MXPA06008126A

MXPA06008126A - Metodos para la produccion de peptidos/proteinas en plantas y peptidos/proteinas producidos de este modo.

Info

Publication number: MXPA06008126A
Application number: MXPA06008126A
Authority: MX
Inventors: Marcia J Kieliszewski; Jianfeng Xu; John Kopchick; Shigeru Okada
Original assignee: Univ Ohio
Priority date: 2004-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2008-02-14
Also published as: EP1711533B1; US9006410B2; EP2133427A1; US20100029548A1; EP2133427B1; US20110217766A1; NZ548513A; JP2013208114A; US20100028993A1; AU2005206885A1; CA2553257A1; WO2005069845A2; AU2005206885B2; US20110230404A1; EP1711533A4; HK1139180A1; US20060148680A1; US8962811B2; US20140024806A1; US20060026719A1

Abstract

Metodos de incrementar el rendimiento en la expresion en plantas de proteinas recombinantes que comprenden: manipular sitios de glicosilacion en genes clonados o ADNc para proteinas, usando codones que accionan modificaciones post-traslacionales en plantas; y manipular los genes clonados o ADNc para que contengan una secuencia de senales secretorias en plantas que direcciona los productos genicos (proteinas) para su secrecion, los metodos dan por resultado rendimientos incrementados de proteinas glicosiladas recombinantes; se exponen proteinas producidas de acuerdo con estos metodos.

Description

MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PEPTIDOS/PROTEINAS EN PLANTAS Y PEPTIDOS/PROTEINAS PRODUCIDOS DE ESTE MODO El trabajo que llevó a esta invención se apoyó, al menos en parte, por el apoyo económico NSF No. MCB9874744 y el proyecto USDA No. OHOW200206201. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención. Esta solicitud reclama prioridad a las solicitudes provisionales de los Estados Unidos Nos. 60/536,486, presentada el 14 de enero de 2004, y 60/582,027, presentada el 22 de junio de la 2004, y 60/602,562, presentada en 18 de agosto de 2004, la descripción total de cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos novedosos para la producción de péptidos de fusión, polipéptidos, y proteínas en plantas, las construcciones de ácidos nucleicos utilizadas en estos métodos, y los productos producidos de conformidad con estos métodos. Los métodos generalmente incluyen la expresión del péptido, polipéptido, o proteína como proteínas de fusión, los cuales son glicosilados por la planta. En algunas modalidades, se expresa un péptido señal basado en una planta como parte de la proteína de fusión. De conformidad con la presente invención, se presentan glicoproteínas novedosas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El mantenimiento de los tejidos vegetales jóvenes en crecimiento depende en gran parte de la turgencia de células constreñidas por una pared celular elástica que comprende tres redes interpenetrantes, es decir, glicoproteínas ricas en celulósico-xiloglucano, pectina, y ricas en hidroxiprolina (HRGPs). Cuando estas redes se encuentran sueltas, la turgencia dirige la extensión de la célula. Significativamente, las HRGPs no tienen homólogos en los animales, enfatizando así una función específica de plantas. Cuantitativamente, la mayoría de las HRGPs de superficie celular (extensinas) forma una red en la pared celular covalentemente entrecruzada. A diferencia de las extensinas, otra serie de HRGPs, arabinogalactano-proteínas (AGPs) se presentan como monómeros que están hiperglicosilados por los polisacáridos del arabinogalactano. Las AGPs inicialmente se unen a la membrana plasmática mediante un anclaje lipídico cuya escisión resulta en su movimiento a partir del periplasma a través de la pared celular hacia el exterior. Aunque están implicadas en diversos aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, las funciones precisas de las AGPs permanecen poco claras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos novedosos para la producción de glicoproteínas en plantas. Las glicoproteínas incluyen un elemento de sitio de glicosilación y un elemento de proteína núcleo. En algunas modalidades, el elemento de proteína núcleo puede ser de origen de mamífero (incluyendo de humano), y en algunas modalidades, el elemento de proteína núcleo puede ser una proteína biológicamente activa. En algunos casos, la proteína puede ser una proteína recombinante aprobada por la FDA que se utiliza terapéuticamente, por ejemplo la hormona de crecimiento recombinante de humano ("hGH"). El sitio de glicosilación es una secuencia de aminoácidos que actúa como un blanco para la glicosilación de la planta. Una característica del presente método es un incremento en el rendimiento de la producción de proteína. Mediante la inclusión de un sitio(s) de glicosilación y una secuencia de péptido señal en la proteína expresada, el rendimiento de la proteína recombinante se incrementa considerablemente en comparación con la expresión de la misma proteína en plantas sin el sitio de glicosilación y la secuencia peptídica de señal. Las glicoproteínas producidas de conformidad con el método exhiben ventajas adicionales sobre sus contrapartes de tipo silvestre, incluyendo solubilidad incrementada, resistencia incrementada a las enzimas proteolíticas, y estabilidad incrementada. Otra característica importante incluye vida media biológica incrementada en comparación con las proteínas de tipo silvestre. Se establecerán características y ventajas adicionales de la invención en parte en la descripción a continuación, y en parte serán evidentes a partir de la descripción, o se pueden aprender por la práctica de la invención. Las características y ventajas de la invención pueden ser considerados y se pueden alcanzar por medio de los elementos y combinaciones particularmente señaladas en las reivindicaciones anexas. La presente invención provee construcciones de ácido nucleico para la expresión de al menos una proteína biológicamente activa en plantas que comprende: a) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un sitio de glicosilación utilizado en plantas y b) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína biológicamente activa. La invención también provee proteínas de fusión biológicamente activas derivadas de plantas que comprenden a) al menos un glicomódulo covalentemente asociado a b) una proteína biológicamente activa. En algunas modalidades, el al menos un glicomódulo comprende un sitio de glicosilación elegido a partir de i) X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, ii) X-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y iii) (X-Hyp)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 1000; en donde X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly, y Val, pero más preferiblemente se selecciona a partir de Ser, Thr, Val, y Ala. En algunas modalidades, el al menos un glicomódulo está covalentemente asociado a una ubicación elegida a partir de la N- terminal y/o de la C-terminal de la proteína. En algunas modalidades, el al menos un glicomódulo se encuentra en el interior de la proteína de mamífero biológicamente activa. Aunque Lys, Ser, Thr, Val, Gly, y Ala, se identificaron específicamente anteriormente como que correspondían a X, se cree que cualquier aminoácido puede servir a ese propósito, y que el motivo estará glicosilado en las plantas. La proteína de mamífero biológicamente activa se puede seleccionar a partir de un grupo que incluye a la hormona de crecimiento, antagonistas de la hormona de crecimiento, la hormona liberadora de la hormona de crecimiento, somatostatina, grelina, leptina, prolactina, proteína quimioatrayente de monocito-1 , interleucina-10, pleiotropina, interleucina-7, interleucina-8, ¡nterferón omega, interferón-alfa 2a y 2b, interferón gamma, interleucina-1 , factor de crecimiento del fibroblasto 6, IFG-1 , factor de crecimiento semejante a insulina 1 , insulina, eritropoietina, GMCSF, y cualquier anticuerpo monoclonal humanizado o anticuerpo monoclonal, en donde el glicomódulo comprende un sitio de glicosilación elegido a partir de i) X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, ii) X-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y iii) (X-Hyp)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 1000; y en donde X se selecciona a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly, y Val, y preferiblemente es Ser, Ala, Thr, y Val. En algunas modalidades, el glicomódulo comprende (X-Hyp)n, X se selecciona a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, más preferiblemente Ser, Ala, Thr, y Val, y n = 1-1000. En algunas modalidades, la proteína es la hormona de crecimiento de humano, y el glicomódulo comprende (Ser-Hyp)?o. Aunque Lys, Ser, Thr, Val, Gly, y Ala, se identifican específicamente como que corresponden a X, se cree que cualquier aminoácido puede servir a ese propósito, y que el motivo estará glicosilado en las plantas. En algunas modalidades, las glicoproteínas de fusión de mamífero biológicamente activas derivadas de plantas de la invención están covalentemente asociadas a al menos una molécula de carbohidrato. En algunas modalidades, el carbohidrato es una porción de arabinogalactano, y en algunas es una porción de arabinosilo. La invención también provee métodos para incrementar la solubilidad acuosa de una molécula de proteína, en donde: se prepara una construcción de ácido nucleico que codifica a) al menos un sitio de glicosilación y b) al menos un péptido o proteína; y expresa la construcción de ácido nucleico como una glicoproteína; en donde el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o igual a aproximadamente 10% del peso molecular de la glicoproteína. El componente de carbohidrato de la glicoproteína puede corresponder a más de o igual a aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, o aproximadamente 90% del peso molecular de la glicoproteína. La invención también provee métodos para la producción de una glicoproteína de fusión biológicamente activa, que comprende expresar en una planta al menos una construcción de ácido nucleico que comprende a) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un sitio de glicosilación y b) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína biológicamente activa, como una glicoproteína; en donde el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o igual a aproximadamente 10 kD y en donde el componente carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o igual a aproximadamente 10% del peso molecular de la glicoproteína. En algunas modalidades, el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o igual a aproximadamente 35 kD, aproximadamente 40 kD, aproximadamente 45 kD, aproximadamente 50 kD, o aproximadamente 55 kD. En algunas modalidades, la vida media farmacocinética de la glicoproteína es mayor que la vida media farmacocinética de una proteína de tipo silvestre correspondiente. En algunas modalidades, el al menos un sitio de glicosilación se elige a partir de i) X-Pron, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y ii) (X-Pro)n? en donde n es de 2 a aproximadamente 1000; en donde X es cualquier aminoácido o se selecciona a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val. Por supuesto, n puede tener un intervalo de 4 a 200 o de 6 a 100 o de 8 a 50 o de 10 a 25, o cualquier número entre éstos o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, la proteína biológicamente activa es la hormona de crecimiento de humano y la glicoproteína comprende (Ser-Hyp)10, y en algunas modalidades, el (Ser-Hyp)10 está covalentemente asociado a la C-terminal de la proteína hormona de crecimiento de humano. La invención también provee formulaciones farmacéuticas inyectables que comprenden la hormona de crecimiento glicosilada de humano, y excluyen excipientes adicionales normalmente requeridos para solvatar o incrementar la solubilidad de las proteínas. En algunas modalidades, la formulación excluye al menos un excipiente elegido a partir de mannitol, sorbitol, trehalosa, glucosa, glicina, leucina, trileucina, histidina, y fosfolípido. En algunas modalidades, la hormona de crecimiento glicosilada de humano comprende un glicomódulo elegido a partir de i) X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 100, y en donde X es cualquier aminoácido, o se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val, ii) X-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 100, y en donde X es cualquier aminoácido, o se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val, y ¡ii) (X-Hyp)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido o se selecciona a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val. La hormona de crecimiento glicosilada puede comprender X-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 20; en donde X se selecciona a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val. La invención también provee formulaciones liofilizadas en polvo de la hormona de crecimiento glicosilada de humano que exhibe una solubilidad mayor que o igual a aproximadamente 10 mg/ml, en donde la formulación excluye excipientes adicionales requeridos para la solubilidad del péptido. En algunas modalidades, el excipiente se elige a partir de mannitol, sorbitol, trehalosa, glucosa, glicina, leucina, trileucina, histidina, y fosfolípido.

La invención provee adicionalmente métodos para incrementar el rendimiento en la producción vegetal de una proteína, que comprende preparar una construcción de ácido nucleico que comprende a) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal para secreción, b) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un sitio de glicosilación, y c) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína; y que expresa la construcción de ácido nucleico como una glicoproteína en plantas o en cultivos de célula vegetal. En algunas modalidades, el al menos un sitio de glicosilación de HRGP se elige a partir de i) X-Pron, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y ¡i) (X-Pro)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 1000; en donde X es cualquier aminoácido, o se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val. La construcción de ácido nucleico también puede incluir o excluir una secuencia de ácido nucleico que codifica proteína fluorescente verde. La invención también provee proteínas producidas de conformidad con estos métodos. La invención también provee moléculas de la hormona de crecimiento covalentemente asociadas a una secuencia de aminoácidos que comprende un glicomódulo, en donde el glicomódulo se elige a partir de i) X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 100, ii) X-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 100, y ii) (X-Hyp)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 100; en donde X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

La invención también provee moléculas antagonistas de la hormona de crecimiento covalentemente asociadas a una secuencia de aminoácidos que comprende un glicomódulo, en donde el glicomódulo se elige a partir de i) X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 100, ii) X-Hypp, en donde n es de 2 a aproximadamente 100, y ii) (X-Hyp)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 100; en donde X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val, o más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, y Val. También se proveen métodos para el tratamiento de un paciente que padece de deficiencia o insuficiencia de la hormona de crecimiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la hormona de crecimiento glicosilada de humano. También se proveen métodos para el tratamiento de un paciente que padece de exceso de la hormona de crecimiento de humano o de exceso de la acción de la hormona de crecimiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista de la hormona de crecimiento glicosilada de humano. Se debe entender que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son solamente ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reclama. Los dibujos anexos, los cuales se incorporan y constituyen una parte de esta especificación, pueden ilustrar modalidades de la invención, y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra series de oligonucleótidos utilizados para construir los genes sintéticos (a) [Gum]n (n = 8, 20)m, y (b) [HP]m (m = 2, 4, 8) mediante preparación mutua y extensión. La superposición está subrayada. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 2 muestra la secuencia de ADN del gen sintético (a) [Gum]3, (b) [Gum]8 y [Gum]20 construido en el plásmido pUC18 entre la secuencia señal (subrayada) y el gen GFP. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 3 muestra la secuencia de ADN del gen sintético [HP] y [HP]8 construido en el plásmido pUC18 entre la secuencia señal (subrayada) y el gen GFP. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 4 muestra la secuencia de ADN del gen sintético [Gum]8[HP]2 y [Gum]8[HP]4 construido en el plásmido pUC18 entre la secuencia señal (subrayada) y el gen GFP. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 5 muestra una representación esquemática de la construcción del cassette del gen hGH-(SP)-?o-EGFP. La figura 6 muestra una representación esquemática de la construcción del cassette del gen hGH-(SP)?0.

La figura 7 muestra una representación esquemática de la construcción del cassette del gen INF-(SP)10. La figura 8 muestra una representación esquemática de la construcción del cassette del gen HSA-(SP) 0. La figura 9 muestra una representación esquemática de la construcción del cassette del gen Dominiol-(SP)?0 . La figura 10A muestra la construcción génica para la expresión de la hormona de crecimiento de humano (hGH) con un motivo (Ser-Hyp)?o unido. La figura 10B muestra cómo el gen (SP)10 se construyó mediante extensión del iniciador. La figura 11 muestra la construcción génica para la expresión de la hormona de crecimiento de humano (hGH) conectada a la proteína fluorescente verde, con un motivo (Ser-Hyp)-?o que conecta los dos. La figura 12 (A y B) muestra la construcción génica para la expresión de albúmina de suero de humano (HSA) con un motivo (Ser-Hyp)?o unido. La figura 13 muestra la construcción génica para la expresión del dominio I de albúmina de suero de humano con un motivo (Ser-Hyp)?o unido. La figura 14 muestra la construcción génica para la expresión del interferón-alfa 2a (INF2a) con un motivo (Ser-Hyp)-?o unido. La figura 15 muestra la detección de equivalentes de hGH secretada dentro del medio de diez líneas de células de tabaco transformadas con cualquier hGH-(SO)?o y hGH.

La figura 16 muestra el curso de tiempo del crecimiento celular y la producción de equivalentes de hGH en el medio de cultivo de células de tabaco transformadas con hGH-(SP)?o- La figura 17 muestra la detección por Western blot de hGH-(SO)-?o (panel izquierdo) y hGH-(SO)?o-EGFP en medio de cultivo. La figura 18 muestra perfiles cromatográficos para el aislamiento de hGH-(SO)?o y hGH-(SO)?0-EGFP mediante CLAR en fase reversa. La figura 19 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-hGH-(SP-?). Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 20 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-hGH-(SP)2. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 21 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-hGH-(SP)5. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 22 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-hGH-(SP)2o- Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 23 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-(SP)?0-hGH-(SP)?o. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas.

La figura 24 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-hGHA-(SP)?0. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 25 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-INF-(SP)5. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 26 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-(SP)5-INF-(SP)5. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 27 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-(SP)5-INF. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 28 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-INF-(SP)2o- Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 29 muestra la secuencia génica de la construcción SStob-(SP)?o-INF-(SP)?0. Los sitios de restricción se encuentran en letras itálicas negritas. La figura 30 muestra una curva de unión para hGH-(SP)10-EGFP. La figura 31 muestra una curva de unión para hGH comercialmente disponible. La figura 32 muestra una curva de unión para hGH-(SP)-]0.

La figura 33 muestra la concentración en suero de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?0 después de una administración particular a cada uno de los ratones. La figura 34 muestra la concentración en suero de IGF-1 después de una administración particular a los ratones de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?o- La figura 35 muestra la concentración en sangre de equivalentes de hGH después de una administración particular de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?0 a los ratones. La figura 36 muestra la concentración en suero de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?o (y controles con PBS) después de dos administraciones por día por cinco días a los ratones. La figura 37 muestra la concentración en suero de IGF-1 después de la administración de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)-?o (y PBS control) después de dos administraciones por día por cinco días a los ratones. La figura 38 muestra los niveles de la hormona de crecimiento después de la administración una vez al día de una menor concentración (1 µg/gm) de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?0 (y PBS control) por cinco días. La figura 39 muestra la concentración en suero de IGF-1 después de la administración de una menor concentración (1 µg/gm) de hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?0 (y PBS control) después de una administración por día por cinco días. La figura 40 muestra el incremento en masa corporal durante el curso de un tratamiento de dos semanas con hGH comercialmente disponible y hGH-(SP)?0.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La conexión entre la estructura y la función es una de las lecciones profundas en biología. Al menos dos aspectos de la biología estructural de la glicoproteína rica en hidroxiprolina (HRGP) parecen ser de importancia funcional: glicosilación y entrecruzamiento covalente. Debido a que las HRGPs tienden a ser glicoproteínas modulares extendidas repetitivas, la investigación que lleva a este punto se ha enfocado en la disección de propiedades funcionales de la HRGP, módulo por módulo. Los genes sintéticos se diseñaron como análogos de cada módulo putativo. Este método permite muchos descubrimientos: códigos de glicosilación para deciframiento, elucidación estructural de los glico-sustituyentes, identificación de motivos entrecruzados, y el diseño de glicoproteínas novedosas, incluyendo productos biomédicos mejorados. El presente trabajo se extendió, y se expandió según, la hipótesis de contigüidad Hyp originalmente propuesta por Kieliszewski et al. Actualmente se ha descubierto que este código de glicosilación O-Hyp pronostica los sitios de glicosilación y sustituyentes de HRGPs. La presente descripción aplica este descubrimiento de numerosas formas. Algunas modalidades se dirigen a métodos para mejorar el rendimiento de la producción de proteínas en plantas. Algunas modalidades incluyen proteínas modificadas producidas de conformidad con la presente descripción, las cuales pueden exhibir propiedades generales mejoradas, y ventajas específicas in vivo, incluyendo vida media biológica extendida y biodisponibilidad mejorada. A continuación se describirá la presente invención con referencia a las modalidades más detalladas, con referencia ocasional a los dibujos anexos. No obstante, esta invención puede estar incorporada en diferentes formas y no debe considerarse como limitante de las modalidades establecidas en la presente invención. Más bien, estas modalidades se proveen de manera que esta descripción transmitirá cabalmente y completamente el alcance de la invención a aquellos expertos en la técnica. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un experto en la técnica al cual pertenece esta invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención aquí es solamente para describir modalidades particulares y no se pretende que sea limitante de la invención. Como se utiliza en la descripción de la invención y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" se pretende que también incluyan las formas plurales, a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente invención se incorporan expresamente como referencias en su totalidad. A menos que se indique de otra manera, se entiende que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, y así sucesivamente utilizados en la especificación y en las reivindicaciones pueden ser modificados en todos los casos mediante el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente especificación y en las reivindicaciones anexas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. Por último, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe ser considerado a la luz de los números de dígitos significativos y métodos ordinarios de redondeo. No obstante los intervalos numéricos y parámetros anteriormente establecidos del amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan tan precisamente como sea posible. No obstante, cualquier valor numérico, contiende inherentemente ciertos errores que necesariamente resultan á partir de la desviación estándar encontrada en sus mediciones respectivas de evaluación. Cada intervalo numérico proporcionado a lo largo de esta especificación incluirá cada intervalo numérico más estrecho que cae dentro de dicho intervalo numérico más amplio, como si dichos intervalos numéricos más estrechos se escribieran todos expresamente en la presente invención. A lo largo de esta descripción, se hará referencia a los compuestos de conformidad con la invención. La referencia a dichos compuestos, en la especificación y las reivindicaciones, incluye esteres y sales de dichos compuestos. Por lo tanto, incluso si no se mencionan de manera explícita, se contemplan dichos esteres y sales, y se abarcan en referencia a los compuestos mismos. Adicionalmente, como se utiliza en la presente invención, "péptido", "polipéptido", y "proteína", pueden ser utilizados y serán utilizados de manera intercambiable. "Péptido/polipéptido/proteína" ocasionalmente será utilizado para referirse a cualesquiera de los tres, pero las menciones de cualesquiera de los tres contempla los otros dos. Es decir, no se pretende limitar el tamaño del polímero de aminoácidos (péptido, polipéptido, o proteína), que se puede expresar utilizando la presente invención. Adicionalmente, se pretende que la mención de "proteína" comprenda enzimas, hormonas, receptores, canales, moléculas de señalización intracelular, y proteínas con otras funciones. Las proteínas multiméricas también se pueden elaborar de conformidad con la presente invención. Aunque los aminoácidos que se presentan de manera natural se discuten a lo largo de esta descripción, también se contemplan y se encuentran dentro del alcance de la invención los aminoácidos que se presentan de manera no natural, o los aminoácidos modificados. De hecho, como se utiliza en la presente invención," aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales, a los aminoácidos que se presentan de manera no natural, y a los análogos de aminoácidos, todos en sus estereoisómeros D y L. Los aminoácidos naturales incluyen alanina (A), arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), cisteína (C), glutamina (Q), ácido glutámico (E), glicina (G), histidina (H), ¡soleucina (I), leucina (L), lisina (K), metionina (M), fenilalanina (F), prolina (P), serina (S), treonina (T), triptofano (W), tirosina (Y), valina (V), hidroxiprolina (O y/o Hyp), isoditirosina (IDT), y di-isoditirosina (di-IDT). La hidroxiprolina, isoditírosina, y di-isoditirosina se forman post-traduccionalmente. Se prefiere el uso de los aminoácidos naturales, en particular los 20 aminoácidos genéticamente codificados. Los aminoácidos que se presentan de manera no natural ¡ncluyen, pero no se limitan a ácido azetidincarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, trileucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina, y ácido pipecólico.

Adicionalmente, aunque se hace referencia específica a los péptidos, polipéptidos, y/o proteínas discretas, también se contemplan específicamente mutantes o variantes de esos péptidos o proteínas. Una "variante" como se utiliza en la presente invención, se refiere a una proteína (o péptido o polipéptido) cuya secuencia de aminoácidos es similar a un péptido/polipéptido/proteína de referencia, pero no tiene 100% de identidad con respecto a las secuencia de péptido/polipéptido/proteína respectiva. Una variante de péptido/polipéptido/proteína tiene una secuencia alterada en la cual uno o más de los aminoácidos en la secuencia de referencia están suprimidos o sustituidos, o uno o más aminoácidos se insertan dentro de la secuencia de la secuencia de aminoácidos de referencia. Una variante puede tener cualquier combinación de deleciones, sustituciones, o inserciones. Como un resultado de ias alteraciones, un péptido/polipéptido/proteína variante puede tener una secuencia de aminoácidos la cual es al menos aproximadamente 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o un porcentaje mayor, idéntica a la secuencia de referencia. También es aceptable un menor porcentaje de identidad, y puede tener un intervalo tan bajo como de 20%. Con el objeto de determinar si un polipéptido mutante es sustancialmente idéntico con respecto a cualquier polipéptido de vertebrado, la secuencia del polipéptido mutante se puede alinear con la secuencia de un primer polipéptido de vertebrado de referencia. Un método de alineamiento es mediante BlastP, utilizando las asignaciones por omisión para la matriz de evaluación y las sanciones por espacio. En una modalidad, el primer polipéptido de referencia de vertebrado es aquél para el cual dicho alineamiento resulta en el menor valor E, es decir, la probabilidad más baja de que se presente un alineamiento con una evaluación del alineamiento tan buena o mejor de lo que se podría presentar solamente por posibilidad. Alternativamente, es uno para el cual dicho alineamiento resulta en el porcentaje de identidad más elevado. Las sustituciones pueden ser conservativas y/o no conservativas. En las sustituciones conservativas de aminoácidos, el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales similares y/o propiedades químicas con el aminoácido correspondiente en la secuencia de referencia. A manera de ejemplo, las sustituciones conservativas (reemplazos) se definen como intercambios dentro de los grupos establecidos a continuación: I residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares - - Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) II residuos negativamente cargados y sus amidas Asn Asp Glu Gln III residuos positivamente cargados --His Arg Lys IV residuos alifáticos grandes no polares -Met Leu lie Val (Cys) V residuos aromáticos grandes -Phe Tyr Trp Tres residuos se encuentran en paréntesis debido a sus papeles especiales en la arquitectura de la proteína. Gly es el único residuo sin una cadena lateral y por lo tanto imparte flexibilidad a la cadena. Pro tiene una geometría inusual la cual constriñe estrechamente la cadena. Cys puede participar en enlaces disulfuro, los cuales mantienen a las proteínas en un estado de plegamiento particular; las cuatro cisteínas de bGH están altamente conservadas. Con las sustituciones conservativas, incluso las variantes con bajos niveles de identidad pueden exhibir actividades muy similares con respecto al péptido/polipéptido/proteína no modificado. Se debe mencionar que en las "variantes" de conformidad con la invención incluyen péptidos/polipéptidos/proteínas que tienen un número mayor o menor de aminoácidos en la versión de tipo silvestre. Con respecto a la hormona de crecimiento, por ejemplo, el tipo silvestre tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kDa, incluso también existen las variantes de 20 y 17 kDa. Esta serie de variantes, las cuales se pueden presentar o no de manera natural, se contemplan expresamente. El antagonista de la hormona de crecimiento, el cual tiene un peso molecular aproximado de 22 kDa, también puede existir en formas de 20 y 17 kDa, y estas formas de antagonistas de la hormona de crecimiento también se contemplan expresamente. Sustancia "biológicamente activa" se refiere a una sustancia, tal como cualquier péptido, polipéptido, o proteína, la cual ocasiona un cambio observable en la estructura, función, o composición de una célula después de la toma por la célula. En algunas modalidades, la sustancia es una proteína animal, en algunas modalidades una proteína de mamífero, y en algunas modalidades una proteína de humano. Los cambios observables incluyen, pero no se limitan a, expresión incrementada o disminuida de uno o más ARNm, expresión incrementada o disminuida de una o más proteínas, fosforilación o desfosforilación de una proteína o de otro componente celular, inhibición o activación de una enzima, inhibición o activación de la unión entre las membranas de un par de unión, una velocidad de síntesis incrementada o disminuida de un metabolito, proliferación celular incrementada o disminuida, e incremento o disminución del efecto en el fenotipo externo de un organismo y los similares. Por ejemplo, la administración de hGH a niños deficientes en GH finalmente estimulará el crecimiento. O la administración de un antagonista de GH de humano a individuos acromegálicos, resultará en niveles más bajos de IGF-1 y la curación clínica del trastorno. Se contemplan expresamente los fragmentos de proteínas biológicamente activas, en donde los fragmentos retienen actividad biológica. También se debe mencionar que los presentes métodos se pueden utilizar para producir proteínas de fusión en plantas. La proteína básica que se modifica en la proteína de fusión puede ser de cualquier fuente, vegetal o animal. Las proteínas de fuentes animales incluyen mamíferos y no mamíferos. Por supuesto, las proteínas de mamífero incluyen proteínas de humano. Frecuentemente a lo largo de este documento, se hará referencia a las formas de proteínas de humano. Se debe reconocer que cuando se hace referencia a las proteínas de humano, frecuentemente las mismas proteínas también se encuentran en otros mamíferos no humanos. Estas otras proteínas de mamíferos no humanos se contemplan expresamente.

