EA028065B1 - Способ очистки рекомбинантного фсг - Google Patents
Способ очистки рекомбинантного фсг Download PDFInfo
- Publication number
- EA028065B1 EA028065B1 EA201171199A EA201171199A EA028065B1 EA 028065 B1 EA028065 B1 EA 028065B1 EA 201171199 A EA201171199 A EA 201171199A EA 201171199 A EA201171199 A EA 201171199A EA 028065 B1 EA028065 B1 EA 028065B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fsh
- chromatography
- exchange chromatography
- anion exchange
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004271 weak anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 9
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 48
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 45
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 45
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 34
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 34
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 19
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 18
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 11
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 9
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 claims description 9
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 abstract description 153
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 abstract description 153
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 abstract description 152
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 7
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 101000893054 Homo sapiens Follitropin subunit beta Proteins 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- -1 dimethylaminoethyl Chemical group 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 5
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 5
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 4
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 4
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 3
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 2
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012610 weak anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSVFSAJIGAJDMR-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl(phenyl)amino]ethyl 5-(5,5-dimethyl-2-oxido-1,3,2-dioxaphosphinan-2-yl)-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3-carboxylate Chemical compound CC=1NC(C)=C(C(=O)OCCN(CC=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C(C=2C=C(C=CC=2)[N+]([O-])=O)C=1P1(=O)OCC(C)(C)CO1 NSVFSAJIGAJDMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101150096839 Fcmr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010058823 Ovarian mass Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100016886 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HES1 gene Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- QKSIFUGZHOUETI-UHFFFAOYSA-N copper;azane Chemical compound N.N.N.N.[Cu+2] QKSIFUGZHOUETI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229950003102 efonidipine Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000003751 purification from natural source Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу очистки рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) или варианта рекомбинантного ФСГ. Способ включает стадии анионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и хроматографии по сродству к красителю, причем способ не включает ни слабую анионообменную хроматографию, ни хроматографию с обращенной фазой, причем стадии осуществляют в приведенном выше порядке. Заявленным способом очистки получают высокий выход рекомбинантного ФСГ с необходимой степенью чистоты. Полученный ФСГ является чрезвычайно эффективным для лечения нарушений фертильности.
Description
Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) или варианта рекомбинантного ФСГ. Способ включает стадии, на которых жидкость, содержащая рекомбинантный ФСГ или вариант рекомбинантного ФСГ, подвергают анионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и хроматографии по сродству к красителю, причем способ не включает ни слабую анионообменную хроматографию, ни хроматографию с обращенной фазой, причем стадии осуществляют в приведенном выше порядке. В результате способа очистки получают высокий выход рекомбинантного ФСГ с необходимой степенью чистоты. Полученный ФСГ является чрезвычайно эффективным при профилактике и лечении заболеваний и медицинских показаниях, при которых препараты ФСГ считаются эффективным средством лечения.
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) продуцируется гонадотропными клетками передней доли гипофиза и выделяется в кровоток. ФСГ действует совместно с лютеинизирующим гормоном (ЛГ) при контроле созревания ооцитов у женщин и сперматогенеза у мужчин. И ФСГ, и ЛГ относятся к семейству гетеродимерных гликопротеинов, которые состоят из двух нековалентно связанных α- и βцепей, которые кодируются различными генами. И α-, и β-цепи являются гликозилированными. αсубъединица состоит из 92 аминокислотных остатков, в то время как β-субъединица состоит из 111 аминокислотных остатков, каждая из которых имеет два потенциальных аспарагин-связанных участка гликозилирования.
ФСГ человека используют для лечения женщин, страдающих отсутствием овуляции, для стимуляции множественной овуляции (суперовуляция) и при подготовке к искусственному оплодотворению, такому как ЭКО, ИКСИ, ΟΙΡΤ (перенос гамет в маточную трубу) или С1РТ. Кроме того, ФСГ человека используют для стимуляции созревания фолликулов у женщин с низкой или отсутствующей секрецией ФСГ, и для стимулирования сперматогенеза у мужчин, страдающих олигоспермией.
При стандартной схеме лечения для стимуляции овуляции, пациентке назначают ежедневные инъекции ФСГ или варианта (приблизительно от 75 до 450 МЕ ФСГ/день) в течение периода от приблизительно б до приблизительно 12 дней. При стандартной схеме лечения для контролируемой гиперстимуляции яичников, пациентке назначают ежедневные инъекции ФСГ или варианта (приблизительно от 150 до 600 МЕ ФСГ/день) в течение периода от приблизительно б до приблизительно 12 дней.
Для стимуляции сперматогенеза схема лечения с использованием 150 МЕ ФСГ три раза в неделю в комбинации с 2500 МЕ хорионического гонадотропного гормона человека (ЬСО) два раза в неделю была результативна для достижения повышения числа сперматозоидов у мужчин, страдающих гипогонадотропным гипогонадизмом.
До 1980-х годов основным источником человеческого ФСГ был ФСГ, присутствующий в моче, выделенный из мочи женщин детородного возраста. Далее, в 1990-х года была представлена очищенная форма высокочистого ФСГ, полученного из мочи, и в конечном итоге, рекомбинантный ФСГ был создан и широко распространен с 1998 года. С появлением метода рекомбинантных ДНК стало возможно синтезировать человеческий ФСГ в клеточных культурах, трансфецированных последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих α- и β-цепь. Последовательности ДНК, кодирующие α- и β-цепи и способы синтеза рекомбинантного ФСГ были раскрыты, например, в международной публикации АО 88/10270, АО 86/04589 и ЕР 0735139.
В настоящее время существуют два коммерческих продукта рекомбинантного человеческого ФСГ на рынке Германии, ΟΟΝΆΕ-Ρ® и Ритедои®, оба получены в результате экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих человеческие α- и β-цепи дикого типа в клетках яичника китайского хомячка (СНО).
Вследствие важности ФСГ при лечении нарушений фертильности, необходимо обеспечение рекомбинантным ФСГ высокой чистоты и высокой специфической активности. Лечение с помощью ФСГ требует многократных инъекций. Высокоочищенные препараты ФСГ можно вводить подкожно, что обеспечивает введение лекарства пациентом самостоятельно, без контроля врача, тем самым увеличивая удобство применения и соблюдение режима лечения пациентом.
В международной патентной заявке АО 2006/051070 А1, принадлежащей Агез Ттайтд 8.А., описан способ очистки рекомбинантного ФСГ, включающий следующие стадии: 1) хроматография по сродству к красителю, 2) хроматография гидрофобного взаимодействия; и 3) хроматография с обращенной фазой. Кроме того, в АО 2006/051070 А1 раскрыт способ очистки ФСГ, включающий стадии, на которых ФСГ подвергают 1) анионообменной хроматографии, 2) хроматографии по сродству к красителю, 3) хроматографии гидрофобного взаимодействия, 4) хроматографии с обращенной фазой и 5) анионообменной хроматографии.
Международная патентная заявка АО 2005/063811 А1, принадлежащая Агез Ттайтд 8.А., относится к способу очистки рекомбинантного человеческого ФСГ, включающему стадии (1) ионообменной хроматографии; (2) хроматографии с иммобилизированными ионами металла; и (3) хроматографии гидрофобных взаимодействий (Н1С).
В международной патентной заявке АО 2007/065918 А2, принадлежащей Агез Ттайтд 8.А., описан способ очистки ФСГ, включающий стадии хроматографии: хроматография по сродству к красителю, слабая анионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий и сильная анионо- 1 028065 обменная хроматография, которые могут быть выполнены в любом порядке.
Существует постоянная потребность в новых способах очистки рекомбинантного ФСГ и вариантов ФСГ. В частности, существует потребность в способах очистки, которые позволяют избежать осуществления стадий хроматографии с обращенной фазой. Кроме того, желательно иметь способ очистки, который не основан на иммуноаффинной хроматографии, но может быть осуществлен без этой дорогостоящей стадии.
В соответствии с настоящим изобретением, эта и дополнительные проблемы решены с помощью признаков, включенных в основной пункт формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления определены в зависимых пунктах формулы изобретения.
Целью изобретения является разработка нового, эффективного способа очистки рекомбинантного ФСГ или варианта рекомбинантного ФСГ.
В первом аспекте изобретение относится к способу очистки раствора рекомбинантного ФСГ человека или варианта рекомбинантного ФСГ человека, включающий стадии, которые осуществляют в следующем порядке:
анионообменной хроматографии; хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии по сродству к красителю, причем способ не включает ни слабую анионообменную хроматографию, ни хроматографию с обращенной фазой и причем анионообменную хроматографию осуществляют с использованием сильной анионообменной смолы, имеющей функциональные группы -Л+(СН3)3, или смолы, имеющей аналогичные характеристики,
Анионообменная хроматография (АЕС) основана на взаимодействиях заряд-заряд между белками в данном образце и зарядами, иммобилизированными на смоле. В анионообменной хроматографии связывающие ионы данных белков являются отрицательными, а иммобилизированная функциональная группа является положительной. Распространенными анионообменными смолами являются ^-смола, четвертичный амин и смола ΌΕΑΕ (ΌίΕΐ1ι\ΊΑηιίηοΕΐ1ιαΐ'Κ\ ДиЭтилАминоЭтан). Тем не менее, в большинстве случаев, стадия анионообменной хроматографии может быть осуществлена со всеми стандартными коммерчески доступными анионообменными смолами или мембранами. Анионообменные смолы могут быть использованы в виде предварительно залитых колонок. Альтернативно, колонки можно подготовить самостоятельно. За исключением обычных, не существует никаких специфических ограничений относительно емкости и конфигурации колонок. Специалист знает, что количество используемой анионообменной смолы зависит от общего содержания белка в жидкости клеточной культуры или любой другой жидкости, например, элюате, полученном на предшествующей стадии хроматографии, внесенной в колонку на стадии поглощения.
Предпочтительные примеры сильных анионообменных смол, которые могут быть использованы в целях изобретения, представляют собой сильные анионообменные смолы с четвертичным аммонием, известные в уровне техники как иКОзрйеге ^, С) 8ерйагозе НР и другие смолы, имеющие молекулы четвертичного аммония (^).
