ES2626248T3 - Proceso para la purificación de glucoproteínas - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la purificación de una glucoproteína que comprende someter un líquido que contiene dicha glucoproteína a las etapas de: a) cromatografía de fase inversa, b) cromatografía de exclusión de tamaño, y c) cromatografía de interacción hidrófoba; en el que las etapas se realizan en la secuencia de cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de interacción hidrófoba.
Description
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DESCRIPCION
Proceso para la purificacion de glucoprotemas
La presente invencion se refiere a un proceso para la purificacion de glucoprotemas, como la FSH (hormona de estimacion de foffculos), LH (hormona luteinizante), CG (gonatropina corionica) y TSH (hormona estimuladora de tiroides) y a la fabricacion de una glucoprotema de interes que emplea un proceso de purificacion respectivo.
Las glucoprotemas son protemas que contienen cadenas de oligosacaridos unidas covalentemente a las cadenas laterales polipeptido. Las glucoprotemas pueden tener un amplio numero de diferentes funciones biologicas, que incluyen funciones estructurales, protectoras, portadoras, funciones de hormonas o enzimas. De acuerdo con lo anterior, se pueden utilizar diversas glucoprotemas como productos farmaceuticos. La disposicion de dichas glucoprotemas es altamente deseable de esta manera. Diversas glucoprotemas se pueden producir hoy en dfa en forma recombinante, lo que sin embargo requiere procedimientos de purificacion extensos para extraer la glucoprotema objetivo de las cosechas de cultivos celulares.
Una clase importante de glucoprotemas son gonatropinas, una familia de cuatro hormonas estrechamente relacionadas, que incluyen FSH, LH, CG yTSH (Glycobiology, vol. 13, N° 3, paginas 179-189, 2003). el FSH se utiliza por ejemplo en el tratamiento de trastornos reproductivos y de infertilidad en pacientes masculinos y femeninos. Tambien el hCG y el LH se utilizan en el tratamiento de fertilidad, solos o en combinacion con FSH.
En la naturaleza, el FSH se produce mediante la glandula pituitaria. Para uso farmaceutico, el FSH se puede producir en forma recombinante (rFSH), o se puede aislar de la orina de mujeres posmenopausicas (FSHu).
FSH se utiliza en pacientes femeninos en induccion de ovulacion (OI) y en la hiperestimulacion ovarica controlada (COH) para tecnologfas reproductivas asistidas (ART). En un regimen de tratamiento ffpico para la induccion de la ovulacion, se administra a un paciente inyecciones diarias de FSH o una variante (de 75 a 300 UI FSH/dfa) durante un penodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 dfas. En un regimen de tratamiento ffpico para hiperestimulacion ovarica controlada, se administra a un paciente inyecciones diarias de FSH o una variante (150-600 UI FSH/dfa, pero tambien tan poco como 75 UI FSH/dfa) durante un penodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 dfas.
El FSH tambien se utiliza para inducir espermatogenia en hombres que sufren de oligospermia. Un regimen que utiliza 150 UI de FSH 3 veces por semana en combinacion con 2,500 UI de hCG dos veces por semana ha sido exitoso en alcanzar la mejora en el conteo de esperma en hombres que sufren hipogonadismo hipogonadotropico (Burgues et al.; Subcutaneous self- administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6).).
Debido a la importancia del FSH es deseable en el tratamiento de los trastornos de la fertilidad, el suministro de FSH de alta pureza y alta actividad espedfica es deseable. El tratamiento de FSH requiere inyecciones repetidas. Se pueden administrar preparaciones de FSH altamente purificadas subcutaneamente, que permiten la auto administracion por el paciente, aumentando de esta manera la comodidad y conveniencia del paciente.
Los documentos WO2005/110015 A2, US2006/0026719 A1, y EP0276551 A1 divulgan un proceso para la purificacion de una glucoprotema en donde las etapas de purificacion se realizan en la secuencia de cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de exclusion de tamano, y cromatograffa de fase inversa.
Lynch et al. (The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19) divulga un metodo para purificar FSH de pituitaria humana. El metodo implica cromatograffa de intercambio de aniones y cationes, cromatograffa de exclusion de tamano y de extraccion por inmunoafinidad.
El documento WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) divulga un proceso para la purificacion de FSH de orina humana partiendo con extractos de orina denominados gonadotrofinas menopausicas humanas (hMG). El proceso utiliza cromatograffa de intercambio ionico sobre resinas de intercambio anionico de base debil del tipo DE[Xi]AE seguido por cromatograffa de afinidad sobre resina que tiene un derivado antraquinona como ligando.
El documento WO 00/63248 (Instituto Massone SA) divulga un proceso para la purificacion de gonadotropinas, que incluyen FSH, de orina humana. El proceso implica las siguientes etapas: cromatograffa de intercambio de iones con una fuerte resina cationica del tipo sulfopropilo, cromatograffa de intercambio de ionico con una fuerte resina anionica, y cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC).
Chiba et al [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] divulga una tecnica para purificar gonadotrofinas de pituitaria canina, que incluyen FSH, que utilizan cromatograffa de afinidad de concavalina (Con) A, cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) y cromatograffa de ion inmovilizado con Cu++.
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El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) describe un metodo para purificar FSH humano a partir de orina. El proceso implica inmunocromatograffa con anticuerpos monoclonales de inmovilizado espedficos FSH unidos a Sefarosa 4B mediante sulfona Divinilo, seguido por HPLC de fase inversa.
El documento EP 1 106 623 A1 divulga un metodo para purificar FSH a partir de muestras biologicas por ejemplo de glandulas pituitarias humanas u orina posmenopausica humana mediante el uso de cromatograffa de afinidad de tinte.
Procesos para la purificacion de FSH recombinante se divulgan en los documentos WO 2005/063811 A1, WO 2006/051070 A1, WO 2007/065918 A2y WO 2009/000913 A1.
El documento WO 2009/000913 A1 divulga un clon de celula que produce FSH, un metodo para producir FSH utilizando el clon de celula y purificar el FSH recombinante obtenido a partir de sobrenadante de cultivo celular. La purificacion se puede realizar mediante uno o mas de las etapas conocidas por el experto, que incluyen cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de hidroxiapatita, cromatograffa de afinidad y filtracion de gel.
El documento WO 2005/063811 A1 divulga un metodo para purificacion de FSH recombinante utilizando las etapas (1) cromatograffa de intercambio iones, (2) cromatograffa de ion de metal inmovilizado y (3) cromatograffa de interaccion hidrofoba.
El documento WO 2006/051070 A1 divulga un metodo para la purificacion de FSH recombinante utilizando las etapas (1) cromatograffa de afinidad de tinte, (2) cromatograffa de interaccion hidrofoba y (3) cromatograffa de fase inversa, que se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
El documento WO 2007/065918 A2 divulga un metodo para la purificacion de FSH recombinante utilizando las etapas
(1) cromatograffa de afinidad de tinte (2) cromatograffa de intercambio anionico, (3) cromatograffa de interaccion hidrofoba y (4) cromatograffa de intercambio de anion fuerte, que se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
El objeto de la presente invencion es por lo tanto proporcionar un proceso de purificacion preferiblemente eficiente en costes que produce glucoprotemas tal como FSH en alto rendimiento y pureza.
De acuerdo con lo anterior la presente invencion se refiere a un proceso de purificacion para glucoprotemas tal como FSH que comprende someter un ffquido que contiene la glucoprotema a las siguientes etapas:
a) cromatograffa de fase inversa (RPC);
b) cromatograffa de exclusion de tamano (SEC); y
c) cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC); en el que las etapas se realizan en la secuencia de cromatograffa de fase inversa, cromatograffa de exclusion de tamano y cromatograffa de interaccion hidrofoba.
El proceso de purificacion puede comprender opcionalmente las etapas de, por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico tal como la cromatograffa de intercambio de aniones o cromatograffa de intercambio cationes, cromatograffa de afinidad tal como cromatograffa de afinidad de tinte, cromatograffa de afinidad inmunitaria, cromatograffa de afinidad de lectina o cromatograffa de afinidad de perborato, filtracion tal como diafiltracion, ultrafiltracion o nanofiltracion, y/o por lo menos una etapa de inactivacion vffica. En una realizacion preferida el proceso de la presente invencion incluye una cromatograffa de intercambio de aniones (AEX) tal como la cuarta etapa de cromatograffa.
Realizar el RPC como primera etapa de cromatograffa proporciona la opcion para cargar ffquidos biologicos “brutos” tal como glucoprotema cruda, ffquidos de frente natural, medios de cultivo celular o lisatos celulares directamente sobre el RPC, opcionalmente despues de depuracion (por ejemplo, filtracion), concentracion y/o etapa de intercambiado de regulador como se describio adelante. Esta realizacion proporciona la ventaja de que cuando se utilizan dichos ffquidos de muestra se pueden cargar grandes cantidades de la en la columna de cromatograffa sin peligro de sobrecargar o atascar la columna. Adicionalmente, las condiciones de regulador requeridas para RPC no conducen a agregacion excesiva de componentes de la solucion de muestra. En resumen, utilizar RPC como primera etapa de cromatograffa reduce el numero de etapas de preparacion que son necesarias antes de empezar la purificacion cromatografica y permite el uso de grandes cantidades de solucion de muestra con altas cantidades de otros componentes independiente de la glucoprotema de interes.