Glicosilación La presente invención generalmente incluye la expresión de las glicoproteínas en plantas utilizando un método novedoso. El método generalmente incluye secuencias de ácidos nucleicos genéticamente diseñadas que codifican para sitios de glicosilación dentro de los genes para proteínas/péptidos/polipéptidos no-HRGP utilizado los códigos que dirigen estas modificaciones post-traduccionales en las plantas. Las secuencias para glicosilación pueden ser construidas como unidades separadas unidas a uno o al otro extremo del gen, para formar proteínas de fusión. Estos genes también que pueden diseñar para codificar las secuencias señal de plantas para dirigir los productos génicos para su secreción. Los tipos de glicosilación incluyen, pero no se limitan a, arabinosilación y la adición del polisacárido de arabinogalactano. La arabinosilación generalmente incluye la adición de cadenas cortas (por ejemplo, generalmente de aproximadamente 1-5) de arabino-oligosacárido (generalmente residuos de L-arabinofuranosilo). Los polisacáridos de arabinogalactano, por otra parte, son más grandes y generalmente se forman a partir de una estructura base núcleo ß-1 ,3-D-galactano periódicamente ataviadas con adiciones 1 ,6 de cadenas pequeñas laterales de D-galactosa y L-arabinosa y ocasionalmente con otros azúcares tales como L-ramnosa y ácido azúcares tales como ácido D-glucurónico y su derivado 4-o-metilo. Los polisacáridos de arabinogalactano también pueden tomar la forma de una estructura base núcleo ß-1 ,6-D-galactano periódicamente ataviada con adiciones 1 ,6 de cadenas pequeñas laterales de arabinofuranosilo. Nótese que estos aductos se añaden por los sistemas enzimáticos naturales de una planta a proteínas/péptidos/polipéptidos que incluyen los sitios blancos para glicosilación, por ejemplo, los sitios de glicosilación. Puede existir variación en la estructura molecular real de la glicosilación que se presenta. Básicamente, se puede añadir cualquier azúcar por una célula vegetal, incluyendo pero limitadas a, Las cadenas de oligosacáridos pueden incluir cualquier azúcar el cual se puede proveer por la célula de hospedero, incluyendo, sin limitación, Gal, GalNAc, Glc, GIcNAc, y Fue, puede elaborar la cadena de oligosacárido. Se debe mencionar que la glicosilación se puede lograr in vitro. Como se utiliza en la presente invención, el término "glicomódulo" se pretende que se refiera a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un residuo de prolina que está hidroxilado y glicosilado. Como se utiliza en la presente invención, el término "sitio de glicosilación" se pretende que se refiera a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un residuo de prolina que actúa como un sitio blanco de hidroxilación y subsecuente glicosilación. La glicosilación generalmente se presenta después de la hidroxilación del uno o más de los residuos de prolina en el sitio. Por lo tanto, dentro de los sitios de glicosilación, los residuos de prolina pueden ser hidroxilados para formar hidroxiprolinas.

Los dos tipos principales de glicosilación se logran de conformidad con la presente invención mediante la introducción de uno o más sitios de glicosilación dentro de un péptido/polipéptido/proteína. La glicosilación generalmente es de dos tipos: 1 ) glicomódulos de arabinogalactano que comprenden residuos agrupados de hidroxiprolina no contiguos (Hyp) en las cuales los residuos Hyp están O-glicosilados con aductos de arabinogalactano (la estructura del cual se describió anteriormente); y 2) arabinosilación glicomódulos que comprende residuos contiguos de Hyp en los cuales algunos o todos los residuos Hyp están arabinosilados (O-glicosilados) con cadenas de arabinosa de aproximadamente 1-5 residuos de largo. Véase las siguientes patentes de E.U.A. y solicitudes publicadas por una discusión más detallada de los sitios blanco para glicosilación, y la teoría de la contigüidad de Hyp: Patentes Nos. 6,548,642, 6,570,062, 6,639,050 y Solicitudes Nos. 2004/0009555 y 2004/0009557. La descripción total de cada una de estas patentes y solicitudes de patente se incorpora en la presente invención como referencia. En particular, los sitios de glicosilación se pueden introducir como sigue. Para los glicomódulos de arabinogalactano (en donde los sitios de glicosilación son residuos agrupados de Hyp no contiguos), los genes codificarán variaciones de (Pro-X)n y (X-Pro)n, en donde = 1-1000, y (X-Pro-Xi. 9), en donde X puede ser Lys, Ala, Ser, Thr, Gly o Val, o más preferiblemente Ser, Ala, Thr, o Val. En otras modalidades, n es mayor que 2, 3, 5, 5, 6, 7, 8, 9, 0, 50, 100, o 500, o menor que 999, 998, 997, 996, 995, 994, 993, 992, 991 , 990, 900, 800, 700, 600, o 500; n puede tener un intervalo de cualquier número a cualquier número entre 1 y 1000. En algunas modalidades, n en un intervalo de 1-100, o de 1-75, o de 1-50, o de 2-25, o de 2-10, o de 2-6. Muchos de los residuos Pro en estas secuencias serán hidroxilados hacia hidroxiprolina (Hyp) y subsecuentemente serán O-glicosilados con oligosacáridos de arabinogalactano o polisacáridos. Se debe mencionar que los repetidos (X-Pro)n o (Pro-X)n pueden estar intercalados entre sí y con otros aminoácidos, y que dichos grupos intercalados repetitivos se contemplan expresamente. Aunque Lys, Ser, Thr, Val, Gly, y Ala, se identifican específicamente como que corresponden a X, se cree que cualquier aminoácido puede servir a ese propósito, y que el motivo estará glicosilado en las plantas. Como se mencionó, X se selecciona más preferiblemente a partir de Ser, Ala, Thr, o Val. Para la arabinosilación de los glicomódulos (en donde los sitios de glicosilación son residuos Hyp contiguos), los genes modificados en sus extremos para la expresión codificarán residuos Pro contiguos (Pro)n, en donde n = 2-1000. En otras modalidades, n es mayor que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, o 500, o menor que 999, 998, 997, 996, 995, 994, 993, 992, 991 , 990, 900, 800, 700, 600, o 500; n puede tener un intervalo de cualquier número a cualquier número entre 2 y 1000. En algunas modalidades, n tiene un intervalo de 1-100, o de 1-75, o de 1-50, o de 2-25, o de 2-10, o de 2-6. La mayoría de los residuos Pro en estas secuencias serán hidroxilados hacia hidroxiprolina y subsecuentemente serán O-glicosilados con arabinósidos que tienen un tamaño de uno a cinco residuos de arabinosa. Se debe mencionar que los repetidos de (Pro)n pueden estar intercalados con otros aminoácidos, y que dichos grupos intercalados repetitivos se contemplan expresamente. Para evitar la confusión, se menciona que la referencia a las construcciones de ácido nucleicos y genes refleja el hecho de que los nucleótidos codificarán prolina, no hidroxiprolina. Por lo tanto, las construcciones de ácidos nucleicos, genes, etc., se referirán a Pro o P (en forma de letra particular). La referencia a los genes que codifican unidades repetidas puede observarse como: (SP)?o, el cual se refiere a una construcción de ácido nucleico que codifica para diez unidades repetidas de Ser-Pro. Para diferenciar los péptidos/polipéptidos/proteínas que han sido producidos en plantas, se hace referencia a la hidroxiprolina, o hyp, o O (en forma de letra particular). Por lo tanto, una vez que el (SP)?0 ha sido expresado en plantas, éste se puede referir como (SO)10- También se puede elaborar cualquier combinación de glicomódulos dentro de una glicoproteína particular. Es decir, una glicoproteína puede incluir la arabinosilación de glicomódulos y glicomódulos de arabinogalactano. Por lo tanto, la construcción de un gen particular puede incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican para uno o más sitios de arabinosilación y/o uno o más sitios de polisacárido de arabinogalactano, los cuales son hidroxilados y glicosilados después de la expresión en un hospedero vegetal.

Los sitios para glicosilación se pueden ubicar en cualquier extremo o en ambos extremos del péptido/polipéptido/proteína, y/o en el interior de la molécula si se desea. Por ejemplo, en una molécula más pequeña, el extremo N o C se puede modificar mediante la adición de sitios de glicosilación; en una molécula más grande, una sustitución interior puede ser más deseable. Por supuesto, se pueden modificar moléculas más pequeñas en sus interiores y las moléculas más grandes se modifican en cualquier extremo o en ambos extremos -la elección se deja al practicante. En el caso de enzimas que se extienden a lo largo de la membrana o que están ancladas a la membrana, se puede preparar una construcción que modifica el extremo N terminal al reemplazar el dominio que se extienden lo largo de la membrana o está anclado a la membrana (evitando la tendencia intrínseca de las glicosiltransferasas, por ejemplo, para asociarse con la membrana de RE/Golgi) con una secuencia señal de secreción N-terminal, seguido por la secuencia de glicosilación, tales como, por ejemplo, un repetido corto (Ser-Hyp)n o (Ala-Hyp)n. (Por ejemplo, algunas enzimas, tales como glicosiltransferasas, se pueden modificar mediante el reemplazo de la secuencia N-terminal que se extiende a lo largo de la membrana que frecuentemente ancla las enzimas a las membranas, con una secuencia señal y un glicomódulo, permitiendo que la glicosiltransferasa sea glicosilada y secretada más que retenida en las membranas del RE o Golgi.) Los transgenes se diseñan para codificar una secuencia señal para secreción a través del sistema endomembranal. La estrategia de uso de una secuencia señal de secreción para dirigir a toda la molécula para secreción se puede utilizar en cualquier construcción, y no se limita a la secreción de proteínas normalmente unidas a la membrana, que se extienden a lo largo de la membrana, o que se anclan a la membrana. La adición de un sitio de glicosilación y la glicosilación subsecuente, sea ésta mediante arabinosilación y/o mediante la adición de polisacárido arabinogalactano, pueda tener numerosos efectos diferentes. En algunos casos, la glicosilación del péptido/polipéptido/proteína resultará en un rendimiento incrementado y secreción del producto expresado en comparación con un producto no glicosilado que de otra manera es idéntico. Es decir, la adición de al menos un sitio para arabinosilación o adición de polisacárido arabinogalactano puede resultar en un rendimiento incrementado del producto secretado en comparación con el producto expresado sin la adición(es). El rendimiento se puede incrementar en aproximadamente 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o 1000%, o más. La glicosilación puede proveer medios adicionales para el aislamiento de péptidos/polipéptidos/proteína de interés. Por ejemplo, mediante la introducción de un sitio de glicosilación dentro de un gen de la proteína y subsecuentemente expresando el gen en plantas, el producto se puede aislar y/o separar mediante cromatografía por afinidad o mediante el uso de una cromatografía basada en lecitina. La adición de arabino-oligosacáridos o polisacáridos de arabinogalactano puede tener efectos sobre la actividad físico-química de los péptidos/polipéptidos/proteínas. Las adiciones pueden incrementar el peso molecular, cambiar el punto isoeléctrico, y cambiar la capacidad del péptido/polipéptido/proteína para modificar los efectos de otros medios. Por ejemplo, la glicosilación puede tener el efecto de incrementar una capacidad de la proteína para actuar como un emulsificante. Por lo tanto, las glicoproteínas elaboradas de conformidad con la presente invención pueden ser utilizadas como emulsificantes. En algunas modalidades, las glicoproteínas de la invención, las cuales pueden actuar como emulsificantes, se combinan con emulsificantes en composiciones farmacéuticas, para mejorar la administración de la glicoproteína o para mejorar la administración de otra sustancia biológicamente activa. La glicosilación puede incrementar el peso molecular de un péptido/polipéptido/proteína. La glicosilación responde a 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 8%, 12%, 16%, 24%, 33%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o incluso un porcentaje mayor del peso total de la glicoproteína. La glicosilación puede añadir 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 kDa o más a un péptido/polipéptido/proteína. Generalmente, la glicosilación puede incrementar el peso molecular mediante un incremento en el porcentaje. La glicosilación de una proteína de conformidad con esta invención puede volver solubles a las proteínas insolubles, y puede incrementar la solubilidad de proteínas ya solubles. Por lo tanto, en algunas modalidades, los péptidos/polipéptidos/proteínas modificadas de conformidad con estos métodos se pueden aislar o disolver en agua, en donde una proteína de tipo silvestre puede requerir soluciones reguladoras de pH. En algunas modalidades de la invención, las glicoproteínas son más estables, en comparación con las proteínas de tipo silvestre, las cuales se agregan o forman multímeros si no se tratan de manera apropiada. En particular, con respecto a la solubilidad de la hormona de crecimiento y a los antagonistas de la hormona de crecimiento, la solubilidad está incrementada en comparación con aquella de las versiones no glicosiladas. La solubilidad incrementada se observa en la ausencia de otros elementos requeridos para la solubilidad en formas no glicosiladas, tales como reguladores de pH u otros aditivos. La solubilidad puede ser mayor que o igual a aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o más mg/ml. La glicosilación de péptidos/polipéptidos/proteínas de conformidad con la invención puede tener el efecto deseado de incrementar la resistencia a la degradación enzimática. Aunque no se ha aclarado completamente por qué ocurre esto, parece que los sustituyentes de carbohidratos voluminosos añadidos de conformidad con la invención bloquean o previenen el acceso a los sitios de degradación enzimática. Por lo tanto, en donde una peptidasa puede tener especificidad para una extremo particular o para una secuencia particular de aminoácidos, la glicosilación bloquea, impide, u oculta el acceso de la peptidasa a esos sitios. Este efecto protector tiene numerosas utilidades en el mundo real, incluyendo incremento de la vida en anaquel, reducción de la degradación por los microbios, e incremento de la probabilidad del pasaje gastrointestinal y por lo tanto, en algunos casos, se permiten para administración oral. En algunas modalidades, los péptidos/polipéptidos/proteínas modificadas de la invención que han sido liofilizadas se pueden disolver con facilidad, mientras que los péptidos/polipéptidos/proteínas de tipo silvestre son más difíciles de disolver. Este aspecto de la invención es importante en, y lleva a la utilidad en, por ejemplo, péptidos/polipéptidos/proteínas de la invención liofilizadas, modificadas y reconstituidas antes de la inyección, las cuales se pueden aplicar, por ejemplo, IM, SC, IV, o IP. En donde los péptidos/polipéptidos/proteínas de tipo silvestre pueden ser difíciles de solubilizar, requiriendo reguladores de pH, sales, ' u otros elementos solubilizantes, los cuales pueden ocasionar quemaduras o irritación durante la inyección, algunos péptidos/polipéptidos/proteínas modificadas de la invención pueden evitar aquellos aditivos no deseables. Por lo tanto, en una modalidad, por ejemplo, una hormona de crecimiento modificada de humano se elabora de conformidad con la presente invención, se prepara, y se empaqueta en la ausencia de mannitol; un polvo liofilizado o solución para inyección excluye mannitol. En una modalidad, una hormona de crecimiento modificada de humano se elabora de conformidad con la presente invención, se prepara, y se empaqueta en la ausencia de glicina añadida; un polvo liofilizado o solución para inyección excluye glicina añadida. En una modalidad, una hormona de crecimiento modificada de humano se elabora de conformidad con la presente invención, se prepara, y se empaqueta en la ausencia de leucina añadida; un polvo liofilizado o solución para inyección excluye leucina añadida. En una modalidad, una hormona de crecimiento modificada de humano se elabora de conformidad con la presente invención, se prepara, y se empaqueta en la ausencia de fosfolípidos añadidos; un polvo liofilizado o solución para inyección excluye fosfolípidos añadidos. En una modalidad, una hormona de crecimiento modificada de humano se elabora de conformidad con la presente invención, se prepara, y se empaqueta en la ausencia de trehalosa añadida; un polvo liofilizado o solución para la inyección excluye trehalosa añadida. En una modalidad, una hormona de crecimiento modificada de humano se elabora de conformidad con la presente invención, se prepara, y se empaqueta en la ausencia de histidina añadida; un polvo liofilizado o solución para inyección excluye histidina añadida. De hecho, las formulaciones de hormona de crecimiento modificada de la invención, por ejemplo, pueden excluir cualesquiera excipientes normalmente requeridos en otras formulaciones de la hormona de crecimiento. Estos impactos sobre las propiedades físico-químicas se pueden lograr sin influir la actividad biológica. Sin embargo, en algunos casos, la glicosilación imparte ventajas adicionales. Debido a la solubilidad incrementada y a la facilidad de disolución, algunos péptidos/polipéptidos/proteínas modificadas de la invención se pueden administrar mediante inhalación al pulmón para un efecto farmacológico. Por ejemplo, una proteína de tipo silvestre puede ser difícil de disolver sin aditivos. Para la inhalación de la proteína de tipo silvestre en forma de polvo liofilizado, la disolución en la membrana del pulmón es muy lenta, la cual a) hace más lenta la velocidad de toma, b) permite la fagocitosis de la materia en forma de partículas, y c) permite que los cilios porten la materia en forma de partículas hacia arriba y fuera del pulmón. No obstante, un péptido/polipéptido/proteína modificada de la invención, se pueden disolver mucho más rápidamente, incrementando así la velocidad de toma, disminuyendo la oportunidad para la fagocitosis, y previniendo la expulsión a través de la acción ciliar. El efecto neto es la creación de un fármaco que se puede administrar mediante inhalación, en donde dicha administración no es posible para el fármaco de tipo silvestre. En algunas modalidades de péptidos/polipéptidos/proteínas que tienen actividad biológica, la arabinosilación y/o adición de polisacárido arabinogalactano puede alterar la actividad biológica. La alteración en la actividad biológica puede ser, por ejemplo, farmacodinámica, por ejemplo, al modificar la actividad agonista y/o antagonista del péptido/polipéptido/proteína. Por ejemplo, un agonista modificado puede exhibir actividad antagonista; por lo tanto, se puede elaborar un antagonista a partir de un agonista. En otros ejemplos, las modificaciones resultan en un incremento o disminución en la afinidad del receptor. La alteración en la actividad biológica puede ser, por ejemplo, farmacocinética, por ejemplo, al modificar la absorción, distribución, localización en tejidos, biotransformación, y/o excreción del péptido/polipéptido/proteína. Por ejemplo, un péptido/polipéptido/proteína glicosilada puede exhibir una biodisponibilidad incrementada o vida media, en relación con el péptido/polipéptido/proteína no glicosilada. La biodisponibilidad o vida media se puede incrementar en aproximadamente 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o 1000%, o más. La biodisponibilidad generalmente se puede medir por el área bajo la curva (AUC). El área bajo la curva es una gráfica de la concentración plasmática del fármaco (concentración no logarítmica) en contra del tiempo después de la administración del fármaco. El área generalmente se puede determinar mediante la "regla trapezoidal", en donde los puntos de datos se conectan mediante segmentos de líneas rectas, las líneas perpendiculares se erigen a partir de la abscisa de cada punto de datos, y la suma de las áreas de los triángulos y trapezoides así construida es computada. El área bajo la curva se puede calcular utilizando cualesquiera medios conocidos en la técnica para el cálculo de este valor. De conformidad con la invención, AUC se puede incrementar en aproximadamente 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o 1000%, o más. Un incremento en la biodisponibilidad también se puede reflejar en una concentración plasmática pico incrementada (Cma ). De conformidad con la invención, la concentración plasmática pico se puede incrementar en aproximadamente 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o 1000%, o más. Por lo tanto, las proteínas biológicamente activas producidas de conformidad con la presente invención pueden tener la ventaja de exhibir vida media extendida y/o biodisponibilidad, y por lo tanto exhiben un efecto incrementado o prolongado en el cuerpo. Aunque no es completamente claro cómo o porqué ocurre esto, esto se puede relacionar con la carga y tamaño incrementado impartido en la molécula biológica por los motivos de carbohidrato de la invención. Otro efecto de la glicosilación de conformidad con esta invención es una ausencia de cambio en la inmunogenicidad o antigenicidad. Por lo tanto, la inmunogenicidad o antigenicidad de un péptido/polipéptido/proteína puede permanecer sin cambio mediante la producción de éste como una glicoproteína de conformidad con esta invención. De hecho en algunas modalidades, la inmunogenicidad o antigenicidad disminuye. En cualquier caso - sin cambio o disminución - esto es importante para las vacunas u otras moléculas parenteralmente introducidas que exhiben un efecto biológico deseable pero están unidas por su inmunogenicidad/antigenicidad. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, el péptido beta amiloide. La inmunogenicidad reducida (o capacidad de producir alergia) en relación con una proteína base puede resultar a partir de la capacidad (incapacidad) de los anticuerpos para reconocer la proteína núcleo. No obstante, también se puede mencionar que las porciones de carbohidrato también pueden ser el epítope de un anticuerpo, y por lo tanto, pueden funcionar como un inmunógeno o alérgeno. Aunque no es claro si es necesario ocasionar que los anticuerpos reconozcan aquellas porciones de carbohidrato como extrañas, se cree que las glicoproteínas elaboradas de conformidad con la presente invención pueden servir como agentes sensibilizantes para inmunoterapia de alergia. Es decir, las glicoproteínas elaboradas de conformidad con la presente invención se pueden utilizar para repetidas inyecciones con el efecto a largo plazo deseado de la reducción de una respuesta alérgica. En particular, las glicoproteínas arabinosiladas (incluyendo glicopéptidos o aminoácidos regularmente glicosilados, tales como una hidroxiprolina particular que tiene al menos una arabinosa unida), las cuales incluyen los glicomódulos X-Hypn, se cree que son útiles en la inmunoterapia de alergias.

Péptidos/polipéptidos/proteínas Los péptidos/polipéptidos/proteínas que se pueden modificar de conformidad con la presente invención pueden ser a partir de diversos organismos, incluyendo pero limitados a, humanos y otros mamíferos y/o vertebrados, invertebrados, plantas, esponjas, bacterias, hongos, algas, arqueobacterias, etc. Adicionalmente, las proteínas y péptidos sintéticos se contemplan expresamente, puesto que son derivados y proteínas de cualquier proteína tales como antagonistas, péptidos agonistas o antagonistas, o anticuerpos. Los péptidos/polipéptidos/proteínas pueden ser grandes o pequeños, monoméricos o multiméricos, y tienen cualquier tipo de utilidad. En algunas modalidades, los péptidos/polipéptidos/proteínas son pequeñas, tales como menos de aproximadamente 25 kDa. A través de la glicosilación de conformidad con esta invención, su peso molecular se puede incrementar hasta 40 kDa o mayor. En algunas modalidades, los péptidos/polipéptidos/proteínas no están modificados post-traduccionalmente, excepto para la formación de puentes disulfuro o glicosilación N-asociada. En algunas modalidades, se evitan los péptidos con muchos residuos de prolina, los cuales pueden ser dirigidos para hidroxilación y la glicosilación subsecuente de Hyp. Los péptidos/polipéptidos/proteínas que se pueden expresar utilizando la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aquellas moléculas en la superfamilia de la hormona de crecimiento, incluyendo pero no limitadas a, la hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placental, y otras interleucinas. Otros ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, proteína quimioatrayente de monoc?'to-1, interleucina-10, pleiotropina, interleucina-7, interleucina-8, interferón omega, interferón-alfa 2a y 2b, interferón gamma, interleucina-1 , factor de crecimiento del fibroblasto 6, IGF-1 , factor de crecimiento semejante a insulina I y II, hormona adrenocorticotrópica, beta-amiloide, amilina, polipéptido natriurético atrial (por ejemplo, alfa), bombesina, bradiquinina, péptido natriurético cerebral, calcitonina, péptido relacionado con el gen de calcitonina, factor liberador de corticotropina, dinorfina, endorfina, endotelina (por ejemplo, -1 , -2, y -3), encefalina, factor de crecimiento epidérmico, péptido inhibidor gástrico, gastrina, péptido liberador de gastrina, la hormona liberadora de la hormona de crecimiento, proteínas de la cubierta de VIH-1, catacalcina, hormona liberadora de la hormona luteinizante, neuroquininas (por ejemplo, A y B), neuromedinas (por ejemplo, B y C), neuropéptido Y, neurotensina, oxitocina, polipéptido pancreático, pancreastina, pancreastatina, _ hormona paratiroide, secretina, somatostatina, sustancia P, factor de crecimiento transformante (por ejemplo, alfa), péptido intestinal vasoactivo, vasopresina, vasotocina, glucagon y los péptidos semejantes a glucagon, eritropoietina, factor estimulante de la colonia de granulocito, PORF-1 y -2 (factores reguladores preópticos), y PYY 3-36. También incluye cualquier proteína factor de crecimiento, hormona, anticuerpo, citoquina, oncoproteína (proteína que ocasiona cáncer), linfoquina, o derivados de los mismos. También se incluyen proteínas implicadas en los procesos metabólicos, incluyendo pero limitados a, insulina, grelina, leptina, adiponectina, resistina, etc. Por ejemplo, la presente invención se puede utilizar para expresar una hormona de crecimiento modificada. La hormona de crecimiento (GH) se secreta por la glándula pituitaria. Esta es una proteína de aproximadamente 22-kDa que exhibe una variedad de actividades biológicas. La hiposecreción de la hormona de crecimiento resulta en enanismo mientras que la hipersecreción resulta en gigantismo y/o acromegalia. Se puede preparar una construcción de ADN recombinante que incluye: los ácidos nucleicos que codifican hGH, ácidos nucleicos que codifican para un sitio de glicosilación de la hidroxiprolina, junto con ácidos nucleicos que codifican para una secuencia señal en planta. Los ácidos nucleicos que codifican para un sitio de glicosilación de hidroxiprolina pueden codificar para X-Pron (o Pron-X), en donde X es Lys, Ser, Thr, Ala, Gly, Val o cualquier aminoácido, o más preferiblemente Ser, Ala, Thr, o Val, y n es de 2 a 1000; o los ácidos nucleicos pueden codificar para (X-Pro)n (o (Pro-X)n), en donde X es cualquier aminoácido, tales como Lys, Ser, Thr, Ala, Gly, o Val, o más preferiblemente Ser, Ala, Thr, o Val, y n es de 1 a 1000. Para los aminoácidos voluminosos, la primera Pro en la serie XPPPPP puede no estar hidrolizada, pero las otras lo estarán. En una modalidad, por ejemplo, los ácidos nucleicos codifican para (Ser-Pro)?o. En esta modalidad, la hGH se expresan como una GH-(Ser-Pro)10 (modificada en el extremo N o C); la Pro es hidroxilada por la planta y luego se glicosila con cadenas de arabinogalactano. El producto es una glicoproteína hGH que comprende (Ser-Hyp)?o. La glicoproteína que exhibe la misma actividad que la hGH de tipo silvestre, exhibe incluso una vida media farmacocinética significativamente incrementada. (La producción y evaluación de esta modalidad se describe con mayor detalle en el ejemplo 6, en la presente invención a continuación). La hGH modificada de conformidad con la presente invención puede producir una concentración plasmática pico mayor de aproximadamente 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, o 24 o más horas, siguiendo a una inyección subcutánea (SC) particular. Este es un incremento sustancial sobre la vida media de la hormona de crecimiento de tipo silvestre, la cual exhibe una vida media de aproximadamente 20-30 minutos.

En una modalidad, los ácidos nucleicos que codifican hGH se diseñan para crear un antagonista de hGH y el sitio de glicosilación se añade en la C-terminal. Por ejemplo, la Gly en la posición 119 (encontrada en una variedad de hormonas de crecimiento de tipo silvestre del animal) o Gly 120 (de hGH) se puede remplazar con cualquier aminoácido diferente a la alanina y generar un antagonista. En una modalidad, Gly 120 de hGH se reemplaza con Lys, la cual produce un antagonista de la hormona de crecimiento de humano. También, un motivo (Ser-Hyp)?o se une en la C-terminal. El resultado es una glicoproteína que exhibe actividad antagonista de hGH e incrementa la vida media, en comparación con la vida media de un antagonista de hGH no glicosilada que es de -20-30 minutos. Por supuesto, se pueden crear construcciones similares con una variante de 20 kD de la hormona de crecimiento, con resultados similares. Por ejemplo, la Gly en la posición 104 (encontrada en una variedad de hormonas de crecimiento de tipo silvestre de 20 kDa de animales) o Gly 105 (de la hormona de crecimiento de humano de 20-kDa) se puede remplazar con cualquier aminoácido diferente a la alanina y generar un antagonista. En una modalidad, Gly 105 de hGH (forma de 20 kDa) se reemplaza con Lys, la cual produce un antagonista de hGH. También, se puede unir el motivo (Ser-Hyp)?o a la C-terminal. En una modalidad, los ácidos nucleicos que codifican para hGH se diseñan para insertar el sitio de glicosilación de la hidroxiprolina en una parte interna de la proteína. En el caso de la GH de 22 kDa, por ejemplo, la Gly normalmente en la posición 119 o 120 se suprime y Ser-Pro-Pro-Pro-Pro se inserta en su lugar. Con esta construcción, las prolinas estarán hidroxiladas y luego serán arabinosiladas. El resultado será un antagonista con vida media incrementada. La siguiente descripción más general es informativa de péptidos/proteínas de fusión de la superfamilia de la hormona de crecimiento que se pueden elaborar de conformidad con esta invención. En una modalidad de la presente invención, la proteína de fusión de la presente invención comprende a) al menos un glicomódulo, y b) una hormona de vertebrado que se presenta de manera natural que pertenece a la superfamilia GH-PRL-PL, como se describe a continuación. La hormona de crecimiento de vertebrado, prolactina, o lactógeno placental son de interés particular. En otra modalidad de la presente invención, la proteína de fusión de la presente invención comprende a) al menos un glicomódulo, y b) un polipéptido mutante biológicamente activo el cual es sustancialmente idéntico, pero no completamente idéntico, a una hormona de crecimiento de vertebrado que se presenta de manera natural, prolactina, o lactógeno placental. El término "que se presenta de manera natural" presupone la ausencia de la intervención humana, por ejemplo, el hecho de que un ratón transgénico ha sido diseñado genéticamente para producir una proteína extraña no significa que la proteína extraña en cuestión se presenta de manera natural en los ratones.

