CN107698676B - 一种高纯度尿促性素的提取制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高纯度尿促性素的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)人绝经期促性腺激素粗制品经过阴离子交换层析纯化，得到高中间体I；(2)中间体I经过阳离子交换层析纯化，得到中间体II；(3)中间体II经过染料亲和层析纯化，得到高纯度尿促性素。本发明依次采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、染料亲和层析工艺，提取纯化制得高纯度HMG。经过阴离子交换层析与阳离子交换层析，HMG纯化倍数可达60倍以上。利用FSH及LH能与染料亲和吸附的性质，进一步去除杂质蛋白。经过3步层析工艺，使HMG纯化倍数达到500倍以上，从而获得高纯度尿促性素，其中FSH与LH比例约为1:1。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高纯度尿促性素（High Purified HumanMenopausal Gonadotropin，HP-HMG）的提取制备方法。
背景技术
20世纪60年代人尿促性素（HMG）产品问世以来，就开始广泛用于人类不孕症的治疗。此后，20年间它成为全世界范围内不孕症治疗的主流。HMG中卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH) 二者的比例为1:1。含有FSH 的第一代产品是尿促性素(HMG)，如Serono 公司的Pergonal，它是FSH与LH 比例约为1:1 的混合物。但是它的比活和纯度都很低，比活一般在40-300IU/mg 蛋白，纯度只有2-3％的有效成分，其余约97％都是杂蛋白。HMG在我国已应用多年，可独立地作为促排卵治疗的用药， 一般用在排卵功能障碍用克罗米酚作为一线治疗失败的不孕症妇女；也应用于低促性腺激素性性腺功能不全的男性和女性；还广泛应用于行体外受精( invitro fertilization， IVF) 的控制性促排卵( controlled ova rianhyperstimulation, COH) 的妇女中。但同时它也有明显的不足之处，如尿蛋白杂质多、尿源的污染、批间的不稳定性、过敏反应、不能皮下注射等。这就需要在辅助生育治疗中使用更高纯度和质量的HMG产品。
高纯度的HMG（HP-HMG）是从天然提取的促性腺激素制剂，纯度达到了重组单组分制剂的水平。HP-HMG相比于普通纯度的HMG，应当具备纯度高、杂质少的优点，基于这些优点，HP-HMG不会造成人体的过敏反应，且可以使用皮下注射，提高患者的顺应性。
专利US7022822B1中公布了一种高纯度HMG的制备方法，工艺为HMG粗品先用阳离子交换层析纯化，再经阴离子交换层析，最后使用疏水层析技术。由于FSH与LH在疏水性质上差异较大，要同时纯化两者需要使用较强的洗脱条件，比如添加乙醇，才能将两者同时洗脱，此洗脱条件会将疏水性介于FSH与LH中间的杂质蛋白洗脱，因此最终产品比活性只有4000IU/mg蛋白质左右。要制备更高纯度的HMG，需要开发使用更有效的分离技术，将FSH与LH同时纯化，使其达到最终的1:1比例，同时，尽量去除杂质蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度尿促性素的提取制备方法，本方法操作简便、生产成本低，对原料的要求低，工业适应性强，获得的HP-HMG纯度更高，卵泡刺激素（FollicleStimulating Hormone，FSH）与黄体生成素（Luteotropic Hormone，LH）的比例接近1:1。 高纯度尿促性素比活性以FSH计，大于8000IU/mg 蛋白质，FSH:LH约为1:1。
本发明采用的技术方案如下：一种高纯度尿促性素的提取制备方法，制备方法包括以下步骤：
(1) 人绝经期促性腺激素（Human Menopausal Gonadotropin，HMG）粗制品经阴离子交换层析纯化，得到中间体I；
(2) 中间体I经阳离子交换层析纯化，得到中间体II；
(3) 中间体II经染料亲和层析纯化，得到高纯度尿促性素溶液。
根据以上所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤（3）所得高纯度尿促性素溶液进行超滤换盐，换盐所用溶液为0.01M PB缓冲溶液，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PB）缓冲液置换原缓冲溶液，优选地，其pH为5.5-7.0。
优选地，上述制备方法还包括将步骤（3）所得尿促性素溶液与冻干保护剂混合后冻干，冻干保护剂为乳糖，优选地，乳糖添加量为3%-6%（g/ml）。
优选地，上述制备方法所述阴离子交换层析填料配基为三乙基氨基乙基、二乙基氨基乙基、氨基乙基或三乙醇基氨基，基质为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、苯乙烯；所述阳离子交换层析填料配基为羧甲基、磺酸基、磷酸基、亚磷酸基、酚基，基质为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯；所述染料亲和层析填料配基为Cibacron Blue、Red、Green、Orange，基质为琼脂糖、葡聚糖或壳聚糖；
具体来说，所述步骤（1）包括以下步骤：
用水溶解HMG粗制品，调节溶液的pH值至4.0-7.0；将HMG溶液上样至已平衡好的阴离子交换层析柱；以pH值为4.0-7.0 的0.02M PB溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；收集上样流出液和洗涤流出液，所得溶液即为中间体I。
具体来说，所述步骤（2）包括以下步骤：
将中间体I的溶液上样至已平衡好的阳离子交换层析柱；以pH 值为4.0-6.0 的0.1M 醋酸-醋酸钠（HAc-NaAc）溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用pH 值为4.0-6.0的含0.1-0.5M NaCl的0.1M HAc-NaAc溶液洗脱，收集洗脱液，并检测洗脱液在280nm 处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为中间体II。
具体来说，所述步骤（3）包括以下步骤：
将中间体II的溶液上样至已平衡好的染料亲和层析柱；以pH 值为6.0-9.0 的0.1M NaAc溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再以pH 值为8.0-10.0 的含0.8-2.5M KCl 的0.02M PB溶液洗脱，收集洗脱液，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为高纯度尿促性素溶液。
优选地，向所述步骤(1)或(2)或(3)获得的产物中加入乙醇，例如95%乙醇进行沉淀；然后用无水乙醇脱水，再进行干燥，例如真空干燥。
优选地，所制备高纯度尿促性素比活性高于6000IU/mg蛋白质，优选地，比活性高于8000IU/mg蛋白质。另外，其中FSH:LH比值为1:0.6～1:1.4，优选地，其比值为1:1。
本发明以HMG为起始原料，依次采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、染料亲和层析工艺，提取纯化制得高纯度HMG。其中，利用蛋白质两性电离的性质，通过改变溶液pH，使蛋白质带上不同电荷，经过阴离子交换层析与阳离子交换层析，HMG纯化倍数可达60倍以上。利用FSH及LH能与染料亲和吸附的性质，进一步去除杂质蛋白。经过3步层析工艺，使HMG纯化倍数达到500倍以上，从而获得高纯度尿促性素，其中FSH与LH比例约为1:1。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为实施例1制备的高纯度尿促性素成品的HPLC图谱。
图3为实施例2制备的高纯度尿促性素成品的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明涉及的生物效价、比活性及纯度的测定及计算方法。
生物效价测定：
FSH、LH生物效价测定按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1216及1217检测。
比活性测定：
精密称取本品约20mg，精密加入水1ml使溶解；另精密称取牛血清白蛋白对照品，加水溶解制成每1ml中分别含1.0mg、0.8mg、0.6mg、0.4mg、0.2mg、0mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0401），分别在280nm的波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白溶液的浓度为横坐标，在280nm的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，吸光度和浓度关系应呈线性。从标准曲线上求得供试品溶液的蛋白浓度，按下式计算比活：
HPLC纯度测定：
取本品适量，加水制成每1ml中约含500IU FSH的溶液作为供试品溶液。照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法试验。采用凝胶色谱柱 Superdex75；以磷酸盐缓冲液（取85%H3PO46.74ml，加水800ml，再加Na2SO4 14.2g，用50%NaOH调pH至6.7，用水定容为1000ml）；柱温30℃；流速0.5ml/min；检测波长214nm；进样量100μl。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
如图１所示，将HMG粗制品（本公司生产，批号Z0203160701）作为起始原料，其FSH生物效价为10IU/mg，LH生物效价为9IU/mg，FSH比活性为16IU/mg蛋白质。
1. Capto DEAE 阴离子交换层析
用1000ml水溶解60g HMG粗制品，调节溶液的pH值至5.0，将此溶液上样至柱体积为1250ml的Capto DEAE层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液（0.02M PB，pH5.0）平衡好；FSH和LH不能吸附，直接流穿，收集上样流穿液，上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，与上样流穿液合并收集。并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；此收集液即为中间体I。
2. CM-Sepharose 阳离子交换层析
中间体I用6KD的超滤膜浓缩至约100ml，调整pH及电导率与CM-Sepharose 阳离子交换层析平衡液一致，上样至柱体积为120ml的 CM-Sepharose 层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.1M HAc-NaAc+0.2M NaCl，pH5.5）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液460ml，即为中间体II。
3. Capto Blue (high sub)染料亲和层析
将中间体II 460ml调节pH及电导率与平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）一致，上样至已平衡好的柱体积为35ml的Capto Blue (high sub) 层析柱（购自GE公司）；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+1.5M KCl，pH 9.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液70ml，即为高纯度尿促性素。
将高纯度尿促性素溶液用截留分子量为6KD的超滤膜超滤浓缩后，用0.01M PB缓冲溶液(pH 6.0)换盐3次，按照3%（w/v）的比例添加乳糖配制成冻干原液，冷冻干燥后得到0.84g高纯度尿促性素成品，成品相关参数见表1，产品的HPLC图谱如图2所示。
表1 实施例1制备的高纯度尿促性素成品参数
实施例2
将低纯度HMG（本公司生产，批号Z0203160801）作为起始原料，其FSH生物效价为11IU/mg，LH生物效价为12IU/mg，FSH比活性为17IU/mg蛋白质。
1. Capto DEAE 阴离子交换层析
用3000ml水溶解180g HMG粗制品，调节溶液的pH值至5.0，将此溶液上样至柱体积为3800ml的Capto DEAE层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液（0.02M PB，pH5.0）平衡好；FSH和LH不能吸附，直接流穿，收集上样流穿液，上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，与上样流穿液合并收集。并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；此收集液即为中间体I。 共收集中间体I 15.3L，用截留分子量为6KD的超滤膜浓缩至约1500ml，加入预冷至-20℃的95%乙醇至乙醇浓度为85%，搅拌均匀后静置过夜沉淀蛋白，次日离心收集沉淀，加入无水乙醇脱水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中间体I 14.85g。
2. CM-Sepharose 阳离子交换层析
中间体I用约400ml平衡液溶解（0.1M HAc-NaAc，pH5.5），调整pH及电导率与CM-Sepharose 阳离子交换层析平衡液一致，上样至柱体积为360ml的 CM-Sepharose 层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.1M HAc-NaAc+0.2MNaCl，pH5.5）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液1400ml，即为中间体II。
3. Capto Blue (high sub)染料亲和层析
将中间体II 调节pH及电导率与平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）一致，上样至已平衡好的柱体积为100ml的Capto Blue (high sub) 层析柱（购自GE公司）；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+1.5M KCl，pH 9.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液220ml，即为高纯度尿促性素。
将高纯度尿促性素溶液用截留分子量为6KD的超滤膜超滤浓缩后，用0.01M PB缓冲溶液(pH 6.0)换盐3次，按照3%（w/v）的比例添加乳糖配制成冻干原液，冷冻干燥后得到2.4 g高纯度尿促性素成品，成品相关参数见表1，产品的HPLC图谱如图2所示。
表1 实施例1制备的高纯度尿促性素成品参数
Claims (4)
1.一种高纯度尿促性素的制备方法，该制备方法为：
(1)人绝经期促性腺激素(Human Menopausal Gonadotropin，HMG)粗制品经过阴离子交换层析纯化，得到中间体I；包括以下步骤：用水溶解HMG粗制品，调节溶液的pH值至5.0；将HMG溶液上样至已用pH值为5.0的0.02M PB溶液平衡好的阴离子交换层析柱；以pH值为5.0的0.02M PB溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；收集上样流出液和洗涤流出液，所得溶液即为中间体I；所述阴离子交换层析柱为Capto DEAE阴离子交换层析柱；
(2)中间体I经过阳离子交换层析纯化，得到中间体II；包括以下步骤：将中间体I的溶液调节pH至5.5，再上样至已用pH值为5.5的0.1M醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)溶液平衡好的阳离子交换层析柱；以pH值为5.5的0.1M醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用pH值为5.5的含0.2M NaCl的0.1M HAc-NaAc溶液洗脱，收集洗脱液，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为中间体II；所述阳离子交换层析柱为CM-Sepharose阳离子交换层析柱；
(3)中间体II经过染料亲和层析纯化，得到高纯度尿促性素溶液；包括以下步骤：将中间体II的溶液调节pH至7.0，上样至预先用pH值为7.0的0.1M NaAc溶液平衡好的染料亲和层析柱；以pH值为7.0的0.1M NaAc溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再以pH值为9.0的含1.5M KCl的0.02M PB溶液洗脱，收集洗脱液，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为高纯度尿促性素溶液；所述染料亲和层析柱为Capto Blue high sub染料亲和层析柱。
2.根据权利要求1所述一种高纯度尿促性素的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤(3)所得尿促性素溶液进行超滤，再用pH为5.5-7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液置换原缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述一种高纯度尿促性素的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将尿促性素溶液与冻干保护剂混合后冻干，冻干保护剂为乳糖，其添加量为3％-6％。
4.根据权利要求1所述一种高纯度尿促性素的制备方法，其特征在于，向步骤(3)所得的产物中加入95％乙醇进行沉淀；然后用无水乙醇脱水，再进行真空干燥。
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