En otra realizacion preferida se realiza una cromatograffa (d) de intercambio de aniones posterior a la cromatograffa
(2) de exclusion de tamano y antes de la cromatograffa (3). de interaccion hidrofoba. Como se describio anteriormente, se pueden realizar etapas adicionales y tambien entre etapas.
El metodo de purificacion de la invencion proporciona la glucoprotema tal como FSH de alta pureza, que luego se puede formularcomo una composicion farmaceutica. La pureza en general esta por encima del 90%, preferiblemente > 95% p/p, mas preferiblemente > 99% p/p, incluso mas preferiblemente > 99.5% p/p, con base en la protema total. Adicionalmente, el metodo de purificacion de la invencion tambien se puede escalar facilmente incluso a tamano industrial, sin mayor cambio en las condiciones de purificacion.
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La glucoprotema cruda que forma el material de partida para los procesos de purificacion de acuerdo con la presente invencion se puede proporcionar en u obtener a partir de lfquidos de fuentes naturales o mediante tecnicas recombinantes tal como por ejemplo cosecha de cultivo celular que contiene la glucoprotema. Normalmente, el material de partida que se obtiene de una fuente natural o cosecha celular, preferiblemente de una cosecha celular, se clarifica primero (por ejemplo, por filtracion) y luego se concentra opcionalmente (por ejemplo, mediante ultrafiltracion) y/o intercambiado de regulador (por ejemplo, a traves de una etapa de diafiltracion) antes de ser capturado por la primera etapa cromatografica.
En las etapas de cromatograffa normalmente se utilizan resinas disponibles comercialmente, preferiblemente resinas a base de polfmeros o resinas a base de agarosa. Tambien es posible utilizar cromatograffa de membrana en la que la resina se reemplaza mediante una membrana funcionalizadas tal como membranas de Sartobind™ (Sartorius) o ChromaSorb™ (Millipore).
Las etapas del proceso de purificacion de la presente invencion se destacan en lo siguiente en mas detalle.
Etapa (a) de cromatograffa de fase inversa.
El proceso implica una etapa de cromatograffa (a) de fase inversa. En una realizacion preferida, especialmente en el caso de glucoprotemas recombinantes, se utiliza la cromatograffa de fase reversa como etapa de captura en la que la glucoprotema se enriquece, por ejemplo, a partir de lfquido de fuente natural o cosecha de cultivo celular. Se prefiere realizar una posterior inactivacion de virus hasta elucion a partir de la columna RPC.
La “cromatograffa de fase de inversa” de acuerdo con la invencion en particular se refiere a una etapa de cromatograffa en el que se utiliza una fase estacionaria no polar y preferiblemente una fase movil polar. En la cromatograffa de fase inversa, normalmente se eluyen compuestos polares primero mientras se retienen compuestos no polares.
La cromatograffa de fase inversa usualmente se realiza al equilibrar y cargar la columna, seguido por un lavado posterior elucion, cada uno con un regulador que contiene preferiblemente un disolvente organico tal como acetonitrilo o isopropanol. Se puede usar el disolvente organico tal como isopropanol para posterior inactivacion del virus hasta elucion.
El equilibrio, carga, lavado y elucion se lleva a cabo preferiblemente al utilizar un regulador de fase movil en pH medianamente alcalino, por ejemplo, en o aproximadamente pH 7 a 8.5, mas preferiblemente en o aproximadamente 7.5. En una realizacion preferida, la especie de regulacion es un regulador de fosfato, preferiblemente fosfato de sodio. Reguladores alternos adecuados para un pH en o aproximadamente 7.5 incluyen BES, MOPS, acetato de amonio, TES, HEPES
Se prefiere que no se realice intercambio de regulador despues de la etapa (a) en el caso de que la etapa (b) posteriormente (SEC) se realice. Se puede alcanzar intercambio de regulador posteriormente mediante SEC posterior al utilizar como regulador de serie el regulador preferido para la siguiente etapa de cromatograffa tal como cromatograffa AEX o HIC.
En una realizacion preferida de soluciones de regulador para la etapa RPC contiene un disolvente organico, cuya concentracion se modula para diferentes fases de la etapa de cromatograffa (equilibrio, carga, lavado y elucion). Preferiblemente el disolvente organico es un disolvente organico miscible en agua tal como el acetonitrilo o un alcohol (tal como metanol, etanol, etcetera), mas preferiblemente isopropanol.
En la solucion de regulacion de equilibrio y carga y la solucion de regulador de lavado el disolvente organico esta contenido preferiblemente en una cantidad entre 5 y 15% v/v de solucion reguladora total, preferiblemente entre 5 y 12% v/v de solucion de regulador total. El regulador de lavado es normalmente identico al regulador de carga. En la solucion de regulador de elucion el disolvente organico esta preferiblemente contenido en una cantidad mayor que en el regulador de carga, preferiblemente en una cantidad entre 15 y 22% v/v de solucion de regulador total, mas preferiblemente entre 16 y 20% v/v de solucion de regulador total.
En realizaciones preferidas, la etapa de cromatograffa de fase inversa puede incluir una etapa de inactivacion de virus. La inactivacion de virus se puede alcanzar al incubar la protema cargada en, unida a o eluida de la columna en la presencia de un disolvente organico, preferiblemente isopropanol o etanol. El tiempo de incubacion y la temperatura de incubacion se seleccionan preferiblemente con el fin de efectuar un grado deseado de inactivacion de virus y en particular depende de la concentracion y naturaleza del disolvente organico utilizado. Adicionalmente, estos parametros tambien se deben ajustar dependiendo de la estabilidad de la glucoprotema que se va a purificar. Por ejemplo, la protema se incuba durante por lo menos 15 minutos, preferiblemente durante por lo menos 30 min, por lo menos 45 minutos, por lo menos 1 h, por lo menos 2 h, por lo menos 3 h o por lo menos 6 h. La incubacion se puede realizar a temperaturas bajas tal como en o por debajo de 4 °C o en o por debajo de 10 °C, o se puede realizar en aproximadamente la temperatura ambiente. La incubacion se puede realizar directamente despues que se ha cargado la muestra sobre la columna, durante o despues de la etapa de lavado, despues de aplicar el regulador de elucion pero antes de elucion de la glucoprotema, o despues de elucion de la glucoprotema. Si se utiliza isopropanol como el disolvente organico, la inactivacion de virus se hace preferiblemente en una concentracion de isopropanol de por lo menos 15% (v/v), preferiblemente en aproximadamente 18% (v/v). En este caso, la glucoprotema se incuba
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referiblemente durante aproximadamente 2 horas, preferiblemente a temperatura ambiente. Preferiblemente, la inactivacion del virus se realiza despues de elucion de la glucoprotema a partir de columna de cromatograffa de fase inversa, preferiblemente en el uso de regulador de elucion. Sin embargo, opcionalmente se pueden agregar componentes adicionales a la solucion de glucoprotema despues de elucion de la columna, en particular para mejorar la inactivacion del virus y/o la estabilidad de la glucoprotema. Utilizar una etapa de inactivacion de virus durante el RPC, el proceso de la invencion se puede realizar sin ninguna etapa de inactivacion de virus adicional. Sin embargo, tambien se pueden combinar diversas etapas de inactivacion de virus, por ejemplo una inactivacion de virus durante RPC y una inactivacion de virus a traves de nanofiltracion y/o a traves de ajuste de pH como se describe aqm.
En una realizacion particularmente preferida, los reguladores que contienen producto para la etapa de RPC (equilibrio, carga, lavado, elucion) contienen un antioxidante, tal como L-metionina. Antioxidantes alternos incluyen t-butil-4- Metoxifenol, 2, 6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil fenol; bimetabisulfito de sodio o potasio, bisulfito de sodio.
El material de columna de fase inversa se hace de una resina a la que se puede unir el material hidrofobo. El material de columna ffpico es sflice y poliestireno; los ligandos hidrofobos se pueden unir opcionalmente. En el caso de resinas sustituidas, la resina se sustituye con un ligando hidrofobo, seleccionado normalmente de alifatos (pero no limitado a estos), tal como C2, C4, Ca, C8, C10, C12, C14, C16 o C18 o derivados de estos, por ejemplo, cianopropilo (CN-propilo), o alifatos ramificados o aromaticos basados en benceno, tal como fenilo, u otros ligandos polares o no polares. El ligando puede ser una mezcla de dos o mas de estos ligandos. Las resinas a base de poliestireno adecuadas incluyen, sin limitacion, resinas suministradas por Rohm Haas (por ejemplo, Amberlite XAD or Amberchrom CG), Polymer Labs (por ejemplo, PLRP-S), GE Healthcare (e.g. Source RPC), Applied Biosystems (por ejemplo. Poros R). Una resina particularmente preferida es Source 30 RPC (GE Healthcare).
El proceso de fabricacion y las caracteffsticas optimas del material columna requieren frecuentemente que un grupo de enlace tambien denominado como separador se inserte entre la resina y el ligando. Otros parametros en los metodos de la presente invencion incluyen carga, es decir, cantidad de protema que se carga a la columna e mdice de flujo. Estos parametros se pueden optimizar a traves de experimentos que son conocidos por el experto en la tecnica.
La glucoprotema normalmente se carga en la columna en una concentracion de por lo menos aproximadamente de 0,1 mg por ml de resina, tal como, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 0.2 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10, o 20 mg por ml de resina; o en el rango de 0.1-200 mg, tal como, por ejemplo, 0.1-100 mg, 0.5-100 mg, 1-50 mg o 230 mg por mL de resina; preferiblemente la carga tiene por lo menos 1 mg por mL de resina. La medicion del volumen de resina empacado se hace normalmente en modo de suspension o en un modo similar.
