NO340811B1 - Fremgangsmåte til å rense FSH - Google Patents
Fremgangsmåte til å rense FSH Download PDFInfo
- Publication number
- NO340811B1 NO340811B1 NO20072863A NO20072863A NO340811B1 NO 340811 B1 NO340811 B1 NO 340811B1 NO 20072863 A NO20072863 A NO 20072863A NO 20072863 A NO20072863 A NO 20072863A NO 340811 B1 NO340811 B1 NO 340811B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- chromatography
- fsh
- anion exchange
- carried out
- stated
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 41
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 45
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 45
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 33
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 31
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 28
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 27
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 26
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 19
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 18
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 claims description 11
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 8
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 abstract description 16
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 141
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 141
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 141
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 10
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 5
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 238000003231 Lowry assay Methods 0.000 description 3
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 2
- FAVZTHXOOBZCOB-UHFFFAOYSA-N 2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl phenol Natural products CC(C)CC1=CC(C)=CC(CC(C)C)=C1O FAVZTHXOOBZCOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007992 BES buffer Substances 0.000 description 2
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000893054 Homo sapiens Follitropin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 238000012369 In process control Methods 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059594 Secondary hypogonadism Diseases 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 2
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 2
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 2
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000004289 sodium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUTLAXLNPLZCOF-UHFFFAOYSA-N 1-Methylhistidine Natural products OC(=O)C(N)(C)CC1=NC=CN1 LUTLAXLNPLZCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 2-[4-[(z)-2-chloro-1,2-diphenylethenyl]phenoxy]-n,n-diethylethanamine;hydron;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C1=CC(OCCN(CC)CC)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(/Cl)C1=CC=CC=C1 PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 1
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLPFFLWZZBQMAO-UHFFFAOYSA-N 4-(5,6,7,8-tetrahydroimidazo[1,5-a]pyridin-5-yl)benzonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C1N2C=NC=C2CCC1 CLPFFLWZZBQMAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGPPBTSXFROGAE-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-bromophenyl)methyl-(1,2,4-triazol-4-yl)amino]benzonitrile Chemical compound C1=CC(Br)=CC=C1CN(N1C=NN=C1)C1=CC=C(C#N)C=C1 GGPPBTSXFROGAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVHIXYEVGDQDX-UHFFFAOYSA-N 9,10-anthraquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 RZVHIXYEVGDQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007988 ADA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010085443 Anserine Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000012617 Butyl Sepharose™ 4 Fast Flow Substances 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N Carnosic acid Natural products CC([C@@H]1CC2)(C)CCC[C@]1(C(O)=O)C1=C2C=C(C(C)C)C(O)=C1O QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N 0.000 description 1
- 108010087806 Carnosine Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SLRNWACWRVGMKD-UHFFFAOYSA-N L-anserine Natural products CN1C=NC(CC(NC(=O)CCN)C(O)=O)=C1 SLRNWACWRVGMKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-LURJTMIESA-N N(tele)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N N-beta-alanyl-L-histidine Natural products NCCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000210053 Potentilla elegans Species 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- MYYIAHXIVFADCU-QMMMGPOBSA-N anserine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](NC(=O)CC[NH3+])C([O-])=O MYYIAHXIVFADCU-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N carnosine Chemical compound [NH3+]CCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC=N1 CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 229940044199 carnosine Drugs 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046989 clomiphene citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229950011548 fadrozole Drugs 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 108010006578 follitropin alfa Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010965 in-process control Methods 0.000 description 1
- 238000011419 induction treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003881 letrozole Drugs 0.000 description 1
- HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N letrozole Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C(N1N=CN=C1)C1=CC=C(C#N)C=C1 HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fluid-Pressure Circuits (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Manufacturing Of Electric Cables (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår feltet rensing av follikkelstimulerende hormon (FSH).
Follikkelstimulerende hormon (FSH) er et injiserbart protein som tilhører klassen gonadotropiner. FSH blir brukt til behandling av infertilitet og reproduktive lidelser hos både kvinnelige og mannlige pasienter.
I naturen blir FSH produsert av hypofysen. For farmasøytisk anvendelse kan FSH produseres rekombinant (rFSH) eller den kan isoleres fra urinen til postmenopausale kvinner (uFSH).
FSH blir brukt hos kvinnelige pasienter til å indusere eggløsning (ovulation induction, OI) og i kontrollert ovariehyperstimulering (COH) for assisterte reproduktive teknologier (ART). I et typisk behandlingsregime for ovulasjonsinduksjon blir en pasient administrert daglige injeksjoner av FSH eller en variant (omtrent 75 til 300 IU FSH/dag) over en periode fra omtrent 6 til omtrent 12 dager. I et typisk behandlingsregime for kontrollert ovariehyperstimulering, blir en pasient administrert daglige injeksjoner av FSH eller en variant (omtrent 150-600 IU FSH/dag) over en periode på fra omtrent 6 til omtrent 12 dager.
FSH blir også brukt for å indusere spermatogenese hos menn som lider av oligospermi. Et regime som benytter 150 IU FSH 3 ganger i uken i kombinasjon med 2500 IU hCG to ganger i uken, er blitt vellykket til å oppnå forbedring i spermetall hos menn som lider av hypogonadotropisk hypogonadisme [Burgues et al.; Subcutaneous self- administration ofhighly purifiedfollicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod. ; 1997, 12, 980-6].
På grunn av viktigheten av FSH i behandling av fertilitetslidelser, er tilgang på FSH med høy renhet og meget spesifikk aktivitet ønskelig. FSH-behandling krever gjentatte injeksjoner. I stor grad rensede FSH-preparater kan administreres subkutant og tillate selvadministrering av pasienten for således å øke pasientbekvemmelighet og etterlevelse.
Lynch et al. [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] beskriver en fremgangsmåte for å rense humant hypofyse-FSH. Fremgangsmåten involverer anion- og kationutvekslingskromatografi, immunaffinitetsekstraksjon og størrelseseksklusjonskromatografi. Fremgangsmåten er sagt å resultere i hypofyse-FSH som har en spesifikk aktivitet på 4990 IU (immunoassay)/mg med 16 IU/mg LH. Proteininnholdet ble bestemt enten ved tørrvekt eller i oppløsning ved absorpsjon på 280 nm (under antagelse av at A<280>icm for 1 g/l er lik 1).
WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) beskriver en prosess for rensing av humant urin FSH som tar utgangspunkt i urinekstrakter kalt humane menopausale gonadotrofiner (hMG). Prosessen bruker ionebyttekromatografi på svakt basiske anioniske utbytteharpikser i DEAE-type etterfulgt av affinitetskromatografi på harpiks som har et antrakinonderivat som en ligand. Fremgangsmåten er sagt å gi urin FSH fri for LH og som har spesifikk aktivitet på 6870 IU (immunoassay)/mg. Proteininnholdet ble bestemt ved å anta at en vannløsning på 1 mg/ml av protein har en optisk tetthet på 0,62 ved 277 nm, i kvartskuvetter med en 1 cm lyslengde.
WO 00/63248 (Instituto Massone SA) beskriver en fremgangsmåte for rensing av gonadotrofiner, inkludert FSH, fra human urin. Prosessen involverer følgende trinn: Ionebyttekromatografi med en sterkt kationisk harpiks av typen sulfopropyl, ionebyttekromatografi med en sterkt anionisk harpiks og hydrofob interaksjonskromatografi (HIC). Et FSH-preparat som har en spesifikk aktivitet på 8400 IU/mg (Steelman-Pohley-metode: Assay of the foUicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) og mindre enn 1 IU LH (rotte seminal vesikkelvektøkningsmetode: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) biologisk aktivitet pr 75 IU FSH er rapportert oppnådd. Proteininnhold ble utført ved Lowry-metoden [O.H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265].