Este mutante puede ser un agonista, es decir, posee al menos una actividad biológica de una hormona de crecimiento de vertebrado, prolactina, o lactógeno placental. Se debe mencionar que una hormona de crecimiento se puede modificar para que se vuelva un mejor agonista de prolactina o del lactógeno placental, y viceversa. El mutante se puede caracterizar como un mutante de la hormona de crecimiento si, después de alineamiento mediante BlastP, tiene un mayor porcentaje de identidad con un una hormona de crecimiento de vertebrado en comparación con cualquier otra prolactina o lactógeno placental conocido de vertebrado. Los mutantes de la prolactina y del lactógeno placental se definen de manera análoga. Alternativamente, el mutante puede ser un antagonista de una hormona de crecimiento de vertebrado, prolactina, o lactógeno placental. En general, el antagonista contemplado es un antagonista del receptor, es decir, una molécula que se une al receptor pero la cual sustancialmente no puede activarlo, por lo tanto antagonizando la actividad del receptor vía el mecanismo de inhibición competitiva. La primera identificación de mutantes de la GH que codifican antagonistas biológicamente activos del receptor de GH fue mencionada en Kopchick et al., Patentes de E.U.A. 5,350,836, 5,681 ,809, 5,958,879, 6,583,115, y 6,787,336, y en Chen et al., 1991 , "Functional antagonism between endogenous mouse growth hormone (GH) and a GH analog results in dwarf transgenic mice", Endocrinology 129: 1402-1408, Chen et al., 1991 , "glycine 119 of bovine growth hormone is critical for growth promoting activity" Mol. Endocrinology 5: 1845-1852, y Chen et al., 1991 , "Mutations in the third alpha-helix of bovine growth hormone dramatically affect its intracellular distribution in vitro and growth enhancement in transgenic mice", J. Biol. Chem. 266: 2252-2258. Todas estas referencias (en adelante, "Kopchick, et al., anteriormente mencionado") se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad. Con el objeto de determinar si el polipéptido mutante es sustancialmente idéntico en comparación con cualquier hormona de vertebrado de la superfamilia GH-PRL_PL, la secuencia del polipéptido mutante se puede alinear con la secuencia de una 'primera hormona de vertebrado de referencia de esa superfamilia. Un método de alineamiento es mediante BlastP, utilizando las asignaciones por omisión para la matriz de evaluación y las sanciones por espacio. En una modalidad, la primera hormona de vertebrado de referencia es aquella para la cual dicho alineamiento resulta en el valor E más bajo, es decir, la probabilidad más baja de que un alineamiento con una evaluación de alineamiento tan buena o mejor puede ocurrir como una posibilidad. Alternativamente, es aquella para la cual dicho alineamiento resulta en la identidad porcentual más elevada. En general, el agonista polipeptídico mutante se considera sustancialmente idéntico a la hormona de vertebrado de referencia si todas las diferencias se puede justificar como siendo (1) sustituciones conservativas de aminoácidos que se sabe que se intercambian preferencialmente en familias de proteínas homologas, (2) sustituciones no conservativas de aminoácido cuyas posiciones se conocen o se determinan (por ejemplo, en virtud de la mutagénesis de selección de alanina) para resultar de manera improbable en la pérdida de la actividad biológica relevante, o (3) variaciones (sustituciones, inserciones, deleciones) observadas dentro de la superfamilia GH-PRL-PL (o, más particularmente, dentro de la familia relevante). El antagonista polipeptídico mutante adicionalmente diferirá de la hormona del vertebrado de referencia en virtud de una o más mutaciones antagonizantes del receptor. Con respecto al punto de aplicación (3) por arriba de las inserciones y deleciones, es necesario alinear el polipéptido mutante con al menos dos hormonas de referencia diferentes. Esto se realiza mediante alineamiento par con par de cada hormona de referencia con respecto al polipéptido mutante. Cuando dos secuencias se alinean entre sí, el algoritmo(s) de alineamiento puede introducir espacios dentro de una o ambas secuencias. Si existe una longitud de un espacio en la secuencia A que corresponde a la posición X en la secuencia B, entonces se puede decir, equivalentemente, que (1) la secuencia A difiere de la secuencia B en virtud de la deleción del aminoácido en la posición X en la secuencia B, o (2) la secuencia B difiere de la secuencia A en virtud de la inserción del aminoácido en la posición X de la secuencia B, entre los aminoácidos de la secuencia A los cuales se alinearon con las posiciones X-1 y X+1 de la secuencia B. Si el alineamiento de la secuencia mutante con respecto a la primera hormona de referencia crea un espacio en la secuencia mutante, entonces la secuencia mutante se puede caracterizar como que difiere de la primera hormona de referencia por la deleción del aminoácido en la posición en la primera hormona de referencia, y dicha deleción se justificaba bajo la cláusula (3) si la otra hormona de referencia difiere de la primera hormona de referencia de la misma manera. De manera similar, si el alineamiento de la secuencia mutante con respecto a la primera hormona de referencia crea un espacio en la secuencia de referencia, entonces la secuencia mutante se puede caracterizar como que difiere a partir de la primera hormona de referencia mediante la inserción del aminoácido alineado con ese espacio, y dicha inserción se justificaba bajo la cláusula (3) si la otra hormona de referencia difiere a partir de la primera hormona de referencia de la misma forma. Los agonistas preferidos del receptor de la GH derivados a partir de la GH de vertebrado de la presente invención son proteínas de fusión las cuales comprenden una secuencia polipeptídica P para la cual la diferencias, si están presentes, entre dicha secuencia de aminoácidos y la secuencia de aminoácidos de una primera hormona de crecimiento de vertebrado de referencia, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de (a) una sustitución de un aminoácido de reemplazo conservativo para el primer residuo de la hormona de crecimiento correspondiente del vertebrado de referencia; (b) una sustitución de un aminoácido de reemplazo no conservativo para el primer residuo de la hormona de crecimiento correspondiente del vertebrado de referencia en donde (i) existe otra hormona de crecimiento del vertebrado de referencia para la cual el aminoácido correspondiente es una sustitución no conservativa para el primer residuo de la hormona de crecimiento correspondiente del vertebrado de referencia, y/o (ii) la afinidad de unión de una sustitución particular mutante de la primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia, en donde dicho residuo correspondiente, en cual no es alanina, se reemplaza por alanina, y es al menos 10% de la afinidad de unión de la primera hormona de crecimiento del vertebrado para el receptor de la hormona de crecimiento del vertebrado al cual se une de manera nativa la primera hormona de crecimiento del vertebrado; (c) una deleción de uno o más residuos se encuentra en dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia pero está suprimido en otra hormona de crecimiento del vertebrado de referencia; (d) inserción de uno o más residuos dentro de dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia entre las posiciones de aminoácidos adyacentes de dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia, en donde existe otra hormona de crecimiento del vertebrado de referencia la cual difiere a partir de dicha primera hormona de crecimiento de referencia en virtud de una inserción en la misma ubicación de dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia; y (e) truncación de los primeros 1-8, 1-6, 1-4, o 1-3 residuos y/o de los últimos 1-8, 1-6, 1-4, o 1-3 residuos encontrados en dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia ("truncación" se pretende que se refiera a una deleción de residuos en la N- o C-terminal del péptido); en donde la secuencia polipeptídica tiene al menos 10% de la afinidad de unión de dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia para un receptor de la hormona de crecimiento del vertebrado, preferiblemente uno al cual dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia se une de manera nativa, y en donde dicha proteína de fusión se une a y activa así un receptor de la hormona de crecimiento del vertebrado.

Los inventores han caracterizado a la proteína de fusión como un "derivado de GH" debido a que la secuencia polipeptídica P califica como una GH del vertebrado o como una GH mutante del vertebrado como se definió anteriormente. Una hormona de crecimiento se une de manera nativa al receptor de la hormona de crecimiento encontrado en la misma especie, por ejemplo, la hormona de crecimiento de humano se une de manera nativa al receptor de la hormona de crecimiento de humano, la hormona de crecimiento de bovino, un receptor de la GH de bovino, y así sucesivamente. Basándose en los análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre las proteínas homologas de diferentes organismos, tales como aquellos presentados en el cuadro 1-2 de Schuiz y Schirmer, Principies of Protein Structure y en las figuras 3-9 de Creighton, Proteins, los inventores definen a las sustituciones conservativas (reemplazos) como intercambios dentro de los grupos establecidos a continuación: I residuos alifátícos pequeños, no polares o ligeramente polares-Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) II residuos negativamente cargados y sus amidas Asn Asp Glu Gln III residuos positivamente cargados-His Arg Lys IV residuos alifáticos grandes no polares-Met Leu lie Val (Cys) V residuos aromáticos grandes-Phe Tyr Trp Tres residuos se encuentran en paréntesis debido a sus papeles especiales en la arquitectura de la proteína. Gly en el único residuo sin una cadena lateral y por lo tanto imparte flexibilidad a la cadena. Pro tiene una geometría inusual la cual constriñe estrechamente la cadena. Cys puede participar en la formación de enlaces disulfuro, los cuales mantienen a las proteínas en un estado de plegamiento particular; las cuatro cisteínas de bGH están altamente conservadas.

Las mutaciones las cuales intercambian l/ll, o las cuales intercambian lll/IV/V, pueden ser consideradas semi-conservativas, las cuales son una subpoblación de las mutaciones no conservativas. Las mutaciones no conservativas, las cuales no se caracterizan como semi-conservativas se pueden caracterizar como "fuertemente no conservativas". Las mutaciones semi-conservativas se prefieren sobre las mutaciones fuertemente no-conservativas. Para la unión al receptor de la hormona de crecimiento de humano, la afinidad de unión se determinó mediante el método descrito en Cunningham y Wells, "High-Resolution Mapping of hGH-Receptor Interactions by Alanine Scanning Mutagenesis", Science 284: 1081 (1989), y por lo tanto utiliza a la hGHRbp como el blanco. Para la unión al receptor de prolactina de humano, la unión se determinó mediante el método descrito en WO92/03478, y por lo tanto utiliza a la hPRLbp como el blanco. Para la unión a los receptores de la hormona del vertebrado no humano, la afinidad de unión se determinó mediante el uso, en orden de preferencia, del dominio de unión extracelular del receptor, el receptor total purificado, y una fuente no purificada del receptor (por ejemplo, una preparación de membrana). La proteína de fusión para unión al receptor preferiblemente tiene actividad promotora del crecimiento en un vertebrado. La actividad promotora (o inhibidora) del crecimiento se puede determinar por los ensayos establecidos en Kopchick, et al., el cual incluye la expresión transgénica del agonista o antagonista de la GH en ratones. O se puede determinar por el examen del efecto la administración farmacéutica del agonista o antagonista de la GH a vertebrados humanos o no humanos. Preferiblemente, aplica una o más de las siguientes condiciones adicionales: (1) la secuencia polipeptídica P es al menos 50%, más preferiblemente al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o más preferiblemente al menos 95% idéntica a dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia, (2) los aminoácidos de reemplazo conservativo son aminoácidos de reemplazo altamente conservativo, (3) cualquier deleción bajo la cláusula (c) es de un residuo el cual no se localiza en una posición de residuo conservado de la familia de la hormona de crecimiento del vertebrado, y, más preferiblemente no es una posición de residuo conservado de la subfamilia de la hormona de crecimiento de mamífero, (4) la primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia es una hormona de crecimiento de mamífero, más preferiblemente, una hormona de crecimiento de humano o una hormona de crecimiento de bovino, (5) cualquier inserción bajo la cláusula (d) es de una longitud de tal manera que existe otra hormona de crecimiento del vertebrado de referencia la cual difiere a partir de dicha primera hormona de crecimiento de referencia en virtud de una inserción de igual longitud en la misma ubicación de dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia (6) las diferencias se limitan a las sustituciones según las cláusulas (a) y/o (b), (7) si la primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia es una hormona de crecimiento no de humano, y el uso pretendido es en la unión o activación del receptor de la hormona de crecimiento de humano, las diferencias incrementan la identidad general con respecto a la hormona de crecimiento de humano, (8) una o más de las sustituciones se seleccionan a partir del grupo que consiste de una o más de las mutaciones que caracterizan a los mutantes de la hGH B2024 y/o B2036 como se describe a continuación, (9) la secuencia polipeptídica P es al menos 50%, más preferiblemente al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70% al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o, si es un agonista, más preferiblemente 100% similar a dicha primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia, o (10) la secuencia polipeptídica P, cuando se alinea a la primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia mediante BlastP utilizando la matriz Blosum62 y las sanciones por espacio -11 para la creación de espacio y -1 para cada extensión por espacio, resulta en un alineamiento para el cual el valor E es menor de e-10, más preferiblemente menor de e-20, e-30, e-40, e-50, e-60, e-70, e-80, e-90 o más preferiblemente e-100.

Para propósitos de la condición (1 ), el porcentaje de identidad se calcula mediante la metodología de BlastP, por ejemplo, se identifica como un porcentaje de la región superpuesta alineada incluyendo los espacios internos. Para propósitos de la condición (2), los reemplazos de aminoácidos altamente conservativos son como sigue: Asp/Glu, Arg/His/Lys, Met/Leu/I le/Val, y Phe/Tyr/Trp. Para propósitos de la condición (3), las posiciones de los residuos conservados son aquellas las cuales, cuando todas las hormonas de crecimiento de vertebrados cuyas secuencias se encuentran en una base de datos de secuencias disponibles al público al tiempo de llenado se alinean como se enseña en la presente invención, se ocupan solamente por los aminoácidos que pertenecen al mismo grupo de intercambio para sustitución conservativa (I, II, lll, IV o V) como se definió anteriormente. Las posiciones de residuos no conservados son aquellas las cuales están ocupadas por aminoácidos que pertenecen a los diferentes grupos de intercambio, y/o las cuales no están ocupadas (por ejemplo, suprimidas) en una o más de las hormonas de crecimiento del vertebrado. Las posiciones de residuos completamente conservados de la familia de la hormona de crecimiento del vertebrado son aquellas posiciones de residuos que están ocupadas por el mismo aminoácido en todas las hormonas de crecimiento de dicho vertebrado. La cláusula (c) no permite la deleción de un residuo en una de las posiciones de residuos completamente conservados. Uno puede definir de manera análoga las posiciones de residuos completamente conservados, conservados, y no conservados de la familia de la hormona de crecimiento de mamífero. Para propósitos de la condición (4), hGH preferiblemente es la forma de hGH la cual corresponde a la porción madura (AAs 27-217) de la secuencia establecida en Swíss-Prot SOMAJHUMAN, P01241 , ísoforma 1 (22 kDa), y la hormona de crecimiento de bovino preferiblemente es la forma de la hormona de crecimiento de bovino la cual corresponde a la porción madura (AA 28-217) de la secuencia establecida en Swiss-Prot SOMA_BOVIN, P01246, por Miller W. L., Martial J. A., Baxter J. D.; "Molecular cloning of DNA complementary to bovine growth hormone mRNA."; J. Biol. Chem. 255: 7521-7524 (1980). Estas referencias se incorporan como referencias en su totalidad. Para propósito de la condición (10), el porcentaje de similitud se calcula mediante la metodología BlastP, por ejemplo, positivos (pares alineados con una evaluación positiva en la matriz Blosum62) como un porcentaje de la región superpuesta alineada incluyendo espacios internos. Los antagonistas de receptor de la GH derivados de la GH de vertebrado de la presente invención se pueden definir de manera similar, excepto que la secuencia polipeptídica se debe diferir adicionalmente a partir de la secuencia de la hormona de crecimiento del vertebrado de referencia, por ejemplo, en la posición que corresponde a Gly 119 en la hormona de crecimiento de bovino o Gly 120 en la hormona de crecimiento de humano, de manera que se imparte actividad antagonista de receptor de la GH (se une pero no se activa) a la secuencia polipeptídica y por lo tanto a la proteína de fusión. Nótese que actualmente se cree que la Gly119 bGH/Gly 120 hGH es una posición del residuo completamente conservado en la familia de la GH del vertebrado. Se ha reportado que una mutación independiente, R77C, puede resultar en la inhibición del crecimiento. Véase Takahashí Y, Kaji H, Okimura Y, Goji K, Abe H, Chihara K.,"Brief report: short stature caused by a mutant growth factor", N Engl J Med. 1996 Feb 15; 334 (7): 432-6. Preferiblemente, el antagonista del receptor de la GH tiene actividad inhibidora del crecimiento. Se considera que el compuesto es inhibidor del crecimiento si disminuye significativamente el crecimiento de los animales prueba de al menos una especie de vertebrados los cuales son tratados con el compuesto (o los cuales han sido genéticamente diseñados para expresar los mismos) (a un nivel de confianza de 0.95) en comparación con el crecimiento de los animales control (el término "significativo" siendo utilizado en su sentido estadístico). En algunas modalidades, es inhibidor del crecimiento en una pluralidad de especies, o al menos en humanos y/o bovinos. También, los antagonistas de la GH pueden comprender una hélice alfa que esencialmente corresponde a la tercera hélice alfa principal de la primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia, y al menos es 50% idéntica (más preferiblemente al menos 80% idéntica) con ésta. No obstante, las mutaciones no necesitan limitarse a la tercera hélice alfa principal.

Los antagonistas contemplados de la GH del vertebrado incluyen, en particular, fusiones en las cuales el polipéptido P corresponde a los mutantes de la hGH B2024 y B2036 como se define en la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. Nótese que B2024 y B2036 son ambos mutantes de la hGH incluyendo, entre otros, una sustitución G10K. Además, los inventores contemplan los antagonistas de la GH en los cuales B2024 y B2036 están mutados adicionalmente de conformidad, mutatis mutandis, con los principios anteriormente establecidos, por ejemplo, en los cuales B2024 o B2036 sirven en lugar de una GH que se presenta de manera natural tal como la HGH como la GH del vertebrado de referencia. De manera similar, uno puede definir los agonistas y antagonistas de la prolactina del vertebrado, y agonistas y antagonistas del lactógeno placental del vertebrado, el cual agoniza o antagoniza un receptor de la prolactina del vertebrado. Uno también puede tener mutantes de una hormona de crecimiento del vertebrado, el cual agoniza o antagoniza el receptor de prolactina (con o sin la retención de la actividad en contra de un receptor de la hormona de crecimiento), y mutantes de una prolactina o lactógeno placental de vertebrado, los cuales agonizan o antagonizan un receptor de la hormona de crecimiento del vertebrado (con o sin la retención de la actividad en contra de un receptor de prolactina). De manera similar, uno puede definir a los agonistas y antagonistas que son híbridos, o son mutantes de híbridos, de dos o más hormonas de referencia de la superfamilia de la hormona de crecimiento-prolactina-hormona del lactógeno placental del vertebrado, y los cuales retienen al menos 10% de al menos una actividad de unión al receptor de al menos una de las hormonas de referencia. Existen varias formas en las cuales estos híbridos pueden ser definidos. En una modalidad, los inventores simplemente permitieron que la primera hormona de crecimiento del vertebrado de referencia y la otra hormona de crecimiento del vertebrado de referencia fueran cualesquiera hormonas de vertebrado las cuales son miembros de la superfamilia. En una segunda modalidad, el mutante principalmente se define con base en una familia, por ejemplo, GH, pero en número limitado de posiciones, por ejemplo, menos de 10% o menos de 5% de la secuencia P, se permite elegir a partir de otra familia. En esta categoría se encuentra la prolactina octomutante de Cunningham, mencionado a continuación, la cual se une a la hGH. En una tercera modalidad, el híbrido es un híbrido segmentado, tales como un dihíbrido visualizado como que consiste de segmentos los cuales derivan alternativamente a partir de (a) la familia de la hormona de crecimiento del vertebrado o (b) la familia de prolactina de vertebrado, iniciando con cualquiera. El número de segmentos puede ser impar o par, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Preferiblemente, existen no más de diez segmentos. En un segmento derivado de la GH, las hormonas de referencia son GH de vertebrado, y en segmentos derivados de prolactina, las hormonas de referencia son prolactinas de vertebrado. Preferiblemente, cada segmento es al menos de diez aminoácidos consecutivos de largo. Los segmentos pueden ser desiguales en longitud. Cunningham, mencionado a continuación, describe varios híbridos GH/prolactina (o mutantes de los mismos) los cuales tienen tres segmentos, del formato (derivado de GH)-(derivado de prolactina)-(derivado de GH). De manera similar, el híbrido segmentado puede ser un dihíbrido GH/PL o PL/PRL, o un trihíbrido GH/PRL/PL (en el último caso, la regla es que los segmentos adyacentes se derivan a partir de diferentes familias, ya sea GH, PRL o PL).

Familia de la hormona de crecimiento-prolactina-lactóqeno placental Las hormonas de crecimiento, lactógenos placentales, y prolactinas son proteínas homologas, que se piensa que se generan a partir de una molécula ancestral común. Se cree que las prolactinas y las hormonas de crecimiento divergieron aproximadamente hace 400 millones de años, de allí la presencia de distintas prolactinas y hormonas de crecimiento en peces. Los lactógenos placentales solamente se observan en mamíferos, y se ha hipotetizado que los PLs de primate se desarrollaron a partir del linaje de la hormona de crecimiento y los PLs no de primate a partir de la prolactina. Se piensa que la proteína hCS se desarrolló a partir de duplicación génica a partir de hGH. También existen somatolactinas en peces, con secuencias intermediarias entre aquellas de prolactina y GH. Las hormonas de crecimiento maduras, prolactinas, y lactógenos placentales típicamente están compuestas de 190-200 residuos, con pesos moleculares de 22,000-23,000 daltones. No obstante, no se requieren estos tamaños; por ejemplo, la GH de lenguado madura no es de más de 173 residuos de largo. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas son demasiado similares para haber sido generadas solamente por casualidad; una búsqueda BlastP, utilizando hGH madura como la secuencia de búsqueda, con la matriz para evaluación por omisión (Blosum62) y las sanciones por espacio (11 por creación/1 por extensión), y sin filtro de baja complejidad, produce un valor E de 1 e-106, 9e-90 para el alineamiento con lactógeno placental de humano (prf 731144A), y 6e-11 para el alineamiento con prolactina de humano (ref Un_000939.1). Las consideraciones funcionales también justifican la definición de la superfamilia de la hormona de crecimiento-lactógeno placental-prolactina. Incluso si también existe un receptor de lactógeno placental diferente, véase Freemark, J. Clin. Investig., 83: 883-9 (1989), el efecto de lactógenos placentales sobre el receptor de prolactina es significativo. Clásicamente, el receptor GH es el receptor específico para GH, y el receptor de prolactina (también conocido como lactógeno) es el receptor específico para prolactina y lactógeno placental. No obstante, las GH de primate se pueden unir al receptor de prolactina con alta afinidad, y algunos lactógenos placentales de mamífero no humano se pueden unir al receptor de somatogeno (GH). También se puede hacer referencia a las similitudes estructurales de las proteínas del receptor de GH y de prolactina. Véase Goffin, et al., "Sequence-Function Relationships Within the Expanding Family of Prolactin, Growth hormone, Placental Lactogen, and Related Proteins in Mammals", Endocrine Revs., 17 (4): 385-410 (1996); Nicoll, et al., "Structural Features of Prolactins and Growth Hormones that Can Be Related to Their Biological Properties", Endocrine Revs., 7 (2): 169-203 (1986). Para el propósito de la presente solicitud, ia superfamilia GH- PRL-PL está compuesta de todas las proteínas las cuales, cuando se alinean con la hGH (porción madura de ref NP_000506.2) mediante BlastP como se estableció anteriormente, produce un alineamiento para el cual el valor E es menor de (por ejemplo, mejor que) e-06. Las hormonas de crecimiento (GH) son una familia de proteínas de vertebrado con aproximadamente 191 residuos de aminoácidos, el número varía de especie a especie. Existen cuatro residuos de cisteína, y dos enlaces disulfuro. Véase generalmente Harvey, et al., Growth Hormone (CRC Press: 1995). La secuencia de aminoácidos de las hormonas de crecimiento aisladas a partir de varias especies de vertebrados está altamente conservada. En la búsqueda BlastP anteriormente mencionada, el valor E para los alineamientos de la hGH madura con un poco de las muchas otras bases de datos de las GH fue como sigue (mejor alineamiento para cada especie citada): 1 e-106 (Pan troglodytes), 3e-97 (Caallithrix jacchus, marmota común), 3e-68 (Balaenoptera borealis, rorcual; Delphinus delphis, delfín común; Hippopotamus amphibius), 4e-68 (Canis familiaris, perro; Sus scrofa domestica, cerdo), 2e-67 (Mus musculus), 1e-66 (Rattus norvegicus, rata noruega; Oryctolagus cuniculus, conejo doméstico; Cavia porcellus, conejillo de Indias), 2e-65 (Capra hircus, cabra; Giraffa camelopardalis, jirafa; Bos taurus, bovino); 3e-65 (Ovis aries, oveja doméstica); 4e-59 (Crocodulus novaeguineae), 4e-58 (Chelonia mydas), 5e-58 (Gallus gallus, pollo); 2e-55 (Tarsius syrichta, trasero de Filipinas) (un valor E relativamente alto para un mamífero); 1e-53 (Lepisosteus osseus, un pez óseo); 8e-08 (Torpedo californica). La mejor evaluación de estomatolactina es sp P20362, valor E de 2e-18. El mejor valor E (más bajo) es aquel el cual se puede obtener si la búsqueda y la secuencia de la base de datos fueran idénticas (o si una comprende a la otra); en una búsqueda reciente en la cual la secuencia de búsqueda fue la hGH madura, el mejor valor E fue aquel para el alineamiento de la hGH madura con la base de datos para el precursor de hGH (ref NP_000506.2): 1 e-106. Si el valor E para un alineamiento es bajo, la evaluación del alineamiento debe haber sido elevada en relación con aquellas las cuales podrían presentarse solamente por casualidad. La evaluación del alineamiento para cada alineamiento se calcula mediante la adición de las evaluaciones de pares de aminoácidos individuales dictados por la matriz para evaluación, y sustrayendo las sanciones por espacio apropiadas para cualesquiera espacios. El algoritmo de alineamiento introduce espacios solamente si éstos resultan en una mejoría neta en la evaluación de alineamiento general. En la matriz de evaluación, las identidades tienden a tener los valores más elevados, y por lo tanto los alineamientos con altas evaluaciones de alineamiento también tenderán a ser caracterizados como que tienen una alta identidad de porcentaje. No obstante, los alineamientos clasificados por la evaluación del alineamiento no necesariamente tendrán el mismo orden como si aquellos mismos alineamientos fueran clasificados mediante el porcentaje de identidad. En BlastP, el porcentaje de identidad se calcula como el número de identidades expresadas como un porcentaje de la longitud de la "superposición", la región alineada. Esta región empieza y termina con pares de aminoácidos alineados (no necesariamente idénticos) y pueden incluir uno o más espacios en cualquier secuencia o en ambas secuencias. Un espacio se presenta en donde uno o más aminoácidos consecutivos dentro de una secuencia se quedan sin aparear con los aminoácidos en la otra secuencia (esto se puede simbolizar mediante el alineamiento de cada uno de éstos con un símbolo nulo, tal como un guión, en esa otra secuencia). La longitud calculada de la región superpuesta es la suma del número de pares alineados y las longitudes de los espacios. Si una secuencia sobresale con respecto a la otra, la región que sobresale es un espacio terminal, fuera de la región de superposición, y no cuenta en el cálculo del porcentaje de identidad. Los siguientes son ejemplos del porcentaje de identidad BlastP de la GH de humano (ref NP_000506.2) con otros miembros de la superfamilia GH-PRL-PL: lactógeno placental de humano (85%, 161/189), GH de ballena, delfín e hipopótamo (67%, 130/192, 3/192 en los espacios), GH de cerdo (67%, 130/193, 3/192 en los espacios), GH de ratón (65%, 126/192, 3/192 en los espacios), GH de bovino (66%, 127/192, 3/192 en los espacios), GH de cocodrilo (59%, 113/190, 3/190 en los espacios), GH de pollo (57%, 110/190, 3/190 en los espacios), GH de hámster de Siria (62%, 108/172, 2/172 en los espacios), GH de Lepisosteus osseus (54%, 102/186, 3/186 en los espacios), de lenguado Japonés (27%, 53/190, 8/190 en los espacios), prolactina de humano (23%, 45/191 , 12/191 en los espacios). El porcentaje de identidad general de la hormona de crecimiento de bovino con otras hormonas de crecimiento de mamífero, no de primate, es muy alto: porcino (92%), ovino (99%), y rata (87%). Watahiki, et al., J. Biol. Chem., 264: 312 (1989) compararon las secuencias de las hormonas de crecimientos de lenguado, peces del género Serióla, atún, salmón, pollo, rata, porcino, ovino, bovino y de humano. La figura 3 de Watahiki identifica los residuos conservados entre las GH y los residuos que se ha pronosticado que son importantes para la manifestación de la actividad promotora del crecimiento. Ellos identificaron los cinco dominios conservados los cuales marcaron GD1-GD5. Las mutaciones en estos dominios conservados tienen mayor probabilidad de afectar la actividad. Se conocen las estructuras 3-dimensionales de dos GH, y son muy similares. La GH de porcino es una proteína de un dominio particular arreglado como un haz de cuatro hélices con las hélices en una relación en antiparalelo (arriba-arriba-abajo-abajo). Sus cuatro hélices están elaboradas de los residuos 7-34, 75-87, 106-127 y 152-183. Véase Abdel-Meguid et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 6434 (1987). La hormona de crecimiento de humano caracteriza un haz de cuatro hélices principales (9-34, 72-92, 106-128, y 155-184), conectado mediante asas (35-71 , 93-105 y 129-154). El asa 1 (entre las hélices 1 y 2) comprende mini-hélices en 38-47 y 64-70, y el asa 2 (entre las hélices 2 y 3) una en 94-100. La referencia a las hélices 1-4 de la hGH es una referencia a las hélices principales, no a las mini-hélices. La hélice 2 se retuerce en Pro-89. Véase DeVos, et al., Science, 255: 306-312 (1992). También se cree que las otras GH son proteínas de cuatro hélices, con base en los métodos de predicción de estructura secundaria, alineamiento de secuencia, y conocimiento de las estructuras 3-D de la pGH y/o hGH. Por ejemplo, la hormona de crecimiento de bovino es 92% homologa al nivel de secuencia de aminoácidos con la hormona de crecimiento de porcino, y la estructura de las bGH ha sido deducida mediante el estudio de las dos secuencias y de la estructura de la hormona de crecimiento de porcino. Se ha reportado que las cuatro hélices alfa se adoptan por los aminoácidos 4-33, 66-80, 108-127 y 150-179. La tercera hélice alfa de la bGH se define como los aminoácidos 106-129. No obstante, se debe mencionar que los extremos de esta hélice tiene una estructura secundaria de hélice alfa menos marcada que la región central, la cual es 109-126. Los límites exactos de la tercera hélice alfa pueden diferir a partir de otras GH, dependiendo de las tendencias de la hélice alfa de los aminoácidos "terminales". La conformación es razonablemente consistente con las predicciones realizadas por Chen y Sonenberg, Biochemistry, 16: 2110 (1977) utilizando el método de Chou y Fasman, Biochemistry, 13: 222 (1974) (AAs 10-34, 66-87, 111-127, 186-191 ). Para el trabajo preliminar en la determinación de la estructura 3-D de bGH, véase Bell, et al., J. Biol. Chem., 260: 8520-25 (1985). Las hormonas de crecimiento pueden tener una reactividad cruzada inter-especies considerable. En general, la tendencia es para hormonas de crecimiento "superiores" para activar receptores de la GH "inferiores", pero no a la inversa. La GH de humano es activa en mamíferos no humanos, pero las GH no de humano, no de primate generalmente son inactivas en humanos. La GH de bovino es activa en el caballo (véase De Kock, et al., J. Endocrinol., 171 (1 ): 163t171 (2001)). Las GH de mamífero y de ave son activas en peces, véase Gill, et al., Biotechnology, 3: 643 (1985) quienes reportaron que las hormonas de crecimiento recombinantes de pollo y de bovino aceleran el crecimiento en el salmón juvenil del pacífico. La mutación de una GH no de humano, que incrementa su similitud con la GH de humano, la volverá más probable para que sea activa en contra del receptor de GH de humano. Para los estudios de los orígenes estructurales de la especificidad de las especies en la GH o en su receptor, véase Liu, et al., "Episodio Evolution of Growth Hormone in Primates and Emergence of the Species Specificity of Human Growth Hormone Receptor", Mol. Biology & Evolution, 17: 945-53 (2001); Alian, et al., "Identification of Novel Sites in the Ovine Growth Hormone Receptor Involved in Binding Hormone and Conferring Species Specificity", Eur. J. Biochem., 261 (2): 555-62 (1999). El lactógeno placental de humano tiene una identidad de secuencia general con hGH de 85%, pero su unión a hGH bp es -2,000 veces más débil. El documento WO 97/11178 en la p. 100. Para una comparación de los lactógenos placentales, véase Forsyth, Exp. Clin. Endocrinol., 102 (3): 244-51 (1994). La prolactina de humano es una proteína de 199 residuos (proteína de 23 kDa), con una identidad de 23% (BlastP) con respecto a la GH de humano. Se ha determinado la estructura 3-D de la prolactina de humano; como se esperaba, ésta tiene cuatro hélices primarias, con una topología arriba-arriba-abajo-abajo, tal como la hormona de crecimiento de humano. También existen diferencias interesantes. La primera asa extendida de hPRL carece de la primera de las dos mini-hélices encontradas en el asa comparable de la hGH, mientras que la segunda mini-hélice se desvía en un ángulo a partir de su contraparte de la hGH. Ambas hPRL y hGH tienen un asa corta que conecta a las hélices primarias 2 y 3, pero el asa es más corta en hPRL, y no existe una mini-hélice componente. Finalmente, la N-terminal de hPRL es más largo que aquel de la hGH, y contiene un asa corta asociada con el disulfuro. Véase Keeler, et al., "The Tertiary Structure and Backbone Dynamics of Human Prolactin", J. Molec. Biol., 328: 1105-221 (2003). En la figura 1 de Keeler, la Gly-120 de la HGH se alinea con la Gly-129 de hPRL. Se sabe que los mutantes G129X de hPRL exhiben actividad antagonista del receptor de prolactina, véase a continuación.