Характерными особенностями сильной анионообменной смолы иКОзрйеге С) являются следующие:
| Функциональная группа | -Ν+(ΟΗ3)3 |
| Общая ионная емкость Динамическая связывающая емкость | 120 мк экв/мл |
| 150 см/ч 180 мг/мл | |
| Транспортный противоион | 600 см/ч 125 мг/мл С1_ |
| Средний размер частиц | 120 мкм |
| Рекомендованный диапазон линейной скорости потока Химическая стабильность | 50-1200 см/ч |
1,0 М ИаОН (20°С) до 2000 часов 1,0 М НС1 (20°С) до 200 часов
Изменения объема рН 4-10 <5%
0,01-1,0 М ИаС1 <5% рН стабильности 1-14
Характерными особенностями сильной анионообменной смолы С) 8ерйагозе НР являются следующие:
- 2 028065
Ионная емкость
Динамическая емкость
Рекомендованная скорость потока Макс.давление на фильтрующий наполнитель в течение процесса Предельное давление на конструктивные элементы колонки
НФЬоаД
Средний размер частиц
Эксклюзионный предел (Мг)
Матрица рН стабильности
Химическая стабильность
0,14-0,20 ммоль С1_/мл 70 мг ВЗА/мл среды 30-150 см/ч бар (42 фунта на кв.дюйм, 0,3 МПа) бар (73 фунта на кв.дюйм, 0,5 МПа)
4 мкм приблизительно 4х106 глобулярный белок поперечносшитая агароза,
6%
2-12 (рабочий и долгосрочный) ,
1-14 (краткосрочный) стабильна во всех распространенных буферах
Предпочтительно избегать использования слабых анионообменных смол, например тех, в основе которых в качестве функциональных групп присутствуют диэтиламиноэтил (ИЕАЕ) или диметиламиноэтил (ЭМАЕ).
Стадию анионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют с использованием буфера, который имеет слабощелочное значение рН, например, приблизительно от 7,0 до приблизительно 9,0, или приблизительно от 7,5 до приблизительно 8,5. Подходящие буферы включают, например, боратный буфер, триэтаноламин/иминодиуксусная кислота Тп§, уксуснокислый аммоний, трицин, бицин, ТЕЗ, НЕРЕЗ, ТАРЗ. Предпочтительным является использование буфера Τπδ. Элюирование из анионообменной смолы обычно осуществляется посредством увеличения проводимости подвижной фазы вследствие добавления соли, предпочтительно хлорида натрия.
Из методов по изобретению, хроматография гидрофобных взаимодействий (Н1С) может быть осуществлена с использованием Н1С-смолы, имеющей относительно умеренно гидрофобную поверхность (по сравнению с более сильной гидрофобной поверхностью смолы для обращенной фазы). Белки со свойствами гидрофобной поверхности притягиваются к таким смолам, которые обычно имеют эфирные, фенильные, бутильные или гексильные группы.
Н1С может быть осуществлен со всеми распространенными коммерчески доступными Н1Ссмолами. Н1С-смолы, которые могут быть использованы в целях изобретения, включают такие матрицы, как Бутил, Фенил, Пропил или Октил Сефароза, ЗОИКСЕ 15 (все имеются в наличии у СЕ НеаИйеаге, Сегшапу), Масго-Ргер Ме1йу1 или ί-бутил Н1С носитель (Βίο-Каб, Сегтапу) или Ргас1оде1 ЕМИ с пропильным или фенильным лигандами (Мегск АС, Сегтапу), смолы Тоуореаг1 Н1С, такие как Тоуореаг1 Ви1у1 650 М и аналогичные Н1С-смолы (Τοδοй В^шепсе).
В предпочтительном варианте осуществления хроматография гидрофобных взаимодействий осуществлена с использование смолы, состоящей из гранул перекрестно-сшитой агарозы, дереватизированных с фенильной, бутильной или октильной группами, или смолы, имеющей аналогичные характеристики. Ниже представлены характеристики фенил сефарозы 6 РР (Рйепу1 Зерйа^οδе 6 РР) (имеется в наличии у СЕ НеаИйеаге).
- 3 028065
| Плотность лиганда | |||||||
| РПепу1 ЗерПагозе™ | 6 | РазП | Ρίονί | (Ιονί | зиЬ) | 25 мкмоль/мл | среды |
| РПепу! ЗерПагозе™ | 6 | РазП | Ρίονί | (ПФдП | зиЬ) | 40 мкмоль/мл | среды |
| Связывающая способность | |||||||
| РПепу1 ЗерПагозе™ | 6 | РазП | Ρίονί | (Ιον | зиЬ) | 10 мг 1дС/мл | среды |
| 24 мг НЗА/мл | среды | ||||||
| РПепу! ЗерПагозе™ | 6 | РазП | Ρίονί | (ПФдП | зиЬ) | 30 мг 1дС/мл | среды |
| 36 мг НЗА/мл | среды | ||||||
| Давление/спецификация обработки | 200-400 см/ч, 1 | ||||||
| бар ХК | 50/60 | ||||||
| колонка, толщина | |||||||
| слоя 25 см | |||||||
| рН стабильности | 2-14 | : (короткое время), | 3-13 |
Химическая стабильность (длительное время)
Стабильна в распространенных буферах, хаотропных агентах, детергентах и полярных органических растворителях.
0 мкм
20% этиловый спирт от 4 до 30°С
Средний размер частиц Хранение
Температура хранения
Связывание на Н1С-смоле обеспечивается в буфере с высокой проводимостью, достигнутой посредством добавления соли (например, ЫаС1, (ΝΗ4)23θ4 или Ыа2ЗО4). Элюирование на стадии Н1С обычно выполняют посредством снижения проводимости подвижной фазы (то есть, снижая концентрацию соли), используя буфер, имеющий значение рН от приблизительно 5 до приблизительно 9, более предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 8, наиболее предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 8.
Равновесные, отмывочные и элюирующие буферы могут включать все типы буферов, обычно используемые для Н1С. Таким образом, буферные вещества включают фосфат натрия, ацетат натрия, Тпз/НС1, НЕРЕЗ, или другие буферные вещества. Более того, буферы могут содержать от 0,5 мМ до 3 М №С1, КС1 или другие подходящие соли, в зависимости от того, используется ли этот буфер для уравновешивания, отмывки или элюирования. Равновесные и отмывочные буферы содержат более высокие концентрации вышеупомянутых солей, чем буферы для элюирования.
Чрезвычайно предпочтительным буфером на стадии Н1С является буфер Тпз/НС1, содержащий хлорид натрия.
Из методов по изобретению, хроматография по сродству к красителю может быть осуществлена с использованием смолы, имеющей в качестве иммобилизованного лиганда состав красителя, который хорошо известен специалисту в уровне техники, а именно, СЛасгоп В1ие БЗС-А. Термин иммобилизованный хорошо понятен специалисту и означает, что лиганд дериватизирован в том смысле, что химически связан со смолой.
В предпочтительном варианте осуществления хроматографию по сродству к красителю осуществляют с СЛасгоп В1ие БЗС-А в качестве лиганда, ковалентно соединенного с любым матриксом, например с агарозным матриксом. Предпочтительно, хроматографию по сродству к красителю осуществляют с использованием смолы, известной как В1ие Зерйагозе ББ (имеется в наличии у СЕ НеаЙБсаге, Сегтапу). Технические характеристики В1ие Зерйагозе ББ представлены далее:
- 4 028065 сыворотки
Лиганд
Метод связывания лиганда
Связывающая способность
Плотность лиганда Матрикс
Средний размер частиц рН стабильности
Хранение
Температура хранения Химическая стабильность
СПоасгоп В1ие ГЗС-А Связывание с триазином >18 мг альбумина человека/мл среды ~7 мкмоль СФЬасгоп В1ие/мл среды Агароза с высокой поперечных связей, 6%
0 мкм
4-12 (длительное время),
3-13 (короткое время)
20% этиловый спирт, 1 М фосфатный буфер, рН 8,0 от С до 30°С
40°С в течение 7 дней частотой
70% этиловом спирте, 6 М гидрохлориде гуанидина, 8 М мочевине
Подразумевается, что метод хроматографии по сродству к красителю по изобретению можно осуществить с альтернативными смолами, имеющими аналогичные характеристики. Примеры альтернативных смол включают Тоуореаг1 АЕ-Ыие-НС-650М (ТозоЬ ВюзОепсез), В1ие СеШЬгц ВщВеаб (81его§епе), 8\уе11Сте1 В1ие (Иегсе), СФасЬгоше Ыие ЗОА-адагозе 100 (Зщша), Айт-Ое1 В1ие (Вю-Каб), Есопо-Рас Ыие сагйтбдез (Вю-Каб), СФасгоп В1ие ЗОА (51§ша).
Элюирование на стадии хроматографии по сродству к иммобилизованному красителю предпочтительно осуществляют с использованием буфера ТП8/НС1 или фосфатного буфера. Наиболее предпочтительным является буфер ТП8/НС1, содержащий хлорид натрия. Значение рН элюента предпочтительно составляет от приблизительно 7 до приблизительно 9, наиболее предпочтительно значение рН находится в диапазоне между 7 и 8.
В другом аспекте способ очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ по настоящему изобретению включает стадии, на которых жидкость, содержащая указанный ФСГ или вариант ФСГ, подвергают, в указанном порядке:
анионообменной хроматографии; хроматографии гидрофобных взаимодействий; хроматографии по сродству к красителю и кроме того, катионообменной хроматографии, причем способ позволяет избежать применения любой слабой анионообменной хроматографии, а также и любой хроматографии с обращенной фазой.
Катионообменная хроматография (СЕС) основана на взаимодействиях заряд-заряд между белками в образце и зарядами, иммобилизованными на смоле. При катионообменной хроматографии связывающие ионы белков являются положительными, а иммобилизованная функциональная группа является отрицательной. Распространенными катионообменными смолами являются δ-смола, производные сульфатов, и СМ (карбоксиметил) смолы, карбоксилсодержащие производные ионы.
Тем не менее, в большинстве случаев, катионообменную хроматографию можно осуществить со всеми распространенными коммерчески доступными катионообменными смолами или мембранами. Катионообменные смолы могут быть использованы в виде предварительно залитых колонок или мембран, на которых зафиксирована данная функциональная группа, например, сульфоновая кислота. Альтернативно, колонки можно подготовить самостоятельно. За исключением обычных, не существует никаких специфических ограничений относительно емкости и конфигурации колонок. Специалист знает, что количество используемой катионообменной смолы зависит от общего содержания белка в жидкости клеточной культуры или любой другой жидкости, например, элюате, полученном на предшествующей стадии хроматографии.
Стандартные катионообменные смолы, которые можно использовать в целях изобретения, имеются в наличии у ОЕ НеаЙЬсаге и других производителей устройств и колонок для ионообменной хроматографии. Обычно, СЕС осуществляется с использованием буферов, которые имеют значение рН от 4 до 7.
В предпочтительном варианте осуществления, стадию катионного обмена по изобретению осуществляют в виде мембранного катионного обмена. Предпочтительно, стадию катионного обмена выполняют с использованием сильного кислотного катионного обменника, сульфоновой кислоты, зафиксированного на мембране, или обменника, имеющего аналогичные характеристики.
Подходящие мембранные адсорберы для использования на стадии катионного обмена по изобретению известны в уровне техники и имеются в наличии у нескольких поставщиков. Например, катионооб- 5 028065 менная хроматография по изобретению может быть осуществлена с использованием мембраны, полученной из регенерированной целлюлозы, и имеющей хроматографический матрикс из сульфоновой кислоты, сформированной на целлюлозном каркасе. Примером эффективного мембранного адсорбера являются мембранные адсорберы 8аг!оЪтб 8, выпускаемые компанией 8аг!огш5. Технические характеристики мембранных адсорберов 8аг!оЪтб 8 представлены ниже.
Название
ЗагбоЫпб 31пд1е3ер® (сильный кислотный катионный обменник 3) сульфоновая кислота (Н-СН2-30з_)
Лиганд
Статическая связывающая >0,8 мг/см2 (29 мг/мл), измерена с бычьим сывороточным альбумином и лизоцимом куриного яйца 4-6 мкэкв/см2 стабилизированная целлюлоза с повышенной прочностью 275 мкм >3 мкм номинальное количество способность
Ионная емкость
Мембрана
Вещество основы
Плотность мембраны Номинальный размер пор
Капсула
Конструкция
Толщина слоя: Вещество капсулы Макс, давление рН стабильности Хранение Химическая стабильность
Цилиндрическая, слоев: 15 мм
Полипропилен (ΓΌΑ)
0,4 МПа (4 бар, 58 фунт/кв.дюйм)
3-14 (короткий срок)
Утилизировать после одного применения Стабильна в отношении всех обычно используемых в хроматографии буферов, 1 М ИаОН (30-60 мин при 20°С), 8 М мочевины, 8 М гидрохлорида гуанидина, этилового спирта, ацетона и 100% ацетонитрила. Избегать окислителей.
Стадия СЕС может быть осуществлена в соответствии с протоколом производителя. Например, буфер ТП5-ИС1 может быть использован при значении рН 7,0.
Было обнаружено, что стадия СЕС, предпочтительно, стадия катионного мембранного адсорбера, очищает белки клетки-хозяина всех размеров молекулярного порядка, и в то же время обеспечивает короткую продолжительность процесса. Выход продукции, приблизительно 95%, является очень благоприятным, поскольку ФСГ не связывается с адсорбером при значении рН 7,0.
В целом было обнаружено, что катионообменная хроматография на хроматографической мембране является очень эффективной при очистке рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ. Таким образом, в другом аспекте, изобретение относится к использованию катионного мембранного адсорбера в способе очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ. В предпочтительном варианте осуществления, катионный мембранный адсорбер представляет собой катионообменный адсорбер, предпочтительно сильный катионообменный адсорбер, полученный из регенерированной целлюлозы и имеющий хроматографический матрикс из сульфоновой кислоты, сформированной на данном целлюлозном каркасе. В другом аспекте способ очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ по изобретению включает стадии, на которых жидкость, содержащую указанный ФСГ или вариант ФСГ, подвергают анионообменной хроматографии; хроматографии гидрофобных взаимодействий; хроматографии по сродству к красителю; необязательно, катионообменной хроматографии и затем, дополнительной анионообменной хроматографии, причем способ позволяет избежать применения любой слабой анионообменной хроматографии, а также любой хроматографии с обращенной фазой.
В одном варианте осуществления эти стадии проводят в следующем порядке: первая анионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий, хроматография по сродству к краси- 6 028065 телю, необязательная катионообменная хроматография, и вторая анионообменная хроматография.
Вторая анионообменная хроматография может быть осуществлена с применением стандартных анионообменных смол, как указано выше применительно к данной первой анионообменной хроматографии. Также вторая анионообменная хроматография предпочтительно является сильной анионообменной хроматографией, осуществленной с использованием сильной анионообменной смолы, имеющей функциональные группы -Ы+(СН3)3, или смолы, имеющей аналогичные характеристики. Предпочтительные примеры сильных анионообменных смол, которые можно использовать в целях изобретения, представляют собой сильные анионообменные смолы на основе четвертичного аммония, известные в уровне техники как иЫОзрйеге О, О Зерйагозе НР и другие смолы, имеющие молекулы четвертичного аммония (О). Характеристики сильных анионообменных смол иКОзрЬегеЦ и О Зерйагозе НР приведены выше применительно к первой анионообменной хроматографии. Также на стадии второй анионообменной хроматографии предпочтительно избегать использования слабых анионообменных смол, например таких, которые основаны на диэтиламиноэтиле (ΌΕΆΕ) или диметиламиноэтиле (ΌΜΑΕ) в качестве функциональных групп.
Стадию анионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют с использованием буфера, который имеет среднещелочное значение рН, например, от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0 или от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,5. Подходящие буферы включают, например, боратный буфер, триэтаноламин/иминодиуксусная кислота Тпь уксуснокислый аммоний, трицин, бицин, ΤΕδ, ΗΕΡΕδ, ΤΑΡδ. Предпочтительным является использование буфера Тпз. Элюирование с анионообменной смолой обычно достигается посредством повышения проводимости подвижной фазы в результате добавления соли, предпочтительно хлорида натрия.
В одном варианте осуществления вторую анионообменную хроматографию осуществляют с использованием буфера Тг18-НС1/хлорид натрия в качестве элюента при значении рН от 7,0 до 9,0.
В другом аспекте способ очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ по изобретению включает стадии, на которых жидкость, содержащую указанный ФСГ или вариант ФСГ, подвергают анионообменной хроматографии; хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии по сродству к красителю, причем способ позволяет избежать применения любой слабой анионообменной хроматографии, а также любой хроматографии с обращенной фазой, и причем способ дополнительно включает стадию эксклюзионной хроматографии.
В другом аспекте способ очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ по изобретению включает стадии, на которых жидкость, содержащую указанный ФСГ или вариант ФСГ, подвергают анионообменной хроматографии; хроматографии гидрофобных взаимодействий; хроматографии по сродству к красителю; необязательной катионообменной хроматографии; необязательной дополнительной анионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии, причем способ позволяет избежать применения любой слабой анионообменной хроматографии, а также любой хроматографии с обращенной фазой.
В одном варианте осуществления эти стадии осуществляют в следующем порядке: анионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий, хроматография по сродству к красителю, необязательная катионообменная хроматография, необязательная дополнительная анионообменная хроматография и эксклюзионная хроматография.
В предпочтительном варианте осуществления, способ по изобретению включает следующие стадии в следующем порядке: первая анионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий, хроматография по сродству к красителю, необязательная катионообменная хроматография, необязательная вторая анионообменная хроматография, и эксклюзионная хроматография.
Экслюзионная хроматография (δΕΟ), также известная как гель-фильтрационная хроматография, представляет собой хроматографический метод, в котором частицы, например белки и другие биомолекулы, разделяются в соответствии с их размерами. Типичной гелевой средой для δΕΟ является полиакриламид, декстран, агароза или их смесь. δΕΟ-матриксы имеются в наличии у различных производителей оборудования и колонок для хроматографии, например, у Токой Вюкаепсе ЬЬС или ΟΕ НеаИйсаге.
Эксклюзионную хроматографию предпочтительно осуществляют с использованием матрикса из сферического соединения перекрестно-сшитой агарозы и декстрана.
Примерами пригодных матриц для эксклюзионной хроматографии являются матриксы, известные в уровне техники как δире^άеx 75 рд, имеющиеся в наличии, например, у ΟΕ НеаКйсаге. Колонки δире^άеx 75 рд обеспечивают высокочувствительное разделение белков, пептидов и других биомолекул в соответствии с их размерами. Как правило, колонки для эксклюзионной хроматографии являются идеальными на стадии доочистки в процессе очистки.
Технические детали матрикса δире^άеx 75 следующие:
- 7 028065
Эксклюзионный предел (Мг) Диапазон разделения (Мг) Матрикс
Средний размер частиц Химическая стабильность
1х105 глобулярный белок 3000-70000 глобулярный белок Сферическое соединение перекрестно-сшитой агарозы и декстрана
4 мкм
Стабилен во всех распространенных буферах: 1 М уксусная кислота, 8 М мочевина, 6 М гидрохлорид гуанидина, 30% изопропиловый спирт, 70% этиловый спирт, 1 М ИаОН (для очистки на месте) 3-12 (рабочий и долгострочный), 1-14 (краткосрочный)
Колонки Зирегбех™ 10/300 СЬ (Тггсогп)* рН стабильности
| Размеры слоя | 10 х 300 мм |
| Рекомендованный объем | 25-250 мкл |
| образца | |
| Объем слоя | 2 4 мл |
| Макс.давление | 18 бар (261 |
| МПа) | |
| Макс, скорость потока | |
| (Н2О при 25°С) | 1,5 мл/мин |
| Теоретические тарелки | >30000 м^1 |
| Колонки Зирегбех™ РС 3.2/30 | |
| Размеры слоя | 3,2 х 300 мм |
| Объем слоя | 2,4 мл |
| Рекомендованный объем | 2-25 мкл |
| образца | |
| Макс.давление | 24 бар (348 |
| МПа) | |
| Макс.скорость потока | |
| (Н2О при 25°С) | 0,100 мл/мин |
| Теоретические тарелки | >30000 м^1 |
| Хранение | 20% этиловый |
| Температура хранения | от 4 до 30 |
Стадия 5БС может быть осуществлена в соответствии с протоколом производителя. Например, натрий-фосфатный буфер можно использовать при значении рН от 6 до 8, предпочтительно при рН приблизительно 7,0.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, способ по изобретению включает следующие стадии в следующем порядке: первая анионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий, хроматография по сродству к красителю, катионообменная хроматография, вторая анионообменная хроматография и эксклюзионная хроматография.
В предпочтительном варианте осуществления стадию катионообменной хроматографии в способе по изобретению осуществляют на мембранном катионообменнике. Предпочтительно, катионообменную стадию проводят с сильным кислотным катионообменником сульфоновой кислотой, зафиксированной на мембране, или с обменником, имеющим аналогичные характеристики.
Кроме того, способ по изобретению включает одну или несколько стадий ультрафильтрации и/или нанофильтрации. Ультрафильтрация представляет собой вид мембранной фильтрации, при которой гидростатическое давление вытесняет жидкость через полупроницаемую мембрану. Взвешенные вещества и растворенные вещества с высокой молекулярной массой удерживаются, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества проходят через данную мембрану. Ультрафильтрация представляет
- 8 028065 собой распространенный способ разделения для очистки и концентрирования макромолекулярных растворов, в особенности белковых растворов. Ультрафильтрация является схожей с нанофильтрацией, однако они различаются по размерам удерживаемых молекул. В концепции настоящего изобретения, предпочтительным является изолирование молекулярного веса 10 кДа (10 кДа УФ). УФ-мембраны, кроме того, могут быть использованы для диафильтрации, для удаления солей и других микрочастиц из раствора посредством повторного или непрерывного разведения и реконцентрации.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения процесс очистки включает одну или несколько стадий ультрафильтрации/диафильтрации и/или нанофильтрации. Эти стадии фильтрации могут быть осуществлены с использованием коммерчески доступных фильтрационных устройств, например, имеющихся в наличии у ОЕ Неа1Шсаге или ЗаДопиз.
Ультрафильтрацию предпочтительно осуществляют с использованием кассет 8аг1осоп и кассет 8агЮсоп 8Нсе, выпускаемых фирмой ЗаДопиз.
Мембрана
Изолируемый молекулярный вес Фильтрующая поверхность Давление подачи рН стабильности
Рабочая температура
Очистка
Дезинфекция
Хранение
ПоЛИЭфирсуЛЬфОН (РЕЗИ) ИЛ1 Нубгозагб® кД от 0,02 до 0,7 м2 бар (58 фунт/кв.дюйм) максимум
1-14
50°С максимум, при 20°С 1 М ИаОН, 40°С 1 М ИаОН, 40-50°С, 30 мин 0,1 М ИаОН
Полиэфирсульфоновая мембрана (ΡΕδϋ), используемая в кассетах с перекрестным потоком, выпускаемых фирмой ЗаДопиз, представляет собой стабильный мембранный полимер, который имеет широкий спектр значений рН и температуры.
Также можно использовать ультрафильтрационные кассеты НубгозаД®, выпускаемые компанией ЗаДопиз. НубгозаД представляет собой мембрану на основе стабилизированной целлюлозы, которая была оптимизирована для биотехнологического применения. Ультрафильтрационные мембраны и кассеты НубгозаД доступны в следующих номинальных пределах молекулярной массы: 2, 5, 10 и 30 кД.
В предпочтительном варианте осуществления способ очистки включает стадию нанофильтрации. Нанофильтрация может быть осуществлена с использованием любого эффективного нанофильтрующего устройства. Нанофильтрацию предпочтительно осуществляют с использованием фильтров Р1апоуа, имеющихся в наличии у фирмы АзаЫ Казе1 Мебша1 Со., Ыб.
Фильтры Р1апоуа предназначены для удаления вирусов во время производства биотерапевтических готовых лекарственных форм, таких как биофармацевтические препараты. Они основаны на микропористой половолоконной мембране, созданной из целлюлозы, регенерированной гидрофильным медноаммиачным раствором, с узким распределением пор, фильтры Р1апоуа доступны в виде одноразовых автономных модулей в четырех средних размерах пор 15 нм, 19 нм, 35 нм, и 72 нм (Р1апоуа 15Ν, 20Ν, 35Ν и 75Ν, соответственно). В технологическом процессе по изобретению предпочтительным является использование фильтра Р1апоуа 15Ν, то есть фильтра, имеющего средний размер пор 15 нм. Фильтр используют в соответствии с протоколом поставщика.
Предпочтительно, чтобы способ очистки ФСГ по изобретению не включал металлоионную аффинную хроматографию.
Кроме того, также предпочтительно, чтобы способ по изобретению позволял избежать использование иммуноаффинной хроматографии. Очистка ФСГ без стадии иммуноаффинной хроматографии исключает возможность возникновения взаимодействия примесей или инфекционных агентов, полученных во время подготовки антитела, с соединением ФСГ.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу очистки рекомбинантного ФСГ или варианта рекомбинантного ФСГ, включающему стадию, на которой жидкость, содержащую указанный ФСГ или вариант ФСГ, подвергают воздействию мембранного катионообменника.
В предпочтительном варианте осуществления, мембранный катионообменник представляет собой сильный кислотный катионообменник сульфоновую кислоту, зафиксированную на мембране, или обменник, имеющий аналогичные характеристики.
Подходящие мембранные адсорберы для использования в способе по изобретению известны в уровне техники и имеются в наличии у нескольких поставщиков. Например, метод катионообменной хроматографии по изобретению может быть осуществлен с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы и имеющей хроматографический матрикс из сульфоновой кислоты, сформированный на данном целлюлозном каркасе. Примером подходящего мембранного адсорбера являются
- 9 028065 мембранные адсорберы §агЮЬшб δ тетЬгапе ЛбвогЬегв, выпускаемые фирмой Зайогшв. Их технические детали представлены выше.
В другом варианте осуществления, способ очистки рекомбинантного ФСГ или варианта рекомбинантного ФСГ включает стадию, на которой жидкость, содержащую ФСГ, подвергают мембранному катионообмену, дополнительно включающий хроматографию гидрофобного взаимодействия.
Метод хроматографии гидрофобного взаимодействия по изобретению можно осуществить, как описано выше применительно к способу очистки рекомбинантного ФСГ или варианта рекомбинантного ФСГ, включающему стадии, на которых жидкость, содержащую указанный ФСГ или вариант ФСГ, подвергают анионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии по сродству к красителю, причем способ не включает ни слабую анионообменную хроматографию, ни хроматографию с обращенной фазой, и его предпочтительные варианты осуществления.
В предпочтительном варианте осуществления, хроматографию гидрофобных взаимодействий осуществляют с использованием смолы, состоящей из гранул перекрестно-сшитой агарозы, дереватизированной фенильными или бутильными группами, или смолы, имеющей аналогичные характеристики.
Если не указано иное, следующие определения предназначены для пояснения и обозначения значения и области применения различных терминов, использованных для описания настоящего изобретения.
Термин ФСГ относится к полипептиду фолликулостимулирующего гормона в качестве полноразмерного зрелого белка, который включает, но не ограничиваясь этим, ФСГ человека или чФСГ, либо полученный рекомбинантным способом, либо выделенный из организма человека, например, из мочи женщин, находящихся в постклимактерическом периоде. Последовательность белка гликопротеина человека и последовательность белка β-субъединицы ФСГ человека известны специалисту в данной области из научной и патентной литературы (см., например, νθ 2004/087213).
Аминокислотная последовательность α-цепи ФСГ человека представлена в §ЕЦ ΙΌ Νο. 1, и аминокислотная последовательность β-цепи ФСГ человека представлена в §ЕЦ ГО Νο. 2, которые приложены к этому описанию. Эти аминокислотные последовательности соответствуют аминокислотным последовательностям дикого типа α- и β-цепей ФСГ человека, как зарегистрировано под инвентарным номером 1 00152 в базе данных ЕМВЬ, и под инвентарным номером ΝΜ_000510 в базе данных ΝΟΒΙ, соответственно.
Последовательности нуклеиновых кислот дикого типа, кодирующие ФСГ человека, представлены в §ЕЦ ГО Νο. 3 (=а-цепь) и № 4 (= β-цепь).
Рекомбинантный ФСГ может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа, которая является естественной для людей, или он может кодироваться измененной последовательностью нуклеиновой кислоты, чья экспрессия в результате приводит к ФСГ, имеющему аминокислотную последовательность дикого типа, то есть, последовательность белка дикого типа, присущая человеку.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ФСГ человека, может, например, быть изменена таким образом, что одна или обе последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют αи β-цепь ФСГ человека, являются приспособленными для частоты использования кодонов в клетках яичника китайского хомячка (СНО), с целью повышения уровня экспрессии и выхода рекомбинантного ФСГ в этих клетках-хозяевах.
Пример последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют ФСГ человека, и которые были модифицированы с учетом частоты использования кодонов в клетках СНО, описаны в международной патентной заявке νθ 2009/000913. Модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь ФСГ человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в §ЕЦ ГО Νο. 5 (в §ЕЦ ГО Νο. 5 кодирующая область начинается с нуклеотида 56 и продолжается до нуклеотида 442), и модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь ФСГ человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в §ЕЦ ГО Νο. 6 (в §ЕЦ ГО Νο. 6 кодирующая область начинается с нуклеотида 19 и продолжается до нуклеотида 366). Клеточная линия СНО, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, включающей первую модифицированную последовательность, кодирующую β-цепь ФСГ человека, и вторую модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь ФСГ человека, была депонирована 28 марта 2007 в базе данных ΌδΜΖ в Вгаип5с11\уещ под депозитарным номером ΌδΜ АСС2833.
В предпочтительном варианте осуществления, жидкая композиция ФСГ по настоящему изобретению содержит рекомбинантный ФСГ дикого типа человека, который получен в результате экспрессии рекомбинантного гена из последовательностей нуклеиновых кислот ФСГ, которые модифицированы с учетом частоты использования кодонов в клетках СНО в отношении как β-цепи ФСГ человека, так и αцепи ФСГ человека. В другом предпочтительном варианте осуществления, рекомбинантный ФСГ получают в результате экспрессии из последовательностей нуклеиновых кислот ФСГ, раскрытых в νθ 2009/000913.
Термин вариант ФСГ охватывает молекулы, отличающиеся аминокислотным составом, характером гликозилирования или межсубъединичными связями от ФСГ человека, но демонстрирующие актив- 10 028065 ность ФСГ. Примеры включают СТР-ΡδΗ, модифицированный рекомбинантный ФСГ пролонгированного действия, состоящий из α-субъединицы дикого типа и гибридной β-субъединицы, где карбоксиконцевой пептид НСС слит с С-концом β-субъединицы ФСГ, как описано у Ь-аРоН с1 а1. (1992) Епбосппо1оду. 131, 2514-2520; или К1еш с1 а1. (2003) Нитап Кергоб., 18, 50-56. Также учитывается одноцепочечный СТР-ΡδΗ, одноцепочечная молекула, описанная у К1еш е1 а1. (2002) РетШИу & §1етШ1у, 77, 1248-1255. Другие примеры вариантов ФСГ включают молекулы ФСГ, имеющие дополнительные участки гликозилирования, встроенные в α- и/или β-субъединицу, как раскрыто в международной публикации АО 01/58493, и молекулы ФСГ со связями δ-δ между субъединицей, как раскрыто в АО 98/58957. Другие примеры вариантов ФСГ раскрыты в АО 2004/087213, для которых характерны карбоксиконцевые делеции β-субъединицы. Другие примеры вариантов ФСГ включают молекулы ФСГ, имеющие измененную степень гликозилирования по сравнению с ФСГ дикого типа в результате изменений аминокислотной последовательности белка, посредством которых вводится дополнительный участок (участки) гликозилирования или удаляется природный участок (участки) гликозилирования.
Кроме того, ФСГ или вариант ФСГ по изобретению может представлять собой молекулу ФСГ, которая была модифицирована посредством химических веществ. Такие конъюгаты ФСГ могут, например, содержать полиалкиленгликоль (например, ПЭГ), гидроксиалкил крахмал (например, ΗΕδ) или другие полимерные молекулы.
Гетеродимеры ФСГ или гетеродимеры варианта ФСГ могут быть получены любым подходящим способом, например, рекомбинантно, посредством выделения или очистки из природных источников, или посредством химического синтеза, или с помощью любой их комбинации.
Использование термина рекомбинантный относится к композициям ФСГ или варианта ФСГ, которые получены в результате применения технологий рекомбинантных ДНК (см., например, международную публикацию АО 85/01958). Последовательности геномной и кДНК клонов ФСГ известны для αи β-субъединиц нескольких биологических видов. Различные способы получения рекомбинантного ФСГ или вариантов ФСГ с использованием рекомбинантной технологии описаны в предшествующем уровне техники, см., например, европейскую патентную заявку ЕР 0711894 и европейскую патентную заявку ЕР 0487512.
Предпочтительно, ФСГ, очищенный в соответствии с изобретением, имеет альфа-субъединицу, соответствующую последовательности δΕρ ГО Νο. 1, и бета-субъединицу, соответствующую последовательности δΕρ ΙΌ Νο. 2.
В другом аспекте изобретение относится к очищенному белку ФСГ или варианта ФСГ, полученному в результате применения способа очистки по изобретению.
Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей ФСГ или вариант ФСГ, очищенный способом по изобретению, а также фармацевтически приемлемый эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит консервант и может быть использована для многократного применения. Предпочтительные фармацевтические композиции описаны в РСТ/ЕР2009/051451.
Кроме того, изобретение также относится к применению ФСГ или варианта ФСГ, очищенного способом по изобретению, или к применению фармацевтической композиции, содержащей указанный ФСГ, или вариант ФСГ, в комбинации с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, при лечении нарушений фертильности.
Рекомбинантный ФСГ человека очищают из супернатанта культуры клеток-хозяев способом по изобретению. Рекомбинантный человеческий ФСГ или вариант ФСГ предпочтительно получают, как описано в международной патентной заявке АО 2009/000913.
Наиболее предпочтительно, ФСГ представляет собой человеческий ФСГ, полученный рекомбинантно, в частности, предпочтительно полученный в клетках яичника китайского хомячка, трансфецированных вектором или векторами, содержащими ДНК, кодирующую гликопротеин α-субъединицы и βсубъединицы ФСГ человека, кодируемые либо последовательностями δΕρ ГО Νο. 3 и 4 (= последовательности нуклеиновых кислот дикого типа), либо последовательностями δΕρ ГО Νο. 5 и 6 (= кодоноптимизированные последовательности нуклеиновых кислот). ДНК, кодирующие α- и β-субъединицы, могут находиться в одном и том же или в разных векторах.
Рекомбинантный ФСГ обладает несколькими преимуществами перед его аналогом, выделенным из мочи. Методы культивирования и выделения с использованием рекомбинантных клеток обеспечивают соответствие между экспериментальными сериями. В отличие от этого, ФСГ, выделенный из мочи, значительно различается от серии к серии такими характеристиками, как чистота, характер гликозилирования, сиалирование и окисление субъединиц. В результате лучшего соответствия характеристик между сериями и чистоты рекомбинантного ФСГ, данный гормон может быть быстро идентифицирован и определен количественно с использованием таких технологий, как изоэлектрическое фокусирование (ΙΕΡ). Простота идентификации и количественного определения рекомбинантного ФСГ позволяет наполнять ампулы по массе гормона (заполнение по массе), а не на основании биооценки.
Термин активность ФСГ относится к способности соединения ФСГ вызывать биологические ре- 11 028065 акции, связанные с ФСГ, такие как увеличение массы яичника в тесте З1ее1тап-Рой1еу (З1ее1тап е1 а1. (1953), Кпс1осппо1оду 53, 604-616), или фолликулярного роста у пациентки. Фолликулярный рост у пациентки может быть оценен с помощью ультразвукового исследования, например, в пересчете на фолликулы, имеющие средний диаметр приблизительно 16 мм на 8 день стимуляции. Биологическую активность оценивают относительно общепринятого стандарта для ФСГ.
Специфическая биоактивность рекомбинантного ФСГ ш у1уо находится, обычно, в диапазоне от приблизительно 8000 МЕ ФСГ/мг белка до приблизительно 16000 МЕ ФСГ/мг белка. Например, рекомбинантный ФСГ в коммерчески доступном продукте Ригедоп (Огдапоп) имеет специфическую биоактивность приблизительно 10000 1Е/мг белка, а для Сопа1-£ от Зегопо биоактивность рекомбинантного ФСГ человека составляет приблизительно 13600 1Е/мг белка.
Активность ФСГ может быть определена известными способами, относящимися к ФСГ и другим гонадотропинам. Такие способы включают, например, анализ иммунной активности фермента (Е1А), или анализ гена-репортера. Биоактивность обычно определяют с помощью биотеста, описанного в 5 Издании Европейской фармакопеи (Еигореап Рйагтасорое1а, 51й Еййюп) для ФСГ, выделенного из мочи, биоактивность оценивают в результате сравнения эффекта ФСГ на увеличение яичников неполовозрелых крыс, подвергнутых воздействию хорионическим гонадотропином с таким же эффектом Стандартного Препарата.
Биологическую активность ФСГ или варианта ФСГ можно оценить, сравнивая, при заданных условиях, его эффект на увеличение яичников неполовозрелых крыс, подвергнутых воздействию хорионическим гонадотропином, с таким же эффектом, используя международный стандартный препарат или эталонный препарат, откалиброванный в Международных Единицах (Европейская Фармакопея, 5 Издание).
Измерение активности ФСГ ш уйго описано, например, у Α1Ьаηеδе е1 а1. (1994), Мо1. Се11 Епйосппо1. 101: 211-219.
Чистота ФСГ или варианта ФСГ, полученного способом по изобретению, составляет, по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно больше чем 99%. Степень чистоты может быть определена посредством анализа методом ВЭЖХ. Подходящие материалы и протоколы для проведения такого анализа могут быть получены от коммерческих поставщиков, таких как \'ус.1ас или ТОЗОН Вджаепсе.
Последующие примеры представлены исключительно для дополнительной иллюстрации способа очистки по изобретению. Область применения изобретения не должна рассматриваться как всего лишь состоящая из следующих примеров.
Примеры
Пример 1.
Получение рекомбинантного ФСГ человека посредством рекомбинантных технологий.
Рекомбинантный ФСГ человека продуцируется в трансфицированных клетках-хозяевах СНО стандартными способами. Эти методы включают получение клона клетки СНО, который продуцирует рекомбинантный ФСГ человека из одной или нескольких рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих α-цепь и β-цепь ФСГ человека, и культивирование данных клеток-хозяев при соответствующих условиях. Рекомбинантный ФСГ человека затем очищают из клеточной культуры в соответствии с изобретением.
В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный ФСГ человека получают, как описано в международной патентной заявке АО 2009/000913.
Пример 2.
Очистка ФСГ из клеточной культуры.
Процедура очистки представляет собой следующее:
Стадия анионообменной хроматографии
Стадия Н1С (хроматография гидрофобных взаимодействий)
Стадия хроматографии по сродству к красителю
- 12 028065
Вирусная инактивация кДа УФ/ДФ (ультрафильтрация/диафильтрация)
Катионный мембранный адсорбер
Стадия анионообменной хроматографии кДа УФ (ультрафильтрация)
Стадия эксклюзионной хроматографии
Нанофильтрация
Продолжительность ферментации составляла 28 дней, и ферментационный объем составлял 30 л. Выход составлял 0,22 мкм, профильтрованный и разбавленный КО-водой (вода, очищенная при помощи обратного осмоса) в 3,5 раза.
Стадия анионообменной хроматографии (АЕС).
Разбавленный полученный супернатант клеточной культуры подвергали анионообменной хроматографии с использованием сильной анионообменной смолы на основе четвертичного аммония, известной в уровне техники как РХОзрИелю С). Этот матрикс имеется в наличии у ВюКаб.
Для уравновешивания использовали три объема колонки (ОК) 50 мМ Тп§-НС1, рН 7,6. Колонку нагружали собранным супернатантом (разбавленным КО-водой в соотношении 1:3,5; титр собранного супернатанта составлял приблизительно 1,8 мкг ФСГ/мл) и отмывали с помощью 50 мМ Тп§-НС1, рН 7,6 (5 ОК). Затем колонку отмывали с помощью 50 мМ Тп§-НС1, 15 мМ №С1, рН 7,6 (5 ОК), и белок был элюирован с использованием 50 мМ Тп§-НС1, 200 мМ №С1, рН 7,6 (8 ОК). На данной стадии выход составлял 90% и более.
Стадия Н1С.
Н1С осуществляли с использованием смолы, состоящей из гранул перекрестно-сшитой агарозы, дериватизированной фенилом. Фенил сефароза 6 РР (имеется в наличии у ОР НеаРЬсаге) является чрезвычайно структурированным производным на основе агарозы. Это вещество является физически и химически стабильным, обеспечивая высокую скорость потока и повышенный срок эксплуатации смолы. Технические характеристики этой смолы представлены выше.
Восемь элюатов, полученных на стадии АЕС, были объединены и разбавлены в 3 раза с использованием 50 мМ Тг1§-НС1, 4,5 №С1, рН 7,6. Н1С-колонка была уравновешена с помощью 50 мМ Тг1§-НС1, 3 М ИаС1, рН 7,6 (4 ОК) и нагружена элюатом, полученным на стадии АЕС, разбавленным в соотношении 1:3. Затем колонку отмывали с использованием 50 мМ Тг1§-НС1, 3 М №С1, рН 7,6 (3 ОК) и отмывали с использованием 50 мМ Тп§-НС1, 1,8 М №С1, рН 7,6 (5 ОК). Было обнаружено, что данный отмывочный буфер с 1,8 М \аС1 имеет хороший потенциал очищения без заметной потери ФСГ. Данный белок затем был элюирован с помощью 50 мМ Тп§-НС1, 0,8 М №С1, рН 7,6 (6 ОК).
Выход ФСГ на данной Н1С-стадии составлял >95% без каких-либо значительных потерь во время нагрузки, и с хорошим потенциалом очистки общего белка с приблизительным фактором 10. Эти результаты демонстрируют, что проведенная Н1С-стадия представляет собой очень эффективную стадию очистки с удовлетворительным выходом и качеством продукта.
Стадия хроматографии по сродству к красителю.
На данной стадии хроматографии по сродству к красителю использовали В1ие ЗерЬагозе РР, имеющуюся в наличии у ОЕ НеаРЬсаге. Элюат, полученный на стадии Н1С, был разбавлен в 4 раза с помощью 50 мМ Тг1§-НС1, рН 7,6. Колонку уравновешивали с помощью 50 мМ Тг1§-НС1, рН 7,6 (3 ОК) и нагружали разбавленным в соотношении 1:4 элюатом, полученным на стадии Н1С. Колонку отмывали с помощью 50 мМ Тг1§-НС1, рН 7,6 (3 ОК), и белок ФСГ был элюирован с помощью 50 мМ Тг1§-НС1, 4 М №С1, рН 7,6 (6 ОК).
После аффинной хроматографии была проведена стадия вирусной инактивации посредством инкубирования данного элюата в 15% 2-пропаноле в течение 2 ч. Для этой цели элюат, полученный на стадии хроматографии по сродству к красителю, был разбавлен 2 раза с помощью 50 мМ Тп§-НС1, 30% 2пропанолом, рН 7,6, в результате получив 50 тМ Тп§-НС1, 15% 2-пропанол, 2 М ЖС1, рН 7,6. После инкубирования в течение 2 ч данный полученный на стадии хроматографии по сродству к красителю вирусно-инактивированный элюат был разведен в 2 раза с помощью 20 мМ Тг1§-НС1, рН 7,0.
- 13 028065 кДа УФ/ДФ.
Ультра- и диафильтрацию в большинстве случаев проводили в соответствии со стандартными протоколами. Эффективными устройствами для УФ/ДФ являются ультрафильтрационные/диафильтрационные кассеты (полиэфирсульфон (РЕ§и), 10 кД) производства БагЮпщ (площадь фильтра: 14000 см2, УФ-фактор: 13-20, ДФ-фактор: 8-10, нагрузка: от 0,1 до 0,5 мг ФСГ/см2). Диафильтрацию с устройствами для УФ/ДФ в большинстве случаев проводили с ультрафильтрационными (концентрация) факторами от 13 до 20, и диафильтрационными факторами от 8 до 10.
Вирусно-инактивированный элюат, полученный на стадии хроматографии по сродству к красителю, был диафильтрован в буфере Тт18-НС1 (20 мМ ТЙ8-НС1, рН 7,0) и нагружен непосредственно на катионный мембранный адсорбер.
Стадия катионного мембранного адсорбера.
Метод катионообменной хроматографии по данному изобретению был осуществлен с применением мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы и имеющей хроматографический матрикс из сульфоновой кислоты, сформированный на данном целлюлозном каркасе. Такой мембранный адсорбер имеется в наличии у §атйтш8 под коммерческим названием §ат№ЪшД δ тетЬтаие айзотЬет. Мембранный адсорбер δηΠοΝηύ δ представляет собой капсулу с несколькими мембранными слоями, на которых иммобилизован лиганд. Мембранные адсорберы имеют преимущество кратковременного технологического процесса и малых объемов буфера. Себестоимость теста и временные затраты незначительны по причине одноразового использования.
Мембранный адсорбер уравновешивали с помощью 20 мМ ТгЕ-НСТ рН 7,0 (200 мл) и нагружали ультраконцентратом 10 кДа УФ/ДФ (приблизительно 100 мл). Данный адсорбер отмывали с помощью 20 мМ ТГ18-НС1, рН 7,0 (200 мл).
Технологический процесс на основе мембранного адсорбера проходит в проточном режиме, что сокращает продолжительность процесса. Кроме того, нет необходимости в регулировании условий нагрузки в отношении следующей стадии обработки (анионообменная хроматография). Выход продукта в данном проточном процессе был очень хорошим. Фактически, не было потери продукта во время процесса с использованием модуля δηΠοΝηύ δ при значениях рН 6,0, 6,5 и 7,0 в различных буферных системах.
Стадия с использованием катионного мембранного адсорбера является очень эффективной для очистки НСР (белок клетки-хозяина). Выход, от 90 до 95%, является очень благоприятным, поскольку очищаемый ФСГ не связывается с адсорбером при значении рН 7,0 в буферной системе 20 мМ Тт18-НС1.
Стадия анионообменной хроматографии.
Вторую анионообменную хроматографию осуществляли с использованием сильной анионообменной смолы на основе четвертичного аммония, известной в уровне техники как О δерЬа^ο8е НР. Эта смола имеется в наличии у СЕ НеаЙЬсаге.
АЕС-колонку уравновешивали с помощью 20 мМ Тт18-НС1, рН 7,0 (3 ОК). Полученную с помощью проточного мембранного адсорбера жидкость нагружали на колонку (3 ОК), и данную колонку сначала отмывали с помощью 20 мМ Тт18-НС1, рН 7,0 (2 ОК), затем с помощью 20 мМ Тт18-НС1, рН 8,5 (3 ОК) и в заключение отмывали с помощью 20 мМ Тт18-НС1, 60 мМ ЫаС1, рН 8,5 (5 ОК). Затем ФСГ элюировали с помощью 20 мМ ТТ15-НС1, 130 мМ ИаС1, рН 8,5 (6 ОК).
Элюат, полученный с О δерЬа^ο8е НР, имеет очень высокую степень чистоты, сопоставимую с коммерческим продуктом СОКАЬ-Г®, кДа УФ.
Ультрафильтрацию 10 кДа проводили в соответствии со стандартными протоколами с использованием ултрафильтрационной кассеты δа^Юсοη (ΡΕδυ, 10 кД) производства δηΠοτιυδ (площадь фильтра: 3000 см2, УФ-фактор: 10-30, нагрузка: от 0,2 до 1,0 мг ФСГ/см2). Ультрафильтрацию проводили в большинстве случаев с использованием ультрафильтрационных (концентрирование) факторов от 10 до 30.
Стадия эксклюзионной хроматографии ^ЕС).
Эксклюзионную хроматографию осуществляли с использованием δире^άеx 75 р§, имеется в наличии у СЕ НеаЙЬсаге. Колонку уравновешивали с помощью 50 мМ Ыа-РО4, рН 7,0 (2 ОК). Полученный на стадии УФ 10 кД ретентат нагружали на данную колонку (0,025 ОК), и колонку отмывали с помощью 50 мМ Ыа-РО4, рН 7,0 (2 ОК).
Элюат, полученный на стадии δΕС, имеет высокую степень чистоты, в таком же диапазоне, как коммерческий продукт СОКАЬ-Г®.
Нанофильтрация.
В заключение, осуществляли нанофильтрацию элюата, полученного на стадии δΕС, используя фильтры Р1аиоуа 15Ν, выпускаемые компанией АзаЬ Казе1 МеФса1 Со., Ый., средний размер пор составляет 15 нм. Расчетная максимальная нагрузка составляла 2,5 мл/см2. Данную фильтрацию осуществляли в соответствии с протоколом фирмы-поставщика.
Чистоту очищенного ФСГ определяли посредством δΕ-НΡ^С (эксклюзионная ВЭЖХ) и δΌδРАСЕ. Чистота и предусмотренные примеси полученного ФСГ были следующие:
- 14 028065
ЗЕ-НРЬС (Димеры и родственные примеси с <1% более высокими молекулярными массами)
3Ό3-ΡΑΟΕ геб. (коллоидальный) НСР (родовой)
ДНК чистота >97% <10 ррт <0,006 пг/МЕ ФСГ
Биоактивность данного рекомбинантного ФСГ человека составляла по меньшей мере приблизительно 10000 МЕ/мг. Предпочтительно биоактивность рекомбинантного ФСГ человека или варианта ФСГ находится в диапазоне приблизительно от 10000 МЕ/мг приблизительно до 17000 МЕ/мг, более предпочтительно биоактивность составляет по меньшей мере приблизительно 12000 МЕ/мг, наиболее предпочтительно биоактивность составляет по меньшей мере приблизительно 15000 МЕ/мг.
Список последовательностей.
8НС) ΙΌ Νο. 1: аминокислотная последовательность α-цепи ФСГ человека.
8НС) ГО Νο. 2: аминокислотная последовательность β-цепи ФСГ человека.
8НС) ГО Νο. 3: последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующая α-цепь ФСГ человека.
8НС) ГО Νο. 4: последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующая β-цепь ФСГ человека.
8НС) ГО Νο. 5: последовательность нуклеиновой кислоты с оптимизированными кодонами, кодирующая β-цепь ФСГ человека.
8НС) ГО Νο. 6: последовательность нуклеиновой кислоты с оптимизированными кодонами, кодирующая α-цепь ФСГ человека.
- 15 028065
Список последовательностей <110> Втодепегтх АС <120> Способ очистки рекомбинантного ФСГ <130> В 9682/ΕΝ < 16 0 > 6 <170> РабепЫп чегзтоп 3.3 <210> 1 <211> 116 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <220>
<221> ЦЕПЬ <222> (1)..(116) <223> альфа-цепь ФСГ человека <400> 1
Меб Азр Туг Туг Агд Ьуз Туг А1а А1а Не РНе Ьеи Ча1 ТЬг Ьеи Зег 15 10 15
Ча1 РЬе Ьеи Нтз Ча1 Ьеи Нтз Зег А1а Рго Азр Ча1 С1п Азр Суз Рго 20 25 30
С1и Суз ТНг Ьеи С1п С1и Азп Рго РНе РНе Зег С1п Рго С1у А1а Рго 35 40 45
11е Ьеи С1п Суз Меб С1у Суз Суз РНе Зег Агд Аба Туг Рго ТНг Рго 50 55 60
Ьеи Агд Зег Ьуз Ьуз ТНг Меб Ьеи Ча1 С1п Ьуз Азп Уа1 ТНг Зег С1и 65 70 75 80
Зег ТНг Суз Суз Ча1 А1а Ьуз Зег Туг Азп Агд Ча1 ТНг Ча1 Меб С1у 85 90 95
С1у РНе Ьуз Ча1 С1и Азп Нтз ТНг А1а Суз Нтз Суз Зег ТНг Суз Туг 100 105 110
Туг Нтз Ьуз Зег 115 <210> 2 <211> 129 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <220>
<210> 3 <211> 369 <212> ДНК <213> Ното зартепз <220>
<221> т1зс_£еаДиге <223> последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующая альфа-цепь ФСГ человека
| <400> 3 сДДааДДаад | ссдссадсаД | ддаДДасДас | адааааДаДд | садсДаДсДД | ДсДддДсаса | 60 |
| ДДдДсддДдД | ДДсДдсаДдД | ДсДссаДДсс | дсДссДдаДд | ДдсаддаДДд | сссадааДдс | 120 |
| асдсДасадд | аааасссаДД | сДДсДсссад | ссдддДдссс | сааДасДДса | дДдсаДдддс | 180 |
| ДдсДдсДДсД | сДададсаДа | ДсссасДсса | сДааддДсса | адаадасдаД | дДДддДссаа | 240 |
| аадаасдДса | ссДсададДс | сасДДдсДдД | дДадсДаааД | саДаДаасад | ддДсасадДа | 300 |
- 17 028065 абддддддбб бсааадбдда даассасасд дсдбдссасб дсадбасббд ббаббабсас 360 ааабсббаа 369 <210> 4 <211> 474 <212> ДНК <213> Ното зартепз <220>
<221> т1зс_£еабиге <223> последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующая бета-цепь ФСГ человека
| <400> 4 аддабссссд | ддсбассбсс | ссдсддддад | дсдсдссссб | бааббаадсс | дссассабда | 60 |
| адасасбсса | дбббббсббс | сббббсбдбб | дсбддааадс | аабсбдсбдс | аабадсбдбд | 120 |
| адсбдассаа | сабсассабб | дсаабадада | аадаадаабд | бсдбббсбдс | абаадсабса | 180 |
| асассасббд | дбдбдсбддс | басбдсбаса | ссадддабсб | ддбдбабаад | дасссадсса | 240 |
| ддсссааааб | ссадааааса | бдбассббса | аддаасбддб | абабдаааса | дбдададбдс | 300 |
| ссддсбдбдс | бсассабдса | даббссббдб | абасабассс | адбддссасс | садбдбсасб | 360 |
| дбддсаадбд | бдасадсдас | адсасбдабб | дбасбдбдсд | аддссбдддд | сссадсбасб | 420 |
| дсбссбббдд | бдааабдааа | даабааасаб | дссабддсаб | дсдадсбсда | аббс | 474 |
<210> 5 <211> 471 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> кодон-оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая бета-цепь ФСГ человека
| <400> 5 аддабссссд | ддбассбссс | сдсддддадд | сдсдссссбб | ааббаадссд | ссассабдаа | 60 |
| дасссбдсад | ббсббсббсс | бдббсбдсбд | сбддааддсс | абсбдсбдса | асадсбдсда | 120 |
| дсбдассаас | абсассабсд | ссабсдадаа | ддаддадбдс | аддббсбдса | бсадсабсаа | 180 |
| сассассбдд | бдсдссддаб | асбдсбасас | садддассбд | дбдбасаадд | ассссдссад | 240 |
| дсссаадабс | садаадассб | дсассббсаа | ддадсбддбд | басдадассд | бдадддбдсс | 300 |
| сддсбдсдсс | сассасдссд | асадссбдба | сассбасссс | дбддссассс | адбдссасбд | 360 |
| сддсаадбдс | дасадсдаса | дсассдасбд | сассдбдадд | ддссбдддсс | ссадсбасбд | 420 |
| садсббсддс | дадабдаадд | адбаабдасс | абддсабдсд | адсбсдаабб | с | 471 |
| <210> 6 <211> 372 <212> ДНК |
- 18 028065 <213> Искусственная <220>
<223> кодон-оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая альфа-цепь ФСГ человека
| <400> 6 сГГааГГаад | ссдссадсаГ | ддасГасГас | аддаадГасд | ссдссаГсГГ | ссГддГдасс | 60 |
| сГдадсдГдГ | ГссГдсасдГ | дсГдсасадс | дссссадасд | ГдсаддасГд | ссссдадГдс | 120 |
| асссГдсадд | адаасссаГГ | сГГсадссад | сссддадссс | ссаГссГдса | дГдсаГдддс | 180 |
| ЬдсГдсГГса | дсадддссГа | ссссассссс | сГдаддадса | адаадассаГ | дсГддГдсад | 240 |
| аадаасдГда | ссадсдадад | сассГдсГдс | дГддссаада | дсГасаасад | ддГдассдГд | 300 |
| аГдддсддсГ | ГсааддГдда | даассасасс | дссГдссасГ | дсадсассГд | сГасГассас | 360 |
| аададсГааГ | да | 372 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (26)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ очистки раствора рекомбинантного ФСГ человека или варианта рекомбинантного ФСГ человека, включающий стадии, которые осуществляют в следующем порядке:анионообменная хроматография; хроматография гидрофобных взаимодействий и хроматография по сродству к красителю, причем способ не включает ни слабую анионообменную хроматографию, ни хроматографию с обращенной фазой, и анионообменную хроматографию осуществляют с использованием сильной анионообменной смолы, имеющей функциональные группы -Ы®(СН3)3, или смолы, имеющей аналогичные характеристики.
- 2. Способ по п.1, где хроматографию гидрофобных взаимодействий осуществляют с использованием смолы, состоящей из гранул перекрестно-сшитой агарозы, дереватизированной фенильными или бутильными группами, или смолы, имеющей аналогичные характеристики.
- 3. Способ по п.1 или 2, где хроматографию по сродству к красителю осуществляют с использованием СЛасгои В1ие 30 в качестве лиганда, ковалентно связанного с любым матриксом.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где хроматографию осуществляют с использованием буфера ΤτΐδНС1/хлорид натрия в качестве элюента при значении рН от 7,0 до 9,0.
- 5. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно включающий стадию катионообменной хроматографии.
- 6. Способ по п.5, где катионообменную хроматографию осуществляют с сильным кислотным катионообменником, представляющим собой сульфоновую кислоту, зафиксированную на мембране, или катионообменником, имеющим аналогичные характеристики.
- 7. Способ по п.5 или 6, где стадии осуществляют в следующем порядке:a) анионообменная хроматография;b) хроматография гидрофобных взаимодействий;c) хроматография по сродству к красителю и б) катионообменная хроматография.
- 8. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно включающий вторую анионообменную хроматографию.
- 9. Способ по п.8, где вторую анионообменную хроматографию осуществляют с использованием сильной анионообменной смолы, имеющей функциональные группы -Ы®(СН3)3, или смолы, имеющей аналогичные характеристики.
- 10. Способ по п.8 или 9, где вторую анионообменную хроматографию осуществляют с использованием буфера Ίϊίδ-11С1/\_юрид натрия в качестве элюента при значении рН от 7,0 до 9,0.
- 11. Способ по любому из пп.8-10, где стадии осуществляют в следующем порядке:a) первая анионообменная хроматография;b) хроматография гидрофобных взаимодействий;c) хроматография по сродству к красителю;б) необязательная катионообменная хроматография и е) вторая анионообменная хроматография.
- 12. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно включающий эксклюзионную хроматографию.
- 13. Способ по п.12, где эксклюзионную хроматографию осуществляют с использованием матрикса из сферических соединений перекрестно-сшитой агарозы и декстрана.
- 14. Способ по п.12 или 13, где стадии осуществляют в следующем порядке:- 19 028065a) первая анионообменная хроматография;b) хроматография гидрофобных взаимодействий;c) хроматография по сродству к красителю;б) необязательная катионообменная хроматография; е) необязательная вторая анионообменная хроматография и ί) эксклюзионная хроматография.
- 15. Способ по любому из пп.1-14, включающий следующие стадии в следующем порядке:a) первая анионообменная хроматография;b) хроматография гидрофобных взаимодействий;c) хроматография по сродству к красителю;б) мембранная катионообменная хроматография; е) вторая анионообменная хроматография и ί) эксклюзионная хроматография.
- 16. Способ по любому из пп.1-15, дополнительно включающий одну или несколько стадий ультрафильтрации и/или нанофильтрации.
- 17. Способ по любому из пп.1-16, в котором не осуществляют металлоионную аффинную хроматографию.
- 18. Способ по любому из пп.1-17, в котором не осуществляют иммуноаффинную хроматографию.
- 19. Способ по любому из пп.1-18, где ФСГ имеет α-цепь с последовательностью 8Еф ГО Ыо. 1 и βцепь с последовательностью 8Еф ГО Ыо. 2.
- 20. Препарат ФСГ или препарат варианта ФСГ, полученный способом по любому из пп.1-19, включающий менее 1% димеров и примесей с более высокими молекулярными массами, менее 10 ррт общего белка клетки-хозяина (НСР), менее 0,006 пг ДНК/МЕ ФСГ и имеющий чистоту более 97%.
- 21. Фармацевтическая композиция для лечения нарушений фертильности, содержащая препарат ФСГ или препарат варианта ФСГ по п.20, а также фармацевтически приемлемый эксципиент.
- 22. Применение препарата ФСГ или препарата варианта ФСГ по п.20 для лечения нарушений фертильности.
- 23. Применение фармацевтической композиции по п.21 для лечения нарушений фертильности.
- 24. Способ получения рекомбинантного ФСГ человека, включающий получение ФСГ в клоне клетки яичника китайского хомячка (СНО), трансфицированной одной или более молекулами рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая кодирует α-цепь ФСГ человека, включающую аминокислотную последовательность 8Еф ГО Ыо. 1, и β-цепь ФСГ человека, включающую аминокислотную последовательность 8Еф ГО Ыо. 2, и очистку рекомбинантного ФСГ человека из культуры клеток способом по любому из пп.1-19.
- 25. Способ получения рекомбинантного ФСГ человека, включающий стадии:a) получение клона клетки СНО, трансфицированной по меньшей мере одним вектором, включающим последовательности 8Еф ГО Ыо. 3 и 4 или 8Еф ГО Ыо. 5 и 6, которые кодируют α-цепь ФСГ человека, включающую аминокислотную последовательность 8Еф ГО Ыо. 1, и β-цепь ФСГ человека, включающую аминокислотную последовательность 8Еф ГО Ыо. 2;b) культивирование клеток-хозяев СНО в подходящих условиях иc) очистка рекомбинантного ФСГ человека из культуры клеток в соответствии со способом по любому из пп.1-19.
- 26. Способ получения фармацевтической композиции по п.21, включающий смешивание ФСГ или варианта ФСГ, полученного способом по любому из пп.1-19, вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09157133 | 2009-04-01 | ||
| PCT/EP2010/002111 WO2010115586A2 (en) | 2009-04-01 | 2010-04-01 | Method for purifying recombinant fsh |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201171199A1 EA201171199A1 (ru) | 2012-05-30 |
| EA028065B1 true EA028065B1 (ru) | 2017-10-31 |
Family
ID=42153744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201171199A EA028065B1 (ru) | 2009-04-01 | 2010-04-01 | Способ очистки рекомбинантного фсг |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9096683B2 (ru) |
| EP (1) | EP2414380B1 (ru) |
| JP (2) | JP5845170B2 (ru) |
| KR (1) | KR101761168B1 (ru) |
| CN (1) | CN102448979B (ru) |
| AU (1) | AU2010234028B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI1012647B1 (ru) |
| CA (1) | CA2755927A1 (ru) |
| CY (1) | CY1116963T1 (ru) |
| DK (1) | DK2414380T3 (ru) |
| EA (1) | EA028065B1 (ru) |
| ES (1) | ES2552055T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20151086T1 (ru) |
| HU (1) | HUE025959T2 (ru) |
| IL (1) | IL215234A (ru) |
| ME (1) | ME02277B (ru) |
| MX (1) | MX2011010480A (ru) |
| NZ (1) | NZ595661A (ru) |
| PL (1) | PL2414380T3 (ru) |
| PT (1) | PT2414380E (ru) |
| RS (1) | RS54318B1 (ru) |
| SI (1) | SI2414380T1 (ru) |
| SM (1) | SMT201500276B (ru) |
| UA (1) | UA106369C2 (ru) |
| WO (1) | WO2010115586A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201106800B (ru) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ME02277B (me) * | 2009-04-01 | 2016-02-20 | Ratiopharm Gmbh | Postupak za prečišćavanje rekombinantnog fsh |
| CN103570820B (zh) * | 2012-08-06 | 2015-11-18 | 齐鲁制药有限公司 | 一种重组人促卵泡激素的纯化方法 |
| KR101516054B1 (ko) * | 2012-11-21 | 2015-05-06 | 씨제이헬스케어 주식회사 | 신규한 지속형 인간 성장호르몬 단량체를 제조하는 방법 |
| CN103059125B (zh) * | 2012-12-27 | 2015-08-12 | 浙江海正药业股份有限公司 | 重组人促卵泡激素的纯化方法 |
| WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
| CN103539860B (zh) * | 2013-11-01 | 2014-12-03 | 广州优联康医药科技有限公司 | 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103539861B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-18 | 广州联康生物科技有限公司 | 长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| JP2017514803A (ja) * | 2014-04-18 | 2017-06-08 | カディラ・ヘルスケア・リミテッド | ゴナドトロピンの新規の精製方法 |
| CN104479005B (zh) * | 2014-09-05 | 2017-10-31 | 上海丽珠制药有限公司 | 一种促性腺激素纯化的方法 |
| CN105461799A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 哈药集团技术中心 | 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法 |
| CN106117342B (zh) * | 2016-07-07 | 2020-01-03 | 江西浩然生物医药有限公司 | 一种高纯度尿促卵泡素的制备方法 |
| RU2694598C1 (ru) * | 2018-08-07 | 2019-07-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Клеточная линия huFSHKKc6 - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и способ получения ФСГ с использованием данной линии |
| CN114867740A (zh) * | 2019-12-26 | 2022-08-05 | 株式会社Lg化学 | 纯化促卵泡激素的方法 |
| KR102283871B1 (ko) * | 2021-03-02 | 2021-08-02 | 한국원자력연구원 | 크로마토그래피를 이용한 무담체 홀뮴-166의 분리 방법, 분리 장치 및 이에 의하여 분리된 무담체 홀뮴-166 |
| CN113372433B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-10-11 | 上海景泽生物技术有限公司 | 纯化fsh方法 |
| CN114591414A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-06-07 | 江西浩然生物制药有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺激素的制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000063248A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Instituto Massone S.A. | Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them |
| US20030059898A1 (en) * | 1983-11-02 | 2003-03-27 | Genzyme Corporation | Cells, vectors and methods for producing biologically active heterodimeric proteins |
| WO2006051070A1 (en) * | 2004-11-09 | 2006-05-18 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
| WO2007065918A2 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh or a fsh mutant |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4840896A (en) | 1983-11-02 | 1989-06-20 | Integrated Genetics, Inc. | Heteropolymeric protein |
| US4923805A (en) | 1983-11-02 | 1990-05-08 | Integrated Genetics, Inc. | Fsh |
| IT1206302B (it) | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
| CA2018676C (en) | 1989-06-20 | 2003-05-06 | Christie A. Kelton | Novel heteropolymeric protein production methods |
| US5021160A (en) * | 1990-01-09 | 1991-06-04 | Gelman Sciences, Inc. | Strongly acidic microporous membranes for cation exchange |
| DE4440587A1 (de) | 1994-11-14 | 1996-05-15 | Fliether Karl Gmbh & Co | Basquill-Schloß |
| US6261823B1 (en) * | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| PT996629E (pt) | 1997-06-25 | 2006-12-29 | Applied Research Systems | Análogos de hormonas glicoproteicas reticulados com ligações dissulfito, sua preparação e utilização |
| US5990288A (en) * | 1997-10-21 | 1999-11-23 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| US6414123B1 (en) * | 1997-10-21 | 2002-07-02 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| AU2001231531A1 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-20 | Maxygen Aps | Follicle stimulating hormones |
| US7157277B2 (en) * | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
| CA2483650A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Copolymers having tunable energy levels and color of emission |
| KR101105486B1 (ko) | 2003-04-02 | 2012-01-13 | 아레스 트레이딩 에스.에이. | Ｆｓｈ 및 ｌｈ과 비이온성 계면활성제의 액상 약제학적 제제 |
| CN100554277C (zh) | 2003-12-22 | 2009-10-28 | 阿雷斯贸易股份有限公司 | Fsh的纯化方法 |
| ES2572629T3 (es) * | 2005-12-09 | 2016-06-01 | Ares Trading S.A. | Método para purificar FSH o un mutante de FSH |
| BRPI0813913B1 (pt) * | 2007-06-28 | 2022-04-19 | Theramex HQ UK Limited | Molécula de ácido nucleico, sequência de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, métodos para produzir fsh humano recombinante, e para produzir a célula hospedeira, e, uso de uma sequência de ácido nucleico. |
| CL2008002054A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-05-29 | Hoffmann La Roche | Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico. |
| ME02277B (me) * | 2009-04-01 | 2016-02-20 | Ratiopharm Gmbh | Postupak za prečišćavanje rekombinantnog fsh |
-
2010
- 2010-04-01 ME MEP-2015-172A patent/ME02277B/me unknown
- 2010-04-01 HU HUE10713424A patent/HUE025959T2/en unknown
- 2010-04-01 BR BRPI1012647-3A patent/BRPI1012647B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-04-01 JP JP2012502514A patent/JP5845170B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-01 WO PCT/EP2010/002111 patent/WO2010115586A2/en active Application Filing
- 2010-04-01 RS RS20150682A patent/RS54318B1/en unknown
- 2010-04-01 ES ES10713424.9T patent/ES2552055T3/es active Active
- 2010-04-01 AU AU2010234028A patent/AU2010234028B2/en active Active
- 2010-04-01 KR KR1020117025974A patent/KR101761168B1/ko active IP Right Grant
- 2010-04-01 MX MX2011010480A patent/MX2011010480A/es unknown
- 2010-04-01 EA EA201171199A patent/EA028065B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-04-01 DK DK10713424.9T patent/DK2414380T3/en active
- 2010-04-01 US US13/262,622 patent/US9096683B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-01 CN CN201080022681.1A patent/CN102448979B/zh active Active
- 2010-04-01 PT PT107134249T patent/PT2414380E/pt unknown
- 2010-04-01 UA UAA201112796A patent/UA106369C2/ru unknown
- 2010-04-01 NZ NZ595661A patent/NZ595661A/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-04-01 CA CA2755927A patent/CA2755927A1/en not_active Abandoned
- 2010-04-01 EP EP10713424.9A patent/EP2414380B1/en active Active
- 2010-04-01 PL PL10713424T patent/PL2414380T3/pl unknown
- 2010-04-01 SI SI201031050T patent/SI2414380T1/sl unknown
-
2011
- 2011-09-15 ZA ZA2011/06800A patent/ZA201106800B/en unknown
- 2011-09-19 IL IL215234A patent/IL215234A/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-06-15 US US14/739,935 patent/US20150353599A1/en not_active Abandoned
- 2015-09-09 JP JP2015177674A patent/JP6231056B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-10-14 HR HRP20151086TT patent/HRP20151086T1/hr unknown
- 2015-10-30 CY CY20151100971T patent/CY1116963T1/el unknown
- 2015-11-04 SM SM201500276T patent/SMT201500276B/it unknown
-
2016
- 2016-07-01 US US15/200,714 patent/US20160304575A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059898A1 (en) * | 1983-11-02 | 2003-03-27 | Genzyme Corporation | Cells, vectors and methods for producing biologically active heterodimeric proteins |
| WO2000063248A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Instituto Massone S.A. | Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them |
| WO2006051070A1 (en) * | 2004-11-09 | 2006-05-18 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
| WO2007065918A2 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh or a fsh mutant |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA028065B1 (ru) | Способ очистки рекомбинантного фсг | |
| EP2504350B1 (en) | Process for the purification of glycoproteins | |
| JP5728016B2 (ja) | 組換えヒトエリスロポエチン（ｅｐｏ）を精製するためのプロセス、このようにして精製されたｅｐｏおよびこれを含む医薬組成物 | |
| BR112013008738B1 (pt) | Method for purification of a protein | |
| KR20040111351A (ko) | 단백질 제제의 안정화 | |
| CN113382716A (zh) | 通过将药物物质和药物产品过程整体化的生物制剂制造的连续制造过程 | |
| WO2011091982A1 (en) | Process for the purification of glycoproteins | |
| CN107129531B (zh) | 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法 | |
| KR20210083174A (ko) | 여포 자극 호르몬의 정제 방법 | |
| US20190023758A1 (en) | Enhanced liquid formulation stability of erythropoietin alpha through purification processing | |
| CN106986928B (zh) | 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法 | |
| WO2023040792A1 (zh) | 一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |