ES2572629T3 - Método para purificar FSH o un mutante de FSH - Google Patents

Abstract

Un método para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH en proteínas con subunidades beta triglicosiladas, que comprende la etapa de someter la muestra a cromatografía de interacción hidrofóbica, en donde la muestra de FSH o mutantes de FSH ha sido primero purificada, que comprende la etapa de someter un líquido que comprende dichos FSH o mutantes de FSH a: (1) cromatografía de afinidad de colorante; (2) cromatografía de intercambio aniónico débil; (3) cromatografía de interacción hidrofóbica; (4) cromatografía de intercambio aniónico fuerte. en donde las etapas se llevan a cabo en dicho orden.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Metodo para purificar FSH o un mutante de FSH Campo de la invencion

La invencion se refiere a la purificacion de una hormona estimuladora del fcdculo (FSH) o de un mutante de la misma.

Fundamento de la invencion

La hormona estimuladora del folfculo (FSH) es una protema que forma parte de la clase de las gonadotropinas. La FSH se utiliza en el tratamiento de la infertilidad y de trastornos de la reproduccion en pacientes tanto femeninos como masculinos.

En la naturaleza, la FSH es producida por la glandula pituitaria o hipofisis. Para uso farmaceutico, la FSH puede producirse por via recombinante (rFSH), o puede ser aislado de la orina de mujeres postmenopausicas (uFSH).

La FSH se utiliza en pacientes femeninas para la induccion de la ovulacion (OI) y en la hiperestimulacion ovarica controlada (COH) para tecnicas de reproduccion asistida (ART). En un regimen de tratamiento tfpico para la induccion de la ovulacion, se administran a una paciente inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente 75 a 300 UI de FSH/dfa) durante un penodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 dfas. En un regimen de tratamiento tfpico para la hiperestimulacion ovarica controlada, se administran a una paciente inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente 150 a 600 UI de FSHMa) durante un penodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 dfas.

La FSH se utiliza tambien para inducir la espermatogenesis en hombres que padecen oligospermia. Un regimen que usa 150 UI de FSH tres veces por semana en combinacion con 2.500 UI de hCG dos veces por semana ha logrado exito consiguiendo una mejora en el recuento de esperma en hombres que padecen de hipogonadismo hipogonadotrofico [Burgues et al.; Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6].

Se han desarrollado agonistas de FSH/mutantes de FSH con valores mayores de la vida mitad fusionando el peptido carboxiterminal de hCG (CTP) con FSH humana recombinante nativa (rhFSH). El resto CTP consta de los aminoacidos 112-118 a 145 con cuatro sitios de glicosilacion unida a O localizados en las posiciones 121, 127, 132 y 138. La patente de EE.UU. No. 5.338.835 y la patente de EE.UU. No. 5.585.345 describen una subunidad p de FSH modificada extendida en la Glu C-terminal con el resto CTP de hCG. Se afirma que el analogo modificado resultante tiene la actividad biologica de la FSH nativa, pero una prolongada vida mitad en circulacion. La patente de EE.UU. No. 5.405.945 describe que la porcion carboxi terminal de la subunidad beta de hCG o una variante de la misma tiene efectos significativos en el aclaramiento de CG, FSH y LH.

La patente de EE.UU. No. 5.883.073 describe protemas de cadena simple que comprenden dos subunidades alfa con actividad agonista o antagonista para CG, TSH, LH y FSH. La patente de EE.UU. No. 5.508.261 describe polipeptidos heterodimericos que tienen afinidad de union a receptores de LH y FSH que comprenden una subunidad a de hormona de glicoprotema y un polipeptido p-subunidad de origen no natural, en donde el polipeptido subunidad p es una cadena de aminoacidos que comprende cuatro subsecuencias unidas, cada de los cuales se elige entre una lista de secuencias espedficas. Klein et al. (2003) describen un analogo de cadena simple de FSH con una vida mitad aumentada, en el que las subunidades ay p estan unidas por un oligopeptido que contiene dos sitios de glicosilacion unidos a N.

El documento WO 01/58493 describe 77 mutaciones que se pueden hacer en la subunidad a de FSH y 51 mutaciones que se pueden hacer en la subunidad beta de la FSH en un intento de mejorar la vida mitad in vivo de la FSH. El documento WO 01/58493 describe que las subunidades a y U mutantes se pueden usar individualmente (1 sitio de glicosilacion adicional) o en combinacion (2 sitios de glicosilacion adicionales). Los 128 mutantes candidatos se identificaron usando 50 modelos de la estructura 3D de la FSH que fueron generados basandose unicamente en la estructura de la hCG y un alineamiento de secuencia de FSH y hCG a pesar de la identidad de solo el 32% entre las subunidades beta de hCG y FSH. El documento WO 01/58493 no describe la produccion o el ensayo de cualquiera de las subunidades a o p de FSH donde se introdujo un sitio de glicosilacion mediante mutagenesis dirigida.

El documento WO 05/020934 describe el mutante de FSH GM1, con mutaciones en las subunidades tanto alfa como beta de FSH, incluyendo una mutacion en H83N de la subunidad alfa y una doble mutacion en E55N/V57T de la subunidad beta. Este documento describe un metodo de purificacion para dicho mutante de FSH que comprende etapas de filtracion seguidas por inmunoafinidad,

Debido a la importancia de la FSH en el tratamiento de los trastornos de la fertilidad, es de desear la provision de FSH o mutantes de FSH de alta pureza y alta actividad espedfica. El tratamiento con FSH requiere inyecciones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

repetidas. Se pueden administrar por v^a subcutanea preparados de FSH muy puros, que permiten la auto- administracion por el paciente, lo que aumenta la comodidad del paciente y el cumplimiento.

Lynch et al. [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12 - 19] describen un metodo para purificar FSH hipofisaria humana. El metodo implica cromatograffa de intercambio anionico y cationico, extraccion por inmunoafinidad y cromatograffa de exclusion por tamano. Se dice que el metodo tiene por resultado FSH hipofisaria que tiene una actividad espedfica de 4.990 Ui (inmunoensayo) /mg, con 16 UI / mg de LH. El contenido de protema se determino bien sea por peso seco o en solucion por absorcion a 280 nm (suponiendo que la A2801 cm para 1 g/l es igual a 1).

El documento WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) describe un procedimiento para la purificacion de la FSH urinaria humana a partir de extractos urinarios llamados gonadotropinas menopausicas humanas (hMG). El procedimiento utiliza cromatograffa de intercambio ionico en resinas de intercambio anionico debilmente basicas del tipo DEAE, seguida de cromatograffa de afinidad en resina que tiene un derivado de antraquinona como ligando. Se dice que el procedimiento produce FSH urinaria libre de LH y que tiene una actividad espedfica de 6.870 UI (inmunoensayo)/mg. El contenido de protema se determino suponiendo que una solucion acuosa de 1 mg/ml de protema tiene una densidad optica de 0,62 a 277 nm, en cubetas de cuarzo de 1 cm de recorrido.

El documento WO 00/63248 (Institut Massone SA) describe un procedimiento para la purificacion de gonadotropinas, incluyendo FSH, a partir de orina humana. El proceso implica las siguientes etapas: cromatograffa de intercambio ionico con una resina cationica fuerte del tipo de sulfopropilo, cromatograffa de intercambio ionico con una resina anionica fuerte, y cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC). Segun se ha publicado se ha obtenido un preparado de FSH que tiene una actividad espedfica de 8.400 UI/ mg (metodo de Steelman - Pohley: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604 - 616) y menos de 1 UI de LH (metodo del aumento de peso de la vesmula seminal de la rata: Van Hell H., Matthijsen R&GA Overbeek, Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) de actividad biologica por 75 UI de FSH. El contenido de protema se obtuvo por el metodo de [O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265].