Etapa (b) cromatograffa de exclusion de tamano
El proceso de la presente invencion tambien implica una etapa de cromatograffa (b) de exclusion de tamano, por ejemplo, para purificacion adicional y/o repeticion de regulacion de la glucoprotema. La cromatograffa de exclusion de tamano comprende la etapa de equilibrar y cargar el eluado de la etapa de cromatograffa anterior a una matriz de filtracion de gel equilibrada con un regulador que tiene una composicion que se desea para almacenamiento o procesamiento adicional de la glucoprotema de un pH de normalmente entre 6.5 y 9, preferiblemente aproximadamente 8.5.
Para realizar la cromatograffa de exclusion de tamano, normalmente selecciona el gel de los grupos de geles polimericos que incluyen, pero no se limitan a geles a base de dextrano tal como Sephadex (por ejemplo. Sephadex G-25) o geles de poliacrilamida tal como Sephacryl (por ejemplo, Sephacryl-S400), geles a base de agarosa tal como Superose o Sepharose (por ejemplo. Sepharose CL-4B), y geles de compuestos preparados a partir de dos tipos de geles tal como Superdex 200 que combina dextrano (Sephadex™) y geles agarosa reticulada agarosa (Superose™).
En una realizacion preferida el regulador se selecciona del grupo consistente de fosfato de sodio, acetato de amonio, MES (acido 2-(N-morfolino) etanosulfonico), Bis-Tris (2-bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol), ADA (acido N-(2-Acetamido) iminodiacetico), PIPES (piperazino-N, N'-bis (acido 2 etanosulfonico), ACES (acido N-(2- Acetamido)-2-aminoetano sulfonico), BES (acido N, N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfonico), MOPS (acido 3-(N- morfolino) propanosulfonico), TES (acido N-Tris (hidroximetil) metil-2-aminoetano sulfonico), HEPES (acido N-2- Hidroxietilpiperazino-N'-2-etanosulfonico), preferiblemente fosfato de sodio o acetato de amonio, mas preferiblemente acetato de amonio.
Opcionalmente dicho regulador comprende adicionalmente una sal inorganica, preferiblemente un haluro de un metal alcalino, mas preferiblemente cloruro de potasio o cloruro de sodio, mas preferiblemente cloruro de sodio, en el que la concentracion de dicha sal inorganica es aproximadamente 0 a 500 mM, preferiblemente aproximadamente 0 a 300 mM, mas preferiblemente aproximadamente 0 a 50 mM. En una realizacion preferida el regulador esta libre de sal.
En una realizacion particularmente preferida, los reguladores que contiene producto para la etapa (b) de la SEC (equilibrado, carga, elucion) contienen un antioxidante, tal como L-metionina. Alternativamente los antioxidantes incluyen t-butil-4-Metoxifenol, 2, 6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil fenol; bimetabisulfito de potasio o de sodio, bisulfito de sodio.
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La cromatograffa de exclusion de tamano comprende adicionalmente la etapa de eluir la glucoprotema de dicha matriz de filtracion gel mediante elucion isocratica, es decir, el regulador de elucion tiene aproximadamente la misma, preferiblemente la misma composicion que el regulador utilizado para equilibrio y/o carga. El flujo pasante se puede registrar mediante absorcion UV en 280 nm y se recolecta la fraccion que contiene glucoprotema.
Etapa (c) de cromatograffa de interaccion hidrofoba
El proceso de la presente invencion tambien implica una etapa (c) de cromatograffa de interaccion hidrofoba. La cromatograffa de interaccion hidrofoba se realiza usualmente al equilibrary cargar la columna, seguido por un lavado y elucion posterior.
La cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) es un metodo de separacion que toma ventaja de las propiedades hidrofobas de las protemas. La adsorcion se promueve mediante interacciones hidrofobas entre regiones no polares en los ligandos hidrofobos de protema inmovilizados en dicho soporte solido. La adsorcion se alcanza en altas concentraciones de sal en la fase movil acuosa y la elucion se facilita al reducir la concentracion de sal. El material de cromatograffa de interaccion hidrofoba es una matriz sustituida con ligandos hidrofobos tal como grupos etilo, butilo, fenilo - o hexilo. El material preferido es una matriz sustituida con un ligando butilo o fenilo.
Se conocen en la tecnica resinas de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) he incluyen resinas tal como butilo Sepharose (GE Healthcare), Phenyl Sepharose (sustitucion alta y baja), Octyl Sepharose y alquil Sepharose (todos de GE Healthcare; otras fuentes de resinas HIC incluyen Biosepra, Francia; E. Merck, Alemania; BioRad, EE UU).
En una realizacion preferida, la cromatograffa de interaccion hidrofoba se lleva a cabo con una resina tal como butil Sepharose HP (que se puede obtener de GE Healthcare). Se entiende que la etapa (c) se puede realizar utilizando resinas alternas, que tiene caractensticas similares. Las resinas alternas que se pueden utilizar son como sigue: Toyopearl butil 650m (que se puede obtener Tosoh Biosep Inc.) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (bajo sub); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (alto sub); Butilo Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose High Performance; Source 15ETH; Source l5lSO; Source 15PHE todos de GE Biosciences (800) 526-3593. Resinas adicionales son: Hydrocell C3 o C4; Fenil Hydrocell de BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558; (vease
www.biochrom.com).
www.biochrom.com).
En una realizacion preferida el regulador de elucion y lavado, carga, y equilibrio se selecciona del grupo que consiste de fosfato de sodio, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES, preferiblemente fosfato de sodio. La union en la resina HIC se alcanza en general al utilizar un regulador de equilibrado y carga con alta conductividad, obtenido por ejemplo a traves de la adicion de sal como NaCl, (NH^SO4o Na2SO4, preferiblemente sulfato de amonio. Las concentraciones de sal preferidas son 1 a 2 M, preferiblemente aproximadamente 1.5 M (NH4)2SO4. El lavado generalmente utiliza el regulador de carga. La elucion en la etapa de cromatograffa de interaccion hidrofoba se lleva a cabo preferiblemente al reducir la conductividad de la fase movil (reducir la concentracion de sal). La reduccion se puede alcanzar en una forma lineal o en forma de etapas.
Se prefiere utilizar un regulador de lavado y elucion, equilibrio y carga, que tiene un pH en o aproximadamente 6 a aproximadamente 9, preferiblemente en o aproximadamente 7.0 a o aproximadamente 8.5 mas preferiblemente en o aproximadamente 7.5. Un sistema de regulador de carga y lavado particularmente preferido, contiene fosfato de sodio y sulfato de amonio preferiblemente en un pH de en o aproximadamente 7.5. Un regulador de elucion preferido contiene fosfato de sodio en un pH en o aproximadamente 7.5.
En una realizacion particularmente preferida, los reguladores que contiene producto para la etapa (c) de HIC (equilibrio de carga, lavado, elucion) contienen un antioxidante, tal como L-metionina. Antioxidantes alternativos incluyen t-butil- 4-Metoxifenol, 2, 6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil fenol; bimetabisulfito de potasio o de sodio, bisulfito de potasio.
Etapas adicionales
Para las tres etapas (a), (b) y (c) de cromatograffa principal los procesos de la presente invencion pueden incluir opcionalmente etapas adicionales conocidas por el experto en la tecnica, por ejemplo, etapas de cromatograffa, etapas de filtracion o etapas de inactivacion de virus. Etapas adicionales preferidas son cromatograffa de intercambio ionico tal como cromatograffa de intercambio aniones o cromatograffa de intercambio cationes, cromatograffa de afinidad tal como cromatograffa de afinidad de tinte, cromatograffa de afinidad inmunitaria, cromatograffa de afinidad de lectinas o cromatograffa de afinidad de perborato, filtracion tal como diafiltracion, ultrafiltracion, nanofiltracion o inactivacion de virus.
Etapa de cromatograffa (d) de intercambio de aniones
E una realizacion preferida el proceso de la presente invencion en adicion comprende la etapa (d) cromatograffa de intercambio de aniones. La cromatograffa de intercambio de aniones usualmente se realiza al equilibrar y cargar la columna, seguido por lavado y posterior elucion.
La cromatograffa de intercambio de aniones se lleva a cabo, preferiblemente con una resina de amonio cuaternario, tal como CaptoQ (que se puede obtener de GE Healthcare), o resina que tiene caractensticas similares tal como
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ToyoPearl QEA (que se puede obtener de Tosoh), Q Sepharose FF (que se puede obtener GE Healthcare), Fractogel EMD, Fractogel TMAE o Fractogel HICAP (que se puede obtener de KGaA, Darmstadt Alemania).
La resina de cromatograffa de intercambio de aniones se equilibra preferiblemente, se carga y lava al utilizar un regulador que tiene un pH medianamente alcalino, por ejemplo, en o aproximadamente 7,2 a o aproximadamente 9.0, o en o aproximadamente 8.0 a o aproximadamente 9.0, mas preferiblemente en o aproximadamente 8.5. Reguladores adecuados incluyen, por ejemplo, regulador de borato, acido trietanolamina/iminodiacetico, Tris (2-Amino-2- hidroximetil-propano-1,3-diol), fosfato de sodio acetato de amonio, Tricino (N-(Tri(hidroximetil)metil) glicina), acido bicino (2 - (bis (2-hidroxietil) amino))etanoico, TES, HEPES, TAPS (acido N-Tris (hidroximetil) metil-3- aminopropanosulfonico). El mas preferido es acetato de amonio, en un pH de en o aproximadamente 8.5.
