CN113372433B - 纯化fsh方法 - Google Patents
纯化fsh方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113372433B CN113372433B CN202110272276.5A CN202110272276A CN113372433B CN 113372433 B CN113372433 B CN 113372433B CN 202110272276 A CN202110272276 A CN 202110272276A CN 113372433 B CN113372433 B CN 113372433B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- fsh
- chromatography
- liquid
- carrying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 64
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 31
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 30
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 24
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 45
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract description 8
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 62
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 62
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 61
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 239000013315 hypercross-linked polymer Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013621 viresolve pro solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及蛋白领域，具体的本发明提供了一种新的纯化FSH的方法，包括步骤：S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；S2)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；S3)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。本发明纯化方法制备所得的FSH蛋白收率高，亚基解离少，适用于商业应用。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白领域，具体涉及重组人促卵泡素的纯化方法。
背景技术
卵泡刺激素又称促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)，是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，受下丘脑分泌的促卵泡激素释放激素控制，FSH是一种异源二聚体糖蛋白，由非共价结合的α亚基和β亚基组成，一般认为α亚基主要负责信号传导，β亚基主要与生理功能有关，α亚基和β亚基单独都不具有生物活性，二者结合在一起引起结构变化，才具有生物活性，其生理功能是促使卵巢(或精巢)发育，促进卵泡(或精子)的生成和释放。
目前，中国市场产品主要有尿源性促排卵激素(P-FSH)和重组促排卵激素(rhFSH)，均能诱发排卵和促进精子生成。尿源性促排卵激素是从经绝后妇女尿中提取的人卵泡刺激素，因尿中提取的卵泡刺激素易受尿中LH(促黄体生成素)污染，影响疗效，尿源性促排卵激素(P-FSH)有逐渐被重组人FSH(rhFSH)所代替的趋势，这对重组人FSH的生产工艺提出了新的要求。
由于卵泡刺激素是有生物活性的异源二聚体糖蛋白，FSH的α亚基和β亚基在生产及储存过程中均可能产生亚基的解离，从而影响其活性。研究发现FSH对pH敏感，pH改变易发生亚基解离，失去生物活性。即便是现有技术中采用优化生产工艺制备卵泡刺激素，仍然无法很好去除卵泡刺激素的解离亚基。
因此，本领域需要开发一种满足生产要求，能够去除卵泡刺激素解离亚基的方法，同时能增加卵泡刺激素制剂的纯度，提高卵泡刺激素制剂的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种步骤简单，适合商业化大生产的，解离亚基少，产品收率高，产品纯度高的重组人FSH制备方法
在本发明的第一方面，提供了一种重组人FSH纯化方法，包括步骤：
S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S3)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。
在另一优选例中，所述步骤S1)中亲和层析包括步骤：
Q1)提供平衡缓冲液，所述FSH液体上样前用平衡缓冲液平衡层析柱；
Q2)重复步骤Q1)2-3次，得到第一样品；
Q3)提供淋洗液，用所述淋洗液淋洗第一样品，得到第二样品；
Q4)提供洗脱液，洗脱所述第二样品，收集洗脱液，得到所述第三样品。
在另一优选例中，所述平衡缓冲液为20mM PB，1～150mM NaCl。
在另一优选例中，所述淋洗优选为20mM Tris-HCl，1M NaCl(pH 7.2)。
在另一优选例中，所述步骤S2)中疏水层析包括步骤：将所述第三样品上样后进行梯度洗脱，收集洗脱液得到所述第四样品。