La patente de EE.UU. No. 5.990.288 (Musick et al.) describe un metodo para purificar FSH a partir de muestras biologicas tales como la hipofisis humana o de orina post-menopausica humana. El proceso utiliza cromatograffa de intercambio cationico en Fractogel EMD SO3- 650M, seguido de cromatograffa de afinidad de colorante sobre resina Mimetic Orange 1, seguido de una etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica en una resina Bakerbond Wide Pore HI-propilo. Se dice que el proceso tiene por resultado una FSH hopofisaria humana que tiene una actividad espedfica de 7.066 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 1 UI (inmunoensayo) /mg de LH, y una FSH urinaria que tiene una actividad espedfica de 6.298 UI (inmunoensayo)/ mg y menos de 3 UI (inmunoensayo)/mg de LH. El contenido de protema se determino por absorcion a 280 nm (suponiendo que la A2801 cm de 1 g/l es igual a 1).

Chiba et al. [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205 - 218] describen una tecnica para la purificacion de gonadotropinas hipofisarias caninas, incluyendo FSH, usando cromaiograffa de afinidad de concanavalina (Con) A, cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) y cromatograffa de iones metalicos inmovilizados con Cu++. Se afirma que la FSH resultante tiene una actividad espedfica de 2,17 UI/g de protema/g usando un ensayo de radiorreceptor para FSH para medir la actividad biologica y el kit de ensayo de protemas BioRad (BioRad Laboratories CA, EE.UU.) para determinar el contenido de protema.

El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) describe un metodo para purificar FSH humana a partir de orina. El proceso implica inmunocromatograffa con anticuerpos monoclonales inmovilizados espedficos de FSH unidos a Sepharose 4B por divinil sulfona, seguido por HPLC de fase inversa. La FSH resultante esta libre de LH y otras protemas urinarias y tiene una actividad espedfica de 6.200 UI/mg de polvo liofilizado (metodo de Steelman - Pohley). El preparado fue el primer preparado de FSH adecuado para la administracion subcutanea, debido a su pureza.

Na et al. [Purification and characterization of recombinant humnan follicle stimulating hormone produced by Chinese hamster ovary cells; Microbiol. Biotechnol., 2005, 15, 395 - 402] describen un metodo de purificacion de FSH que comprende una primera etapa de cromatograffa de intercambio anionico, seguida por cromatograffa de interaccion hidrofobica y cromatograffa con hidroxiapatita. Se dice que el procedimiento tiene por resultado una FSH recombinante que tiene una actividad espedfica de aproximadamente 16.000 UI.

Sumario de la invencion

La invencion proporciona un metodo para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH en protemas con subunidades beta triglicosiladas, que comprende la etapa de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica, en donde la muestra de FSH o mutantes de FSH ha sido primero purificada, que comprende la etapa de someter un ffquido que comprende dicho FSH o mutantes de FSH a:

(1) cromatograffa de afinidad de colorante;

(2) cromatograffa de intercambio anionico debil;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(3) cromatograffa de interaccion hidrofobica;

(4) cromatograffa de intercambio anionico fuerte.

Las etapas cromatograficas se llevan a cabo en dicho orden.

La FSH mutante de acuerdo con la presente invencion puede comprender preferiblemente una o mas de las siguientes mutaciones en comparacion con la FSH de tipo silvestre:

D3N y/o H83N en la subunidad alfa, y/o

E55N y/o V57T en la subunidad beta.

Los mutantes de FSH tambien pueden comprender inserciones de aminoacidos en comparacion con la FSH de tipo silvestre. En realizaciones preferidas se insertan secuencias de cuatro aminoacidos tales como GNFT o GNRT entre los aminoacidos 3 y 4 de la subunidad alfa de la FSH de tipo silvestre.

En una realizacion preferida, los mutantes de FSH comprenden una mutacion D3N en la subunidad alfa y una doble mutacion E55N/V57T en la subunidad beta.

En otra realizacion preferida, los mutantes de FSH comprenden una insercion GNFT entre los aminoacidos 3 y 4 de la subunidad alfa de la FSH de tipo silvestre y una doble mutacion E55N/V57T en la subunidad beta.

En otra realizacion preferida, los mutantes de FSH comprenden una insercion de GNRT entre los aminoacidos 3 y 4 de la subunidad alfa de la FSH de tipo silvestre y una doble mutacion E55N/V57T en la subunidad beta.

En otra realizacion preferida, los mutantes de FSH comprenden una mutacion H83N en la subunidad alfa y una mutacion doble E55N/V57T en la subunidad beta.

Un mutante de FSH particularmente preferido de acuerdo con la presente invencion es el descrito en el documento WO 2005/020934, que se refiere como GM1, en el que la subunidad alfa de FSH comprende la secuencia de SEC ID NO. 1, y en el que la subunidad beta de FSH comprende la secuencia de SEC ID NO. 2.

En la FSH de tipo silvestre hay 4 sitios de N glicosilacion, 2 de cada uno dentro de la subunidad alfa (N52 y N78) y de la beta (N7 y N24).

La FSH mutante puede ser N-glicosilado en los restos de asparagina 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de dicha FSH mutante. El N83 de la subunidad alfa mutante puede estar glicosilado, ademas de los sitios de glicosilacion de la FSH de tipo silvestre. N55 de la subunidad beta mutante puede estar glicosilado, ademas de los sitios de glicosilacion de FSH de tipo silvestre.

En una realizacion preferida, el mutante de FSH tiene una subunidad alfa de FSH que comprende la secuencia de SEC ID NO. 1, y una subunidad beta de FSH que comprende la secuencia de SEC ID NO. 2, en donde N52 y N78 de la subunidad alfa estan glicosilados y ademas N7 y N24 de la subunidad beta estan glicosilados. Este mutante FSH se denomina aqu GM1 con subunidad beta diglicosilado.

En una realizacion mas preferida, la FSH mutante tiene una subunidad alfa de FSH que comprende la secuencia de SEC ID NO. 1, y una subunidad beta de FSH que comprende la secuencia de SEC ID NO. 2, en donde N52 y N78 de la subunidad alfa estan glicosilados y ademas N7, N24 y N55 de la subunidad beta estan glicosilados. Este mutante de FSH se denomina GM1 con subunidad beta triglicosilado.

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH en protemas con subunidades beta tri-glicosiladas, que comprende la etapa de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica.

Preferiblemente la cromatograffa de interaccion hidrofobica se lleva a cabo sobre una columna Source 15 o una columna analoga.

Preferiblemente, el mutante de FSH es GM1.

Un cuarto aspecto de la presente invencion consiste en un mutante de FSH con una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 en donde dicho mutante de FSH tiene una bioactividad espedfica entre 11.000 y 17.000 UI/mg.

Un quinto aspecto de la presente invencion consiste en una composicion farmaceutica que comprende una FSH o un mutante de FSH que tiene una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2, obtenida por el metodo de la presente invencion, asf como un excipiente farmaceuticamente aceptable.

5

10

15

20

25

30

35

40

Un sexto aspecto de la presente invencion consiste en el uso de FSH o un mutante de FSH que tiene una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 obtenido por el metodo de la presente invencion para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de trastornos de la fertilidad.

En una realizacion, la FSH o mutante de FSH se obtiene por medios recombinantes.

Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se usan en la descripcion de la invencion:

DF: diafiltracion

FSH: hormona estimuladora del foffculo;

r-FSH: FSH recombinante;

hFSH: FSH humana;

r-hFSH: FSH humana recombinante

BV: Volumen del lecho

DEAE: dietilaminoetilo

ELISA: inmunoensayo ligado a una enzima

DAC: cromatograffa de afinidad de colorante

OD: densidad optica

HIC: cromatograffa de interaccion hidrofobica HPLC: cromatograffa de ffquidos de alta resolucion IRMA: ensayo inmunorradiometrico KD o kD: kiloDalton

HCP: protema de celula hospedadora, protemas que proceden de la celula hospedadora usada para la expresion de FSH

IPC: controles en proceso IEF: enfoque isoelectrico PES: polieter sulfona

RP-HPLC: cromatograffa de ffquidos de alta resolucion en fase inversa

Q FF: intercambio anionico en Q Sepharose FF

RT: temperatura ambiente

UF: ultrafiltracion

WFI: agua para inyeccion

Descripcion detallada de la invencion

Se describe en el presente texto un metodo para enriquecer una muestra de FSH o un mutante de FSH en protemas con subunidades beta triglicosiladas que comprende la etapa de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica.

La invencion proporciona un metodo para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH en protemas con subunidades beta triglicosiladas que comprende la etapa de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica en donde la muestra de FSH o mutantes de FSH ha sido primera purificada, que comprende la etapa de someter un ffquido que comprende dicha FSH o mutantes de FSH a:

(1) cromatograffa de afinidad de colorante;

(2) cromatograffa de intercambio anionico debil;

5

10

15

20

25

30

(3) cromatograffa de interaccion hidrofobica;

(4) cromatograffa de intercambio anionico fuerte;

Las etapas cromatograficas se llevan a cabo en dicho orden.

El metodo de purificacion de la invencion proporciona una masa de la FSH o mutante de FSH, de alta pureza que despues puede ser formulada para el medicamento final. Tiene la ventaja de proporcionar un alto grado de pureza sin utilizar cromatograffa de inmunoafinidad. La FSH o mutante de FSH crudos que forma el material de partida para la purificacion de acuerdo con la presente invencion consiste en cosechas de cultivo de celulas que contienen la FSH o mutante de FSH.

En una realizacion preferida, se incluye un antioxidante o un aminoacido libre o dipeptido con efecto antioxidante y eliminador en algunas o todas las etapas del metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion. Mas concretamente, el antioxidante esta presente en cualquiera de los tampones utilizados para purificar y/o concentrar y/o filtrar el mutante de FSH. El antioxidante previene la oxidacion de la FSH o mutante de fSh durante el tratamiento. Un antioxidante preferido es la L-metionina. Preferiblemente, la L-metionina se utiliza a una concentracion de aproximadamente 10 a 100 mM. Otros ejemplos de antioxidante incluyen t-butil-4-metoxi-fenol, 2,6-bis (1,1-dimetiletil)-4-metil fenol; bimeta-bisulfito de potasio o de sodio, bisulfito de sodio. Ejemplos de aminoacido libre y dipeptido con efecto antioxidante y eliminador son histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anserina, 1 -metilhistidina o combinaciones de los mismos.

Tfpicamente, el material de partida se clarifica primero y despues opcionalmente se concentra (por ejemplo, usando ultrafiltracion) y/o se intercambia en tampon (por ejemplo a traves de una etapa de diafiltracion) antes de ser capturado en la primera etapa cromatografica.

En las etapas de cromatograffa pueden utilizarse resinas basadas en polfmeros y resinas basadas en agarosa. Tambien es posible usar cromatograffa de membrana, en la que la resina se reemplaza con una membrana funcionalizada.

Las 4 etapas de purificacion de la presente invencion se presentan a continuacion con mas detalle.

Etapa de cromatograffa de afinidad de colorante (1).

El metodo de la invencion implica una etapa de cromatograffa de afinidad de colorante (1). En una realizacion preferida, la etapa de cromatograffa de afinidad de colorante se lleva a cabo utilizando una resina que tiene como ligando inmovilizado un compuesto colorante que es bien conocido por los expertos en la tecnica, es decir, Cibacron Blue F3G-A. El termino "inmovilizado" es bien entendido por los expertos en la tecnica y significa que el ligando es derivatizado en el sentido de que esta unido qmmicamente a la resina. Una resina particularmente preferida es Blue Sepharose FF (que puede obtenerse de GE Biosciences Inc.). Las caracteffsticas tecnicas de Blue Sepharose FF son las siguientes:

ESPECIFICACIONES TECNICAS

Ligando

Cibacron Blue F3G-A

Metodo de acoplamiento del ligando

Acoplamiento de triazina

Capacidad de union

= 18 mg de albumina de suero humano /ml de gel drenado

Matriz

Agarosa altamente reticulada, 6%

Lfmite de exclusion (Mr)

4 x 106

Intervalo de tamanos de parffcula

45- 165 pm

Velocidad lineal de flujo *

“ 750 cm/h

Densidad de ligando

“ 7 pmol Cibacron azul / ml de medio

Estabilidad de pH

4-12 (a largo plazo), 3-13 (a corto plazo)

Estabilidad qmmica

40°C durante 7 dfas en: etanol al 70%, hidrocloruro de guanidina 6 M, urea 8 M

5

10

15

20

25

30

35

40

Se entiende que el metodo puede realizarse con resinas alternativas que tienen caractensticas similares. Los ejemplos de resinas alternativas incluyen: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh Bioscience), Blue Cellthru BigBead (Sterogene), SwellGel Blue (Pierce), Cibachrome blue 3GA-agarosa 100 (Sigma), Affi-Gel Blue (BioRad), cartuchos Econo-Pac blue (Bio-Rad), Blue sepharose HP (Amersham), Cibacron blue 3GA (Sigma).

La elucion en la etapa de cromatograffa de afinidad de colorante inmovilizado debe llevarse a cabo preferiblemente usando un tampon de fosfato, de forma especialmente preferible hidroxido de amonio. El pH del eluyente debe ser preferiblemente de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 13, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente l2, de forma especialmente preferible a aproximadamente 11 - 12. Entre los tampones alternativos apropiados para mantener un pH de aproximadamente 11,8 se incluye el bicarbonato amonico.

En una realizacion particularmente preferida, los tampones en contacto con el producto para la etapa de cromatograffa de afinidad de colorante (equilibrio y lavado) contienen un antioxidante, tal como L-metionina. Otros ejemplos de antioxidante incluyen t-butil-4-metoxifenol, 2,6-bis (1,1 -dimetiletil)-4-metil fenol; bimetabisulfito de potasio o de sodio, bisulfito de sodio.

Etapa de cromatograffa de intercambio anionico debil (2).