La elucion de la resina de intercambio ionico se alcanza al aumentar la conductividad de la fase movil a traves de la adicion de sal, preferiblemente NaCl. Reguladores adecuados incluyen, por ejemplo, regulador de borato, acido trietanolamina/iminodiacetico, Tris, acetato de amonio, Tricina, bicina, TES, HEPES, TAPS. Se prefiere acetato de amonio.
La cromatograffa de intercambio de aniones se puede utilizar para eluir selectivamente diferentes isoformas que se originan principalmente de niveles de sulfatacion y/o sialilacion diferentes y de grupos funcionales glucano de la glucoprotema.
Las glucoprotemas son constituyen de una estructura principal de pepffdos y oligosacaridos que se unen al grupo OH residuos de serina y/o treonina en una forma ligada a O y/o unida al grupo amida de asparragina en una forma ligada a N. Las estructuras de oligosacaridos frecuentemente terminan con acido neurammico de oligosacaridos cargados negativamente (tambien denominado acido sialico).
La actividad in vivo de productos de glucoprotema parece estar influenciado por el grado sialilacion de la galactosa terminal. Por ejemplo, De Leeuw et al (1996, Mol Hum Reprod. 1996 May;2(5):361-9) demostro que las isoformas FSH con alto contenido de acido sialico ejercen mayor actividad espedfica que aquellas con menor contenido de acido sialico debido a una prolongada vida media circulante. Sin embargo, las isoformas FSH tienen un menor contenido de acido sialico que muestran una mayor actividad de union de receptor. Por lo tanto, para aplicaciones espedficas de FSH, se pueden requerir diferentes isoformas con diferentes grados de sialilacion.
El termino “isoformas”, como se utiliza aqrn, se refiere a una preparacion/fraccion de glucoprotema que contiene glucoprotemas que tienen secuencia de aminoacidos identica o muy similar y un punto isoelectrico comun pero que puede diferir con respecto al alcance, a la complejidad, a la naturaleza, a la antenaridad y al orden de los grupos sialilo y galactosilo unidos. Una isoforma de acuerdo con la invencion tambien puede comprender multiples formas de glucoprotema de la misma secuencia de aminoacidos una a secuencia de aminoacidos muy similar y punto isoelectrico que difiere adicionalmente en otras modificaciones que llevan carga tal como acetilacion y sulfatacion. El termino “secuencia de aminoacidos muy similar” indica que la secuencia de aminoacidos de una protema tambien comprende aquellas secuencias que son funcionalmente equivalentes a la secuencia de aminoacidos tipo natural y de esta manera, ejerce la misma funcion. En particular, “secuencia de aminoacidos muy similar” comparte una homologfa de secuencia, preferiblemente una identidad de secuencia, con una secuencia de aminoacido de referencia de por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, mas preferiblemente por lo menos 98%, sobre un tramo de aminoacidos consecutivos que representan por lo menos 50%, preferiblemente por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, mas preferiblemente 100% de la secuencia de aminoacidos de referencia completa.
de esta manera, las isoformas de glucoprotema se pueden definir preferiblemente mediante punto isoelectrico y secuencia de aminoacidos y cada una de dichas isoformas definidas puede comprender actualmente multiples isoformas en el sentido qmmico estricto (moleculas que tiene la misma composicion atomica, pero difieren en su estructura espacial). En particular, el punto isoelectrico de diferentes glucoprotemas de la misma isoforma preferiblemente no difiere en mas de 2 unidades, mas preferiblemente no mas de 1 unidad, no mas de 0.5 unidades o no mas de 0.2 unidades, y mas preferiblemente el punto isoelectrico no difiere en mas de 0.1 unidades.
Para la elucion selectiva de isoformas cargadas en forma diferente tal como isoformas sialiladas diferentemente se prefiere utilizar dos o mas, preferiblemente dos reguladores A y B de elucion, que diferencian en pH y/o contenido de sal, cada uno de ellos se basa en por ejemplo, acetato de amonio, regulador de borato, acido trietanolaminao/iminodiacetico, Tris, fosfato de sodio, acetato de amonio, Tricina, bicina, TES, HEPES o PAPS, se prefiere acetato de amonio. Utilizando diferentes reguladores de elucion, se puede realizar elucion en una forma de etapas, primero utilizando un regulador de elucion y luego utilizando otro regulador de elucion, opcionalmente tambien utilizando una o mas etapas de elucion intermedias con diferentes mezclas de reguladores de elucion. Alternativamente o adicionalmente, se puede realizar elucion utilizando un gradiente, partiendo con una primera relacion de mezcla de los reguladores de elucion (por ejemplo 100% del primer regulador de elucion) y cambiando gradualmente a una segunda relacion de mezcla de los reguladores de elucion (por ejemplo, 100% del segundo regulador de elucion).
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El regulador de elucion utilizado primero (regulador A) en general, puede ser A) un regulador medianamente acido que esta libre de sal, o b) un regulador neutro o medianamente basico con bajo contenido de sal tal como NaCl (preferiblemente entre 20 y 200 mM). El regulador A se puede utilizar para eluir glucoprotema de baja carga, por ejemplo, bajo grado de sialilacion. En la variante A) el regulador A tiene un pH por ejemplo, en o aproximadamente 3.0 a o aproximadamente 6.5, o en o aproximadamente 4.0 a o aproximadamente 6.0, mas preferiblemente en o aproximadamente 5. En la variante b) el regulador A tiene un pH de o aproximadamente 7.0 a 9.0, preferiblemente 8.5.
El segundo regulador de elucion utilizado (regulador B) en general es un regulador ligeramente alcalino que contienen sal de un mayor contenido de sal que el regulador A que se puede utilizar para eluir glucoprotema de alta carga, por ejemplo, sialilacion de alto grado. El regulador B tiene un pH por ejemplo, en o aproximadamente 7.0 o en aproximadamente 9.0 o en aproximadamente 8.0 o en aproximadamente 9.0, mas preferiblemente en o aproximadamente 8.5. La sal es preferiblemente NaCl. El contenido de sal en el regulador B es preferiblemente de 200 mM a 1 M.
Utilizando diferentes reguladores de elucion y un gradiente de elucion en forma de etapas, las isoformas de glucoprotema diferentes cargadas sobre la columna de cromatograffa de intercambio de aniones eluira en diferentes fracciones dependiendo de su carga. Por ejemplo, la glucoprotema que se va a purificar puede estar presente en las fracciones de flujo, es decir, se une a la columna de cromatograffa de intercambio de aniones solo debilmente o en lo absoluto, se pueden eluir con el primer regulador de union, en una relacion de mezcla espedfica del primero y segundo regulador de elucion, o con el segundo regulador de elucion. Las fracciones de glucoprotema que se utilizan para las etapas de purificacion adicionales y de esta manera, las isoformas de glucoprotema que se van a purificar, dependeran principalmente de las aplicaciones deseadas de la glucoprotema. Las otras isoformas de glucoprotema que no son de interes se pueden eliminar utilizando la etapa de cromatograffa de intercambio de aniones. Con respecto al FSH, por ejemplo solo el FSH que tiene un alto grado de sialilacion, y de esta manera que tiene una alta circulacion de vida media, o solamente se puede purificar FSH tienen un bajo grado de sialilacion y de esta manera, tiene una alta actividad de union de receptor.
En una realizacion particularmente preferida los reguladores que hacen contacto con el producto para la cromatograffa de intercambio de iones (equilibrio, lavado y elucion) contiene un antioxidante, preferiblemente L-metionina. Los antioxidantes alternativos se mencionaron anteriormente.
Como una alternativa o adicionalmente a la cromatograffa de intercambio de aniones estandar, se puede realizar cromatoenfoque. El cromatoenfoque es una tecnica cromatografica que separa las protemas de acuerdo con las diferencias en su punto isoelectrico (pl). En particular, se puede utilizar una fase estacionaria cargada y las protemas cargadas en la columna de cromatoenfoque se pueden eluir utilizando un gradiente de pH. Por ejemplo, la fase estacionaria se puede cagar positivamente y el gradiente de pH se puede desarrollar a partir de un primer pH a un segundo, menor pH, por ejemplo, de aproximadamente pH 9 a aproximadamente pH 6 o de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 4. Debido a las condiciones espedficas del cromatoenfoque, las protemas eluyen con el fin de que sus puntos isoelectricos y preferiblemente las protemas de un pl espedfico se enfocan en bandas angostas. Esto, como protemas a un mayor pH que su pl se cargan negativamente y se unen a la fase estacionaria cargada positivamente, que por lo tanto se hacen lentas. Cuando el pH en el gradiente de elucion alcanza el pl de la protema, es generalmente neutro en carga y de esta manera migra con el flujo de la fase movil. En un pH mas bajo que el pl de la protema, la protema se rechaza por la fase estacionaria debido a su carga positiva, acelerandola de esta manera. Por lo tanto, las protemas en la parte posterior de una zona migraran mas rapidamente que aquellas en la parte delantera, formando gradualmente bandas de protemas mas angostas. En esta configuracion, la protema con el pl mas alto eluye primero y la protema con el pl mas bajo eluye de ultimo.
Las fases estacionariamente adecuadas son, por ejemplo, medios sustituidos con aminas de regulacion, cargadas, tal como Mono P (que se puede obtener de GE Healthcare) u otro material de cromatograffa de intercambio anionico. Para formar el gradiente de pH para elucion, los sistemas de regulacion tales como Polybuffer 74 y Polybuffer 96 (que se puede obtener de GE Healthcare) se pueden utilizar. Equilibrar, cargar y lavar la columna se puede utilizando cualquier condicion en donde la glucoprotema de interes y/o cualquier impureza se unen al material de columna. Por ejemplo, se puede utilizar las condiciones como se describio anteriormente para la cromatograffa de intercambio de aniones. Cuando se utiliza un gradiente de pH decreciente, preferiblemente un regulador tiene un pH igual a o mayor que el pH de partida del gradiente de elucion utilizado para equilibrado, carga y/o lavado. Cuando se utiliza un gradiente de pH creciente, preferiblemente un regulador que tiene un pH igual o menor que el pH de partida del gradiente de elucion se utiliza para equilibrio, carga y/o lavado.
Preferiblemente, para equilibrio, carga y lavado, se utiliza un regulador similar a aquel utilizado al inicio del gradiente de pH de elucion.
Proceso general
Las etapas de cromatograffa de fase inversa, cromatograffa de exclusion de tamano, cromatograffa de interaccion hidrofoba y cromatograffa de intercambio de aniones siguen el orden de
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(1) cromatograffa de fase inversa, (2) cromatograffa de exclusion de tamano, (3) cromatograffa de intercambio de aniones, (4) cromatograffa de interaccion hidrofoba. Opcional se encuentra una concentracion posterior y/o etapa (5) de intercambio de regulador de ultrafiltracion y/o diafiltracion, y la etapa (6) de nanofiltracion.
En realizaciones preferidas, el proceso para la purificacion de una glucoprotema de acuerdo con la invencion no comprende una cromatograffa de inmunoafinidad y/o una cromatograffa de intercambio de cationes. Mas preferiblemente, el proceso de acuerdo con la invencion no compromete ninguna etapa cromatografica adicional salvo aquellas descritas aqrn. El proceso de acuerdo con la invencion comprende preferiblemente solo tres etapas cromatograficas, es decir, una cromatograffa de fase inversa, una cromatograffa de exclusion de tamano y una cromatograffa de interaccion hidrofoba, o solo cuatro etapas, es decir, una cromatograffa de fase inversa, una cromatograffa de exclusion de tamano, una cromatograffa de intercambio de aniones y una cromatograffa de interaccion hidrofoba. La cromatograffa de intercambio de aniones tambien se puede remplazar por una etapa de cromatoenfoque como se describio anteriormente.
Sin embargo, etapas no cromatograficas adicionales, preferiblemente aquellas descritas aqrn, se pueden realizar adicionalmente a y tambien entre las etapas definidas. Preferiblemente, estas etapas adicionales incluyen etapas para disminuir o inactivar sustancias peligrosas o indeseadas tales como bacterias, virus, acidos nucleicos o protemas priones, por ejemplo, filtracion esteril, nanofiltracion, adsorcion y/o etapas de activacion de pH. En realizaciones alternas, a pesar de las etapas descritas anteriormente, el proceso de acuerdo con la invencion puede comprender etapas cromatograficas para disminuir o inactivar sustancias peligrosas o indeseadas, que incluyen por ejemplo cromatograffa de adsorcion. Preferiblemente, los procesos de purificacion de la invencion comprenden por lo menos uno, mas preferiblemente por lo menos dos, mas preferiblemente por lo menos tres etapas de inactivacion o disminucion de virus. Ha este respecto, tambien las etapas de cromatograffa del proceso de purificacion de acuerdo con la invencion, en particular la etapa (b) de cromatograffa de exclusion de tamano, se pueden utilizar como etapa de disminucion de virus en razon a que normalmente separan los virus de la glucoprotema. Por ejemplo, virus y parffculas similares a virus tienen un tamano mucho mas grande en comparacion con las glucoprotemas y de esta manera, se separan efectivamente de estas durante cromatograffa de exclusion de tamano.
Adicionalmente, el proceso de acuerdo con la invencion preferiblemente no comprende una etapa de intercambio de regulador directamente antes de y/o directamente despues de la cromatograffa de exclusion de tamano. En particular, si se realiza el proceso en el orden de (1) cromatograffa de fase inversa, (2) cromatograffa de exclusion de tamano, opcional (3) cromatograffa de intercambio de aniones y (4) cromatograffa de interaccion hidrofoba, preferiblemente no hay intercambio de regulador entre la cromatograffa de fase inversa y la cromatograffa de exclusion de tamano y/o entre la cromatograffa de exclusion de tamano y la cromatograffa de intercambio de aniones o la cromatograffa de interaccion hidrofoba.
Otras etapas
Antes de la primera etapa de cromatograffa de cromatograffa de fase inversa, puede ser deseable llevar a cabo una etapa de ultrafiltracion, con el fin de concentrar la glucoprotema cruda. Adicionalmente, se puede realizar una etapa de diafiltracion antes de la primera etapa de cromatograffa con el fin de realizar un intercambio de regulador. La etapa de ultrafiltracion y la etapa de diafiltracion se pueden realizar simultaneamente o secuencialmente. La ultrafiltracion y/o diafiltracion se lleva a cabo preferiblemente utilizando una membrana que tiene un corte en o aproximadamente 3 -30 kD, mas preferiblemente en o aproximadamente 10 kD. Sin embargo, la presente invencion tambien abarca procesos de purificacion en el que no se realiza etapa de ultrafiltracion y/o etapa de diafiltracion antes de la primera etapa de cromatograffa.
En una realizacion preferida, despues de una o mas de las etapas de cromatograffa (particularmente despues de la ultima etapa de cromatograffa), la muestra de glucoprotema se somete a una etapa de ultrafiltracion y/o diafiltracion. Preferiblemente la ultrafiltracion y/o diafiltracion se realiza con el fin de obtener un volumen que tiene la composicion deseada. La ultrafiltracion (y/o diafiltracion) se lleva a cabo preferiblemente utilizando una membrana que tiene un corte en o aproximadamente 3 -30 kD, mas preferiblemente en o aproximadamente 10 kD. Se prefiere realizar durante ultrafiltracion y/o diafiltracion un intercambio de regulador a un regulador pre formulacion, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de fosfato de sodio, citrato de sodio, MES Bis-Tris, ADA, PIPES, ACeS, BES, MOPS, TES, HEPES, preferiblemente fosfato de sodio, preferiblemente estabilizantes que contiene fosfato de sodio por ejemplo sacarosa y antioxidantes similares a L-metionina. El pH preferiblemente esta en el rango de 6.5 a 7.5, mas preferiblemente aproximadamente 7.0 a 7.1.
Etapas adicionales opcionales que se pueden realizar en el proceso de purificacion de acuerdo con la invencion incluyen una o mas etapas de filtracion esteril. Estas etapas se pueden utilizar para remover contaminantes biologicos tales como celulas eucariotas y/o procariotas, en particular bacterias y/o virus. Preferiblemente, estas etapas realizan en o cerca al final del proceso de purificacion para evitar contaminacion adicional despues de la etapa de filtracion esteril. Para eliminacion de bacterias u otras celulas, el filtro utilizado para filtracion esteril tiene preferiblemente un tamano de poro de 0,22 pm o menos, preferiblemente 0.1 pm o menos. Para la eliminacion de virus o parffculas similares a virus, se puede realizar una etapa de nanofiltracion como se describe a adelante.
Otra etapa adicional que se puede realizar en el proceso de purificacion de acuerdo con la invencion es una etapa de inactivacion de virus a traves de incubacion de glucoprotema en un pH espedfico. Por ejemplo, la glucoprotema se incuba en un pH de 4.0 o menos, preferiblemente aproximadamente pH 3.6. El tiempo de incubacion preferiblemente es por lo menos 15 min, por lo menos 30 min, por lo menos 60 min, por lo menos 90 min, por lo menos 2 h, por lo 5 menos 3 h o por lo menos 6 h. La incubacion se puede realizar a una temperatura baja tal como 10 °Co menos o 4 °C o menos, o aproximadamente a temperatura ambiente. Por ejemplo, el material de glucoprotema se puede incubar en un pH de aproximadamente 3.6 durante por aproximadamente 90 min en aproximadamente temperatura ambiente. Esta etapa de inactivacion de virus se puede realizar en cualquier momento durante el proceso de purificacion y preferiblemente se realiza despues de la ultima etapa de cromatograffa.
10 En una realizacion preferida, el proceso de la presente invencion comprende las siguientes etapas en el orden mostrado adelante:
(0) Ultrafiltracion (opcionalmente una etapa diafiltracion adicional; preferiblemente con una membrana que tiene un corte de en o aproximadamente 10 kD);
(1) Cromatograffa de fase inversa (RPC) (preferiblemente utilizando una columna Source 30 RPC);
15 (1a) Ultrafiltracion (preferiblemente con una membrana que tiene un corte de en o aproximadamente 10 kD);
(2) Cromatograffa de exclusion de tamano (preferiblemente utilizando una columna Superdex 200);
(3) Cromatograffa de intercambio de aniones (preferiblemente utilizando una columna CaptoQ);
(4) Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) (preferiblemente utilizando una columna butil HP);
(5) Ultrafiltracion y/o diafiltracion (preferiblemente con una membrana que tiene un corte de 10 kD).