Receptor de la hormona de crecimiento (Somatotrópico) El receptor hGH pertenece a una familia grande de receptores de origen hematopoiético, la cual incluye a la interleucina-3 y a los receptores del factor estimulante de la colonia de granulocito. Para la purificación y caracterización de un receptor de la hormona de crecimiento de humano, véase Leung, et al., Nature, 330: 537-43 (1987). El dominio extracelular del receptor de la hGH se designó hGHbp. La afinidad (Kd) de la hGH para la hGHbp se reportó por Cunningham et al. (1989) como de 0.34 nM. El documento WO 92/03478 reporta que la afinidad de la hGH para la hGHbp en la presencia de EDTA es tal que la Kd es de 0.42 nM, mientras que en la presencia de ZnCI2 la afinidad se redujo (KD de 1.6 nM). También se reportó que la afinidad de hPRL para la hGHbp es extremadamente baja (KD > 100,000 nM ya sea en la presencia de EDTA o de ZnCI2, véase el cuadro 1 ). La afinidad del hPL para la hGHbp es muy baja (949.2 nM, cuadro 13), pero no tan baja como aquella de hRPL.

Estructura 3D de los complejos de GH: receptor de la GH También se conoce la estructura 3D del complejo hGH:hGHbp (véase Wells y DeVos, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22: 329-51 (1993) y DeVos, et al., Science, 255: 306 (1992)). Estos investigadores examinaron el complejo de la hGH y el dominio extracelular de su receptor (hGHR) mediante difracción de rayos X. El complejo tuvo la forma de la hGH (hGHR) 2; es decir, el receptor se dimeriza para interactuar con la hGH. La primera región de unión al receptor ("sitio 1") de la hGH es cóncava y se forma principalmente por los residuos en las caras expuestas de la hélice 4, pero también por los residuos expuestos de la hélice 1 y los residuos en la región que conecta las hélices 1 y 2. La segunda región de unión al receptor ("sitio 2") comprende los lados expuestos de las hélices 1 y 3 y es relativamente plana. El papel de la hélice 3 se muestra mejor en la figura 5 de DeVos; existe una disminución significativa en la accesibilidad del solvente alrededor de la E119 de la hGH después de la formación del complejo. Los antagonistas de la GH que son mutantes de la GH con mutaciones que corresponden a bGH119X (o hGH120X) parecen interferir con la dimerización del receptor. Los residuos del sitio 1 de la hGH son H18, H21 , Q22, F25, K41 , Y42, L45, Q46, P61 , S62, N63, E66, R167, K168, D171 , K172, 1175, R178, C182 y C189. Los residuos del sitio 2 son T3, 14, L6, L9, N12, L15, r16, R19, Q22, Y103, N109, D116, D119, G120 y T123. Véase los cuadros 4 y 5 de la patente de E.U.A. No. 5,506,107 para detalles sobre la naturaleza de las interacciones entre estos residuos y la hGHbp. De conformidad con la estructura de rayos X del complejo de la hgh(hGHbp)2, las dos HGHbp se contactan entre sí en la Ser201. Consecuentemente, se puede utilizar una matriz hGHbp(S201 C) para evaluar las variantes de la hGH para la unión solo al sitio 1. Véase el documento WO 97/11178.

Receptor de prolactina El dominio de unión extracelular (AAs 1-211) del receptor de prolactina se designó hPRLbp. Este es aproximadamente 32% idéntico a la hGHbp, véase el documento WO 90/04788 p. 89. El documento WO 92/03478 ¡nicialmente reporta (cuadro 1 ) que la afinidad de hPRL para la hPRLbp en la presencia de EDTA es tal que la Kd es de 2.1 nM, aunque en la presencia de ZnCI2 la afinidad se redujo (KD de 2.6 nM). No obstante, en el cuadro 11 se dice que la afinidad de hPRL para la hPRLbp sin zinc es de 2.8 nM. La GH de humano también se une al receptor de prolactina de humano. (Véase Boutin et al., Cell, 53: 69 (1988)). El documento WO 92/03478 reporta que la afinidad de la hGH para la hPRLbp en la presencia de EDTA es tal que la Kd es de 270 nM, aunque en la presencia de ZnCI2 la afinidad se incrementa sustancialmente (KD de 0.033 nM, por ejemplo, 33 pM). La afinidad incrementada también se observó para la sustitución particular de la Ala de la hGH en los mutantes H18A (370 a 4.5 nM), H21A (200 a 3 nM), E174A (360 a 12 nM) y D171A (ND a 0.037 nM). El epítope para unión a la hGH para el receptor de prolacfina está compuesto de determinantes en la parte media de la hélice 1 (que comprenden los residuos F25 y D26), una región en asa (incluyendo 158 y R64), y una porción central de la hélice 4 (incluyendo K168, K172, E174, y F176). Véase el documento WO 90/04788 p. 56. Esta zona específica se sobrepone, pero no es idéntica, con respecto al epítope hGH para el receptor de la hGH. Se proporcionan las afinidades en unión de diversos mutantes de la hGH para la hPRLbp en la presencia de ZnCI2 en los cuadros 7-9. El documento WO 92/03478, p. 13, sugiere que la unión del zinc al complejo de la hGH:hPRLbp se media por los residuos de la hGH H18, H21 y E174. La afinidad de hPL por la hPRLbp en la presencia de ZnCI2 es de 50 pM. En la ausencia de zinc el hPL se precipita. Las afinidades de unión de la hPRLbp de los mutantes dei hPL D56E, M64R, E174A, M179I, D56E/M64R/M179I, y V41/D56E/M64R/M179I se proporcionan en el cuadro 12 del documento WO 92/03478.

Proteínas híbridas y mutagénesis para selección del homólogo Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989) utilizaron una técnica denominada mutagénesis para selección del homólogo para identificar los residuos que participan en la unión de hGH a la hGHbp. Esencialmente, los fragmentos seleccionados a partir del polipéptido hGH se reemplazaron con los fragmentos correspondientes (de conformidad con el alineamiento de secuencia de Cunningham) de una hormona homologa (pGH, hPL o hPRL). Esto en efecto creó las proteínas las cuales fueron híbridos de hGH y una hormona homologa. Se debe mencionar que Cunningham no siempre reemplaza todos los residuos del segmento blanco.

Una comparación de las afinidades de unión de estos mutantes de GH y hGH de fipo silvestre con respecto a un receptor clonado de hígado de la hGH, lleva a la conclusión de que se presentaron tres determinantes polipeptídicos discontinuos en la hGH implicados en la unión del receptor de la hGH de hígado. Estos se localizaron en el extremo NH2, en el extremo COOH, y dentro de un asa entre los residuos de aminoácidos 54 y 74. Estos dominios de unión putativos se analizaron adicionalmente mediante una técnica de mutagénesis para selección de alanina en la cual los residuos de alanina se sustituyeron sistemáticamente a lo largo de esas regiones (véase a continuación). A continuación se establecen adicionalmente las mutaciones introducidas dentro de la hGH por Cunningham: Las primeras cuatro columnas se basan en Cunningham et al. (1989), y la última columna en el cuadro XVIII del documento WO 90/04788. Los datos de la hGHbp para w+ hPRL también son a partir del documento WO 90/04788. Los datos para la unión de w+ hGH a hGH bp son a partir del cuadro 11 del documento WO 94/04788.

Estudio de mutagénesis para selección de la primera Ala La mutagénesis para selección de la alanina se describió inicialmente por Cunningham y Wells ("High-Resolution Mapping of hGH-Receptor Interactions by Alanine Scanning Mutagenesis", Science 284: 1081 (1989)). En vista de los resultados de mutagénesis para selección del homólogo, su estudio se dirigió hacia los residuos 2-19, 54-75, y 167-191. Se muestra que los residuos de aminoácidos en las posiciones 10, 58, 64, 68, 172, 174, 175, y 176 de hGH son importantes para la unión del receptor de la GH. No obstante, se reportó no se inhibió el crecimiento por ninguno de los mutantes para la sustitución de una Ala particular en las GH evaluadas. Basándose en la mutagénesis para selección de alanina, los aminoácidos de reemplazo preferidos para la hGH son los residuos F10, F54, E56, 158, R64, Q68, D171 , K172, E174, T175, F176, R178, C182 y V185 que se listan en el cuadro IV, p. 52, del documento WO 90/04788. Estos residuos son aquellos para los cuales la sustitución de alanina resulta en un efecto de más de cuatro veces a sobre la Kd. El cuadro V de la misma referencia enlista los residuos para los cuales la sustitución de la alanina resulta en un efecto de menos de dos veces, y el cuadro VI aquellos para los cuales tuvo un efecto favorable. El cuadro X que se establece a continuación sugiere el reemplazo de los AAs para los residuos de la hGH S43, F44, H18, E65, L73, E186, S188, F191 , F97, A98, N99, S100, L101 , V102, Y103, G104, R19, Q22, D26, Q29, E30 y E33.

Estudio de la hGH174 Puesto que la mutación E174A resultó un incremento sustancial en la afinidad de hGH:hGHbp, se evaluaron doce sustituciones alternativas en este sitio para actividad. El tamaño de la cadena lateral parece ser el factor principal para la determinación de la afinidad. El AA óptimo sigue siendo Ala (0.075), seguido por Ser (0.11), Gly (0.15), Gln (0.21), Asn (0.26), Glu (tipo silvestre, 0.37), His (0.43), Lys (1.14), Leu (2.36) y Tyr (2.9). No se presentó expresión de E174D o E174R. Véase el cuadro 6 del documento WO 92/03478.

Estudio de mutagénesis para selección de la segunda Ala Los residuos K41 , Y42, L45 y Q46, los cuales pertenecen a la primera minihélice, no se evaluaron en el primer estudio, y por lo tanto se estudiaron subsecuentemente. Los valores de la Kd se proporcionan en el cuadro 3 de la patente de E.U.A. No. 5,534,617. El documento WO 97/11178 menciona en la p. 106 que "un punto inicial para la optimización eficiente de la afinidad es un análisis completo de la alanina en la interfaz relevante".

Mutantes dobles Se prepararon varios mutantes dobles con el objetivo de alterar la preferencia del receptor hGH/hPRL. Para la hGH de tipo silvestre, la unión es de 2.3 nM a hPRLr y de 0.34 a hGHr. Para K168A/E174A, los valores son 1950 y 0.09, y para K172A/F176A, éstos son -40,000 y 190. Estos mutantes dobles evidencian así la preferencia incrementada por el hGHr sobre el hPRLr. Véase el documento WO 90/04788.

Aditividad de los efectos por sustitución particular El cuadro XXI del documento WO 90/04788 analiza la aditividad de los efectos de diversas sustituciones particulares sobre la unión de los receptores de la hGH o de la hPRL. Estos efectos se caracterizan como "impresionantemente aditivos." Genoteca de la hélice-4a Se preparó una genoteca combinatorial de mutantes en la cual la hGH de tipo silvestre se mutó al azar en los residuos K172, E174, F176 y R178. Estos residuos se dirigieron para mutagénesis al azar debido a que todos estos yacen o se encuentran cerca de la superficie de la hGH, y contribuyen significativamente a la unión del receptor como se muestra por mutagénesis para selección de la Ala, yacen dentro de una estructura indefinida que ocupa dos vueltas en el mismo lado de la hélice 4, y están sustituidos por al menos un aminoácido entre las variantes evolutivamente conocidas de la hGH. Véase la p. 32 del documento WO 92/09690. Las mutantes seleccionadas mediante unión competitiva con respecto la hGHbp fueron KSYR (0.06 nM), RSFR (0.10), RAYR (0.13), KTYK (0.16), RSYR (0.20), KAYR (0.22), RFFR (0.26), KQYR (0.33), KEFR (tipo silvestre, 0.34), RTYH (0.68), QRYR (0.83), KKYK (1.1 ), RSFS (1.1 ) y KSNR (3.1 ), con, por ejemplo, "KSYR" denotando K172, S174, Y176 y R178. El mutante de unión más estrecha (E174S, F176Y) tuvo una afinidad aproximadamente seis veces mayor que la hGH de tipo silvestre. Véase el cuadro Vil del documento WO 92/09690. Para las secuencias de algunos mutantes no seleccionados (¡lustrando así la diversidad de la genoteca), véase el cuadro VI de la patente de E.U.A. No. 5,780,279. Estos mutantes deben tener una afinidad de unión menor a la hGHbp que los mutantes seleccionados, pero no están necesariamente completamente sin capacidad de unión., Genoteca de la hélice-4b Se preparó una genoteca combinatorial de mutantes en la cual el mutante de la hGH (E174S, F176Y) se mutó al azar en R167, D171 , T175 y 1179. El cuadro XI del documento WO 92/09690 muestra que N, K, S, D, T, E y A se aceptan todos en 167 (wt=R); S, N y D en 171 (wt=D); T, A y S en 175 (wt=T); y T, N, Q, I y L en 179 (wt=l). Algunas mutaciones se sobre-representaron entre las clonas seleccionadas en comparación con la frecuencia esperada de esas mutaciones en la genoteca basándose en el codón (NNS) utilizado para codificarlos. Esta sobre-representación se puede expresar en unidades de desviación estándar por (frecuencia observada-frecuencia esperada)/desviación estándar. En las 56 clonas secuenciadas, las mutaciones sobre-representadas (con una evaluación de al menos 2.0 unidades de desviación estándar) fueron R167N (25.6 sd), R167K (4.1 ), D171S (14.1 ), D171 (4.8), D171 N (4.1), T175 (29.1), I179T (18.6), I179N (4.1 ). Véase el cuadro 4 de la patente de E.U.A. No. 5,534,617. El mejor miembro de la genoteca fue un pentamutante (R167D, D171S, E174S, F176Y, 1179T), con tres nuevas mutaciones con relación a la doble mutación de fondo, las cuales se unen al receptor de la hGH aproximadamente 8 veces mejor que la hGH tipo silvestre.

Genoteca de la hélice-1 Se preparó una genoteca combinatorial de mutantes en la cual la hGH de tipo silvestre se mutó al azar en F10, M14, H18 y H21. Después de 4 rondas de selección, se aisló un tetramutante (F10A, M14W, H18D, H21 N) el cual se une al receptor aproximadamente 3 veces mejor (Kd 0.10 nM) que la hGH de tipo silvestre. En las 68 clonas secuenciadas, los siguientes aminoácidos estuvieron sobre-representados en las posiciones mutadas con una evaluación de al menos 2.0 unidades de desviación estándar: F10A (12.0 sd), F10 (10.4 sd), F10H (6.2 sd), M14W (11.1 ), M14S (4.8), M14Y (2.7), M14N (2.7), M14H (2.0), H18D (18.8), H18F (4.1), H18N (3.4), H21 N (20.2), y H21 (4.8). Véase el cuadro 4 de la patente de E.U.A. No. 5,534,617. Más generalmente, el cuadro VIII del documento WO 92/09690 muestra que H, A, Y, L, I, y F se aceptaron todos en la posición 10, G, W, T, N y S en la posición 14; N, D, V, I S, y F en la posición 18, y N, H, G y L en la posición 21.

Genoteca de la minihélice-l Se preparó una genoteca combinatorial de mutantes en la cual la hGH de tipo silvestre se mutó en la minihélice-1 en las posiciones K41 , Y42, L45 y Q46. Los resultados se muestran en el cuadro 4 de la patente de E.U.A.

No. 5,534,617. Se secuenciaron diecisiete clonas. Mediante el criterio de la desviación estándar hubo una preferencia leve (3.7 unidades de desviación estándar) para K41 R, una ligera preferencia para Y42R (2.0 sd) o Y42Q (2.0 sd), una fuerte preferencia para L45W (4.8 sd) o L45 de tipo silvestre (4.5 sd), y una preferencia más fuerte para Q46W (7.6). También se observaron K41 F (2.0 sd), Q46F (2.0 sd) y Q46Y (2.0 sd). Se clonó el mejor de los miembros de la genoteca 835.A6 (411 , 42H, 45W, 46W), con una afinidad mejorada 4.5 veces sobre la hGH tipo silvestre. Véase el cuadro 5 de la patente de E.U.A. No. 5,534,617.

Genoteca del asa-A Se preparó una genoteca combinatorial de los mutantes en la cual la hGH de tipo silvestre se mutó al azar en las posiciones del asa A F54, E56, 158 y R4. En las 26 clonas secuenciadas, las mutaciones sobre-representadas (al menos 2 sd) fueron F54P (14.1 sd), E56D (4.7), E56W (4.7), E56Y (2.5), 158 (8.1 ), I58V (3.5) y R64K (22.8). El mutante R64K, que se encontró en 81% de las clonas, previamente se conoció porque podría ocasionar una mejoría de tres veces en la afinidad. El mejor de los miembros de la genoteca evaluados fue el tetramutante (F54P, E56D, I58T, R64K), el cual tuvo una afinidad 5.6 veces mayor en comparación con la hGH de fipo silvestre.

Uso de la genoteca combinatorial, Generalmente El documento WO 97/11178 menciona (p. 107) que idealmente uno debería modificar al azar los residuos que se encuentran en contacto entre sí en el mismo paso de mutagénesis de manera que éstos se dejan co-variar. Aunque dicha covariación permite la detección de efectos no aditivos por sustitución múltiple, la mayoría de las mejorías fueron efectos aditivos simples. Véase el documento WO 97/11178, p. 108.

Mutantes no combinatoriales por sustitución múltiple Se sintetizaron diversas combinaciones de las siguientes subcombinaciones de mutaciones múltiples y se evaluaron como se muestra en el cuadro 6 de la patente de E.U.A. No. 5,534,617: A= F10H, M14G, H18N, H21N B= F10A, M14W, H18D, H21 N (0.10) C= M14S, H18F, H21L (0.68) D= R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T (0.04) E= R167E, D171S, E174S, F176Y (0.04) F= R167N, D171N, E174S, F176Y, I179T (0.06) 852b= K41 I, Y42H, L45W, Q46W, F54P, R64K (0.0079) Se prepararon las combinaciones de las variantes de la hélice-1 A, B o C, con las variantes de la hélice-4b D, E o F. La variante A, y las combinaciones AD, AE y AF, formaron dímeros disulfuro y por lo tanto no fueron investigadas adicionalmente. La variante C también formó un dímero disulfuro, pero no CD, CE y CF. No es evidente si se preparó BE; no se hace referencia a esto. Las combinaciones evaluadas, y sus valores Kd (nM), fueron BD (0.01), CD (0.011), CE (0.014), BF (0.016), CF (0.021) y 852d (BD+852b) (0.0009). Nótese que 852d difiere en 15 sustituciones a partir de la hGH de tipo silvestre.

Genoteca combinatorial por selección de unión Se han realizado algunos intentos para explorar de manera combinatorial las mutaciones simultáneas en la hélice-1 y la hélice-4. La mutación de cuatro residuos en la hélice-1 y 4 residuos en la hélice 4 para explorar de manera sistemática todos los 20 AAs posibles en cada una de estas ocho posiciones podría significar la preparación de un agrupamiento de las secuencias de ADN 1.1 e12 las cuales mediante la degeneración de NNS codifican 2.6e10 polipéptidos diferentes. En 1991 no fue posible la obtención de una genoteca al azar de fagémido lo suficientemente grande (tal vez de e13 transformantes) para asegurar la representación de todas las variantes. Consecuentemente, se construyó una genoteca mediante el agrupamiento de ADN seleccionados por ligación al azar a partir de la selección de genoteca de la hélice-1 y hélice-4b, y el ADN no degenerado para completar la secuencia codificante, de manera que se crea un agrupamiento combinado. Existe cierta cantidad de diversidad en cada uno de los agrupamientos del donante. Los resultados se muestran en el cuadro XIII- A del documento WO 92/09690. Véase también el cuadro 7 del documento WO 97/11178.

Mutantes de la tercera hélice alfa de las hormonas de crecimiento los cuales funcionan como los antagonistas de la GH Los mutantes de la hGH y de la bGH los cuales funcionan como los antagonistas de la GH se identificaron inicialmente en Kopchick et al. Kopchick et al. descubrieron que la mutación de Gly119 en la bGH hacia Arg ("G119R"), Pro ("G119P"), Lys ("G119K"), Trp ("G119W") o Leu ("G119L"), o la Gly120 homologa en hGH hacia Arg o Trp, resulta en una muteína (proteína mutante o fragmento peptídico de la misma) la cual tiene actividad inhibidora del crecimiento en vertebrados, especialmente mamíferos. Kopchick et al. descubrieron que los mutantes de la bGH, cuando se expresan en los ratones transgénicos, resultan en ratones con una relación de crecimiento de entre 0.57 y 1.0. La relación de crecimiento de los ratones se correlacionó negativamente con el nivel de suero del análogo de la bGH, por ejemplo, conforme el nivel de suero del análogo de la bGH se incrementa, la relación de crecimiento de los animales disminuye. También, estos análogos, cuando se expresan en NIH-3T3-preadipocitos, no resultan en la estimulación de la diferenciación de los preadipocitos, mientras que la GH nativa promoverá su diferenciación. De hecho, estos análogos antagonizarán la capacidad de la GH de tipo silvestre para promover la diferenciación de preadipocitos. Kopchick et al. se refirieron a estos análogos como "antagonistas funcionales". Kopchick et al. también generaron ratones transgénicos los cuales expresan cualquier hGH, hGH G120A, hGH G120R y hGH G120W de tipo silvestre. Los ratones los cuales expresan hGH G120A muestran un fenotipo de crecimiento mejorado similar a los ratones los cuales expresan la hGH de tipo silvestre. En contraste, la sustitución de R o W por G en la posición 120 de la hGH, y la expresión subsecuente en ratones transgénicos, resulta en animales con una relación de crecimiento entre 0.73 y 0.96, y cuyo nivel de hGH en suero se correlaciona de manera negativa con el fenotipo de crecimiento; por ejemplo, conforme se incrementan los niveles en suero de éstos análogos de la hGH 120, disminuyen las relaciones de crecimiento. Se ha demostrado por los investigadores de Genentech que el mutante G120R de la hGH se une a la hGHbp, y que la afinidad para la hGHbp (S237C) fue de Kd= 1.6 nM, y para la hGHbp (S201 C) fue de Kd =2.7 nM. En el mismo experimento, la KD para la unión de la hGH de tipo silvestre hacia la hGHbp (S201 C) fue de 0.9 nM. Es importante señalar que cuando hGh y bGH están alineadas de conformidad con principios comúnmente aceptados de alineamiento de secuencia, el residuo de glicina en la bGH en la posición 19 está alineado con (por ejemplo, corresponde a) el residuo de glicina en la hGH en la posición 120. Ambos se localizan en la porción central de la tercera hélice alfa.

Los mutantes preferidos inhibidores del crecimiento se caracterizan por una modificación de la topografía de la superficie de la tercera hélice alfa. En la tercera hélice alfa de la hormona de crecimiento de "fipo silvestre" de bovino, existe una hendidura en la superficie o depresión que inicia, en el Aspartato-115, profundizando en la glicina-119, y terminando con la alanina-122. Todos los mutantes discutidos en las referencias mencionadas en esta sección, los cuales retienen la actividad promotora del crecimiento de tipo silvestre y aquellos que no lo hacen, son consistentes con la teoría de que la actividad promotora del crecimiento requiere la presencia de esta hendidura o depresión y que, si la parte central de esta hendidura está "ocupada" por la sustitución de aminoácidos con cadenas laterales más voluminosos, la muteína inhibe el crecimiento del sujeto. Con respecto al aminoácido 119, la glicina es tanto el residuo de aminoácidos más pequeño como el residuo de aminoácidos menos favorable para la formación de la hélice alfa. Por lo tanto, se cree que cualquier otro aminoácido puede ser sustituido por éste sin desestabilizar la hélice alfa, mientras que al mismo tiempo ocupa la hendidura anteriormente mencionada. Todas las sustituciones de la G119 bGH evaluadas resultaron en un fenotipo de "animal pequeño". Estas sustituciones fueron arginina (un AA grande, positivamente cargado), prolina (un AA cíclico alifático), lisina (un AA grande, positivamente cargado), triptofano (un AA grande, aromático) y leucina (un AA grande, no polar, alifático).