US 5,990,288 (Musick et al.) beskriver en fremgangsmåte til å rense FSH fra biologiske prøver så som humane hypofysekjertler eller human postmenopausal urin. Prosessen benytter kationutbyttekromatografi på Fractogel EMD SO3-650M etterfulgt av fargestoffaffinitetskromatografi på Mimetic Orange 1 -harpiks etterfulgt av et trinn med hydrofob interaksjonskromatografi på Bakerbond Wide Pore HI-Propyl-harpiks. Prosessen er sagt å resultere i humant hypofyse FSH som har en spesifikk aktivitet på 7066 IU (immunoassay)/mg og mindre enn 1 IU (immunoassay)/mg av LH og et urin FSH som har en spesifikk aktivitet på 6298 IU (immunoassay)/mg og mindre enn 3 IU (immunoassay)/mg av LH. Proteininnholdet ble bestemt ved absorpsjon ved 280 nm (under antagelse at A<280>icm for 1 g/l er lik 1).
Chiba et al. [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] beskriver en teknikk for rensing av hundehypofysegonadotrofiner, inkludert FSH, ved å bruke konkanavalin (Con) A affinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) og immobilisert metallionkromatografi med Cu<++>. Det resulterende FSH er rapportert å ha en spesifikk aktivitet på 2,17 IU/g protein ved å bruke et radioreseptorassay for FSH til å måle biologisk aktivitet og BioRad proteinassaysettet (BioRad Laboratories CA USA) for å bestemme proteininnholdet.
WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) beskriver en fremgangsmåte for å rense humant FSH fra urin. Prosessen involverer immunkromatografi med FSH-spesifikke immobiliserte monoklonale antistoffer bundet til sefarose-4B ved divinylsulfon etterfulgt av revers fase HPLC. Det resulterende FSH er fri for LH og andre urinproteiner og har en spesifikk aktivitet på 6200 IU/mg av lyofilisert pulver (Steelman-Pohleymetode). Preparatet var det første FSH-preparatet som var egnet for subkutan administrering på grunn av dets renhet.
W09625496 beskriver bovint FSH og en fremgangsmåte for rensing derav. Fremgangsmåten for å rense er en ett-trinns metode som involverer affinitetskromatografi.
Det forblir imidlertid et pågående behov for nye metoder for å rense FSH og FSH-varianter. Særlig er det behov for rensemetoder som unngår anvendelse av kostbare immunaffinitetskromatografitrinn.
Det er en hensikt ved oppfinnelsen å tilveiebringe en ny metode til å rense rekombinant FSH eller en rekombinant FSH-variant.
I et første aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte til å rense rekombinant humant FSH eller en FSH-variant som tar utgangspunkt i en væske som inneholder rått FSH som omfatter følgende trinn: (1) Fargeaffinitetskromatografi;
(2) hydrofob interaksjonskromatografi; og
(3) revers fasekromatografi;
som kan utføres i enhver rekkefølge.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 illustrerer den foreliggende oppfinnelsen, det vil si en fremgangsmåte til rensing som omfatter trinnene:
Fargeaffinitetskromatografi,
hydrofob interaksjonskromatografi,
revers fasekromatografi.
Figur 2 viser et flytskjema for en spesifikk utforming av den foreliggende oppfinnelsen, det vil si en fremgangsmåte for rensing som omfatter trinnene:
Ultrafiltrering/diafiltrering,
anionutvekslingskromatografi,
fargeaffinitetskromatografi,
hydrofob interaksjonskromatografi,
revers fasekromatografi, anionutvekslingskromatografi,
nanofiltrering,
ultrafiltrering/diafiltrering.
Forkortelser
Følgende forkortelser ble brukt i beskrivelsen i henhold til oppfinnelsen: DF: Diafiltrering;
FSH: Follikkelstimulerende hormon;
r-FSH: Rekombinant FSH;
hFSH: Humant FSH;
r-hFSH: Rekombinant humant FSH;
BV: Sengevolum;
DEAE: Dietylaminoetyl;
ELISA: Enzymkoblet immunoassay;
DAC: Fargeaffinitetskromatografi;
IMAC: Immobilisert metallionaffinitetskromatografi;
OD: Optisk tetthet;
HIC: Hydrofob interaksjonskromatografi;
HPLC: Væskekromatografi med høy ytelsesevne;
IRMA: Immunradiometrisk assay;
KD eller kD: kiloDalton;
HCP: Vertscelleprotein, protein som stammer fra vertscellen brukt for ekspresjon av
FSH
IPC: I prosesskontroller;
IEF: Isoelektrisk fokusering;
PES: Polyetersulfon;
RP-HPLC: Revers fase væskekromatografi med høy ytelsesevne;
Q FF: Anionutveksling på Q sefarose FF;
RT: Romtemperatur;
UF: Ultrafiltrering;
WFI: Vann for injeksjon.
Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte til å rense rekombinant humant FSH eller rekombinant FSH-variant som tar utgangspunkt i en væske som inneholder rått FSH, som omfatter trinnene: (1) Fargeaffinitetskromatografi;
(2) hydrofob interaksjonskromatografi; og
(3) revers fasekromatografi;
som kan utføres i enhver rekkefølge.
Rensemetoden i henhold til oppfinnelsen tillater et rekombinant FSH-volum med høy renhet som deretter kan formuleres til det endelige medikamentet, for eksempel Gonal-F (Serono). Det har fordelen av å gi en høy grad av renhet uten å benytte immunaffinitetskromatografi. Det rå FSH som danner utgangsmaterialet for rensingen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen består av cellekulturinnhøstinger som inneholder rekombinant FSH.
I en foretrukket utforming blir en antioksidant eller en fri aminosyre eller dipeptid med antioksiderende og rensende virkning inkludert i noen eller alle trinnene i rensemetoden ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Mer presist er antioksidanten tilstede i alle bufferne brukt til å rense og/eller konsentrere og/eller filtrere r-hFSH. Antioksidanten forhindrer oksidering av FSH under prosesseringen. En foretrukket antioksidant er L-metionin. Fortrinnsvis blir L-metionin brukt i en konsentrasjon på eller rundt 10-100 mM. Ytterligere eksempler på en antioksidant inkluderer t-butyl-4-metoksyfenol, 2,6-bis(l,l-dimetyletyl)-4-metylfenol; kalium- eller natriumbimetabisulfitt, natriumbisulfitt. Eksempler på fri aminosyre og dipeptid med antioksiderende og rensende virkning er histidin, taurin, glysin, alanin, karnosin, anserin, 1-metylhistidin eller kombinasjoner derav.
Typisk blir utgangsmaterialet først klarert og deretter og eventuelt konsentrert (for eksempel ved å bruke ultrafiltrering) og/eller bufferutvekslet (for eksempel gjennom et diafiltreringstrinn) før det er blitt innfanget på det første kromatografitrinnet.
I kromatografitrinnene kan polymerbaserte og agarosebaserte harpikser anvendes. Det er også mulig å anvende membrankromatografi hvori harpiksen blir erstattet med en funksjonalisert membran.
De 3 rensetrinnene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen (det vil si fargeaffinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, revers fasekromatografi) er i det følgende beskrevet mer detaljert.
Farfieaffinitetskromatografitrinn ( 1)
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen involverer et trinn med fargeaffinitetskromatografi (1). I en foretrukket utforming blir trinnet med fargeaffinitetskromatografi utført ved å bruke en harpiks som har som en immobilisert ligand en fargeforbindelse som er velkjent for en person med kunnskap på området, det vil si Cibacron Blue F3G-A. Betegnelsen "immobilisert" er godt forstått av en fagperson og betyr at liganden er derivatisert i den forstand at den er kjemisk koblet til harpiksen. En spesielt foretrukket harpiks er Blue Sepharose FF (kan oppnås fra Amersham Biosciences Inc.). De tekniske trekkene til Blue Sepharose FF er som følger:
Det er forstått at fremgangsmåten kan utføres med alternative harpikser som har lignende egenskaper. Eksempler på alternative harpikser inkluderer: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh Bioscience), Toyopearl SuperButyl 550, Toyopearl Phenyl 650, Blue Cellthru BigBead (Sterogene), SwellGel Blue (Pierce), Cibachrome blue 3GA-agarose 100 (Sigma), Affi-Gel Blue (BioRad), Econo-Pac blue patroner (BioRad), Blue sepharose HP (Amersham), Cibacron Blue 3GA (Sigma).
Eluering i trinnet med immobilisert fargeaffinitetskromatografi bør fortrinnsvis utføres ved å bruke en buffer av fosfat, særlig foretrukket natriumfosfat. pH i elueringen bør fortrinnsvis være fra på eller rundt 6,0 til på eller rundt 11,5, mer fortrinnsvis fra på eller rundt 6,5 til på eller rundt 8, særlig fortrinnsvis på eller rundt 7,0. Alternative buffere som er egnet for å opprettholde en pH på 7,0 inkluderer følgende: MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES. Elueringsbufferen for trinnet med fargeaffinitetskromatografi bør fortrinnsvis inneholde et salt for å øke konduktiviteten, fortrinnsvis NaCl.
I en særlig foretrukket utforming inneholder produktkontaktskapende buffere for trinnet med fargeaffinitetskromatografi (ekvilibrering, vask og eluering) en antioksidant så som L-metionin. Ytterligere eksempler på en antioksidant inkluderer t-butyl-4-metoksyfenol, 2,6-bis(l,l-dimetyletyl)-4-metylfenol; kalium- eller natriumbimetabisulfitt, natriumbisulfitt.
Hydrofob interaksjonskromatografitrinn ( 2)
Fremgangsmåten involverer også et trinn med hydrofob interaksjonskromatografi (2). I en foretrukket utforming blir den hydrofobe interaksjonskromatografi en utført med en harpiks så som Toyopearl Butyl 65OM (som kan oppnås fra Tosoh Biosep Inc.).
Det skal forstås at trinn (2) kan utføres ved å bruke alternative harpikser som har lignende egenskaper. Alternative harpikser som kan anvendes, er som følger: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (lav sub); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (høy sub); Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose High Performance; SOURCE 15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE 15PHE alle fra Amersham Biosciences (800) 526-3593; (se www. amershambiosciences. com). Enda ytterligere harpikser er: Hydrocell C3 eller C4; Hydrocell Phenyl fra BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558; (se www. biochrom. com).
Binding på HIC-harpiksen blir utført i en buffer med en høy konduktivitet, oppnådd gjennom tilsetning av salt (NaCl, (NH4)2S04eller Na2S04for eksempel). Eluering i trinnet med hydrofob interaksjonskromatografi blir fortrinnsvis utført ved å redusere konduktiviteten til den mobile fasen (redusere saltkonsentrasjonen) ved å bruke en buffer som har en pH fra på eller rundt 6 til på eller rundt 8, mer fortrinnsvis fra på eller rundt 6,5 til på eller rundt 7,5, mest fortrinnsvis på eller rundt 7. Et særlig foretrukket system inneholder natriumfosfat for bufring, fortrinnsvis ved en pH på eller rundt 7 og ammoniumsulfat. Alternative buffere er nevnt ovenfor.
I en særlig foretrukket utforming inneholder de produktkontaktbringende buffere for trinnet (2) i HIC (ekvilibrering, vask, eluering) en antioksidant så som L-metionin. Alternative antioksidanter er nevnt ovenfor.
Revers fasekromatografitrinn ( 3)
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen omfatter også et trinn med revers fasekromatografi (RPC) (3). RPC blir fortrinnsvis utført ved å bruke en harpiks så som SOURCE 30 RPC (som kan oppnås fra Amersham Biosciences). Det skal forstås at trinn (3) kan utføres ved å bruke alternative harpikser som er velkjente for en fagperson og som har lignende egenskaper.
Kromatografien blir fortrinnsvis utført ved å bruke en mobil fasebufring på svakt alkalisk pH, for eksempel på eller rundt pH 7-8,5, fortrinnsvis på eller rundt 7,5 eller 7,6.1 en foretrukket utforming er buffer enhetene ammoniumacetat. Alternative buffere som er adekvate for en pH på eller rundt 7,6 inkluderer: BES, MOPS, fosfat, TES, HEPES. Bufferoppløsningene brukt i dette trinnet kan også inneholde et organisk modifiserende middel hvor konsentrasjonen av hvilke blir modulert for forskjellige faser av kromatografitrinnet (opplasting, vasking, eluering og regenerering). I en foretrukket utforming er det organiske modifiserende middelet et vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis en alkohol (så som metanol, etanol, osv.), mest fortrinnsvis 2-propanol (/sø-propanol).
I en spesielt foretrukket utforming inneholder de produktkontaktbringende bufferne for trinnet RPC (ekvilibrering, vask, eluering) en antioksidant så som L-metionin. Alternative antioksidanter er nevnt ovenfor.
Eventuelt ytterligere rensetrinn 0 - ionebyttekromatografi
I tillegg til de 3 hovedrensetrinnene angitt ovenfor, kan den foreliggende oppfinnelsen inkludere ytterligere rensetrinn.
I en utforming involverer rensemetoden i henhold til oppfinnelsen et preliminært trinn med ionebyttekromatografi (0) utført, fortrinnsvis med en sterk anionutvekslingsharpiks, særlig fordelaktig en kvaternær ammoniumharpiks så som
Q Sepharose FF (som kan oppnås fra Amersham Biosciences) som har følgende egenskaper:
Lineær strømningshastighet ved 25°C 1 bar 400-700 cm/time
15 cm sengehøyde, XK 50/30-kolonne:
Alternativt kan ionebyttekromatografitrinnet (0) utføres ved å bruke en harpiks så som Fractogel EMD TMAE HICAP (som kan oppnås fra Merck KGaA, Darmstadt Tyskland) eller en harpiks som har lignende egenskaper, se nedenfor:
Trinnet med ionebyttekromatografi blir fortrinnsvis utført ved å bruke en buffer som har en svak alkalisk pH (for eksempel fra på eller rundt 7,2 til på eller rundt 9,0 eller fra på eller rundt 8,0 til på eller rundt 9,0, mest fortrinnsvis på eller rundt 8,5). Egnede buffere inkluderer for eksempel boratbuffer, trietanolamin/iminodieddiksyre Tris, ammoniumacetat, tricin, bicin, TES, HEPES, TAPS. Mest foretrukket er boratbuffer ved en pH på eller rundt 8,5. Eluering fra ionebytteharpiksen blir utført ved å øke konduktiviteten til den mobile fasen ved tilsetning av salt, fortrinnsvis NaCl. I en særlig foretrukket utforming inneholder de produktbringende buffere for ionebyttekromatografien (ekvilibrering, vask, eluering) en antioksidant, fortrinnsvis L-metionin. Alternative antioksidanter er nevnt ovenfor.
I en foretrukket utforming omfatter således fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen følgende trinn: (0) Anionbyttekromatografi, fortrinnsvis på en sterk anionbytteharpiks [fortrinnsvis en kvaternær ammoniumharpiks så som Q Sepharose FF eller Fractogel EMD TMAE]; (1) fargeaffinitetskromatografi [fortrinnsvis på Blue Sepharose FF]; (2) hydrofob interaksjonskromatografi [fortrinnsvis på Toyopearl Butyl 650M];
(3) revers fasekromatografi [fortrinnsvis på Source 30 RPC].
Eventuelt ytterligere rensetrinn (- 1) - ultrafiltrering/ diafiltrering Før trinnet med ionebyttekromatografi (0) kan det være ønskelig å utføre et ultrafiltreringstrinn for å konsentrere det rå FSH. Ultrafiltreringen (eller diafiltreringen) blir fortrinnsvis utført ved å bruke en membran som har en cut-off på eller rundt 3-10 kD, mest foretrukket på eller rundt 8 kD.
Eventuelt ytterligere rensetrinn ( 4) - anionutvekslingskromatografi I en ytterligere foretrukket utforming omfatter også fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen et andre trinn med anionutvekslingskromatografi (4). En foretrukket harpiks er Fractogel EMD TMAE HICAP (som kan oppnås fra Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) eller en harpiks som har lignende egenskaper som nevnt ovenfor. Alternativt kan det andre trinnet med anionutvekslingskromatografi utføres på Q Sepharose FF eller andre harpikser som har lignende egenskaper som nevnt ovenfor.