20 Puede ser deseable someter la muestra de glucoprotema a una etapa de nanofiltracion, en particular como una etapa de depuracion de virus; es decir, reducir el riesgo de contaminacion de la preparacion de glucoprotema con virus o partmulas similares a virus que se originan de cultivos de celulas. La nanofiltracion se puede realizar en cualquier etapa del proceso de purificacion, sin embargo, se prefiere particularmente llevar a cabo nanofiltracion despues del final del procedimiento cromatografico. La nanofiltracion se puede realizar mas de una vez, por ejemplo, se puede 25 realizar dos veces. Dispositivos de nanofiltracion preferidos tienen un tamano de poro aproximadamente 15 y 20 nm.
En otra realizacion preferida, el metodo de la invencion comprende de esta manera las siguientes etapas en los ordenes mostrados adelante:
(0) Ultrafiltracion (preferiblemente con una membrana que tiene un corte de en o aproximadamente 10 kD);
(1) Cromatograffa de fase inversa (RPC) (preferiblemente utilizando una columna Source 30 RPC);
30 (1a) Ultrafiltracion (preferiblemente con una membrana que tiene un corte en o aproximadamente 10 kD);
(2) Cromatograffa de exclusion de tamano (preferiblemente utilizando una columna Superdex 200);
(3) Cromatograffa de intercambio de aniones (preferiblemente utilizando una columna CaptoQ);
(4) Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) (preferiblemente utilizando una columna butil HP);
(5) Ultrafiltracion y/o diafiltracion (preferiblemente con una membrana que tiene un corte de 10 kD).
35 (6) Nanofiltracion (preferiblemente que incluye depuracion de virus).
Los procesos de purificacion espedfica descritos anteriormente se realizan preferiblemente sin incluir ninguna etapa de cromatograffa adicional, etapas de ultrafiltracion y/o etapas de diafiltracion. Sin embargo, en realizaciones particulares, el proceso de purificacion descrito anteriormente puede comprender etapas adicionales, en particular una o mas etapas adicionales descritas, por ejemplo, aquellas utilizadas para eliminar o inactivar sustancias peligrosas y/o 40 indeseadas.
Se prefiere que un antioxidante o un aminoacido o dipeptido con un antioxidante y un efecto secuestrante se incluyan en algunas o todas las etapas del metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. Mas espedficamente el antioxidante esta presente en cualquiera de los reguladores utilizados para purificar y/o concentrar y/o filtrar la glucoprotema tal como FSH. El antioxidante previene la oxidacion de las glucoprotemas tal como FSH. El antioxidante 45 evita la oxidacion de la glucoprotema tal como FSH durante proceso. Un antioxidante preferido es L-metionina. Preferiblemente, se utiliza L-metionina en una concentracion de o aproximadamente 0.1 a 10 mm. Ejemplos adicionales de un antioxidante incluyen t-butil-4-metoxi-fenol, 2, 6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil fenol; bimeta-bisulfito de potasio o sodio, bisulfito de sodio. Ejemplos de aminoacidos y dipeptidos libres con antioxidantes y efecto secuestrante son histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anserina, 1 -metilhistidina o combinaciones de las mismos.
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Una ventaja de la presente invencion es que el proceso de purificacion es altamente efectivo, reduce el numero de etapas cromatograficas a un mmimo de 3 etapas cromatograficas o incluye un enriquecimiento de moleculas de glucoprotema altamente sialilada a un mmimo de 4 etapas cromatograficas. En particular, utilizando el proceso de purificacion de acuerdo con la invencion, las etapas de purificacion problematicas e intensivas en costes tal como en particular etapas de purificacion de afinidad, especialmente etapas de purificacion de inmunoafinidad, llegan a ser innecesarias y se pueden evitar. El proceso proporciona un alto grado de pureza de glucoprotema y bioactividad espedfica > 90%, preferiblemente > 98%, mas preferiblemente > 99% p/p, cada uno basado en la protema total segun se mide, por ejemplo, por HCP-ELISA. Adicionalmente, los procesos de purificacion de acuerdo con la invencion proporcionan una recuperacion sorprendentemente alta de la glucoprotema de interes presente en el material de partida.
Glucoprotemas
Las glucoprotemas son protemas que contienen cadenas de oligosacaridos (glucanos) unidos covalentemente a cadenas laterales de polipeptidos. Las glucoprotemas pueden comprender uno o mas glucanos que preferiblemente se acoplan a un atomo de nitrogeno (N-glucosilacion) o un atomo de oxfgeno (O-glucosilacion) del polipeptido. De esta manera, la glucoprotema puede ser N-glucosilada o O-glucosilada. Preferiblemente, las glucoprotemas comprenden glucanos naturales. Sin embargo, el termino “glucoprotema” comprende protemas o polipeptidos que tienen glucanos naturales y/o glucanos no naturales, en particular glucanos producidos sinteticamente y/o glucanos que comprenden unidades de monosacaridos no naturales o modificadas.
La glucoprotema que se va a purificar se selecciona preferiblemente del grupo de gonadotropinas tales como FSH (hormona de estimulacion de folmulo), LH (hormona luteinizante), CG (gonadotropina corionica) y TSH (hormona de estimulacion de tiroides) que incluye todas las isoformas y variantes de las mismas. Los terminos “glucoprotema”, “FSH”, “CG”, “LH” y “TSH” como se utiliza en esta solicitud siempre incluye todas las isoformas y variantes de la glucoprotema, especialmente aquellas descritas adelante y bajo la etapa (d) (AEX) anterior. El termino “gonadotropina” de acuerdo con la invencion se refiere preferiblemente a gonadotropinas naturales como FSH, CG, LH, y TSH, pero tambien a versiones recombinantes de las mismas, asf como a cualquier isoforma, variante y analogos de la mismas. Preferiblemente, las isoformas, variantes y analogos de gonadotropinas presentan una o mas actividades biologicas de las gonadotropinas naturales. Sin embargo, el proceso de purificacion de una glucoprotema de acuerdo con la invencion tambien es adecuado para purificar otras glucoprotemas tal como, por ejemplo, eritropoyetina, diversos anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, factores de estimulacion de colonas de macrofagos granulocitos, y activadores de plasminogeno de tejidos.
Almacenamiento/liofilizacion
La composicion lfquida resultante del proceso de purificacion como se describe anteriormente y que contiene glucoprotemas purificadas se puede congelar para almacenamiento como es, o despues de purificacion, el eluato se puede someter a liofilizacion (“secado por congelamiento”) para retirar el disolvente. El producto liofilizado o lfquido resultante se denomina “volumen de glucoprotema”.
Formulaciones
La glucoprotema de la invencion o purificada de acuerdo con el metodo de la invencion se puede formular para cualquier tipo de administracion, preferiblemente para inyeccion, ya sea intramuscular o subcutanea, preferiblemente subcutanea. La formulacion de glucoprotemas se puede secar por congelamiento, en cuyo caso se disuelve en agua para inyeccion justo antes de inyeccion. La formulacion de glucoprotema tambien puede ser una formulacion lfquida, en cuyo caso se puede inyectar directamente, sin disolucion previa. La formulacion puede contener excipientes conocidos y estabilizantes y puede comprender adicionalmente antioxidantes y/o surfactantes. La formulacion de glucoprotema puede ser de una sola dosis o multiples dosis. Si es de multiples dosis, preferiblemente debe contener un agente bacteriostatico, tal como, por ejemplo, alkilparabeno, alcohol bendlico, meta-cresol, timol o fenol, preferiblemente metilparabeno o meta-cresol. Las formulaciones de dosis unica tambien pueden comprender un agente bacteriostatico. Formulaciones adecuadas se describen por ejemplo en los documentos WO 2004/087213, WO 00/04913, WO 2007/092829 y EP 0 853 945, incorporadas aqrn por referencia.
La glucoprotema de la invencion se puede formular sin excipientes y estabilizantes conocidos, por ejemplo, sacarosa y manitol. Tambien puede comprender un antioxidante, tal como metionina. Adicionalmente puede comprender un surfactante, tal como TWEEN (preferiblemente TWEEN 80), Pluronic (preferiblemente Pluronic F68).
En una formulacion multidosis particularmente preferida, la glucoprotema producida por el metodo de la invencion se formulada al disolverla en agua para inyeccion con sacarosa, regulador de fosfato (pH 6.5 a 7.5), Pluronic F68, la metionina y un agente bacteriostatico.
Indicaciones
La glucoprotema de la invencion es adecuada para uso en todos los tratamientos en donde la glucoprotema se indica. Por ejemplo, el FSH es particularmente adecuado para la administracion subcutanea en induccion de ovulacion, hiperestimulacion ovarica controlada para tecnologfas reproductivas asistidas, y en el tratamiento de oligospermia. Se
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puede utilizar en conjunto con otras gonadotropinas, tal como LH y CG. Tambien se puede utilizar con compuestos adicionales que aumentan la respuesta al FSH, tal como citrato de clomifeno, inhibidores de aromatasa, tal como anastrozol, letrozol, Fadrozol y yM-511. Adicionalmente, tambien se puede utilizar LH y CG solos en el tratamiento de fertilidad.