En la hGH, la glicina homologa se encuentra en la posición 120. La sustitución de arginina o triptofano resultó en un antagonista, no obstante, la hGH G120A retuvo la actividad promotora del crecimiento. Consecuentemente, actualmente se cree que si se desea una actividad antagonista, esta glicina, la cual está conservada en todas las GH de vertebrados, se puede reemplazar por cualquier aminoácido diferente a la alanina (el segundo aminoácido más pequeño), y más preferiblemente por cualquier aminoácido el cual es al menos tan grande como la prolina (el aminoácido de reemplazo más pequeño que se sabe que resulta en un fenotipo de animal "pequeño"). La modificación de la posición 115 se sugiere por la teoría de la "hendidura" de Kopchick et al. El aspartato en la posición 115 se puede reemplazar por un aminoácido más voluminoso, el cual no destruye la hélice alfa. Preferiblemente, el aminoácido de reemplazo tiene un tamaño mayor que aquel del aspartato. Los aminoácidos histidina, metionipa, isoleucina, leucina, lisina, arginina, fenilalanina, tirosina, y triptofano son sustancialmente más grandes que el aspartato. De estos, His, Met, Leu, y Trp se prefieren más debido a que combinan las ventajas del volumen con una propensión razonablemente fuerte hacia la hélice alfa. No obstante, se debe mencionar que la Glu es el aminoácido que forma de manera más evidente la hélice alfa en comparación con todos los aminoácidos. El mutante D115A de la bGH no es un antagonista de la GH, pero la alanina es menor que el ácido aspártico, de manera que esto no es probatorio del valor de reemplazo de Asp115 con un aminoácido más voluminoso. Es posible seleccionar de manera sistemática el efecto de todas las posibles sustituciones de aminoácidos en la posición que corresponde a la bGH 119 sola, o también en las posiciones que corresponden a bGH 115 y/o 119. Es posible que G119A llevará a un fenotipo "pequeño" si se acopla con otras mutaciones, por ejemplo, en 115 y 122. Por lo tanto, uno podría seleccionar una genoteca combinatorial en la cual todos los miembros de la genoteca contienen la mutación G119A, y todas las posiciones 115 y 122 varían a través de todos los 20 aminoácidos posibles. Este método se puede extender, si se desea, a otras posiciones de aminoácidos en la tercera hélice alfa. Los aminoácidos que se prefieren particularmente para la selección son los seis aminoácidos espacialmente más cercanos a la Gly119 de la bGH, es decir, Alai 22, Leu123, Ile120, Leu116, Asp115 y Glu118. La selección para los efectos de todas las mutaciones de la posición 119 y estas seis posiciones proximales podrían requerir una genoteca con 207 miembros. Si no se puede preparar dicha genoteca, uno podría preparar 19 genotecas separadas, cada una caracterizada por una mutación de fondo bGHG119X particular, y mutación al azar de las seis posiciones proximales (para 206 miembros diferentes de la genoteca por genoteca). Además de la mutación en la posición que corresponde a bGH 119, la cual se considera necesaria para impartir la actividad inhibidora del crecimiento deseada, son posibles mutaciones adicionales las cuales llevarán a una actividad inhibidora del crecimiento o a otra actividad antagonista intacta. Estas mutaciones pueden tomar la forma de sustituciones, deleciones, o inserciones particulares o múltiples, en las regiones no esenciales del polipéptido. Por ejemplo, es posible alterar otro aminoácido en la hélice alfa si la sustitución no destruye la hélice alfa. Preferiblemente, dichas alteraciones reemplazan un aminoácido con uno de tamaño y polaridad similar. Puede ser ventajoso modificar los aminoácidos que flanquean el sitio de mutación primario 119 con el objeto de incrementar la propensión hacia la formación de la hélice alfa de la secuencia, particularmente si la mutación en 119 es una que se espera que desestabilice a la hélice. La actividad antagonista de la GH se manifestó, no solamente en estos mutantes con sustitución particular, sino también en los mutantes con sustitución múltiple. El primero de éstos que se estudió por Kopchick et al. fue el mutante bGH E117L/G119R/A122D, el cual inhibió el crecimiento en los ratones transgénicos. La secreción por la célula L de ratón de la proteína mutante se observó en el caso de los mutantes de la bGH E117/G119R, E111 L/G119W, E111 L/G119W/L121 R/M124K, E111 L/G119W/R125L, y E111L/G119W/L121 R/M124K.

Mutantes B2024 y B2036 GHA En vista del análisis mutacional precedente, se seleccionaron dos mutantes de la hGH para atención especial. El mutante B2024 se caracteriza por las mutaciones H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, G120K, K168A, y E174A. El mutante B2036 se caracteriza por las mutaciones H18D, H21 N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, y 1179T. En ambos casos, la mutación en negritas imparte actividad antagonista y las otras mutaciones mejoran la unión del "sitio 1" con respecto al receptor de la hGH. Véase el documento WO 97/11178. El mutante B036 se puede comparar con el mutante agonista 852d GH previamente descrito. La mutación R64K de' 852d se omitió para proteger los residuos de unión al sitio 1 de la PEGilación. De manera similar, las mutaciones K168A y K172R se añadieron a B2036 para reducir el número de sitios de PEGilación en el sitio 1. Algunas de las mutaciones de 852d se omitieron de B2036 debido a que éstas confieren solamente mejorías modestas a la afinidad, y se consideró que su omisión probablemente reduce la antigenicidad en humanos. El mutante B2024 apoya este tema adicionalmente, omitiendo las mutaciones adicionales. Ambos B2036 y B2024 se podrían convertir hacia agonistas mediante la reversión de la mutación G120. En un ensayo basado en célula de la actividad antagonista, B2036 no PEGilado tuvo una IC50 de 0.19 ug/ml, mientras que la IC50 para una forma PEGilada (PEG-4/5-B2036) de B2036 fue de 13.1 ug/ml. Posteriormente, se mostró que otra forma PEGilada, PEG (20,000)-B2036, tuvo una IC50 de 0.25 ug/ml. Véase el documento WO 97/11178 en p. 135. Se ha mostrado que ambas formas PEGiladas y no PEGiladas de B2036 reducen los niveles de IGF-1 en monos rhesus. El documento WO 97/11178 en p. 136. (Véase, generalmente, Ross et al., JCE, 2001 , vol 86, páginas 1716-1723, para su discusión de las hormonas de crecimiento PEGiladas y su unión.) Agonistas y antagonistas de la GH químicamente modificados (incluyendo PEGilados) Con el objeto de reducir la inmunogenicidad y/o de incrementar la vida media, un poliol se puede conjugar con un agonista o antagonista de la GH en uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo, lisina(s). Véase el documento WO 93/00109. Los polioles adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos sustituidos en una o más posiciones del hidroxilo con un grupo químico, tales como un grupo alquilo que tiene entre uno y cuatro átomos de carbono. Típicamente, el poliol es un poli(alquilen)glicol, tal como poli(etilen)glicol (PEG). Los procesos de conjugación del PEG al hGH (o un mutante de la hGH) se denominan PEGilación, pero el proceso también se aplica a la conjugación de otros polioles. Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de 500 a 30,000 daltones, con un peso molecular promedio de 5,000 daltones siendo especialmente preferido. Preferiblemente, el proceso es tal que se conjugan de dos a siete, más preferiblemente de cuatro a seis, moléculas de PEG a cada molécula de la hGH (o mutante). La composición final puede ser homogénea, por ejemplo, todas las moléculas contienen el mismo número de PEGs en los mismos sitios de PEGilación, o en sitios heterogéneos, por ejemplo, el número de PEGs o los sitios de unión de los PEGs varían de conjugado a conjugado. Preferiblemente, las condiciones de reacción son tales que la conjugación no destruye la actividad de unión al sitio 1. También, si se va a utilizar el conjugado como un agonista de la GH, la conjugación no debe destruir la actividad de unión del sitio 2. Véase generalmente el documento WO 97/11178. Nótese que la mutación G120K anteriormente contemplada provee un sitio de PEGilación adicional.

Mutantes de prolactina Basándose en la serie de datos anteriormente establecidos, Cunningham, et al., Science, 247: 1461 (Marzo 11 , 1990) designaron un octamutante de prolactina de humano, el cual se une a la hGHbp (Kd de 2.1 nM) más de 10,000 veces más fuertemente en comparación con la prolactina de humano de tipo silvestre (Kd > 40,000). Este octamutante de hPRL se une a la hGHbp en aproximadamente una sexta parte tan fuertemente como la hGH de tipo silvestre (Kd de 0.34 nM), incluso tuvo solamente 26% de identidad de secuencia general con respecto a la hGH. El octamutante se caracterizó mediante las mutaciones (numeración de la hGH, alineamiento de hGH:hPRL de Cunningham) H171 D, N175T, Y176F, K178R, E174A, E62S, D63N, y Q66E. La mutación adicional L1791 no alteró la afinidad. El documento WO 90/04788 sugiere la posibilidad de mejorar la unión adicionalmente con las mutaciones V14M y H185V, véase P. 113.

Estudios mutacionales inspirados por la comparación de hGH y hPL Dentro de las tres regiones (residuos de la hGH 4-14, 54-74, 171-185) las cuales fueron identificadas por la mutagénesis para selección de Ala como constituyentes del epítope para la unión al hGHr de la hGH, el hPL difiere solamente en siete posiciones a partir de la hGH, como sigue: P2Q, I4V, N12H, R16Q, E56D, R64M, e I179M, en donde, por ejemplo, "P2Q" significa que la prolina en la posición 2 de la hGH se reemplaza con Q en el AA correspondiente del hPL alineado. Todas estas siete posiciones fueron seleccionadas para Ala en la hGH, y cuatro de las sustituciones de Ala (14A, E56A, R64A, e I179A) resultaron en una reducción de dos veces o más en la afinidad de unión. El mutante para sustitución particular de la hGH I179M redujo la afinidad de la hGH solamente en 1.7 veces (en comparación con 2.7 veces para I179A). Ambas mutaciones R64A y R64M ocasionaron reducciones de 20 veces en la afinidad. El mutante doble de la hGH E56D/R64M evidencia una reducción total en la afinidad de 30 veces.

Mutantes del lactógeno placental El hPL de tipo silvestre se une a la hGHbp (S201C) con una afinidad (KD) de 1800 nM, mientras que la hGH de tipo silvestre se une al mismo blanco con una afinidad de 1.4 nM. El hPL mutante (0274), caracterizado por las mutaciones 10Y, 14E, 18R, 21 G, se une a la hGHbp (S201C) con una afinidad de 1.1 nM, por ejemplo, superior a aquella hGH de tipo silvestre. Véase el documento WO 97/11178, el cuadro 9 en la p. 101. El documento WO 90/04788 p. 116 menciona que el mutante doble D56E, M64R en el hPL mejora sustancialmente su actividad de unión para el receptor de la hGH, y también sugiere las modifícaciones adicionales M179I y V4I. La variante G120R del hPL inhibe el crecimiento estimulado por la hGH en las células FDC-P1 transfectadas con el receptor del hPRL. La IC50 para G120R-hPL es aproximadamente 8 veces mayor que para G120R-hGH. Véase Fuh & Wells, J. Biol. Chem., 270: 13133 (1995). Más allá de la superfamilia de las proteínas de la hormona de crecimiento, se contemplan específicamente las variantes de todos los péptidos/polipéptidos/proteínas mencionadas de la presente intención. Por lo tanto, cualquiera de los aminoácidos en cualquier posición se puede modificar mediante deleción/inserción/mutación. Estas variaciones se pueden realizar además de, o como parte del, motivo de glicosilación. Para la administración/emulsificación del fármaco: Las proteínas pequeñas hidrófobas o amfipáticas se marcan con el motivo deseado para elaborar emulsificantes del fármaco. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a, albúmina de suero de humano, incluyendo sus dominios individuales. Por supuesto, la hSA se puede elaborar con glicomódulos de conformidad con la invención, para cualquier propósito o uso, no solamente para administración/emulsificación del fármaco.

Se contemplan específicamente las siguientes proteínas modificadas: 1 ) la hormona de crecimiento de humano modificada en el extremo C o N con (Ser-Hyp)n en donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 10; 2) prolactina de humano modificada en el extremo C o N con (Ser-Hyp)n en donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 10; 3) lactógeno placental de humano, modificado en el extremo C o N con (Ser-Hyp)n en donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 10; 4) interferón-2-alfa, modificado en el extremo C o N con (Ser-Hyp)n en donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 10; y 5) insulina, modificada en el extremo C o N con (Ser-Hyp)n en donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 10. En algunas modalidades, las "inserciones" N terminales se encuentran en el extremo N terminal de la forma madura o en circulación de las diversas hormonas. Esta ubicación puede ser deseable para hormonas proteicas que se encuentran en el torrente sanguíneo, las cuales se generan por medio de. un péptido para secreción amino terminal es decir se escinden durante el proceso de secreción. Además de las proteínas específicas anteriormente establecidas, también se pueden expresar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y anticuerpos monoclonales humanizados, de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, los anficuerpos glicosilados a la hormona de crecimiento o al receptor de la hormona de crecimiento se pueden elaborar de conformidad con la presente invención.

Expresión en plantas Los genes recombinantes se expresan en células vegetales, tales como células cultivadas en suspensión celular, incluyendo pero limitadas a, células de tabaco BY2. La expresión también se- puede lograr en un intervalo de hospederos vegetales intactos, y en otros organismos incluyendo pero limitados a, invertebrados, plantas, esponjas, bacterias, hongos, algas, arqueobacterias.

En algunas modalidades, la construcción/plásmido/ADN recombinante de expresión comprende un promotor. No se pretende que la presente invención se limite a un promotor particular. Se contempla cualquier secuencia del promotor la cual es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico operativamente asociada que codifica al menos una porción de ácido nucleicos de la presente invención, para que encuentre dentro del alcance de la invención. Los promotores incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras de orígenes bacterianos, virales y vegetales. Los promotores de origen bacteriano incluyen, pero no se limitan a, promotor de la octopin sintasa, promotor de la opalin sintasa, y otros promotores derivados a partir de plásmidos Ti nativos. Los promotores virales incluyen, pero no se limitan a, promotores del ARN 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), y promotores del T-ADN a partir de Agrobacterium. Los promotores vegetales incluyen, pero no se limitan a, promotor de la subunidad pequeña de la ribuIosa-1 ,3-bisfosfato carboxilasa, promotores de la ubiquitina del maíz, promotor de la faseolina, promotor de E8, y promotor de Tob7. La invención no se limita al número de promotores utilizados para controlar la expresión de una secuencia de ácidos nucleico de interés. Se puede utilizar cualquier número de promotores siempre y cuando la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de interés se controle de manera deseada. Además, la selección de un promotor se puede dirigir por el deseo de que la expresión se lleve a cabo en toda la planta, o se localice en tejidos seleccionados de la planta, por ejemplo, raíz, hojas, fruta, etc. Por ejemplo, se conocen los promotores activos en flores (Benfy et al. (1990) Plant Cell 2: 849-856). La transformación de las células vegetales se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos, los ejemplos de los cuales se conocen en la técnica, e incluyen por ejemplo, transferencia del gen mediada por partícula (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,584,807 incorporada en la presente invención como referencia); la infección con una cepa de Agrobacterium que contiene el ADN externo - para integración al azar (Patente de E.U.A. No. 4,940,838 incorporada en la presente invención como referencia) o integración dirigida (Patente de E.U.A. No. 5,501 ,967 incorporada en la presente invención como referencia) del ADN externo dentro del genoma de la célula vegetal; electroinyección (Nan et al. (1995) En "Biotechnology in Agriculture and Forestry", Ed. Y. P. S. Bajaj, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Vol 34: 145-155; Griesbach (1992) HortScience 27: 620); fusión con liposomas, lisosomas, células, minicélulas, u otros cuerpos con superficie de lípidos que se pueden fundir (Fraley et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1859-1863; polietilenglicol (Krens et al. (1982) Nature 296: 72-74); químicos que incrementan la toma de ADN libre; transformación utilizando virus, y los similares. Los términos "infectando" e "infección" con una bacteria se refieren a la co-incubación de una muestra biológica blanco, (por ejemplo, célula, tejido, etc.) con una bacteria bajo condiciones de tal manera que las secuencias de ácidos nucleicos contenidas dentro de la bacteria se introducen dentro de una o más células de la muestra biológica blanco. El término "Agrobacterium" se refiere a una bacteria fitopatogénica en forma de rodillo, Gram-negativa, que tiene su origen en el suelo, la cual ocasiona la agalla corona. El término "Agrobacterium" incluye, pero no se limita a, las cepas de Agrobacterium tumefaciens, (las cuales típicamente ocasionan la agalla corona en las plantas infectadas), y Agrobacterium rhizogenes (las cuales ocasionan la enfermedad de raíz velluda en plantas hospederas infectadas). La infección de una célula vegetal con Agrobacterium generalmente resulta en la producción de opinas (por ejemplo, opalina, agropina, octopina, etc.) por la célula infectada. Por lo tanto, las cepas de Agrobacterium las cuales ocasionan la producción de la opalina (por ejemplo, cepa LBA4301 , C58, A208) se refieren como Agrobacteria "tipo nopalina"; las cepas de Agrobacterium las cuales ocasionan la producción de la octopina (por ejemplo, cepa LBA4404, Ach5, B6) se refieren como Agrobacteria "tipo octopina"; y las cepas de Agrobacterium las cuales ocasionan la producción de agropina (por ejemplo, cepa EHA105, EHA101 , A281 ) se refieren como Agrobacteria "tipo agropina". Los términos "bombardeando", "bombardeo", y "bombardeo biolístico" se refieren al proceso de aceleración de partículas hacia una muestra biológica blanco (por ejemplo, célula, tejido, etc.) para producir heridas en la membrana celular de una célula en la muestra biológica blanco y/o la entrada de partículas dentro de la muestra biológica blanco. Los métodos para el bombardeo biolístico se conocen en la técnica (por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,584,807, los contenidos de la cual se incorporan en la presente invención como referencia), y están comercialmente disponibles (por ejemplo, el acelerador de microproyectiles dirigidos por gas helio (PDS-1000/He) (BioRad). El término "formación de microheridas" cuando se hace en referencia al tejido vegetal se refiere a la introducción de heridas microscópicas en ese tejido. La microcicatrización se puede lograr mediante, por ejemplo, bombardeo de partículas, o bombardeo biolístico. Las células vegetales también se pueden transformar de conformidad con la presente invención a través de cloroplasto genéticamente diseñado, un procedimiento es como se describe en la técnica. Los métodos para el diseño genético del cloroplasto se pueden llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 6,680,426, y en las Solicitudes de E.U.A. Publicadas Nos. 2003/0009783, 2003/0204864, 2003/0041353, 2002/0174453, 2002/0162135, los contenidos totales de cada una de las cuales se incorporan en la presente invención como referencias. Se contempla una variedad de células hospederas para uso en esta invención, incluyendo células eucariontes y procariontes. No se pretende que la presente invención se limite por las células hospederas utilizadas para la expresión de los genes sintéticos de la presente invención. Generalmente, la presente invención se contempla en plantas. Como se utiliza en la presente invención, "plantas" comprende cualquier organismo es decir fotoautotrófico, el cual incluye a las algas verde-azules. También se contemplan específicamente las algas verdes, rojas, y de color café. Las plantas que se pueden utilizar como células hospederas incluyen plantas vasculares y no vasculares. Las plantas no vasculares incluyen, pero no se limitan a, Briofitas, las cuales incluyen adicionalmente pero no se limitan a, musgos (Briofita), hepáticas (Hepaticofita), y ceratófilos (Antocerotofita). Las plantas vasculares incluyen, pero no se limitan a, plantas vasculares inferiores (por ejemplo, que dispersan esporas), tales como, Licofita (licopodio), incluyendo Lycopodiae, Selaginellae, e Isoetae, colas de caballo o equiseto (Esfenofita), heléchos en cepillo (Psilotofita), y heléchos (Pterofita). Las plantas vasculares incluyen, pero no se limitan a, i) heléchos fósiles formadores de semilla (Pteridofita), ii) gimnospermas (semilla no protegida mediante un fruto), tales como Cicadofita (Cicadas), Coniferofita (Coniferas, tales como pino, abeto, pino, cicuta, tejo), Ginkgofita (por ejemplo, Ginkgo), Gnetofita (por ejemplo, Gnetum, Ephedra, y Welwitschia), y iii) angiospermas (semillas protegidas mediante un fruto de plantas que florecen), la cual incluye a la Antofita, que comprende adicionalmente dicotiledóneas (dicotiledóneas) y monocotiledóneas (monocotiledóneas). Las células hospederas vegetales específicas que se pueden utilizar de conformidad con la invención incluyen, pero no se limitan a, legumbres (por ejemplo, frijol de soya) y plantas solanáceas (por ejemplo, tabaco, tomate, etc.). Otras células que se contempla que se encuentran dentro del alcance de esta invención son las algas verdes tipos, Clamidomonas, Volvox, y lenteja de agua (Lemna). La presente invención no se limita por la naturaleza de las células vegetales. Se contemplan todas las fuentes de tejidos vegetales. En una modalidad, el tejido vegetal que se selecciona como un blanco para la transformación con vectores que son capaces de expresar las secuencias de la invención son capaces de regenerar una planta. El término "regeneración" como se utiliza en la presente invención, significa el crecimiento de una planta completa a partir de una célula vegetal, un grupo de células vegetales, una parte vegetal o una pieza de una planta (por ejemplo, a partir de semilla, un protoplasto, callo, cuerpo semejante a protobulbo, o parte vegetal). Dichos tejidos incluyen pero no se limitan a semillas. Semillas de plantas que florecen que consisten de un embrión, un revestimiento de semilla, y alimento almacenado. Cuando el embrión se forma completamente, generalmente consiste de un eje hipocotiledón-raíz que confiene ya sea uno o dos cotiledones y un meristemo apical en el ápice del vastago y en el ápice de la raíz. Los cotiledones de la mayoría de las dicotiledóneas son carnosos y contienen el alimento almacenado de la semilla. En otras dicotiledóneas y la mayoría de las monocotiledóneas, el alimento se almacena en el endospermo y los cotiledones funcionan absorbiendo los compuestos más simples que resultan a partir de la digestión del alimento. Las especies a partir de los siguientes ejemplos de géneros de plantas se pueden regenerar a partir de protoplastos transformados: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapi, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura. Para la regeneración de las plantas transgénicas a partir de los protoplastos transgénicos, se provee inicialmente una suspensión de protoplastos transformados o una placa de Petri que contiene explantes transformados. En tejido del callo se forma y los vastagos se pueden inducir a partir de los callos y subsecuentemente se produce la formación de raíces. Alternativamente, la formación del embrión somático se puede inducir en el tejido del callo. Estos embriones somáticos germinan como los embriones naturales para formar plantas. El medio de cultivo generalmente contendrá diversos aminoácidos y hormonas vegetales, tales como auxina y citoquininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para dichas especies tales como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Estas tres variables se pueden controlar empíricamente para resultar en una regeneración reproducible. Las plantas también se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados. Las plantas dicotiledóneas las cuales se ha mostrado que son capaces de regenerarse a partir de células individuales transformadas para obtener plantas transgénicas completas incluyen, por ejemplo, manzana (Malus pumila), zarzamora (Rubus), híbrido de zarzamora/frambuesa (Rubus), frambuesa roja (Rubus), zanahoria (Daucus carota), coliflor (Brassica olerácea), apio (Apium graveolens), pepino (Cucumis sativus), berenjena (Solanum melongena), lechuga (Lactuca sativa), patata (Solanum tuberosum), colza (Brassica napus), frijol de soya de tipo silvestre (Glycine canescens), fresa (Fragaria xananassa), tomate (Lycopersicon esculentum), nogal (Juglans regia), melón (Cucumis meló), uva (Vitis vinifera), y mango (Mangifera indica). Las plantas monocotiledóneas las cuales se ha mostrado que son capaces de llevar a cabo regeneración a partir de células individuales transformadas para obtener plantas transgénicas completas incluyen, por ejemplo, arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), y maíz. Además, la regeneración de las plantas totales a partir de las células (no necesariamente transformadas) también se observa en: chabacano (Prunus armeniaca), espárrago (Asparagus officinalis), banana (hybrid Musa), frijol (Phaseolus vulgaris), cereza (híbrido de Prunus), uva (Vitis vinifera), mango (Mangifera indica), melón (Cucumis meló), ocra (Abelmoschus esculentus), cebolla (híbrido de Allium), naranja (Citrus sinensis), papaya (Carrica papaya), melocotón (Prunus pérsica), ciruela (Prunus domestica), pera (Pyrus communis), piña (Ananas comosus), sandía (Citrullus vulgaris), y trigo (Triticum aestivum).

Las plantas regeneradas se transfieren a condiciones estándar en suelo y se cultivan de manera convencional. Después de que el vector de expresión se incorpora de manera estable dentro de las plantas transgénicas regeneradas, éste puede ser transferido a otras plantas mediante propagación vegetativa o mediante cruza sexual. Por ejemplo, en las cosechas que se propagan de manera vegetativa, las plantas transgénicas maduras se propagan mediante la toma de esquejes o mediante técnicas de cultivo de tejidos para producir múltiples plantas idénticas. En las cosechas propagadas mediante semilla, las plantas transgénicas maduras se auto-cruzan para producir una planta homocigota endogámica la cual es capaz de pasar el transgén a su progenie mediante heredabilidad Mendeliana. La planta endogámica produce semillas que contienen la secuencia de ácidos nucleicos de interés. Estas semillas se pueden crecer para producir plantas que podrían producir los polipéptidos deseados. Las plantas endogámicas también se pueden utilizar para desarrollar nuevos híbridos mediante la cruza de la planta endogámica con otra planta endogámica para producir un híbrido. No se pretende que la presente invención se limite a solamente ciertos tipos de plantas. Se contemplan tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las monocotiledóneas incluyen céspedes, lilas, lirios, orquídeas, espadañas, palmas, Zea mays (tales como maíz), arroz, cebada, trigo y todos los céspedes. Las plantas dicotiledóneas incluyen casi todas las familias de árboles y arbustos (diferentes a las coniferas) y muchas de las hierbas (plantas no leñosas).

Los cultivos de tomate son un ejemplo de un recipiente para módulos HRGP repetitivos que son hidroxilados y glicosilados. Los cultivos producen HRGPs de superficie celular en altos rendimientos fácilmente eluídas a partir de la superficie celular de las células intactas y poseen las enzimas requeridas para modificaciones post-traduccionales únicas a las HRGP prolil hidroxilasas, hidroxiprolina O-glicosiltransferasas y otras glicosiltransferasas específicas de plantas para la construcción del complejo de cadenas laterales de polisacárido. Otros recipientes para las secuencias de la invención incluyen, pero no se limitan a, células y plantas cultivadas del tabaco, por ejemplo, BY 2 de tabaco (amarillo brillante 2). Brevemente, la presente estrategia de expresión se puede utilizar en plantas, tales" como monocotiledóneas y dicotiledóneas intactas, gimnospermas, heléchos, briofitos, cultivos en suspensión celular, y algas, etc., para expresar proteínas a partir de diversos organismos, tales como humanos y otros mamíferos y/o vertebrados, invertebrados, plantas, esponjas, bacterias, hongos, algas, arqueobacterias, potencialmente en cualquier organismo en este planeta.

Utilidades Dependiendo del péptido/polipéptido/proteína particular expresado, se contempla una variedad de utilidades para el producto. Si el producto expresado incluye proteína fluorescente verde, por ejemplo, el producto o células que contienen el producto se pueden utilizar en ensayos fluorescentes de selección. Sí el producto es biológicamente activo, por ejemplo, el producto expresado se puede utilizar como un antagonista o agonista del receptor, y se puede utilizar in vitro e ¡n vivo. Las utilidades in vitro incluyen, por ejemplo, el uso de ensayos de selección. Las utilidades in vivo incluyen, pero no se limitan a, el uso de los compuestos para el tratamiento de humanos u otros animales, basándose en las actividades agonistas o antagonistas. El término "tratamiento" como se utiliza en la presente invención con referencia a una enfermedad se utiliza ampliamente y no se limita a un método de curación de la enfermedad. El término "tratamiento" incluye cualquier método que sirve para reducir uno o más de los efectos patológicos o síntomas de una enfermedad o para reducir la velocidad de progresión de uno o más de dichos efectos patológicos o síntomas. Aunque el espacio limita la descripción de todas las utilidades para todos los péptidos/polipéptidos/proteínas que se pueden elaborar de conformidad con esta invención, los ejemplos se describirán específicamente con referencia a la hormona de crecimiento. La administración de la hormona de crecimiento descrita en la presente invención se puede utilizar para: el tratamiento de humanos u otros animales deficientes en la hormona de crecimiento, incluyendo perros, gatos, cerdos, vacas, caballos; reducción de los efectos laterales catabólicos de los glucocorticoides; tratamiento de la osteoporosis; estimulación del sistema inmune; aceleración de la cicatrización de heridas; aceleración de la reparación de fracturas óseas; tratamiento para el retraso de crecimiento; tratamiento para la insuficiencia cardiaca congestiva; tratamiento para la falla o insuficiencia renal aguda o crónica; tratamiento para la estatura corta fisiológica, incluyendo niños deficientes en la hormona de crecimiento; tratamiento de la estatura corta asociada con enfermedad crónica; tratamiento de la complicidad; tratamiento del retraso de crecimiento asociado con el síndrome de Prader-Willi y el síndrome de Turner; tratamiento del síndrome metabólico (también conocido como síndrome X); aceleración de la recuperación y reducción de la hospitalización de pacientes con quemaduras o después de una cirugía mayor; tratamiento del retraso del crecimiento intrauterino, displasia esqueletal, hipercortisonismo y síndrome de Cushíng; reemplazo de la hormona de crecimiento en pacientes estresados; tratamiento de las osteocondrodisplasias, síndrome de Noonans, trastornos del sueño, enfermedad de Alzheimer, retraso de la cicatrización de heridas, y deprivación psicosocial; tratamiento de la disfunción pulmonar y dependencia del ventilador; atenuación de la respuesta de la proteína catabólica después de una operación principal; tratamiento de los síndromes de mala absorción, reducción de la caquexia y pérdida de proteína debido a enfermedad crónica tales como cáncer o SIDA; aceleración de la ganancia de peso y acrementación de proteína en pacientes con una nutrición parenteral total; tratamiento de hiperinsulinemia incluyendo nesidioblastosis; tratamiento adyuvante para la inducción de la ovulación y para prevenir y tratar las úlceras gástricas y duodenales; estimulación del desarrollo tímico y prevención de la declinación r de la función tímica relacionada con la edad; terapia adjunta para pacientes que se someten a hemodiálisis crónica; tratamiento de pacientes inmunosuprimidos y mejoría de la respuesta del antibiótico después de la vacunación; mejoría de la fuerza muscular, incremento de la masa muscular, movilidad, mantenimiento del grosor de la piel, homeostasis metabólica, homeostasis renal en la persona de edad avanzada, débil; estimulación de los osteoblastos, remodelamiento del hueso, y crecimiento del cartílago; tratamiento de enfermedades neurológicas tales como neuropatía periférica y neuropatía inducida por fármaco, síndrome de Guillian-Barre, esclerosis amiotrófica lateral, esclerosis múltiple, accidentes cerebrovascuiares y enfermedades desmielinizantes; y estimulación del crecimiento de la lana en las ovejas. En animales de granja, la hormona de crecimiento se puede utilizar para incrementar la producción de carne en, por ejemplo, pollos, pavos, ovejas, cerdos, y ganado; la estimulación del crecimiento de pre- y post-natal, mejoría de la eficiencia de alimentación en animales criados para producción de carne, mejoría de la calidad de la res o ave muerta (incremento en la relación músculo a grasa); incremento en la producción de leche en ganado lechero o en otras especies de mamíferos; mejoría de la composición corporal; modificación de otras funciones metabólicas e inmunológicas dependientes de la GH tales como mejoría de la respuesta del anticuerpo después de la vacunación o procesos de desarrollo mejorados; y crecimiento acelerado y mejoría de la relación proteína-a-grasa en peces.

En los animales de compañía, el uso de la hormona de crecimiento incluye la estimulación del desarrollo tímico y la prevención de la declinación en la función tímica relacionada con la edad; prevención de la declinación en la cognición relacionada con la edad; aceleración de la cicatrización de heridas; aceleración de la reparación de fracturas óseas; estimulación de los osteoblastos, remodelamiento óseo y crecimiento del cartílago; atenuación de la respuesta catabólica de la proteína después de cirugía mayor, aceleración de la recuperación a partir de lesiones por quemadura y cirugías mayores tal como cirugía gastrointestinal; estimulación del sistema inmune y mejoría de la respuesta del anticuerpo después de la vacunación; tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, tratamiento de la falla renal o insuficiencia aguda o crónica, tratamiento de la obesidad; tratamiento del retraso en el crecimiento, displasia esqueletal y osteocondrodisplasias; prevención de los efectos laterales catabólicos de los glucocorticoides; tratamiento del síndrome de Cushing; tratamiento de los síndromes de mala absorción, reducción de la caquexia y pérdida de proteína debido a enfermedad crónica tal como cáncer; aceleración de la ganancia de peso y acrementación de la proteína en animales que reciben nutrición parenteral total; provisión de un tratamiento adyuvante para la inducción de la ovulación y para prevenir úlceras gastrointestinales; mejoría de la masa muscular, fuerza y movilidad; mantenimiento del grosor de la piel, y mejoría de la función de los órganos vitales y de la homeostasis metabólica o en la promoción del crecimiento de animales pequeños hacia animales más grandes. Con respecto a los antagonistas de la hormona de crecimiento descritos en la presente invención, las enfermedades que se pueden tratar se caracterizan por uno o más de los siguientes criterios: niveles elevados en la producción de la hormona de crecimiento, niveles elevados en la producción del receptor de la hormona de crecimiento, y respuesta celular elevada de los receptores a la hormona de crecimiento. El término "elevado" como se utiliza en la presente invención se ufiliza con respecto a los niveles normales de producción de la hormona de crecimiento, la producción del receptor de la hormona de crecimiento, o la respuesta celular mediada por la hormona de crecimiento en un tejido (o tejidos) de una persona enferma (o animal) en comparación con el nivel en un individuo normal. Las enfermedades que se pueden tratar con antagonistas de la hormona de crecimiento mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, acromegalia, gigantismo, cáncer, diabetes, enfermedades vasculares del ojo (retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía de anemia por célula falciforme, etc.) así como la nefropatía y glomeruloesclerosis y en individuos críticamente enfermos en la unidad de cuidados intensivos de un hospital. Los cánceres que se pueden tratar mediante la invención incluyen, pero no se limitan a, cánceres que comprenden células tumorales que expresan los receptores de la hormona de crecimiento. Los cánceres que se pueden tratar mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a: de corazón: sarcoma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma; de pulmón: carcinoma broncogénico (de célula escamosa, de célula pequeña no diferenciada, de célula grande no diferenciada, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; gastrointestinal: de esófago (carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), de estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), de páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), de intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), de intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velludo, hamartoma, leiomioma); del tracto genitourinario: de riñon (adenocarcinoma, tumor de Wilm (nefroblastoma), linfoma, leucemia), de vejiga y uretra (carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula transicional, adenocarcinoma), de próstata (adenocarcinoma, sarcoma), de testículos (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de célula intersticial, fibroma, f?broadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); de hígado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; de hueso: sarcoma osteogénico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de célula del retículo), mieloma múltiple, tumor de célula gigante maligna, cordoma, osteocondroma (exostosis osteocartilaginosas), condroma benigno, condroblastoma, coridromixofibroma, osteoma osteoide y tumores de célula gigante; del sistema nervioso: cráneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteítis deformans), de las meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), del cerebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), de médula espinal (neurofibroma, meningioma, glioma, sarcoma); ginecológicos: de útero (carcinoma endometrial), de cérvix (carcinoma cervical, displasia cervical pre-tumoral), de ovarios (carcinoma ovárico [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, tumores endometrioides, celioblastoma, carcinoma de célula clara, carcinoma no clasificado], tumores de la célula de la granu losa-teca, tumores de la célula de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), de la vulva (carcinoma de célula escamosa, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), de la vagina (carcinoma de célula clara, carcinoma de célula escamosa, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrionario), de las trompas de Falopio (carcinoma); hematológicos: de la sangre (leucemia mieloide (aguda y crónica), leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplástico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin [linfoma maligno]; de la piel: melanoma maligno, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, sarcoma de Kaposi, molas, nervios displásticos, lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides, psoriasis; y de glándulas adrenales: neuroblastoma. Específicamente se contemplan los usos en los cánceres de mama, de colon, y de próstata, así como las leucemias y linfomas. El agonista o antagonista de la hormona de crecimiento se puede combinar con excipientes farmacéuticos compatibles, no tóxicos y se administra. En el caso de administración a animales no humanos, puede ser preferible incorporar el fármaco dentro del alimento de los animales, posiblemente en una combinación preparada del fármaco y de la materia nutricional lista para su uso por un granjero. La hormona de crecimiento o antagonistas de la hormona de crecimiento se pueden administrar oralmente, rectalmente, transdermalmente, mediante infiltración pulmonar, insuflación, o parenteralmente (incluyendo intravenosamente, subcutáneamente e intramuscularmente) a los humanos, en cualquier forma de dosis farmacéutica adecuada. También se pueden añadir las porciones de polietilenglicol a la hormona de crecimiento o antagonistas de la hormona de crecimiento. En el caso de tratamiento de la retinopatía, ésta se puede administrar directamente sobre o dentro del ojo por medio de una forma farmacéutica ocular convencional. Una dosis efectiva y protocolo de tratamiento se pueden determinar mediante medios convencionales, iniciando con una dosis baja en animales de laboratorio y luego incrementando la dosis a la vez que se monitorean los efectos, y sistemáticamente también variando el régimen de dosis. Generalmente, un punto terminal clínico para la acción de la GH es mediante la medición del nivel del IGF-1 en suero. Conforme la GH va hacia arriba, también lo hace el IGF-1. Conforme la GH va hacia abajo, también lo hace el IGF-1. De manera que en condiciones de deficiencia de la GH, tanto la GH como el IGF-1 son bajos. Cuando uno proporciona GH recombinante a estos individuos, los niveles del IGF-1 se elevarán. El médico tratante intentará mantener el nivel del IGF-1 en intervalos normales ajustados para la edad. Por otra parte, si un individuo tiene demasiada GH, entonces el IGF-1 será elevado. Cuando uno proporciona el antagonista de la GH, los niveles del IGF-1 caerán. El médico tratante tratará de dosificar al paciente de tal manera que el nivel del IGF-1 regresará a los niveles normales, ajustados para la edad. Se pueden tomar en consideración numerosos factores por un médico tratante cuando se determina una dosis óptima para un sujeto dado. Principalmente entre éstos se encuentra la cantidad de la hormona de crecimiento que se secrete normalmente por la pituitaria, la cual es del orden de 0.5 mg/día para adultos humanos sanos. Los factores adicionales incluyen la talla del paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente, la enfermedad particular a ser tratada, la severidad de la enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente, la actividad in vivo del agonista o antagonista, y los similares. Se podrían escoger las dosis de ensayo después de la consideración de los resultados en estudios animales y de la literatura clínica con respecto a la administración de las hormonas de crecimiento, y/o de somatostatina (al inhibidor de la liberación de la hormona de crecimiento). Se apreciará por la persona experta en la técnica que la información tales como las constantes de unión y la Ki derivada a partir de los ensayos de unión por competencia in vitro para la hormona de crecimiento también se pueden utilizar en el cálculo de las dosis. Una dosis típica para humano de un antagonista de la hormona de crecimiento podría ser de aproximadamente 0.1 mg/día a aproximadamente 10 mg/día, o de aproximadamente 0.5 mg/día a aproximadamente 2 mg/día, o de aproximadamente 1 mg/día. Una dosis típica para humano de un agonista de la hormona de crecimiento podría ser de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 80 mg/día, o de aproximadamente 20 mg/día a aproximadamente 40 mg/día, o de aproximadamente 30 mg/día. Como se mencionó anteriormente, la dosis apropiada se puede determinar empíricamente, mediante el monitoreo del nivel del IGF-1. Por ejemplo, uno proporciona suficiente antagonista de la GH para regresar los niveles del IGF-1 hacia los niveles normales. Se debe mencionar que la glicosilación de las proteínas de conformidad con la invención puede incrementar significativamente el peso molecular. La hormona de crecimiento (22 kDa) modificada con (Ser-Hyp) 0, por ejemplo, exhibe un peso molecular mayor de 45 kDa. Por lo tanto, el peso molecular puede ser más del doble aún cuando la actividad permanece siendo la misma. Esto se debe tomar en cuenta cuando se determina la dosis y se debe considerar la equivalencia de la dosis en una base molar.

La invención también provee formulaciones farmacéuticas para el uso en los presentes métodos para el tratamiento de la enfermedad. Las formulaciones pueden comprender al menos una proteína biológicamente activa, tales como, por ejemplo, el agonista o antagonista de la hormona de crecimiento, y pueden incluir un vehículo farmacéuficamente aceptable. Se puede utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua con pH regulado, 0.4% de solución salina, 0.3% de glicina, y los similares. Las formulaciones farmacéuticas también pueden comprender componentes adicionales que sirven para extender la vida de anaquel de las formulaciones farmacéuticas, incluyendo conservadores, estabilizantes de la proteína, y los similares. Las formulaciones preferiblemente están estériles y libres de materia en forma de partículas (para formas inyectables). Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas convencionales de esterilización, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes reguladores del pH, agentes para el ajuste de la toxicidad y los similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. Las formulaciones de la invención se pueden adaptar para diversas formas de administración, incluyendo intramuscularmente, subcutáneamente, intravenosamente, intraocularmente, y los similares. Las presentes formulaciones también se pueden formular de manera que se provean para la liberación sostenida del agonista o antagonista de la hormona de crecimiento. Los detalles adicionales de los métodos para la preparación de composiciones parenteralmente administrables y los ajustes necesarios para la administración a los sujetos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, el cual se incorpora en la presente invención como referencia. Otras utilidades serán evidentes a aquéllos expertos en la técnica a partir de la lectura de esta descripción.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión de los análogos de la glicoproteína de la goma arábiga con células transqénicas de tabaco La glicoproteína de la goma arábiga (GAGP), una proteína arabinogalactano (AGP), es el componente activo de superficie que explica las propiedades de emulsificación de la goma arábiga. Esta GAGP funcional es una HRGP típica que consiste de cuatro porciones carbohidrato incluyendo galactosa, arabinosa, rhamnosa y ácido glucurónico, y una pequeña proporción (-10%, p/p) de proteína rica en Hyp como una parte integral de la estructura (Islam A. M., Philips G. O., Sljivo A., Snowden M. J. y William P. A. (1997), Food Hydrocolloids 11 (4): 493- 505.). La GAGP ya ha sido aislada y bien caracterizada. No obstante, el gen que codifica la GAGP aún no ha sido clonado hasta ahora, ni tampoco se ha podido elucidar el mecanismo preciso por medio del cual la GAGP exhibe capacidad emulsificante y propiedades únicas. Recientemente, se derivó la secuencia de aminoácidos dominante de la estructura base del polipéptido de la GAGP. Esta contiene un motivo consenso repetitivo de 19 residuos SOOO(0/T/S)LSOSOTOTOO(0/L)GPH (0:h¡droxiprolina) (Goodrum L.J., Patel A., Leykam J. F. y Kieliszewski M. J. (2000), Phytochem 54(1): 99-106). Esto provee la posibilidad de expresar análogos de la GAGP en células vegetales transgénicas mediante el uso de la tecnología de gen sintético. Los genes que codifican los siete análogos de la GAGP fueron diseñados y construidos. Estos incluyen tres tipos: a) [Gum]3, [Gum]8 y [Gum]20 son los genes que codifican tres, ocho, y veinte repetidos del motivo consenso de la de GAGP, respectivamente; b) [HP] y [HP]8, los cuales son los genes que codifica cuatro y ocho repetidos del péptido hidrófobo de la GAGP [HP] que también se deriva a partir de la estructura base del péptido GAGP; y c) [Gum]8[HP]2 y [Gum]8[HP] son aquellos de la combinación de [Gum]8 con dos y cuatro repetidos de la [HP]. Estos análogos sintéticos se expresan como proteínas de fusión con proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) en las células de tabaco.

Materiales y métodos Construcción del gen Todo los cassettes del gen construidos para expresar los análogos de la GAGP tienen una estructura "SStob-[gen sintético]-EGFP", en la cual el gen sintético que codifica diversos análogos de la GAGP se inserta entre SStob, el cual codifica la secuencia señal de la extensina a partir del tabaco (De Loóse, M., Gheysen, G., Tire, C, Gielen, J., Villarroel, R., Genetello, C, Van Montagu, M., Depicker, A. e Inze, D. (1991), Gene, 99: 95-100), y el gen para la EGFP. 1) Síntesis del gen [Gum [Gumía y [Guirí El gen [Gum]3 que codifica tres repetidos de SPSPTPTAPPGPHSPPPTL se construyó mediante polimerización cabeza-a-cola de tres series de pares de oligonucleótidos complementarios, parcialmente superpuestos incluyendo el enlazador hacia 5', el repetido GAGP interno y el enlazador hacia 3' como se describe por Shpak et al (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ). Los [Gum]8 y [Gum]2o se diseñaron para codificar 4 y 10 repetidos de GPHSPPPPLSPSPTPSPPL-GPHSPPP"TLSPSPTPTPPP, los cuales se designaron [Gum]2. Este tiene ligeras diferencias en la alternación de los repetidos, por lo tanto se parece de manera más cercana a la GAGP nativa. El gen [Gumk se sintetizó mediante extensión del iniciador a partir de dos oligonucleótidos mutuamente cebados (figura 1a) (Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville, IA). El dúplex se colocó dentro del plásmido pUC18 como un fragmento HindIII/EcoRI. La construcción de cuatro y diez repetidos del gen sintético incluyó la fijación compatible pero no regenerable de los sitios de restricción (Xmal y BsrFI) del fragmento [Gum]2 para generar un número doble de los repetidos (Lewis R. V., Hinman M., Kothakota S. y Fournier M. (1996), Protein Expression Purif 7: 400-406). Mediante la reiteración, dicho fragmento del gen se podría multiplicar geométricamente a cuatro y diez repetidos en longitud. 2) Síntesis del gen ÍHP1Z, ÍHP]4 y GHPIB Los genes [HP]2, [HP] y [HP]8 se diseñaron para codificar dos, cuatro y ocho repetidos de TPLPTLTPLPAPTPPLLPH, designado como [HP]!. [HP]? también se sintetizó mediante extensión del iniciador a partir de dos oligonucleótidos mutuamente cebados (figura 1 b) como se mencionó anteriormente. El dúplex se colocó dentro del plásmido pUC18 como un fragmento HindIII/EcoRI. La construcción de dos ([HP]2), cuatro ([HP]4) y ocho ([HP]8) repetidos del gen sintético incluyó la fijación compatible pero no regenerable de los sitios de restricción (BspEl y Xmal) del fragmento [HP]? como se describió anteriormente. 3) Construcción del plásmido pUC-SStob-rGum1n-EGFP (n= 3, 8. 10} La construcción del plásmido pUC-SStob-[Gum]3-EGFP fue de conformidad con Shpak et al. (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ) (figura 2a). Los genes polimerizados [Gum]8 y [Gum]20 se subclonaron dentro de pUC-SStob-EGFP (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741) como un fragmento BspEI/Agel entre los genes SStob y EGFP para generar el plásmido designado pUC-SStob-[Gum]8-EGFP y pUC-SStob[Gum]20-EGFP (figura 2b). 4) Construcción del plásmido pUC-SStob-rHP1n-EGFP (n= 4, 8) Los genes polimerizados [HP]4 y [HP]8 se suclonaron dentro de pUC-SStob-EGFP (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ) como un fragmento Agel/Ncol entre los genes SStob y EGFP para generar el plásmido designado pUC-SStob-[HP]4-GFP y pUC-SStob-[HP]8-EGFP (figura 3). 5) Construcción del plásmido pUC-SStob-[Gum1g[HP1n-EGFP (n= ^4) Los genes polimerizados [HP]2 y [HP]4 se suclonaron dentro de pUC-SStob-[Gum]8-EGFP como un fragmento Agel/Ncol entre los genes [Gum]8 y EGFP para generar el plásmido designado pUC-SStob-[Gum]8[HP]2-EGFP y pUC-SStob-[Gum]8[HP]4-EGFP (figura 4). La secuenciación de ADN de todas las construcciones de genes anteriormente mencionados se llevó a cabo en el Department of Environmental and Plant Biology, Ohio Universíty.

Construcción del vector para transformación vegetal Toda la construcción "SSto -[gen sintético]-EGFP" se subclonó entonces dentro del vector vegetal pBI121 (Clontech, CA) como un fragmento BamHI/Sacl en lugar del gen reportero para la ß-glucuronidasa para generar los plásmidos pBI-SSíob-[gen sintético]-EGFP. La expresión de estos genes sintéticos estuvo bajo el control del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV).

Transformación y selección de la célula vegetal Se introdujo el plásmido pBI121-SStob-[gen sintético]-EGFP dentro de la cepa de Agrobacterrium tumefáciens LBA4404 mediante el método de congelamiento-descongelamiento (Holsters et al., 1978), luego las células de tabaco cultivadas en suspensión (Nicotiana tabacum, BY2) se transformaron con el Agrobacterium como se describió anteriormente (An, G. (1985), Plant Physiol, 79: 568-570) y se seleccionaron sobre medio sólido Schenk & Hildebrandt (SH) (Schenk y Hildebrandt, 1972) que contenía 0.4 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 200 mg/L de canamicina (Sigma) y 400 mg/L de timentin (SmithKIine Beecham, PA). Se eligieron al menos diez líneas celulares de cada construcción y se transfirieron dentro de medio líquido SH que comprendía los mismos componentes anteriormente mencionados, excepto por la exclusión de timentin. Después de 10 días de cultivo a temperatura ambiente en un agitador giratorio Innova (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) con rotación a 90 rpm, el medio de cultivo de cada línea celular se seleccionó para la expresión de la proteína blanco mediante ia determinación de la intensidad de la fluorescencia verde. Las líneas celulares que producen la intensidad más elevada de fluorescencia verde de cada una de las construcciones se seleccionaron para subcultivos.

Aislamiento de la glicoproteína de fusión análogo de la GAGP-EGFP a partir del medio El medio de cultivo, cosechado después de 12-14 días de cultivo, se concentró aproximadamente 10 veces mediante rotorevaporación debajo de los 30°C. Se cargó una alícuota de 100-200 ml del medio que contenía cloruro de sodio 2 M sobre una columna para cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) (Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow, 16x700 mm, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) equilibrada en cloruro de sodio 2 M, y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio paso a paso a partir de 2 , 1 M hasta agua destilada. La fracción fluorescente verde eluída en agua destilada se agrupó, se concentró mediante congelamiento-descongelamiento, y luego se fraccionó con una columna para cromatografía por permeación en gel Superose-12 (GPC) (16x700 mm, Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada en regulador de pH con fosfato de sodio 200 mM (pH 7). La fracción fluorescente colectada a partir de la columna GPC se purificó adicionalmente con CLAR mediante la inyección dentro de una columna PRP-1 semipreparativa Hamilton (10 µm, 7x305 mm, Hamilton Co., Reno, NV) equilibrada con regulador de pH para inicio A (0.1% de ácido trifluoroacético). Las proteínas se eluyeron con regulador de pH B (0.1 % de ácido trifluoroacético + 80% de acetonitrilo, v/v) con un gradiente lineal de 0-70% de B en 100 minutos a una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto.

Remoción de la EGFP a partir de la glicoproteína de fusión mediante digestión con tripsina Aproximadamente 100 mg de la glicoproteína de fusión se desnaturalizaron mediante calor en agua a ebullición por 2 minutos, se enfriaron, luego se combinaron con un volumen igual de bicarbonato del amonio al 2% (p/v) recientemente preparado que contenía cloruro de calcio 10 mM y 100 µg de tripsina. Después de la incubación durante toda la noche a temperatura ambiente, la muestra se fraccionó con una columna Superose-12 GPC y se purificó adicionalmente con CLAR utilizando el mismo método que se describió anteriormente.

Caracterización de las propiedades de emulsificación Los ensayos de emulsión se llevaron a cabo de conformidad con el método de Pearce y Kinsella (Pearce K. N. y Kinsella J. E. (1978), J Agrie Food Chem 26 (3): 716-723) con algunas modificaciones. Se preparó una emulsificación mediante la sonicación de 0.4 mL de aceite de naranja y 0.6 mL de la solución de la proteína al 0.5% (p/v) (en regulador de pH con fosfato 0.05 M, pH 6.5) en un tubo de vidrio con un desmembrador sónico (Fisher Scientific) equipado con una sonda Microtip®. La amplitud se estableció a 4 y la mezcla de aceite/agua se trató por 60 segundos y se mantuvo sobre hielo todo el tiempo. Una alícuota de 100 µl de la emulsión así obtenida se diluyó de manera serial con solución de SDS (dodeciisulfato de sodio) al 0.1 % para producir una dilución final de 1/1500. La densidad óptica de la dilución 1/1500 se determinó entonces a los 500 nm, la cual se definió como la capacidad emulsificante (EA). La emulsión remanente se almacenó verticalmente en el tubo de vidrio por 2 horas a temperatura ambiente, y luego se midió de nuevo la densidad óptica de la dilución 1/1500. El porcentaje de densidad óptica que permanece después de 2 horas de almacenamiento se define como la estabilidad emulsificante (ES).

Resultados Todos los análogos de la GAGP expresados por las células de tabaco exhibieron una capacidad emulsificante menor en comparación con la GAGP nativa. El orden de la capacidad emulsificante de estos análogos de la GAGP fue [HP]8 > [HP]4 > [Gum]8[HP]4 > [Gum]8[HP]2 > [Gum]20 > [Gum]8 > [Gum]3. No obstante, como se muestra en el cuadro 1 , cuando la EGFP se une a estos análogos sintéticos de la GAGP, todas las proteínas de fusión exhiben una mejor capacidad emulsificante en comparación con la GAGP nativa.

CUADRO 1 Las propiedades de emulsificación de los análogos GAGP recombinantes Construcciones Capacidad Estabilidad emulsificante (EA) emulsíficante (ES) [Gum]3 0 0..003355 0 0 [Gum]8 0 0..005555 0 0 [Gum]20 0 0..114455 7 7..55%% [HPU 0 0..552233 4 444..22%% [HP]8 0 0..558899 5 533..11 %% [Gum]8[HP]2 0 0..118811 1 188..22%% [Gum]8[HP]4 0 0..335566 6 644..55%% [Gum]3-EGFP 1 1..222233 9 944..55%% [Gum]8-EGFP 1 1..003344 9 911..77%% [Gum]20-EGFP 0 0..996688 9 933..44%% [HP]4-EGFP 1 1..444455 8 811..22%% [HP]8-EGFP 1 1..333344 8 833..44%% [Gum]8[HP]2-EGFP 0 0..995544 9 900..88%% [Gum]8[HP]4-EGFP 0 0..993388 9 911..55%% Control GAGP 0.784 93.7% EGFP 0.156 17.9% EJEMPLO 2 Rendimiento incrementado mediante la glicosilación Algunas proteínas transgénicas expresadas en células vegetales generalmente producen rendimientos muy bajos, por lo tanto su expresión en sistemas vegetales es costosa, ineficiente, y poco práctica. La presente invención incluye formas novedosas para incrementar los rendimientos de las proteínas transgénicas producidas en células vegetales mediante la producción de proteínas transgénicas como glicoproteínas de fusión que poseen al menos un glicomódulo de glicoproteína rica en hidroxiprolina (HRGP). Este ejemplo emplea algunas de las técnicas descritas en el ejemplo 1 anteriormente mencionadas para crear proteínas novedosas con glicomódulos. Mediante la inclusión de estos glicomódulos, se incrementa el rendimiento de la proteína expresada en el medio. Brevemente, existen dos tipos generales de glicomódulos: 1 ) glicomódulos de arabinogalactano que comprenden residuos de hidroxiprolina (Hyp) agrupados, no contiguos, en los cuales los residuos Hyp están O-glicosilados con aductos de arabinogalactano (por ejemplo, repetidos Xaa-Hyp-Xaa-Hyp-Xaa-Hyp en donde Xaa es Ser o Ala, pero pueden ser otros aminoácidos semejantes a Thr o Val (o Lys o Gly). Por ejemplo [Ser-Hyp]n o [Ala-Hyp]n); y 2) glicomódulos de arabinosilación que comprenden residuos Hyp contiguos en los cuales algunos o todos los residuos Hyp están arabinosilados con cadenas de arabinooligosacáridos a partir de aproximadamente 1-5 residuos de largo (por ejemplo, módulos Xaa-Hyp-Hyp-Hyp-Hypn, en donde Xaa puede ser Ser o Ala u otros aminoácidos, por ejemplo, [Ser-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp]n o [Ser-Hyp-Hyp]n).

Modificación en el extremo de los genes para expresión: Los transgenes pueden incluir una secuencia señal para secreción a través del sistema endomembranal. Por ejemplo, la secuencia señal de la extensina del tabaco: MASLFATFLWLSLSLAQTTRSA (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ); secuencia señal de la LeAGP-1 del tomate: MDRKFVFLVSILCIWASVTG (Li & Showalter, Li y Showalter, Plant Mol Biol. (1996) noviembre; 32 (4): 641-52; Zhao ZD, Tan L, Showalter AM, Lamport DT, Kieliszewski MJ., Plant J. 2002 agosto; 31 (4): 431-44). 1 ) Construcción del gen Para estos ejemplos, se construyeron los cassettes del gen para que tengan las siguientes estructuras: Secuencia A: Glicomódulo Pro teína señal O Secuencia B: Proteína Glico ?dulo señal Las figuras 5, 6, 7, 8, y 9 muestran, respectivamente, esquemas para la construcción del cassette de los genes para hGH-(SP)10-EGFP, hGH- (SP)-?o, INF-(SP)?o, HSA (albúmina de suero de humano)-(SP)10, y dominiol (dominio I de HSA)-(SP)?o. La figura 10A muestra la construcción genética para la expresión de hGH-(SP)10; la figura 10B muestra cómo se creó la construcción mediante extensión del iniciador. Las figuras 11 , 12 (A y B), 13, y 14, muestran, respectivamente, las construcciones genéticas para la expresión de hGH-(SP)10-EGFP, HSA-(SP)?0) dominiol(de HSA)-(SP)?o, y INF2a (¡nterferón 2a)-(SP)10.

Resumen de los resultados La EGFP se expresó con una secuencia señal N-terminal que dirige la secreción de la EGFP. No obstante, incluso con la secuencia señal unida, la cantidad promedio secretada en el medio fue tan baja que no se pudo cuantificar de manera precisa.

En contraste, cuando se expresó la EGFP como proteínas de fusión de la HRGP de diversos tipos, los rendimientos se incrementaron dramáficamente. Los cuadros 2 y 3 a continuación proporcionan ejemplos de los diferentes tipos de plantas, proteínas, y construcciones que producen un rendimiento incrementado.

CUADRO 2 Eiemplos de rendimiento de las glicoproteínas de fusión purificadas HRGP-EGFP expresadas en las células de tabaco BY2 (se mencionan agüellas que también se expresan en el tomate o en Arabidopsis) Glicoproteína de mg purificados/mi de fusión purificada medio recolectado Glicomódulo de arabinogalactano añadido (Ser-Hyp)32-EGFP 23 Shpak et al. (1999) (Ala-Hyp)5?-EGFP 30 Tan et al. (2003) (Thr-Hyp)99-EGFP 10 Tan et al. (2003) (Val-Hyp)10-EGFP 6 Tanet al. (2003) Glicomódulo con arabinosilación añadido (Ser-Hyp-Hyp)24-EGFP 10 Shpak et al. (2001 ) (Ser-Hyp-Hyp-Hyp)?s- 36 Shpak et al. (2001 ) EGFP (Ser-Hyp-Hyp-Hyp- 23 Shpak et al. (2001 ) Hyp)18-EGFP (YK)20-EGFPa 3-27 Held et al 2004 Journal of Biological Chemistry Vol 279: 55474-55482 (YK)8-EGFPa 4-7 Held et al (YL)8-EGFPa 6-23 Held et al (2004) (FK)9-EGFPa 0-3.3 Held et al, (2004) Ambos tipos de glicomódulos añadidos (Ala-Hyp)4-(YK)20-EGFP 111 no publicado (GAGP)3-EGFP 8 (Shpak et al (1999) (Ala-Ala-Ser-Ser-Hyp- > 50 no publicado Hyp-Leu)6-EGFP y (Ala- Ala-Gly-Thr-Thr-Hyp- Hyp)6-EGFP (tabaco y tomate) EGFP-LeAGP-1?GPI > 50 no publicado (tabaco y Arabidopsis) a (YK)2o y (YK)T designan las secuencias: (Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Lys)2o y (Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp -Tyr-Tyr-Tyr-Lys)8 respectivamente; (YL)8 designa (Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp -Tyr-Tyr-Tyr-Leu)8; (FK)8 designa (Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Phe-Phe-Phe-Lys)8.

CUADRO 3 Rendimiento de proteínas no vegetales expresadas como una proteína secretada en células de Nicotiana tabacum cultivadas en suspensión Proteína de fusión hGH mg/L de medio hGH-EGFP No detectada no publicado hGH-(Ser-Hyp)10-EGFP 16-24 no publicado hGH No detectada no publicado hGH-(Ser-Hyp)10 20-32 mg no publicado INFa2 No detectada no publicado INFa2-(Ser-Hyp)?o + no publicado HSA + no publicado HSA-(Ser-Hyp)?o + no publicado HSADoml no publicado HSADoml-(Ser-Hyp)?o + no publicado Análisis detallado de los resultados Los resultados anteriormente resumidos se tomaron a partir de numerosos estudios diferentes, con diferentes construcciones y diferentes proteínas expresadas, y se seleccionaron como representativos de cada estudio particular. La siguiente sección detalla el proceso de expresión, observado en diversas etapas, enfocado a la expresión de a) una construcción de la hGH sin un módulo de glicosilación, y b) una construcción de la hGH que tiene un módulo de glicosilación. En algunos casos, la expresión de hGH- (SO)?o se comparó con hGH-(SO)?0-EGFP, para observar cómo se expresan diferentes elementos peptídicos. La figura 15 muestra la detección de equivalentes de la hGH secretada dentro del medio de las células de tabaco transformadas con hGH-(SO)?o y hGH. El marco (A) muestra un ensayo de dot blot de los equivalentes de la hGH que se presentan en un µL de medio a partir de 10 líneas celulares transformadas con cualquier hGH-(SO)10 (superior) o hGH (inferior). El marco (B) muestra un ELISA intercalado para la cuantificación de los equivalentes de la hGH en el medio a partir de las mismas dos series de diez líneas celulares.

Estos resultados demuestran que la unión de un módulo de glicosilación incrementa significativamente la secreción de la proteína expresada en el medio.

La figura 16 muestra el curso en el tiempo del crecimiento celular y de los equivalentes de la hGH en las células de tabaco BY-2 transformadas con hGH-(SO)?o. Las células de tabaco secreción en matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenían 100 mL de medio. Se retiraron tres matraces a intervalos de 2 días para medir el peso celular seco y los equivalentes de la hGH en el medio. Las células cultivadas se cosecharon mediante filtración en un embudo concrecionado, y el filtrado (medio de cultivo) se recolectó para los ensayos de la hGH; las células se lavaron tres veces con agua destilada, luego se liofilizaron por tres días antes de la medición del peso seco. Los equivalentes de la hGH se midieron vía ensayos de ELISA intercalado. El medio a partir de las células transformadas se cosechó después de 8-10 días de cultivo mediante filtración en un embudo común concrecionado y se suplementaron con cloruro de sodio hasta una concentración final de 2 M. El material insoluble se concentró mediante centrifugación a 25,000 x G por 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se fraccionó mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en una columna de Fenil-Sefarosa 6 (Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow, 16 por 700 mm, Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada en cloruro de sodio 2 M. Después de que el medio se cargó completamente sobre la columna HIC, las proteínas se eluyeron paso a paso primero con un regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/cloruro de sodio 2 M, seguido por regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/cloruro de sodio 0.8 M, y luego con el regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/cloruro de sodio 0.2 N. La velocidad de flujo fue de 1.0 ml/minuto, y las fracciones se monitorearon a los 220 nm con un detector de UV. Cada fracción eluída se ensayó para la presencia de hGH mediante ensayos de dot blot y ELISA. El regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/ fracción de NaCI 0.2 N que contenía la mayoría de la glicoproteína de fusión hGH-(SO)?0 se concentró mediante ultrafiltración a 4°C, y se utilizó ya sea para los ensayos de unión a la hGH y de actividad, o se purificó adicionalmente mediante cromatografía en fase reversa. La figura 18 muestra el aislamiento de hGH-(SO)-?0 (A) y hGH-(SO)-?o-EGFP (B) mediante cromatografía en fase reversa sobre una columna polimérica para fase reversa-1 (PRP-1) de Hamilton equilibrada con un regulador de pH A (0.1% de ácido trifluoroacético). Las proteínas se eluyeron con regulador de pH B (0.1 % de ácido trifluoroacético, 80% de acetonitrilo, v/v) utilizando un gradiente lineal de dos pasos de 0-30% B en 15 minutos, seguido por 30%-70% de B en 90 minutos a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto. La absorbancia se midió a los 220 nm. La proteína de fusión hGH-(SO)-?o-EGFP se fraccionó inicialmente mediante cromatografía por permeación en gel sobre una columna Superose-12 antes de la inyección sobre la PRP-1. La figura 17 muestra la detección por Western blot de hGH-(SO)10 (panel a mano izquierda) y hGH-(SO)10-EGFP (panel a mano derecha) utilizando anticuerpos anti-hGH. Los geles se procesaron después del fraccionamiento del medio de cultivo utilizando cromatografía por interacción hidrófoba. Las muestras (10 µg de proteína) se procesaron en un SDS-PAGE al 4-15%, luego se transfirieron a una membrana NitroBind. El anticuerpo policlonal de conejo anti-hGH diluido a 1 : 500 en regulador de pH TTBS (TrisHCl 100 mM, pH 7.5, NaCI 150 mM y Tween 20 al 0.1 %) y anti-lgG de conejo de cabra conjugado a fosfatasa alcalina diluido a 1 :1000 en regulador de pH TTBS se utilizaron como las anticuerpos primarios y secundarios, respectivamente. La línea 1 : marcador molecular; líneas 2, 3, 4: hGH-(SO)?0 (A) o hGH-(SO)10-EGFP (B) medio de cultivo; líneas 5: hGH estándar (2 µg). Las bandas borrosas a 50-75 kDa (A) o de 75 a 100 kDa son típicas para las proteínas de arabinogalactano, las cuales incluyen hGH-(SO) y hGH-(SO)10-EGFP. Se añadieron suficientes arabinogalactanos O-Hyp para llevar la masa molecular hacia -50 kDa. El carbohidrato no solamente crea sitios de microheterogeneidad, sino que también interfiere con la unión del SDS, la cual produce la vista borrosa en el gel. La banda en> 150 kDa en (A) puede ser un contaminante. La banda en ~22 kDa en (A) probablemente es hGH liberada a partir de la proteína de función hGH-(SO)?0 ya sea durante el proceso de aislamiento o durante el tratamiento de calentamiento en el regulador de pH para carga de pH 8. Los inventores han observado que las construcciones ricas en SOSO (0=Hyp) son de alguna manera lábiles cuando se calientan en una base (pH 8) tal vez debido a un cambio de N — *- 0 acilo, lo cual es un problema alrededor de los residuos de Ser. En lugar de calentar las construcciones antes de SDS PAGE, las proteínas se pueden incubar a temperatura ambiente por varias horas en el regulador de pH para carga (sin calor), lo cual parece resolver el problema. La banda en -25 kDa en (B) podría ser EGFP, hGH con cierto SO y glicano unido, o algún contaminante. La presencia de un elemento EGFP no cambia significativamente el perfil de glicosilación de la proteína expresada. Como se muestra en el cuadro 4 a continuación, la galactosa y arabinosa comprenden los principales monosacáridos en la hGH(SO)?o o en la hGH-(SO)?0-EGFP, con menores cantidades de rhamnosa y ácido urónico. El azúcar explica el 55.5% del peso seco de la hGH(SO)?o, y 46.5% del peso seco de las glicoproteínas de fusión hGH-(SO)?o- EGFP.

CUADRO 4 Composición de glicosilo de hGH-(SO) lio v hGH- (SOI Im-EGFP Residuo de hGH-(SO)?n hGH-(SO)ift -EGFP glicosilo Moles % Peso % Moles % Peso % Rha 7 3.9 8 3.7 Ara 32 15.2 28 11.0 Gal 43 25.1 49 24.2 GlcUA 18 11.3 14 7.6 Total 100 55.5 100 46.5 El cuadro 5 muestra el perfil de glicosilación de INF-(SO)?o, el cual fue similar a aquel de hGH-(SO)10.

CUADRO 5 Composición de glicosilo de INF-(SO) 10 Residuo de glicosilo INF-(SO)?o Moles porcentuales Peso porcentual (% (% molar) peso) Rha 9 4.6 Ara 30 17.6 Gal 45 29.3 Acido uránicos 16 12.3 Total 100 63.8 Como se pronostica mediante la hipótesis de la contigüidad de Hyp (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ; Shpak, E., Barbar, E., Leykam, J. F. & Kieliszewski, M. J. J. Biol. Chem. 276, 11272-11278 (2001 )), ambas glicoproteínas de fusión hGH-(SO)?0 y hGH-(SO)10-EGFP contenían solamente el polisacárido Hyp (cuadro 6). El mismo efecto se observó en INF- (SO)?o (cuadro 7).

CUADRO 6 Glicósido de Representado como el porcentaje de la Hyp-PS, Hyp polisacárido; Hyp-Aran, Hyp-arabinósid??. ; NG-Hyp, Hyp no-glicosilado CUADRO 7 Perfiles de glicósido de hidroxiprolina de INF-(SO) o Hyp-PS, Hyp polisacárido; Hyp-Aran, Hyp-arabinósido^; NG-Hyp, Hyp non-glicosilada El cuadro 8 muestra el análisis del enlace glicosilo de la hGH- (SO) 10- CU/> 1DRO8 Enlace glicosilo Moles porcentuales t-Rha (p) 6 t-Ara (f) 17 t-Ara (p) 6 1 ,4-Ara (p) 7 1 ,5-Ara (f) 8 1,2,3,5-Ara(f) 1 t-Gal (p) 4 1,3-Gal(p) 10 1,6-Gal(p) 5 1,3,4-Gal(p) 1 1,3,6-Gal(p) 17 1,3,4,6-Gal(p) 1 1,2,3,4,6-Gal(p) 1 t-GlcA (p) 2 1,4-Glc(p) 10 1 ,4-GicA (p) 4 Residuos terminales 35 Residuos ramificados 65 Descripción qeneral de la clonación Los cassettes de los genes se construyeron para codificar el sitio de glicosilación en cualquier extremo N-terminal o C-terminal de la proteína, y se sub-clonaron dentro de pUC18-SSob- EGFP (vector pUC18 que codifica la secuencia final de la extensina del tabaco [SStob] y EGFP). Los genes se secuenciaron y luego se subclonaron dentro de pB121 (Clontech), los fragmentos BamHI/Sacl en lugar del gen de la ß-glucuronidasa y por detrás del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S.

Transformación vegetal Los plásmidos derivados a partir de pBI121 que contenían los cassettes del gen se transfirieron dentro de Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404. La transformación de las células de tabaco siguieron los métodos anteriormente descritos (An, G. (1985), Plant Physio, 79: 568- 570; Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ; Zhao ZD, Tan L, Showalter AM, Lamport DT, Kieliszewski MJ., Plant J. 2002 agosto; 31 (4): 431-44). Las células de tomate se transformaron con el método de disco de hoja (McCormick et al, 1986 Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) utilizando Agrobacterium tumefaciens McCormick, S.; Niedermeyer, J.; Fry, J.; Barnason, A.; Horsch, R.; Fraley, R. Plant Cell Reports 5: 81-84) Las células de Arabidopsis se transformaron utilizando el método de Forreiter et al. (Forreiter C, Kirschner M, Nover L., Plant Cell. 1997 diciembre; 9 (12): 2171-81 ).

Cultivos celulares Todas las células transformadas fueron cultivadas en medio SH (Schenk y Hildebrandt, 1972) que contenía 34 g/L de sacarosa, 0.4 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y 200 mg/L de canamicina (Sigma). Los matraces (250 ml o 1000 ml) se colocaron en agitadores giratorios con una rotación a 90 rpm a temperatura ambiente. Los medios se recolectaron después de 10-20 días de cultivo para aislamiento de las proteínas blanco.

Aislamiento de la glicoproteína Las glicoproteínas se aislaron a partir de medio utilizando cromatografía por interacción hidrófoba (HIC) y cromatografía en fase reversa, como se muestra a continuación (Nótese las siguientes diferencias: NaCI 2 M/Tris 25 mM pH 8.5 se utilizó para equilibrar la columna de HIC; y la columna se eluyó con un gradiente paso a paso de un segundo regulador de pH que solamente contenía Tris 25 mM pH 8.5. El derivado de hGH se eluyó en el gradiente de Tris 25 mM/0.2 M) (Shpak, E., Barbar, E., Leykam, J. F. & Kieliszewski, M. J. J. Biol. Chem. 276, 11272-11278 (2001); Zhao ZD, Tan L, Showalter AM, Lamport DT, Kieliszewski MJ., Plant J. 2002 agosto; 31 (4): 431-44; Li LC, Bedinger PA, Volk C, Jones AD, Cosgrove DJ, Plant Physiol. 2003 agosto; 132 (4): 2073-85).

EJEMPLO 3 Eiemplos de construcciones adicionales de la hormona de crecimiento de humano Además de las construcciones de la hGH descritas en el ejemplo 2 anteriormente mencionado, también se han sintetizado las siguientes construcciones y se transformaron en células de tabaco. 1. hGH-(SO)? El fragmento del gen SS'^-hGH-ÍSP^ se amplificó con PCR utilizando pUC-SStob-hGH-(SP)?0 como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-TAAGTGTACAATCAGGGTGAGAAGCCGCAGCTG-3' Luego se subclonó el fragmento de PCR resultante dentro de pUC-SStob-EGFP como un fragmento BamHI/BsrGI, reemplazando SStob- EGFP, para generar el plásmido designado pUC-SStob-hGH-(SP)? (figura 19). 2. hGH-(SO)2 El fragmento del gen SStob-hGH-(SP)2 se amplificó con PCR utilizando pUC-SStob-hGH-(SP)?0 como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-TAAGTGTACAATCATGGAGAGGGTGAGAAGCC-3' Luego se subclonó el fragmento de PCR resultante dentro de pUC-SSlob-EGFP como un fragmento BamHI/BsrGI, reemplazando SStob-EGFP, para generar el plásmido designado pUC-SStob-hGH-(SP)2 (figura 20). 3. hGH-(SO)g El fragmento del gen SStob-hGH-(SP)5 se amplificó con PCR utilizando pUC-SStob-hGH-(SP)?0 como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-TAAGTGTACAATCAAGGCGATGGGGAAGGGCTTGG-3' Luego se subclonó el fragmento de PCR resultante dentro de Puc-SStob-EGFP como un fragmento BamHI/BsrGI, reemplazando SStob- EGFP, para generar el plásmido designado pUC-SStob-hGH-(SP)5 (figura 21). 4. hGH-(SO)2n Un sitio de restricción Ncol se introdujo inicialmente a la derecha después del fragmento del gen SStob-hGH-(SP)?0 con PCR utilizando pUC-SStob-hGH-(SP)10 como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-ATAAGCCATGGTTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3' El fragmento de PCR resultante, SStob-hGH-(SP)10Nco1 se subclonó entonces dentro de pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10* como un fragmento BamHI/Ncol, reemplazando SStob-hGHNco1, para generar el plásmido designado pUC-SStob-hGH-(SP)20 (figura 22). Los nucleótidos extra introducidos dentro de este plásmido para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sitio dirigida utilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). (*: pUC-SStob-hGHNcol-(SP)?0 en el plásmido preliminar pUC-SStob-hGH-(SP)10 sin la presente mutación sitio dirigida para remover el sitio de restricción de Ncol.) 5. (SO hGH-(SO).f. Un fragmento (SP)?o se amplificó inicialmente con PCR utilizando pUC-SStob-hGH-(SP)?o como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-TTATCCCGGGCCTCACCCTCTCCAAGCCCTTCC-3' y 5'-TTATCCCGGGTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3' El fragmento de PCR resultante, x al(SP)10xmal se subclonó dentro de pUC-SStob-Xma,hGH-(SP)10** en el sitio' Xmal, insertando entre SStob y hGH-Xmal(SP)10 para generar el plásmido designado pUC_SStob(SP)10-hGH-(SP)?0 (figura 23). Los nucleótidos extra introducidos dentro de este plásmido para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sitio dirigida utilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). (**pUC-SStob-Xma,hGH-(SP)10 en el plásmido preliminar pUC-SStob-hGH-(SP) 10 sin la presente mutación sitio dirigida para remover el sitio de restricción de Xmal. 6. hGHA-(SO) n (hGHA: antagonista de la hormona de crecimiento de humano) pUC-SStob-hGHA-(SP)10 (figura 24) se generó mediante mutagénesis sitio dirigida del plásmido pUC-SStob-hGH-(SP)10 (a partir de la codificación de Gly120 para codificar Lys120) utilizando la siguiente serie de iniciadores: ' 5'-GGACCTAGAGGAAAAGATCCAAACGCTG-3' y 5'-CAGCGTTTGGATCTTTTCCTCTAGGTCC-3' EJEMPLO 4 Ejemplos adicionales de las construcciones del interferón Además de la construcción del interferón alfa2 (INF-(SO)-?o) descrita en el ejemplo 2 anteriormente mencionada, se realizaron las siguientes construcciones adicionales. 1. INF-(SO)s El fragmento del gen SStob-INF-(SP)5 se amplificó con PCR utilizando pUC-SStob-INF-(SP)-?0 como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-TAAGTGTACAATCAAGGCGATGGGGAAGGGCTTGG-3' El fragmento de PCR resultante se subclonó dentro de Puc-SStob-EGFP como un fragmento BamHI/BsrGI, reemplazando SStob-EGFP, para generar el plásmido designado pUC-SStob-INF-(SP)5 (figura 25). Esta transformación se llevó a cabo en células de Arabidopsis thaliana. 2. (S?yiNF-(SO) El fragmento del gen SStob-(SP)5 se amplificó con PCR utilizando pUC_SSto -(SP)?0-hGH-(SP)?o como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-ATAAGGCCCGGGTAGGCGATGGGGAAGGGCTTG-3' El fragmento de PCR resultante se subclonó dentro de pUC-SStob-INF-(SP)5 como un fragmento BamHI/Xmal, reemplazando SStob, para generar el plásmido designado pUC-SStob-(SP)5-INF-(SP)5 (figura 26). Los nucleótidos extra introducidos dentro de este plásmido para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sitio dirigida ufilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). Esta transformación se llevó a cabo en células de Arabidopsis thaliana. 3.(SO INF El fragmento del gen SStob-(SP)5 se amplificó con PCR como se menciono anteriormente. El fragmento de PCR resultante se subclonó dentro de pUC-SStob-INF como un fragmento BamHI/Xmal, reemplazando SStob, para generar el plásmido designado pUC-SStob-(SP)5-INF (figura 27). Los nucleótidos extra introducidos dentro de este plásmido para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sitio dirigida utilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). Esta transformación se llevó a cabo en células de Arabidopsis thaliana. 4.1NF-(SO)2o Inicialmente se introdujo un sitio para restricción de Ncol a la derecha después del fragmento del gen SStob-INF-(SP)?0 con PCR utilizando pUC-SSlob-INF-(SP)?o como molde y la siguiente serie de iniciadores: 5'-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3' y 5'-ATAAGCCATGGTTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3' El fragmento de PCR resultante, SStob-INF-(SP)10Nco1 se subclonó entonces dentro de pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10 como un fragmento BamHI/Ncol, reemplazando SStob-INFNco1, para generar el plásmido designado pUC-SStob-INF-(SP)20 (figura 28). Los nucleótidos extra introducidos dentro de este plásmido para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sitio dirigida utilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). Esta transformación se llevó a cabo en células de tabaco. 5. (SO)?o-INF(SO)?o Se generó un fragmento S'Stob-(SP)?o mediante la digestión de Puc_SStob-(SP)10Xmal-hGH-(SP)10*** con BamHI/Xmal. Este fragmento se subclonó entonces dentro de pUC-SStob-INF-(SP)?o, reemplazando SStob, para generar el plásmido designado pUC_SStob-(SP)?0-INF-(SP)10 (figura 29). Los nucleótidos extra introducidos dentro de este plásmido para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sifio dirigida utilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). (***: pUC_SStob-(SP)10Xmal-hGH-(SP)10 es el plásmido preliminar pUC-SStob-(SP)10- hGH-(SP)10 sin la presente mutación sitio dirigida para remover el sitio de restricción Xmal. Esta transformación se llevó a cabo en células de tabaco.

EJEMPLO 5 Ejemplos proféticos de las proteínas de fusión EGFP Otras proteínas de fusión EGFP que se pueden elaborar de conformidad con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, (Ala-Hyp)? EGFP, (Thr-Hyp)n-EGFP, (Thr-Hyp)?orEGFP, y (Val-Hyp)n-EGFP. Estos son solamente algunos de los ejemplos que se contemplan específicamente. La invención difícilmente se limita a estos ejemplos; se puede realizar esencialmente cualquier combinación o número de repetidos X-Hyp (en donde X es un aminoácido y Hyp es hidroxiprolina).

EJEMPLO 6 Mejoría de las características biológicas de los péptidos por la glicosilación La hormona de crecimiento de humano (hGH) es una hormona polipeptídica secretada por la glándula pituitaria y transportada por la sangre hacia tejidos blanco tales como el hígado, músculo, hueso, y tejido adiposo.

La GH de humano induce cambios metabólicos en los tejidos blanco, finalmente estimulando los procesos que resultan en crecimiento corporal. La hiposecreción de la hGH resulta en enanismo y la hipersecreción resulta en gigantismo y acromegalia. Adicionalmente, la hGH incluye el metabolismo de los adipocitos y de las células musculares y de los procesos tal como envejecimiento; de allí, el intenso interés en la manipulación de los niveles de la hGH en sangre y tejidos. A pesar de estas utilidades importantes, generalmente la GH nativa o recombínante no es adecuada como un fármaco polipeptídico debido a que su tamaño pequeño resulta en una rápida eliminación por el riñon y una vida media en circulación muy corta (-30 minutos). Por lo tanto, los pacientes que se someten a tratamiento para enanismo requieren inyecciones demasiado frecuentes de la hGH. La unión de los grupos de polietilenglicol (PEG) a los residuos de lisina en el polipéptido - un proceso denominado PEGilación -mejora dramáticamente las propiedades farmacológicas de la hGH. La PEGilación hace que la hGH sea clínicamente más efectiva al incrementar su masa molecular, por lo tanto previniendo la filtración renal y haciendo más lenta la eliminación de la hGH a partir del cuerpo; ésta también protege al polipéptido de la proteólisis y reduce la inmunogenicidad. No obstante, la PEGilación tiene ciertas desventajas. El direccionamiento relativamente no específico de los residuos de lisina reduce dramáticamente las afinidades de unión al receptor, tanto como 1500 veces. Además, el proceso de PEGilación toma mucho tiempo y es inconveniente, puesto que requiere la purificación del polipéptido derivado, incrementando en gran medida los costos del fármaco. Este ejemplo describe el trabajo en el cual los inventores incrementaron el peso molecular efectivo de la hGH y su estabilidad en circulación correspondiente mediante la expresión de ésta en células vegetales como una glicoproteína.

Materiales y métodos Construcción del plásmid? para transformación vegetal pBI SStob-hGH-(SP)m {3B/121 es un plásmido comercialmente disponible a partir de Clontech. Un derivado del cual se realizó para este trabajo. El ADNc de la hormona de crecimiento de humano se produjo mediante RT-PCR a partir del ADN total extraído de células L de ratón establemente transfectadas con el gen de la hGH (Chen et al, 1994) utilizando la siguiente serie de iniciadores: 5'- ACCCGGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3' y 5'- GATTCCATGGTGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC-3'. El fragmento de PCR resultante contenía el marco de lectura abierta para hGH pero carecía de su péptido señal. Este fragmento se clonó dentro de pUC-SStob-EGFP como un fragmento Xmal/Ncol entre SStob, el cuál codifica la secuencia señal para la extensina (SS) del tabaco, y el gen para la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) para generar el plásmido designado pUC-SStob-hGH-EGFP. El gen sintético gen que codifica, diez repetidos del dipéptido Ser-Pro (SP) se construyó mediante extensión del iniciador de dos oligonucleótidos mutuamente cebados (Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville, IA) (figura 10B) El gen (SP)10 se subclonó dentro de pUC-SStob-hGH-EGFP como un fragmento Ncol y BsrGI, reemplazando EGFP para generar pUC-SStob-hGH-(SP)10. Los nucleótidos extra introducidos dentro del cassette del gen SStob-hGH-(SP)?o para propósitos de clonación se removieron entonces mediante mutagénesis sitio dirigida utilizando el equipo para mutagénesis QuickChange (Strategies, CA). La secuenciación de SStob-hGH-(SP)10 se llevó a cabo en the Department of Environmental and Plant Biology, Ohio University. Luego toda la construcción SStob-hGH-(SP)10 (figura 10A) se clonó dentro del vector para transformación vegetal pBI121 (Clontech, CA) como un fragmento BamHl y Sacl en lugar del gen reportero para la ß-glucuronidasa para producir el plásmido pBI-SStob-hGH-(SP)10. La expresión de SSlob-hGH-(SP)10 estuvo bajo el control del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S.

Transformación y selección de la célula vegetal El plásmido pBI-SStob-hGH-(SP)10 se introdujo dentro de la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediante el método de congelamiento- descongelamiento (Holsters et al., 1978), luego las células de tabaco cultivadas en suspensión (Nicotiana tabacum, BY2) se transformaron con el Agrobacterium como se describió anteriormente (An, G. (1985) High efficiency transformation of cultured tobáceo cells. Plant Physiol, 79: 568-570) y se seleccionaron sobre medio sólido Schenk & Hildebrandt (SH) (Schenk y Hildebrandt, (1972) Médium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot, 50: 199-204) que contenía 0.4 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 200 mg/L de canamicina (Sigma), y 400 mg/L de TIMENTIN (SmithKIine Beecham, PA). Para la producción del producto del transgén, las células se crecieron en medio líquido SH que comprendía los mismos componentes anteriormente mencionados, excepto excluyendo TIMENTIN. Después de 8 a 10 días de cultivo a temperatura ambiente en un agitador giratorio Innova (New Brunswick Scientific, Edison, NJ), rotando a 90 rpm, el medio de cultivo para cada línea celular se seleccionó para la expresión de la hGH mediante ensayos de dot blot y ELISA (véase a continuación). Se eligieron tres líneas celulares de alto rendimiento para subcultivo bajo las condiciones anteriormente descritas.

Aislamiento de la glicoproteína de fusión hGH-(SO)?n El medio a partir de las células transformadas se cosechó después de 8-10 días de culture mediante filtración en un embudo común concrecionado y se suplemento con cloruro de sodio a una concentración final de 2 M. El material insoluble se concentro mediante centrifugación a 25,000 x G por 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se fraccionó mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) sobre una columna de Fenil-Sefarosa 6 (Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow, 16 por 700 mm, Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada en cloruro de sodio 2M. Después de que el medio se cargó completamente sobre la columna HIC, las proteínas se eluyeron paso a paso primero con un regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/cloruro de sodio 2 M, seguido por regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/cloruro de sodio 0.8 M, y luego con el regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/cloruro de sodio 0.2 N. La velocidad de flujo fue de 1.0 ml/minuto, y las fracciones se monitorearon a los 220 nm con un detector UV. Cada fracción eluída se ensayó para la presencia de hGH mediante ensayos de dot blot y ELISA. El regulador de pH con Tris (25 mM, pH 8.5)/fracción de NaCI 0.2 N que contenía la mayoría de la glicoproteína 'de fusión hGH-(SO)?0 se concentró mediante ultrafiltración a 4°C, y se utilizó ya sea para los ensayos la unión a la hGH binding o para la actividad, o se purificó adicionalmente mediante cromatografía en fase reversa. Cada fracción eluída se ensayó para la presencia de hGH mediante ensayos de dot blot y ELISA. La fracción a partir de la columna HIC, la cual contenía la glicoproteína de fusión (designada hGH-(SO)?o), se concentró mediante ultrafiltración a 4°C y se utilizó ya sea para los ensayos de la unión a la hGH o para la actividad. La fracción rica en hGH-(SO)?0 HIC se fraccionó adicionalmente mediante cromatografía en fase reversa en una columna analítica polimérica para fase reversa-1 de Hamilton (PRP-1) (4.1 x 150 mm, Hamilton Co., Reno, NV) equilibrada con un regulador de pH A (0.1 % de ácido trifluoroacético). Las proteínas se eluyeron con regulador de pH B (0.1 % de ácido trifluoroacétíco, 80% de acetonitrilo, v/v) utilizando un gradiente lineal de dos pasos de 0-30% de B en 15 minutos, seguido por 30%-70% de B en 90 minutos a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto. La absorbancia se midió a los 220 nm. , Análisis de Western Blot Las muestras (10 µg) de hGH-(SO)?0 se mezclaron con un volumen igual de un regulador reductor de pH para muestra 2X y se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida al 4-12% (BioRad, CA), luego se transfirieron hacia una membrana NitroBind (MSI, Westboro, MA) utilizando una celda mini Trans-Blot BioRad. El anticuerpo anti-hGH policlonal de conejo (Fitzgerald Industries International, Concord, MA) diluido a 1 :500 en regulador de pH TTBS (Tris-HCl 100 mM, pH 7.5, NaCI 150 mM, y Tween 20 al 0.1 %) y anti-lgG de conejo de cabra conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) diluido a 1 :1000 en regulador de pH TTBS se utilizaron como anticuerpos primarios y secundarios, respectivamente.

Cuantificación de la hGH mediante ELISA La concentración de los equivalentes de la hGH en el medio o en el eluído de la columna se determinó utilizando un equipo para hGH mediante ELISA intercalado (Roche Molecular Biochemicals, Alemania) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Composición del glicosilo y perfiles del glicósido de hidroxiprolina Se analizaron los azúcares neutros como acetatos de alditol derivados mediante cromatografía de gases utilizando una columna Hewlett-Packard HP-5 (entrecruzada 5% de PH ME Siloxano, 30 m x 0.32 mm x 0.25, um) programada de 130°C a 177°C a 1.2°C/minuto. Los datos se capturaron mediante el software ChemStation de Hewlett-Packard. Un ciento de µg de hGH-(SO)?o se utilizaron para cada análisis con 50 nanomoles de mio-inositol como el estándar interno. Los ácidos uránicos se ensayaron mediante el método colorimétrico basado en la reacción con m-hidroxidifenilo, con ácido D-glucurónico como el estándar.

Secuenciación de aminoácidos y ensayo de composición La secuencia de aminoácidos N-terminal de la hGH-(SO)?o se determinó en the Michigan State University Macromolecular Facility en un secuenciador de gases 477-A de Applied Biosystems. La composición de aminoácidos de la hGH-(SO)-?0 se determinó mediante CLAR en fase reversa en un sistema Beckman Gold (Beckman Instruments Inc., CA) después de la hidrólisis con el ácido clorhídrico y la derivación subsecuente con fenilisotiocianato (Bergman, T, Cariquist, M, Jornvall, H. (1986) Amino acid analysis by high performance liquid chromatography of phenylthiocarbamyl derivatives. En: Wittmann-liebold B, editor. Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis. Berlin: Springer-Verlag. P 45-55). El contenido de Hyp de las muestras se ensayó de manera colorimétrica como se describió anteriormente (Kivirikko, K.l. y Liesmaa, M. (1959) A colorimetric method for determination of hydroxyproline in tissué hydrolysates. Scandinavian J Clin Lab, 11 : 128-131 ).

CUADRO 9 Composición de aminoácidos v secuencia N-terminal de la HGH-ÍSO)™ Aminoácido Composición (moles %) hGH(SO)1c > ADNc de Pronosticada0 hGH(SO)10 Hyp 4.5 ~ 4.7 Pro 6.8 8.5 3.8 Asxa 2.5 9.5 9.5 Glxb 14.6 12.8 12.8 Thr 3.9 5.2 5.2 Ser 14.8 13.7 13.7 Gly 5.6 3.8 3.8 Ala 7.4 3.3 3.3 Val 3.1 3.3 3.3 Met 1.8 0.5 0.5 He 3.1 3.3 3.3 Leu 9.7 12.3 12.3 Tyr 2.0 3.8 3.8 Phe 5.2 6.2 6.2 His 2.9 0.5 0.5 Lys 6.9 4.3 4.3 Arg 4.6 ' 4.7 4.7 Cys 0.5 1.9 1.9 Trp nd 0.0 0.0 Secuencia N (secuencia principal) Phe-Pro-Thr-lle-Pro-Leu- terminal Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu (secuencia menor) Ser-His-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu- Leu-Lys-Asn-Tyr-G ly-Leu-Leu-Tyr a: Asx incluye Asp y Asn b: Glx incluye Glu y Gln c: forma pronosticada de la secuencia peptídica diseñada de la glicoproteína hGH(SO)?0 y teoría de la contigüidad de Hyp (Shpak, E., Leykam, J. F., y Kieliszewski, M. J. (1999), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 96: 14736-14741 ; Shpak, E., Barbar, E., Leykam, J. F. & Kieliszewski, M. J. J. Biol. Chem. 276, 11272-11278 (2001 )). La secuencia anteriormente mencionada es la N-terminal de la hGH-(SP)?o intacta, la secuencia menor se presenta después de la escisión proteolítica en un sitio lábil (N150-S151 ) en el dominio hGH de la hGH-SP10. El análisis de la hGH expresó una proteína dirigida en el sistema de los inventores BY- 2 que mostró que no contenía Hyp, sugiriendo que la hGH en las glicoproteína de fusión de los inventores contiene solamente Hyp en el módulo SO. Esta composición de aminoácidos indica que existen 9.5 residuos Hyp en la secuencia de 211 aminoácidos.

Ensayos de unión al radioreceptor de hGH-(SO) n Los ensayos de unión de la hGH-(SP)10, aislada con HIC (cromatografía por interacción hidrófoba), se llevaron a cabo utilizando un ensayo de unión a la superficie de células en monocapa. Brevemente, las células NIH3T3-L1 que expresan el receptor de la hormona de crecimiento (GHR) se crecieron hasta confluencia en placas para cultivo de células de 12 pozos. A Las células se les eliminó el suero durante toda la noche con DMEM simple. Las células se enjuagaron dos veces con 1 ml de PBS que contenía 0.1 % de BSA a temperatura ambiente antes del ensayo de unión. Las células se incubaron en la presencia de una cantidad constante de [125l]-hGH (Perkin Elmer) con cantidades variables de preparaciones de GH en volúmenes de reacción de 1 mL que contenían 0.1 % de BSA a temperatura ambiente por 2 horas en un agitador orbital. La reacción de unión se terminó al enjuagar las células 3 con 1 mL de PBS enfriado con hielo que contenía 0.1 % de BSA. Las células se solubilizaron con NaOH 0.1 N y se neutralizaron con HCl 0.1 N y la radioactividad unida a la superficie celular se midió ufilizando un contador de centelleo líquido. Este ensayo de unión se repitió con una construcción de la hGH-(SP)10-EGFP. Los resultados, presentados en la figura 30, muestran que incluso con proteína fluorescente verde unida, la hGH modificada se une al receptor con relativamente alta afinidad (EC50 de aproximadamente 10 nM). Los resultados también muestran que el motivo de glicosilación puede estar situado en el interior; no es necesario que el motivo de glicosilación se encuentre en cualquier extremo terminal. Los resultados para la hGH comercialmente disponible para la hGH-(SP)?o se presentan en las figuras 31 y 32. La EC5o para hGH-(SP)10 fue de 1 nM, consistente con la unión de la hGH comercialmente disponible a su receptor (figura 31 ).

Efectos in vivo de la hGH-(SP)?o Con el objeto de determinar el efecto farmacológico y la velocidad de eliminación de la hormona de crecimiento modificada, hGH- (SP)-?o y hGH comercialmente disponibles (Fitzgerald Industries International, Inc. 34 Junction Square Drive, Concord, MA 01742-3049 USA) se evaluaron en ratones. Para estas pruebas, ratones C57BL/6J de 5 a 6 meses de edad se inyectaron intraperitonealmente con las muestras de GH preparadas en PBS. El plasma se ensayó para los niveles de la hormona de crecimiento y del factor de crecimiento semejante a insulina I ("IGF-1"; liberado en el cuerpo en respuesta a la hormona de crecimiento). (Los equipos de ELISA para la hormona de crecimiento y para el IGF-1 se obtuvieron a partir de Diagnostic Systems Laboratorios Inc.) Prueba 1 : Inyección particular de 2 µg de GH/g de peso corporal. Se tomó una muestra de plasma a los 1 y 4 días después de la inyección. Los resultados se muestran en las figuras 33 (concentración de la hormona de crecimiento) y 34 (concentración del IGF-1). Claramente, la hGH-(SP)10 exhibió una concentración mucho mayor en la medición del día uno y exhibió una vida media dramáticamente, y área trabajo la curva incrementadas. Los niveles de IGF-1 muestran que el efecto biológico de la GH fue mejorado y extendido. En otra prueba de la vida media de la hGH, a cada grupo de ratones (dos) se le proporcionó una dosis particular de 30 µg de equivalente de la hGH. Las muestras de suero (30 µl) se tomaron durante intervalos que se extendieron por 48 horas y se analizaron para concentración de la hGH mediante ELISA. Los resultados, que se muestran en la figura 35, demuestran una extensión significativa de la vida media plasmática mediante la glicosilación.

Prueba 2: 2 µg de la GH/g por peso corporal/día. La hormona de crecimiento (modificada y control) se administró diariamente en forma de dos inyecciones, 12 horas aparte, por 5 días. Se tomó una muestra de plasma a los 1 , 4, 6, 8, 11 , y 18 días después de la primera inyección. Los resultados se muestran en las figuras 36 y 37. La figura 36 muestra la concentración en suero de la hormona de crecimiento; la figura 37 muestra la concentración en suero del IGF-1. De nuevo, nótese cómo los niveles de la GH (figura 36) son insignificantes el día uno con una preparación comercial de la hormona de crecimiento, mientras que la forma glicosilada tiene una concentración mucho mayor en el día uno. El efecto biológico (que se muestra en la figura 37) para la hormona de crecimiento comercialmente disponible esencialmente cesa menos de 5 días después de la última administración (en el día 5), mientras que la forma glicosilada continúa produciendo niveles mensurables del IGF-1 más de dos semanas después de la última administración. Estos resultados sugieren que ésta puede ser la acción más larga de la hormona de crecimiento alguna vez desarrollada.

Prueba 3: 1 µg de la GH/g de peso corporal/día. La GH se administró en inyecciones diarias particulares por 5 días y se tomó una muestra de plasma a los 1 , 4, 7, 9, y 11 días después de la primera inyección. Los resultados se muestran en las figuras 38 y 39. Incluso a esta dosis baja, se observó una diferencia significativa entre la hormona de crecimiento comercialmente disponible y la forma glicosilada de la invención.

Prueba 4: Efectos de la hGH-(SO)10 sobre el crecimiento del cuerpo total. Ratones de siete a ocho semanas de edad se dividieron al azar en 3 grupos de tratamiento, por ejemplo, control (n=3), hGH (n=3), y hGH- (SO)?o (n=4). Los ratones se enjaularon en grupos de dos o tres individuos. La hGH (Fittzgerald, Concord MA) y la hGH-(SO)?o se prepararon a 100 µg/mL en PBS. Los ratones se inyectaron intraperitonealmente con una dosis total de 1 µg por gramo de peso corporal, dos veces diariamente a aproximadamente las 9 AM y las 9 PM, por seis días. Después de una intermitencia al día uno, la dosis se incrementó a 2 µg por gramo de peso corporal por 7 días adicionales. La figura 40 muestra la ganancia de peso de los ratones en la prueba. Brevemente, los ratones control ganaron un promedio de 0.83 g durante un período de dos semanas. Los ratones que recibieron hGH ganaron un promedio de 2.13 g y los ratones que recibieron hGH-(SO)10 ganaron un promedio de 2.15 g durante el período de dos semanas. La ganancia de peso en comparación con los ratones control fue significativa (p < 0.05, ANOVA) para ambas hGH y hGH-(SO)?0 y no existió una diferencia significativa entre los tratamientos con hGH y hGH-(SO)?0.

Ensayo de inmunogenicidad de la hGH-(SO)?n La hGH-(SO)?0 se inyectó en los ratones para evaluar su inmunogenicidad en comparación con la hormona de crecimiento de tipo silvestre.

Régimen de inmunización: Las ratonas Balb/C (-6-7 semanas de edad) fueron sangradas y se inmunizaron cuatro veces a intervalos de dos semanas. Cada una de las ratonas recibió 50 µg de hGH-(SP)?o subcutáneamente dividida entre 2 sitios (flanco derecho e izquierdo. 0.05 mL/sitio). El suero se congeló a -20°C hasta ese ensayo para la actividad del anticuerpo mediante ELISA.

Protocolo de ELISA: Las placas EIA (NUNC poliestireno) se revistieron con 40 µg/mL del inmunógeno (hGH-(SP)10) en regulador de pH con carbonato-bicarbonato, pH 9.0, 50 µL/pozo, y se dejaron reposar durante toda la noche. Un número igual de pozos se revistió solamente con regulador de pH, (SP)10 solamente (20 µg/mL) o hGH solamente (20 µg/mL). El inmunógeno se decantó y se añadieron 200 µL de PBS-5% de BSA (+ de 0.05% de Tween-20) por pozo por dos horas a temperatura ambiente para bloquear la unión no especifica. La BSA se decantó y a cada pozo se le añadieron 50 µL (pozos por duplicado tanto revestidos con inmunógeno como pozos no revestidos) de PBS-1 % de BSA solamente o diluciones de suero de ratón en PBS-BSA. El suero pre-inmune y la mayoría de la muestra de suero reciente se compararon a partir del mismo ratón en cada placa. ' La incubación se llevó a cabo por cuatro horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. Los pozos se lavaron 4X en PBS-Tween. A cada uno de los pozos se le añadieron 50 µl de una dilución 1 :5000 de Ig anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (todos isotipos) en PBS-BSA por una hora a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron cuatro veces. El ensayo se desarrolló mediante la adición de 50 µL/pozo del sustrato OPD en regulador de pH con citrato-f osfato, pH 6. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl/pozo de ácido sulfúrico al 12.5% cuando se observó un buen contraste entre los pozos de fondo y las muestras. La ELISA se leyó a 490 nm.

Interpretación Ambos ratones mostraron una fuerte respuesta del anticuerpo a la hGH después de una inyección particular de hGH. Los niveles de anticuerpo crecieron con inyecciones repetidas. Ambos ratones pasaron de poseer anticuerpo marginalmente detectable hasta (SP) purificado después de la 2a y 3a inyecciones. La baja respuesta se puede deber a una escasa detección como un resultado de la baja unión del antígeno (SP)-?o purificado en la placa de ELISA (véase a continuación), lo cual podría reducir las reacciones observadas. Ambos ratones tuvieron un nivel de anticuerpo inesperadamente alto al antígeno conjugado de hGH-SP?0 incluso antes de la inmunización. Puesto que el suero pre-inmune no reaccionó con la (SP) 0 purificada o hGH sola, esto se puede explicar porque se observó que los ratones habían desarrollado un anticuerpo para reacción cruzada anti-(SP)?o a otro antígeno. Es posible que solamente se detecte cuando se conjuga a la hGH debido a que el conjugado de la hGH-(SP)10 se une fuertemente a la placa de ELISA, permitiendo una mejor detección de anti-(SP)10. Aunque esto es una especulación, es consistente con las observaciones en otros ratones en donde los materiales vegetales produjeron respuestas de fondo sin inmunización.

Los valores OD fueron más elevados para las placas revestidas con hGH en comparación con las placas revestidas con hGH-(SP)?0, las cuales pueden reflejar un reconocimiento diferencial o simplemente niveles diferentes de los determinantes reconocidos en las dos placas.

CUADRO 10 Dilución del suero 1 :100 Tiempo Ratón # anti-SP10 anti-hGH anti- después de (DO) (DO) hGHSPIO la (DO) inmunización 0 semanas 1 0.05 0.26 0.97 2 0.05 0 0.87 2 semanas 1 0.05 1.79 1.3 2 0.05 1.52 1.1 4 semanas 1 0.14 2.48 1.3 2 0-1 2.27 1.1 6 semanas 1 0.28 2.33 2.15 2 0.23 2.29 2.1 Dilución del suero 1:500 Tiempo Ratón # anti-SP10 anti-hGH anti- después de (DO) (DO) hGHSPIO la (DO) inmunización 0 semanas 1 0.04 0.11 0.41 2 0.03 0.04 0.36 2 semanas 1 0.03 1.16 0.55 2 0.02 0.83 0.46 4 semanas 1 0.1 2.29 1.82 2 0.06 1.99 1.44 6 semanas 1 0.16 2.23 1.98 2 0.15 2.15 1.86 Los experimentos de competencia también se llevaron a cabo utilizando placas revestidas con hGH-(SO)?0, anticuerpos anti-hGH-(SO)?0 (dilución del suero 1 :10,000), y 100 µg/ml de (SO)10 como inhibidor competitivo del anticuerpo de unión. Se observó una ¡nhibición de la reacción del 5%. En resumen, la glicoproteína de fusión de la hGH, designada hGH-(SO)?o, contenida en los diez repetidos en tándem C-terminales del sitio de glicosilación Ser-Hyo(SO), la cual dirige la adición de los polisacáridos de ramnoglucoronoarabinogalactano a cada residuo Hyp y masa molecular incrementada de la hGH a partir de 22 kDa a aproximadamente 50 kDa y la vida media en circulación de minutos a varias horas o incluso días. La EC50 para la hGH-(SO)-?0 fue de 1 nM, consistente con la unión de la GH de tipo silvestre a su receptor; además la hGH-(SO)?0 estimula la fosforilación de JAK 5 en células en cultivo y finalmente produjo la misma respuesta fisiológica response como la hGH de tipo silvestre. La evaluación preliminar de la antigenicidad de la hGH-(SO) 0 inyectada subcutáneamente en los ratones indica que no es más inmunogénica que la hormona de crecimiento de tipo silvestre. Otras modalidades de la invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y la práctica de la invención descrita en la presente invención. Se pretende que la especificación y ejemplos sean considerados solamente como ejemplares, , con un alcance verdadero y espíritu de la invención siendo indicado por las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una construcción de ácido nucleico para la expresión de al menos una proteína biológicamente activa en plantas que comprende: a) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un sitio de glicosilación y b) al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína biológicamente activa.

2.- Una glicoproteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta que comprende a) al menos un glicomódulo, covalentemente asociado a b) una proteína biológicamente activa de mamífero.

3.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque al menos un glicomódulo se elige a partir de i) X-Hypn o X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, ii) Hypn-X, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, iii) (Hyp-X)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 1000, y iv) (X-Hyp)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 1000; en donde X es cualquier aminoácido.

4.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val para los glicomódulos X-Hypn, Hypn-X, (Hyp-X)n, y (X-Hyp)n.

5.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

6.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque al menos un glicomódulo está covalentemente asociado en una ubicación elegida a partir de la N-terminal y de la C-terminal de la proteína.

7.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque al menos un glicomódulo se encuentra en el interior de la proteína de mamífero biológicamente acfiva.

8.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la proteína de mamífero biológicamente activa se elige a partir de la hormona de crecimiento, antagonistas de la hormona de crecimiento, la hormona liberadora de la hormona de crecimiento, somatostatina, grelina, lepfina, prolactina, proteína quimioatrayente de monocito-1 , ¡nterleucina-10, pleiotropina, interleucina-7, interleucina-8, ¡nterferón omega, interferón-AIpha 2, ¡nterferón gamma, interleucina-1 , factor de crecimiento del fibroblasto 6, IFG-1 , factor de crecimiento semejante a insulina 1 , insulina, eritropoietina, GMCSF, y cualquier anticuerpo monoclonal humanizado en donde el glicomódulo comprende i) X-Hypn, X-Pro-Hypn, o Hypn-X en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y ii) (X-Hyp)n o (Hyp-X)n en donde n es de 1 a aproximadamente 1000; y en donde X es cualquier aminoácido.

9.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa I derivada de planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val para los glicomódulos X-Hypn, Hypn-X, (Hyp-X)„, y (X-Hyp)„.

10.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

11.- La prateína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la proteína de mamífero biológicamente activa es una proteína de humano.

12.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el glicomódulo comprende (X-Hyp)n o (Hyp-X)n, en donde X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val.

13.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente acfiva derivada de planta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

14.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la proteína es la hormona de crecimiento de humano, y el glicomódulo comprende (Ser-Hyp)-?o.

15.- La proteína de fusión de mamífero biológicamente activa derivada de planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la glicoproteína de fusión está covalentemente asociada a al menos una molécula de carbohidrato.

16.- Un método para incrementar la solubilidad acuosa de una molécula de proteína, que comprende: preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica: a) al menos un sitio de glicosilación y b) al menos una proteína; y expresar la construcción de ácido nucleico como una glicoproteína de fusión; en donde el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o igual a aproximadamente 10% del peso molecular de la glicoproteína.

17.- El método para incrementar la solubilidad acuosa de una molécula de proteína de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o ¡gual a aproximadamente 50% del peso molecular de la glicoproteína.

18.- El método para incrementar la solubilidad acuosa de una molécula de proteína de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o igual a aproximadamente 75% del peso molecular de la glicoproteína.

19.- El método para incrementar la solubilidad acuosa de una molécula de proteína de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o ¡gual a aproximadamente 90% del peso molecular de la glicoproteína.

20.- Un método para producir una proteína de fusión biológicamente activa, que comprende expresar en una planta al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: a) al menos un sitio de glicosilación y b) al menos una proteína biológicamente activa, como una glicoproteína; en donde el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o igual a aproximadamente 10 kD y en donde el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o igual a aproximadamente 10% del peso molecular de la glicoproteína.

21.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque al menos una proteína biológicamente activa se selecciona a partir de insulina, factor de crecimiento semejante a insulina, somatostatina, la hormona liberadora de la hormona de crecimiento, grelina, prolactina, lactógeno placental, la hormona de crecimiento, y el antagonista de la hormona de crecimiento.

22.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o igual a aproximadamente 35 kD.

23.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o igual a aproximadamente 40 kD.

24.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente acfiva de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o ¡gual a aproximadamente 45 kD.

25.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la vida media farmacocinética de la glicoproteína es mayor que la vida media farmacocinética de una proteína de tipo silvestre correspondiente.

26.- El método para producir una molécula de proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el al menos un sifio de glicosilación se elige a partir de i) X- Pron o Pr?n-X, en donde n es de 6 a aproximadamente 100, y ii) (X-Pro)n o (Pro-X)n, en donde n es de 6 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido.

27.- El método para producir una molécula de proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val.

28.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

29.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la proteína biológicamente activa es la hormona de crecimiento y la glicoproteína comprende (Ser-Hyp)10.

30.- Ei método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el (Ser-Hyp)-?o está covalentemente asociado a la C-terminal de la hormona de crecimiento.

31.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizado además porque la hormona de crecimiento es la hormona de crecimiento de humano.

32.- Una formulación farmacéutica inyectable que comprende la hormona de crecimiento glicosilada de humano, y excluyendo al menos un excipiente elegido a partir de mannitol, sorbitol, trehalosa, glucosa, glicina, leucina, trileucina, histidina, y fosfolípido.

33.- La formulación farmacéutica inyectable de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque la hormona de crecimiento glicosilada de humano comprende un glicomódulo elegido a partir de i) X-Pro-Hypn, X-Hypn o Hypn-X, en donde n es de 6 a aproximadamente 100, y ii) (X-Hyp)n o (Hyp-X)n, en donde n es de 6 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido en el glicomódulo X-Pro-Hypn, y X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val para los glicomódulos X-Hypn, Hypn-X, (Hyp-X)n, y (X-Hyp)n.

34.- La formulación farmacéutica inyectable de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la hormona de crecimiento glicosilada comprende (X-Hyp)n o (Hyp-X)n, en donde n es de 6 a aproximadamente 20; en donde X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val.

35.- La formulación farmacéutica inyectable de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

36.- Una formulación en polvo liofilizada de la hormona de crecimiento glicosilada de humano que exhibe una solubilidad mayor que o ¡gual a aproximadamente 10 mg/ml, en donde la formulación excluye al menos un excipiente elegido a partir de mannitol, sorbitol, trehalosa, glucosa, glicina, leucina, trileucina, histidina, y fosfolípido.

37.- La formulación en polvo liofilizada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque la formulación excluye mannitol, sorbitol, trehalosa, glucosa, glicina, leucina, trileucina, y fosfolípido.

38.- Un método para incrementar el rendimiento en la producción vegetal de una proteína, que comprende: preparar una construcción de ácido nucleico que comprende: a) al menos una secuencia codificante de ácido nucleico del péptido señal, b) al menos una secuencia codificante de ácido nucleico del sitio de glicosilación, y c) al menos una .secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína; y expresar la construcción de ácido nucleico como una glicoproteína.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque al menos un sitio de glicosilación se elige a partir de i) X-Pron o Pron-X, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y ii) (X-Pro)n o (Pro-X)n, en donde n es de 1 a aproximadamente 1000; en donde X es cualquier aminoácido.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque X se elige a partir de Gly, Lys, Ser, Thr, Ala, y Val.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque la construcción de ácido nucleico excluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína fluorescente verde.

43.- Una proteína producida de conformidad con el método que se define en la reivindicación 42.

44.- Una molécula de la hormona de crecimiento de humano covalentemente asociada a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un glicomódulo, en donde el glicomódulo se elige a partir de i) X-Hypn o X-Pro-Hypn, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, ii) Hypn-X, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, iii) (Hyp-X)n, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, y iv) (X-Hyp)n, en donde n es de 4 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido en el glicomódulo X-Pro-Hypn, y en donde X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val para los glicomódulos X-Hypn, Hypn-X, (Hyp-X)n, y (X-Hyp)n.

45.- Una molécula antagonista de la hormona de crecimiento de humano covalentemente asociada a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un glicomódulo, en donde el glicomódulo se elige a partir de i) X-Hypn o X-Pro-Hypn, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, ii) Hypn-X, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, iii) (Hyp-X)n, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, y iv) (X-Hyp)n, en donde n es de 4 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido en el glicomódulo X-Pro-Hypn, y en donde X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val para los glicomódulos X-Hypn, Hypn-X, (Hyp-X)n, y (X-Hyp)n.

46.- El uso de la hormona de crecimiento glicosilada de humano, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece de la deficiencia o insuficiencia de la hormona de crecimiento.

47.- El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde la hormona de crecimiento es la hormona como se describe en la reivindicación 44.

48.- El uso del antagonista de la hormona de crecimiento glicosilada para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece de exceso de la hormona de crecimiento de humano o de la actividad de la hormona de crecimiento.

49.- El uso como se reclama en la reivindicación 48, en donde el antagonista de la hormona de crecimiento es el antagonista como se describe en la reivindicación 45.

50.- El uso de insulina glicosilada para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece de diabetes tipo I o tipo II.

51.- El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la insulina glicosilada comprende al menos un glicomódulo elegido a partir de i) X-Hypn o X-Pro-Hypn, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, ii) Hypn-X, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, iii) (Hyp-X)n, en donde n es de 4 a aproximadamente 100, y iv) (X-Hyp)n, en donde n es de 4 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido en el glicomódulo X-Pro-Hypn, y en donde X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val para los glicomódulos X-Hypn, Hypn-X, (Hyp-X)n, y (X-Hyp)n.

52.- El uso de una glicoproteína de fusión derivada de planta que comprende a) al menos un glicomódulo, covalentemente asociado a b) una proteína biológicamente activa, en donde al menos un glicomódulo se elige a partir de X-Hypn y X-Pro-Hypn, en donde n es de 2 a aproximadamente 1000, y en donde X es cualquier aminoácido, para la fabricación de un medicamento para prevenir la respuesta inmune alérgica en un mamífero.

53.- El uso como se reclama en la reivindicación 52, en donde X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val.

54.- Un método para incrementar la vida media de una proteína de fusión biológicamente activa, que comprende: expresar en una planta al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: a) al menos un sitio de glicosilación y b) al menos una proteína biológicamente activa, como una glicoproteína; en donde el peso molecular de la glicoproteína es mayor que o ¡gual a aproximadamente 10 kD y en donde el componente de carbohidrato de la glicoproteína corresponde a más de o igual a aproximadamente 10% del peso molecular de la glicoproteína.

55.- El método para incrementar la vida media de una molécula de proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque al menos un sifio de glicosilación se elige a partir de i) X-Pron o Pron-X, en donde n es de 6 a aproximadamente 100, y ii) (X-Pro)n o (Pro-X)n, en donde n es de 6 a aproximadamente 100; en donde X es cualquier aminoácido.

56.- El método para producir una molécula de proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque X se elige a partir de Lys, Ser, Ala, Thr, Gly y Val.

57.- El método para producir una proteína de fusión biológicamente activa de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque X se elige a partir de Ser, Ala, Thr, y Val.