Trinnene med anionutvekslingskromatografi, fargeaffinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi (HIC), revers fasekromatografi og andre trinn av anionutvekslingskromatografi, kan utføres i enhver rekkefølge, skjønt det er foretrukket å utføre et trinn med anionutvekslingskromatografi først. De gjenværende trinnene med fargeaffinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi (HIC), RPC og eventuelt andre anionutvekslingskromati kan utføres i enhver rekkefølge, skjønt det er foretrukket å følge den rekkefølge som er vist nedenfor: (0) Anionutvekslingskromatografi, (1) fargeaffinitetskromatografi, (2) hydrofob interaksjonskromatografi (HIC), (3) revers fasekromatografi RPC; og (4) andre anionutvekslingskromatografi.
Eventuelt ytterligere rensetrinn ( 5) - ultrafiltrering/ diafiltrering I en ytterligere foretrukket utforming, etter ethvert av trinnene med kromatografi (særlig etter et trinn med revers fasekromatografi), blir FSH-prøven utsatt for et konsentrasjonstrinn. Fortrinnsvis blir trinnet utført ved å bruke ultrafiltrering kombinert med diafiltrering for å oppnå et volum som har den ønskede sammensetning. Ultrafiltreringen (eller diafiltreringen) blir fortrinnsvis utført ved å bruke en membran som har en cut-off på eller rundt 3-10 kD, mest fortrinnsvis på eller rundt 5 kD.
I en særlig foretrukket utforming blir følgende trinn utført i den rekkefølge som er vist nedenfor: (-1) Ultrafiltrering (fortrinnsvis med en membran som har en cut-off på eller rundt 8kD); (0) anionutvekslingskromatografi (fortrinnvis ved å bruke en Q Sepharose FF-kolonne); (1) fargeaffinitetskromatografi (fortrinnsvis ved å bruke en Blue Sepharose FF-kolonne); (2) hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) (fortrinnsvis ved å bruke en Butyl 650 M-kolonne); (3) revers fasekromatografi (RPC) (fortrinnsvis ved å bruke en Source 30 RPC-kolonne); (4) anionutvekslingskromatografi på en sterkt basisk anionutvekslingsharpiks (fortrinnsvis ved å bruke en TMAE hicap-harpiks); og
(5) ultrafiltrering (fortrinnsvis med en membran som har en cut-off på 5 kD).
Det kan være ønskelig å utsette FSH-prøven til et trinn med nanofiltrering, særlig som et virusklareringstrinn; det vil si for å redusere risikoen for kontaminering av FSH-preparatet med virus eller viruslignende partikler som har sin opprinnelse i cellekulturen. Nanofiltrering kan utføres på ethvert trinn av renseprosessen, det er imidlertid særlig foretrukket å utføre nanofiltrering etter andre trinn av ionebyttekromatografi eller etter revers fasekromatografi eller etter hydrofob interaksjonskromatografi. Nanofiltrering kan utføres mer enn én gang, for eksempel kan den utføres to ganger.
I en særlig foretrukket utforming, omfatter fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen følgende trinn: (-1) Ultrafiltrering (fortrinnsvis med en membran som har en cut-off på eller rundt 8kD); (0) anionutvekslingskromatografi (fortrinnvis med Q Sepharose FF-kolonne); (1) fargeaffinitetskromatografi (fortrinnsvis med Blue Sepharose FF-kolonne); (2) hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) (fortrinnsvis med Butyl 650 M); (3) revers fasekromatografi (RPC) (fortrinnsvis med 30 RPC); (4) anionutvekslingskromatografi på en sterkt basisk anionutvekslingsharpiks (fortrinnsvis TMAE hicap-harpiks); (4') nanofiltrering; (5) ultrafiltrering (fortrinnsvis med en membran som har en cut-off på 5 kD).
Fordelen med den foreliggende oppfinnelsen er at rensemetoden ikke har et kostnadsintensivt immunoaffinitetskromatografitrinn og tilveiebringer likevel en høy grad av FSH-renhet og spesifikk bioaktivitet. I tillegg inneholder den rensede FSH i henhold til den foreliggende oppfinnelsen ikke uønskede urenheter tilført ved immunoaffinitetskromatografi (for eksempel immunglobuliner som lekker fra harpiksen).
Lagring/lyofilisering
Den flytende sammensetningen som resulterer fra renseprosessen som beskrevet ovenfor og som inneholder renset FSH kan fryses for lagring som den er eller etter rensing, hvor eluatet kan utsettes for lyofilisering ("frysetørking") for å fjerne oppløsningsmiddelet. Den resulterende væske eller lyofilisert produkt blir kalt "FSH-volum".
FSH-formuleringer
FSH eller en FSH-variant i henhold til oppfinnelsen eller renset i henhold til fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan formuleres for injeksjon, entra intramuskulært eller subkutant, fortrinnsvis subkutant. FSH-formuleringen kan være frysetørket, i hvilket tilfelle den blir oppløst i vann for injeksjon like før injeksjon. FSH-formuleringen kan også være en flytende formulering, i hvilket tilfelle den kan injiseres direkte uten tidligere oppløsning.
FSH-formuleringen kan være enkeldose eller flere doser. Hvis den er en flertallsdose, bør den fortrinnsvis inneholde et bakteriostatisk middel så som for eksempel benzylalkohol, metakresol, tymol eller fenol, fortrinnsvis benzylalkohol eller metakresol. Enkeltdoseformuleringer kan også omfatte et bakteriostatisk middel.
FSH i henhold til oppfinnelsen kan formuleres med kjente eksipienter og stabiliserende midler, for eksempel sukrose og mannitol. Det kan også omfatte en antioksidant så som metionin. Det kan ytterligere omfatte et overflateaktivt middel så som TWEEN (fortrinnsvis TWEEN 20) eller Pluronic (fortrinnsvis Pluronic F68).
I en særlig foretrukket multidoseformulering blir FSH fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen formulert ved at den oppløses i vann for injeksjon med sukrose, fosfatbuffer (pH 7), Pluronic F68, metionin og metakresol eller benzylalkohol.
En særlig foretrukket flytende multidoseformulering av rekombinant FSH for subkutan eller intramuskulær injeksjon er følgende:
Indikasjoner
FSH i henhold til oppfinnelsen er egnet for anvendelse i alle behandlinger hvor FSH er indikert. Den er spesielt egnet for subkutan administrering ved ovulasjonsinduksjon, kontrollert ovariehyperstimulering for assisterte reproduktive teknologier og ved behandling av oligospermi. Det kan anvendes sammen med andre gonadotrofiner så som LH og hCG. Det kan også anvendes med ytterligere forbindelser som øker responsen til FSH så som klomifencitrat, aromataseinhiborer så som Anastrozole, Letrozole, Fadrozole og YM-511.
Sekvenser:
SEKV.ID. NR. 1: Humant glykoprotein a-underenhet;
SEKV.ID. NR. 2: hFSH p-underenhet;
SEKV.ID. NR. 3: hFSH p-underenhet variant 1;
SEKV.ID. NR. 4: hFSH p-underenhet variant 2;
SEKV.ID. NR. 5: hFSH p-underenhet variant 3.
Follikkelstimulerende hormon eller FSH som brukt heri, refererer seg til humant FSH (hFSH) fremstilt som et fullengde modent protein. FSH er en dimer sammensatt av den humane glykoprotein alfa-underenheten og den humane FSH beta-underenheten. Proteinsekvensen til den humane glykoprotein alfa-underenheten er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 1 og proteinsekvensen til den humane FSH beta-underenheten er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 2.
Anvendelsen av betegnelsen "rekombinant" refererer seg til preparater av FSH som er fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi (se for eksempel WO 85/01958). Et eksempel på en metode til å uttrykke FSH ved å bruke rekombinant teknologi er ved transfeksjon av eukaryote celler med DNA-sekvenser som koder en alfa- og en beta-underenhet av FSH, enten tilveiebrakt på én vektor eller på to vektorer hvor hver underenhet har en separat promoter som beskrevet i europeisk patent nr. EP 0 211 894 og EP 0 487 512. DNA som koder FSH kan være et cDNA eller det kan inneholde introner. Et annet eksempel på anvendelse av rekombinant teknologi til å fremstille FSH er ved anvendelse av homolog rekombinasjon for å innsette et heterologt regulatorisk segment i operativ forbindelse med endogene sekvenser som koder en eller begge av underenhetene av FSH som beskrevet i europeisk patent nr EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Det er også vurdert metoder så som de beskrevet i WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies) hvori en av underenhetene er innskutt heterologt i en celle og den andre underenheten blir uttrykt ved aktivering av genomiske sekvenser ved innsetting av et heterologt regulatorisk segment ved homolog rekombinasjon. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes til å rense FSH uttrykt ved å bruke enhver av disse metodene og andre metoder.
Uttrykket "rekombinant celle" refererer seg til en celle fremstilt ved å innsette heterologt DNA inkludert enhver av de ovenfor nevnte metoder for genetisk manipulering.
Fortrinnsvis blir FSH produsert rekombinant i kinesisk hamstereggstokk (CHO) celler transfektert med en vektor eller vektorer som omfatter DNA som koder for den humane glykoprotien alfa-underenheten og beta-underenheten av FSH. DNA som koder alfa- og beta-underenheter kan være tilstede på samme eller forskjellige vektorer.
Uttrykket "FSH-variant" er ment å omfatte de molekyler som atskiller seg i aminosyresekvens, glykosyleringsmønster eller inter-underenhetkobling fra humant FSH men som utviser FSH-aktivitet. Eksempler inkluderer CTP-FSH, lengevirkende modifisert rekombinant FSH som består av villtype a-underenhet og en hybrid P-underenhet hvori karboksyterminalpeptidet til hCG er blitt fusjonert til C-terminalen til P-underenheten av FSH som beskrevet i LaPolt et al. ; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; eller Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]. Også inkludert er enkeltkjede CTP-FSH, et enkeltkjedemolekyl som består av de følgende sekvenser (fra N-terminal til C-terminal):
hvori pFSH betyr P-underenheten av FSH, phCG CTP (113-145) betyr det karboksyterminale peptidet til hCG og ocFSH betyr a-underenheten av FSH som beskrevet av Klein et al. [ Pharmacokinetics andpharmacodynamics of single- chain recombinant human follicle- stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255]. Andre eksempler på FSH-varianter inkluderer FSH-molekyler som har ytterligere glykosyleringssteder inkorporert i a- og/eller P-underenheten som beskrevet i WO 01/58493 (Maxygen) og FSH-molekyler med interunderenhet S-S-bindinger som beskrevet i WO 98/58957. Ytterligere eksempler på FSH-varianter inkluderer kimære molekyler som omfatter sekvenser fra FSH og sekvenser fra hCG eller LH så som de beskrevet i WO 91/16922 og WO 92/22568.
FSH-variantene referert til heri inkluderer også karboksyterminaldelesjonene til beta-underenheten som er kortere enn fullengde modent protein med SEKV.ID. NR. 2. Karboksyterminaldelesj oner i den humane beta-underenheten er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 3, 4 og 5. Det skal forstås at karboksyterminalvarianter av betakjeden danner kompleks med en kjent alfa-underenhet for å danne en FSH-variant heterodimer.
I en foretrukket utforming blir FSH produsert rekombinant i CHO-celler, enten i et serum eller i et serumfritt medium.
I en foretrukket utforming er det rensede FSH-produktet i henhold til fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen egnet for subkutan administrering og tillater derved selvadministrering av pasienten.
Uttrykket "rått rekombinant FSH" refererer seg til cellekutursupernatant fra rekombinante celler som uttrykker FSH før den har gjennomgått noe kromatografisk trinn. Uttrykket omfatter den rå formen av supernatanten (som isolert fra cellene) så vel som konsentrert og/eller filtrert og/eller ultrafiltrert supernatant.
Betegnelsen "biologisk aktivitet" i forbindelse med FSH-aktivitet refererer seg til evnen til en FSH-formulering til å utløse biologiske responser assosiert med FSH så som ovarievektøkning i Steelman-Pohley-assayet [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616] eller follikulær vekst i en kvinnelig pasient. Follikulær vekst i en kvinnelig pasient kan evalueres ved ultralyd, for eksempel i form av antall follikler som har en gjennomsnittlig diameter på eller rundt 16 mm på dag 8 av stimuleringen. Biologisk aktivitet blir evaluert med hensyn på en akseptert standard for FSH.
LH-innholdet i et FSH-preparatet kan måles for eksempel ved å bruke et LH-spesifikt immunoassay så som Delfia hLH Spee (Wallac Oy, Turku, Finland).
Betegnelsen "spesifikk aktivitet" med referanse til FSH betyr den biologiske aktiviteten i IU av preparatet i et anerkjent biologisk assay for FSH så som Steelman Pohley bioassay [dividert på mengden av protein som bestemt av et assay for totalt proteininnhold så som Lowry-assay [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr og R.J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J.R Dulley og P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136], Bradford-assayet [Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248] eller ved absorbans på 280 nm.
Fortrinnsvis har FSH oppnådd ved oppfinnelsen en spesifikk aktivitet på større enn eller rundt 8000 IU/mg, mer fortrinnsvis større enn på eller rundt 9000 IU/mg, enda mer fortrinnsvis større enn på eller rundt 10000 IU/mg, enda mer fortrinnsvis på eller rundt 14000 IU/mg hvori biologisk aktivitet er målt ved Steelman-Pohley bioassay og proteininnholdet er målt ved SE-HPLC.
FSH-prøvene kan analyseres med hensyn på deres renhet på forskjellige trinn i fremgangsmåten ved å bruke for eksempel tekniker slik som de opplistet nedenfor: r-hFSH-kvantifisering/fri alfa-underenhet/renhet/oksiderte former: RP-HPLC Som nevnt ovenfor er FSH et heterodimert glykoprotein sammensatt av en a- og en P-underenhet. Noe dissosiasjon av underenhetene kan skje og dette kan overvåkes ved å se på mengden av fri a-underenhet som er tilstede i en prøve. I tillegg kan FSH-underenhetene oksideres. De oksiderte kontaminantene kan kvantifiseres ved å bruke RP-HPLC, mens de frie underenhetene kan vurderes ved å bruke SDS-PAGE.
r-hFSH-kvantifisering: Immunoassay
FSH-innhold i en prøve kan bestemmes ved å bruke et immunoassay som er spesifikt for FSH så som DELFIA FSH immunoassay.
Totalt protein: Bradford-assay, Lowry-assay, absorbans på 280 nm
Som ved ethvert proteinpreparat kan totalt proteininnhold bestemmes ved å bruke teknikker så som et Bradford-assay, et Lowry-assay eller ved absorbans på 280 nm.
Isoforme mønstere: IEF
Som nevnt ovenfor, er FSH et glykoprotein som har et flertall av oligosakkaridrester festet på forskjellige steder i begge underenhetene. Oligosakkaridrestene kan ha forskjellige grader av forgrening og kan beskyttes med sialsyrerester. Sialsyrerester er negativt ladde (ved nøytral pH). Forskjeller i beskyttelse fører til heterogenitet med en blanding av elementer som har forskjellige isoelektriske punkter (pl). Dette kan vurderes ved å bruke en teknikk som separerer basert på ladning, så som isoelektrisk fokusering (IEF).
Vertscelleprotein (HCP)
Vertscelleprotein kan analyseres ved å bruke et ELISA-assay. For eksempel kan antistoff utfordres med en "hermekultur" som er en kultur av vertsceller uten FSH-gen.
EKSEMPLER
Den foreliggende oppfinnelsen vil nå illustreres ved hjelp av to eksempler.
Tilsvarende flytskjemaer som illustrerer nevnte to eksempler er presentert i figur 1 og 2.
Det resulterende rensede r-hFSH er betegnet "r-hFSH-bulk".
EKSEMPEL 1 fkfr figur 1)
Trinn ( 1) : Fargeaffinitetskromatografi på blå sefarose
FSH-utgangsmaterialet for rensing ble fremstilt fra cellekulturhøstinger som inneholder rekombinant FSH, det vil si FSH som ble produsert rekombinant i CHO-celler, enten i et serum eller i et serumfritt medium. Fargeaffinitetskromatografikolonnen (Blue Sepharose FF-harpiks) blir først ekvilibrert med en buffer med lav konduktivitet ved en pH på 8,5 som inneholder L-metionin. Væsken som inneholder FSH blir deretter påført direkte på harpiksen. Etter opplasting blir det ubundne materialet vasket vekk ved å bruke ekvilibreringsbuffer. FSH blir til slutt eluert ved å skulle kolonnen med natriumfosfatbuffer med pH 7,0 som inneholder NaCl og L-metionin. Elueringsoppsamlingen blir direkte prosessert til det neste trinnet. Trinnet blir utført ved 2-8°C.
Trinn ( 2) : Hydrofob interaksjonskromatografi ( HIC) på Toyopearl Butyl 650 M
Blue Sepharose FF-eluatet fra trinn (1) blir lastet på en Toyopearl Butyl 650 M-kolonne ekvilibrert mot en natriumfosfatbuffer, pH 7,0, som inneholder ammoniumsulfat og L-metionin. Det ubundne materialet blir skylt ut med ekvilibreringsbuffer. FSH blir eluert med samme buffer, men med en redusert konsentrasjon av ammoniumsulfat. Eluatet blir prosessert til neste trinn. Trinnet blir utført ved RT.
Trinn ( 3) : Revers fase på Source 30 RPC
HIC-eluatet (fra trinn (2)) blir først tilpasset ved tilsetning av IPA (isopropanol). En Source 30 RPC-kolonne blir ekvilibrert mot en ammoniumacetatbuffer, pH 7,6, som inneholder L-metionin og 2-propanol ved en konsentrasjon som er ekvivalent til den i det bearbeidede opplastingsmaterialet. Etter utskylling av ubundet materiale med ekvilibreringsbuffer, blir harpiksen vasket med ammoniumacetatbuffer, pH 7,6, som inneholder L-metionin og en økt konsentrasjon av 2-propanol. FSH blir avslutningsvis eluert ved ytterligere å øke konsentrasjonen av 2-propanol. Elueringsoppsamlingen blir til slutt fortynnet under omrøring med vann som inneholder L-metionin. Den fortynnede oppsamlingen blir bearbeidet til det neste trinnet. Trinnet blir utført ved RT.
Ved å følge ovennevnte prosedyre, er rensefaktoren - det vil si forholdet mellom FSH-renhet i den rensede prøven mot FSH-renhet i utgangsmaterialet (rått FSH) - omtrent 40000.
EKSEMPEL 2 fkfr figur 2)
Trinn (- 1) : Ultrafiltrering/ diafiltrering av konsentrert r- hFSH
Alle operasjoner ble utført under avkjølte betingelser (2-8°C). Rått FSH som danner utgangsmaterialet for rensingen blir avledet fra cellekulturinnhøstinger som inneholder rekombinant FSH.
Klarering
Rått r-hFSH blir filtrert gjennom et 0,5 nm dypt filter (så som Pall Profile II-filtere eller tilsvarende).
Ultrafiltrering
Det klarerte råmaterialet ble først konsentrert ved ultrafiltrering ved å bruke en 10 kD polyetersulfonmembran. Det konsentrerte retentatet blir deretter diafiltrert mot minst 5 diavolumer av boratbuffer, pH 8,5 som inneholder L-metionin som antioksidant. Konduktiviteten og pH til retentatet ble målt for å overvåke fremgangen i diafiltreringen. Retentatet ble deretter konsentrert ytterligere før systemet ble drenert. Ultrafiltreringsenheten ble endelig skylt med diafiltreringsbuffer og rensemiddel blandet med det gjenvunne retentatet. Oppsamlingen ble bearbeidet videre til neste trinn.
Filtrering
Det konsentrerte produktet ble filtrert gjennom et 0,2 nm polyetersulfonfilter (eller tilsvarende).
Trinn ( 0) : Anionutveksling på O Sepharose FF
Det filtrerte materialet ble deretter påført på en sterk anionutvekslings (Q Sepharose FF) -harpiks ekvilibrert mot natriumboratbuffer, pH 8,5, som inneholder L-metionin. Etter opplastingen ble kolonnen renset med ekvilibreringsbuffer for å skille ut alt ubundet materiale. Kolonnen ble deretter eluert med natriumboratbuffer, pH 8,5, som inneholder NaCl (for å øke konduktiviteten) og L-metionin (som en antioksidant). Den oppsamlede elueringsvæsken ble prosessert til fargeaffinitetskromatografi.
Trinn ( 1) : Fargeaffinitetskromatografi på Blue Sepharose Fargeaffinitetskromatografikolonnen (Blue Sepharose FF-harpiks) ble først ekvilibrert med elueringsbuffer fra Q Sepharose FF-trinnet. Det oppsamlede eluatet ble deretter påført direkte på harpiksen. Etter opplastingen ble det ubundne materialet vasket ut ved å bruke ekvilibreringsbuffer. FSH ble til slutt eluert ved å skylle kolonnen med natriumfosfatbuffer ved pH 7,0 som inneholder NaCl og L-metionin. Elueringsoppsamlingen ble direkte prosessert til neste trinn. Trinnet ble utført ved 2-8°C.
Trinn ( 2) : Hydrofob interaksjonskromatografi på Toyopearl Butyl 650 M
Blue Sepharose FF-eluatet ble lastet på en Toyopearl Butyl 650 M-kolonne ekvilibrert mot en natriumfosfatbuffer, pH 7,0, som inneholder ammoniumsulfat og L-metionin. Det ubundne materialet ble skylt ut med ekvilibreringsbuffer. FSH ble eluert med samme buffer, men med en redusert konsentrasjon av ammoniumsulfat. Eluatet ble prosessert til neste trinn. Trinnet ble gjennomført ved RT.
Trinn ( 3) : Revers fase på Source 30 RPC
HIC-eluatet (fra trinn (2)) ble først behandlet ved tilsetning av IPA (isopropanol). Source 30 RPC-kolonnen ble ekvilibrert mot en ammoniumacetatbuffer, pH 7,6, som inneholder L-metionin og 2-propanol i en konsentrasjon ekvivalent til den i det bearbeidede opplastingsmaterialet. Etter å ha skylt ut det ubundne materialet med ekvilibreringsbuffer, ble harpiksen vasket med ammoniumacetatbuffer, pH 7,6, som inneholder L-metionin og en økt konsentrasjon av 2-propanol. FSH blir avslutningsvis eluert ved å ytterligere øke konsentrasjonen av 2-propanol. Elueringsoppsamlingen blir til slutt fortynnet under omrøring med vann som inneholder L-metionin. Den fortynnede oppsamlingen blir prosessert til neste trinn. Trinnet ble gjennomført ved RT.
Trinn ( 4) : Anionutvekslingskromatografi på Fractogel EMD TMAE hicap-harpiks
En Fractogel EMD TMAE hicap-kolonne ble først ekvilibrert med natriumboratbuffer, pH 8,5, som inneholder L-metionin. Det fortynnede post-RPC-materialet (fra trinn (3)) ble lastet på kolonnen. Det ubundne materialet ble skylt ut ved å bruke ekvilibreringsbuffer. FSH blir eluert fra kolonnen ved å øke saltkonsentrasjonen på en lineær måte. Trinnet ble gjennomført ved 2-8°C.
Trinn ( 4') : Nanofiltrering
Eluatet fra Fractogel EMD TMAE-trinnet (4) ble påført direkte på en 20 nm nanofiltreringsanordning med et trykk på 3 bar under nitrogen. Filtratet blir bearbeidet til neste trinn. Operasjonen blir utført ved 2-8°C.
Trinn ( 5) : Bulk ultrafiltrering
Det nanofiltrerte FSH-materialet ble konsentrert ved tangentiell gjennomstrømningsfiltrering på en 5 kD polyetersulfonmembran. Når retentatet nådde omtrent halvparten av det opprinnelige volumet, ble materialet buffer utvekslet ved diafiltrering mot WFI.
Renhet av prøvene
Renheten av FSH-prøvene etter rensetrinnene ble bestemt:
Biologisk aktivitet av prøvene
Den biologiske aktiviteten til det rensede r-hFSH ble målt ved å bruke Steelman-Pohley ovarievektøkningsmetoden. Spesifikk aktivitet ble beregnet ved å bruke den biologiske aktiviteten dividert med FSH-innholdet som bestemt av en SE-HPLC-metode som beskrevet nedenfor.