Glucoprotemas recombinantes
El uso del termino “recombinante” se refiere a preparaciones de glucoprotemas tal como FSH que se producen a traves del uso de tecnologfa de ADN recombinante. Un ejemplo de un metodo para expresar una glucoprotema que utiliza tecnologfa recombinante es la transfeccion de una celula anfitriona adecuada, preferiblemente una celula anfitriona eucariota, con un vector de expresion que comprende una secuencia de ADN que codifica la glucoprotema de interes. Usualmente, el vector de expresion lleva un promotor fuerte que dirige la expresion de la glucoprotema, por ejemplo, CMV o SV40 y un marcador de seleccion adecuado para la seleccionar las celulas anfitrionas que tienen incorporado el vector. La transfeccion puede ser estable o transitoria. Los sistemas de expresion recombinante adecuados son bien conocidos en la tecnica y de esta manera no necesitan descripcion detallada. Preferiblemente, la celula anfitriona eucariotica se selecciona de celulas de primate, preferiblemente celulas de humanas y celulas de roedores, preferiblemente celulas CHO. Para expresion recombinante de FSH, las celulas anfitrionas eucarioticas se transfectan con secuencias de ADN que codifican una subunidad alfa y beta de FSH, ya sea proporcionada en un vector o en dos vectores con cada subunidad que tiene un promotor separado, como se describe en las patentes Europeas No. EP 0 211 894 y EP 0 487 512. El ADN que codifica el FSH puede ser un cADN o puede contener intrones.
Otro ejemplo del uso de la tecnologfa recombinante para producir FSH es mediante el uso de recombinacion homologa para insertar un segmento regulador heterologo en conexion operativa a secuencias endogenas que codifican una o ambas de las subunidades de FSH, como se describe en la patente Europea No. EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Tambien se contemplan metodos tales como aquellos divulgados en el documento WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies), en el que una de las subunidades es heterologamente insertada en una celula, y la otra subunidad se expresa mediante activacion de secuencias genomicas por insercion de un segmento regulador heterologo por recombinacion homologa. El metodo de la invencion se puede utilizar para purificar FSH expresado utilizando cualquiera de estos metodos y otros metodos.
Los procesos de purificacion de acuerdo con la invencion son utiles para purificacion glucoprotemas naturales, asf como recombinantes, que incluyen isoformas y variantes de las mismas. Las isoformas de glucoprotemas se refieren preferiblemente a isoformas como se definio anteriormente. El termino “variante” abarca preferiblemente glucoprotemas derivadas de una glucoprotema natural, tal como formas mutantes de las mismas, protemas de fusion de las mismas, fragmentos de estas y/o glucoprotemas que tienen diferente patron de glucosilacion. Tambien se comprenden compuestos imitadores de glucoprotemas, que incluyen protemas que comprenden estructuras glucomimeticas y/o estructuras peptidomimeticas. Preferiblemente, las variantes de glucoprotemas y/o isoformas presentan una o mas actividades que son cualitativamente y/o cuantitativamente similares o identicas a aquellas de la glucoprotema natural.
La expresion “variante de glucoprotemas” tal como “variante FSH” significa que abarca aquellas moleculas que difieren en secuencia de aminoacidos, numero de sitios de glucosilacion (que incluyen sitios de glucosilacion adicionales o eliminados) o en conexion de intersubunidad de una glucoprotema humana, pero que exhibe una o mas de sus actividades. Ejemplos de variantes FSH incluyen CTP-FSH, un FSH recombinante modificado de larga duracion, que consiste de la subunidad [alfa] tipo natural y la subunidad [beta] en la que el peptido de terminal de carboxi hCG se ha fusionado al terminal C de la subunidad [beta] del FSH, como se describe en LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; or Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]. Tambien se incluye un CTP-FSH de cadena simple, una molecula de cadena simple, que consiste de la siguiente secuencia (del terminal N al terminal C):
[beta]FSH, [beta]hCG CTP (113-145), [alfa]FSH
En el que FSH [beta] significa la subunidad [beta] de FSH, hCG CTP [beta] (113-145) significa el peptido de terminal de carboxi de hCG y FSH [alfa] significa la subunidad [alfa] de FSH, como lo describe Klein et al [Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255]. Otros ejemplos de variantes FSH incluyen moleculas FSH que tienen sitios de glucosilacion adicionales incorporados en la subunidad [alfa] y/o [beta], como se divulga en el documento WO 01/58493 (Maxygen) y moleculas FSH con enlaces S-S de intersubunidad, como se divulga en el documento WO 98/58957. Ejemplos adicionales de variantes FSH incluyen moleculas quimericas que comprenden secuencias de FSH y secuencias de hCG o LH, tal como aquellas descritas en los documentos WO 91/16922 y WO 92/22568.
Las variantes FSH referidas aqrn tambien incluyen eliminaciones de terminal carboxi de la subunidad beta que son mas cortas que la protema madura de longitud completa. Se entiende que las variantes de terminal carboxi del complejo de forma de cadena beta con una subunidad alfa conocida forman un heterodfmero variante FSH. Adicionalmente, las variantes FSH tambien incluyen protemas de fusion en la cadena a y la cadena p o partes de las
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mismas se combinan en una cadena de polipeptido, preferiblemente que comprende un ligador entre ambas cadenas. En otros ejemplos las protemas de fusion FSH, una o ambas de las cadenas FSH, se fusionan a un anticuerpo o una parte del mismo tal como un fragmento Fc de un anticuerpo.
Las variantes FSH referidas aqrn tambien incluyen FSH de diferentes especies como por ejemplo caballo (Equus caballus), cerdo (Sus scrofa), vaca (Bos taurus), gato (Felis catus), perros (Canis familiaris).
En una realizacion preferida, la FSH se produce en forma recombinante, ya sea en un suero o en un medio libre de suero. En otra realizacion preferida, el FSH purificada producido de acuerdo con el metodo de la invencion es adecuado para administracion subcutanea, que permite la auto administracion por el paciente.
Las variantes de glucoprotema descritas anteriormente con respecto al FSH como glucoprotema de ejemplo en una forma similar tambien aplican a otras glucoprotemas, cuando es apropiado, en particular a otras gonadotropinas tal como LH, TSH y CG.
La expresion “glucoprotema recombinante cruda” se refiere al sobrenadante de cultivo celular de celulas recombinantes que expresan glucoprotemas, antes que experimente cualquier etapa cromatografica. La expresion abarca la forma cruda del sobrenadante (como aislado de las celulas), asf como concentrado y/o filtrado o supernadante ultrafiltrado.
Proceso para fabricar glucoprotemas
Tambien se proporciona un proceso para fabricar una glucoprotema de interes al realizar el proceso para la purificacion de una glucoprotema descrita aqrn. La glucoprotema se puede obtener de fuentes naturales o recombinantemente.
En una realizacion preferida, se proporciona un proceso para fabricar una glucoprotema de interes, que comprende las siguientes etapas:
i) expresar recombinante la glucoprotema de interes;
II) purificar dicha glucoprotema de interes expresada recombinante al someter un ffquido que contiene dicha glucoprotema por lo menos a las etapas formadas en la secuencia de:
a) cromatograffa de fase inversa,
b) cromatograffa de exclusion de tamano, y
c) cromatograffa de interaccion hidrofoba.
El proceso de fabricacion respectivo conduce a la produccion de glucoprotemas muy puras que en particular son adecuadas en uso en formulaciones farmaceuticas.
Dicho proceso de fabricacion comprende preferiblemente por lo menos una o mas etapas como se describio anteriormente en conjunto con los procesos de purificacion. La divulgacion respectiva tambien aplica al proceso de fabricacion de acuerdo con la presente invencion y se refiere a la divulgacion anterior para evitar repeticiones.
Adicionalmente, el proceso de fabricacion de acuerdo con la presente invencion puede comprender una etapa de formular la glucoprotema de interes en la forma de una formulacion farmaceutica. Las formulaciones ffquidas o liofilizadas adecuados se conocen en la tecnica anterior y se describieron anteriormente, nos referimos a la divulgacion respectiva.
Preferiblemente, la glucoprotema de interes que se produce mediante el metodo de fabricacion de acuerdo con la presente invencion se selecciona de gonadotropinas, seleccionadas preferiblemente de FSH CG, LH, y TSH.
Seccion experimental
El siguiente experimento ilustra el proceso de la presente invencion.
Etapa 0: ultrafiltracion
El FSH crudo forma el material de partida que se deriva de sobrenadantes de cultivo celular que contienen FSH recombinante.
Antes de la etapa de ultrafiltracion se clarifica el sobrenadante mediante filtracion a temperatura ambiente a traves de un filtro de profundidad de 2 pm. La ultrafiltracion luego se realiza con una membrana que tiene un corte de o aproximadamente 10 kD, con una presion de transmembrana que no excede 1.2 bar.
Etapa 1: Cromatograffa de fase inversa (columna Source30 RPC)
Regulador de carga
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[0109]: 20 mM Na-fosfato pH 7.5/10% v/v isopropanol (que contiene metionina) regulador de elucion: 20 mM Na-fosfato pH 7.5/18% v/v isopropanol (que contiene metionina)
El material obtenido a partir de la concentracion y ultrafiltracion (etapa 0) se complemento con isopropanol a una concentracion equivalente al regulador de carga. La columna Source30 se equilibra con regulador de carga. Despues de cargar el material en la columna se lava el material no unido durante aproximadamente 15CV mediante regulador de carga. El FSH se eluye al aumentar la concentracion de isopropanol hasta 18% v/v en el Regulador de Elucion (aproximadamente 8CV). El grupo de elucion se concentra mediante ultrafiltracion para proceder a la siguiente etapa. La etapa se realiza a temperatura ambiente.
