JP6231056B2 - 組換えfshを精製する方法 - Google Patents
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Description
びIVF、ICSI、GIFTまたはCIFT等の受胎支援の準備に使用されている。さらに、ヒトFSHは、FSH生産が低いか無い女性での卵胞成熟の刺激や、先天性または後天性の低ゴナドトロピン性性機能低下症の男性での精子形成の刺激のために使用されている。
年代に導入され、遂には1998年以来、組換えFSHが開発され広く使用されるようになった。組換えDNA技術の到来で、α鎖およびβ鎖 をコードする核酸配列でトランス
フェクトした細胞培養物でヒトFSHを生産することが可能となった。α鎖およびβ鎖をコードするDNA配列と、組換え FSHの生産方法が例えば特許文献1〜3に開示され
ている。
標)という2つの市販の組換えヒトFSH製品があり、これらはいずれもヒト野生型α鎖およびβ鎖をコードするDNA配列をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現させることにより生産されている。
受胎障害の治療におけるFSHの重要性のために、高純度で比活性の高い組換えFSHを提供することが望ましい。FSH治療には注射が繰り返し要求される。高度に精製されFSH製剤は皮下投与が可能であり、これは患者による自己投与を許容し、それにより、患者の便宜および遵守を増大させることが可能である。
アフィニティークロマトグラフィ、2)疎水性相互作用クロマトグラフィ、および3)逆相クロマトグラフィからなる工程を含む方法について記載している。さらに、特許文献4は、FSHを1)陰イオン交換クロマトグラフィ、2)色素アフィニティークロマトグラフィ、3)疎水性相互作用クロマトグラフィ、4)逆相クロマトグラフィ、および5)陰イオン交換クロマトグラフィにかける工程を含むFSHの精製方法を開示している。
オン交換クロマトグラフィ、(2)固定化金属イオンクロマトグラフィ、および(3)疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)からなる工程を含む方法に関する。
クロマトグラフィ、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、および強陰イオン交換クロマトグラフィからなるクロマトグラフィ工程を含む方法について記載している。これらのクロマトグラフィ工程はどの順序で実行されてもよい。
第1態様では、本発明は、組換え卵胞刺激ホルモン(FSH)または組換えFSH変異型を精製する方法であって、
前記FSHまたはFSH変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記3つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない方法を提供する。
第四級アミノエチル(QAE)部分 例えばToyopearl QAE(ドイツ所在のTosoh Bioscience社から入手可能)、Selectacel QAE(セルロースの第四級アミノエチル誘導体、アメリカ合衆国ペンシルバニア所在のPolysciences社から入手可能)等を含む樹脂、
第四級アンモニウム(Q)部分 例えばQ Sepharose XL、Q Sepharose FF、Q Sepharose HP(ドイツ所在のGE Healthcare社から入手可能)、Resource Q(ドイツ所在のGE Healthcare社から入手可能)、Macro Prep High Q(アメリカ合衆国カリフォルニア州Bio−rad)、Toyopearl Super Q(ドイツ所在のTosoh Bioscienceから入手可能)、UNOsphere Q(アメリカ合衆国カリフォルニア州Bio−radから入手可能)およびトリメチルアンモニウムエチル(TMAE)基を含む樹脂、例えばFractogel EMD TMAE(ドイツ所在のMerckから入手可能)を含む樹脂。
オン交換樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる強陰イオン交換クロマトグラフィである。
官能基 −N+(CH3)3
総イオン容量 120μeq/ml
動的容量
150cm/時 180mg/ml
600cm/時 125mg/ml
送出する対イオン Cl-
平均粒径 120μm
推奨される線形流速範囲
50−1200cm/時
化学安定性
2,000時間まで 1.0M NaOH(20℃)
200時間まで 1.0M HCl(20℃)
体積変化
体積変化率
pH4−10 <5%
0. 01−1.0M NaCl <5%
pH安定性 1−14
強陰イオン交換体Q Sepharose HPの特性は以下の通りである:
イオン容量 0.14−0.20 mmol Cl-/ml
動的容量 70mg BSA/ml 媒体
記録流速 30−150cm/時
動作中の充填ベッドに対する最大圧力 3バール(42psi、0.3MPa)
HiLoadカラムハードウェア圧力限界 5バール(73psi、0.5MPa)
平均粒径 34μm
排除限界(Mr) 約4×106球状タンパク質
マトリックス 架橋アガロース、6%
pH安定性 2−12(動作期間および長期間)
1−14(短期間)
化学安定性 一般に用いられているすべての緩衝液において安定
官能基としてジエチルアミノエチル(DEAE)またはジメチルアミノエチル(DMAE)に基づくもののような弱陰イオン交換樹脂の使用は回避することが望ましい。
たはオクチル基で誘導体化された架橋アガロースビーズから成る樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる。Phenyl Sepharose 6FF(GE Healthcare社から入手可能)の特性が以下に与えられる。
Phenyl Sepharose(商標)6 Fast Flow (low sub) 25μmol/ml 媒体
Phenyl Sepharose(商標)6 Fast Flow (high sub) 40μmol/ml 媒体
結合量
Phenyl Sepharose(商標)6 Fast Flow (low sub) 10mg IgG/ml 媒体、24mg HSA/ml 媒体
Phenyl Sepharose(商標)6 Fast Flow(high sub) 30mg IgG/ml 媒体、36mg HSA/ml 媒体
圧力/フロー仕様 200−400cm/時、1バール XK 50/60カラム、ベッド高さ 25cm
pH安定性 2−14(短期間)、3−13(長期間)
化学安定性 通常の緩衝液、カオトロピック剤、界面活性剤、および極性有機溶媒において安定
平均粒径 90μm
保存 20% エタノール
保存温度 4℃から30℃まで
HIC樹脂での結合は、塩(例えばNaCl、(NH4)2SO4またはNa2SO4)の
添加を通じて得られた高い伝導率を備えた緩衝液で達成される。HIC工程における溶出は、5または5周辺から9または9周辺、より好ましくは6または6周辺から8または8周辺、最も好ましくは7または7周辺から8または8周辺のpHを有する緩衝液を用いて、移動相の伝導率を減少させる(つまり塩濃度を低下させる)ことにより通常実行される。
本発明の方法の色素アフィニティークロマトグラフィは、固定化リガンドとして当業者に周知の色素化合物すなわちシバクロンブルーF3G−Aを有する樹脂を使用して行なうことが可能である。用語「固定化」は、当業者によく理解されている用語であって、リガンドが樹脂に化学的に結合されるという意味でリガンドが誘導体化されることを意味する。
好ましい実施形態では、色素アフィニティークロマトグラフィは、任意のマトリックス(例えばアガロースマトリックス)に共有結合されたリガンドとしてのシバクロンブルーF3G−Aを用いて行なわれる。好ましくは、色素アフィニティークロマトグラフィは、Blue Sepharose FF(ドイツ所在のGE Healthcare社から入手可能)として周知の樹脂を使用して行なわれる。Blue Sepharose FFの技術特性は以下に与えられる:
リガンド シバクロンブルーF3G−A
リガンドカップリング方法 トリアジンカップリング
結合量 >18mgヒト血清アルブミン/ml 媒体
リガンド密度 約7μmol シバクロンブルー/ml 媒体
マトリックス 高度に架橋されたアガロース、6%
平均粒径 90μm
pH安定性 4−12(長期間)、3−13(短期間)
保存 20% エタノール、0.1M リン酸カリウム緩衝液、pH8.0
保存温度 4℃から30℃まで
化学安定性 70% エタノール、6M 塩酸グアニジン、8M 尿素で40℃にて7日間において安定
本発明の方法の色素アフィニティークロマトグラフィは、同様の特性を有する代替樹脂で行なわれてもよいことが理解される。代替樹脂の例には以下のものが含まれる:Toyopearl AF−blue−HC−650M(Tosoh Bioscience社)、Blue Cellthru BigBead(Sterogene社)、SwellGel Blue(Pierce社)、Cibachrome blue 3GA−アガロース 100(Sigma社)、AffiGel−Blue(Bio−rad社)、Econo−Pac blueカートリッジ(Bio−rad社)、シバクロンブルー3GA(Sigma社)。
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、
−色素アフィニティークロマトグラフィ、および
さらに陽イオン交換クロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記4つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。
ク質含有量に依存して決まることが理解される。
本発明の陽イオン交換工程に使用される適切な膜吸着体は、当該技術分野で周知であり、いくつかの供給業者から入手可能である。例えば、本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィは再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する膜を使用して行なうことが可能である。有用な膜吸着体の例は、Sartorius社により販売されているSartobind S膜吸着体である。Sartobind S膜吸着体の技術的なデータは以下に与えられる。
名称 Sartobind SingleSep(登録商標)(強酸陽イオン交換体S)リガンド スルホン酸(R−CH2−SO3 -)
静的結合量 ≧0.8mg/cm2 (29mg/ml)ウシ血清アルブミンおよび鶏卵リゾチームで測定
イオン交換能 4−6μeq/cm2
膜
基材 安定化強化セルロース
膜厚 275μm
公称孔径 >3μm
カプセル
設計 円筒状、公称の層数:15
ベッド高さ:4mm
材料カプセル ポリプロピレン(FDA)
最大圧力 0.4 MPa(4バール、58psi)
pH安定性 3−14(短期間)
保存 1回使用後、廃棄
化学安定性 1M NaOH(20℃で30−60分)、8M 尿素、8M 塩酸グアニジン、エタノール、アセトンおよび100% アセトニトリルにおいて、クロマトグラフィで一般に用いられているすべての緩衝液において安定。酸化剤はなし。
CEC工程、好ましくは陽イオン細胞膜吸着体工程は、処理時間を短く維持しつつすべての分子の大きさの宿主細胞タンパク質を除去することが分かった。FSHはpH7.0では吸着体に結合しないため、約95%という収率は非常に有利である。
別の態様では、本発明による組換えFSHまたはFSH変異型を精製する方法は、 前記FSHまたはFSH変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、
−色素アフィニティークロマトグラフィ、
−任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、および
さらなる陰イオン交換クロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記クロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。
イオン交換樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる強陰イオン交換クロマトグラフィである。本発明の目的で使用可能な強陰イオン交換樹脂の好ましい例は、UNOsphere QおよびQ Sepharose HPとして当該技術分野で周知の第四級アンモニウム強陰イオン交換体樹脂、ならびに第四級アンモニウム基(Q)部分を有する他の樹脂である。強陰イオン交換体UNOsphereQおよびQ Sepharose HPの特性は、第1の陰イオン交換クロマトグラフィに関して与えた通りである。第2の陰イオン交換クロマトグラフィ工程でも、官能基としてジメチルアミノエチル(DEAE)またはジメチルアミノエチル(DMAE)に基づくもの等の弱陰イオン交換樹脂の使用を避けるのが好ましい。
別の態様では、本発明による組換え卵胞刺激ホルモン(FSH)または組換えFSH変異型を精製する方法は、前記FSHまたはFSH変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記3つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まず、
前記方法は、サイズ排除クロマトグラフィをさらに含む。
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、
−色素アフィニティークロマトグラフィ、
−任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、
−任意選択のさらなる陰イオン交換クロマトグラフィ、および
−サイズ排除クロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記6つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。
有用なサイズ排除クロマトグラフィマトリックスの例は、例えばGE Healthcare社から入手可能な、Superdex 75 pgとして当該技術分野で周知のマトリックスである。Superdex 75 pgカラムは、サイズによるタンパク質、ペプチドおよび他の生体分子の高分解能の分離を可能にする。一般に、サイズ排除カラムは精製手順における研摩工程にとって理想的である。
排除限界(Mr) 1×105 球状タンパク質
分離範囲(Mr) 3000−70000 球状タンパク質
マトリックス 架橋アガロースとデキストランからなる球状複合体
平均粒径 34μm
化学安定性 すべての一般的な緩衝液において安定:
1M 酢酸、8M 尿素、6M 塩酸グアニジン、30% イソプロピルアルコール、70% エタノール、1M NaOH(定置洗浄用)
pH安定性 3−12(動作時間および長期間)および1−14(短期間)
Superdex(商標) 10×300 GLカラム(Tricorn)*
ベッド寸法 10×300mm
推奨サンプル体積 25−250μl
ベッド体積 24ml
最大圧力 18バール(261psi、1.8MPa)
最大流速(25℃の水) 1.5ml/分
理論段 >30 000m-1
Superdex(商標) PC 3.2/30カラム
ベッド寸法 3.2×300mm
ベッド体積 2.4ml
推奨サンプル体積 2−25μl
最大圧力 24バール(348psi、2.4MPa)
最大流速(25℃の水) 0.100ml/分
理論段 >30 000m-1
保存 20% エタノール
保存温度 4℃から30℃まで
SEC工程は製造業者のプロトコルに従って行なうことが可能である。例えば、リン酸ナトリウム緩衝液はpH6〜8、好ましくは約pH7.0で使用することが可能である。
膜 ポリエーテルスルホン(PESU)またはHydrosart(登録商標)
分子量カットオフ値 10kD
フィルタ面積 0.02〜0.7m2
供給圧 4バール(58psi)最大
pH安定性 1−14
動作温度 20℃において最大50℃
洗浄 1M NaOH、40℃
消毒 1M NaOH、40−50℃、30分
保存 0.1M NaOH
Sartorius社により販売されている交差流カセットに使用されているポリエーテルスルホン膜(PESU)は、広範pHと温度範囲を特徴とする安定な膜ポリマーである。
さらに、本発明の方法は、免疫親和性クロマトグラフィがないことが好ましい。免疫親和性クロマトグラフィ工程のないFSHの精製により、抗体の調製から生じる不純物または病原体がFSH化合物と干渉する可能性が無くなる。
本発明の方法に使用される適切な膜吸着体が、当該技術分野で周知であると共に、いくつかの供給業者から入手可能である。例えば、本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィは、再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する膜を使用して行なうことが可能である。有用な膜吸着体の例は、Sartorius社により販売されているSartobind S膜吸着体である。その技術的詳細は上述した。
前記方法は弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも、それらの好ましい実施形態も含まない。
用語「FSH」は、組換え技術により生産されてもよいし、閉経後の女性の尿等のヒ
トの供給源から分離されてもよい、ヒトFSHすなわち「hFSH」を含む がこれに限
定されない全長成熟タンパク質としての卵胞刺激ホルモンポリペプチドのことを指す。 ヒト糖タンパク質のタンパク質配列およびヒトFSHβサブ ユニットのタンパク質配列
は、科学論文および特許文献(例えば国際公開第2004/087213号参照)から当業者には知られている。
れ、ヒトFSHのβ鎖のアミノ酸配列は配列番号2で示される。これらのア ミノ酸配列
は、EMBLデータベースでアクセッション番号J00152およびNCBIデータベースでアクセッション番号NM000510でそれぞれ寄託されたヒトFSHのα鎖およびβ鎖野生型アミノ酸配列に相当する。
組換えFSHは、ヒトで天然に見出される野生型核酸配列によってコードされてもよいし、またはその発現が野生型アミノ酸配列(つまりヒトで天然に見出される野生型タンパク質配列)を有するFSHになる変更された核酸配列によってコードされてもよい。
する核酸配列の一方又は両方を、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞でのコドン使用に適合させて、かかる宿主細胞での組換えFSHの発現レベルおよび収率を増加させるように変更されてもよい。
が、国際公開第2009/000913号に記載されている。ヒトFSHのβ鎖をコードする修飾核酸配列は、配列番号5で示される核酸配列のコード領域であり(配列番号5において、コード領域はヌクレオチド56から開始し、ヌクレオチド442まで延びる)、ヒトFSHのα鎖をコードする修飾核酸配列は、配列番号6で示される核酸配列のコード領域である(配列番号6で、コード領域 はヌクレオチド19から開始し、ヌクレオチド
366まで延びる)。ヒトFSHのβ鎖をコードする第1の修飾核酸配列と、ヒトFSHのα鎖をコードする第2 の修飾核酸配列とを有する組換え核酸分子を備えたCHO細胞
系を、2007年3月28日に寄託番号DSM ACC2833の下、ブラウンシュベイク (Braunschweig)所在のドイツ細胞バンク(DSMZ)に寄託した。
、またはサブユニット間結合が異なるが、FSH活性は示す分子を包含する ことを意味
する。例にはCTP−FSHが含まれ、これはLaPoIt et al. (1992)Endocrinology, 131, 2514-2520またはKlein et al. (2003)Human Reprod., 18, 50-56に記載されているような、野生型αサブユニットと、hCGのカルボキシ末端ペプチドがFSHのβサブユニットのC末端に融合されたハイブリッド βサブユニットとから成る長時間作用性修飾組
換えFSHである。単一鎖CTP−FSHも含まれるが、これはhCGのカルボキシ末端ペプチドがFSHのβサ ブユニットのC末端に融合されたKlein et al. (2002)Fertility & Sterility, 77, 1248-1255に記載された単一鎖分子である。FSH変異型の他の例
には、国際公開第01/58493号に開示されるようなα鎖およびβ鎖の少なくと も
一方に追加のグリコシル化部位組み込まれたFSH分子や、国際公開第98/58957号に開示されるようなサブユニット間S−S結合を有するFSH分子 が含まれる。国際
公開第2004/087213号には、βサブユニットのカルボキシ末端の欠失が特徴であるFSH変異型の他の例が開示されている。FSH 変異型の他の例には、追加のグリ
コシル化部位を導入するか天然のグリコシル化部位を削除するようにタンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより、野生型のFSHと比較してグリコシル化の程度を変更させたFSH分子が含まれる。
FSH変異型の調製を指す(例えば国際公開第85/01958号参照)。 FSHのゲ
ノムおよび相補的DNAクローンの配列がいくつかの種のαサブユニットとβサブユニットについて知られている。組換え技術を使用した組換え FSHまたはFSH変異型の種
々の生産方法が先行技術に記載されており、例えば欧州特許出願出願公開第0 711 894号および欧州特許出願出願公開第0 487 512号を参照されたい。
別の態様では、本発明は、本発明による精製方法によって得られた、精製されたFSHまたはFSH変異型タンパク質に関する。
ブユニットの純度、グリコシル化パターン、シアリル化および酸化等の特性がバッチによって大幅に変わる。組換えFSHではバッチごとの一貫 性と純度が大きいため、かかる
ホルモンは容易に等電点電気泳動(IEF)等の技術を使用して容易に識別および定量化することが可能である。組換えFSHの 識別および定量化が可能となるその容易さによ
り、バイオアッセイにより充填せずにホルモンの質量で(fill-by-mass)ガラス瓶に充填することが 可能となる。
質〜約16,000IU FSH/mgタンパク質の範囲である。例えば、市販製品であ
るPuregon(Organon社)中の組換えヒトFSHは、約10,000IU
FSH/mgタンパク質の特異的生物活性を有し、Serono社のGonal−fの場合、組換えヒトFSHの生物活性は約13,600IU FSH/mgタンパク質である
。
理された未熟ラットの卵巣を拡大させるFSH効果と、標準品の同じ効果とを比較することにより推定される。
本発明の方法で得られるFSHまたはFSH変異型の純度は、少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは99%よりも大きい。純度の程度はHPLC分析により決定可能である。そのような分析を行なうための適切な材料およびプロトコルをVydacまたはTOSHO Bioscience等の供給業者から得ることが可能である。
実施例
実施例1
実施例1
組換え技術による組換えヒトFSHの調製
組換えヒトFSHは、トランスフェクトされたCHO宿主細胞中で標準的方法により生産さ れる。かかる方法は、ヒトFSHのα鎖とβ鎖をコードする1または複数の組換え核
酸分子から、組換えヒトFSHを生産するCHO細胞クローンを生成し、かつ宿主細胞を適切な条件で培養することを含む。次に組換えヒトFSHは、本発明に従って細胞培養物からを精製される。
実施例2
細胞培養物からのFSHの精製
精製スキームは以下の通りである:
陰イオン交換クロマトグラフィ工程
↓
HIC工程
↓
色素アフィニティー工程
↓
ウイルス不活性化
↓
10kDa UF/DF
↓
陽イオン膜吸着体
↓
陰イオン交換クロマトグラフィ工程
↓
10kDa UF
↓
サイズ排除クロマトグラフィ工程
↓
ナノろ過
発酵期間は28日とし、発酵体積は30Lとした。収穫物は0.22μmでろ過し、逆浸透水で3.5倍で希釈した。
希釈した細胞培養物の上清収穫物を、UNOsphere Qとして当該技術分野で知られている第四級アンモニウム基の強陰イオン交換樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィにかけた。このマトリックスはBioRadから入手可能である。
(5CV)で洗浄し、タンパク質を50mM Tris−HCl、200mM NaCl、pH7.6(8CV)を使用して溶出した。この工程の収率は90%以上であった。
HICを、フェニル基で誘導化した架橋アガロースビーズから成る樹脂を使用して実行した。Phenyl Sepharose 6FF(GE Healthcare社から入手可能)は、アガロースに基づく高度に架橋された誘導体である。Phenyl Sepharose 6FFは物理的および化学的に安定しており、高い流量と樹脂寿命の増大を許容する。この樹脂の技術的詳細については上述した。
Tris−HCl、0.8M NaCl、pH 7.6(6CV)で溶出した。
ータは、この開発されたHIC工程が、合理的な収率と産物品質とを伴う非常に効率的な精製工程であることを示している。
ブルー Sepharose FF(GE Healthcare社から入手可能)を、色素アフィニティークロマトグラフィ工程に使用した。HIC溶出液を50mM Tris−HCl pH7.6で4倍で希釈した。カラムを50mM Tris−HCl、pH7.6(3CV)を使用して平衡化し、1:4の希釈HIC溶出液を載せた。次にカラムを50mM Tris−HCl、pH 7.6(3CV)で洗浄し、FSHタンパク質を50mM Tris−HCl、4M NaCl、pH 7.6(6CV)で溶出した。
限外および透析ろ過を、標準プロトコルに従って通常通りに行った。有用なUF/DF装置は、Sartorius社製のSartocon限外ろ過/透析ろ過カセット(ポリエーテルスルホン(PESU)、10kD)である(フィルタ面積:14,000cm2
、UF係数:13−20、DF係数:8−10、装填量(load):0.1〜0.5mg FSH/cm2)。UF/DF装置による透析ろ過を、限外ろ過(濃縮)係数13〜20
および透析ろ過係数8〜10で一般に実行した。
着体に直接載せた。
本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィを、再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する膜を使用して行なった。そのような膜吸着体は、Sartobind S膜吸着体の商標名でSartor
ius社から入手可能である。Sartobind S膜吸着体は、リガンドが固定化されたいくつ
かの膜層を備えたカプセルである。この膜吸着体は、処理時間が短く、かつ緩衝液の体積が小さいという利点を有する。使い捨ての考え方であるため、確認にかかるコストと時間は無視できる。
UF/DF保持液(約100mL)を載せた。その後、吸着体を20mM Tris−HCl、pH 7.0(200mL)で洗浄した。
Q Sepharose HPとして当該技術分野で知られている第四級アンモニウム基の強陰イオン交換樹脂を用いて、第2の陰イオン交換クロマトグラフィを行なった。この樹脂はGE Healthcare社から入手可能である。
8.5(3CV)で洗浄し、最後に20mM Tris−HCl、60mM NaCl、pH 8.5(5CV)で洗浄した。その後、FSHを20mMTris−HCl、130mM NaCl、pH 8.5(6CV)で溶出した。
10kDa UF:
10kDa限外ろ過を、Sartorius社製のSartocon限外ろ過カセット(PESU、10kD)(フィルタ面積:3,000cm2、UF係数:10−20、装
填量(load):0.2〜1.0mg FSH/cm2)を使用して、標準プロトコルに従
って行った。限外ろ過は通常、10〜30の限外ろ過(濃縮)係数で一般に実行した。
サイズ排除クロマトグラフィはSuperdex 75pg(GE Healthcare社から入手可能)を使用して行なった。カラムを50mM Na−PO4、pH7.
0(2CV)を使用して平衡化した。10kDa UFh保持液をカラム(0.025C
V)に載せ、その後、カラムを50mM Na−PO4、pH7.0(2CV)で洗浄し
た。
ナノろ過:
最後に、SEC溶出液をAsahi Kasei Medical社により販売されているPlanova 15Nフィルタ(平均孔径15nm)を使用してナノろ過した。目標装填最大値は2.5mL/cm2とした。ろ過は供給業者のプロトコルに従って行なっ
た。
SE−HPLC (二量体およびより高い分子量の関連物質)<1%
SDS−PAGE、還元)(コロイド法) 純度 >97%
HCP(汎用)< 10ppm
DNA < 0.006pg/IU FSH
組換えヒトFSHの生物活性は少なくとも約10,000IU/mgと決定された。好ましくは、組換えヒトFSHまたはFSH変異型の生物活性は約10,000IU/mgから約17,000IU/mgまでの範囲であり、より好ましくは、生物活性は少なくとも約12,000IU/mgであり、最も好ましくは、生物活性は少なくとも約15,000IU/mgである。
配列表:
配列番号1:ヒトFSHのα鎖のアミノ酸配列
配列番号2:ヒトFSHのβ鎖のアミノ酸配列
配列番号3:ヒトFSHのα鎖をコードする野生型の核酸配列
配列番号4:ヒトFSHのβ鎖をコードする野生型の核酸配列
配列番号5:ヒトFSHのβ鎖をコードするコドン最適化した核酸配列
配列番号6:ヒトFSHのα鎖を子オードするコドン最適化した核酸配列
Claims (3)
- 組換えヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)の製造方法であって、
ヒトFSHのα鎖とβ鎖をコードする1または複数の組換え核酸分子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞クローンの細胞培養物から前記組換えヒトFSHを精製する工程
を含み、
前記精製工程は、前記FSHを含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記3つのクロマトグラフィは前記記載の順序で実施され、
該工程は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない、方法。 - 前記FSHを、医薬として許容される賦形剤とともに医薬組成物の形態に製剤化する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 組換えヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)を含有する医薬組成物の製造方法であって、
a)ヒトFSHのα鎖とβ鎖をコードする1または複数の組換え核酸分子から、組換えヒトFSHを生産するCHO細胞クローンを生成する工程、
b)前記CHO宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、
c)前記細胞の培養物から前記組換えヒトFSHを精製する工程であって、前記FSHを含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記3つのクロマトグラフィは前記記載の順序で実施され、
弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない、精製工程、およ
び
d)前記FSHを、医薬として許容される賦形剤とともに医薬組成物の形態に製剤化する工程を含む、方法。
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