El metodo de la invencion comprende tambien una etapa de cromatograffa de intercambio anionico debil (2). Una resina preferida es DEAE Sepharose FF (que puede obtenerse de GE Biosciences), o una resina que tenga caractensticas similares. Alternativamente, la etapa de cromatograffa de intercambio anionico debil puede llevarse a cabo en Fractogel DEAE (Merck KgaA), Toyopearl DEAE 650M (Tosoh Biosep Inc.). La etapa de cromatograffa de intercambio anionico debil (2) se lleva a cabo preferiblemente usando un tampon de acetato de amonio a un pH de aproximadamente 7,5 a 9,5.

Etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica (3).

El metodo implica tambien una etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica (3). En una realizacion preferida, la cromatograffa de interaccion hidrofobica se lleva a cabo con una resina tal como Toyopearl Butyl 650M (que puede obtenerse de Tosoh Biosep Inc.).

Se entiende que la etapa (3) puede realizarse utilizando resinas alternativas, que tienen caractensticas similares. Las resinas alternativas que se pueden utilizar son los siguientes: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub); Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose High Performance; SOURCE 15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE15PHE, todos de GE Biosciences (800) 526 - 3593; (vease
www.amershambiosciences.com). Otras resinas son: Hydrocell C3 o C4; Hydrocell Phenyl de Biochrom Labs Inc. (812) 234 - 2558; (vease
www.biochrom.com).

La union a la resina HIC se consigue en un tampon con una conductividad elevada, que se obtiene por adicion de sal (NaCl, (NH4) 2SO4 o Na2SO4, por ejemplo). La elucion en la etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica se lleva a cabo preferiblemente por la reduccion de la conductividad de la fase movil (reduciendo la concentracion de sal), utilizando un tampon que tiene un pH desde aproximadamente 6 a aproximadamente 8, mas preferiblemente de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5, lo mas preferiblemente a aproximadamente 7). Un sistema particularmente preferido contiene fosfato de sodio para el tamponamiento preferiblemente a un pH de 7 o aproximadamente 7, y sulfato de amonio. Anteriormente se han mencionado tampones alternativos.

En una realizacion particularmente preferida, los tampones en contacto con el producto para la etapa (3) de HIC (equilibrado, lavado, elucion) contienen un antioxidante tal como L-metionina. Anteriormente se han mencionado antioxidantes alternativos.

Etapa de cromatograffa de intercambio anionico fuerte (4).

El metodo de la invencion comprende tambien una segunda etapa de cromatograffa de intercambio anionico (4), que se realiza en una resina de intercambio anionico fuerte. Una resina preferida es Fractogel EMD TMAE HICAP (que puede obtenerse de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

Soporte

Fractogel ® EMD TMAE

N° Cat.

1.16887

Tamano de las parffculas tipo S

20-40 pm

Tipo de cromatograffa

cromatograffa de intercambio ionico

Grupo funcional

grupo trimetilaminoetilo (tipo Q)

Estructura del monomero

CH2=CH-CONH (CH2) 2N + (CHa)a

5

10

15

20

25

Capacidad de union con protema

120 mg de BSA /ml de gel

Intervalo de estabilidad de pH

pH 2 a pH 12

Valor de pK

> 13

Condiciones de elucion

altas concentraciones de sal

Lfmite de presion (lecho: 150 x 10 mm)

20 bar (perdida de carga a lo largo de la columna)

Temperatura de trabajo

de 4 °C a temperatura ambiente

Conservante

etanol al 20%

Cartucho listo para usar

50-10 mm

Material a granel tipos S

100 ml; 500 ml

Velocidad lineal de flujo

1,27 - 6,35 cm /min

Alternativamente, la segunda etapa de cromatograffa de intercambio anionico puede llevarse a cabo en Q Sepharose FF con las siguientes caractensticas:

Tipo de intercambiador de iones

anion fuerte

Capacidad total (mmol/ml)

0,18 a 0,25

Lfmite de exclusion (protemas globulares)

4 x 106

Forma de las esferas

esferica, diametro de 45- 165 pm

Estructura de las esferas

agarosa reticulada, 6%

Estabilidad del pH en operacion

2 -12

Estabilidad del pH en limpieza

1 -14

Velocidad lineal de flujo a 25 °C 1 bar 15 cm de altura del lecho, columna XK 50/30

400 - 700 cm/h

La segunda etapa de cromatograffa de intercambio anionico se lleva a cabo preferiblemente usando un tampon que tiene un pH ligeramente alcalino (por ejemplo, de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 9,0, o de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,0, lo mas preferiblemente a aproximadamente 8,5). Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, tampon de borato, acido trietanolamina/iminodiacetico Tris, acetato de amonio, tricina, bicina, TES, HEPES, TAPS. El mas preferido es el tampon borato, a un pH de aproximadamente 8,5. La elucion a partir de la resina de intercambio anionico se consigue aumentando la conductividad de la fase movil por medio de la adicion de sal, preferiblemente NaCl. En una realizacion particularmente preferida, los tampones de contacto con el producto para la cromatograffa de intercambio anionico (equilibrado, lavado, elucion) contienen un antioxidante, preferiblemente L-metionina. Anteriormente se han mencionado antioxidantes alternativos.

Etapa opcional de purificacion (0) - Etapa de captura.

Antes de la etapa de cromatograffa de afinidad de colorante (1), puede ser de desear llevar a cabo una etapa de captura con el fin de eliminar las impurezas mas crudas. La etapa de captura se lleva a cabo preferiblemente utilizando un Q Sepharose Fast Flow (GE Biosciences) llevado a cabo preferiblemente usando un tampon que tiene un pH ligeramente alcalino (por ejemplo de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5, lo mas preferiblemente a aproximadamente 7,0). Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, tampon de borato, acido trietanolamina/iminodiacetico Tris, acetato de amonio, tricina, bicina, TES, HEPEs, TAPS. El mas preferido es el tampon borato, a un pH de aproximadamente 7,0. La elucion de la resina de intercambio anionico se consigue aumentando la conductividad de la fase movil mediante la adicion de sal, preferiblemente NaCl. En una realizacion particularmente preferida, los tampones en contacto con el producto para la cromatograffa de intercambio anionico (equilibrado, lavado, elucion) contienen un antioxidante, preferiblemente L- metionina. Anteriormente se han mencionado antioxidantes alternativos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Etapa de purificacion adicional opcional (3bis) - ultrafiltracion/diafiltracion.

Antes de la etapa de la segunda cromatograffa de intercambio ionico (4), puede ser deseable llevar a cabo una etapa de ultrafiltracion (3bis) con el fin de concentrar la FSH o mutante de FSH crudos. La ultrafiltracion (o diafiltracion) se lleva a cabo preferiblemente utilizando una membrana que tiene un valor de corte de aproximadamente 3-10 kD, lo mas preferiblemente aproximadamente 8 kD.

Etapa de purificacion adicional opcional (5) - nanofiltracion.

Puede ser deseable someter la muestra de FSH a una etapa de nanofiltracion, en particular como etapa de aclaramiento de virus, es decir, para reducir el riesgo de contaminacion del preparado de FSH con virus o parffculas similares a virus que se originan del cultivo de celulas.

La nanofiltracion se puede hacer en cualquier etapa del proceso de purificacion, pero particularmente se prefiere llevar a cabo la nanofiltracion despues de la 2a etapa de cromatograffa de intercambio ionico. La nanofiltracion puede ser realizada mas de una vez, por ejemplo puede llevarse a cabo dos veces.

En una realizacion particularmente preferida, se llevan a cabo las siguientes etapas en el orden que se indica a continuacion:

(0) etapa de captura (preferiblemente usando una columna Q SFF);

(1) cromatograffa de afinidad de colorante (preferiblemente usando una columna de Blue Sepharose FF);

(2) cromatograffa de intercambio anionico debil (preferiblemente usando una columna de DEAE Sepharose FF);

(3) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) (preferiblemente utilizando una columna Butyl 650M);

(3bis) ultrafiltracion (preferiblemente con una membrana que tiene un valor de corte de 8 kD);

(4) cromatograffa de intercambio anionico en una resina de intercambio anionico fuertemente basica (preferiblemente usando una resina TMAE hicap);

(5) nanofiltracion

La ventaja de la presente invencion es que el metodo de purificacion carece de una etapa de cromatograffa de inmunoafinidad, de alto elevado, y de todas formas proporciona un alto grado de pureza y bioactividad espedfica de glicoprotema. Tambien, la glicoprotema purificada, preferiblemente la FSH o mutante de FSH de la presente invencion, no contiene impurezas no deseadas anadidas por la cromatograffa de inmunoafinidad (por ejemplo, inmunoglobulinas lixiviadas de la resina).

Las muestras de FSH o mutantes de FSH, que han sido sometidas al menos a las etapas (1) a (4) y opcionalmente

(0), (3 bis) y/o (5) se consideran puras.

Etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica.

Un mutante de FSH mas preferido de acuerdo con esta invencion tiene una subunidad alfa de FSH que comprende la secuencia SEC ID NO. 1, y una subunidad beta de FSH que comprende la secuencia SEC ID NO. 2, en donde N52 y N78 de la subunidad alfa estan glicosilados y otros N7, N24 y N55 de la subunidad beta estan glicosilados. Este mutante de FSH se refiere como GM1 con subunidad beta triglicosilada.

Sin embargo, dependiendo de la lmea celular elegida para la produccion recombinante de GM1, la posicion N55 de la subunidad beta puede estar solo parcialmente glicosilada. Cuando se produce en celulas CHO (ovario de hamster chino), que es una lmea celular comun para la produccion de FSH y sus mutantes, solo aproximadamente el 40% de las protemas GM1 tienen una subunidad beta tri-glicosilada.

Como GM1 con subunidad beta triglicosilada tiene una bioactividad espedfica mas alta que GM1 con subunidad beta-diglicosilada, existe la necesidad de un procedimiento para acumular o enriquecer las protemas con subunidad beta triglicosilada.

Ahora se ha encontrado que una muestra de FSH o mutantes de FSH puede ser enriquecida en protemas con una subunidad beta triglicosilada sometiendola a una columna de interaccion hidrofobica.

En una realizacion, la invencion se refiere por tanto a un metodo para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH en protemas con subunidades beta tri-glicosiladas, que comprende la etapa de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica. Preferiblemente la cromatograffa de interaccion hidrofobica se lleva a cabo en una columna Source 15 o una columna analoga.

5

10

15

20

25

Por consiguiente, es deseable llevar a cabo una etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica, en particular, usando una columna de Source 15 HIC (de Amersham; se define como perla resolutiva Source 15 de 15 pm de diametro) que tiene las siguientes caractensticas:

Soporte

Source 15 PHE

N° cat.

17-0147

Tamano de las partmulas de tipo S

15 pm

Tipo de cromatograffa

Cromatograffa de interaccion hidrofobica

Grupo funcional

Fenilo

Estructura del monomero

R-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5

Capacidad de union de protema

25 mg de BSA/ml de gel

Intervalo de estabilidad de pH

de pH 2 a pH 12

Valor de pK

NA

Condiciones de elucion

bajas concentraciones de sal, preferiblemente la conductividad es de 105 ± 2 mS/cm

Lfmite de presion (altura del lecho: 30 mm)

14 bar (perdida de carga a lo largo de la columna)

Temperatura de trabajo

de 4 °C a 40 °C

Conservante

Etanol al 20%

Cartucho listo para el uso

5/50 - 100 - 150 mm y 10/50 - 100 - 150 mm

Material en masa tipos S

100 ml; 1 L

Velocidad lineal de flujo

2,5-15 cm/min

Las columnas que se consideran analogas a la columna Source 15 HIC tienen las siguientes caractensticas: Permiten alta resolucion, tienen esferas pequenas, tamano de poro grande y son hidrofilas. Esfera pequena significa preferiblemente un tamano entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 pm. Tamano de poro grande significa preferiblemente tamanos de poro de aproximadamente 750 a aproximadamente 1000 Angstrom. Preferiblemente, estas columnas se basan en resinas basadas en polfmero, que se derivatizan con un ligando funcional de interaccion hidrofobica, opcionalmente a traves de enlazadores de diferentes tamanos hasta polfmeros largos. Las resinas basadas en polfmeros comprenden preferiblemente resinas de metacrilato, poliestireno y divinilbenceno. Los ligandos funcionales de interaccion hidrofobica comprenden preferiblemente eter, propilo, polipropilenglicol, isopropilo, fenilo, butilo y hexilo.

Las columnas HIC preferidas utilizadas como analogos de la columna Source 15 son:

• Fractogel fenilo tipo S (de Merck)

• TSK gel fenilo 5PW (de Tosoh Biosciences)

• Todas las resinas hidrofobicas tipo 'S' de Merck

• Todas las resinas hidrofobicas TSK de Tosoh Biosciences

En una realizacion en la que la protema es un mutante de FSH existente en diferentes formas de glicosilacion, esta etapa proporciona un enriquecimiento en la forma mas glicosilada. Espedficamente, utilizando una columna Source 15 HlC o una columna analoga se proporciona un enriquecimiento en el mutante de FSH en el que la subunidad beta es, por ejemplo, triglicosilada en lugar de diglicosilada.

En una realizacion preferida, la etapa de enriquecimiento se realiza en una muestra pura de FSH o mutantes de FSH, es decir, la muestra habfa sido previamente sometida a las etapas (1) a (4), y opcionalmente, (0), (3 bis) y/o (5) como se definio anteriormente. Sin embargo, la muestra de FSH o mutantes de FSH tambien puede haber sido sometida a un proceso de purificacion diferente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

En una realizacion preferida, la presente invencion se refiere entonces a un metodo que comprende las etapas en el orden siguiente:

(0) etapa de captura;

(1) cromatograffa de afinidad de colorante;

(2) cromatograffa de intercambio anionico debil;

(3) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC);

(3 bis) ultrafiltracion;

(4) cromatograffa de intercambio anionico fuerte;

(5) nanofiltracion;

(6) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC).

En una realizacion, la etapa de enriquecimiento (6) sola o combinada con etapas previas de purificacion proporciona un producto final del mutante de FSH con una subunidad alfa que comprende la secuencia de SEC ID NO. 1, y con una subunidad beta de FSH que comprende la secuencia de SEC ID NO. 2, con la siguiente relacion de glicosilacion:

• mutante de FSH que tiene una subunidad beta triglicosilada aproximadamente 70 - 80%

• mutante de FSH que tiene una subunidad beta diglicosilado aproximadamente 20 - 30%

La relacion de mutante de FSH en el que esta presente la subunidad beta triglicosilada se incrementa por tanto en comparacion con una muestra sin realizar la etapa de enriquecimiento en el que la relacion es la siguiente:

• mutante de FSH que tiene una subunidad beta triglicosilada aproximadamente 30 - 40%

• mutante de FSH que tiene una subunidad beta diglicosilado aproximadamente 70 - 60%

La presente invencion se refiere tambien a una muestra de mutantes de FSH que pueden obtenerse por la etapa de enriquecimiento anterior.

Los mutantes de FSH que tienen una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 con subunidades beta tri-glicosiladas tienen bioactividades espedficas mayores que los mutantes con subunidades beta diglicosiladas.

En una realizacion de la presente invencion se obtiene un mutante de FSH que tiene una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 y que tiene una bioactividad espedfica entre 11.000 y 17.000 UI/mg.

Tales mutantes, tanto si se obtienen por cualquiera de los metodos anteriores o por cualquier otro metodo, tambien se incluyen en esta invencion.

Preferiblemente, la muestra de mutante de FSH tiene una bioactividad espedfica entre 12.000 y 16.000 UI/mg y mas preferiblemente de aproximadamente 15.000 UI/mg, en donde la actividad biologica se mide por el bioensayo de Steelman Pohley y el contenido de protemas se mide mediante SE-HPLC.

Preferiblemente, la muestra de mutante de FSH contiene al menos 60%, preferiblemente al menos 70% - 80%, mas preferiblemente al menos 90% de subunidades beta triglicosiladas.

Almacenamiento/Liofilizacion

La composicion ffquida resultante del proceso de purificacion como se describe anteriormente y que contiene FSH o mutante de FSH purificados, se puede congelar para su almacenamiento tal cual, o despues de la purificacion el material eluido se puede someter a liofilizacion ("secado por congelacion") para eliminar disolvente. El ffquido o producto liofilizado resultante se denomina "granel de mutante de FSH".

Formulaciones de FSH

La FSH o mutante de FSH de la invencion o purificada de acuerdo con el metodo de la invencion se pueden formular para inyeccion, por via intramuscular o subcutanea, preferiblemente subcutanea. La formulacion de mutante de FSH puede ser liofilizada, en cuyo caso se disuelve en agua para inyeccion justo antes de la inyeccion. La formulacion de FSH o mutante de FSH puede ser tambien una formulacion ffquida, en cuyo caso se puede inyectar directamente, sin disolucion previa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La FSH o formulacion mutante de FSH pueden ser de dosis unica o de dosis multiple. Si se trata de dosis multiple, debe contener preferiblemente un agente bacteriostatico, tal como, por ejemplo, alcohol bendlico, metacresol, timol o fenol, preferiblemente alcohol bendlico o metacresol. Las formulaciones de dosis unica tambien pueden comprender un agente bacteriostatico.

La FSH o mutante de FSH de la invencion puede formularse con excipientes y estabilizantes conocidos, por ejemplo sacarosa y manitol. Tambien puede comprender un antioxidante, tal como metionina. Puede comprender ademas un agente tensioactivo, tal como TWEEN (preferiblemente TWEEN 20), o Pluronic (preferiblemente Pluronic F68).

Una composicion farmaceutica particularmente preferida que puede obtenerse por los metodos de la invencion es una formulacion liofilizada, en la que un mutante de FSH con una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 se formula con sacarosa, metionina, Tween 20, Na2HPO4-2H2O, NaH2PO4'H2O, hidroxido de sodio y acido o-fosforico a un pH de aproximadamente 7.

En una formulacion multidosis particularmente preferida, la FSH producida por el metodo de la invencion se formula disolviendola en agua para inyeccion con sacarosa, tampon de fosfato (pH 7), Pluronic F68, metionina y metacresol o alcohol bendlico.

Indicaciones

La FSH o mutante de FSH de la invencion es adecuada para su uso en todos los tratamientos en los que esta indicada la FSH. Es especialmente adecuada para la administracion subcutanea en la induccion de la ovulacion, la hiperestimulacion ovarica controlada para tecnologfas de reproduccion asistida, y en el tratamiento de la oligospermia. Se puede usar junto con otras gonadotropinas, tales como LH y hCG. Tambien se puede usar con otros compuestos que aumentan la respuesta a la fSh, tales como el citrato de clomifeno, inhibidores de la aromatasa, tales como Anastrozol, Letrozol, Fadrozol y YM-511.

Secuencias:

SEC ID NO. 1: mutante de FSH (GM1) subunidad a;

SEC ID NO. 2: mutante de FSH (GM1) subunidad p.

La expresion "celula recombinante" se refiere a una celula producida insertando ADN heterologo, incluyendo cualquiera de los metodos de manipulacion genetica antes mencionados. Preferiblemente la FSH es producida por via recombinante en celulas de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas con un vector o vectores que comprenden ADN que codifica la glicoprotema humana subunidad alfa y la subunidad beta de FSH. El ADN que codifica las subunidades alfa y beta puede estar presente en el mismo vector o en vectores diferentes.

En una realizacion preferida, la FSH o mutante de FSH se produce de forma recombinante en celulas CHO, o bien en un suero o en un medio libre de suero.

En una realizacion preferida, la FSH purificada o mutante de FSH producidos de acuerdo con el metodo de la invencion son adecuados para la administracion subcutanea, permitiendo la autoadministracion por el paciente.

La expresion "FSH o mutante de FSH recombinante crudos " se refiere al sobrenadante de cultivo celular a partir de celulas recombinantes que expresan FSH, antes de que haya sido sometido a ninguna etapa de cromatograffa. La expresion comprende la forma cruda del sobrenadante (como se afsla de las celulas), asf como sobrenadante concentrado y/o filtrado y/o ultrafiltrado.

La expresion "actividad biologica" en relacion con la actividad de FSH, se refiere a la capacidad de una formulacion de mutante de FSH de desencadenar respuestas biologicas asociadas con FSH, tales como aumento de peso ovarico en el ensayo de Steelman-Pohley [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604 - 616], o el crecimiento folicular en una paciente. El crecimiento folicular en una paciente puede ser evaluado mediante ultrasonidos, por ejemplo, en terminos del numero de folfculos que tienen un diametro medio de aproximadamente 16 mm en el dfa 8 de la estimulacion. La actividad biologica se evalua con respecto a un estandar aceptado para FSH.

El contenido de LH en un preparado de FSH puede medirse, por ejemplo, usando un inmunoensayo espedfico de LH, tal como el Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finlandia).

La expresion "actividad espedfica", en referencia a la FSH o el mutante de FSH de acuerdo con la presente invencion, significa la actividad biologica en UI del preparado en un ensayo biologico para FSH reconocido, tal como el bioensayo de Steelman Pohley [dividido por la cantidad de protemas, determinada mediante un ensayo para el contenido de protema total, como el ensayo de Lowry [O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr y R. J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R. Dulley y P. A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136], el ensayo de Bradford [Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248], o mediante la absorbancia a 280 nm.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Las muestras de FSH pueden analizarse en relacion con su pureza en diversas etapas del procedimiento usando, por ejemplo, tecnicas tales como las enumeradas a continuacion:

Cuantificacion de FSH o mutante de FSH/ subunidad alfa libre / pureza / formas oxidadas: RP-HPLC.

Como se menciono anteriormente, la FSH o mutante de FSH es una glicoprotema heterodimerica, compuesta de una subunidad a y una p. Puede ocurrir cierta disociacion de las subunidades, y esto puede controlarse observando la cantidad de subunidad a libre presente en una muestra. Ademas, las subunidades de mutante de FSH pueden llegar a oxidarse. Los contaminantes oxidados pueden ser cuantificados utilizando RP-HPLC, mientras que las subunidades libres pueden evaluarse usando SDS-PAGE.

Cuantificacion de FSH o mutante de FSH: Inmunoensayo.

El contenido de mutante de FSH en una muestra puede determinarse usando un inmunoensayo espedfico para el mutante de FSH, tal como el inmunoensayo DELFlA FSH.

Protema total: Ensayo de Bradford, ensayo de Lowry, absorbancia a 280 nm.

Como con cualquier preparado proteico, el contenido de protema total puede determinarse usando tecnicas tales como un ensayo de Bradford, un ensayo de Lowry o por absorbancia a 280 nm.

Patron de isoformas: IEF.

Como se menciono anteriormente, la FSH o mutante de FSH es una glicoprotema que tiene multiples restos de oligosacaridos unidos en varios lugares en ambas subunidades. Los restos de oligosacaridos pueden tener diferentes grados de ramificacion y pueden estar cubiertos con restos de acido sialico. Los restos de acido sialico estan cargados negativamente (a pH neutro). Las diferencias de recubrimiento conducen a la heterogeneidad, con una mezcla de especies que tienen diferentes puntos isoelectricos (pl). Esto puede evaluarse usando una tecnica que separa basandose en la carga, tal como el enfoque isoelectrico (lEF).

Protema de la celula hospedadora (HCP).

La protema de la celula hospedadora puede ser analizada usando un ensayo ELISA. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos contra un "cultivo simulacion", que es un cultivo de celulas hospedadoras sin gen de FSH.

Ejemplos

La presente invencion sera ahora ilustrada mediante 2 ejemplos.

Ejemplo 1

Etapa (1): Cromatograffa de afinidad de colorante sobre Blue Sepharose.

El material de partida de mutante de FSH para la purificacion se prepara a partir de cosechas de cultivo celular que contienen mutante de FSH recombinante, es decir, el mutante de FSH que tienen una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 fue producido por via recombinante en celulas CHO de acuerdo con el documento WO 2005/020934. La columna de cromatograffa de afinidad de colorante (resina Blue Sepharose FF) se equilibra primero con un tampon de baja conductividad a un pH de 7,0 que contiene L- metionina. Entonces se aplica el ffquido que contiene la FSH directamente a la resina. Despues de la carga, el material no unido se separa por lavado usando tampon de equilibrado. La FSH se eluye finalmente lavando la columna con tampon de hidroxido de amonio a pH 11,8, que contiene L-metionina. El conjunto de elucion se procesa directamente al paso siguiente. El paso se realiza a temperatura ambiente.

Etapa (2): Cromatograffa de intercambio anionico debil en DEAE Sepharose FF.

El material eluido Blue Sepharose FF de la etapa (1) se carga en una columna de DEAE Sepharose FF equilibrada frente a un tampon de acetato de amonio, pH 8,5, que contiene acetato de amonio y L-metionina. El material no unido se lava con tampon de equilibrio. El mutante de FSH se encuentra en la fraccion no unida.

Etapa (3): Cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) en Toyopearl Butyl 650M.

El material eluido de Blue Sepharose FF procedente de la etapa (2) se carga en una columna Toyopearl Butyl 650M equilibrada contra un tampon de fosfato de sodio, pH 7,0, que contiene sulfato de amonio y L-metionina. El material no unido se lava con tampon de equilibrado. La elucion se realiza con tampon de fosfato de sodio pH 7,0 que contiene sulfato de amonio y L-metionina.

Etapa (4): Cromatograffa de intercambio anionico fuerte en Fractogel EMD TMAE HICAP.

El material eluido de HIC (de la etapa (3)) se carga en una columna Fractogel EMD TMAE HICAP equilibrada frente a tampon de borato de sodio, pH 8,5, que contiene L-metionina. Despues de la carga, la columna se aclaro con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

tampon de equilibrado con el fin de eliminar todo el material no unido. A continuacion, la columna se eluyo con tampon de borato de sodio pH 8,5, que contiene NaCl (para aumentar la conductividad) y L-metionina (como antioxidante).

Al seguir el procedimiento anterior, el factor de purificacion, es decir la relacion de pureza del mutante de FSH en la muestra purificada frente a la pureza del mutante de FSH en el material de partida (mutante de FSH crudo), es de aproximadamente 40.000.

Ejemplo 2

Etapa (0): Etapa de captura.

El material de partida de mutante de FSH para la purificacion se prepara a partir de cosechas de cultivo de celulas que contiene mutante de FSH recombinante, es decir, el mutante de FSH que tiene una subunidad alfa de acuerdo con SEC ID NO 1 y una subunidad beta de acuerdo con SEC ID NO 2 fue producido por via recombinante en celulas CHO de acuerdo con el documento WO 2005/020934.

Clarificacion

El mutante r-FSH crudo se filtro a traves de un filtro profundo (tal como filtros Millipore Millistack o equivalentes). La recoleccion clarificada se concentra en una membrana de 8 kDa y se captura en la columna Q SFF.

Etapa (1): Cromatograffa de afinidad de colorante sobre Blue Sepharose.

El material de partida de mutante de FSH para la purificacion se prepara a partir de cosechas de cultivo celular que contienen mutante de FSH recombinante, es decir, el mutante de FSH fue producido por via recombinante en celulas CHO de acuerdo con el documento WO 2005/020934, bien sea en un suero o en un medio libre de suero. La columna de cromatograffa de afinidad de colorante (resina Blue Sepharose FF) se equilibra primero con un tampon de baja conductividad a pH 7,0 que contiene L-metionina. Entonces se aplica el lfquido que contiene la FSH directamente a la resina. Despues de la carga, el material no unido se elimina por lavado usando tampon de equilibrado. La FSH se eluye finalmente lavando la columna con tampon de hidroxido de amonio a pH 11,8, que contiene L-metionina. El conjunto de elucion se procesa directamente a la etapa siguiente. La etapa se realiza a temperatura ambiente.

Etapa (2): Cromatograffa de intercambio anionico debil en DEAE Sepharose FF.

El material eluido de Blue Sepharose FF de la etapa (1) se carga en una columna de DEAE Sepharose FF equilibrada frente a un tampon de acetato de amonio, pH 8,5, que contiene acetato de amonio y L-metionina. El material no unido se elimina con tampon de equilibrado. El mutante de FSH esta en la fraccion no unida.

Etapa (3): Cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) en Toyopearl Butyl 650M.

El material eluido Blue Sepharose FF de la etapa (2) se carga en una columna Toyopearl Butyl 650M equilibrada frente a un tampon de fosfato de sodio, pH 7,0, que contiene sulfato de amonio y L-metionina. El material no unido se elimina con tampon de equilibrio.

Etapa (3 bis): Diafiltracion.

El mutante de FSH de la etapa (3) se concentro mediante filtracion de flujo tangencial sobre una membrana de 8 KD de polieter sulfona. Cuando el material retenido alcanzo aproximadamente la mitad del volumen inicial, el material se sometio a intercambio de tampon mediante diafiltracion frente a WFI y luego tampon de equilibrado de la cromatograffa de intercambio anionico siguiente.

Etapa (4) Cromatograffa de intercambio anionico en resina Fractogel EMD TMAE hicap.

Una columna Fractogel EMD TMAE hicap se equilibro primero con tampon de borato de sodio, pH 8,5, que contiene L-metionina. El material diluido (de la etapa (3)) se cargo en la columna. El material no unido se elimino usando tampon de equilibrado. La FSH se eluye de la columna aumentando la concentracion de sal de una forma lineal.

Etapa (5) Nanofiltracion.

El material eluido de la etapa (4) de Fractogel EMD-TMAE se aplico directamente a un dispositivo de nanofiltracion de 20 nm a una presion de 3 bares bajo nitrogeno. El filtrado se procesa para la etapa siguiente. La operacion se llevo a cabo a 2-8 °C.

Etapa (6) Etapa de cromatograffa de interaccion hidrofobica usando una columna Source 15 HIC.

El filtrado de la nanofiltracion se ajusta en relacion con la conductividad y se carga en una columna Source 15 HIC equilibrada frente a borato de sodio, pH 9,1, que contiene sulfato de amonio, sulfato de potasio y L-metionina. El

material no unido se elimina con tampon de equilibrio. La FSH se eluye de la columna disminuyendo el contenido de sal de una forma escalonada.

Se obtiene un producto final del mutante de FSH con lo que se identifican las siguientes glicoformas (utilizando un metodo anafftico basado en cromatograffa de ffquidos de alta presion):

5 Mutante de FSH que tiene una subunidad beta triglicosilada 76%

Mutante de FSH que tiene una subunidad beta diglicosilada 24%

Pureza de las muestras

Tabla 1: pureza de las muestras de mutante de FSH despues de cada etapa de purificacion

Etapa de purificacion

Pureza

Etapa (0):

19% FSH

Etapa de captura

• Contenido de FSH determinado por RP-HPLC

• Contenido total de protema determinado mediante

Bradford

Etapa (1):

aproximadamente 1.182.000 ppm HCP

Cromatograffa de afinidad de colorante en resina

• Contenido de FSH determinado por RP-HPLC

Blue Sepharose FF

• Contenido de protema de celulas hospedadoras

determinado por ELISA

Etapa (2):

Cantidad de impureza: 586.000 ppm

Cromatograffa de intercambio anionico en resina

• Contenido de FSH determinado por RP-HPLC

DEAE Sepharose FF

• Contenido de protema de celulas hospedadoras

determinado por ELISA

Etapa (3):

Cantidad de impureza: 3500 ppm

Cromatograffa de interaccion hidrofobica en resina

• Contenido de FSH determinado por RP-HPLC

Toyopearl Butyl 650 M

• Contenido de protema de celulas hospedadoras

determinado por ELISA

Etapa (4):

Cantidad de impureza: < 1000 ppm

Cromatograffa de intercambio anionico en resina

• Contenido de FSH determinado por RP-HPLC

Fractogel EMD TMAE hicap

• Contenido de protema de celulas hospedadoras

determinado por ELISA

10

15

Actividad biologica de muestras de mutante de FSH

La actividad biologica del mutante de r-FSH purificado se midio utilizando el metodo de aumento de peso ovarico Steelman - Pohley. La actividad espedfica se calculo usando la actividad biologica dividida por el contenido de mutante de FSH como se determina por un metodo de SE-HPLC, como se describe a continuacion.

En la Tabla 2 se dan Ejemplos de valores para dos muestras de una FSH global final. Las muestras se obtuvieron siguiendo un metodo que comprende los siguientes etapas:

(0) etapa de captura;

(1) cromatograffa de afinidad de colorante;

(2) cromatograffa de intercambio anionico debil;

(3) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC);

(3 bis) ultrafiltracion;

(4) cromatograffa de intercambio anionico fuerte;

(5) nanofiltracion;

(6) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC).

La actividad espedfica de la masa final obtenida esta tipicamente entre 11.000 y 17.000 Ul/mg, en particular de 12.000 a 16.000.

Tabla 2. Actividad espedfica de mutante de r-FSH purificado en masa de la invencion

Analisis

Muestra 1 Muestra 2

Concentracion de protema por SE-HPLC (mg/ml)

0,72 0,64

Actividad espedfica (actividad biologica/SE-HPLC)

15.824 Ul/mg 11.914 Ul/mg

5

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH en protemas con subunidades beta triglicosiladas, que comprende la etapa de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica, en donde la muestra de FSH o mutantes de FSH ha sido primero purificada, que comprende la etapa de someter un ffquido que comprende dichos FSH o mutantes de FSH a:

   (1) cromatograffa de afinidad de colorante;

   (2) cromatograffa de intercambio anionico debil;

   (3) cromatograffa de interaccion hidrofobica;

   (4) cromatograffa de intercambio anionico fuerte. en donde las etapas se llevan a cabo en dicho orden.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1a, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofobica se lleva a cabo en una columna Source 15 o una columna analoga.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion ia o la reivindicacion 2a, en donde el mutante de FSH tiene una subunidad alfa segun la SEC ID No. 1 y una subunidad beta segun la SEC ID No. 2.
4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 3a, en donde la cromatograffa de afinidad de colorante de la Etapa (1) se lleva a cabo con una resina que tiene Cibacron Blue F3G-A inmovilizado.
5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 4a, en donde la resina usada para la cromatograffa de afinidad de colorante de la Etapa (1) es Blue Sepharose FF.
6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 5a, en donde la cromatograffa de afinidad de colorante de la Etapa (1) se lleva a cabo usando un tampon de hidroxido de amonio a un pH de aproximadamente 9 a 13 como eluyente.
7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 6a, en donde la resina usada para la cromatograffa de intercambio anionico debil de la Etapa (2) es DEAE Sepharose FF.
8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 7a, en donde la cromatograffa de intercambio anionico debil de la Etapa (2) se lleva a cabo usando un tampon de acetato de amonio a un pH de aproximadamente 7,5 a 9,5.
9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 8a, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) de la Etapa (3) se lleva a cabo usando Toyapearl Butyl 650 M.
10. 10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 9a, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofobica de la Etapa (3) se lleva a cabo usando fosfato sodico/sulfato amonico con un pH de aproximadamente 6 a 8 como eluyente.
11. 11. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 10a, en donde la resina utilizada para la cromatograffa de interaccion hidrofobica de la Etapa (4) es Fractogel TMAE HiCap.
12. 12. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 11a, en donde la etapa de cromatograffa de intercambio anionico fuerte de la Etapa (4) se lleva a cabo usando borato sodico con un pH de aproximadamente 7,2 a 9 como eluyente.
13. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 12a, que comprende ademas una etapa de captura (0).
14. 14. El metodo segun la reivindicacion 13a, en donde la Etapa de captura (3) se lleva a cabo usando una columna de Q Sepharose FF.
15. 15. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas una etapa de concentracion, preferiblemente una etapa de ultrafiltracion.
16. 16. Un metodo para enriquecer una muestra de FSH o mutantes de FSH para protemas con subunidades beta triglicosiladas que comprende las etapas de someter la muestra a cromatograffa de interaccion hidrofobica, comprendiendo el metodo las etapas:

    (0) etapa de captura;

    (1) cromatograffa de afinidad de colorante;

    10

    (2) cromatograffa de intercambio anionico debil;

    (3) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC);

    (3 bis) ultrafiltracion;

    (4) cromatograffa de intercambio anionico fuerte;

    (5) nanofiltracion;

    (6) cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC)

    en donde las etapas se llevan a cabo en dicho orden.
17. 17. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cualquiera de los eluyentes y/o tampones puede contener un antioxidante, en particular L-metionina.