Spesifikk aktivitet av det endelige volum oppnådd er typisk mellom 10000 og 17000 IU/mg. Eksempelverdier for 2 prøver i et endelig volum FSH som ble oppnådd ifølge metoden til eksempel 2 er gitt i tabell 1.
Claims (24)
1. Fremgangsmåte til å rense rekombinant FSH eller en FSH-variant,karakterisert vedat det omfatter å utsette en væske som inneholder FSH for: (1) Fargeaffinitetskromatografi; (2) hydrofob interaksjonskromatografi; og (3) revers fasekromatografi;
som kan bli utført i en hvilken som helst rekkefølge.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
karakterisert vedat fargeaffinitetskromatografien i trinn (1) blir utført med en harpiks som har immobilisert Cibracron Blue F3G-A.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2,
karakterisert vedat harpiksen brukt for fargeaffinitetskromatografi i trinn (1) er Blue Sepharose FF.
4. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 3,
karakterisert vedat fargeaffinitetskromatografien i trinn (1) blir utført ved å bruke natriumfosfatbuffer med en pH fra på eller rundt 6,5 til 11,5 som elueringsmiddel.
5. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 4,
karakterisert vedat den hydrofobe interaksjonskromatografi en (HIC) i trinn (2) blir utført ved å bruke Toyapearl Butyl 650 M eller en harpiks som har lignende egenskaper.
6. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 5,
karakterisert vedat hydrofobe interaksjonskromatografien i trinn (2) blir utført ved å bruke natriumfosfat/ammoniumsulfat som elueringsmiddel.
7. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 6,
karakterisert vedat trinnet med revers fasekromatografi i trinn (3) blir utført ved å bruke Source 30 RPC som harpiks.
8. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 7,
karakterisert vedat trinnet med revers fasekromatografi i trinn (3) blir uført ved å bruke ammoniumacetat med 2-propanol som elueringsmiddel.
9. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 8,
karakterisert vedat trinnene blir utført i følgende rekkefølge: (1) Fargeaffinitetskromatografi; (2) hydrofob interaksjonskromatografi; og deretter (3) revers fasekromatografi.
10. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 9,
karakterisert vedat den ytterligere omfatter et trinn med anionutvekslingskromatografi, trinn (0).
11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10,
karakterisert vedat trinnet med anionutvekslingskromatografi blir utført før trinnene (1), (2) og (3).
12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11,
karakterisert vedat trinnene er utført i rekkefølgen: (0) Anionutvekslingskromatografi; (1) fargeaffinitetskromatografi; (2) hydrofob interaksjonskromatografi; og (3) revers fasekromatografi.
13. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, 11 eller 12,
hvori anionutvekslingskromatografien i trinn (0) blir utført med Q Sepharose FF-harpiks eller Fractogel EMD TMAE HiCap-harpiks.
14. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 10 til 13,karakterisert vedat ionebyttekromatografien i trinn (0) blir utført ved å bruke boratbuffer som elueringsmiddel.
15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14,
karakterisert vedat boratbufferen er ved en pH på eller rundt 8,5.
16. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 10 til 15,karakterisert vedat den ytterligere omfatter et andre trinn med anionutvekslingskromatografi, trinn (4).
17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16,
karakterisert vedat det andre trinnet med anionutvekslingskromatografi i trinn (4) blir utført etter trinnene (1), (2) og (3).
18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17,
karakterisert vedat trinnene blir utført i rekkefølgen: (0) Anionutvekslingskromatografi; (1) fargeaffinitetskromatografi; (2) hydrofob interaksjonskromatografi; (3) revers fasekromatografi; og (4) anionutvekslingskromatografi.
19. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 16 til 18,karakterisert vedat det andre trinnet med anionutvekslingskromatografi i trinn (4) blir utført ved å bruke Fractogel EMD TMAE HiCap-harpiks eller Q Sepharose FF-harpiks.
20. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 16 til 19,karakterisert vedat det andre trinnet med anionutvekslingskromatografi i trinn (4) blir utført ved å bruke boratbuffer og en gradient med økende NaCl-konsentrasjon.
21. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 16 til 20,karakterisert vedat det omfatter et trinn med nanofiltrering, trinn (4'), utført på det andre trinnet i anionutvekslingskromatografitrinn (4).
22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21,
karakterisert vedat den omfatter et ultrafiltreringstrinn (5) etter trinnet med nanofiltrering (4').
23. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 22,karakterisert vedat ethvert av elueringsmidlene og/eller bufferne kan inneholde en antioksidant, særlig L-metionin.
24. Fremgangsmåte til å rense humant rekombinant FSH,
karakterisert vedat den omfatter trinnene å utsette FSH til: (-1) Ultrafiltrering; (0) anionutvekslingskromatografi på Q Sepharose FF med borat/NaCl, L-metion, pH på eller rundt 8,5 som elueringsmiddel; (1) å utsette eluatet fra trinn (0) for et trinn med fargeaffinitetskromatografi på Blue Sepharose FF og fosfat, NaCl, L-metionin ved en pH på eller rundt 7 som elueringsmiddel; (2) å utsette eluatet fra trinn (1) for et trinn med hydrofob
interaksjonskromatografi på Toyopearl Butyl 650 M med fosfat, ammoniumsulfat, L-metionin ved en pH på eller rundt 7 som elueringsmiddel; (3) å utsette eluatet fra trinn (2) for et trinn med revers fasekromatografi på Source 30 RPC med ammoniumacetat, L-metionin, med 2-propanol ved en pH på eller rundt 7,6 som elueringsmiddel; (4) å utsette eluatet fra trinn (3) for et trinn med anionutvekslingskromatografi på Fractogel EMD TMAE hicap-harpiks med borat, L-metionin, ved en pH på eller rundt 8,5 og NaCl; (4') å utsette eluatet fra trinn (4) for et trinn med nanofiltrering; og (5) å utsette permeatet fra trinn (4') for et trinn med ultrafiltrering.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP04105639 | 2004-11-09 | ||
| US62871704P | 2004-11-17 | 2004-11-17 | |
| PCT/EP2005/055815 WO2006051070A1 (en) | 2004-11-09 | 2005-11-08 | Method for purifying fsh |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20072863L NO20072863L (no) | 2007-06-05 |
| NO340811B1 true NO340811B1 (no) | 2017-06-19 |
Family
ID=39560952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20072863A NO340811B1 (no) | 2004-11-09 | 2007-06-05 | Fremgangsmåte til å rense FSH |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7741455B2 (no) |
| EP (1) | EP1809663B1 (no) |
| KR (1) | KR101173717B1 (no) |
| CN (1) | CN101087805B (no) |
| AT (1) | ATE408624T1 (no) |
| AU (1) | AU2005303818B2 (no) |
| BR (1) | BRPI0517973B8 (no) |
| CA (1) | CA2579131A1 (no) |
| CY (1) | CY1108602T1 (no) |
| DE (1) | DE602005009856D1 (no) |
| DK (1) | DK1809663T3 (no) |
| EA (1) | EA011673B1 (no) |
| ES (1) | ES2312037T3 (no) |
| HK (1) | HK1108704A1 (no) |
| HR (1) | HRP20080464T3 (no) |
| IL (1) | IL182716A (no) |
| MX (1) | MX2007005327A (no) |
| NO (1) | NO340811B1 (no) |
| PL (1) | PL1809663T3 (no) |
| PT (1) | PT1809663E (no) |
| SI (1) | SI1809663T1 (no) |
| WO (1) | WO2006051070A1 (no) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100554277C (zh) * | 2003-12-22 | 2009-10-28 | 阿雷斯贸易股份有限公司 | Fsh的纯化方法 |
| US20080219952A1 (en) | 2005-08-26 | 2008-09-11 | Ares Trading S.A. | Process For the Preparation of Glycosylated Interferon Beta |
| EP1960419B1 (en) * | 2005-12-09 | 2016-03-16 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh or a fsh mutant |
| US9091695B2 (en) * | 2007-06-01 | 2015-07-28 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and systems for quantification of peptides and other analytes |
| EP2492280A1 (en) | 2007-06-28 | 2012-08-29 | BioGeneriX AG | FSH producing cell clone |
| AU2008314689A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Method for purifying an Fc-containing protein |
| AU2008314687A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Method for purifying Fc-fusion proteins |
| CN110433136A (zh) | 2008-02-08 | 2019-11-12 | 泰哈麦克斯总部英国有限公司 | 促卵泡激素的液体制剂 |
| JP2009273427A (ja) * | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| KR101761168B1 (ko) * | 2009-04-01 | 2017-07-25 | 바이오제너릭스 게엠베하 | 재조합 ｆｓｈ 정제 방법 |
| CN101519445B (zh) * | 2009-04-08 | 2013-03-27 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高比活尿促卵泡刺激素及其制备方法 |
| CN101555279B (zh) * | 2009-05-19 | 2013-03-27 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度尿促卵泡刺激素及其制备方法 |
| CN101928342B (zh) * | 2009-06-18 | 2013-05-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途 |
| EP2325194A1 (en) * | 2009-11-24 | 2011-05-25 | Glycotope GmbH | Process for the purification of glycoproteins |
| JP2011172602A (ja) * | 2011-06-15 | 2011-09-08 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| CN103570820B (zh) * | 2012-08-06 | 2015-11-18 | 齐鲁制药有限公司 | 一种重组人促卵泡激素的纯化方法 |
| WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
| JP5750471B2 (ja) * | 2013-05-22 | 2015-07-22 | Ｊｃｒファーマ株式会社 | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| CN103539861B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-18 | 广州联康生物科技有限公司 | 长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103539860B (zh) * | 2013-11-01 | 2014-12-03 | 广州优联康医药科技有限公司 | 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103554269B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-11 | 广州联康生物科技有限公司 | 重组猪促卵泡激素融合蛋白 |
| MY183011A (en) | 2014-04-18 | 2021-02-05 | Cadila Healthcare Ltd | Novel purification process of gonadotropin |
| CN104961821A (zh) * | 2014-07-28 | 2015-10-07 | 厦门欧瑞捷生物科技有限公司 | 一种从人尿中提取促性腺激素的方法 |
| WO2016116966A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins |
| CN105461799A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 哈药集团技术中心 | 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法 |
| CN107698676B (zh) * | 2017-11-07 | 2020-07-14 | 江西浩然生物医药有限公司 | 一种高纯度尿促性素的提取制备方法 |
| CN110305903B (zh) * | 2019-07-31 | 2021-10-01 | 江苏璟泽生物医药有限公司 | 重组人促卵泡激素及其制备方法 |
| CN110563832A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-12-13 | 江苏璟泽生物医药有限公司 | 一种高纯度重组促卵泡刺激素纯化方法 |
| CN113372433B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-10-11 | 上海景泽生物技术有限公司 | 纯化fsh方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025496A1 (en) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM |
| WO2000063248A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Instituto Massone S.A. | Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1206302B (it) * | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
| US5665868A (en) | 1990-09-14 | 1997-09-09 | Vittal Mallya Scientific Research Foundation | Chromatographic agent and its use for the separation or proteins, polypeptides of metals |
| SE9201073D0 (sv) | 1992-04-03 | 1992-04-03 | Kabi Pharmacia Ab | Protein formulation |
| AUPN801296A0 (en) | 1996-02-12 | 1996-03-07 | Csl Limited | Stabilised growth hormone formulation and method of preparation thereof |
| IT1287138B1 (it) | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
| US6162905A (en) | 1996-11-07 | 2000-12-19 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | FSH and LH separation and purification process |
| US6414123B1 (en) | 1997-10-21 | 2002-07-02 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| US5990288A (en) | 1997-10-21 | 1999-11-23 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| UA92145C2 (en) | 2000-02-22 | 2010-10-11 | Мерк Сероно С.А. | Purified lh |
| EP2267026A1 (en) * | 2000-04-12 | 2010-12-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU784808B2 (en) * | 2001-04-02 | 2006-06-29 | Kedrion Melville Inc. | Prion and viral clearance process |
| CN100554277C (zh) | 2003-12-22 | 2009-10-28 | 阿雷斯贸易股份有限公司 | Fsh的纯化方法 |
| US7598356B2 (en) | 2004-07-08 | 2009-10-06 | Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center | Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily |
-
2005
- 2005-11-08 CN CN2005800375919A patent/CN101087805B/zh active Active
- 2005-11-08 AT AT05815953T patent/ATE408624T1/de active
- 2005-11-08 DE DE602005009856T patent/DE602005009856D1/de active Active
- 2005-11-08 BR BRPI0517973A patent/BRPI0517973B8/pt active IP Right Grant
- 2005-11-08 US US11/575,833 patent/US7741455B2/en active Active
- 2005-11-08 WO PCT/EP2005/055815 patent/WO2006051070A1/en active Application Filing
- 2005-11-08 AU AU2005303818A patent/AU2005303818B2/en active Active
- 2005-11-08 KR KR1020077007365A patent/KR101173717B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-08 EP EP05815953A patent/EP1809663B1/en active Active
- 2005-11-08 ES ES05815953T patent/ES2312037T3/es active Active
- 2005-11-08 SI SI200530407T patent/SI1809663T1/sl unknown
- 2005-11-08 EA EA200701040A patent/EA011673B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-11-08 MX MX2007005327A patent/MX2007005327A/es active IP Right Grant
- 2005-11-08 PT PT05815953T patent/PT1809663E/pt unknown
- 2005-11-08 DK DK05815953T patent/DK1809663T3/da active
- 2005-11-08 CA CA002579131A patent/CA2579131A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-08 PL PL05815953T patent/PL1809663T3/pl unknown
-
2007
- 2007-04-22 IL IL182716A patent/IL182716A/en unknown
- 2007-06-05 NO NO20072863A patent/NO340811B1/no unknown
-
2008
- 2008-03-10 HK HK08102739.4A patent/HK1108704A1/xx unknown
- 2008-09-19 HR HR20080464T patent/HRP20080464T3/xx unknown
- 2008-11-27 CY CY20081101371T patent/CY1108602T1/el unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025496A1 (en) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM |
| WO2000063248A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Instituto Massone S.A. | Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1809663B1 (en) | 2008-09-17 |
| CN101087805A (zh) | 2007-12-12 |
| WO2006051070A1 (en) | 2006-05-18 |
| US7741455B2 (en) | 2010-06-22 |
| CY1108602T1 (el) | 2014-04-09 |
| DK1809663T3 (da) | 2008-11-17 |
| AU2005303818A1 (en) | 2006-05-18 |
| PT1809663E (pt) | 2008-10-02 |
| HK1108704A1 (en) | 2008-05-16 |
| CN101087805B (zh) | 2012-05-23 |
| EP1809663A1 (en) | 2007-07-25 |
| BRPI0517973B1 (pt) | 2018-02-14 |
| IL182716A0 (en) | 2007-07-24 |
| ATE408624T1 (de) | 2008-10-15 |
| DE602005009856D1 (de) | 2008-10-30 |
| EA200701040A1 (ru) | 2007-10-26 |
| IL182716A (en) | 2010-12-30 |
| BRPI0517973A (pt) | 2008-10-21 |
| EA011673B1 (ru) | 2009-04-28 |
| US20080070832A1 (en) | 2008-03-20 |
| MX2007005327A (es) | 2007-08-02 |
| PL1809663T3 (pl) | 2009-01-30 |
| BRPI0517973B8 (pt) | 2021-05-25 |
| ES2312037T3 (es) | 2009-02-16 |
| KR101173717B1 (ko) | 2012-08-13 |
| AU2005303818B2 (en) | 2011-06-23 |
| SI1809663T1 (sl) | 2009-02-28 |
| KR20070083618A (ko) | 2007-08-24 |
| CA2579131A1 (en) | 2006-05-18 |
| HRP20080464T3 (en) | 2008-10-31 |
| NO20072863L (no) | 2007-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO340811B1 (no) | Fremgangsmåte til å rense FSH | |
| AU2006323925B2 (en) | Method for purifying FSH or a FSH mutant | |
| AU2010324104C1 (en) | Process for the purification of glycoproteins | |
| DK2414380T3 (en) | Process for the purification of recombinant fsh | |
| NO330774B1 (no) | Fremgangsmater for a rense humant rekombinant FSH og FSH-varianter | |
| JP4933439B2 (ja) | Ｆｓｈの精製方法 |