ES2312037T3 - Metodo para puruficar fsh. - Google Patents
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Abstract
Un método para purificar FSH recombinante o una variante de FSH que comprende someter a un líquido que contiene FSH a: (1) una cromatografía de afinidad a colorantes; (2) una cromatografía de interacción hidrófoba; y (3) una cromatografía de fase inversa; que puede ser llevado a cabo en cualquier orden.
Description
Método para purificar FSH.
La invención se refiere al campo de la
purificación de la hormona estimuladora del folículo (FSH).
La hormona estimuladora del folículo (FSH) es
una proteína inyectable que pertenece a la clase de gonadotrofinas.
La FSH se usa en el tratamiento de los trastornos de la infertilidad
y reproductivos tanto en pacientes femeninos como en masculinos.
En la naturaleza, la FSH es producida por la
glándula pituitaria. Para su uso farmacéutico, la FSH puede ser
producida recombinantemente (rFSH), o puede ser aislada a partir de
la orina en mujeres posmenopáusicas (uFSH).
La FSH se usa en pacientes femeninos en la
inducción de la ovulación (Ol) y en la hiperestimulación ovárica
controlada (COH) para tecnologías de reproducción asistida (TRA). En
un régimen de tratamiento típico para la inducción de la ovulación,
a un paciente se le administra inyecciones diarias de FSH o una
variante (aproximadamente de 75 a 300 UI FSH/día) durante un
periodo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días. En un
régimen de tratamiento típico para la hiperestimulación ovárica
controlada, a un paciente se le administra inyecciones diarias de
FSH o una variante (aproximadamente 150-600 UI
FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 hasta
aproximadamente 12 días.
La FSH también es usada para inducir la
espermatogénesis en hombres que sufren de oligoespermia. Se ha
logrado que un régimen que usa 150 UI de FSH 3 veces semanalmente
en combinación con 2.500 UI de hCG dos veces semanalmente mejora el
recuento del esperma en hombres que sufren de hipogonadismo
hipogonadotrófico [Burgues et al.; "Subcutaneous self-
administration of highly purified follicle stimulating hormone and
human chorionic gonadotrophin for the treatment of male
hypogonadotrophic hypogonadism". Grupo español de colaboración en
hipogonadismo hipogonadotrófico en hombres; Hum. Reprod.;
1997, 12, 980-6].
A causa de la importancia de la FSH en el
tratamiento de los trastornos de la fertilidad, la provisión de FSH
de alta pureza y de alta actividad específica es deseable. El
tratamiento con FSH requiere de inyecciones repetidas. Las
preparaciones de FSH altamente purificadas pueden ser administradas
subcutáneamente, permitiendo la autoadministración por el paciente,
aumentándose así la comodidad del paciente y el cumplimiento
terapéutico.
Linchar et al. "The extraction and
purification of human pituitary follicle-stimulating
hormone and luteinising hormone"; Acta Endocrinologica,
1988, 288, 12-19] describen un método para purificar
la FSH de la glándula pituitaria humana. El método implica la
cromatografía de intercambio catiónico y aniónico, la extracción por
inmunoafinidad y la cromatografía de exclusión por tamaños. El
método, según se piensa, causa que la FSH de la glándula pituitaria
tenga una actividad específica de 4.990 UI (inmunoensayo)/mg, con 16
UI/mg de LH. El contenido de proteínas fue determinado por la
absorción a 280 nm en peso seco o en solución (asumiendo que
A^{280}_{1 \ cm} para 1 g/l es igual a 1).
El documento WO 98/20039 (IBSA lnstitut
Biochimique SA) describe un procedimiento para la purificación de
la FSH humana urinaria que comienza con extractos urinarios llamados
gonadotrofinas menopáusicas humanas (hMG). 0 El procedimiento usa la
cromatografía de intercambio iónico con resinas de intercambio
aniónico débilmente básicas del tipo DEAE seguido de la
cromatografía de afinidad en resinas que tienen un derivado de
antraquinona como ligando. El procedimiento, según se piensa,
proporciona FSH urinaria libre de LH y que tiene una actividad
específica de 6.870 UI (inmunoensayo)/mg. El contenido de proteínas
fue determinado asumiendo que una solución de agua de 1 mg/ml de
proteína tiene una densidad óptica de 0,62 a 277 nm, en cuvetas de
cuarzo con una longitud de paso de 1 cm.
El documento WO 00/63248 (Instituto Massone SA)
describe un procedimiento para la purificación de gonadotrofinas,
incluyendo FSH, a partir de orina humana. El procedimiento implica
las etapas siguientes: cromatografía de intercambio iónico con una
resina fuertemente catiónica del tipo sulfopropilo, cromatografía de
intercambio iónico con una resina fuertemente aniónica, y
cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Una preparación de
FSH que tiene una actividad específica de 8.400 UI/mg (método de
Steelman-Pohley: "Assay of the follicle
stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic
gonadotrophy"; Endocrinology; 1953, 53,
604-616) y menos de 1 UI de LH (método de ganancia
de peso de la vesícula seminal en rata: Van Hell H, Matthijsen R
& GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) de
actividad biológica por 75 UI de FSH, según se publica, es
obtenida. El contenido de proteínas fue realizado por el método de
Lowry [O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951,
193, 265]. El documento de EE.UU. Nº. 5.990.288 (Musick et
al.) describe un método para purificar FSH a partir de muestras
biológicas, tales como glándula pituitaria humana u orina
posmenopáusica humana. El procedimiento usa la cromatografía de
intercambio catiónico en Fractogel EMD
SO_{3}-650M, seguido de la cromatografía de
afinidad a colorantes en resina Mimetic Orange 1, seguido de una
etapa de cromatografía de interacción hidrófoba en resina Bakerbond
Wide Pore Hl-Propyl. El procedimiento, según se
dice, da como resultado FSH de glándula pituitaria humana que tiene
una actividad específica de 7.066 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 1
UI (inmunoensayo)/mg de LH, y una FSH urinaria que tiene una
actividad específica de 6.298 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 3 UI
(inmunoensayo)/mg de LH. El contenido de proteínas fue determinado
por la absorción a 280 nm (asumiendo que una A^{280}_{1 \ cm}
para 1 g/l es igual a 1).
Chiba et al. [Isolation and partial
characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland;
Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218]
describen una técnica para purificar gonadotrofinas de glándula
pituitaria canina, incluyendo FSH, usando cromatografía de afinidad
de Concanavalina (Con) A, cromatografía de interacción hidrófoba
(HIC) y cromatografía de ión metálico inmovilizado con Cu^{++}. La
FSH resultante, según se publica, tiene una actividad específica de
2,17 UI/g proteína usando un ensayo radioreceptor para FSH que mide
la actividad biológica y el kit de ensayo de proteína BioRad
(Laboratorios BioRad CA EE.UU.) para determinar el contenido de
proteínas.
El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca
Cesare Serono SPA) describe un método para purificar FSH humana a
partir de la orina. El procedimiento implica la inmunocromatografía
con anticuerpos monoclonales inmovilizados
FSH-específicos unidos a Sepharose 4B por
divinil-sulfona, seguido de HPLC de fase inversa. La
FSH resultante está libre de LH y otras proteínas urinarias y tiene
una actividad específica de 6.200 UI/mg de polvo liofilizado
(método de Steelman-Pohley). La preparación era la
primera preparación de FSH que era adecuada para la administración
subcutánea, debido a su pureza.
Todavía hay una necesidad de nuevos métodos para
purificar FSH y variantes de FSH. En particular, hay una necesidad
de métodos de purificación que eviten el uso de las etapas de
cromatografía de inmunoafinidad de costes elevados.
Un objeto de la invención es proporcionar un
nuevo método para purificar FSH recombinante o una variante de FSH
recombinante.
En un primer aspecto, la invención proporciona
un método para purificar FSH recombinante humana o una variante de
FSH que comienza a partir de un líquido que contiene FSH cruda, que
comprende las etapas siguientes:
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes;
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba; y
- (3)
- cromatografía de fase inversa;
que puede ser llevado a cabo en cualquier
orden.
La figura 1 ilustra la presente invención, es
decir un procedimiento de purificación que comprende las etapas
de:
- -
- cromatografía de afinidad a colorantes,
- -
- cromatografía de interacción hidrófoba,
- -
- cromatografía de fase inversa,
La figura 2 muestra un organigrama de una
realización específica de la presente invención, es decir un
procedimiento de purificación que comprende las etapas de:
- -
- ultrafiltración/diafiltración,
- -
- cromatografía de intercambio aniónico,
- -
- cromatografía de afinidad a colorantes,
- -
- cromatografía de interacción hidrófoba,
- -
- cromatografía de fase inversa,
- -
- cromatografía de intercambio aniónico,
- -
- nanofiltración,
- -
- ultrafiltración/diafiltración;
Las abreviaturas siguientes son usadas en la
descripción de la invención:
DF: diafiltración
FSH: hormona estimulante del folículo;
r-FSH: FSH recombinante;
hFSH: FSH humana;
r-hFSH: FSH recombinante
humana
BV: Volumen de lecho
DEAE: dietilaminoetilo
ELISA: inmunoensayo unido a enzima
DAC: cromatografía de afinidad a colorantes
IMAC: cromatografía de afinidad de ión metálico
inmovilizado
OD: densidad óptica
HIC: Cromatografía de interacción hidrófoba
HPLC: cromatografía líquida de alta
resolución
IRMA: ensayo inmunoradiométrico
KD o kD: kiloDalton
HCP: proteína de célula huésped, proteínas que
provienen de la célula huésped usada para la expresión de FSH
IPC: Controles en procedimiento
IEF: enfoque isoeléctrico
PES: polietersulfona
RP-HPLC: cromatografía líquida
de alta resolución de fase inversa
Q FF: intercambio aniónico en Q Sepharose FF
TA: Temperatura ambiente
UF: ultrafiltración
WFI: agua para inyección
La invención proporciona un método para
purificar FSH recombinante humana o una variante de FSH recombinante
que comienza a partir de un líquido que contiene FSH cruda,
comprendiendo las etapas:
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes;
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba; y
- (3)
- cromatografía de fase inversa;
que puede ser llevado a cabo en cualquier
orden.
El método de purificación de la invención
proporciona una solución de FSH recombinante de alta pureza que
posteriormente puede ser formulada en un medicamento final, por
ejemplo, Gonal-F (Serono). Esto tiene la ventaja de
proporcionar un alto grado de pureza sin usar cromatografía de
inmunoafinidad. La FSH cruda que forma el material de partida para
la purificación de acuerdo con la presente invención consiste en
recolecciones de un cultivo celular que contienen FSH
recombinante.
En una realización preferida, un antioxidante o
un aminoácido libre o dipéptido con efecto antioxidante y
secuestrante es incluido en algunas o todas las etapas del método de
purificación de acuerdo con la presente invención. Con más
precisión, el antioxidante está presente en cualquiera de los
tampones usados para purificar y/o concentrar y/o filtrar la rhFSH.
El antioxidante previene la oxidación de la FSH durante el
procesamiento. Un antioxidante preferido es la
L-metionina. Preferiblemente, la
L-metionina es usada a una concentración de o
aproximadamente de 10-100 mM. Otros ejemplos de
antioxidantes incluyen
t-butil-4-metoxi-fenol,
2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil-fenol;
bimeta-bisulfito de potasio o sodio, bisulfito de
sodio. Los ejemplos de aminoácidos libres y dipéptido con efecto
antioxidante y secuestrante son histidina, taurina, glicina,
alanina, carnosina, anserina, 1-metilhistidina o sus
combinaciones.
Típicamente el material de partida es
clarificado primero y después y opcionalmente es concentrado (por
ejemplo, usando la ultrafiltración) y/o el tampón es cambiado (por
ejemplo mediante una etapa de diafiltración) antes de ser capturado
en la primera etapa cromatográfica.
En las etapas de cromatografía, pueden ser
usadas resinas a base de polímero y a base de agarosa. Es también
posible usar cromatografía de membrana, en la cual la resina es
sustituida por una membrana funcionalizada.
Las 3 etapas de purificación de la presente
invención (es decir la cromatografía de afinidad a colorantes, la
cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de fase
inversa) se describen más detalladamente a continuación.
El método de la invención implica una etapa de
cromatografía de afinidad a colorantes (1). En una realización
preferida, la etapa de cromatografía de afinidad a colorantes es
llevada a cabo usando una resina que tiene como ligando
inmovilizado un compuesto colorante que es conocido por los expertos
en la técnica, es decir Cibacron Blue F3G-A. El
término "inmovilizado" es conocido por cualquier experto en la
técnica y significa que el ligando está derivatizado en el sentido
de que está unido químicamente a la resina. Una resina
particularmente preferida es la Blue Sepharose FF (comercializado
en Amersham Biosciences Inc.). Las características técnicas de Blue
Sepharose FF son las siguientes:
Se entiende que el método puede ser realizado
con resinas alternativas, que tengan características similares. Los
ejemplos de resinas alternativas incluyen: Toyopearl
AF-blue-HC-650M
(Tosoh Bioscience), Toyopearl SuperButyl 550, Toyopearl Phenyl 650,
Blue Cellthru BigBead (Sterogene), SwellGel Blue (Pierce),
Cibachrome Blue 3GA-agarosa 100 (Sigma),
Affi-Gel Blue (BioRad), cartuchos de
Econo-Pac Blue (Bio-Rad), Blue
sepharose HP (Amersham), Cibacron Blue 3GA (Sigma).
La elución en la etapa de cromatografía de
afinidad a colorantes inmovilizados preferiblemente debe ser llevada
a cabo usando un tampón de fosfato, particularmente y
preferiblemente fosfato de sodio. El pH del eluente preferiblemente
debe ser de o aproximadamente de 6,0 o aproximadamente 11,5, más
preferiblemente debe ser de o aproximadamente de 6,5 a o
aproximadamente 8, particularmente preferiblemente o aproximadamente
7,0. Tampones alternativos apropiados para mantener un pH de 7,0
incluyen lo siguiente: MES, bis-Tris, ADA, PIPES,
ACES, BES, MOPS, TES, HEPES. El tampón de elución para la etapa de
cromatografía de afinidad a colorantes preferiblemente debe
contener una sal que aumente la conductividad, preferiblemente
NaCl.
En una realización particularmente preferida,
los tampones que se ponen en contacto con el producto para la etapa
de cromatografía de afinidad a colorantes (equilibrado, lavado y
elución) contiene un antioxidante, tal como
L-metionina. Otros ejemplos de un antioxidante
incluyen
t-butil-4-metoxifenol,
2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil-fenol;
bimetabisulfito de potasio o sodio, bisulfito de sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
El método también implica una etapa de
cromatografía de interacción hidrófoba (2). En una realización
preferida, la cromatografía de interacción hidrófoba es llevada a
cabo con una resina tal como Toyopearl Butyl 650M (comercializada
por Tosoh Biosep Inc.).
Se sobrentiende que la etapa (2) puede ser
realizada usando resinas alternas, que tengan características
similares. Las resinas alternativas que pueden ser usadas son las
siguientes: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (bajo sub); Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow (alto sub); Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl
Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose de alta resolución; SOURCE
15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE 15PHE todas de Amersham Biosciences
(800) 526-3593; (véase
www.amershambiosciences.com). Otras resinas más son: Hydrocell C3 o
C4; Hydrocell Phenyl de BioChrom Labs Inc. (812)
234-2558; (véase www.biochrom.com)
La unión de la resina HIC es lograda en un
tampón con una alta conductividad, obtenido por la adición de sal
(por ejemplo NaCl, (NH_{4})_{2}SO_{4} o
Na_{2}SO_{4}). La elución en la etapa de cromatografía de
interacción hidrófoba preferiblemente es llevada a cabo reduciendo
la conductividad de la fase móvil (reduciendo la concentración de
sal), usando un tampón que tiene un pH de o aproximadamente de 6 a o
aproximadamente a 8, más preferiblemente de o aproximadamente de
6,5 a o aproximadamente a 7,5, más preferiblemente a o
aproximadamente a 7). Un sistema particularmente preferido contiene
fosfato de sodio para tamponar preferiblemente a un pH de o
aproximadamente de 7 y sulfato de amonio. Tampones alternativos son
mencionados anteriormente.
En una realización particularmente preferida,
los tampones que se ponen en contacto con el producto para la etapa
(2) de HIC (equilibrado, lavado, elución) contienen un antioxidante,
tal como la L-metionina. Antioxidantes alternativos
son mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de la invención también comprende una
etapa de cromatografía de fase inversa (RPC) (3). La RPC
preferiblemente es llevada a cabo usando una resina tal como SOURCE
30 RPC (comercializada por Amersham Biosciences). Se sobrentiende
que la etapa (3) puede ser realizada usando resinas alternativas que
son conocidas para cualquier experto en la técnica y que tienen
características similares.
La cromatografía preferiblemente es llevada a
cabo usando una fase móvil que tampone a un pH suavemente alcalino,
por ejemplo a o aproximadamente a pH 7-8,5, más
preferiblemente a o aproximadamente a 7,5 ó 7,6. En una realización
preferida, la especie tamponante es el acetato de amonio. Tampones
alternativos adecuados para un pH a o aproximadamente a 7,6
incluyen: BES, MOPS, Fosfato, TES, HEPES. Las soluciones tamponantes
usadas para esta etapa también pueden contener un modificante
orgánico, cuya concentración es modulada para las diferentes fases
de la etapa de cromatografía (carga, lavado, elución y
regeneración). En una realización preferida, el modificante orgánico
es un disolvente orgánico miscible en agua, preferiblemente un
alcohol (tal como metanol, etanol, etc.), más preferiblemente
2-propanol(isopropanol).
En una realización particularmente preferida,
los tampones que se ponen en contacto con el producto para la etapa
de RPC (equilibrado, lavado, elución) contiene un antioxidante, tal
como L-metionina. Antioxidantes alternativos son
mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de las 3 etapas de purificación
principales -descritas anteriormente- la presente invención puede
incluir etapas de purificación adicionales.
En una realización, el método de purificación de
la invención implica una etapa preliminar de cromatografía de
intercambio iónico (0) llevada a cabo, preferiblemente con una
resina de intercambio aniónico fuerte, particularmente
preferiblemente una resina de amonio cuaternario, tal como la Q
Sepharose FF (comercializada por Amersham Biosciences), teniendo las
características siguientes:
- Tipo de intercambiador iónico:
- Anión fuerte
- Capacidad total (mmol/ml):
- 0,18-0,25
- Límite de exclusión (proteínas globulares):
- 4 x 10^{6}
- Forma de perlas:
- Esféricas, diámetro 45-165 \mum
- Estructura de las perlas:
- Agarosa reticulada, 6%
- Estabilidad del pH operacional:
- 2-12
- Estabilidad del pH de limpieza:
- 1-14
- Caudal lineal a 25ºC, 1 bar, lecho de 15 cm
- 400-700 cm/h
altura, columna XK 50/30:
De forma alternativa, la etapa de cromatografía
de intercambio iónico (0) puede ser llevada a cabo usando una resina
tal como Fractogel EMD TMAE HICAP (comercializada por Merck KGaA,
Darmstadt, Alemania), o una resina que tenga características
similares, véase más abajo:
La etapa de cromatografía de intercambio iónico
preferiblemente es llevada a cabo usando un tampón que tiene un pH
suavemente alcalino (por ejemplo de o aproximadamente de 7,2, a o
aproximadamente a 9,0, o de o aproximadamente de 8,0, a o
aproximadamente a 9,0, más preferiblemente a o aproximadamente a
8,5). Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, tampón borato,
trietanolamina/ácido Tris iminodiacético, acetato de amonio,
tricina, bicina, TES, HEPES, TAPS. El tampón más preferido es el
borato, a un pH de o aproximadamente de 8,5. La elución desde la
resina de intercambio iónico es lograda aumentando la conductividad
de la fase móvil por la adición de la sal, preferiblemente NaCl. En
una realización particularmente preferida, los tampones que se ponen
en contacto con el producto para la cromatografía de intercambio
iónico (equilibrado, lavado, elución) contienen un antioxidante,
preferiblemente L-metionina. Antioxidantes
alternativos son mencionados anteriormente.
Así en una realización preferida, el método de
la invención comprende las etapas siguientes:
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico, preferiblemente en una resina de intercambio aniónico fuerte, [preferiblemente una resina de amonio cuaternario, tal como la Q Sepharose FF o Fractogel EMD TMAE];
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes [preferiblemente en Blue Sepharose FF];
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba [preferiblemente en Toyopearl Butyl 650M];
- (3)
- cromatografía de fase inversa [preferiblemente en SOURCE 30 RPC].
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la etapa de cromatografía de
intercambio iónico (0), puede ser deseable llevar a cabo una etapa
de ultrafiltración, para concentrar la FSH cruda. La
ultrafiltración (o diafiltración) preferiblemente es llevada a cabo
usando una membrana que tiene un tamaño de poro de o aproximadamente
de 3-10 kD, más preferiblemente de o aproximadamente
de 8 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, el método de
la invención también comprende una segunda etapa de cromatografía
de intercambio aniónico (4). Una resina preferida es Fractogel EMD
TMAE HICAP (comercializada por Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), o
una resina que tenga características similares, tales como las
mencionadas anteriormente. De forma alternativa, la segunda etapa
de cromatografía de intercambio aniónico puede ser llevada a cabo en
Q Sepharose FF, u otra resina que tenga características similares,
como las mencionadas anteriormente.
Las etapas de cromatografía de intercambio
aniónico, cromatografía de afinidad a colorantes, cromatografía de
interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de fase inversa y la
segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico pueden ser
llevadas a cabo en cualquier orden, aunque sea preferido llevar a
cabo la etapa de cromatografía de intercambio aniónico primero. Las
etapas restantes de cromatografía de afinidad a colorantes,
cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), RPC y la segunda
cromatografía de intercambio aniónico opcional pueden ser llevadas
a cabo en cualquier orden, aunque sea preferido seguir el orden
mostrado más abajo:
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico,
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes,
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba (HIC),
- (3)
- cromatografía de fase inversa RPC; y
- (4)
- segunda cromatografía de intercambio aniónico.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, después de
cualquiera de las etapas de cromatografía (particularmente después
de una etapa de cromatografía de fase inversa), la muestra de FSH es
sometida a una etapa de concentración. Preferiblemente la etapa es
realizada usando la ultrafiltración combinada por diafiltración para
obtener una solución que tiene la composición deseada. La
ultrafiltración (o diafiltración) preferiblemente es llevada a cabo
usando una membrana que tiene un tamaño de poro de o aproximadamente
de 3-10 kD, más preferiblemente de o aproximadamente
de 5 kD.
En una realización particularmente preferida,
las etapas siguientes son llevadas a cabo en el orden mostrado más
abajo:
- (-1)
- Ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un tamaño de poro de o de aproximadamente 8 kD),
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico (preferiblemente usando una columna de Q Sepharose FF);
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes (preferiblemente usando una columna de Blue Sepharose FF);
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) (preferiblemente utilizando una columna Butyl 650M);
- (3)
- cromatografía de fase inversa (RPC) (preferiblemente utilizando una columna SOURCE 30 RPC);
- (4)
- cromatografía de intercambio aniónico en una resina de intercambio aniónico fuertemente básica (preferiblemente usando una resina TMAE hicap); y
- (5)
- ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un tamaño de poro de 5 kD).
\vskip1.000000\baselineskip
Puede ser deseable someter a la muestra de FSH a
una etapa de nanofiltración, en particular, como una etapa de
aclaramiento del virus; es decir para reducir el riesgo de la
contaminación de la preparación de FSH de virus o partículas del
tipo virus que provengan del cultivo celular. La nanofiltración
puede ser hecha en cualquier etapa del procedimiento de
purificación, sin embargo, es particularmente preferido llevar a
cabo la nanofiltración después de la 2^{a} etapa de cromatografía
de intercambio iónico, o después de la cromatografía de fase
inversa o después de la cromatografía de interacción hidrófoba. La
nanofiltración puede ser realizada más de una vez, por ejemplo,
puede ser realizada dos veces.
En una realización particularmente preferida, el
método de la invención comprende las etapas siguientes:
- (-1)
- Ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un tamaño de poro de o de aproximadamente 8 kD),
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico (preferiblemente con Q Sepharose FF),
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes (preferiblemente con Blue Sepharose FF),
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) (preferiblemente con Butyl 650M),
- (3)
- cromatografía de fase inversa (RPC) (preferiblemente con SOURCE 30 RPC),
- (4)
- cromatografía de intercambio aniónico en una resina de intercambio aniónico fuertemente básica (preferiblemente la resina TMAE hicap);
- (4')
- nanofiltración,
- (5)
- ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un tamaño de poro de 5 kD).
\vskip1.000000\baselineskip
La ventaja de la presente invención consiste en
que el método de purificación está desprovisto de una etapa de
cromatografía de inmuno-afinidad de alto coste y que
proporciona de todos modos un alto grado de pureza de FSH y una
bioactividad específica. También, la FSH purificada de la presente
invención no contiene las impurezas indeseadas añadidas por la
cromatografía de inmuno-afinidad (por ejemplo, las
inmunoglobulinas lixiviadas de la resina).
\vskip1.000000\baselineskip
La composición líquida que es el resultado del
procedimiento de purificación como se describe anteriormente y que
contiene la FSH purificada puede ser congelada para el almacenaje
como tal, o después de que la purificación, el eluato puede ser
sometido a liofilización para eliminar el disolvente. El producto
resultante líquido o liofilizado se llama "solución de
FSH".
\vskip1.000000\baselineskip
La FSH o una variante de FSH de la invención o
purificada de acuerdo con el método de la invención puede ser
formulada para la inyección, intramuscular o subcutánea,
preferiblemente subcutánea. La formulación de FSH puede ser
liofilizada, en el caso de que sea disuelta en agua para la
inyección justo antes de la inyección. La formulación de FSH
también puede ser una formulación líquida, en el caso de que puede
ser inyectada directamente, sin la disolución anterior. La
formulación de FSH puede ser una dosis simple o múltiples dosis. Si
es dosis múltiple, preferiblemente debería contener a un agente
bacteriostático, tal como, por ejemplo, alcohol bencílico,
meta-cresol, tilmol o fenol, preferiblemente alcohol
bencílico o meta-cresol. Las formulaciones de dosis
simples también pueden comprender a un agente bacteriostático.
La FSH de la invención puede ser formulado con
excipientes conocidos y estabilizadores, por ejemplo, sacarosa y
manitol. También puede comprender un antioxidante, tal como la
metionina. Además puede comprender un tensioactivo, tal como TWEEN
(preferiblemente TWEEN 20), o Pluronic (preferiblemente Pluronic
F68).
En una formulación de multidosis particularmente
preferida, la FSH producida por el método de la invención es
formulada disolviéndola en agua para inyección con sacarosa, tampón
fosfato (pH 7), Pluronic F68, metionina y
meta-cresol o alcohol bencílico.
Una formulación multidosis líquida
particularmente preferida de FSH recombinante para la inyección
subcutánea o intramuscular es la siguiente:
La FSH de la invención es adecuada para uso en
todos los tratamientos en los que la FSH es indicada.
Particularmente es adecuada para la administración subcutánea en la
inducción de la ovulación, la hiperestimulación ovárica controlada
para técnicas de reproducción asistida, y en el tratamiento de la
oligoespermia. Puede ser usada junto con otras gonadotropinas,
tales como LH y hCG. También puede ser usada con otros compuestos
que aumentan la respuesta frente a FSH, tales como citrato de
clomifeno, inhibidores de aromatasa, tales como Anastrozol,
Letrozol, Fadrozol e YM-511.
SEQ ID NO. 1: subunidad \alpha de
glicoproteína humana;
SEQ ID NO. 2: subunidad \beta de hFSH
SEQ ID NO. 3: variante 1 de la subunidad \beta
de hFSH
SEQ ID NO. 4: variante 2 de la subunidad \beta
de hFSH
SEQ ID NO. 5: variante 3 de la subunidad \beta
de hFSH
La hormona estimuladora del folículo, o FSH,
según se usa en este documento se refiere a la FSH humana (hFSH)
producida como una proteína madura entera. La FSH es un dímero
compuesto de la subunidad alfa de glicoproteína humana y la
subunidad beta de FSH humana. La secuencia de la proteína de la
subunidad alfa de glicoproteína humana es proporcionada en la SEQ
ID NO. 1, y se muestra la secuencia de la proteína de la subunidad
beta de FSH humana en SEQ ID NO. 2. El uso del término
"recombinante" se refiere a preparaciones de FSH que son
producidas mediante el uso de la tecnología del ADN recombinante
(véase por ejemplo el documento WO 85/01958). Un ejemplo de un
método para expresar FSH utilizando la tecnología recombinante es
por transfección de células eucariotas con secuencias de ADN que
codifican una subunidad alfa y beta de FSH, si se proporciona sobre
un vector o sobre dos vectores teniendo cada subunidad un promotor
separado, como se describe en las patentes europeas N^{os}. EP 0
211894 y EP 0 487512. El ADN que codifica FSH puede ser un cDNA o
puede contener intrones. Otro ejemplo del uso de la tecnología
recombinante para producir FSH es por el uso de recombinación
homóloga para insertar un segmento regulador heterólogo en conexión
funcional con secuencias endógenas que codifican una o ambas de las
subunidades de FSH, como se describe en la patente europea Nº. EP 0
505500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). También se
contemplan métodos como los descritos en el documento WO 99/57263
(Transkaryotic Therapies), en el que una de las subunidades es
insertada heterólogamente en una célula, y la otra subunidad es
expresada por la activación de secuencias genómicas mediante la
inserción de un heterólogo segmento regulador por recombinación
homóloga. El método de la invención puede ser usado para purificar
la FSH expresada usando cualquiera de estos métodos y otros
métodos.
La expresión "célula recombinante" se
refiere a una célula producida al insertar ADN heterólogo,
incluyendo cualquiera de los métodos anteriormente mencionados de
manipulación genética.
Preferiblemente la FSH es producida
recombinantemente en el ovario de células transfectadas de hámster
chino (CHO) con un vector o vectores que comprenden el ADN que
codifica la subunidad alfa de glicoproteína humana y la subunidad
beta de FSH. El ADN que codifica las subunidades alfa y beta puede
estar presente en los mismos vectores o diferentes.
La expresión "variante de FSH" se entiende
que abarca aquellas moléculas que se diferencian en la secuencia de
aminoácidos, modelo de glicosilación o en el enlace de la
intersubunidad de FSH humana, pero que exhibe actividad con FSH.
Los ejemplos incluyen CTP-FSH, una FSH recombinante
modificada de acción larga, consistiendo la subunidad \alpha tipo
silvestre y una subunidad \beta en el cual el péptido carboxi
terminal de hCG ha sido fusionado al extremo
C-terminal de la subunidad \beta de FSH, como se
describe en LaPoIt et al., Endocrinology; 1992, 131,
2514-2520; o Klein et al.; "Development and
characterization of a long-acting recombinant hFSH
agonist"; Human Reprod. 2003, 18,
50-56]. También se incluye la cadena simple de
CTP-FSH, una molécula de cadena simple, que consiste
en las secuencias siguientes (desde el extremo
N-terminal al extremo
C-terminal):
en la que \betaFSH significa la
subunidad \beta de FSH, \betahCG CTP (113-145)
significa el péptido carboxi-terminal de hCG y
\alphaFSH significa la subunidad \alpha de FSH, como se describe
en Klein et al. [Pharmacokinetics and pharmacodynamics of
single-chain recombinant human
follicle-stimulating hormone containing the human
chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus
monkey, Fertility & Sterility; 2002, 77,
1248-1255]. Otros ejemplos de variantes de FSH
incluyen moléculas de FSH que tienen sitios de glicosilación
adicionales incorporados en la subunidad \alpha y/o la subunidad
\beta, como se describe en el documento WO 01/58493 (Maxygen), y
moléculas FSH con enlaces S-S intersubunidad, como
se describe en el documento WO 98/58957. Otros ejemplos de
variantes de FSH incluyen moléculas quiméricas que comprenden
secuencias de FSH y secuencias de hCG o LH, como las descritas en
los documentos WO 91/16922 y WO
92/22568.
Las variantes de FSH referidas en este documento
también incluyen las deleciones del extremo
carboxi-terminal de la subunidad \beta que son
más cortas que la longitud entera de la proteína madura de SEQ ID
NO:2. Las deleciones del extremo carboxi-terminal
de la subunidad \beta humana son proporcionadas en SEQ ID NOS: 3,
4, y 5. Se sobrentiende que las variantes del extremo
carboxi-terminal de la cadena \beta forman el
complejo con una subunidad \alpha conocida para formar un
heterodímero de la variante de FSH.
En una realización preferida, la FSH es
producida recombinantemente en células CHO, en un medio con suero o
sin suero.
En una realización preferida, la FSH purificada
producida de acuerdo con el método de la invención es adecuada para
la administración subcutánea, permitiendo la autoadministración por
el paciente.
La expresión "FSH recombinante cruda" se
refiere al sobrenadante del cultivo celular de células recombinantes
que expresan FSH, antes de que haya sufrido cualquier etapa
cromatográfica. La expresión abarca la forma a granel del
sobrenadante (según se aísla de las células) así como el
sobrenadante concentrado y/o filtrado y/o ultrafiltrado.
La expresión "actividad biológica" en
relación con la actividad de FSH, se refiere a la capacidad de una
formulación de FSH para obtener respuestas biológicas asociadas con
FSH, tales como la ganancia de peso ovárico en el ensayo de
Steelman-Pohley [Assay of the follicle stimulating
hormone based on the augmentation with human chorionic
gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53,
604-616], o el crecimiento folicular en una
paciente. El crecimiento folicular en una paciente puede ser
evaluado por ultrasonido, por ejemplo, en términos del número de
folículos que tienen un diámetro medio de o aproximadamente de 16 mm
desde el día 8 del estímulo. La actividad biológica es evaluada en
relación a un estándar aceptado para FSH.
El contenido de LH en una preparación de FSH
puede ser medido, por ejemplo, usando un inmunoensayo específico de
LH, tal como el Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finlandia).
La expresión "actividad específica", en
referencia a FSH, significa la actividad biológica en UI de la
preparación en ensayo biológico aprobado para FSH, tal como el
bioensayo de Steelman Pohley [dividido por la cantidad de proteína,
como se determina por un ensayo para el contenido de proteína total,
tal como el ensayo de Lowry [O. H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L.
Farr y R.J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265;
Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R.
Dulley y P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64, 248], o
por absorbancia a 280 nm.
Preferiblemente, la FSH obtenida según la
invención tiene una actividad específica mayor que o aproximadamente
igual a 8000 UI/mg, más preferiblemente mayor o aproximadamente
igual a 9000 UI/mg, aún más preferiblemente mayor que o
aproximadamente igual a 10000 UI/mg, aún más preferiblemente o
aproximadamente 14000 UI/mg en la que la actividad biológica es
medida por el bioensayo de Steelman-Pohley y el
contenido de proteína es medido por SE-HPLC.
Las muestras de FSH pueden ser analizadas
respecto a su pureza en varias etapas del procedimiento utilizando,
por ejemplo, técnicas tales como las enumeradas más abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
Como se menciona anteriormente, la FSH es una
glicoproteína heterodimérica, compuesta de una subunidad \alpha y
\beta. Puede ocurrir alguna disociación de las subunidades, y esto
puede ser controlado observando la cantidad de la subunidad
\alpha libre presente en una muestra. Además, las subunidades de
FSH pueden oxidarse. Los contaminantes oxidados pueden ser
cuantificados usando RP-HPLC, mientras que las
subunidades libres pueden ser evaluadas usando
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido de FSH en una muestra puede ser
determinado usando un inmunoensayo específico para FSH, tal como el
inmunoensayo DELFIA FSH.
\vskip1.000000\baselineskip
Como con cualquier preparación de proteínas, el
contenido de proteína total puede ser determinado usando técnicas
tales como el ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry o por
absorbancia a 280 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se menciona anteriormente, la FSH es una
glicoproteína, que tiene múltiples restos de oligosacáridos unidos
en varios sitios en ambas subunidades. Los restos de oligosacáridos
pueden tener diferentes grados de ramificación y pueden ser
terminados con restos de ácido siálico. Los restos de ácido siálico
están negativamente cargados (a pH neutro). Las diferencias de
terminaciones conducen a la heterogeneidad, teniendo una mezcla de
especie diferentes puntos isoeléctricos (pI). Esto puede ser
evaluado usando una técnica de separación basada en la carga, tal
como el enfoque isoeléctrico (IEF).
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de la célula huésped pueden ser
analizadas usando un ensayo ELISA. Por ejemplo, los anticuerpos
pueden ser generados frente a un "cultivo simulado", que es un
cultivo de células huésped sin el gen de FSH.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención será ilustrada a
continuación mediante 2 ejemplos.
Los organigramas correspondientes que ilustran
dichos 2 ejemplos son presentados en la Figura 1 y 2. La
r-hFSH purificada resultante se llama "solución de
r-hFSH".
\vskip1.000000\baselineskip
(cfr. la Figura
1)
Etapa
(1)
El material de partida de FSH para la
purificación se prepara a partir de recolecciones del cultivo
celular que contienen FSH recombinante, es decir, FSH que fue
producido recombinantemente en células CHO, en un medio con suero o
sin suero. La columna de cromatografía de afinidad a colorantes
(resina Blue Sepharose FF) primero es equilibrada con un tampón de
baja conductividad a un pH de 8,5 que contiene
L-metioniona. El líquido que contiene la FSH
entonces se aplica directamente a la resina. Después de la carga, el
material desunido se lava utilizando un tampón de equilibrado. La
FSH finalmente se eluye lavando la columna con tampón fosfato de
sodio a pH 7,0, que contiene NaCl y L-metionina. La
combinación de la elución se trata directamente en la siguiente
etapa. La etapa se realiza a 2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Etapa
(2)
El eluato de FF Blue sepharose de la etapa (1)
es cargado en una columna Toyopearl Butyl 650M equilibrada contra
un tampón de fosfato de sodio, pH 7,0, que contiene sulfato de
amonio y L-metionina. El material desunido es
lavado con tampón de equilibrado. La FSH es eluída con el mismo
tampón, pero con una concentración reducida de sulfato de amonio.
El eluato es tratado en la siguiente etapa. La etapa es realizada a
TA.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(3)
El eluato HIC (de la etapa (2)) primero es
acondicionado por la adición de IPA (isopropanol). Una columna
Source 30RPC es equilibrada contra tampón de acetato de amonio, pH
7,6, conteniendo L-metionina, y
2-propanol a una concentración equivalente a la del
material de carga acondicionado. Después de lavar el material
desunido con tampón de equilibrado, la resina es lavada con tampón
acetato de amonio, pH 7,6, conteniendo L-metionina,
y una mayor concentración de 2-propanol. La FSH
finalmente es eluída aumentando además la concentración de
2-propanol. La combinación de elución finalmente es
diluída en agitación, con agua que contiene
L-metionina. La combinación diluída es tratada en la
siguiente etapa. La etapa es realizada a TA.
Después del procedimiento anterior el factor de
purificación - es decir la relación de pureza de FSH en la muestra
purificada frente a la pureza de FSH en el material de partida (FSH
cruda) - es aproximadamente 40.000.
\vskip1.000000\baselineskip
(cfr. la Figura
2)
Etapa
(-1)
Todas las operaciones fueron realizadas en
condiciones refrigeradas (2-8ºC). La FSH cruda que
forma el material de partida para la purificación es derivada a
partir de las recolecciones del cultivo celular que contiene la FSH
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
La r-hFSH cruda fue filtrada a
través de un filtro de tamaño de poro 0,5 \mum (tal como los
filtros de Pall Profile II o equivalentes).
\vskip1.000000\baselineskip
El material crudo clarificado primero fue
concentrado por ultrafiltración usando una membrana de poliéter
sulfona de 10KD. El concentrado fue entonces diafiltrado frente al
menos 5 diavolumes de tampón borato, pH 8,5 que contenía
L-metionina como antioxidante. La conductividad y el
pH del concentrado fueron medidos para controlar el progreso de
diafiltración. El concentrado entonces fue concentrado más antes del
drenaje del sistema. Finalmente se limpió la unidad de
ultrafiltración con tampón de diafiltración y la solución de
enjuegue fue mezclada con el concentrado recuperado. La combinación
fue llevada a la siguiente etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto concentrado fue filtrado a través de
un filtro de poliéter sulfona de 0,2 \mum (o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(0)
El material filtrado entonces fue aplicado a una
resina de intercambio aniónico fuerte (Q-sepharose
FF) equilibrada contra tampón borato de sodio, pH 8,5, que contenía
L-metionina. Después de la carga, la columna fue
aclarada con tampón de equilibrado para limpiar todo el material
desunido. La columna entonces fue eluída con tampón borato de sodio
pH 8,5, conteniendo NaCl (para aumentar la conductividad) y
L-metionina (como antioxidante). La combinación de
elución recogida fue tratada frente a la cromatografía de afinidad a
colorantes.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(1)
La columna de cromatografía de afinidad a
colorantes (resina Blue Sepharose FF) primero fue equilibrada con
el tampón de elución de la etapa de Q-Sepharose FF.
El eluato de captura entonces fue aplicado directamente a la
resina. Después de la carga, el material desunido fue lavado
utilizando tampón de equilibrado. El FSH finalmente fue eluído
limpiando la columna con tampón fosfato de sodio a pH 7,0,
conteniendo NaCl y L-metionina. La combinación de
elución fue tratada directamente en la siguiente etapa. La etapa fue
realizada a 2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(2)
El eluato de Blue Sepharose FF fue cargado en
una columna Toyopearl Butyl 650M equilibrada contra un tampón
fosfato de sodio, pH 7,0, conteniendo sulfato de amonio y
L-metionina. El material desunido fue lavado con
tampón de equilibrado. La FSH fue eluído con el mismo tampón, pero
con una concentración reducida de sulfato de amonio. El eluato fue
tratado en la siguiente etapa. La etapa fue realizada a TA.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(3)
El eluato de HIC (de la etapa (2)) primero fue
acondicionado por la adición de IPA (isopropanol). La columna
SOURCE 30RPC fue equilibrada contra un tampón de acetato de amonio,
pH 7,6, conteniendo L-metionina, y
2-propanol a una concentración equivalente con la
del material de carga acondicionado. Después de lavar el material
desunido con tampón de equilibrado, la resina se lava con tampón
acetato de amonio, pH 7,6, conteniendo L-metionina,
y una mayor concentración de 2-propanol. La FSH
finalmente es eluída aumentando más la concentración de
2-propanol. La combinación de elución finalmente es
diluída con agitación, con agua que contiene
L-metionina. La combinación diluída es tratada en la
siguiente etapa. La etapa fue realizada a TA.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(4)
Una columna Fractogel EMD TMAE hicap fue
equilibrada primero con tampón borato de sodio, pH 8,5, conteniendo
L-metionina. El material diluido
post-RPC (de la etapa (3) fue cargado en la columna.
El material desunido fue lavado usando tampón de equilibrado. La FSH
es eluída de la columna aumentando la concentración de sal en una
manera lineal. La etapa fue realizada a 2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(4')
El eluato de la etapa (4) Fractogel
EMD-TMAE fue aplicado directamente a un dispositivo
de nanofiltración de 20 nm a una presión de 3 bares bajo nitrógeno.
El filtrado es tratado en la siguiente etapa. La operación fue
realizada a 2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
(5)
El material de FSH nanofiltrado fue concentrado
mediante filtración con flujo tangencial en una membrana de poliéter
sulfona de 5KD. Cuando el concentrado alcanzó aproximadamente la
mitad del volumen inicial, al material le fue cambiado el tampón por
diafiltración frente a WFI.
\newpage
La pureza de las muestras de FSH después de las
etapas de purificación fue determinada:
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad biológica de la
r-hFSH purificada fue medida usando el método de
Steelman-Pohley de ganancia de peso ovárico. La
actividad específica fue calculada usando la actividad biológica
dividida por el contenido de FSH como se determina por un método de
SE-HPLC, como se describe más abajo. La actividad
específica de la solución final obtenida está típicamente entre
10.000 y 17.000 UI/mg. Se muestran los valores ejemplares para 2
muestras de una solución final de FSH obtenida después del método
del Ejemplo 2 en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Un método para purificar FSH recombinante o
una variante de FSH que comprende someter a un líquido que contiene
FSH a:
- (1)
- una cromatografía de afinidad a colorantes;
- (2)
- una cromatografía de interacción hidrófoba; y
- (3)
- una cromatografía de fase inversa;
que puede ser llevado a cabo en cualquier
orden.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la cromatografía de afinidad a colorantes de la etapa (1) es llevada
a cabo con una resina que tiene inmovilizado Cibacron Blue
F3G-A.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que la resina usada para la cromatografía de afinidad a colorantes
de la etapa (1) es Blue Sepharose FF.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la cromatografía de afinidad a
colorantes de la etapa (1) es llevada a cabo usando tampón fosfato
de sodio a un pH de o aproximadamente de 6,5 a 11,5 como
eluente.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la cromatografía de interacción
hidrófoba (HIC) de la etapa (2) es llevada a cabo usando Toyapearl
Butyl 650M, o una resina que tiene características similares.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la cromatografía de interacción
hidrófoba de la etapa (2) es llevada a cabo usando fosfato de
sodio/sulfato de amonio como eluente.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa de cromatografía de fase
inversa de la etapa (3) es llevada a cabo usando SOURCE 30 RPC como
resina.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la etapa de cromatografía de fase
inversa de la etapa (3) es llevada a cabo usando acetato de amonio
con 2-propanol como eluente.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que las etapas se llevan a cabo en el
orden siguiente:
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes;
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba; y luego
- (3)
- cromatografía de fase inversa.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende además una etapa de la etapa
de cromatografía intercambio aniónico (0).
11. El método de la reivindicación 10, en el que
la etapa de cromatografía de intercambio aniónico es llevada a cabo
antes de las etapas (1), (2) y (3).
12. El método de la reivindicación 11, en el que
las etapas se llevan a cabo en el orden:
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico;
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes;
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba; y
- (3)
- cromatografía de fase inversa.
13. El método de la reivindicación 10, 11 ó 12,
en el que la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (0)
es llevada a cabo con la resina Q Sepharose FF o resina Fractogel
EMD TMAE HiCap.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que la cromatografía de intercambio
iónico de la etapa (0) es llevada a cabo usando tampón borato como
eluente.
15. El método de la reivindicación 14, en el que
el tampón borato está a un pH de o aproximadamente de 8,5.
\newpage
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15, que comprende además una segunda etapa de
la etapa de cromatografía de intercambio aniónico (4).
17. El método de la reivindicación 16, en el que
la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la
etapa (4) es llevada a cabo después de las etapas (1), (2) y
(3).
18. El método de la reivindicación 17, en el que
las etapas se llevan a cabo en el orden:
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico;
- (1)
- cromatografía de afinidad a colorantes;
- (2)
- cromatografía de interacción hidrófoba;
- (3)
- cromatografía de fase inversa; y
- (4)
- cromatografía de intercambio aniónico.
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que la segunda etapa de
cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (4) es llevada a
cabo usando la resina Fractogel EMD TMAE HiCap o la resina Q
Sepharose FF.
20. El método de la reivindicación 16 a 19, en
el que la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de
la etapa (4) es llevada a cabo usando tampón de borato y un
gradiente para aumentar la concentración de NaCl.
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, que comprende una etapa de la etapa de
nanofiltración (4'), llevada a cabo la segunda etapa de la etapa de
cromatografía de intercambio aniónico (4).
22. El método de la reivindicación 21, que
comprende una etapa de ultrafiltración (5), después de la etapa de
nanofiltración (4').
23. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que cualquiera de los eluentes y/o
tampones puede contener un antioxidante, en particular
L-metionina.
24. Un método para purificar FSH recombinante
humana que comprende las etapas de someter FSH a:
- (-1)
- ultrafiltración;
- (0)
- cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose FF con borato/NaCl, L-metionina, a un pH a aproximadamente 8,5 como eluente;
- (1)
- someter el eluato de la etapa (0) a una etapa de cromatografía de afinidad a colorantes en Blue Sepharose FF, y fosfato, NaCl, L-metionina, a un pH de o aproximadamente 7 como eluente;
- (2)
- someter el eluato de la etapa (1) a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba en Toyopearl Butyl 650M, con fosfato, sulfato de amonio, L-metionina, a un pH de o aproximadamente de 7 como eluente;
- (3)
- someter el eluato de la etapa (2) a una etapa de cromatografía de fase inversa en Source 30 RPC con acetato de amonio, L-metionina, con 2-propanol a un pH de o aproximadamente de 7,6 como eluente;
- (4)
- someter el eluato de la etapa (3) a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico en resina Fractogel EMD TMAE hicap, con borato, L-metionina, a un pH de o aproximadamente de 8,5, y NaCl;
- (4')
- someter el eluato de la etapa (4) a una etapa de nanofiltración; y
- (5)
- someter el permeado de la etapa (4') a una etapa de ultrafiltración.
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US6414123B1 (en) | 1997-10-21 | 2002-07-02 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
US5990288A (en) | 1997-10-21 | 1999-11-23 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
DE60034117T2 (de) * | 1999-04-16 | 2007-12-13 | Instituto Massone S.A. | Verfahren zur herstelllung von gonadotropin-zusammensetzungen |
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