특성에 따라 선택된다. 더욱이, 상기 파라미터는 또한 정제되는 당단백질의 안정성에 따라 조정되어야 한다. 예를 들어, 단백질은 적어도 15분, 바람직하게는 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간 또는 적어도 6시간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션은 낮은 온도, 예를 들어, 4℃ 또는 그 미만 또는 10℃ 또는 그 미만에서 수행될 수 있거나, 대략 실온에서 수행될 수 있다. 인큐베이션은 샘플이 컬럼에 로딩된 직후, 세척 단계 동안 또는 세척 단계 후, 용리 완충액 적용 후이나 당단백질의 용리 전, 또는 당단백질의 용리 후에 수행될 수 있다. 이소프로판올이 유기 용매로 사용되는 경우, 바이러스 비활성화는 바람직하게는 적어도 15%(v/v), 바람직하게는 약 18%(v/v)의 이소프로판올 농도에서 수행된다. 이러한 경우, 당단백질은 바람직하게는 약 2시간, 바람직하게는 실온에서 인큐베이션된다. 바람직하게는, 바이러스 비활성화는 역상 크로마토그래피 컬럼으로부터의 당단백질의 용리 후, 바람직하게는 사용되는 용리 완충액 중에서 수행된다. 그러나, 특히 바이러스 비활성화 및/또는 당단백질 안정성을 향상시키기 위해 컬럼으로부터의 용리 후에 임의로 추가 성분이 당단백질 용액에 첨가될 수 있다. RPC 동안 바이러스 비활성화 단계를 이용하여, 본 발명의 방법은 임의의 추가 바이러스 비활성화 단계 없이 수행될 수 있다. 그러나, 다양한 바이러스 비활성화 단계, 예를 들어, 본원에 기재되는 바와 같은 RPC 동안의 바이러스 비활성화 및 나노여과 및/또는 pH 조정을 통한 바이러스 비활성화 단계가 또한 조합될 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, RPC의 단계(평형화, 로드, 세척, 용리)를 위한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 예를 들어, L-메티오닌을 함유한다. 대안적 항산화제는 t-부틸-4-메톡시페놀, 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 포타슘 또는 소듐 비메타비설파이트, 소듐 비설파이트를 포함한다.

역상 컬럼 물질은 소수성 물질이 부착될 수 있는 수지로 구성된다. 전형적 컬럼 물질은 실리카 및 폴리스티렌이고; 소수성 리간드가 임의로 부착될 수 있다. 치환되는 수지의 경우, 수지는 전형적으로 지방족, 예를 들어, C₂, C₄, C₆, C₈, C₁₀, C₁₂, C₁₄, C₁₆, 또는 C₁₈ 또는 이의 유도체, 예를 들어, 시아노프로필 (CN-프로필), 또는 분지된 지방족, 또는 벤젠-기반 방향족, 예를 들어, 페닐, 또는 다른 극성 또는 비-극성 리간드로부터 선택되나 이에 제한되지는 않는 소수성 리간드로 치환된다. 리간드는 상기 리간드 중 2개 이상의 혼합물일 수 있다. 적합한 폴리스티렌 기반 수지는, 비제한적인 예로, Rohm Haas(예를 들어, Amberlite XAD 또는 Amberchrom CG), Polymer Labs(예를 들어, PLRP-S), GE Healthcare(예를 들어, Source RPC), Applied Biosystems(예를 들어, Poros R)에 의해 공급되는 수지를 포함한다. 특히 바람직한 수지는 Source 30 RPC(GE Healthcare)이다.

컬럼 물질의 제조 방법 및 최적 특징은 스페이서로도 언급되는 연결 기가 수지와 리간드 사이에 삽입되는 것을 종종 필요로 한다. 본 발명의 방법에서 다른 파라미터는 로드, 즉, 컬럼에 로딩되는 단백질의 양 및 유속을 포함한다. 이러한 파라미터는 당업자에게 공지된 실험을 통해 최적화될 수 있다.

당단백질은 전형적으로 수지 ml 당 적어도 약 0.1 mg, 예를 들어, 수지 ml 당 적어도 약 0.2 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10, 또는 20 mg의 농도, 또는 수지 mL 당 0.1-200 mg, 예를 들어, 0.1-100 mg, 0.5-100 mg, 1-50 mg, 또는 2-30 mg의 범위로 컬럼에 로딩되며; 바람직하게는 로드는 수지 mL 당 적어도 1 mg이다. 패킹된 수지 부피의 측정은 전형적으로 현탁액 또는 유사한 방식으로 수행된다.

크기 배제 크로마토그래피 단계 (b)

본 발명의 방법은 또한, 예를 들어, 당단백질의 추가 정제 및/또는 재완충화(re-buffering)를 위한 크기 배제 크로마토그래피의 단계 (b)를 포함한다. 크기 배제 크로마토그래피는 이전 크로마토그래피 단계의 용리액의 평형화 단계, 및 저장에 요망되는 조성을 갖는 완충액으로 평형화된 겔 여과 매트릭스로의 상기 이전 크로마토그래피 단계의 용리액의 로딩 단계, 또는 전형적으로 6.5 내지 9, 바람직하게는 약 8.5의 pH에서의 당단백질의 추가 처리 단계를 포함한다.

크기 배제 크로마토그래피를 수행하기 위해, 겔은 전형적으로 덱스트란-기반 겔, 예를 들어, Sephadex(예를 들어, Sephadex G-25) 또는 폴리아크릴아미드 겔, 예를 들어, Sephacryl(예를 들어, Sephacryl-S400), 아가로오스-기반 겔, 예를 들어, Superose 또는 Sepharose(예를 들어, Sepharose CL-4B),및 2 종류의 겔로부터 제조된 복합 겔, 예를 들어, Superdex 200 조합 Dextran(Sephadex™) 및 가교된 Agarose(Superose™) 겔을 포함하나 이에 제한되지는 않는 중합 겔 군으로부터 선택된다.

한 바람직한 구체예에서, 완충액은 소듐 포스페이트, 암모늄 아세테이트, MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), Bis-Tris (2-비스(2-히드록시에틸)아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올), ADA (N-(2-아세트아미도) 이미노디아세트산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산), ACES (N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산), BES (N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산), TES (N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산), HEPES (N-2-히드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄설폰산), 바람직하게는 소듐 포스페이트 또는 암모늄 아세테이트, 더욱 바람직하게는 암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.

임의로, 상기 완충액은 또한 무기염, 바람직하게는 알칼리 금속의 할라이드, 더욱 바람직하게는 포타슘 클로라이드 또는 소듐 클로라이드, 가장 바람직하게는 소듐 클로라이드를 포함하며, 상기 무기염의 농도는 약 0 내지 500 mM, 바람직하게는 0 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 약 0 내지 50 mM이다. 한 바람직한 구체예에서, 완충액은 염 비함유 완충액이다.

특히 바람직한 구체예에서, SEC의 단계 (b)(평형화, 로드, 용리)를 위한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 예를 들어, L-메티오닌을 함유한다. 대안적 항산화제는 t-부틸-4-메톡시페놀, 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 포타슘 또는 소듐 비메타비설파이트, 소듐 비설파이트를 포함한다.

크기 배제 크로마토그래피는 등용매(isocratic) 용리에 의해 상기 겔 여과 매트릭스로부터 당단백질을 용리시키는 단계를 추가로 포함하며, 즉, 용리 완충액은 평형화 및/또는 로딩에 사용되는 완충액과 대략 동일한, 바람직하게는 동일한 조성을 갖는다. 유동(flow through)은 280 nm에서의 UV 흡수에 의해 기록될 수 있고, 당단백질을 함유하는 분획이 수거된다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 (c)

본 발명의 방법은 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (c)의 단계를 포함한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 보통 컬럼의 평형화 및 로딩 후, 세척 및 이후의 용리에 의해 수행된다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 단백질의 소수성 특성을 이용하는 분리 방법이다. 흡착은 단백질 상의 비-극성 영역과 고체 지지체 상의 고정된 소수성 리간드 사이의 소수성 상호작용에 의해 촉진된다. 흡착은 수성 이동상 중 높음 염 농도에서 달성되고, 용리는 염 농도를 감소시킴으로써 촉진된다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 소수성 리간드, 예를 들어, 에틸기, 부틸기, 페닐기 또는 헥실기로 치환된 물질이다. 바람직한 물질은 부틸 또는 페닐 리간드로 치환된 물질이다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지는 당 분야에 공지되어 있고, Butyl Sepharose(GE Healthcare), Phenyl Sepharose(저치환 및 고치환), Octyl Sepharose 및 Alkyl Sepharose(모두 GE Healthcare; HIC 수지의 다른 공급원은 Biosepra, France; E. Merck, Germany; BioRad USA를 포함함)와 같은 수지를 포함한다.

한 바람직한 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 Butyl Sepharose HP(GE Healthcare로부터 구입가능함)와 같은 수지를 이용하여 수행된다. 단계 (c)가 유사한 특징을 갖는 대안적 수지를 이용하여 수행될 수 있는 것이 이해된다. 사용될 수 있는 대안적 수지는 다음과 같다: Toyopearl Butyl 650M(Tosoh Biosep Inc.로부터 구입가능), Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(저치환); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(고치환); Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose High Performance; Source 15ETH; Source 15ISO; Source 15PHE, 모두 GE Biosciences (800) 526-3593로부터 구입가능. 또 다른 수지는 BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558로부터의 Hydrocell C3 또는 C4; Hydrocell Phenyl이다(www.biochrom.com 참조).

한 바람직한 구체예에서, 평형화, 로딩, 세척 및 용리 완충액은 소듐 포스페이트, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES, 바람직하게는 소듐 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된다. HIC 수지 상에서의 결합은, 예를 들어, NaCl, (NH₄)₂S0₄ 또는 Na₂S0₄, 바람직하게는 암모늄 설페이트와 같은 염의 첨가를 통해 수득되는 높은 전도율을 갖는 평형화 및 로딩 완충액을 이용하여 일반적으로 달성된다. 바람직한 염 농도는 1 내지 2M, 바람직하게는 약 1.5M (NH₄)₂S0₄이다. 세척은 일반적으로 로딩 완충액을 이용한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계에서의 용리는 바람직하게는 이동상의 전도율을 감소(염 농도를 감소)시킴으로써 수행된다. 감소는 선형 방식 또는 계단식으로 달성될 수 있다.

6 또는 약 6 내지 9 또는 약 9, 더욱 바람직하게는 7.0 또는 약 7.0 내지 8.5 또는 약 8.5, 가장 바람직하게는 7.5 또는 약 7.5의 pH를 갖는 평형화, 로딩, 세척 및 용리 완충액을 이용하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 평형화, 로딩 및 세척 완충액 시스템은 바람직하게는 7.5 또는 약 7.5의 pH의 소듐 포스페이트 및 암모늄 설페이트를 함유한다. 바람직한 용리 완충액은 7.5 또는 약 7.5의 pH의 소듐 포스페이트를 함유한다.

특히 바람직한 구체예에서, HIC의 단계 (c)(평형화, 로드, 세척, 용리)를 위한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 예를 들어, L-메티오닌을 함유한다. 대안적 항산화제는 t-부틸-4-메톡시페놀, 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 포타슘 또는 소듐 비메타비설파이트, 소듐 비설파이트를 포함한다.

추가 단계

3개의 주요 크로마토그래피 단계 (a), (b) 및 (c) 외에, 본 발명의 방법은 당업자에게 공지된 추가 단계, 예를 들어, 크로마토그래피 단계, 여과 단계 또는 바이러스 비활성화 단계를 임의로 포함할 수 있다. 바람직한 추가 단계는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, 염료 친화성 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피 또는 퍼보레이트 친화성 크로마토그래피, 여과, 예를 들어, 정용여과, 초여과 또는 나노여과, 또는 바이러스 비활성화이다.

음이온 교환 크로마토그래피 단계 (d)

한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 음이온 교환 크로마토그래피 (d)를 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 보통 컬럼의 평형화 및 로딩 후, 세척 및 이후의 용리에 의해 수행된다.

음이온 교환 크로마토그래피는 바람직하게는 4차 암모늄 수지, 예를 들어, CaptoQ(GE Healthcare로부터 구입가능), 또는 유사한 특징을 갖는 수지, 예를 들어, ToyoPearl QEA(Tosoh로부터 구입가능), Q Sepharose FF(GE Healthcare로부터 구입가능) 또는 Fractogel EMD, Fractogel TMAE 또는 Fractogel HICAP(Merck KGaA, Darmstadt Germany로부터 구입가능)을 이용하여 수행된다.

음이온 교환 크로마토그래피 수지는 바람직하게는 약간의 알칼리성 pH, 예를 들어, 7.2 또는 약 7.2 내지 9.0 또는 약 9.0, 또는 8.0 또는 약 8.0 내지 9.0 또는 약 9.0, 가장 바람직하게는 8.5 또는 약 8.5의 pH를 갖는 완충액을 이용함으로써 평형화되고, 로딩되고, 세척된다. 적합한 완충액은, 예를 들어, 보레이트 완충액, 트리에탄올아민/이미노디아세트산, 트리스 (2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올), 소듐 포스페이트, 암모늄 아세테이트, 트리신 (N-(트리(히드록시메틸)메틸)글리신), 비신 (2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)에탄산), TES, HEPES, TAPS (N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산)을 포함한다. 가장 바람직한 것은 8.5 또는 약 8.5의 pH의 암모늄 아세테이트이다.

이온-교환 수지로부터의 용리는 염, 바람직하게는 NaCl의 첨가를 통해 이동상의 전도율을 증가시킴으로써 달성된다. 적합한 완충액은, 예를 들어, 보레이트 완충액, 트리에탄올아민/이미노디아세트산 트리스, 암모늄 아세테이트, 트리신, 비신(bicine), TES, HEPES, TAPS를 포함한다. 바람직한 것은 암모늄 아세테이트이다.

음이온 교환 크로마토그래피는 당단백질의 글리칸-모이어티의 다양한 시알화 및/또는 황산화 수준으로부터 주로 발생하는 다양한 전하의 이소형(isoform)을 선택적으로 용리시키는데 사용될 수 있다.

당단백질은 O-연결 방식으로 세린 및/또는 트레오닌 잔기의 OH-기에 부착되고/되거나, N-연결 방식으로 아스파라긴의 아미드 기에 부착된 펩티드 백본 및 올리고당류로부터 구성된다. 올리고당류 구조는 종종 음성으로 하전된 당류 뉴라민산(시알산으로도 명명됨)으로 종결된다.

당단백질 생성물의 생체내 활성은 말단 갈락토오스의 시알화 정도에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 예를 들어, 문헌[De Leeuw et al. (1996, Mol Hum Reprod. 1996 May;2(5):361-9)]에서는 높은 시알산 함량을 갖는 FSH 이소형이 연장된 순환 반감기로 인해 낮은 시알산 함량을 갖는 것보다 높은 특이적 활성을 발휘한 것을 나타내었다. 그러나, 낮은 시알산 함량을 갖는 FSH 이소형은 높은 수용체 결합 활성을 나타낸다. 따라서, FSH의 특정 적용을 위해, 다양한 시알화 정도를 갖는 다양한 이소형이 요구될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "이소형"은 동일하거나 매우 유사한 아미노산 서열 및 공통의 등전점을 갖지만, 부착된 갈락토실-기 및 시알릴-기의 정도, 복잡성, 특성, 안테나리티(antennarity) 및 순서와 관련하여 상이할 수 있는 당단백질을 함유하는 당단백질 제조물/분획을 의미한다. 본 발명에 따른 이소형은 또한 아세틸화 및 황산화와 같은 다른 전하를 갖는 변형에서 추가적으로 상이한, 동일하거나 매우 유사한 아미노산 서열 및 등전점의 다수의 당단백질 형태를 포함할 수 있다. 용어 "매우 유사한 아미노산 서열"은 단백질의 아미노산 서열이 또한 야생형 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 서열을 포함함으로써 동일한 기능을 발휘하는 것을 나타낸다. 특히, "매우 유사한 아미노산 서열"은 전체 참조 아미노산 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 100%를 나타내는 연속 아미노산의 스트레치(stretch) 전체에 걸쳐 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%의 참조 아미노산 서열과의 서열 상동성, 바람직하게는 서열 동일성을 공유한다.

따라서, 당단백질 이소형은 바람직하게는 이의 등전점 및 아미노산 서열에 의해 규정될 수 있고, 각각의 상기 규정된 이소형은 실제 엄격한 화학적 의미의 다수의 이소형(동일한 원자 조성을 갖지만, 공간 구조에서 상이한 분자)을 포함할 수 있다. 특히, 동일 이소형의 다양한 당단백질의 등전점은 바람직하게는 2 단위 이하, 더욱 바람직하게는 1 단위 이하, 0.5 단위 또는 0.2 단위 이하로 상이하고, 가장 바람직하게는 등전점은 0.1 단위 이하로 상이하다.

다양하게 시알화된 이소형과 같은 다양하게 하전된 이소형의 선택적 용리를 위해, 예를 들어, 암모늄 아세테이트, 보레이트 완충액, 트리에탄올아민/이미노디아세트산, 트리스, 소듐 포스페이트, 암모늄 아세테이트, 트리신, 비신, TES, HEPES 또는 TAPS, 바람직하게는 암모늄 아세테이트를 각각 기반으로 하는 pH 및/또는 염 함량이 상이한 2개 또는 그 초과, 바람직하게는 2개의 용리 완충액 A 및 B를 사용하는 것이 바람직하다. 상이한 용리 완충액을 이용하여, 용리는 먼저 하나의 용리 완충액을 이용한 후, 다른 용리 완충액을 이용하고, 임의로 또한 상기 용리 완충액의 다양한 혼합물을 이용한 하나 이상의 중간 용리 단계를 이용하는 계단 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용리는 용리 완충액의 첫번째 혼합비(예를 들어, 첫번째 용리 완충액 100%)로 시작하여 점진적으로 용리 완충액의 두번째 혼합비(예를 들어, 두번째 용리 완충액 100%)로 변경시키는 구배를 이용하여 수행될 수 있다.

일반적으로 첫번째로 사용되는 용리 완충액(완충액 A)은 a) 염을 함유하지 않는 약간 산성인 완충액, 또는 b) NaCl(바람직하게는 20 내지 200mM)과 같은 저염 함량을 갖는 중성 또는 약간 염기성의 완충액일 수 있다. 완충액 A는 낮은 전하, 예를 들어, 낮은 정도의 시알화의 당단백질을 용리시키는데 사용될 수 있다. 변형 a)에서, 완충액 A는, 예를 들어, 3.0 또는 약 3.0 내지 6.5 또는 약 6.5, 또는 4.0 또는 약 4.0 내지 6.0 또는 약 6.0, 가장 바람직하게는 5 또는 약 5의 pH를 갖는다. 변형 b)에서, 완충액 A는, 예를 들어, 7.0 또는 약 7.0 내지 9.0, 바람직하게는 8.5의 pH를 갖는다.

일반적으로 두번째로 사용되는 용리 완충액(완충액 B)은 높은 전하, 예를 들어, 높은 정도의 시알화의 당단백질을 용리시키는데 사용될 수 있는, 완충액 A보다 높은 염 함량의 염을 함유하는 약간 알칼리성의 완충액이다. 완충액 B는, 예를 들어, 7.0 또는 약 7.0 내지 9.0 또는 약 9.0, 또는 8.0 또는 약 8.0 내지 9.0 또는 약 9.0, 가장 바람직하게는 8.5 또는 약 8.5의 pH를 갖는다. 염은 바람직하게는 NaCl이다. 완충액 B의 염 함량은 바람직하게는 200mM 내지 1M이다.

다양한 용리 완충액 및 구배 또는 계단식 용리를 이용하여, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩된 다양한 당단백질 이소형은 이의 전하에 따라 다양한 분획으로 용리될 것이다. 예를 들어, 정제되는 당단백질은 유동의 분획으로 제공될 수 있으며, 즉, 정제되는 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 단지 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않으며, 이는 첫번째 용리 완충액, 특정한 혼합비의 첫번째 및 두번째 용리 완충액, 또는 두번째 용리 완충액과 함께 용리될 수 있다. 추가 정제 단계에 사용되는 당단백질 분획, 및 이에 따른 정제되는 당단백질 이소형은 주로 당단백질의 요망되는 적용에 좌우된다. 관심 대상이 아닌 다른 당단백질 이소형은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 제거될 수 있다. FSH와 관련하여, 예를 들어, 높은 정도의 시알화를 가짐으로써 높은 순환 반감기를 갖는 FSH, 또는 낮은 정도의 시알화를 가짐으로써 높은 수용체 결합 활성을 갖는 FSH만이 정제될 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 이온-교환 크로마토그래피(평형화, 세척, 용리)를 위한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 바람직하게는 L-메티오닌을 함유한다. 대안적 항산화제는 상기 언급되어 있다.

표준 음이온 교환 크로마토그래피에 대한 대안 또는 이에 대한 추가로, 크로마토포커싱(chromatofocusing)이 수행될 수 있다. 크로마토포커싱은 단백질의 등전점(pI)에서의 차이에 따라 단백질을 분리시키는 크로마토그래피 기술이다. 특히, 하전된 정지상이 사용될 수 있고, 크로마토포커싱 컬럼에 로딩된 단백질은 pH 구배를 이용하여 용리될 수 있다. 예를 들어, 정지상은 양성으로 하전될 수 있고, pH 구배는 첫번째 pH로부터 두번째의 낮은 pH, 예를 들어, 약 pH 9로부터 약 pH 6 또는 약 pH 7로부터 약 pH 4로 진행될 수 있다. 크로마토포커싱의 특이적 조건으로 인해, 단백질은 이의 등전점의 순서로 용리되고, 바람직하게는 특정 pI의 단백질이 협소한 밴드로 포커싱된다. 단백질의 pI보다 높은 pH에서 단백질이 음성으로 하전되고 양성으로 하전된 정지상에 부착됨에 따라, 단백질이 느려진다. 용리 구배의 pH가 단백질의 pI에 도달하는 경우, 단백질은 전하에 있어서 전체 중성이 되고, 이에 따라 이동상의 유동으로 이동한다. 단백질의 pI보다 낮은 pH에서, 단백질은 이의 양성 전하로 인해 정지상에 의해 반발되며, 이에 따라 단백질 이동이 촉진된다. 이에 의해, 구역 뒤에 있는 단백질은 앞에 있는 단백질보다 더욱 신속하게 이동하여 점진적으로 더욱 협소한 밴드의 단백질을 형성할 것이다. 이러한 환경에서, 가장 높은 pI를 갖는 단백질이 먼저 용리되고, 가장 낮은 pI를 갖는 단백질이 마지막으로 용리될 것이다.

적합한 정지상은, 예를 들어, 하전된 완충 아민으로 치환된 매질, 예를 들어, Mono P(GE Healthcare로부터 구입가능) 또는 다른 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 용리를 위한 pH 구배를 형성시키기 위해, Polybuffer 74 또는 Polybuffer 96(GE Healthcare로부터 구입가능)과 같은 적합한 완충 시스템이 이용될 수 있다. 컬럼의 평형화, 로딩 및 세척은 관심 당단백질 및/또는 임의의 불순물이 컬럼 물질에 결합하는 임의의 조건을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피에 대해 상기 기재된 바와 같은 조건이 이용될 수 있다. 감소하는 pH 구배를 이용하는 경우, 바람직하게는 용리 구배의 시작 pH와 동등하거나 이보다 높은 pH를 갖는 완충액이 평형화, 로딩 및/또는 세척에 이용된다. 증가하는 pH 구배를 이용하는 경우, 바람직하게는 용리 구배의 시작 pH와 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는 완충액이 평형화, 로딩 및/또는 세척에 이용된다. 바람직하게는, 평형화, 로딩 및 세척에 대해, 용리 pH 구배의 시작에서 사용되는 것과 유사한 완충액이 사용된다.

전체 과정

역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 음이온-교환 크로마토그래피의 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있으나, 역상 크로마토그래피의 단계를 첫번째로 수행하는 것이 바람직하다. 나머지 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있으나, (1) 역상 크로마토그래피, (2) 크기 배제 크로마토그래피, (3) 음이온 교환 크로마토그래피, (4) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 순서에 따르는 것이 바람직하다. 초여과 및/또는 정용여과의 이후의 농축 및/또는 완충액 교환 단계 (5), 및 나노여과의 단계 (6)는 선택적이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 당단백질의 정제를 위한 방법은 면역친화성 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 본원에 기재된 것을 제외한 임의의 추가 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 단지 3개의 크로마토그래피 단계, 즉, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 단지 4개의 단계, 즉, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 또한 상기 기재된 바와 같은 크로마토포커싱 단계에 의해 대체될 수 있다.

그러나, 추가의 비-크로마토그래피 단계, 바람직하게는 본원에 기재된 비-크로마토그래피 단계가 규정된 단계에 더하여 및 또한 규정된 단계 사이에 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 추가 단계는 박테리아, 바이러스, 핵산 또는 프리온 단백질과 같은 요망되지 않거나 위험한 물질을 감소시키거나 비활성화시키기 위한 단계, 예를 들어, 멸균 여과, 나노여과, 흡착 및/또는 pH 비활성화 단계를 포함한다. 대안적 구체예에서, 상기 기재된 단계 외에, 본 발명에 따른 방법은, 예를 들어, 흡착 크로마토그래피를 포함하는 요망되지 않거나 위험한 물질을 감소시키거나 비활성화시키기 위한 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 정제 방법은 적어도 하나, 더욱 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개의 바이러스 감소 또는 비활성화 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 또한 본 발명에 따른 정제 방법의 크로마토그래피 단계, 특히 크기 배제 크로마토그래피 단계 (b)가 바이러스 감소 단계로 사용될 수 있는데, 상기 크기 배제 크로마토그래피 단계가 일반적으로 당단백질로부터 바이러스를 분리시키기 때문이다. 예를 들어, 바이러스 및 바이러스-유사 입자는 당단백질에 비해 훨씬 큰 크기를 가지며, 이에 따라, 크기 배제 크로마토그래피 동안 당단백질로부터 효과적으로 분리된다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 크기 배제 크로마토그래피 직전 및/또는 직후에 완충액 교환 단계를 포함하지 않는다. 특히, 상기 방법이 (1) 역상 크로마토그래피, (2) 크기 배제 크로마토그래피, 임의의 (3) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (4) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 순서로 수행되는 경우, 바람직하게는 역상 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피 사이 및/또는 크기 배제 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 사이에 완충액 교환이 존재하지 않는다.

다른 단계

첫번째 크로마토그래피 단계 전(특히, 역상 크로마토그래피의 단계 전), 미정제 당단백질을 농축시키기 위해 초여과의 단계를 수행하는 것이 요망될 수 있다. 또한, 완충액 교환을 수행하기 위해 첫번째 크로마토그래피 단계 전에 정용여과 단계가 추가로 수행될 수 있다. 초여과 단계 및 정용여과 단계는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 초여과 및/또는 정용여과는 바람직하게는 3-30 kD 또는 약 3-30 kD, 가장 바람직하게는 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프(cut-off)를 갖는 막을 이용하여 수행된다. 그러나, 본 발명은 또한 정제 방법을 포함하며, 여기서 첫번째 크로마토그래피 단계 전에 초여과 단계 및/또는 정용여과 단계가 수행되지 않는다.

한 바람직한 구체예에서, 크로마토그래피의 단계 중 하나 이상 후(특히, 크로마토그래피의 마지막 단계 후), 당단백질 샘플은 초여과 및/또는 정용여과 단계에 적용된다. 바람직하게는, 초여과 및/또는 정용여과는 요망되는 조성을 갖는 벌크를 수득하기 위해 수행된다. 초여과 (및/또는 정용여과)는 바람직하게는 3-30 kD 또는 약 3-30 kD, 가장 바람직하게는 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용하여 수행된다. 초여과 및/또는 정용여과 동안, 예를 들어, 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES, 바람직하게는 소듐 포스페이트, 바람직하게는 소듐-포스페이트 함유 안정화제, 예를 들어, 수크로오스 및 항산화제, 예를 들어, L-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 예비-제형화 완충액으로의 완충액 교환을 수행하는 것이 바람직하다. pH는 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 약 7.0 내지 7.1의 범위이다.