在另一优选例中，所述洗脱液缓冲液选自：20mM PB，1.25M(NH4)2SO4(pH7.0)；20mMPB(pH7.2)；或其组合。
在另一优选例中，所述疏水层析缓冲液为1.1M-1.4M(NH4)2SO4的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，优选(NH4)2SO4浓度为1.1M、1.2M、1.25M、1.3M、1.4M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)
在另一优选例中，所述梯度洗脱在紫外上升至50mAU后开始。
在另一优选例中，所述梯度洗脱在洗脱峰降至15mAU后停止。
在另一优选例中，所述第四样品蛋白回收率为97％。
在另一优选例中，所述第四样品解离亚基0.9％。
在另一优选例中，所述第四样品HCP残留量为16ppm。
在另一优选例中，所述步骤S3)中阴离子层析包括步骤：将所述第四样品上样后进行等度洗脱，收集洗脱液得到所述第五样品。
在另一优选例中，所述等度洗脱在紫外上升至10mAU后开始。
在另一优选例中，所述等度洗脱在洗脱峰降至5mAU后停止。
在另一优选例中，所述步骤S2)前；和/或步骤S3)前；和/或步骤S3)后，还包括步骤：将上一步所得的样品进行超滤换液。
在另一优选例中，包括步骤：将所述方法最后一步得到的纯化的重组FSH进一步纳滤，收集纳滤液，得到进一步纯化的重组FSH。
在另一优选例中，所述步骤S1)中的亲和层析介质为CaptureSelectTM FSHAffinity Matrix；和/或
所述步骤S2)中所述疏水层析介质为Phenyl HP；和/或
所述步骤S3)中所述阴离子层析介质为Gigacap Q-650M。
在另一优选例中，所述方法还包括选自下组的非层析步骤：离心过滤，深层过滤，透析过滤，纳滤，超滤，病毒灭活；
并且，所述方法至少包括一个病毒灭活步骤。
在本发明的第二方面提供了一种FSH，所述FSH由第一方面所述的方法制备。
在另一优选例中，所述FSH具有以下一个或多个特征：
T1)解离亚基小于1％；
T2)纯度大于99.9％；
T3)HCP残留小于5ppm；
T4)FSH蛋白收率大于85％。
在另一优选例中，所述解离亚基小于1％，较佳地小于0.8％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现一种新的制备rhFSH的方法。在此基础上，完成了本发明。
按照本发明的制备方法纯化所得的rhFSH解离亚基少，产品收率高，适应大规模的商业化生产。本发明的方法包括主要步骤：S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；S2)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；S3)将所述第四样品进行阴离子层析。本发明的步骤S1)中的亲和层析还包括反复平衡-上样-洗脱的步骤。
术语
如本文所用，“本发明的方法”、“本发明的制备方法”、“本发明的纯化方法”、“本发明的纯化FSH的方法”可互换使用，指的是包括特定步骤的重组人FSH纯化方法，所述步骤在下述术语“本发明的纯化方法”中有相关描述。
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
卵泡刺激素
卵泡刺激素又称促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)，是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，受下丘脑分泌的促卵泡激素释放激素控制，FSH是一种异源二聚体糖蛋白，由非共价结合的α亚基和β亚基组成，分子量24 000～35 000。人FSH含16％碳水化合物(半乳糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖、海藻二糖和N-乙酰神经氨酸等)。
亲和层析
将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后用适当的洗脱液，将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。
疏水层析
疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。
阴离子层析
离子交换层析中，层析基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
蛋白收率
即蛋白纯化收率，收率是指纯化步骤后目标蛋白量和纯化前一目标蛋白量的比率。
解离亚基
FSH是一种异源二聚体糖蛋白，由非共价结合的α亚基和β亚基组成，未结合的亚基即解离亚基。
HCP残留即宿主细胞蛋白残留，包括宿主细胞的蛋白或多肽。
本发明的纯化方法
本发明提供了一种纯化FSH的方法，包括步骤：
S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S3)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。在另一优选例中，本发明的方法包括步骤：
S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S3)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S4)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S5)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。在另一优选例中，本发明的方法包括步骤：
S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S3)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S4)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S5)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。