- RCP
- Columna
- Source30 RPC
- Poliestireno/divinil benceno
- Fase unida
- ninguno
- Forma de globulo
- Rfgido, esferico, poroso, monodisperso
- Tamano de parffcula
- 30 pm
- Residencia [min]
- 1.3
- Maximo Flujo lin [cm/h]
- 500
Etapa 1a: ultrafiltracion
El eluado de la etapa 1 (RPC) se somete a ultrafiltracion a temperatura ambiente con una membrana que tiene un corte de o aproximadamente 10 kD en una presion de transmembrana no excede 1.2 bar y que concentra el eluado a hasta aproximadamente 10% del volumen de columna de SEC.
Etapa 2: Cromatograffa de exclusion de tamano (columna Superdex 200)
Regulador de serie: acetato de amonio 15 mM pH 8.5 (que contiene metionina)
El material agrupado de la etapa 1a una se sometio a columna SEC, se equilibro con regulador de serie. El FSH se eluye bajo condiciones isocraticas en un tiempo de retencion distinto (aproximadamente 0.6 - 0.7 CV). Esta etapa de cromatograffa proporciona purificacion y un intercambio de regulador antes de la siguiente etapa. La etapa sEc se realiza a temperatura ambiente.
- SEC
- Columna
- Superdex 200 Compuesto esferico de agarosa Entrecruzada y dextrano
- Altura de lecho
- 60 cm
- Lfmite de exclusion (Mr)
- 1.3 x 106 protemas globulares
- Rango de separacion (Mr)
- 10 000-600 000 protemas globulares
- Flujo lin max [cm/h]
- 120
Etapa 3: Cromatograffa de intercambio de aniones (columna CaptoQ)
Regulador de carga: 15 mM de acetato amonio pH 8.5 (que contiene metionina)
Regulador de elucion A: 15 mM acetato de amonio pH 5 (que contiene metionina)
Regulador de elucion B: 15 mM acetato de amonio pH 8.5 (que contiene metionina) - NaCl 0.25 M.
El material obtenido de la etapa 2 (SEC) se aplica luego a una resina de intercambio de aniones equilibrada con regulador de carga. El material no unido se lava con regulador de carga (aproximadamente 10 CV). El FSH se eluyo
parcialmente mediante regulador de elucion A (que contiene menos moleculas FSH cargadas) antes de la segunda etapa de elucion con regulador de elucion B (que contiene las moleculas FSH cargadas mayores). Ambas etapas de elucion se realizan en una forma de etapas. El AEX se realiza a temperature ambiente.
- AEX
- Matriz
- CaptoQ
- Tipo de intercambio de ion
- Anion fuerte, Q
- Grupo cargado
- -N+(CH3)3
- Capacidad ionica total
- 0.16-0.22 mmol Cl-/ml medio
- Tamano de parffcula*
- 90 pm (d50v)
- Flujo Lin Max.
- 700 cm/h
- Capacidad de union dinamica
- > 100 mg BSA/ml medio
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Etapa 4: Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) (columna butil HP)
Regulador de carga: 20 mM Na fosfato pH 7.5-1.5 M-sulfato de amonio (que contiene metionina)
Regulador de elucion: 20 mM Na fosfato pH 7.5 (que contiene metionina)
El material de elucion con regulador B obtenido de la columna de cromatograffa de intercambio de anion (mayores 10 moleculas de FSH acidas) se ajusta con regulador de carga a sulfato de amonio 1.5 M y se carga en una columna butil HP Sepharose equilibrado con regulador de carga. Despues de lavar el material no unido, se eluye el FSH de la columna al reducir la concentracion de sulfato de amonio en una forma lineal a bajo cero. La etapa HlC se realiza a temperatura ambiente.
- HIC
- Matriz
- Butil Cefarosa HP
- Ligando
- Butilo
- Densidad de ligando
- 50 pmol/ml
- Tamano de parffcula promedio
- 34 pm
- Flujo lin maximo
- 600 cm/h
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Etapa 5: Diafiltracion (membrana que tiene un corte de 10 kD)
Regulador de preformulacion: 9-10 mM sodio-fosfato pH 7.0-7.1 0.1g/l metionina 50 mg/ml de sacarosa
20 EL eluado de la etapa 4 (HIC) se aplica luego a temperatura ambiente a diafiltracion. Mediante este regulador de etapa se intercambia al regulador de preformulacion y se ajusta a la concentracion deseada.
Etapa 6: nanofiltracion
El producto de la etapa de diafiltracion se aplica directamente a un dispositivo de nanofiltracion de 20 nm a una presion de aprox. 2 bar. La etapa se realiza a temperatura ambiente.
El proceso de las etapas (-1) a (6) produce FSH en una pluralidad de > 99.99% p/p con base en la protema total como 5 se determina mediante el ensayo HCP (nivel de protema de celula anfitrion < 0.01% p/p).
Claims (15)
- 510152025303540Reivindicaciones1. Un proceso para la purificacion de una glucoprotema que comprende someter un Ifquido que contiene dicha glucoprotema a las etapas de:a) cromatograffa de fase inversa,b) cromatograffa de exclusion de tamano, yc) cromatograffa de interaccion hidrofoba;en el que las etapas se realizan en la secuencia de cromatograffa de fase inversa, cromatograffa de exclusion de tamano y cromatograffa de interaccion hidrofoba.
- 2. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que en la etapa a) de cromatograffa de fase inversa el regulador de elucion contiene un disolvente organico, preferiblemente isopropanol.
- 3. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que en la etapa b) de cromatograffa de exclusion de tamano se realiza intercambio de regulador.
- 4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una o mas etapas seleccionadas del grupo que consiste de etapas de cromatograffa, etapas de filtracion y etapas de inactivacion de virus.
- 5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las etapas adicionales se seleccionan del grupo que consiste de cromatograffa de intercambio de iones tal como cromatograffa de intercambio de anion y cromatograffa de intercambio de cation; cromatograffa de afinidad tal como cromatograffa de afinidad de tinte, cromatograffa de afinidad inmunitaria, cromatograffa de afinidad lectinas y cromatograffa de afinidad perborato; filtracion tal como diafiltracion, ultrafiltracion y nanofiltracion; e inactivacion de virus.
- 6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente una etapa d) de cromatograffa de intercambio de anion y/o una etapa de cromatoenfoque.
- 7. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la etapa d) de cromatograffa de intercambio de anion se lleva a cabo posterior a la etapa b) de cromatograffa de exclusion de tamano.
- 8. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en el que la etapa d) de cromatograffa de intercambio de anion en el que se utiliza por lo menos un regulador de elucion que contiene sal, y/o se separan isoformas cargadas de la glucoprotema.
- 9. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la glucoprotema se seleccion del grupo que consiste de FSH, CG, LH y TSH, preferiblemente FSH.
- 10. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la glucoprotema se produce recombinantemente.
- 11. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende realizar secuencialmente las etapas de(0) Ultrafiltracion;(1) cromatograffa de fase inversa;(1) opcionalmente ultrafiltracion;(2) cromatograffa de exclusion de tamano;(3) cromatograffa de intercambio de aniones;(4) cromatograffa de interaccion hidrofoba;(5) ultrafiltracion y/o diafiltracion;(6) nanofiltracion.
- 12. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el proceso(i) no comprende una etapa de intercambio de regulador entre la cromatograffa de fase inversa y la cromatograffa de exclusion de tamano; y/o(ii) no comprende una etapa de intercambio de regulador entre la cromatograffa e exclusion de tamano y la cromatograffa de intercambio de anion o la cromatograffa de interaccion hidrofoba; y/ o(iii) no comprende una cromatograffa de inmunoafinidad y/o una cromatograffa de intercambio de cationes;(iv) Comprende solo tres etapas cromatograficas, es decir, una cromatograffa de fase inversa, una cromatograffa de 5 exclusion de tamano, y una cromatograffa de interaccion hidrofoba; o solo cuatro etapas cromatograficas, es decir,una cromatograffa de fase inversa, una cromatograffa de exclusion de tamano, una cromatograffa de intercambio de aniones o etapa de cromatoenfoque y una cromatograffa de interaccion hidrofoba.
- 13. Un proceso para de fabricacion de una glucoprotema de interes, que comprende las siguientes etapas: i) expresar recombinantemente la glucoprotema de interes;10 II) purificar dicha glucoprotema de interes expresa recombinantemente al someter un ffquido que contiene dicha glucoprotema en por lo menos las etapas de:a) cromatograffa de fase inversa,b) cromatograffa de exclusion de tamano, yc) cromatograffa de interaccion hidrofoba;15 en el que las etapas se realizan en la secuencia de cromatograffa de fase inversa, cromatograffa de exclusion de tamano y cromatograffa de interaccion hidrofoba.
- 14. El proceso de fabricacion de acuerdo con la reivindicacion 13, que comprende por lo menos una de las siguientes etapas:i) uno o mas etapas como se define en las reivindicaciones 1 a 12; y/o 20 II) una etapa para formular la glucoprotema de interes en forma de una formulacion farmaceutica.
- 15. El proceso de fabricacion de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, en el que la glucoprotema se selecciona de las gonadotropinas, preferiblemente seleccionadas de FSH, CG, LH, y TSH.
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