본 발명에 따른 정제 방법에서 수행될 수 있는 추가의 임의적 단계는 하나 이상의 멸균 여과 단계를 포함한다. 이러한 단계는 진핵생물 및/또는 원핵생물 세포, 특히 박테리아, 및/또는 바이러스와 같은 생물학적 오염을 제거하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 단계는 멸균 여과 단계 후의 추가 오염을 방지하기 위해 정제 방법 종료시 또는 종료에 인접하여 수행된다. 박테리아 또는 다른 세포의 제거를 위해, 멸균 여과에 사용되는 필터는 바람직하게는 0.22 ㎛ 또는 그 미만, 바람직하게는 0.1 ㎛ 또는 그 미만의 세공 크기를 갖는다. 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 제거를 위해, 하기 기재되는 바와 같은 나노여과 단계가 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 정제 방법에서 수행될 수 있는 또 다른 추가 단계는 특정 pH에서의 당단백질의 인큐베이션을 통한 바이러스 비활성화 단계이다. 예를 들어, 당단백질은 4.0 또는 그 미만의 pH, 바람직하게는 약 pH 3.6에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간은 바람직하게는 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 90분, 적어도 2시간, 적어도 3시간 또는 적어도 6시간이다. 인큐베이션은 10℃ 또는 그 미만 또는 4℃ 또는 그 미만과 같은 낮은 온도 또는 대략 실온에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 당단백질 물질은 대략 실온에서 약 90분 동안 약 3.6의 pH에서 인큐베이션될 수 있다. 이러한 바이러스 비활성화 단계는 정제 방법 동안 임의의 시점에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 마지막 크로마토그래피 단계 후에 수행된다.

한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기 제시된 순서의 하기 단계를 포함한다:

(0) 초여과(임의로, 추가 정용여과 단계; 바람직하게는 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용함);

(1) 역상 크로마토그래피(RPC)(바람직하게는, Source 30 RPC 컬럼을 이용함);

(1a) 초여과(바람직하게는, 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용함);

(2) 크기 배제 크로마토그래피(바람직하게는, Superdex 200 컬럼을 이용함);

(3) 음이온-교환 크로마토그래피(바람직하게는, CaptoQ 컬럼을 이용함);

(4) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)(바람직하게는, Butyl HP 컬럼을 이용함);

(5) 초여과 및/또는 정용여과(바람직하게는, 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용함).

당단백질 샘플을, 특히 바이러스 청소 단계로서, 즉, 세포 배양으로부터 발생하는 바이러스 또는 바이러스-유사 입자에 의한 당단백질 제조물의 오염 위험을 감소시키기 위해 나노여과 단계에 적용시키는 것이 요망될 수 있다. 나노여과는 정제 방법의 임의의 단계에서 수행될 수 있으나, 크로마토그래피 절차의 종료 후에 나노여과를 수행하는 것이 특히 바람직하다. 나노여과는 1회 이상 수행될 수 있고, 예를 들어, 2회 수행될 수 있다. 바람직한 나노여과 장치는 약 15 내지 20 nm의 세공 크기를 갖는다.

따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기 제시되는 순서의 하기 단계를 포함한다:

(0) 초여과(바람직하게는, 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용함);

(5) 초여과 및/또는 정용여과(바람직하게는, 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용함);

(6) 나노여과(바람직하게는, 바이러스 정화를 포함함).

상기 기재된 특정 정제 방법은 바람직하게는 임의의 추가 크로마토그래피 단계 및/또는 초여과 단계 및/또는 정용여과 단계를 포함하지 않고 수행된다. 그러나, 특정 구체예에서, 상기 기재되는 정제 방법은 추가 단계, 특히 본원에 기재된 추가 단계 중 하나 이상, 예를 들어, 요망되지 않고/않거나 위험한 물질을 제거하거나 비활성화시키는데 사용되는 추가 단계를 추가로 포함할 수 있다.

항산화 및 제거(scavenging) 효과를 갖는 항산화제 또는 유리 아미노산 또는 디펩티드가 본 발명에 따른 정제 방법의 단계 중 일부 또는 전부에 포함되는 것이 바람직하다. 더욱 특히, 항산화제는 FSH와 같은 당단백질을 정제하고/하거나, 농축시키고/시키거나, 여과시키는데 사용되는 완충제 중 임의의 것에 존재한다. 항산화제는 처리 동안 FSH와 같은 당단백질의 산화를 방지한다. 바람직한 항산화제는 L-메티오닌이다. 바람직하게는, L-메티오닌은 0.1 또는 약 0.1 내지 10 mM의 농도로 사용된다. 항산화제의 추가 예는 t-부틸-4-메톡시-페놀, 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 포타슘 또는 소듐 비메타-비설파이트, 소듐 비설파이트를 포함한다. 항산화 및 제거 효과를 갖는 유리 아미노산 및 디펩티드의 예는 히스티딘, 타우린, 글리신, 알라닌, 카르노신, 안세린, 1-메틸히스티딘 또는 이의 조합물이다.

본 발명의 장점은 정제 방법이 매우 효과적이고, 크로마토그래피 단계 수를 최소 3개의 크로마토그래피 단계 또는 고도로 시알릴화된 당단백질 분자의 부화를 포함하여 최소 4개의 크로마토그래피 단계로 감소시키는 것이다. 특히, 본 발명에 따른 정제 방법을 이용하여, 비용 집약적이고 문제가 되는 정제 단계, 예를 들어, 특히 친화성 정제 단계, 특히 면역친화성 정제 단계가 불필요하게 되고 회피될 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어, HCP-ELISA에 의해 측정되는 경우 전체 단백질을 기초로 하여 각각 90% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 더욱 바람직하게는 99% w/w 초과의 높은 정도의 당단백질 순도 및 특이적 대 생물 활성(bioactivity)을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 정제 방법은 놀랍게도 시작 물질에 존재하는 관심 당단백질의 높은 회수를 제공한다.

당단백질

당단백질은 폴리펩티드 측쇄에 공유적으로 부착된 올리고당류 사슬(글리칸)을 함유하는 단백질이다. 당단백질은 바람직하게는 폴리펩티드의 질소 원자(N-당화) 또는 산소 원자(O-당화)에 커플링되는 하나 이상의 글리칸을 포함할 수 있다. 따라서, 당단백질은 N-당화되고/되거나 O-당화될 수 있다. 바람직하게는, 당단백질은 천연 글리칸을 포함한다. 그러나, 용어 "당단백질"은 천연 글리칸 및/또는 비-천연 글리칸, 특히 합성적으로 생성된 글리칸 및/또는 비-천연 또는 변형된 단당류 유닛(들)을 포함하는 글리칸을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.

정제되는 당단백질은 바람직하게는 모든 이소형 및 변이체를 포함하는 생식샘자극호르몬, 예를 들어, FSH(난포자극호르몬), CG(융모생식샘자극호르몬), LH(황체형성호르몬) 및 TSH(갑상샘-자극 호르몬)의 군으로부터 선택된다. 본 출원에서 사용되는 용어 "당단백질", "FSH", "CG", "LH" 및 "TSH"는 항상 당단백질의 모든 이소형 및 변이체, 특히 하기 기재되고 상기 단계 (d)(AEX)하의 것을 포함한다. 본 발명에 따른 용어 "생식샘자극호르몬"은 바람직하게는 천연 생식샘자극호르몬, 예를 들어, FSH, CG, LH 및 TSH 뿐만 아니라 이의 재조합 형태 및 이의 임의의 이소형, 변이체 및 유사체를 의미한다. 바람직하게는, 생식샘자극호르몬의 이소형, 변이체 및 유사체는 천연 생식샘자극호르몬의 하나 이상의 생물학적 활성을 나타낸다. 그러나, 본 발명에 따른 당단백질의 정제 방법은 또한 다른 당단백질, 예를 들어, 에리트로포이어틴, 다양한 항체, 특히 모노클로날 항체, 과립구 대식세포-집락-자극 인자, 및 조직 플라스미노겐 활성제를 정제하는데 적합하다.

저장/동결건조

상기 기재된 바와 같은 정제 방법으로부터 발생하고, 정제된 당단백질을 함유하는 액체 조성물은 그대로(as is) 저장을 위해 동결될 수 있거나, 정제 후, 용매를 제거하기 위해 용리액은 동결건조("동결-건조")에 적용될 수 있다. 생성된 액체 또는 동결건조된 생성물은 "당단백질 벌크(Bulk)"로 명명된다.

제형화

본 발명의 당단백질 또는 본 발명의 방법에 따라 정제된 당단백질은 임의의 종류의 투여, 바람직하게는 근내 또는 피하, 바람직하게는 피하 주사용으로 제형화될 수 있다. 당단백질 제형은 동결-건조될 수 있고, 이러한 경우 상기 당단백질은 주사 직전에 주사용수에 용해된다. 당단백질 제형은 또한 액체 제형일 수 있고, 이러한 경우 상기 당단백질은 직전의 용해 없이 직접 주사될 수 있다. 제형은 공지된 부형제 및 안정화제를 함유할 수 있고, 추가로 항산화제 및/또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 당단백질 제형은 단일 용량 또는 다용량일 수 있다. 다용량인 경우, 이는 바람직하게는 정균제, 예를 들어, 알킬파라벤, 벤질 알콜, 메타-크레솔, 티몰 또는 페놀, 바람직하게는 메틸파라벤 또는 메타-크레솔을 함유해야 한다. 단일 용량 제형은 또한 정균제를 포함할 수 있다. 적합한 제형은, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 WO 2004/087213호, WO 00/04913호, WO 2007/092829호 및 EP 0 853 945호에 기재되어 있다.

본 발명의 당단백질은 공지된 부형제 및 안정화제, 예를 들어, 수크로오스 및 만니톨과 함께 제형화될 수 있다. 이는 또한 항산화제, 예를 들어, 메티오닌을 포함할 수 있다. 이는 추가로 계면활성제, 예를 들어, TWEEN(바람직하게는, TWEEN 80), 또는 Pluronic(바람직하게는, Pluronic F68)을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 다용량 제형에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 당단백질은 수크로오스, 포스페이트 완충액(pH 6.5 내지 7.5), Pluronic F68, 메티오닌 및 정균제와 함께 주사용수에 상기 당단백질을 용해시킴으로써 제형화된다.

적응증

본 발명의 당단백질은 상기 당단백질을 필요로 하는 모든 치료에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, FSH는 배란유도, 보조생식기술을 위한 과배란유도, 및 정자부족의 치료에서 피하 투여에 특히 적합하다. 이는 다른 생식샘자극호르몬, 예를 들어, LH 및 CG와 함께 사용될 수 있다. 이는 또한 FSH에 대한 반응을 증가시키는 추가 화합물, 예를 들어, 클로미펜 시트레이트, 아로마타제 억제제, 예를 들어, 아나스트로졸(Anastrozole), 레트로졸(Letrozole), 파드로졸(Fadrozole) 및 YM-511과 함께 사용될 수 있다. 더욱이, LH 및 CG는 또한 생식능력 치료에서 단독으로 사용될 수 있다.

재조합 당단백질

용어 "재조합"의 사용은 재조합 DNA 기술의 사용을 통해 생성되는 FSH와 같은 당단백질의 제조를 의미한다. 재조합 기술을 이용하여 당단백질을 발현시키는 방법의 한 예는 관심 당단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한 적합한 숙주 세포, 바람직하게는 진핵생물 숙주 세포의 트랜스펙션이다. 보통, 발현 벡터는 당단백질의 발현을 유도하는 강한 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 SV40, 및 통합된 벡터를 갖는 숙주 세포를 선택하기 위한 적합한 선택 마커를 갖는다. 트랜스펙션은 안정적이거나 일시적일 수 있다. 적합한 재조합 발현 시스템은 종래에 널리 공지되어 있고, 따라서 상세한 기재를 필요로 하지 않는다. 바람직하게는, 진핵생물 숙주 세포는 영장류 세포, 바람직하게는 사람 세포 및 설치류 세포, 바람직하게는 CHO 세포로부터 선택된다. FSH의 재조합 발현을 위해, 진핵생물 숙주 세포는 유럽 특허 번호 EP 0 211 894호 및 EP 0 487 512호에 기재된 바와 같이 하나의 벡터로 제공되거나 별개의 프로모터를 갖는 각각의 서브유닛을 갖는 두개의 벡터로 제공되는지 간에 FSH의 알파 및 베타 서브유닛을 엔코딩하는 DNA 서열로 트랜스펙션된다. FSH를 엔코딩하는 DNA는 cDNA일 수 있거나, 이는 인트론을 함유할 수 있다.

FSH를 생성시키기 위한 재조합 기술의 사용의 또 다른 예는 유럽 특허 번호 EP 0 505 500호(Applied Research Systems ARS Holding NV)에 기재된 바와 같이 FSH의 서브유닛 중 하나 또는 둘 모두를 엔코딩하는 내인성 서열에 작동적으로 연결되는 이종성 조절 세그먼트를 삽입시키는 상동성 재조합의 사용에 의한 것이다. 서브유닛 중 하나가 세포에 이종성으로 삽입되고, 다른 서브유닛이 상동성 재조합에 의한 이종성 조절 세그먼트의 삽입에 의해 유전체 서열의 활성화에 의해 발현되는 WO 99/57263호(Transkaryotic Therapies)에 개시된 것과 같은 방법이 또한 고려된다. 본 발명의 방법은 상기 방법 및 다른 방법 중 임의의 것을 이용하여 발현된 FSH를 정제시키는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 정제 방법은 천연 당단백질 뿐만 아니라 이소형 및 변이체를 포함하는 재조합 당단백질을 정제시키는데 유용하다. 당단백질 이소형은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 이소형을 의미한다. 용어 "변이체"는 바람직하게는 천연 당단백질로부터 유래된 당단백질, 예를 들어, 천연 당단백질의 돌연변이 형태, 천연 당단백질의 융합 단백질, 천연 당단백질의 단편 및/또는 다양한 당화 패턴을 갖는 당단백질을 포함한다. 또한, 글리코미메틱(glycomimetic) 구조 및/또는 펩티도미메틱(peptidomimetic) 구조를 포함하는 단백질을 포함하는 당단백질의 모방 화합물이 포함된다. 바람직하게는, 당단백질 변이체 및/또는 이소형은 천연 당단백질의 활성과 정성적 및/또는 정량적으로 유사하거나 동일한 하나 이상의 활성을 나타낸다.

표현 "당단백질 변이체", 예를 들어, "FSH 변이체"는 사람 당단백질로부터의 당화 부위(추가 또는 결실 당화 부위를 포함함)의 아미노산 서열, 수, 또는 서브유닛 내 연결이 상이하나 상기 사람 당단백질의 활성 중 하나 이상을 나타내는 분자를 포함하는 것을 의미한다. FSH 변이체의 예는 문헌[LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; 또는 Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]]에 기재된 바와 같은 hCG의 카르복시 말단 펩티드가 FSH의 [베타]-서브유닛의 C-말단에 융합된, 야생형 [알파]-서브유닛 및 하이브리드 [베타]-서브유닛으로 구성되는 장기 작용의 변형된 재조합 FSH인 CTP-FSH를 포함한다. 하기 서열(N-말단으로부터 C-말단)로 구성되는 단쇄 분자인 단쇄 CTP-FSH가 또한 포함된다:

[베타]FSH, [베타]hCG CTP (113-145), [알파]FSH

상기에서, [베타]FSH는 FSH의 [베타]-서브유닛을 의미하고, [베타]hCG CTP (113-145)는 hCG의 카르복시 말단 펩티드를 의미하고, [알파]FSH는 FSH의 [알파]-서브유닛을 의미하며, 이는 문헌[Klein et al. [Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255]]에 기재되어 있다. FSH 변이체의 다른 예는 WO 01/58493호(Maxygen)에 개시된 바와 같은 [알파]-서브유닛 및/또는 [베타]-서브유닛에 통합된 추가 당화 부위를 갖는 FSH 분자, 및 WO 98/58957호에 개시된 바와 같은 서브유닛간 S-S 결합을 갖는 FSH 분자를 포함한다. FSH 변이체의 추가 예는 WO 91/16922호 및 WO 92/22568호에 기재된 것과 같은 FSH로부터의 서열 및 hCG 또는 LH로부터의 서열을 포함하는 키메라 분자를 포함한다.

본원에서 언급되는 FSH 변이체는 또한 전장 성숙 단백질보다 짧은 베타 서브유닛의 카르복시 말단 결실을 포함한다. 베타 사슬의 카르복시 말단 변이체가 공지된 알파 서브유닛과 복합체를 형성하여 FSH 변이체 이종이합체를 형성하는 것이 이해된다. 더욱이, FSH 변이체는 또한 α-사슬 및 β-사슬 또는 이의 일부가 하나의 폴리펩티드 사슬로 조합되고, 바람직하게는 둘 모두의 사슬 사이에 링커를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. FSH 융합 단백질의 다른 예에서, FSH 사슬 중 하나 또는 둘 모두는 항체 또는 이의 일부, 예를 들어, 항체의 Fc 단편에 융합된다.

본원에서 언급되는 FSH 변이체는 또한, 예를 들어, 말(Equus caballus), 돼지(Sus scrofa), 소(Bos taurus), 고양이(Felis catus), 개(Canis familiaris)와 같은 다양한 종으로부터의 FSH를 포함한다.

한 바람직한 구체예에서, FSH는 혈청 또는 혈청 비함유 배지 중에서 재조합적으로 생성된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 정제된 FSH는 환자에 의한 자가-투여를 가능케 하는 피하 투여에 적합하다.

유사한 방식의 예시적 당단백질로서 FSH와 관련하여 상기 기재된 당단백질의 변이체가 또한 적절한 경우 다른 당단백질, 특히 LH, TSH 및 CG와 같은 다른 생식샘자극호르몬에 적용된다.

표현 "미정제 재조합 당단백질"은 당단백질이 임의의 크로마토그래피 단계를 겪기 전의 상기 당단백질을 발현하는 재조합 세포로부터의 세포 배양 상층액을 의미한다. 상기 표현은 상층액의 미가공 형태(세포로부터 분리된 바와 같음) 뿐만 아니라 농축되고/되거나, 여과되고/되거나, 초여과된 상층액을 포함한다.

당단백질을 제조하기 위한 방법

본원에 기재된 당단백질의 정제를 위한 방법을 수행함으로써 관심 당단백질을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 당단백질은 천연원으로부터 또는 재조합적으로 수득될 수 있다.

한 바람직한 구체예에서, 관심 당단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 이는 하기 단계를 포함한다:

ⅰ) 관심 당단백질을 재조합적으로 발현시키는 단계;

ⅱ) 상기 당단백질을 함유하는 액체를 적어도 a) 역상 크로마토그래피, b) 크기 배제 크로마토그래피, 및 c) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계에 적용시킴으로써 상기 재조합적으로 발현된 관심 당단백질을 정제시키는 단계.

각각의 제조 방법은 약학적 제형으로 사용하기에 특히 적합한 매우 순수한 당단백질의 생성을 발생시킨다.

상기 제조 방법은 바람직하게는 정제 방법과 함께 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나 이상의 단계를 포함한다. 각각의 개시내용이 또한 본 발명에 따른 제조 방법에 적용되고, 반복을 피하기 위해 상기 개시내용이 참조된다.

더욱이, 본 발명에 따른 제조 방법은 약학적 제형 형태로 관심 당단백질을 제형화시키는 단계를 포함할 수 있다. 안정적인 액체 또는 동결건조된 제형이 종래에 공지되어 있고, 상기 기재되어 있으며, 본 발명자는 각각의 개시내용을 참조한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 제조 방법에 의해 생성되는 관심 당단백질은, 바람직하게는 FSH, CG, LH 및 TSH로부터 선택되는 생식샘자극호르몬으로부터 선택된다.

실험 섹션

하기 실험은 본 발명의 방법을 예시하며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 개시내용을 한정하고자 하는 것이 아니다.

단계 0: 초여과

시작 물질을 형성하는 미정제 FSH를 재조합 FSH를 함유하는 세포 배양 상층액으로부터 획득하였다.

초여과 단계 전, 상층액을 2 ㎛ 깊이의 필터를 통한 실온 여과에 의해 정화시켰다. 이후, 1.2 바(bar)를 초과하지 않는 막간 차압(transmembrane pressure)과 함께 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용하여 초여과를 수행하였다.

단계 1: 역상 크로마토그래피( Source30 RPC 컬럼 )

로딩 완충액: 20 mM Na-포스페이트 pH 7.5/10% v/v 이소프로판올(메티오닌 함유)

용리 완충액: 20 mM Na-포스페이트 pH 7.5/18% v/v 이소프로판올(메티오닌 함유)

농축 및 초여과(단계 0)으로부터 수득된 물질에 이소프로판올을 로딩 완충액과 동등한 농도로 보충하였다. Source30 컬럼을 로딩 완충액으로 평형화시켰다. 컬럼으로 상기 물질을 로딩시킨 후, 결합되지 않은 물질을 로딩 완충액으로 약 15CV 동안 세척하였다. 용리 완충액 중의 이소프로판올 농도를 18% v/v까지 증가(약 8CV)시킴으로써 FSH를 용리시켰다. 다음 단계로 진행시키기 위해 용리 풀(pool)을 초여과에 의해 농축시켰다. 상기 단계를 실온에서 수행하였다.

단계 1a: 초여과

단계 1(RPC)로부터의 용리액을 실온에서 1.2 바를 초과하지 않는 막간 차압에서 10 kD 또는 약 10 kD의 컷오프를 갖는 막을 이용한 초여과에 적용시키고, 상기 용리액을 SEC 컬럼 부피의 약 10%로 농축시켰다.

단계 2: 크기 배제 크로마토그래피( Superdex 200 컬럼 )

런닝 완충액: 15 mM 암모늄-아세테이트 pH 8.5(메티오닌 함유)

단계 1a로부터의 풀링된 물질을 SEC 컬럼에 적용시키고, 런닝 완충액으로 평형화시켰다. FSH를 다른 체류 시간(약 0.6 - 0.7 CV)으로 등용매 조건하에서 용리시켰다. 이러한 크로마토그래피 단계는 다음 단계 전의 정제 및 완충액 교환을 제공한다. SEC 단계를 실온에서 수행하였다.

단계 3: 음이온-교환 크로마토그래피( CaptoQ 컬럼 )

로딩 완충액: 15 mM 암모늄-아세테이트 pH 8.5(메티오닌 함유)

용리 완충액 A: 15 mM 암모늄-아세테이트 pH 5(메티오닌 함유)

용리 완충액 B: 15 mM 암모늄-아세테이트 pH 8.5(메티오닌 함유) - 0.25 M NaCl

이후, 단계 2(SEC)로부터 수득된 물질을 로딩 완충액으로 평형화된 음이온 교환 수지에 적용시켰다. 결합되지 않은 물질을 로딩 완충액으로 세척(약 10 CV)하였다. FSH를 용리 완충액 A(덜 하전된 FSH 분자를 함유함)으로 부분적으로 용리시키고, 용리 완충액 B(더 많이 하전된 FSH 분자를 함유함)로 두번째 용리 단계를 수행하였다. 둘 모두의 용리 단계를 계단 방식으로 수행하였다. AEX를 실온에서 수행하였다.

단계 4: 소수성 상호작용 크로마토그래피( HIC )( Butyl HP 컬럼 )

로딩 완충액: 20 mM Na-포스페이트 pH 7.5 - 1.5M 암모늄-설페이트(메티오닌 함유)

용리 완충액: 20 mM Na-포스페이트 pH 7.5(메티오닌 함유)

음이온-교환 크로마토그래피 컬럼(높은 산성 FSH 분자)으로부터 수득된 완충액 B를 이용한 용리로부터의 물질을 로딩 완충액을 이용하여 1.5M 암모늄-설페이트로 조정하고, 로딩 완충액으로 평형화된 Butyl-HP Sepharose 컬럼에 로딩시켰다. 결합되지 않은 물질을 세척한 후, 암모늄-설페이트 농도를 선형 방식으로 0으로 감소시킴으로써 FSH를 컬럼으로부터 용리시켰다. HIC 단계를 실온에서 수행하였다.

단계 5: 정용여과 (10 kD 의 컷오프를 갖는 막)

예비제형화 완충액: 9-10 mM 소듐-포스페이트 pH 7.0 - 7.1

0.1 g/l 메티오닌

50 mg/ml 수크로오스

이후, 단계 4(HIC)로부터의 용리액을 실온에서 정용여과에 적용시켰다. 이러한 단계에 의해, 완충액을 예비제형화 완충액으로 교환시키고, 요망되는 농도로 조정하였다.

단계 6: 나노여과

정용여과 단계로부터의 생성물을 약 2 바의 압력에서 20 nm 나노여과 장치에 직접 적용시켰다. 상기 단계를 실온에서 수행하였다.

단계 (-1) 내지 (6)의 방법은, FSH가 HCP-검정에 의해 결정시 전체 단백질을 기준으로 99.99% w/w 초과의 순도가 되도록하였다(숙주 세포 단백질 수준 0.01% w/w 미만).

Claims

당단백질을 함유하는 액체를,
a) 역상 크로마토그래피,
b) 크기 배제 크로마토그래피, 및
c) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계에 적용시키는 것을 포함하고; 상기 단계가, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 순서로 수행되고,
상기 당단백질은 생식샘자극호르몬인, 상기 당단백질을 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 역상 크로마토그래피 단계 a)에서, 용리 완충액이 유기 용매를 함유하는, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 단계 b)에서, 완충액 교환이 수행되는, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 단계, 여과 단계 및 바이러스 비활성화 단계로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는 추가 단계를 더 포함하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 추가 단계가 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 여과 및 바이러스 비활성화로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 5항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에서 선택되고, 친화성 크로마토그래피는 염료 친화성 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 퍼보레이트(perborate) 친화성 크로마토그래피에서 선택되고, 여과는 정용여과(diafiltration), 초여과, 나노여과(nanofiltration)에서 선택되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 d); 크로마토포커싱(chromatofocusing) 단계; 또는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 d) 및 크로마토포커싱(chromatofocusing) 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 7항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 d)가 크기 배제 크로마토그래피 단계 b) 이후에 수행되는 방법.
제 7항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 d)에서, 적어도 하나의 염-함유 용리 완충액이 사용되는 방법.
제 7항에 있어서, 당단백질의 다양한 하전된 이소형(isoform)이 분리되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 당단백질이 FSH(난포자극호르몬), CG(융모생식샘자극호르몬), LH(황체형성호르몬) 및 TSH(갑상샘-자극 호르몬)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 당단백질이 재조합적으로 생성되는 방법.
제 1항에 있어서,
(0) 초여과:
(1) 역상 크로마토그래피;
(1a) 초여과;
(2) 크기 배제 크로마토그래피;
(3) 음이온-교환 크로마토그래피;
(4) 소수성 상호작용 크로마토그래피;
(5) 초여과; 정용여과; 또는 초여과 및 정용여과;
(6) 나노여과의 단계를 순차적으로 수행하거나;
(0) 초여과:
(1) 역상 크로마토그래피;
(2) 크기 배제 크로마토그래피;
(3) 음이온-교환 크로마토그래피;
(4) 소수성 상호작용 크로마토그래피;
(5) 초여과; 정용여과; 또는 초여과 및 정용여과;
(6) 나노여과의 단계를 순차적으로 수행하는 것을 포함하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
(i) 역상 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 사이에 완충액 교환 단계를 포함하지 않거나
(ii) 크기 배제 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 사이에 완충액 교환 단계를 포함하지 않거나
(iii) 면역 친화성 크로마토그래피; 양이온 교환 크로마토그래피; 또는 면역 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하지 않거나
(iv) 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 구성된 단지 세 크로마토그래피 단계를 포함하거나; 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 크로마토포커싱 단계 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 구성된 네 크로마토그래피 단계만을 포함하는 방법.
ⅰ) 관심 당단백질을 재조합적으로 발현시키는 단계;
ⅱ) 상기 당단백질을 함유하는 액체를 적어도,
a) 역상 크로마토그래피,
b) 크기 배제 크로마토그래피, 및
c) 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계에 적용시킴으로써 상기 재조합적으로 발현된 관심 당단백질을 정제시키는 단계를 포함하고,
상기 단계들은 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 순서로 수행되고,
상기 당 단백질은 생식샘자극호르몬인, 관심 당단백질을 제조하는 방법.
제 15항에 있어서,
ⅰ) 제 13항에 정의된 하나 이상의 단계;
ⅱ) 약학적 제형 형태로 관심 당단백질을 제형화시키는 단계; 또는
iii) 제 13항에 정의된 하나 이상의 단계 및 약학적 제형 형태로 관심 당단백질을 제형화시키는 단계 중 적어도 하나를 포함하는 제조 방법.
제 15항에 있어서, 상기 당단백질이 FSH, CG, LH 및 TSH로부터 선택되는 방법.