CN106008662A - 一种以枸杞蜂花粉为原料制备富锌中性糖蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种热水浸提、制备富锌枸杞蜂花粉中性糖蛋白的方法。该方法包括花粉的烘干，粉碎，热水浸提，抽滤并离心取上清，减压浓缩，乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀复溶，透析，冷冻干燥，DEAE‑52柱层析等工序制备枸杞蜂花粉中性糖蛋白。采用ICP‑AES检测分析枸杞蜂花粉中性糖蛋白中微量元素的含量，证明了制备的中性糖蛋白为一种富锌中性糖蛋白。本发明的枸杞蜂花粉中性糖蛋白的制备方法具有提取工艺简单、温和、成本低、不污染环境等优点，且制备的中性糖蛋白富含锌元素，在保健食品及医药行业具有广阔的应用前景。

Description

一种以枸杞蜂花粉为原料制备富锌中性糖蛋白的方法
技术领域
本发明涉及从茄科枸杞属枸杞的蜂花粉中提取相关成分的技术领域，具体涉及一种富锌元素的中性糖蛋白的制备方法。
背景技术
枸杞为茄科枸杞属多年生灌木，在我国主要分布于宁夏、甘肃、新疆、河北、陕西等地。枸杞既是一种传统的中药药材，又是一种营养滋补品。现代研究表明，枸杞里含有众多的功能成分，如枸杞多糖、多酚、维生素、不饱和脂肪酸、甾醇类及萜类等，这些功能成分与枸杞具有的抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抗炎等活性作用有着密切的联系。枸杞蜂花粉作为枸杞植物的遗传基因源，具有抗衰老、提高免疫力、增强大脑发育、促进胃肠消化等作用。近年来，关于枸杞蜂花粉中活性成分的研究逐渐增多，但迄今为止，国内外对于枸杞蜂花粉中糖蛋白的提取制备研究鲜见报道。
发明内容
本发明旨在提供一种低成本、无污染、高效便捷的制备富锌中性糖蛋白的方法：
(1)将枸杞蜂花粉置于60℃下烘干，粉碎，过60目筛，得到颗粒均匀的粉碎物；
(2)将步骤(1)制得的粉碎物，按液料比20mL/g，加去离子水进行热水浸提，提取温度为90℃，时间4h，提取次数2次，得到提取液；
(3)将步骤(2)所得到的提取液抽滤、离心(5000rpm，10min)，得到上清液；
(4)将步骤(3)所得上清液在45℃条件下，减压浓缩至合适的体积，然后在浓缩液中加4倍体积的95％乙醇，4℃沉淀24h，离心(4000rpm，15min)取沉淀；
(5)将步骤(4)所得沉淀物用合适体积的去离子水溶解，并装入8000KDa～14000Kda的透析袋中透析3天；
(6)将步骤(5)所得的透析液于45℃下浓缩至合适体积，并冻干得到枸杞蜂花粉糖蛋白粗品；
(7)称取一定量的糖蛋白粗品，用去离子水溶解，上样于DEAE-52纤维素柱，并用去离子水、0.1mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脱；洗脱液分别用苯酚-硫酸法，紫外分光光度法隔管追踪检测其中的多糖和蛋白质含量；结果去离子水洗脱出来的组分1为一种中性糖蛋白，0.1mol/L NaCl洗脱出来组分2为一种酸性糖蛋白，0.3mol/L NaCl洗脱出来的组分3为另外一种酸性糖蛋白；然后将去离子水洗脱出来的中性糖蛋白组分收集，将液体减压浓缩至合适的体积，并用去离子水透析3天，浓缩后冷冻干燥制得枸杞蜂花粉中性糖蛋白。制备的中性糖蛋白为白色絮状物，其中多糖含量为50.41％，蛋白质含量为1.64％；
(8)将步骤(7)所得中性糖蛋白用分子排阻色谱检测其纯度，得到单一对称峰型，表明得到的中性糖蛋白为较纯品；
制备的枸杞蜂花粉中性糖蛋白为白色絮状物，ICP-AES检测出其中锌元素的含量为6.97μg/mg，远高于中性糖蛋白中其他微量元素的含量。
2、根据专利要求1所述的一种热水提取富锌中性糖蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(2)的液料比20mL/g，提取温度90℃，提取时间4h，提取次数2次。
附图说明
图1枸杞蜂花粉糖蛋白粗品的DEAE凝胶柱梯度洗脱曲线
图2枸杞蜂花粉中性糖蛋白分子排阻色谱图
图3枸杞蜂花粉原料、糖蛋白粗品、中性糖蛋白中微量元素含量对比图
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
实施例1：
(1)将枸杞蜂花粉置于60℃下烘干，粉碎，过60目筛，得到颗粒均匀的粉碎物；
(2)将步骤(1)制得的粉碎物，按液料比20mL/g，加去离子水进行热水浸提，提取温度为90℃，时间4h，提取次数2次，得到提取液；
(3)将步骤(2)所得到的提取液用真空泵抽滤、并在5000rpm的条件下离心10min，得到上清液；
(4)将步骤(3)所得上清液用旋转蒸发仪，在45℃条件下，减压浓缩至合适的体积，然后往浓缩液中加4倍体积的95％乙醇，4℃条件下沉淀24h，接着在4000rpm的条件下离心15min，并取沉淀；
(5)将步骤(4)所得沉淀物用合适体积的去离子水溶解，装入8000～14000Kda的透析袋中透析3天，在透析过程中每隔一段时间更换新的去离子水进行透析；
(6)将步骤(5)所得的透析液于用旋转蒸发仪于45℃条件下，浓缩至合适体积，并冻干得到枸杞蜂花粉中性糖蛋白粗品；
(7)将步骤(6)所得糖蛋白粗品溶解后，上样于DEAE-52纤维素柱，并用去离子水、0.1mol/LNaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脱；洗脱液分别用苯酚-硫酸法，紫外分光光度法隔管追踪检测其中的多糖和蛋白质含量；结果去离子水洗脱出来的组分1为一种中性糖蛋白，0.1mol/L NaCl洗脱出来的组分2为一种酸性糖蛋白，0.3mol/L NaCl洗脱出来的组分3为另外一种酸性糖蛋白；然后将去离子水洗脱出来的组分1收集，并将收集液减压浓缩至合适的体积，去离子水透析3天，浓缩后冷冻干燥，得到枸杞蜂花粉中性糖蛋白；
制备的中性糖蛋白为白色絮状物，采用苯酚硫酸法以及考马斯亮蓝法测定样中总糖和蛋白质的含量，其总糖含量为50.41％，蛋白质含量为1.64％。选取一定量的中性糖蛋白溶于去离子水，用分子排阻色谱检测其纯度，得到单一对称峰型，表明得到的中性糖蛋白为较纯品。
实施例2：
枸杞蜂花粉原料、糖蛋白粗品、中性糖蛋白中矿物元素含量的测定
(1)对枸杞蜂花粉原料、糖蛋白粗品、中性糖蛋白进行微波消解
称取枸杞蜂花粉原料、糖蛋白粗品、中性糖蛋白各约50mg，设置3个平行，分别加入5ml的优级纯浓硝酸，置于High Performance Microwave Digest System-ETOHS one中消解，其消解条件为：
消解的样品分别用去离子水定容于25ml的容量瓶中备用。
(2)矿物元素标品的配置
将各微量元素单标(浓度为1000μg/ml)，先配成浓度均为100μg/ml的次级母液；然后将微量元素Se、Zn、Fe、Mn、Cu、Al配置成各浓度梯度的混标，介质为5％HNO3，其浓度梯度为0μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml。
(3)ICP-AES分析
将上述消解的枸杞蜂花粉原料、糖蛋白粗品、中性糖蛋白用ICP-AES分析其中微量元素的含量。
从由图3中可以看出，枸杞蜂花粉中含有众多的微量元素，且相比于枸杞蜂花粉原料和糖蛋白粗品，枸杞蜂花粉中性糖蛋白中锌元素的含量更高；另外，在枸杞蜂花粉中性糖蛋白中，锌元素的含量要明显高于其他微量元素的含量，其含量可高达6.97μg/mg，这表明杞花粉中性糖蛋白为一种富锌糖蛋白。
综上所述仅为本发明的较佳施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所做的等效变化与修饰都应为本发明的技术范畴。

Claims (2)

1.一种以枸杞蜂花粉为原料制备富锌中性糖蛋白的方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)将枸杞蜂花粉置于60℃下烘干，粉碎，过60目筛，得到颗粒均匀的粉碎物；
(2)将步骤(1)制得的粉碎物，按液料比20mL/g，加去离子水进行热水浸提，提取温度为90℃，时间4h，提取次数2次，得到提取液；
(3)将步骤(2)所得到的提取液抽滤、在5000rpm离心机里离心10min，获到上清液；
(4)将步骤(3)所得上清液浓缩到合适的体积，然后往浓缩液中加4倍体积的95％乙醇，4℃沉淀24h，在4000rpm离心机里离心15min，然后取沉淀；
(5)将步骤(4)所得沉淀物用合适体积的去离子水溶解，并装入8000～14000Kda的透析袋中透析3天；
(6)将步骤(5)所得的透析液于45℃下浓缩至合适体积，并冻干得到枸杞蜂花粉糖蛋白粗品；
(7)将步骤(6)所得糖蛋白粗品溶解后，上样于DEAE-52纤维素柱，并用去离子水、0.1mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脱；洗脱液分别用苯酚-硫酸法，紫外分光光度法隔管检测其中的多糖和蛋白质，去离子水洗脱出来的组分1是一种中性糖蛋白，0.1mol/L NaCl洗脱出来的组分2是一种酸性糖蛋白，0.3mol/L NaCl洗脱出来的组分3是另外一种酸性糖蛋白；然后将去离子水洗脱出来的组分1收集，并将液体减压浓缩至合适的体积，去离子水透析3天，浓缩后冷冻干燥，得到枸杞蜂花粉中性糖蛋白。制备的中性糖蛋白为白色絮状物，其中多糖含量为50.41％，蛋白质含量为1.64％；
(8)将步骤(7)所得中性糖蛋白用分子排阻色谱检测其纯度，峰型单一对称，表明得到的中性糖蛋白为较纯品；
制备的枸杞蜂花粉中性糖蛋白为白色絮状物，用ICP-AES检测蜂花粉中微量元素的含量，结果显示，其中性糖蛋白中锌元素的含量为6.97μg/mg，远高于该糖蛋白中其他微量元素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种热水提取富锌中性糖蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(2)的液料比20mL/g，提取温度90℃，提取时间4h，提取次数2次。
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