S6)将上一步所得的样品进行超滤换液。
在另一优选例中，本发明的方法包括步骤：
S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S3)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S4)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S5)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。
S6)将上一步所得的样品进行纳滤。
在另一优选例中，本发明的方法包括步骤：
S1)提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S3)将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S4)将上一步所得的样品进行超滤换液；
S5)将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH。
S6)将上一步所得的样品进行超滤换液。
S7)将S6)最后一步得到的纯化的重组FSH进一步纳滤，收集纳滤液，得到进一步纯化的重组FSH。
在另一优选例中，所述步骤S1)中的亲和层析介质为CaptureSelectTM FSHAffinity Matrix；和/或
所述步骤S2)中所述疏水层析介质为Phenyl HP；和/或
所述步骤S3)中所述阴离子层析介质为Gigacap Q-650M。
在另一优选例中，所述方法还包括选自下组的非层析步骤：离心过滤，深层过滤，透析过滤，纳滤，超滤，病毒灭活；
并且，所述方法至少包括一个病毒灭活步骤。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的制备方法纯化所得的重组人FSH(rhFSH)亚基含量少，仅为总体含量的1％。
(b)通过本发明的方法制备的rhFSH的活性高；目标蛋白收率高。
(c)本发明的制备方法层析步骤少，减少样品暴露时间，操作环境相对密闭，适宜商业化大生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例中使用的物料
本发明使用的FSH液体浓度为20-100mg/L。购自上海景泽生物技术有限公司，FSH液体为CHO细胞表达的发酵液，经过离心后收集的液体。所用FSH液体为pH值3.5-3.6，孵育60min后的FSH液体，SEC-HPLC测定FSH液体解离亚基4.7％，孵育后回调pH至7.2。
实施例1制备本发明的rhFSH
1.1亲和层析
具体操作步骤为，“20mM PB，150mM NaCl”(pH 7.2)平衡液平衡亲和层析介质CaptureSelectTM FSH Affinity Matrix(Thermo)，
FSH液体上样，
20mM PB，150mM NaCl(pH 7.2)平衡液第一次平衡，
20mM Tris-HCl，1M NaCl(pH 7.2)中淋洗，
20mM PB，150mM NaCl(pH 7.2)平衡液第二次平衡，
20mM Tris-HCl，2M MgCl2(pH 7.2)进行洗脱，收集洗脱液：紫外上升至75mAU开始收集洗脱液，洗脱峰降至25mAU后停止收集洗脱液。收集的洗脱液即步骤1亲和层析洗脱液，SEC-HPLC测定解离亚基1.3％，此步骤蛋白回收率91％，纯度98.2％，HCP残留量为28ppm。
1.2超滤换液
选取PALL(10KD)进行超滤换液，置换液为20mM PB(pH7.2)，将步骤1.1亲和洗脱液体积浓缩至原来的1/2左右，测定滤出液的pH位于7.0-7.4时，停止换液。
1.3疏水层析
具体操作步骤为：
步骤1.2液体上样于20mM PB，1.25M(NH4)2SO4，pH7.0平衡好的层析介质Phenyl HP(GE)，进行梯度洗脱，洗脱缓冲液为
Buffer A：20mM PB，1.25M(NH4)2SO4，pH7.0；
Buffer B：20mM PB，pH7.2
0-100％Buffer B进行梯度洗脱。洗脱体积为20CV。
紫外上升至50mAU后开始收集洗脱液，洗脱峰降至15mAU后停止收集洗脱液。收集的洗脱液即步骤1.3疏水层析洗脱液，SEC-HPLC测定解离亚基0.9％，此步骤蛋白回收率97％，HCP残留量为16ppm。
1.4超滤换液
用PALL(10KD)膜包进行超滤换液，将步骤1.3疏水层析洗脱液浓缩并置换到10mMPB(pH7.2)缓冲液中。将步骤1.3疏水层析洗脱液体积浓缩至原来的1/2左右，测定滤出液的pH位于7.0-7.4时，停止换液。
1.5阴离子层析
层析介质为Gigacap Q-650M(TOSOH)
步骤1.4超滤浓缩液上样于用10mM PB(pH7.2)平衡好的层析介质上，用50％Buffer B等度洗脱(Buffer A：10mM PB，pH7.2；Buffer B：10mM PB，1M NaCl，pH7.2)，紫外上升至10mAU后收集洗脱液，洗脱峰降至5mAU后停止收集洗脱液。SEC-HPLC测定解离亚基0.8％，此步骤蛋白回收率97％，HCP残留低至7ppm。
1.6纳滤
选择Millipore公司的双层聚醚砜膜Viresolve ProModus 1.2进行纳滤，收集纳滤液。经过工艺验证，该步骤狂犬病毒、小鼠白血病病毒的去除率降低4.5个log以上。
表1实施例1纯化的rhFSH检测结果
实施例2
本实施例使用的FSH液体为pH值3.8孵育60min后的FSH液体，孵育后回调pH至7.2，SEC-HPLC测定解离亚基2.3％，FSH液体浓度为55mg/L。
按照实施例1的步骤制备本实施例的rhFSH,区别在于被实施例的FSH液体是pH值选定为3.8孵育60min后的液体，孵育后回调pH至7.2，SEC-HPLC测定解离亚基2.3％，FSH液体浓度为55mg/L。
表2实施例2纯化的rhFSH检测结果
实施例3
FSH液体为pH3.8孵育60min后的FSH液体，孵育后回调pH至7.2，SEC-HPLC测定解离亚基2.3％，FSH液体浓度为55mg/L。
按照实施例1的步骤制备本实施例的rhFSH，区别在于增加步骤7为超滤换液
步骤7具体为：用PALL(10KD)膜包进行超滤换液，将步骤6纳滤收集液浓缩并置换到10mM PB(pH7.2)缓冲液中。测定滤出液的pH位于7.0-7.4时，停止换液。
表3实施例3纯化的rhFSH检测结果
参照实施例1，发明人把层析步骤进行了次序调换，步骤具体条件不变，如下：
对比例1
(1)亲和层析
(2)超滤换液
(3)阴离子层析
(4)超滤换液
(5)疏水层析
(6)超滤换液
对比例2
(1)阴离子层析
(2)超滤换液
(3)亲和层析
(4)超滤换液
(5)疏水层析
(6)超滤换液
对比例1和2纯化步骤测得的rhFSH结果
测试对比例1和对比例2纯化的rhFSH，对比发现，其解离亚基去除率均小于本发明方法，而蛋白总收率方面只有本发明方法纯化的rhFSH的85％左右，且外源性DNA残留量远远高于本发明方法纯化的rhFSH的。
讨论
如现有的技术通过凝胶过滤层析去除解离亚基，去除效果有限，且凝胶过滤层析对株高和柱效要求高，不利于商业化大生产。尤其近年来，国家监管部门出台《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，蛋白分离纯化步骤中必须要有除层析以外的病毒去除/灭活步骤，而低pH值灭活病毒会导致FSH亚基的解离，解离亚基根据作用pH值和孵育时间，占2-15％不等，更加需要对其进行监控和科学去除。
本发明的具体步骤主要如下：
1.亲和层析
此步骤用于捕获发酵液里面的目标蛋白。经过一系列条件摸索和条件优化，发现亲和层析介质为CaptureSelectTM FSH Affinity Matrix(Thermo)捕获的目标蛋白最多。在具体亲和层析操作步骤中，发现常规层析步骤如平衡-上样-洗脱步骤，经过平衡液和洗脱液的优化筛选，目标蛋白纯度介于97-98％，蛋白收率介于75-78％之间，但是HCP高达300ppm。本实施例的亲和层析步骤中，在上样步骤后增加平衡步骤,淋洗后增加平衡步骤再进行洗脱，使得目标蛋白的纯度高于98％(包括解离亚基)，目标蛋白收率超过85％，HCP残留低于30ppm。
2.超滤换液
步骤1亲和层析洗脱液的缓冲体系为“氯化镁、磷酸盐”等的复杂溶液体系，浓度超过一定限度，会发生沉淀导致层析系统压力过大，实验无法正常进行，因此对步骤1亲和层析洗脱液进行超滤换液，便于后续层析实验。
3.疏水层析
此步骤用于去除部分产品相关杂质和工艺相关杂质。用1M(NH4)2SO4，进行梯度洗脱，蛋白回收率为90％。
选取Phenyl HP(GE)作为疏水层析介质。因为步骤1亲和层析洗脱液有一定的盐浓度，考虑步骤间的衔接和实际效果，将疏水层析置于亲和层析之后，直接向亲和层析洗脱液中加入(NH4)2SO4至上样浓度，作为疏水层析上样样品，操作简便，效果显著。
经过试验发现用(NH4)2SO4缓冲液作为洗脱液，疏水层析后蛋白回收率高，经过对(NH4)2SO4缓冲液浓度进一步筛选，发现(NH4)2SO4终浓度为0.5M或者0.7M时，目标蛋白发生沉淀，目标蛋白回收率低于30％，(NH4)2SO4终浓度为1M时，目标蛋白回收率为91％。(NH4)2SO4终浓度为1.6M时，目标蛋白回收率为89％。(NH4)2SO4终浓度为1.1M、1.2M、1.25M、1.3M、1.4M时蛋白回收率高于其他浓度。即(NH4)2SO4终浓度1.1％-1.4％，蛋白回收率最高。
4.超滤换液
5.阴离子层析
此步骤的离子层析主要去除电荷异质体和部分解离亚基。
6.纳滤
按照上述顺序进行的本发明的方法制备的rhFSH的蛋白收率能够达到86％以上，而现有技术的纯化方法一般只能达到70％左右。
本发明的方法制备的rhFSH的解离亚基<小于1％，较佳地<0.5％，更佳地<0.1％。，而现有技术的纯化方法一般只能达到3％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种重组人FSH纯化方法，其特征在于，包括步骤：
S1）提供FSH液体，将所述FSH液体进行亲和层析，得到第三样品；
S2）将所述第三样品进行疏水层析得到所述第四样品；
S3）将所述第四样品进行阴离子层析，得到所述纯化的重组人FSH；
所述步骤S1）中亲和层析包括步骤：
Q1）提供平衡缓冲液，所述FSH液体上样前用平衡缓冲液平衡层析柱；
Q2）重复步骤Q1）2-3次，得到第一样品；
Q3）提供淋洗液，用所述淋洗液淋洗第一样品，得到第二样品；
Q4）提供洗脱液，洗脱所述第二样品，收集洗脱液，得到所述第三样品；
所述步骤S2）前、步骤S3）前、步骤S3）后，还包括步骤：将上一步所得的样品进行超滤换液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1）中的亲和层析介质为CaptureSelectTM FSH Affinity Matrix。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2）中所述疏水层析介质为PhenylHP。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括步骤：将所述方法最后一步得到的纯化的重组FSH进一步纳滤，收集纳滤液，得到进一步纯化的重组FSH。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3）中所述阴离子层析介质为Gigacap Q-650M。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110272276.5A CN113372433B (zh) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | 纯化fsh方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110272276.5A CN113372433B (zh) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | 纯化fsh方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113372433A CN113372433A (zh) | 2021-09-10 |
| CN113372433B true CN113372433B (zh) | 2022-10-11 |
Family
ID=77569717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110272276.5A Active CN113372433B (zh) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | 纯化fsh方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113372433B (zh) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1809663B1 (en) * | 2004-11-09 | 2008-09-17 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
| CA2625978A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh or a fsh mutant |
| KR101761168B1 (ko) * | 2009-04-01 | 2017-07-25 | 바이오제너릭스 게엠베하 | 재조합 ｆｓｈ 정제 방법 |
| CN105461799A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 哈药集团技术中心 | 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法 |
-
2021
- 2021-03-12 CN CN202110272276.5A patent/CN113372433B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113372433A (zh) | 2021-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103379949B (zh) | 蛋白纯化方法 | |
| JP5948343B2 (ja) | トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを精製する方法 | |
| CN104672328B (zh) | 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法 | |
| CN109929027B (zh) | 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法 | |
| CN110241093A (zh) | 一种重组痘病毒的纯化方法 | |
| CN112266415A (zh) | 规模化生产凝血酶调节蛋白的方法 | |
| US4764279A (en) | Process for preparing the principal proteins of hemolyzed blood in the non-denatured form | |
| CN109879930B (zh) | 一种重组蛋白的纯化方法 | |
| CN105732738A (zh) | 一种妥布霉素的提纯方法 | |
| CN114181970A (zh) | 一种慢病毒载体纯化方法 | |
| CN115925890A (zh) | 一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法 | |
| CN109320611B (zh) | 一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法 | |
| CN113372433B (zh) | 纯化fsh方法 | |
| JP7312830B2 (ja) | 遺伝子改良水稲の子実から組換えヒトフィブロネクチンを分離精製する方法 | |
| CN109929038B (zh) | Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法 | |
| CN111057138A (zh) | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人生长激素的方法 | |
| CN113480632B (zh) | 一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺 | |
| CN114409765A (zh) | 抗体的纯化方法 | |
| CN114867740A (zh) | 纯化促卵泡激素的方法 | |
| EP3919613B1 (en) | Enhanced purification of adeno-associated virus to more effectively remove contaminating dna | |
| CN107033236A (zh) | 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法 | |
| CN113698494A (zh) | 纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法 | |
| CN114605515B (zh) | 高活性植物凝集素的分离纯化工艺 | |
| CN115058414B (zh) | 一种纯化质粒dna的方法 | |
| WO2024216791A1 (zh) | 一种腺病毒制品的纯化方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |